NO308992B1

NO308992B1 - Aminoguanidinkarboksylater og anvendelse av disse for fremstilling av et medikament for behandling av ikke- insulinavhengig diabetes mellitus

Info

Publication number: NO308992B1
Application number: NO972346A
Authority: NO
Inventors: Scott D Larsen; Valerie A Vaillancourt; Paul D May; Steven P Tanis; John A Tucker; Martin D Meglasson; Heinrich J Schostarez
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1994-11-23
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2000-11-27
Also published as: ATE205188T1; US6329545B1; CN1377642A; SK64097A3; BR9509741A; ES2163531T3; CZ136997A3; RU2162462C2; JPH10509455A; MX9703807A; EP0793646B1; PL320361A1; SK282357B6; CN1164226A; FI972185A; PL184614B1; DK0793646T3; NO972346D0; GEP20002026B; EP0793646A1

Description

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye forbindelser som kan anvendes for behandling av: ikke-insulin-avhengig diabetes mellitus (NIDDM); diabetiske komplikasjoner resulterende fra overdreven ikke-enzymatisk glykosylering av proteiner i ikke-insulinavhengig diabetes mellitus; svekket glukosetoleranse; og fedme. Oppfinnelsen angår også anvendelse av en kjent forbindelse for fremstilling av et medikament for behandling av de ovenfor angitte sykdommer.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, eller NIDDM og diabetes Type n er synonyme,. NIDDM-pasienter har en unormalt høy blodglukosekonsentrasjon fastende og et forsinket cellulært opptak av glukose etter måltider eller etter en diagnostisk test kjent som glukosetoleranse-testen. NIDDM diagnostiseres basert på erkjente kriterier (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988) .

Insulin-avhengig diabetes mellitus, IDDM, og

diabetes Type I er synonyme. IDDM-pasienter har en unormalt høy blodglukosekonsentrasjon fastende og forsinket cellulært opptak av glukose etter måltider eller etter en diagnostisk test kjent som glukosetoleransetesten. IDDM diagnostiseres basert på erkjente kriterier (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988).

Svekket glukosetoleranse oppstår når graden av metabolsk rensing av glukose fra blodet er mindre enn hva som vanligvis finner sted i den generelle populasjon etter en standard dose av glukose er blitt administrert oralt eller parenteralt (American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988). Svekket glukosetoleranse kan oppstå i individer som ikke oppfyller de diagnostiske kriterier for disse sykdomstilstan-der. Svekket glukosetoleranse i ikke-diabetiske individer er en predisponerende faktor for utvikling av NIDDM.

Fedme er en tilstand hvori det er en økning i kroppsfettinnholdet resulterende i en overdreven kroppsvekt utover de aksepterte normer for alder, kjønn, høyde og kropps-bygning (Bray, Obesity, An Endocrine Perspective, s. 2303, Multihormonal Systems and Disorders (1989)). Aksepterte normer er blitt bestemt ved livsforsikringsselskapenes døde-lighetserfåring og ved forekomst av sykelighet i relasjon til kroppssammensetning. Den overdrevne dødelighet som finner sted i fete individer resulterer fra sykdommer som predispo-neres av denne tilstand. De innbefatter kreft, cardiovasku-lær sykdom, fordøyelsessykdom, respirasjonssykdom og diabetes mellitus.

I pasienter med kronisk hyperglycemi slik som oppstår i ikke-insulin-avhengig diabetes og insulin-avhengig diabetes, oppstår en glukose-avhengig protein—tverrbinding i en grad utover normen (Bunn, American Journal of Medicine, Vol. 70, s. 325, 1981) resulterende i forandret tertiær proteinstruktur (Brownlee, kapittel 18, Diabetes Mellitus,

s. 279, 1990). Overdreven ikke-enzymatisk glykosylering av■ proteiner bidrar til diabetiske komplikasjoner og komplikasjoner ved aldring i ikke-diabetiske mennesker, slik som neuropati, nefropati, retinopati, hypertensjon og arterioskle-rose (Brownlee, 1990, supra).

Hyperglycemi er definert som blodglukosekonsentrasjon utover den aksepterte norm for den generelle populasjon (American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988).

Selv om forholdet mellom disse tilstander er kjent, ville det være en fordel å ha et legemiddel som kan behandle eller forhindre alle disse.

Informasjonsbeskrivelse

3-(1-(aminomethyl)hydrazino))-propansyre er rapportert i JP 54128523 (Chem.Abstr. 92:75899h) å være et fungicid og insekticid. Syntesen av N-(hydrazinoiminomethyl)—glycin er rapportert i: Gante, J. Chem. Ber. 1968, 101, 1195. Enkelte alkylid-aminoguanidinderivater er beskrevet i US patentskrift 5 272 165 med tittel "Inhibiting advanced glycosylation of body proteins - using 2-alkylidene-amino:guanidine deriv.,

used e.g. for treating diabetic side-effeets or esp. preventing tooth staining." Aminoguanidinanaloger av arginin er beskrevet i DE 4244539-A1 og WO 9104-023-A. US patentskrift 5 132 453 beskriver at N6-(hydrazino-imino-methyl)-lysin er anvendbar som en inhibitor av nitrogenoksyddannelse og for behandling av hypertensjon. EP-230-037-A beskriver visse nye 2-substituerte guanidinderivater med antiischemisk og cardio-beskyttende aktivitet. US patentskrift 3 412 105 beskriver p-aryl-N-guanidino-((3-alaniner eller a-carboxy-(3-alaniner) som MAO-inhibitorer og lengevirkende hypotensive midler.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser som er kjennetegnet ved formel I eller II

hvori AG er

(a) N-aminoguanidin,

(b) N,N<1->diaminoguanidin, eller (c) N,N',N"-triaminoguanidin;

hvori n er et hele tall fra 1-5;

hvori R<1> er

(a) hydrogen,

(b) fenyl,

(c) Ci-Cs-alkyl, eller

(d) Ci-C5-alkyl-fenyl; og

hvori R<2> er

(a) fenyl,

(b) Ci-Cio-alkyl, eller

(c) Ci-C5-alkyl-fenyl,

med følgende forbehold:

(a) i formel I, når n er 2 eller 3, er Rx forskjellig

fra hydrogen;

(b) i formel I, når n er én, er Rx forskjellig fra

methyl;

(c) i formel II, når R2 er ethyl eller fenyl, er Rx

forskjellig fra hydrogen; og

(d) forbindelsen av formel I er forskjellig fra N-(hydrazinometyl)glycin; og (e) i formel II, når AG er N-aminoguanidin og R2 er benzyl, er Rx forskjellig fra hydrogen. Oppfinnelsen angår også anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for behandling eller forhindring av ikke-insulinavhengig diabetes mellitus eller fedme, hvori forbindelsen er av formel III

hvori R3 er H, methyl, ethyl, benzyl eller n-hexyl.

For de generiske formler I og II er bindingen av AG-fragmentet uspesifisert, dvs. bindingen til det tilstøtende carbon kan også oppstå ved enhver av nitrogenene av AG-fragmentene av AG-fragmentet. De gjenværende nitrogener av AG-fragmentet er usubstituert.

Eksempler på alkylgrupper som har fra 1 til 10 carbonatomer innbefatter for eksempel methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, n-pentyl, isoamyl, n-hexyl, n-heptyl, n-oktyl, n-nonyl, n-decyl og andre isomere former derav.

Eksempler på farmasøytisk akseptable syreaddisjons-salter innbefatter: acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butyrat, citrat, camferat, camfersulfonat, cyklopentanpropionat, digluconat, dodecyl-sulfat, ethansulfonat, fumarat, glucoheptanoat, glycerofosfat, hemisulfat, heptanoat, hexanoat, hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyethansulfonat, laktat, maleat, methan-sulfonat, 2-naftalensulfdnat, nicotinat, oxalat, palmoat, pektinat, persulfat, 3-fenylpropionat, pikrat, pivalat, propionat, succinat, tartrat, thiocyanat, tosylat og unde-canoat.

Dosen av forbindelsene av formel I-III som skal anvendes er mellom 0,1 og 100 mg/kg kroppsvekt daglig. Den foretrukne dose er 1 - 50 mg/kg/dag. Administreringen kan være ved oral, parenteral, intranasal, buccal, sublingual, intrarektal eller transdermal rute. Den orale rute foretrek-kes .

Nye forbindelser ifølge oppfinnelsen er angitt ved de generiske formler I og II. Kjente forbindelser for anvendelse ved behandling av NIDDM er representert ved formel III.

Blant forbindelsene ifølge oppfinnelsen, representert ved generisk formel I og II, er forbindelsene angitt i Tabell I spesielt foretrukne og deres foretrukne anvendelighet er ved behandling av NIDDM og dets komplikasjoner.

Tabell 2 inneholder en liste av beslektede forbindelser som ikke kreves. Disse er innbefattet for å demon-strere den overraskende effekt av de krevde forbindelser ved å vise at disse forbindelser, som er nært beslektet med de krevde forbindelser, ikke betraktes som aktive ved den høyeste testede dose.

Tabell 3 inneholder en liste av forbindelser innen den generiske ramme som omfattes av de generiske formler I og II som sviktet i å utvise aktivitet ved den høyeste testede dose, og som således utgjør de unntak som sees i forbeholdene i i krav 1.

Tabell 4 inneholder en liste av nye forbindelser spesifikt krevet ifølge oppfinnelsen. Prosedyrer for deres fremstilling er angitt i avsnitt 4.

Tabell 5 inneholder en liste over kjente forbindelser som kreves for anvendelse ved behandling av NIDDM.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således nye og kjente forbindelser med overraskende og uventede anti-diabetiske egenskaper.

Administrering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen til KKAy-mus i en dose på ca. 100 - 500 mg/kg/dag resulterer i delvis eller fullstendig bedring av hyperglycemi i denne gnagermodell av ikke-insulin-avhengig diabetes mellitus (spesifikke forbindelser er oppført i Tabell 4 og 5; se Chang, Wyse, Copeland, Peterson og Ledbetter, Diabetes 1985, s. 466, 1986). KKAy-mus er insulin-resistente (Chang et al, supra) og den observasjon at det ikke-fastende blodglukosenivå reduseres i disse dyr indikerer at insulinresistens

mest sannsynlig er mindre ved behandling med de krevede forbindelser. KKAy-mus er fete sammenlignet med normale, ut-avlede mus (Chang et al, supra), og administrering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen resulterer i vekttap.

Administrering av N-(dihydrazinomethylen)-glycin, den foretrukne forbindelse i denne serie, til diabetiske KKAy-mus i 4 dager reduserte det ikke-fastende blodglukosenivå av dyrene (se Tabell 6). En dose på 60 mg/kg/dag fremkalte en 35 % reduksjon i blodglukosenivået som var statistisk signifikant sammenlignet med. kontrollen. Høyere doser fremkalte enda større reduksjoner i blodglukosekonsentrasjonen. 3-guanidinopropionsyre til 500 mg/kg/dag fremkalte en tilnærmet lignende reduksjon i blodglukosekonsentrasjonen som ble oppnådd med 60 mg/kg/dag av N-(dihydrazinomethylen)-glycin.

Administrering av N-(dihydrazinomethylen)-glycin til diametiske KKAy-mus i 4 dager reduserte kroppsvekten av dyrene (se Tabell 6). En dose på 100 mg/kg/dag fremkalte en 4 % reduksjon i kroppsvekt som var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollen. Høyere doser fremkalte en enda større reduksjon i overskudd av kroppsvekt i KKAy-mus. 3-guanidinopropionsyre til 500 mg/kg/dag fremkalte en tilnærmet lik reduksjon i kroppsvekten av KKAy*-mus som ble oppnådd med 100 mg/kg/dag av N-(dihydrazinomethylen)-glycin.

Administrering av N-(dihydrazinomethylen)-glycin til normale C57BL-mus til 100 mg/kg reduserte den fastende blodglukosekonsentrasjon av disse dyr (Tabell 7).

Administrering av N-(dihydrazinomethylen)-glycin til diabetiske KKAy-mus eller normale C57BL-mus til 100 mg/kg resulterte i forbedret glukosetoleranse som vist ved lavere blodglukosenivåer etter injeksjon av en standard testdose av glukose (Tabell 7).

Ikke-enzymatisk glykosylering av proteiner er det første trinn i glukose-avhengig tverrbinding av proteiner (Brownlee, supra). Ikke-enzymatisk glycosylering av humant serum-albumin reduseres av N-(dihydrazinomethylen)-glycin, N-(hydrazinoiminomethyl)-glycin og [2-(aminoiminomethyl)-hydrazino]-, monohydroklorideddiksyre in vitro (Tabell 8). Aminoguanidin, som tidligere har blitt vist å inhibere ikke-enzymatisk glykosylering av proteiner in vitro (Khatami, Suldan, David, Li og Rockey, Life Sciences, vol. 43, s. 1725 - 1731, 1988) og in vivo (Brownlee, supra), er også effektiv i denne utprøvning (Tabell 8).

3-guanidinopropionsyre hadde ingen effekt på ikke-enzymatisk glykosylering av albumin i denne utprøvning.

I pasienter med diabetes mellitus er det flere metabolske forstyrrelser som det ville være av terapeutisk fordel å korrigere: det unormalt forhøyede blodnivå av glukose i ikke-fastet og fastet tilstand, den forsinkede rensing av glukose fra blodstrømmen (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988), og den overdrevne glykosylering av proteiner som bidrar til utvikling av diabetiske komplikasjoner (Brownlee, supra).

Enn videre er fedme hyppig assosiert med ikke-insulin-avhengig diabetes mellitus og forverrer den forstyrrede glukosemetabolisme i disse pasienter (Horton and Jeanrenaud, kapittel 27, Obesity and Diabetes Mellitus, 1990). Den opti-male behandling av ikke-insulin-avhengig diabetes mellitus ville kunne korrigere alle disse forstyrrelser. Overdreven glykosylering av proteiner, slik som kan oppstå i ikke-insulin-avhengig diabetes mellitus og insulin-avhengig diabetes mellitus-pasienter, kan forhindres ved blokkering av den kjemiske reaksjon av glukose og proteinmolekyler (Brownlee, supra) og redusere den unormale økning av blod-glukosekonsentras jonen i den diabetiske tilstand (Holman and Turner, Diabetic Medicine, 5:582-588, 1988; Benjamin and Sacks, Clin Chem., 4015:683-687, 1994). Den mest ønskelige behandling ville virke ved begge metoder for mer fullstendig å redusere graden av ikke-enzymatisk proteinglykosylering.

Det er de krevde forbindelsers evne til positivt å påvirke multiple metabolske defekter omfattende diabetes mellitus, og forhindre metabolske defekter ved mere enn én mekanisme som klart skiller deres farmakologiske virkninger fra andre guanidinforbindelser som tidligere er blitt krevet som behandlinger av diabetes mellitus. De krevede forbindelser er uventet bedre enn aminoguanidin, diaminoguanidin, 3-guanidinopropionsyre og metformin ved behandlingen av NIDDM fordi de gir et mere fullstendig spektrum av ønskelige akti-viteter og er effektive i lavere doser.

De krevede forbindelser gir uventede fordeler ved behandling av diabetes mellitus sammenlignet med diaminoguanidin og aminoguanidin da de krevede forbindelser virker metabolske for å redusere overdreven blodglukosekonsentrasjon, så vel som direkte å blokkere ikke-enzymatisk glykosylering av proteiner. De krevede forbindelser er uventet bedre enn aminoguanidin og diaminoguanidin ved behandling av svekket glukosetoleranse eller fedme da aminoguanidin og diaminoguanidin mangler virksomhet i dette henseende. Aminoguanidin og diaminoguanidin inhiberer ikke-enzymatisk glykosylering av proteiner in vitro og dannelsen av fremskredne glykosyle-ringssluttprodukter in vivo (Kumari, Umar, Bansal og Sahib, Diabetes, 40:1079-1084, 1991). Basert på dets inhibering av ikke-enzymatisk proteinglykosylering har aminoguanidin vært foreslått å ha anvendelse ved behandling av diabetes (Brownlee, supra). Aminoguanidin har ingen effekt på blodglukosenivået av normale gnagere eller rotter gjort diabetiske ved injeksjon av alloxan eller streptozotocin (Kumari, Umar, Bansal, Sahib, supra; Yagihashi, Kamijo, Baba, Yagihashi og Nagai, Diabetes, 41:47-52, 1992; Edelstein og Brownlee, Diabetologia, 35:96-97, 1992; Oxlund og Andreassen, Diabeterologia, 35:19-25, 1992). Diaminoguanidin har ingen effekt på blodglukosenivået av normale eller alloxan-diabetiske rotter (Kumari, Umar, Bansal, Sahib, supra). Aminoguanidin har ingen effekt på kroppsvekten av normale eller diabetiske rotter (Kumari, Umar, Bansal, Sahib, supra; Yagihashi, Kamijo, Baba, Yagihashi og Nagai, supra; Oxlund

og Andreassen, Diabetologia, 35:19-25, 1992), eller resulterer i en økning i kroppsvekt av mennesker og rotter (Baylin, Horakova, and Beaven, Experientia, 31:562, 1975). Diaminoguanidin påvirker ikke kroppsvekten av normale eller alloxan-diabetiske rotter (Kumari, Umar, Bansal, Sahib, supra). En effekt av aminoguanidin eller diaminoguanidin på glukosetoleransen har hittil ikke blitt demonstrert.

De krevede forbindelser er uventet bedre enn 3-guanidinopropionsyre ved behandling av diabetes mellitus da den sistnevnte er mindre kraftig ved kontrollen av hyperglycemi og mangler evnen til å inhibere den ikke-enzymatiske glycosylering av proteiner. Foreliggende forbindelser er uventet bedre enn 3-guanidinopropionsyre ved behandling av svekket glukosetoleranse eller fedme på grunn av den større styrke av disse forbindelser. 3-guanidinopropionsyre har tidligere blitt vist å redusere hyperglycemi og overskudd av kroppsvekt og forbedre glukosetoleransen i diabetiske gnagere (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse og de Souza, J.Pharm, and Exp. Therapeutics, 266:1454-1462, 1993). Den foretrukne forbindelse ifølge oppfinnelsen, N-(dihydrazinomethylen)-glycin, er mer kraftig enn 3-guanidinopropionsyre til å redusere unormalt forhøyet blodglukosenivå og kroppsvekt av KKAy-mus. For å redusere blodglukosenivået av KKAy i mus med 20 % er det nødvendig med 130 mg/kg/dag av den sistnevnte forbindelse. En lignende reduksjon i blodglukosenivået kan oppnås ved en dose på 30 mg/kg/dag av N-(dihydrazinomethylen)-glycin. N-(dihydrazinomethylen)-glycin administrert til KKAy-mus til 60 mg/kg/dag var tilnærmet like effektiv som 500 mg/ kg/dag av 3-guanidinopropionsyre. 3-guanidinopropionsyre forbedrer glukosetoleransen i diabetiske KKAy-mus når den administreres i maten som en 1 % blanding som vil avgi en dose på tilnærmet 1000 mg/kg/dag (US patentskrift 5 132 324). Sammenligningsvis forbedret N-(dihydrazinomethylen)-glycin glukosetoleransen av normale C57BL og diabetiske KKAy-mus når den ble administrert til 100 mg/kg/dag. Med hensyn til reduksjon av kroppsvekt var 100 mg/kg/dag av N-(dihydrazino-methylen) -glycin tilnærmet like effektiv som 500 mg/kg/dag av 3-guanidinopropionsyre. 3-guanidinopropionsyre inhiberer ikke den ikke-enzymatiske glycosylering av albumin in vitro i mot-setning til foreliggende forbindelser.

Foreliggende forbindelser er uventet bedre enn metformin ved behandling av diabetes mellitus, glukose-intoleranse og fedme da den sistnevnte er mindre kraftig når den ble testet ved den samme dyremodell som foreliggende forbindelser. Også med hensyn til dens virksomhet til å redusere kroppsvekt og forhindre ikke-enzymatisk proteinglycosylering er de angitte data for metformin selvmotsigende og gir ikke et forenlig resultat. Metformin har tidligere blitt vist å redusere hyperglycemi i ikke-insulinavhengige diabetiske pasienter når den administreres til 1000 - 3000 mg/dag og å øke graden av glukose ved rensing i slike pasienter når den administreres til 1500 - 2500 mg/dag (Bailey, Diabetes Care, 15:755-772, 1992). Gnagere er mindre følsomme overfor metformin enn mennesker og høyere doser (basert på kroppsvekt)

er derfor nødvendig for å vise glycemiske effekter (Bailey, Flatt, Wilcock og Day, Frontiers in Diabetes Research, s.

277 - 282, 1990; Penicaud, Hitier, Ferre og Girard, Biochem. J. 262:881-885, 1989). Kronisk oral administrering av metformin reduserer hyperglycemi når den administreres til neo-natale streptozotocin-diabetiske rotter til 100 mg/kg/dag (Rossetti, DeFronzo, Gherzi, Stein et al. Metabolism, 39:425-435, 1990), til DBM-mus til 400 mg/kg/dag (Bailey, Flatt, Wilcock og Day, supra), til Zucker fa/fa-rotter til 350 mg/kg/dag (Penicaud, Hitier, Ferre og Girard, supra), og til KKAy-mus til 300 mg/kg/dag eller mer (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, de Souza, supra). Kronisk oral administrering av metformin påvirket ikke blodglukosekonsentrasjonen i normale mus som mottok 250 mg/kg/dag, i streptozotocin-diabetiske mus som mottok 250 mg/kg/dag (Bailey, Flatt, Wilcock og Day, supra), eller diabetiske ob/ob-mus som mottok 250 mg/kg/dag (Bailey, Flatt og Ewan, Arch. Int. Pharmacodyn, 282:233-239, 1986). Akutt administrering av 264 mg/kg metformin eller dens analoge buformin til 132 mg/kg påvirket ikke blodglukosenivået av rotter (Tutwiler og Bridi, Diabetes, 27:868-876, 1978) . Når den foretrukne forbindelse ifølge oppfinnelsen, N-(dihydrazinomethylen)-glycin ble bestet i KKAy-mus var den mere kraftig enn metformin til å redusere det unormalt forhøye-de blodglukosenivå i denne modell. For å redusere blodglukosenivået av KKAy-mus med 25 % var det nødvendig med 300 mg/kg/dag av metformin (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse, og de Souza, supra). En lignende reduksjon i blodglukosenivået kunne oppnås med en dose på 30 - 60 mg/kg/dag av N-(dihydrazino-methylen) -glycin. Med hensyn til økning av glukosetoleransen er metformin blitt rapportert ikke å påvirke glukosetoleransen i normale rotter når den gis til en dose på 750 mg/kg (Tutwiler og Bridi, supra) eller i normale mus når den gis til 50 mg/kg (Bailey, Flatt, Wilcock og Day, supra). Når den ble gitt til normale mus eller streptozotocin-diabetiske rotter til 250 mg/ kg oralt ble glukosetoleransen øket (Bailey, Flatt, Wilcock og Day, supra). Sammenligningsvis øket N-(dihydrazinomethylen)-glycin glukosetoleransen når den ble administrert til normale C57BL eller diabetiske KKAy-mus ved en nedre dose av 100 mg/kg. Med hensyn til reduksjon av kroppsvekten er metformin blitt rapportert å forårsake vekttap i ikke-insulinavhengige diabetiske pasienter som ble behandlet i ett år (Bailey, supra) eller å ikke ha noen signifikant effekt på kroppsvekten av

fete ikke-insulin-avhengige diabetiske pasienter behandlet i en lignende tidsperiode (Multi-centre Study, Diabetologia, 24:404-4il, 1983). Metformin forårsaket ikke vekttap i diabetiske ob/ob-mus når den ble administrert til 240 mg/kg/ dag eller streptozotocin-diabetiske mus når den ble administrert til 60 mg/kg/dag (Lord, Atkins og Bailey, Diabetologia 25:108-113, 1983). Metformin forårsaket statistisk signifikant vekttap i KKAy-mus behandlet med 1700 mg/kg/dag av forbindelsen, men ikke når lavere doser ble gitt (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse og de Souza, supra). Når N-(dihydrazinomethylen)-glycin sammenligningsvis ble administrert til KKAy-mus til 100 mg/kg/dag var den tilnærmet like effektiv som 1700 mg/kg/dag av metformin til å fremkalle vekttap i denne fete musestamme (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse og de Souza, supra). Metformin er blitt rapportert å inhibere ikke-enzymatisk glykosylering av erythrocyttplasma

membraner ved konsentrasjoner på 0,5 og 5 mikromol pr. liter, basert på dens evne til å forhindre reduksjon i de elektron-paramagnetiske resonansspektroskopirekkefølgeparametre av plasmamembraner inkubert med glukose in vitro (Freisleben, Ruckert, Wiernsperger, og Zimmer, Biochemical Pharmacology, 43:1185-1194, 1992). Ved høyere konsentrasjoner, 50 og 100 mikromol pr. liter, hadde metformin en motsatt effekt og forårsaket en meget lav ordensparameter. Hvorvidt metformin kan forventes å redusere eller forverre ikke-enzymatisk glykosylering av proteiner i diabetiske pasienter, vil således avhenge av konsentrasjonen av metformin i serum av de behandlede pasienter. I diabetiske mennesker administrert 1 gram av metformin oralt er den midlere Cmakg plasmakonsentrasjon 3,24 mikrogram pr. milliliter (eller 25 mikromol pr. liter)

(Tucker, Casey, Phillips, Connor et al., Br. J. Clin. Pharmacol., 2:235-246, 1981), og ligger derfor midtveis mellom den høyeste konsentrasjon som er vist å redusere den ikke-enzymatiske glykosylering av erythrocytter og den laveste konsentrasjon som er vist å stimulere prosessen. Basert på de publiserte metforminplasmanivåer i diabetiske pasienter kan ingen konklusjon trekkes med hensyn til hvorvidt metformin vil inhibere den ikke-enzymatiske glykosylering av proteiner eller forverre prosessen på en eller annen måte når den administreres som en terapi til pasienter.

Generelle metoder for fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er vist i Reaksjonsskjema 1-4. Spesifikke eksempler for et utall av disse teknikker kan finnes i forsøksprosedyrene angitt i "beskrivelse av den foretrukne utførelsesform". Ved anvendelse av andre utgangsmaterialer og reaktanter kan de forskjellige forbindelser ifølge oppfinnelsen fremstilles. Følgende referanser diskuterer prosedyrer som angår de generelle synteser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Reaksjonsskjema 1: Gante, J.Chem, Ber. 1968, 101, 1195. Armarego, W.L.F.; Kobayashi, T. J. Chem. Soc. (C) 1971, 238. Evans, D.A.; Britton, T.C.; Dorow, R.L.; Dellaria, J.F. J.Am. Chem. Soc. 1986, 108, 6395, Evans, D.A.; Britton, T.C.; Dorow, R.L.; Dellaria, J.F. Tetrahedron 1988, 44, 5525. Reaksjonsskjema 3; Gut, J.; Hesoun, D.; Novacek, A. Coll. Czech, Chem, Comm. 1966, 31, 2014. Miura, K.; Ikeda, M.; Kondo, T.; Setogawa, K. Chem. Abstr. 1962, 56:4767b. Pankaskie, M.; Abdel-Monem, M.M. J. Pharm. Sei. 1980, 69, 1000.

Reaksjonsskjema 4: Lee, K.; Kim, S.; Um, H.; Park, H. Synthe-sis 198 9, 63 8. Reddy, T.I.; Bhawal, B.M.; Rajappa, S. Tetrahedron 1993, 49, 2101.

In vivo og in vitro screeningprotokoller.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

De etterfølgende forsøksprosedyrer er spesifikke eksempler som beskriver fremstillingen av et utall forbindelser ifølge oppfinnelsen: Eksempel 1: [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]-eddiksyre

Ethylhydrazinoacetathydroklorid (7,73 g, 50 mmol) ble forsåpet ved tilbakeløpskokning i 100 ml IN NaOH i 2 timer. Til den varme løsning ble det deretter tilsatt 2-methyl-2-thiopseudoureasulfat (6,95 g, 50 mmol) og løsningen ble kokt under tilbakeløpskjøling i ytterligere 2 timer. Blandingen ble konsentrert til tilnærmet det halve volum, ved hvilket tidspunkt et hvitt fast materiale utfeltes. Løsningen ble avkjølt og filtrert under dannelse av 3,34 g av et hvitt fast materiale. Omkrystallisering fra vann ga 2,41 g (36 %) [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]-eddiksyre som et høykrystallinsk hvitt fast materiale. Sm.p.: 247 - 248° C (dek); <1>H NMR: (D20) 6 3,40 (s, 2H).

Eksempel 2: [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]-, monohydroklorideddiksyre

Til en omrørt løsning av [(aminoiminomethyl)-hydrazono]-, monohydroklorid-monohydrateddiksyre (10 g, 60 mmol) i 300 ml methanol ble det tilsatt 0,25 g 10 % Pd-C og blandingen ble hydrogenert ved 2,1 kg/cm 2 over natten. Blandingen ble filtrert og løsningsmidlet ble fordampet til tørrhet. Residuet ble omkrystallisert fra EtOH under dannelse av 4,2 g (42 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale (sm.p. 163 - 165° C). <1>H NMR (D20) 6 3,68 (s, 2H).

Eksempel 3: [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]-eddiksyrefenyl-methylester-monohydroklorid

HCl-gass ble boblet gjennom en suspensjon av [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]-eddiksyre (2,00 g, 15,2 mmol) i 30 ml benzylalkohol. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ca. 1 time inntil alt forelå i løsning. Det urene produkt ble ut-felt ved tilsetning av Et20. Dette materiale ble omkrystallisert fra MeOH/EtOAc under dannelse av [2-(aminoiminomethyl)-hydrazino]-eddiksyre-fenylmethylestermonohydroklorid (3,20 g, 82 %) som et hvitt krystalinsk fast materiale.

Sm.p.: 162 - 164° C

<1>H NMR (CD3OD): 6 3,69 (s, 2H), 5,24 (s, 2H), 7,34 - 7,42

(m, 5H).

Eksempel 4: a-hydrazinobenzenpropansyre

En løsning av LDA (50 ml av en 1,5M løsning i THF) i 250 ml tørr THF ble avkjølt til -78° C. Til denne ble det dråpevis tilsatt en løsning av ethylhydrocinnamat (12,0 ml, 68,2 mmol) i 250 ml tørr THF. Løsningen ble omrørt ved -78°C i 30 minutter. En løsning av di-tert-butyl-azodicarboxylat (18,84 g, 81,8 mmol) i 100 ml tørr THF ble deretter dråpevis tilsatt. Etter 10 minutter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 14 ml HOAc og fikk oppvarmes til romtemperatur. Blandingen ble fordelt mellom Et20 og vann. Det vandige lag ble ekstrahert med 3 x 100 ml Et20. De kombinerte organiske lag ble vasket med 2 x 100 ml mettet vandig NaHCO^ og 1 x 100 ml saltvann, ble tørket over natriumsulfat og kondensert. Det urene produkt ble kromatografert på silica (90/10 hexan/EtOAc) under dannelse av 15,33 g (55 %) av den bis-BOC-beskyttede hydrazinoester. Esteren ble tatt opp i 200 ml CH2C12. Til dette ble det tilsatt 120 ml trifluoreddiksyre. Blandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur. Etter fjerning av løsningsmidlet ble det urene produkt tatt opp i 75 ml IN NaOH og ble kokt under tilbakeløpskjøling i 2 timer. Løsningen ble avkjølt, ble ekstrahert med Et20, ble nøytralisert, kondensert til halogen, ble avkjølt og filtrert. Det resulterende brunaktige faste materiale ble omrørt i kokende i-PrOH i 1 5 minutter for å fjerne fargede urenheter. Filtrering og tørking ga 3,35 g (27 %) av ot-hydrazinobenzenpropansyre som et hvitt fast materiale.

Sm.p.: 198 - 201° C (dek). 1H NMR: (D20) 6 7,41 - 7,29 (m, 5H) , 3,89 (dd, J = 7,6 Hz, 1H), 3,23 - 3,08 (m, 2H).

Eksempel 5 a-[2-(aminoiminomethyl)hydrazinojbenzenpropan-syremonohydrat

En løsning av ot-hydrazinobenzenpropansyre (3,00 g, 16,7 mmol) og 2-methyl-2-thiopseudoureasulfat (2,55 g, 18,3 mmol) i 17 ml IN NaOH ble oppvarmet til tilbakeløpskoking i 2 timer. Blandingen ble nøytralisert med 3N HC1 og ble konsentrert inntil utfelling startet (ca. 1/2 volum). Det urene produkt ble filtrert og omkrystallisert fra vann under dannelse av 1,81 g (49 %) a-[2-(aminoiminomethyl)hydrazino]-benzenpropansyre-monohydrat som et monohydrat. Sm.p.: 127 - 130° C (dek). <1>H NMR: (D20) & 7,40 - 7,27 (m, 5H), 3,60 (dd, J = 8,6 Hz, 1H) , 3,04 (dd, J = 14,6 Hz, 1H) , 2,86 (dd, J = 14,8 Hz, 1H). 2-[2-(aminoiminomethyl)hydrazino]propansyre

En blanding av 10,0 g (55,4 mmol) 2-[(aminoimino-methyl) hydrazono]propansyrehydroklorid (J. Pharmaceut. Sei. 1980, 69, 1000-1004), 1,5 g 10 % palladium-på-carbon og 300

ml destillert vann ble ristet under 3,5 kg/cm 2 hydrogentrykk i 16 timer ved 25° C. Blandingen ble filtrert. Til filtratet ble det tilsatt 75 g "Dowex"IR118H sterk sur kationbytterharpiks i hydrogenform. Blandingen ble omrørt

i 1 time og blandingen ble deretter filtrert. Harpiksen ble vasket med tre 100 ml porsjoner destillert vann. Det kombinerte filtrat og vaskeløsninger ble kastet og harpiksen ble vasket med fem 200 ml porsjoner 20 % (vol/vol) pyridin i destillert vann. Disse vaskeløsninger ble kombinert og løsningsmidlet ble fordampet ved redusert trykk (25° C, 1 torr). Det resulterende hvite pulver ble oppløst i 30 ml tilbakeløpskokende destillert vann og den resulterende

løsning ble fortynnet med 90 ml varm absolutt ethanol. Blandingen fikk avkjøles til 25° C og etter 24 timer ble det dannede bunnfall oppsamlet ved filtrering. Det faste materiale ble tørket (20 torr/50°C/24 timer) under dannelse av 3,8 g av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale, sm.p. 239 - 241° C.

Eksempel 6: [1-(aminoiminomethyl)hydrazino]-eddiksyre-mono-hydrobromid

Til en omrørt suspensjon av aminoguanidinbicarbonat (100 g, 734 mmol) i 200 ml vann ble det tilsatt bromeddiksyre (100 g, 720 mmol). Etter en begynnelsesbrusning ble den homo-gene løsning kokt under tilbakeløpskjøling over natten, ble avkjølt til omgivende temperatur og løsningsmidlet ble fordampet til tørrhet. Residuet ble suspendert i 200 ml EtOH og ble lydbehandlet. Det faste materiale ble filtrert under dannelse av 13,6 g (9 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale (sm.p. 163 - 165° C), ^ NMR (D20) 6 4,25 (s, 2H).

Eksempel 7: 3-[[imino[(1-methylethyliden)hydrazino]-methyl]-amino]propansyre

|3-alanin (6,00 g, 67,5 mmol) ble oppløst i 67,5 ml IN NaOH. Til dette ble det tilsatt N-amino-S-methylisothio-urea-hydrojodid (15,69 g, 67,5 mmol). Blandingen ble oppvarmet til tilbakeløpskoking i 1,5 time. Løsningsmidlet ble fjernet. Det urene produkt ble tatt opp i ca. 50 ml vann og 50 ml aceton ble tilsatt. Fjerning av løsningsmidlet ga et oransje fast materiale som ble kromatografert på silica (80/20 CHCl3/MeOH og deretter 60/40 CHCl3/MeOH) under dannelse av 5,88 g (47 %) av 3-[[ imino[(1-methylethyliden)hydrazino]-methyl]-amino]-propansyre som et blekt oransje fast materiale. Sm.p: ^125° C (dek). <1>E NMR: (D20) 6 3,36 (t, J = 6 Hz, 2H), 2,35 (t, J = 6 Hz, 2H), 1,87 (s, 3H), 1,80 (s, 3H).

Eksempel 8: N-(hydrazinoiminomethyl)-|3-alanin

3-[[imino[(1-methylethyliden)hydrazino]methyl]-amino]propansyre (5,88 g, 31,61 mmol) ble oppløst i 125 ml vann og ble oppvarmet til 60° C i 72 timer. Løsningsmidlet

ble fordampet og produktet ble omrørt i en 4:1 blanding av EtOH og MeOH. Det resulterende blekoransje bunnfall ble filtrert, ble vasket med ethanol og tørket under dannelse av 3,16 g (68 %) N-(hydrazinoiminomethyl)-(3-alanin som et blekt oransje fast materiale. Sm.p.: 177 - 179° C. "'"H NMR: (D20) 6 3,39 (t, J = 6 Hz, 2H) , 2,42 (t, J = 6 Hz, 2H) .

Eksempel 9: N-(dihydrazinomethylen)-1-alanin

Til en suspensjon av L-alanin (10,0 g, 0,11 mol) og triethylamin (33,5 ml, 0,24 mol) i 90 ml EtOH og 6 ml H20 ble tilsatt carbondisulfid (7,2 ml, 0,12 mol). Etter omrøring over natten ble methyljodid (7,5 ml, 0,12 mol) tilsatt til den gule løsning. Blandingen ble omrørt i 1 time og ble konsentrert til en oppslemming. Residuet ble oppløst i 25 ml H20 og konsentrert HC1 ble tilsatt inntil blandingen var sur. Blandingen ble ekstrahert med 3 x 100 ml Et.,0 og den organiske fase ble tørket (MgSO^) og konsentrert under dannelse av 18,4 g (93 %) av det tilsvarende dithiocarbamat som et blekt gult fast materiale med god renhet. En analytisk ren prøve ble erholdt ved omkrystallisering fra Et20/hexan: sm.p. 90 -

92° C; <1>H NMR (D20) 6 4,89 (q, J = 7 Hz, 1 H), 2,59 (s, 3 H), 1,52 (d, J = 7 Hz, 3 H).

Til en løsning av dithiocarbamatet (5,0 g, 28 mmol) i 50 ml methylenklorid ved 0° C ble det tilsatt methyltrifluormethansulfonat (3,5 ml, 31 mmol). Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og ble omrørt i 20 timer. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk til en fargeløs olje. Den resulterende olje ble oppløst i 5 ml H20 og 28 mmol 1,0 M NaOH ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med 3 x 100 ml EtOAc og den organiske fase ble tørket (MgS04). Etter filtrering ble løsningsmidlet fjernet i vakuum under dannelse av en tykk viskøs olje. Oljen ble oppløst i 25 ml absolutt EtOH og vannfri hydrazin (4,4 ml, 0,14 mol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 1,5 timer og det faste materiale (2,5 g) som ble dannet ble oppsamlet ved filtrering. Det hvite pulver ble ytterligere renset ved krystallisering fra H20/IPA under dannelse av 2,2 g (49 %) av diaminoguanidinet som et hvitt pulver: sm.p. 174 - 176° C (dek); <X>H NMR (D20) 6 3,69 (q, J = 7 Hz, 1H), 1,20 (d, J = 7 Hz, 3 H).

Eksempel 10: N-(dihydrazinomethylen)-p-alanin

Ved en prosedyre analog med den som ble anvendt for N-(dihydrazinomethylen)-1-alanin, ble p-alanin omdannet til N-(dihydrazinomethylen)-|3-alanin (sm.p. 192° C, dek).

<1>H NMR (D20) 3,40 (t, 2H, J = 7 Hz), 2,48 (t, 2H, J = 7 Hz).

Eksempel 11: N-(dihydrazinomethylen)-glycin

En løsning av methylert thiocarbohydrazid (25,0 g, 101 mmol) og glycin (6,314 g, 83,98 mmol) i 50 ml vann og 12,5 N NaOH (8,89 ml, 111 mmol) ble omrørt under nitrogen ved 75 - 80° C i 3 timer. Løsningen ble avkjølt med is mens den fremdeles var under nitrogen før porsjonsvis tilsetning av absolutt ethanol (550 ml i 50 ml porsjoner), idet blandingen ble omrørt mellom hver tilsetning inntil utfellingen var fullført. Blandingen ble deretter omrørt i 15 minutter ved 0° C før filtrering. Det oppsamlede faste materiale ble vasket grundig med absolutt ethanol. Tørking ga et lyst lyserødt pulver (8,04 g). Det urene faste materiale ble oppløst i 30 ml vann, ble filtrert for å fjerne noe fint uløselig materiale og ble deretter fortynnet til et volum på 250 ml med absolutt ethanol. Utfelling startet praktisk talt umiddelbart og ble akselerert ved lydbehandling i noen få sekunder. Etter henstand ved romtemperatur i 10 minutter ble blandingen filtrert under dannelse av et blekt rosa pulver (5,25 g, 42 %, sm.p. 200° C, dek). <1>H NMR (D20) 3,78 (s) .

Eksempel 12: [2-(hydrazinoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre

Ethylhydrazinoacetat-hydroklorid (9,28 g, 60 mmol) ble forsåpet ved tilbakeløpskoking i 120 ml IN NaOH i 2 timer. Til den varme løsning ble det deretter tilsatt N-amino-S-methylisothiourea-hydrojodid (13,98 g, 60 mmol) og løsningen ble kokt under tilbakeløpskoking i ytterligere 2 timer. Løsningsmidlet ble fjernet. Det urene produkt ble oppløst i methanol og ble filtrert for å fjerne NaCl. Filtratet ble kondensert og tørket ved høyvakuum. Residuet ble deretter omrørt med 150 ml MeOH over natten. Det resulterende hvite faste materiale ble filtrert. Dette faste materiale ble deretter kokt under tilbakeløpskjøling i 100 ml MeOH i 2 timer for å fjerne enhver urenhet. Blandingen ble deretter avkjølt og filtrert. Det resulterende faste materiale ble tørket i vakuum under dannelse av 2,14 g (24 %) av [2-(hydrazinoiminomethyl)-hydrazino]eddiksyre som et off-hvitt fast materiale. Sm.p: 201 - 203° C (dek). <1>H NMR: (D20) 6 3,39 (s, 2H) .

Eksempel 13: N-(dihydrazinomethylen)-d-alanin

Til en suspensjon av D-alanin (1,8 g, 20 mmol) og triethylamin (6,1 ml, 44 mmol) i 15 ml EtOH og 1 ml H20 ble det tilsatt carbondisulfid (1,3 ml, 22 mmol). Etter omrøring over natten ble methyljodid (1,4 ml, 22 mmol) tilsatt til den gule løsning. Blandingen ble omrørt i 1 time og ble konsentrert til en oppslemming. Residuet ble oppløst i H20 og konsentrert HC1 ble tilsatt inntil blandingen var sur. Blandin-

gen ble ekstrahert med methyl-t-butylether (3 x 50 ml), og den organiske fase ble tørket (MgSO^) og konsentrert under dannel-

se av en gul olje som med lydbehandling og tilsetning av en liten mengde av hexan stivnet. Etter ytterligere tørking ble 2,9 g gult fast materiale erholdt. Produktet ble ytterligere renset ved omkrystallisering (Et20/hexan) under dannelse av 1,67 g (47 %) av forbindelsen identifisert som forbindelse A

i Tabell 9 som et kremfarget fast materiale: sm.p. 89 - 91° C;

<X>H NMR (D20) 6 4,67 (m, 1H), 2,39 (s, 3H), 1,32 (d, J = 7,0 Hz, 3H) .

Til en løsning av dithiocarbamatet av Forbindelse A

i Tabell 9 (15,1 g, 84,3 mmol) i 170 ml methylenklorid ved 0°C ble det tilsatt methyltrifluormethansulfonat (10,5 ml, 92,7 mmol). Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og ble omrørt i 20 timer. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk til en fargeløs olje. Den resulterende olje ble oppløst i 40 ml H20 og 84,3 mmol 1,0 M NaOH ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med 3 x 200 ml EtOAc og den organiske fase ble tørket (MgS04). Etter filtrering ble løsningsmidlet fjernet i vakuum under dannelse av en tykk viskøs olje. Oljen ble oppløst i 85 ml absolutt EtOH og vannfrift hydrazin (13,2 ml, 0,42 mol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 1,5 timer og det faste materiale (7,5 g) som ble dannet ble oppsamlet ved filtrering. Det hvite pulver ble ytterligere renset ved krystallisering fra H20/IPA under dannelse av 6,48 g (48 %) av tittelforbindelsen som et hvitt pulver: sm.p. 175 - 177° C;

H NMR (D20) 6 3,69 (q, J = 7 Hz, 1H), 1,20 (d, J = 7 Hz, 3H).

Eksempel 14: N-(dihydrazinomethylen)-valin

Til en suspensjon av L-valin (5,0 g, 42,7 mmol) og triethylamin (13,1 ml, 93,9 mmol) i 30 ml EtOH og 2 ml H20 ble det tilsatt carbondisulfid (2,8 ml, 47,0 mmol). Etter om-røring over natten ble methyljodid (2,9 ml, 47,0 mmol) tilsatt til den gule løsning. Blandingen ble omrørt i 2 timer og ble konsentrert til en oppslemming. Residuet ble oppløst i 10 ml H20 og konsentrert HC1 ble tilsatt inntil blandingen var sur. Blandingen ble ekstrahert med 3 x 100 ml Et20 og den organiske fase ble tørket (MgSO^) og konsentrert under dannelse av en gul olje som etter såing ga et gult fast materiale. Det faste materiale ble suspendert i hexan og ble filtrert under dannelse av 7,7 g av Forbindelse B i Tabell 9 som et off-hvitt fast materiale. Filtratet ble avkjølt til 0° C under dannelse av en andre masse på 0,27 g av Forbindelse B i Tabell 9 (7,97 g totalt, 90 %) som et hvitt fast materiale: sm.p. 76 - 78° C;

<1>H NMR (CDC13) 6 5,30 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 1,08 (d, J = 7,0 Hz, 3 H), 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3 H).

Til en løsning av Forbindelse B i Tabell 9 (8,0 g, 38,6 mmol) i 60 ml methylenklorid ved 0° C ble det tilsatt methyltrifluormethansulfonat (4,8 ml, 42,5 mmol). Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og ble omrørt i 20 timer. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk til en farge-løs olje. Den resulterende olje ble oppløst i 10 ml H20 og 38,6 ml 1,0 M NaOH ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med 3 x 100 ml EtOAc og den organiske fase ble tørket (MgSO^). Etter filtrering ble løsningsmidlet fjernet i vakuum under

> dannelse av en tykk viskøs olje. Oljen ble oppløst i 150 ml isopropylalkohol og hydrazinmonohydrat (9,4 ml, 0,19 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 2 timer og THF ble tilsatt, hvilket resulterte i et mer filtrerbart fast

materiale. Filtrering ga 2,4 g (33 %) av tittelforbindelsen som et svakt hygroskopisk hvitt fast materiale. sm.p. 112 - 116° C; <1>H NMR (D20) 6 3,70 (d, J=5,0 Hz, 1H), 2,20 (m, 1 H), 0,97 (d, J = 7,0 Hz, 3 H), 0,94 (d, J = 7,0 Hz, 3H).

Eksempel 15: [1-(aminohydrazonomethyl)hydrazino]eddiksyre (Det henvises til Reaksjonsskjema 5).

Fremstilling av 9

Til en omrørt suspensjon av ethylhydrazinoacetat-hydroklorid (5,0 g, 32,34 mmol) og N-methylmorfolin (3,26 g, 32,34 mmol) ved 0° C ble det tilsatt fast N-(benzyloxy-carbonyloxy)succinimid (8,06 g, 32,34 mmol). Blandingen fikk oppvarmes til omgivende temperatur over natten og løsningsmid-let ble fjernet i vakuum. Residuet ble suspendert mellom EtOAc/H20, lagene ble ristet, de organiske bestanddeler ble fraskilt og tørket over Na2S04. Løsningsmidlet ble fjernet og residuet ble kromatografert via Si02 flashkromatografi (elueringsmiddel 4:1 hexan/EtOAc) under dannelse av 5,7 g (70 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale med smeltepunkt 95 - 97° C. Residuet i etterfølgende reaksjoner ble renset ved omkrystallisering fra EtOAc/hexan under dannelse av tittelforbindelsen i et ubetydelig lavere utbytte. <X>H NMR (CDC13) 6 1,27 (t, J = 7 Hz, 3 H), 3,66 (s, 2 H), 4,19 (q, J = 7 Hz, 2 H), 5,13 (s, 2 H), 6,77 (brs, 1 H), 7,33 (m, 5 H).

Fremstilling av 10

Til en omrørt suspensjon av Fremstilling 9 (3,0 g, 11,89 mmol) i 30 ml EtOH ved omgivende temperatur ble det tilsatt vandig NaOH (IN, 11,89 ml). Til blandingen ble det tilsatt ytterligere 10 ml H.,0 og blandingen ble omrørt i 1

time. (Blandingen ble en homogen løsning hvorpå et fast materiale utfeltes). Vandig HC1 (1 N, 11,89 ml) ble deretter tilsatt og ethanolen ble fjernet i vakuum og det vandige lag ble ekstrahert med 2 x 100 ml EtOAc. De organiske lag ble kombinert, ble tørket over Na2S04 og løsningsmidlet ble

fjernet under dannelse av 2,31 g (87 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale. Sm.p. 131 - 133° C.

,1H NMR (CD3OD) 6 3,59 (s, 2 H), 5,15 (s, 2 H), 7,37 (m, 5 H).

Fremstilling av 11

Til en omrørt suspensjon av Fremstilling 10 (25,44 g, 112,7 mmol) i 500 ml EtOAc ble det tilsatt trimethylsilyliso-thiocyanat (14,79 g, 112,7 mmol) og blandingen ble oppvarmet til forsiktig tilbakeløpskoking (80° C) over natten. Den resulterende løsning ble avkjølt til omgivende temperatur og ble vasket med 2 x 100 ml H20. Det organiske lag ble fraskilt, ble tørket over Na2S04 og løsningsmidlet ble fordampet til tørrhet. Det oljeaktige residuum ble oppløst i CH2C12 og fikk stå ved omgivende temperatur i 3 minutter under hvilket tidsrom et fast materiale ble dannet. Det faste materiale ble filtrert, ble vasket med 100 ml CH2C12 og ble tørket i vakuum. Det faste materiale ble oppslemmet i 300 ml varm EtOAc for å oppløse ethvert svovel-relatert biprodukt og ble triturert med 200 ml hexan under dannelse av 17,1 g av tittelforbindelsen (53 %) som et hvitt fast materiale, sm.p. 148 - 149° C. <1>H NMR (CD3OD) 6 5,20 (s, 2 H), 7,30 (m, 5 H), gjenværende CH2 var ikke observert.

Fremstilling av 12

Til en omrørt løsning av Fremstilling 11 (5,0 g, 17,64 mmol) i 150 ml EtOH ved omgivende temperatur ble det tilsatt methyljodid (2,73 g, 19,41 mmol) og den resulterende løsning ble omrørt over natten. Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum under dannelse av 7,50 g (kvantitativt) av tittelforbindelsen som et gult skum. <1>H NMR (CT>3OD) <5 2,69 (brs, 6 H), 2,84 (brs, 0,4H), 4,40-4,70 (m, 2H), 5,31 (brs, 2H), 7,46 (m, 5H).

Fremstilling av 13

Til en kraftig omrørt løsning av Fremstiling 12 (25,5 g, 6 0 mmol) i 100 ml H20 ved omgivende temperatur ble det tilsatt hydrazinhydrat (6,06 g, 120 mmol) langsomt inntil halvparten var blitt tilsatt. 10 ml H20 ble tilsatt til den faste masse som var blitt dannet, og det faste materiale ble brutt opp mekanisk med en spatel. Det gjenværende hydrazin ble deretter tilsatt og løsningen ble kraftig omrørt i 1 time. Den heterogene blanding ble lydbehandlet og omrøringen ble fortsatt inntil en tykk masse var blitt dannet. 50 ml EtOH ble tilsatt, det faste materiale ble filtrert, ble vasket med EtOH og tørket i vakuum under dannelse av 9,24 g (55 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale. Sm.p. 16 8 -

170° C. <X>H NMR (D20) 6 3,86 (brs, 1 H), 4,21 (brs, 1 H),

5,17 (s, 2 H) , 7,39 (s, 5 H) .

[1-(hydrazinoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre

Til en løsning av Fremstilling 13 (9,20 g, 32,71 mmol) i MeOH/H-O (400 ml, ~2:1 v/v) ble tilsatt 1,0 g 10 % Pd-C og blandingen ble hydrogenert ved 2,1 kg/cm 2 i 4 timer. Katalysatoren ble filtrert gjennom diatoméjord og 1,0 g 10 % Pd-C ble igjen tilsatt. Blandingen ble hydrogenert ved 2,1 kg/cm 2 i 2,5 timer og ble bestemt å være fullført ved TLC (elueringsmiddel 85:14:1 CH2/Cl2/MeOH/HC02H). Blandingen ble filtrert gjennom diatoméjord og løsningsmidlet ble fjernet til ca. 50 ml, ved hvilket tidspunkt et fast materiale utfeltes. Det faste materiale ble filtrert, ble vasket med en minimal mengde av H20 og ble tørket i vakuum under dannelse av 3,60 g (75 %) av tittelforbindelsen som et off-hvitt fast materiale, smeltepunkt 196 - 198° C. En andre masse ble erholdt ved konsentrering av filtratet inntil et fast materiale ble dannet. Filtrering ga 0,90 g (19 %, totalt utbytte: 94 %) av ytterligere materiale med identisk smeltepunkt. <1>H NMR (D20) 6 4,06 (s, 2 H).

Biologisk testing

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse ble testet med hensyn til deres evne til å redusere blodglukose og kroppsvekt som følger: KKAy-mus er gnagermodeller på NIDDM og fedme (Chang, Wyse, Copeland, Peterson og Ledbetter, 1986) . En forbehand-let blodprøve ble erholdt fra retro-orbital sinus og musene ble arrangert i grupper på 6 slik at det midlere forbehand-lingsblod-glukosenivå var det samme gjennomsnittlig i alle grupper. Testforbindelsene ble blandet i f6ret til en konsentrasjon på 0,5 % og musene fikk innta dietten ad libitum. Kontrollmus mottok usupplert får. På dag 0 ble musene veiet for å gi kontrollfor eller får supplert med testforbindelser. Etter 3 dagers forbruk av kontrollfor eller for supplementert med testforbindelsene ble en blodprøve erholdt for bestemmelse av glukosekonsentrasjonen og dyrene ble veiet for bestemmelse av vekttap. Forforbruk ble målt ved veiing av foret tilveiebragt ved begynnelsen av studien og forresten ved slutten av studiet. Forforbruket ble beregnet ved subtrahering av vekten av residuet fra vekten av de gitte for. Legemiddelinntaket ble beregnet ved multiplisering av forforbruket med 0,5 %. Under anvendelse av denne metode ble legemiddelinntaket bestemt til å være ca. 500 mg/kg/dag. Blodglukosedata er uttrykt som den midlere blodglukosekonsen-tras jon i testgruppen dividert med det midlere blodglukosenivå i kontrollgruppen (behandling/kontroll eller T/C). Forbindelser resulterende i T/C-verdier lik eller mindre enn 0,90 ble betraktet å være aktive anti-hyperglycemiske midler. Vekttapdata er uttrykt som prosents forandring i kroppsvekt. Forbindelser resulterende i en reduksjon på 1 % eller mer mindre enn kontrollen i kroppsvekt over tre dager ble betraktet å være aktive anti-fedmemidler.

Tabell 6

Dose-respons for reduksjon i hyperglycemia og fedme i KKAy-mus ved oral administrering av N-(dihydrazinomethylen)-glycin

KKAy-mus ble behandlet med N-(dihydrazinomethylen)-glycin som beskrevet ovenfor, bortsett fra at forbindelsen ble blandet i fåret til 0,03, 0,06, 0,10, 0,20, 0,30 og 0,40 % slik at de daglige angitte doser var tilnærmet 30, 60, 100, 200, 300 og 400 mg/kg. Kontrollmusene mottok usupplert får. For sammenligning med N-(dihydrazinomethylen)-glycin, 3-guanidinopropionsyre (3-GPA) ble administrert som en 0,50 % blanding i fåret (tilnærmet dose, 500 mg/kg/dag). Dataene er vist som den prosentvise forandring i blodglukosekonsentrasjonen og kroppsvekt på Dag 3 sammenlignet med Dag 1 av studien. Middelverdier + S.E.M. for n=6 mus/gruppe. Statistisk signifikans ble bestemt ved variansanalyse under anvendelse av JMP 3.0.2 program (SAS Institute). * f P<0,05 vs. Nil; 11, signifikant mindre enn 3-GPA (P<0,05).

Tabell 7

Forbedring av intraperitoneal glukosetoleranse

Glukosetoleranse ble målt i ikke-diabetiske C57BL-mus og diabetiske KKAy-mus. Dyrene ble dosert ved oral slange-foring med destillert vann (kontroll) eller 100 mg/kg N-(di-hydrazinomethylen) -glycin ble deretter fastet i 16-17 timer. Blodprøver for glukosebestemmelse ble erholdt fra retro-orbital sinus. Prøver ble erholdt umiddelbart før administrering av 2 g/kg glukose I.P. (Tid = 0) og 30, 60 og 90 minutter etter injeksjonen. Blodglukose ble bestemt under anvendelse av en glukoseautoanalysator. Dataene er uttrykt som middelverdier + S.E.M. for 5-6 mus pr. gruppe. Statistisk signifikans ble bestemt ved variansanalyser under anvendelse av JMP 3.0.2 program (SAS Institute). <*>, P<0,05 vs. Kontroll.

Tabell 8

Inhibering av ikke-enzymatisk glykosylering av protein Ikke-enzymatisk glykosylering av protein ble målt under anvendelse av etablerte metoder (Dolhofer og Wieland, 1979; Khatami, Suldan, David, Li, og Rockey, 1988). Inkorporering av 100 mM [14C]-D-glukose i humant serumalbumin ble bestemt ved oppløsning av humant serumalbumin (Sigma Chemical Co.), [14C]-glukose, og glukose i en fysiologisk saltvannsoppløsning og inkubering ved 37° C i 8 dager. Testforbindelsene ble tilsatt til løsningen til 19,1 mM. Glykosylering av albumin ble bestemt ved utfelling av proteinet med 1 volum 12 % trikloreddiksyre, sentrifugering og vasking av pelleten to ganger med 6 % trikloreddiksyre, og med sentrifugering etter hver vask. Den vaskede pellet ble oppløse-lig? jort, seintillasjonsmiddel ble tilsatt og inkorporeringen av radiomerket glukose ble bestemt ved væskescintillasjons-telling. Dataene er uttrykt som prosent av [14C]-glukose inkorporert i albumin (middelverdien av 2 målinger). Statistisk signifikans ble bestemt ved variansanalyser under anvendelse av JMP 3.0.2 programvare (SAS Institute).

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved formel I eller II hvori AG er (a) N-aminoguanidin, (b) N,N'-diaminoguanidin, eller (c) N,N',N"-triaminoguanidin; hvori n er et hele tall fra 1-5; hvori R<1> er (a) hydrogen, (b) fenyl, (c) C^Cg-alkyl, eller (d) Ci-Cg-alkyl-fenyl; og hvori R<2> er (a) fenyl, (b) C^-C^-alkyl, eller (c) C^Cg-alkyl-fenyl, med følgende forbehold: (a) i formel I, når n er 2 eller 3, er Rj forskjellig fra hydrogen; (b) i formel I, når n er én, er Rx forskjellig fra methyl; (c) i formel II, når R2 er ethyl eller fenyl, er Rx forskjellig fra hydrogen; og (d) forbindelsen av formel I er forskjellig fra N-(hydrazinometyl)glycin; og (e) i formel II, når AG er N-aminoguanidin og R2 er benzyl, er Rx forskjellig fra hydrogen.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre, dens monohydrid, og dens fenylmethylester-monohydroklorid, a- [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]benzenpropansyremonohydrat, [1-(aminoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre-monohydrobromid, N-(hydrazinoiminomethyl)-p-alanin, N-(dihydrazinomethylen)glycin, [2-(hydrazinoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre, N-(dihydrazinomethylen)-P-alanin, N-(dihydrazinomethylen)-L-alanin, racemisk HN=C(NH2) -NH-NH-CH (CH3) -COOH, N-(dihydrazinomethylen)-d-alanin, og N-(dihydrazinomethylen)valin.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra [2-(aminoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre og dens monohydroklorid, N-(dihydrazinomethylen)glycin, [2-(hydrazinoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre, og [1-(hydrazinoiminomethyl)hydrazino]eddiksyre.

4. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for behandling eller forhindring av ikke-insulin-avhengig diabetes mellitus eller fedme, hvori forbindelsen er av formel III hvori R<3> er H, methyl, ethyl, benzyl eller n-hexyl.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvori forbindelsen er valgt fra [(aminoiminomethyl)hydrazono]eddiksyre-monohydroklorid, 2-[(aminoiminomethyl)hydrazono]propansyre-monohydroklorid, 2-[(aminoiminomethyl)hydrazono]butansyre-monohydroklorid, N-(hydrazinoiminomethyl)glycin og dets hydroklorid (2:1), a-[(aminoiminomethyl)hydrazono]benzenpropansyre, og 2-[(aminoiminomethyl)hydrazono]oktansyre.