NO161601B

NO161601B - PROCEDURE FOR PREPARING A GLYCORELATED ANTIGEN

Info

Publication number: NO161601B
Application number: NO822215A
Authority: NO
Inventors: Masakazu Adachi
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1981-10-01
Filing date: 1982-06-29
Publication date: 1989-05-29
Also published as: PT75148A; AT382080B; DE3249568A1; DK292182A; IT1189305B; FR2513882B1; FI822325A0; FI77157B; CH655661B; CH655660B; PT75148B; DE3249568C2; NL8202638A; AU554858B2; NO161601C; ATA363782A; MX7437E; CA1195269A; IL66270A0; ATA354585A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et glykolrelatert antigen (GRA) som sensitiverer lymfocytter til kreftcellecytotoksiske lymfocytter, og som også i seg selv kan anvendes som et anti-kreftmiddel, og det karakteristiske ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at GRA isoleres fra humane eller muse-kreftcellemembrankomponenter ved affinitetskromatografering på en peanøttlektin-(PNA)- og/eller Dolichos bønneagglutinin-lektin-(DBA)-holdig uoppløselig bærer. The present invention relates to a method for producing a glycol-related antigen (GRA) which sensitizes lymphocytes to cancer cell cytotoxic lymphocytes, and which can also be used in itself as an anti-cancer agent, and the characteristic of the method according to the invention is that GRA is isolated from human or mouse cancer cell membrane components by affinity chromatography on a peanut lectin (PNA)- and/or Dolichos bean agglutinin-lectin (DBA)-containing insoluble support.

Det er kjent at immunrespons-effektorceller, spesielt T-lymfocytter spiller en hovedrolle i celle-formidlet immunrespons, bevirker avstøtning av podninger som skyldes fremmedcelle-antigener, men fremviser ikke noen særlig eller meget begrenset inhibering mot kreftceller. Kreftcellene blir således ikke ødelagt og formerer seg in vivo og fører endelig til døden for den kreftbærende vertsorganisme. It is known that immune response effector cells, especially T-lymphocytes play a major role in cell-mediated immune response, cause rejection of grafts caused by foreign cell antigens, but do not exhibit any particular or very limited inhibition against cancer cells. The cancer cells are thus not destroyed and multiply in vivo and ultimately lead to the death of the cancer-bearing host organism.

Den mekanisme som er ansvarlig for å skille mellom selv og ikke-selv er ikke fullstendig klar og forskjellige under-søkelser har vært foretatt for å skaffe innsikt i naturen av den materialbasis som er involvert i dette system, f. eks celleoverflatemarkører på mus-leukemia-celler eller embryo-nale karcinom-celler under anvendelse av lektiner som f. eks Dolichos bønneagglutinin (DBA) og peanøtt-agglutinin (PNA) som beskrevet i Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2) 448 - 455 The mechanism responsible for distinguishing between self and non-self is not completely clear and various investigations have been carried out to gain insight into the nature of the material basis involved in this system, e.g. cell surface markers on mouse leukemia cells or embryonal carcinoma cells using lectins such as Dolichos bean agglutinin (DBA) and peanut agglutinin (PNA) as described in Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2) 448 - 455

(1979), Ibid. 96 (4) 1547 - 1553 (1980), J. Biochem. 89 473 - 481 (1981) og Cell 18 183 - 191 (september 1979). (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 473-481 (1981) and Cell 18 183-191 (September 1979).

Såvidt vites har det imidlertid ikke vært noen særlig forsøk på å tilveiebringe nye lymfocytter som kan bekjempe kreftceller spesifikt og også tilveiebringe anti-kreftmidler under anvendelse av immunrespons i lymfocytter. However, as far as is known, there has been no particular attempt to provide new lymphocytes that can fight cancer cells specifically and also provide anti-cancer agents using the immune response in lymphocytes.

Som et resultat av omfattende studier vedrørende immunrespons for vertsorganismen til kreftceller og dens anvendelse for behandling av kreft, er det nå funnet at i et kreftcelle-spesifikt antigen som ikke finnes i differensierte normale celler, er der GRA som virker som et immunogen for vertsorganismen og har meget høy immunogenisitet som bevirker en immunrepons som er spesifikk for kreftcellene. Det er videre funnet at når GRA anvendes for sensitivering av lymfocytter kan det oppnås kreftcellecytotoksiske lymfocytter som virker spesifikt på kreftceller inneholdende GRA og hvis de krefcellecytotoksiske lymfocytter tilføres verten, gjen-kjenner de GRA og virker på kreftcellene inneholdende GRA og ødelegger dem og de fremviser således en utmerket virkning ved behandling og forhindring av kreft. As a result of extensive studies concerning the immune response of the host organism to cancer cells and its application to the treatment of cancer, it has now been found that in a cancer cell-specific antigen that is not found in differentiated normal cells, there is GRA which acts as an immunogen for the host organism and has very high immunogenicity, which causes an immune response that is specific to the cancer cells. It has further been found that when GRA is used to sensitize lymphocytes, cancer cell cytotoxic lymphocytes can be obtained which act specifically on cancer cells containing GRA and if the cancer cell cytotoxic lymphocytes are added to the host, they recognize GRA and act on the cancer cells containing GRA and destroy them and thus exhibit an excellent effect in the treatment and prevention of cancer.

Kort beskrivelse av tegningene Brief description of the drawings

Fig. 1 er' et mikrofotografi av Daudi-kreftceller. Fig. 1 is a photomicrograph of Daudi cancer cells.

Fig. 2 er et mikrofotografi som illustrerer dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 1. Fig. 2 is a photomicrograph illustrating the formation of plaques of GRA-1-K-T in the cancer cells of Fig. 1.

Fig. 3 er et mikrofotografi av KATO-III kreftceller. Fig. 3 is a photomicrograph of KATO-III cancer cells.

Fig. 4 er et mikrofotografi som illustrerer dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 3. Fig. 4 is a photomicrograph illustrating the formation of plaques of GRA-1-K-T in the cancer cells of Fig. 3.

Fig. 5 er et mikrofotografi av BT-I kreftcelle. Fig. 5 is a photomicrograph of BT-I cancer cell.

Fig. 6 er et mikrofotografi som viser dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 5. Fig. 6 is a photomicrograph showing the formation of plaques of GRA-1-K-T in the cancer cells of Fig. 5.

Fig. 7 er et mikrofotografi av MKN-45 kreftceller. Fig. 7 is a photomicrograph of MKN-45 cancer cells.

Fig. 8 er et mikrofotografi som viser dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftceller i fig. 7. Fig. 8 is a photomicrograph showing the formation of plaques by GRA-1-K-T in cancer cells in Fig. 7.

Fig. 9 er et mikrofotografi av MOLT kreftceller. Fig. 9 is a photomicrograph of MOLT cancer cells.

Fig. 10 er et mikrofotografi som viser dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 9. Fig. 11 er et mikrofotografi av BT-1 behandlet med en blanding av usensitiverte human periferale blod-lymfocytter. Fig. 12 og 13 er hver et mikrofotografi av kreftcellevevet i kreftbærende mus tilført GRA-M-1-K. Fig. 14 er et mikrofotografi som viser tilstanden for kreft i en kreft-bærende musegruppe som tilføres GRA-M-1. Fig. 15 er et mikrofotografi som viser krefttilstanden i en kreftbærende musegruppe som ikke tilføres GRA-M-1. Fig. 16 er et mikrofotografi som viser kreftcellevevet i en kreftbærende musegruppe som ikke tilføres GRA-M-1. Fig. 17 er et mikrofotografi av kreftcelle-vevet av gruppen som tilføres GRA-M-1. Fig. 18 viser et SDS gel-elektroforesediagram av GRA under anvendelse av proteinfarging ved hjelp av C.B.B.-metoden. Fig. 19-21 viser SDS gel-elektroforesediagrammer av slik GRA under anvendelse av sukkerfarging ved hjelp av PAS-metoden. Fig. 22 er en skjematisk illustrasjon av resultatene av SDS gel-elektroforesediagram av GRA under anvendelse av proteinfarging ved hjelp av C.B.B.-metoden, og Fig. 23 representerer en grafisk fremstilling som viser tumor-vekst-takten i C3H/HE mus transplantert med X5563 immune muse-miltceller og X5563-celler. Fig. 10 is a photomicrograph showing the formation of plaques of GRA-1-K-T in the cancer cells of Fig. 9. Fig. 11 is a photomicrograph of BT-1 treated with a mixture of unsensitized human peripheral blood lymphocytes. Figures 12 and 13 are each a photomicrograph of the cancer cell tissue in cancer-bearing mice administered GRA-M-1-K. Fig. 14 is a photomicrograph showing the state of cancer in a cancer-bearing group of mice administered GRA-M-1. Fig. 15 is a photomicrograph showing the cancer state in a cancer-bearing mouse group not supplied with GRA-M-1. Fig. 16 is a photomicrograph showing the cancer cell tissue in a cancer-bearing mouse group not supplied with GRA-M-1. Fig. 17 is a photomicrograph of the cancer cell tissue of the group administered GRA-M-1. Fig. 18 shows an SDS gel electrophoresis diagram of GRA using protein staining by the C.B.B. method. Figures 19-21 show SDS gel electrophoresis diagrams of such GRA using sugar staining by the PAS method. Fig. 22 is a schematic illustration of the results of SDS gel electrophoresis plot of GRA using protein staining by the C.B.B. method, and Fig. 23 represents a graph showing the tumor growth rate in C3H/HE mice transplanted with X5563 immune mouse spleen cells and X5563 cells.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen Detailed description of the invention

Kreftcellecytotoksiske lymfocytter kan fremstilles f. eks ved hjelp av en metode hvor GRA anvendes for å sensitivere lymfocytter. Cancer cell cytotoxic lymphocytes can be produced, for example, using a method where GRA is used to sensitize lymphocytes.

GRA anvendt i denne metode kan oppnås fra humane kreftceller inneholdende GRA, fra mennesker og dyr, særlig mus, f. eks dyrkede kreftceller, transplanterte kreftceller, spontant-forekommende kreftceller, kjemisk substans- eller virus-induserte kreftceller, og kreftceller avledet fra operert vev, ved hjelp av den følgende metode. GRA used in this method can be obtained from human cancer cells containing GRA, from humans and animals, especially mice, e.g. cultured cancer cells, transplanted cancer cells, spontaneously-occurring cancer cells, chemical substance- or virus-induced cancer cells, and cancer cells derived from operated tissue , using the following method.

Cellemembrankomponenter separeres fra kreftceller som beskrevet i det foregående og behandles med et lektin som kombinerer spesifikt med en terminal galaktose eller et termianalt N-acetylgalaktosamin, hvorved GRA kombineres med lektinet og lett kan separeres. Cell membrane components are separated from cancer cells as described above and treated with a lectin that combines specifically with a terminal galactose or a terminal N-acetylgalactosamine, whereby GRA combines with the lectin and can be easily separated.

Eksempel på galaktosebindende lektin inkluderer peanøttlektin (PNA), (Se J.B.C. 250, 8518 - 8523 (1975), Z. Immunitaets-forsch, 138, 423 - 433 (1969), Br. J. Exp. Pathol, 27, 228 - 236 (1946), Proe. Nath. Acad. Sei. USA, 75, No. 5, 2215 - 2219 (1978), Biochemistry, 13, 196 - 204 (1974), og Carbo-hydrate Research, 51, 107 - 118 (1976)). Eksempler på N-acetylgalaktosamin-bindende lektin inkluderer Dolichos-bønne (Dolichos biflorus) agglutinin (DBA). Examples of galactose-binding lectin include peanut lectin (PNA), (See J.B.C. 250, 8518-8523 (1975), Z. Immunitaets-forsch, 138, 423-433 (1969), Br. J. Exp. Pathol, 27, 228-236 (1946), Proe. Nath. Acad. Sei. USA, 75, No. 5, 2215-2219 (1978), Biochemistry, 13, 196-204 (1974), and Carbo-hydrate Research, 51, 107-118 ( 1976)). Examples of N-acetylgalactosamine-binding lectin include Dolichos bean (Dolichos biflorus) agglutinin (DBA).

Separeringen av kreftcellemembrankomponentene kan oppnås ved hjelp av kjent teknikk som f. eks homogeniseringsmetoden og en oppløsningsmetode under anvendelse av et oppløsnings-middel. Det er mer fordelaktig å anvende en metode hvor kreftceller homogeniserer i fysiologisk saltløsning eller i en passende buffer, en del av det utfelte samles ved hjelp av en teknikk som f. eks sentrifugalseparering og oppløses i fysiologisk saltløsning eller en buffer ved anvendelse av er oppløsningsmiddel, og supernatantdelen separeres ved hjelp av en teknikk f. eks sentrifugalseparering. Oppløsningsmidler som kan anvendes inkluderer overflateaktive midler som er generelt kjent å kunne oppløse cellemembranene, som f. eks ikke-ioniske overflateaktive midler, f. eks "TRITON X-100", "NP-40" digitoni og urea, samt anioniske overflateaktive midler, f. eks natriumdodecylsulfonat (SDS). The separation of the cancer cell membrane components can be achieved using known techniques such as, for example, the homogenization method and a dissolution method using a solvent. It is more advantageous to use a method where cancer cells are homogenized in physiological salt solution or in a suitable buffer, part of the precipitate is collected using a technique such as centrifugal separation and dissolved in physiological salt solution or a buffer using is solvent, and the supernatant part is separated using a technique, e.g. centrifugal separation. Solvents that can be used include surfactants that are generally known to dissolve cell membranes, such as non-ionic surfactants, eg "TRITON X-100", "NP-40" digitoni and urea, as well as anionic surfactants, eg sodium dodecyl sulphonate (SDS).

Fra de således oppnådde kreftcellemembrankomponenter isoleres From the thus obtained cancer cell membrane components are isolated

da GRA som er i stand til å kombinere med lektinet ved anvendelse av affinitetskromatografering under anvendelse av en kolonnebærer inneholdende lektin. Kolonnebæreren kan lett fremstilles ved immobilisering av lektin på en uoppløselig bærer. Slik immobilisering av lektin på en uoppløselig bærer kan gjennomføres ved kjente metoder som anvendes konven- then GRA capable of combining with the lectin using affinity chromatography using a column support containing lectin. The column support can be easily prepared by immobilizing lectin on an insoluble support. Such immobilization of lectin on an insoluble support can be carried out by known methods which are used conventionally

sjonelt ved immobilisering av biosubstanser. Av disse metoder foretrekkes anvendelse av en cyanbromid-aktiverings-poly-sakkaridmetode og en immobiliseringsmetode under anvendelse av N-hydroksysuccinimidestere. Cyanbromid-aktiverings-polysakkaridmetoden er en metode hvori en uoppløselig bærer behandles med cyanbromid og det aktiverte produkt oppnådd på tionally when immobilizing biosubstances. Of these methods, the use of a cyanobromide activation polysaccharide method and an immobilization method using N-hydroxysuccinimide esters are preferred. The cyanobromide activation polysaccharide method is a method in which an insoluble support is treated with cyanobromide and the activated product obtained on

denne måte underkastes en koblingsreaksjon med lektin under milde betingelser for immobilisering av lektinet. Ved behandling av den uoppløselige bærer med cyanbromid, anvendes f. eks basiske forbindelser som natriumhydroksyd og natriumhydrogenkarbonat for å innstille pH fra 7,5 til 12, og bæreren behandles i et løsningsmiddel som f. eks vann, in this way is subjected to a coupling reaction with lectin under mild conditions for immobilization of the lectin. When treating the insoluble carrier with cyanogen bromide, basic compounds such as sodium hydroxide and sodium hydrogen carbonate are used, for example, to adjust the pH from 7.5 to 12, and the carrier is treated in a solvent such as water,

acetonitril, eller en buffer holdt ved 7,5 til 12, f. eks en 0,1 M natriumhydrogenkarbonat-buffer (pH omtrent 8,7) og en 0,01 M fosfatbuffer (pH omtrent 7,7) ved romtemperatur i 1 til 12 minutter. Vanligvis er den mengde cyanbromid som anvendes foretrukket tilsvarende mengden av den uoppløselige bærer. acetonitrile, or a buffer maintained at 7.5 to 12, e.g., a 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH about 8.7) and a 0.01 M phosphate buffer (pH about 7.7) at room temperature for 1 to 12 minutes. Generally, the amount of cyanogen bromide used preferably corresponds to the amount of the insoluble carrier.

En hvilken som helst kjent uoppløselig bærer som har lav ikke-spesifikk adsorbsjon til alle biosubstanser, har høy porøsitet, inneholder en funksjonell gruppe som er i stand til immobilisering av biosubstanser under milde betingelser, Any known insoluble carrier that has low non-specific adsorption to all biosubstances, has high porosity, contains a functional group capable of immobilization of biosubstances under mild conditions,

og er kjemisk og fysikalsk tilstrekkelig stabil kan anvendes ved oppfinnelsen. Uoppløselige bærere som kan anvendes inkluderer en bærer fremstilt av cellulose, f. eks amino-etylcellulose, karboksymetylcellulose, bromacetylcellulose og p-anilin-cellulose, en bærer av fornettet dekstran, f. eks "Sephadex" og "CM-Sephadex" og en bærer av agarose, f. eks "Sepharose 2B", "Sepharose 4B" og "Sepharose 6B". and is chemically and physically sufficiently stable can be used in the invention. Insoluble carriers which can be used include a carrier made of cellulose, eg amino-ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, bromoacetyl cellulose and p-aniline cellulose, a carrier of cross-linked dextran, eg "Sephadex" and "CM-Sephadex" and a carrier of agarose, e.g. "Sepharose 2B", "Sepharose 4B" and "Sepharose 6B".

Ved koblingsreaksjonen av den cyanbromid-aktiverte bærer som oppnådd ovenfor med lektin anvendes den cyanbromid-aktiverte bærer som i en mengde på fra 30 til 80 ganger lektinmengden og de omsettes i et passende løsningsmiddel som f. eks en 0,01 mol/l vandig løsning av natriumhydrogen-karbonat (inneholdende 0,5 mol/l natriumklorid, pH 8,4) ved en temperatur på fra 0 til 40°C, foretrukket fra 2 til 8°C i en periode på fra 10 til 20 timer. På denne måte kan det fremstilles en bærer for affinitetskromatografering inneholdende lektin. In the coupling reaction of the cyanobromide-activated carrier obtained above with lectin, the cyanobromide-activated carrier is used in an amount of from 30 to 80 times the amount of lectin and they are reacted in a suitable solvent such as, for example, a 0.01 mol/l aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (containing 0.5 mol/l sodium chloride, pH 8.4) at a temperature of from 0 to 40°C, preferably from 2 to 8°C for a period of from 10 to 20 hours. In this way, a carrier for affinity chromatography containing lectin can be prepared.

Ved affinitetskromatografering under anvendelse av den lektinholdige bærer som fremstilt ovenfor kombinerer det ønskede GRA med lektinet inneholdt i bæreren og innesperres i kolonnen. Deretter kan substanser som er i stand til å kombinere med f. eks lektin føres gjennom kolonnen for å gjennomføre en utvekslingsreaksjon, eller alternativt føres en adsorbsjonsseparator (eluerende oppløsning), f. eks en saltoppløsning med høy konsentrasjon, en vandig oppløsning av kaliumtiocyanat eller en nitratbuffer gjennom kolonnen for dissosiering og erholdelse av ønsket GRA. In affinity chromatography using the lectin-containing support as prepared above, the desired GRA combines with the lectin contained in the support and is trapped in the column. Subsequently, substances capable of combining with e.g. lectin can be passed through the column to carry out an exchange reaction, or alternatively an adsorption separator (eluting solution) can be passed, e.g. a high concentration salt solution, an aqueous solution of potassium thiocyanate or a nitrate buffer through the column for dissociation and obtaining the desired GRA.

Ved utvekslingsreaksjonen inkluderer eksempler på substanser som er i stand til å kombinere med lektin når en bærer for affinitetskromatografering inneholdende galaktosebindende lektin anvendes, de substanser som kan kombinere med et terminalt galaktosekombinerende lektin, f. eks galaktose, disakkarider inneholdende en terminal galaktose og oligosakkarider inneholdende en terminal galaktose, og eksempler på substanser i stand til å kombinere med lektin når en bærer for affinitetskromatografering inneholdende N-acetylgalaktosamin-bindende lektin anvendes inkluderer substanser som kan kombinere med et terminalt N-acetylgalaktosamin-kombinerende lektin, f. eks N-acetylgalaktosamin, disakkarider inneholdende et terminalt N-acetylgalaktosamin og oligosakkarider inneholdende et terminalt N-acetylgalaktosamin. In the exchange reaction, examples of substances capable of combining with lectin when a carrier for affinity chromatography containing galactose-binding lectin is used include those substances capable of combining with a terminal galactose-combining lectin, e.g. galactose, disaccharides containing a terminal galactose and oligosaccharides containing a terminal galactose, and examples of substances capable of combining with lectin when a support for affinity chromatography containing N-acetylgalactosamine-binding lectin is used include substances capable of combining with a terminal N-acetylgalactosamine-combining lectin, e.g. N-acetylgalactosamine, disaccharides containing a terminal N-acetylgalactosamine and oligosaccharides containing a terminal N-acetylgalactosamine.

Det således oppnådde GRA inneholder glykoprotein inneholdende galaktose og/eller N-acetylgalaktosamin-terminus, glykolipid og/eller sakkarid. The GRA thus obtained contains glycoprotein containing galactose and/or N-acetylgalactosamine terminus, glycolipid and/or saccharide.

Det således fremstilte GRA kan frysetørres om ønsket og ytterligere renses under anvendelse av ordinære separasjons-metoder. F. eks kan de GRA-preparater som isoleres med et galaktose-bindende lektin underkastes en separasjonsmetode under anvendelse av et N-acetylgalaktosamin-kombinerende lektin, og de preparater som isoleres med et N-acetylgalaktosamin-kombinerende lektin kan behandles ved hjelp av en separasjonsmetode under anvendelse av et galaktosebindende lektin. The GRA produced in this way can be freeze-dried if desired and further purified using ordinary separation methods. For example, the GRA preparations isolated with a galactose-binding lectin can be subjected to a separation method using an N-acetylgalactosamine-combining lectin, and the preparations isolated with an N-acetylgalactosamine-combining lectin can be processed using a separation method using a galactose-binding lectin.

Lymfocytter som anvendt heri er ikke kritiske, og hvilke som helst lymfocytter fra normale eller kreft-bærende mennesker eller dyr kan anvendes. Eksempler inkluderer slike lymfocytter som oppnås fra perifert blod, benmarg, lymfeknuter, milt, mandler og thymus. Disse lymfocytter isoleres ved hjelp av fysikalske eller kjemiske metoder, en overflatemembran-metode eller lignende. Lymphocytes used herein are not critical, and any lymphocytes from normal or cancer-bearing humans or animals may be used. Examples include such lymphocytes obtained from peripheral blood, bone marrow, lymph nodes, spleen, tonsils and thymus. These lymphocytes are isolated using physical or chemical methods, a surface membrane method or the like.

Sensitivering av lymfocytter med GRA gjennomføres ved dyrking av lymfocytter på et dyrkingsmedium inneholdende GRA i en periode på fra ltillO døgn, foretrukket fra 2til7 døgn. Sensitization of lymphocytes with GRA is carried out by cultivating lymphocytes on a culture medium containing GRA for a period of from 1 to 0 days, preferably from 2 to 7 days.

Som dyrkingsmedia for bruk ved sensitiveringen av lymfocytter kan anvendes foreskjellige vanlige næringsmedia som kon-vensjonelt anvendes ved celledyrking. Foretrukne eksempler inkluderer et RPMI 1640 medium, en Eagle MEM kultur, etc. med human serum, føtalt kalveserum (FCS), kalveserum, hesteserum eller lignende tilsatt dertil. Mengden av GRA som tilsettes til dyrkingen er vanligvis fra 1 til 1.000 ng/ml og foretrukket fra 5 til 500 ng/ml, beregnet som en mengde av sukker pr 1 x 10<6>/ml lymfocytt. As culture media for use in the sensitization of lymphocytes, various normal nutrient media can be used which are conventionally used in cell culture. Preferred examples include an RPMI 1640 medium, an Eagle MEM culture, etc. with human serum, fetal calf serum (FCS), calf serum, horse serum or the like added thereto. The amount of GRA added to the culture is usually from 1 to 1,000 ng/ml and preferably from 5 to 500 ng/ml, calculated as an amount of sugar per 1 x 10<6>/ml lymphocyte.

Dyrkingen gjennomføres ved hjelp av den vanlige metode, Cultivation is carried out using the usual method,

f. eks ved pH omtrent 7,2 og en temperatur på omtrent 37°C. for example at a pH of approximately 7.2 and a temperature of approximately 37°C.

De kreftcellecytotoksiske lymfocytter er hovedsakelig normale lymfocytter og har en GRA-spesifikk cellebekjempende aktivitet. F. eks har GRA-1-K-T, som er en av de kreftcellecytotoksiske lymfocytter, egenskaper felles med humane perifere blod T-celler og viser en cellebekjempende aktivitet som er spesifikk mot kreftceller inneholdende GRA, som er vist i det eksempel som er beskrevet senere. The cancer cell cytotoxic lymphocytes are mainly normal lymphocytes and have a GRA-specific cell-fighting activity. For example, GRA-1-K-T, which is one of the cancer cell cytotoxic lymphocytes, has properties in common with human peripheral blood T cells and shows a cell-fighting activity that is specific against cancer cells containing GRA, as shown in the example described later .

Typiske eksempler på kreftcellecytotoksiske lymfocytter er GRA-1-K-T og GRA-M-1. Typical examples of cancer cell cytotoxic lymphocytes are GRA-1-K-T and GRA-M-1.

De kreftcellecytotoksiske lymfocytter kan formeres ubegrenset på det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium inneholdende en T-cellevekstfaktor (TCGF, IL-2). Den selektive dyrking av kloning av de kreftcellecytotoksiske lymfocytter kan gjennomføres ved den konvensjonelle ultra-fortynningsmetode, og lymfocyttene kan lagres stabilt over et langt tidsrom, f. eks i flytende nitrogen. The cancer cell cytotoxic lymphocytes can be multiplied indefinitely on the culture medium described above containing a T-cell growth factor (TCGF, IL-2). The selective cultivation of cloning of the cancer cell cytotoxic lymphocytes can be carried out by the conventional ultra-dilution method, and the lymphocytes can be stored stably over a long period of time, e.g. in liquid nitrogen.

GRA fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse kan anvendes separat som en aktiv bestanddel og kan dertil anvendes i kombinasjon med andre anti-bakterielle midler og kreft-inhiberende midler. Kreftinhiberende midler inneholdende GRA som en aktiv bestanddel kan ha en hvilken som helst form bare de er i den tilstand at GRA inneholdes i effektive mengder. Vanligvis tilføres midlet intravenøst, subkutant, intradermalt eller intramuskulært som en opp-løsning, suspensjon eller emulsjon. I tillegg kan det leveres som et tørt produkt som kan gjøres flytende ved tilsetning av en passende bærer før bruk. Disse flytende midler kan inneholde et suspensjonsmiddel, f. eks metyl-cellulose, et emulgeringsmiddel, f. eks lecitin, konser-veringsmidler som f. eks metyl-p-hydroksybenzoat, et stabiliseringsmiddel som ikke utøver som sådant skadelig innvirkning på den immuniserende funksjon av mennesker eller dyr, en buffer, og lignende. GRA produced in accordance with the present invention can be used separately as an active ingredient and can also be used in combination with other anti-bacterial agents and cancer-inhibiting agents. Cancer inhibiting agents containing GRA as an active ingredient can have any form as long as they are in the condition that GRA is contained in effective amounts. Usually, the agent is administered intravenously, subcutaneously, intradermally or intramuscularly as a solution, suspension or emulsion. In addition, it can be supplied as a dry product which can be liquefied by the addition of a suitable carrier before use. These liquid agents may contain a suspending agent, e.g. methyl cellulose, an emulsifier, e.g. lecithin, preservatives such as e.g. methyl p-hydroxybenzoate, a stabilizer which does not as such exert a harmful effect on the immunizing function of people or animals, a buffer, and the like.

Vandige bærere som kan anvendes inkluderer fysiologisk saltløsning, og ikke vandige bærere som kan anvendes inkluderer vegetabilsk olje, f. eks sesamolje, mineralolje som f. eks paraffin, animalsk olje som f. eks squalen. og propylenglykol. I tillegg, for immunologisk forbedring, kan passende tilsetningsmidler innlemmes. Tilsetningsmidler, som kan anvendes inkluderer "Freunds" komplette tilsetningsmidler, saponin for dyr og aluminiumhydroksyd for mennesker. Aqueous carriers that can be used include physiological salt solution, and non-aqueous carriers that can be used include vegetable oil, eg sesame oil, mineral oil such as paraffin, animal oil such as squalene. and propylene glycol. In addition, for immunological enhancement, suitable additives may be incorporated. Additives which may be used include "Freund's" complete additives, saponin for animals and aluminum hydroxide for humans.

Det kreftinhiberende middel inneholdende GRA kan tilføres en gang eller gjentatte ganger over en lang tidsperiode til kreftpasienter for behandling av kreft, eller kan tilføres personer som er i ferd med å få kreft for prevensjon av denne. The cancer-inhibiting agent containing GRA can be administered once or repeatedly over a long period of time to cancer patients for the treatment of cancer, or can be administered to people who are about to get cancer for the prevention of this.

Da LD50 (mus, intraperitonealt) av GRA er minst 500 mg/kg beregnet som en mengde av sukker, har det kreftinhiberende middel lav giftighet og kan derfor tilføres innefor vide doseringsområder. Selv om konsentrasjonen av GRA i det kreftinhiberende middel ikke er kritisk, foretrekkes vanligvis en konsentrasjon i området 0,001till00 ug/ml beregnet som en mengde sukker. Med hensyn til dosen av det kreftinhiberende middel foretrekkes det vanligvis at dette tilsettes i en mengde på 0,001 til 1.000 ug/kg/døgn, samtidig eller i flere porsjoner, selv om dette varierer avhengig av graden av sykdom, alder og kjønn av pasienten. As the LD50 (mouse, intraperitoneal) of GRA is at least 500 mg/kg calculated as a quantity of sugar, the cancer-inhibiting agent has low toxicity and can therefore be administered within wide dosage ranges. Although the concentration of GRA in the anticancer agent is not critical, a concentration in the range of 0.001 to 00 µg/ml calculated as an amount of sugar is usually preferred. With regard to the dose of the anticancer agent, it is usually preferred that this be added in an amount of 0.001 to 1,000 ug/kg/day, simultaneously or in several portions, although this varies depending on the degree of disease, age and sex of the patient.

Gra kan anvendes for sensitivering av lymfocytter til kreftcellecytotoksiske lymfocytter. Slike kreftcellecytotoksiske lymfocytter i form av et kreftinhiberende middel anvendes foretrukket som en injiserbar oppløsning i kombinasjon med bærere som anvendes ved fremstilling av slike blodmedisiner. Bærere som anvendt heri er ikke kritiske, men bærere med en tonisitet tilsvarende blodets foretrekkes. Spesielt foretrekkes fysiologisk saltløsning. Ved fremstilling av midlet foretrekkes det at de kreftcellecytotoksiske lymfocytter vaskes tilstrekkelig med fysiologisk saltløsning eller lignende for å fjerne det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium og deretter bringes til å flyte i en bærer. Gra can be used to sensitize lymphocytes to cancer cell cytotoxic lymphocytes. Such cancer cell cytotoxic lymphocytes in the form of a cancer-inhibiting agent are preferably used as an injectable solution in combination with carriers used in the preparation of such blood medicines. Carriers used herein are not critical, but carriers with a tonicity similar to that of blood are preferred. Physiological saline is particularly preferred. When preparing the agent, it is preferred that the cancer cell cytotoxic lymphocytes are sufficiently washed with physiological salt solution or the like to remove the above-described culture medium and then floated in a carrier.

Konsentrasjonen av kreftcellecytotoksiske lymfocytter i midlet er ikke spesifikt begrenset, men er foretrukket fra IO<5> til 10^ pr ml. Når de kreftcellecytotoksiske lymfocytter tilføres intraperitonealt i en dose på 10^ pr mus, iakttas ingen giftighet. Selv om dosen av det kreftinhiberende middel fremstilt på basis av de kreftcellecytotoksiske lymfocytter varierer avhengig av graden av sykdom, alder og kjønn av pasienten, foretrekkes det vanligvis at midlet tilføres i en dose på lO^tillO^-^/kg/døgn i en porsjon eller i oppdelte porsjoner. The concentration of cancer cell cytotoxic lymphocytes in the agent is not specifically limited, but is preferably from 10<5> to 10^ per ml. When the cancer cell cytotoxic lymphocytes are administered intraperitoneally in a dose of 10^ per mouse, no toxicity is observed. Although the dose of the cancer-inhibiting agent prepared on the basis of the cancer cell cytotoxic lymphocytes varies depending on the degree of disease, age and gender of the patient, it is generally preferred that the agent be administered at a dose of 10^ to 0^-^/kg/day in one portion or in divided portions.

De følgende eksempler, undereksempeler, testeksempler og referanstest gis for å illustrere oppfinnelsen mer detaljert. The following examples, sub-examples, test examples and reference test are given to illustrate the invention in more detail.

UNDEREKSEMPEL 1 SUB-EXAMPLE 1

Lokalitet av GRA Location of GRA

(1) - A Fremstilling av FITC-merket lektin (PNA-FITC). (1) - A Preparation of FITC-labeled lectin (PNA-FITC).

10 mg peanøttlektin (PNA), ble oppløst i 2 ml av en 0,01 M fosfatbuffer inneholdende 0,85 % NaCl (pH = 7,2). I 1 ml av en 0,5 M hydrogenkarbonatbuffer (pH = 9,0) ble oppløst 2 mg FITC, og en 0,5 ml porsjon av den resulterende oppløsning ble tilsatt til den ovenfor fremstilte PNA-buffer. Blandingen ble så omrørt ved romtemperatur i 2 timer og ble deretter 10 mg of peanut lectin (PNA) was dissolved in 2 ml of a 0.01 M phosphate buffer containing 0.85% NaCl (pH = 7.2). In 1 ml of a 0.5 M bicarbonate buffer (pH = 9.0) 2 mg of FITC was dissolved, and a 0.5 ml portion of the resulting solution was added to the PNA buffer prepared above. The mixture was then stirred at room temperature for 2 hours and then was

separert på "Sephadex G25" (10 mm x 300 mm). Den initiale topp ble oppsamlet. FITC/PNA forhold = 1,0. separated on "Sephadex G25" (10 mm x 300 mm). The initial peak was collected. FITC/PNA ratio = 1.0.

(1) - B Fremstilling av FITC-merket lektin (DBA-FITC). (1) - B Preparation of FITC-labeled lectin (DBA-FITC).

På samme måte som i (l)tilA ovenfor ble DBA-FITC oppnådd under anvendelse av DBA. FITC/DBA forhold = 0,9. (1) - C Soyabønne-agglutinin FITC (FITC-SBA). FITC/SBA forhold = 1,4. In the same manner as in (l) to A above, DBA-FITC was obtained using DBA. FITC/DBA ratio = 0.9. (1) - C Soybean agglutinin FITC (FITC-SBA). FITC/SBA ratio = 1.4.

(2) Lokalitet av GRA i forskjellige kreftceller. (2) Locality of GRA in different cancer cells.

(a) Dyrkede human-kreftceller (1*10^) ble vasket tre ganger med en 0,05 M tris saltsyrebuffer inneholdende 0,85 % NaCl (pH = 7,2) ved hjelp av en sentrifugeringsmetode og deretter ble 100 pl PNA-FITC, DBA-FITC eller SBA-FITC (200 ug/ml) fremstilt som ovenfor under (1) tilsatt dertil. Den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i 30 minutter for å bringes til reaksjon. Etter fullført reaksjon ble reak-sjonsblandingen vasket tre ganger med en 0,01 M fosfatbuffer inneholdende 0,85 % NaCl (pH =7,2) og deretter ble cellene anbragt på en glassplate og undersøkt under et fluorescens-mikroskop. (a) Cultured human cancer cells (1*10^) were washed three times with a 0.05 M tris hydrochloric acid buffer containing 0.85% NaCl (pH = 7.2) using a centrifugation method and then 100 µl of PNA- FITC, DBA-FITC or SBA-FITC (200 ug/ml) prepared as above under (1) added thereto. The resulting mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to react. After completion of the reaction, the reaction mixture was washed three times with a 0.01 M phosphate buffer containing 0.85% NaCl (pH =7.2) and then the cells were placed on a glass plate and examined under a fluorescence microscope.

Mus X5563 og mus MH134 ble behandlet og undersøkt på samme måte som ovenfor. Mouse X5563 and mouse MH134 were treated and examined in the same manner as above.

Resultatene er vist i Tabell 1. De anvendte kreftceller er alle kjente og er erholdt fra First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University. The results are shown in Table 1. The cancer cells used are all known and were obtained from First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University.

Resultatene er vist i Tabell 2. De maligne vev fra kreftpasienter var blitt oppnådd fra Kansai Medical University. The results are shown in Table 2. The malignant tissues from cancer patients had been obtained from Kansai Medical University.

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

Fremstilling av GRA Production of GRA

(l)tilA Fremstilling av immobilisert lektin (PNA-"Sepharose") (l) to A Preparation of immobilized lectin (PNA-"Sepharose")

3 g CNBr-aktivert "Sepharose 4B" ble fullstendig vasket med 3 g of CNBr-activated "Sepharose 4B" were completely washed with

1 mM HC1 og suspendert i 200 ml 0,1 M natriumhyrdrogen-karbonat (pH = 8,5). Deretter ble 5 ml av en 0,01 M fosfatbuffer (pH = 8,5) inneholdende 20 mg PNA tilsatt og blandingen ble reagert ved 25°C i 2 timer under leilighetsvis omrøring for fremstilling av PNA-"Sepharose". (l)tilB På samme måte som i (l)tilA ovenfor med unntagelse av at DBA anvendes i stedet for PNA, ble DBA-"Sepharose" oppnådd. 1 mM HCl and suspended in 200 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate (pH = 8.5). Then 5 ml of a 0.01 M phosphate buffer (pH = 8.5) containing 20 mg of PNA was added and the mixture was reacted at 25°C for 2 hours with occasional stirring to prepare PNA-Sepharose. (l) to B In the same way as in (l) to A above with the exception that DBA is used instead of PNA, DBA-"Sepharose" was obtained.

(2) Fremstilling av GRA (2) Preparation of GRA

(a) BT-1 (Burkitt lymphom) celler (1,3 • IO<8>) ble vasket tre ganger med fysiologisk saltløsning og 30 ml av 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH =7,4) inneholdende 2 % "TRITON X-100", 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 nffl MgCl2 ble tilsatt dertil. Blandingen ble omrørt ved 4°C i 15 minutter og ble så underkastet ultrasentrifugerende separasjon ved 100.000 x g. Av 28 ml av den således oppnådde supernatantvæske ble en (a) BT-1 (Burkitt lymphoma) cells (1.3 • IO<8>) were washed three times with physiological saline and 30 ml of 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH =7.4) containing 2% " TRITON X-100", 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2 and 2 nfl MgCl 2 were added thereto. The mixture was stirred at 4°C for 15 minutes and was then subjected to ultracentrifugation separation at 100,000 x g. From 28 ml of the thus obtained supernatant liquid, a

14 ml porsjon ført gjennom en kolonne (diameter 0,5, lengde 14 ml portion passed through a column (diameter 0.5, length

1 cm) for affinitetskromatografering, fylt med PNA-agarose-kuler som var blitt ekvilibrert med en Tris-saltsyrebuffer (pH =7,4) inneholdende 0,1 % "TRITON X-100" 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2- Etter å ha vært vasket med den samme buffer som anvendt ovenfor, ble blandingen eluert med en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 0,1 M laktose, 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 og 0,1 % "TRITON X-100". Den således eluerte porsjon ble dialysert med en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer inneholdende 0,85 % NaCl, 2 mM MgCl2 og 2mM CaCl2 i 48 timer til å gi 17 ml av en GRA-oppløsning. Med GRA-oppløsningen ble mengden av protein og mengden av sukker målt ved hjelp av Folin-Lowry-metoden henholdsvis fenol-svovelsyre-metoden og de ble funnet å være henholdsvis 644 ug og 120 ug. Dette omtales i det følgende som "GRA-1". 1 cm) for affinity chromatography, filled with PNA-agarose beads that had been equilibrated with a Tris-hydrochloric acid buffer (pH =7.4) containing 0.1% "TRITON X-100" 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2 and 2 mM MgCl2- After being washed with the same buffer as used above, the mixture was eluted with a 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing 0.1 M lactose, 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 0.1% "TRITON X-100". The thus eluted portion was dialyzed with a 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer containing 0.85% NaCl, 2 mM MgCl 2 and 2 mM CaCl 2 for 48 hours to give 17 ml of a GRA solution. With the GRA solution, the amount of protein and the amount of sugar were measured by the Folin-Lowry method and the phenol-sulphuric acid method respectively and they were found to be 644 µg and 120 µg respectively. This is referred to below as "GRA-1".

(b) C3H/He muse-mammakreftceller (MMT) (1 • 10<10>) ble vasket tre ganger med fysiologisk saltløsning og 30 ml av en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 2 % "TRITON X-100", 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2 ble tilsatt dertil. Blandingen ble omrørt ved 4°C i 30 minutter. Deretter ble blandingen underkastet ultra-sentrifugeringsseparasjon ved 100.000 x g i 2 timer og deretter ble supernatantvæsken dialysert over natten med en 0,1 Tris-saltsyrebuffer (b) C3H/He mouse mammary cancer cells (MMT) (1 • 10<10>) were washed three times with physiological saline and 30 ml of a 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing 2% " TRITON X-100", 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2 were added thereto. The mixture was stirred at 4°C for 30 minutes. Then the mixture was subjected to ultra-centrifugation separation at 100,000 x g for 2 hours and then the supernatant fluid was dialyzed overnight with a 0.1 Tris-hydrochloric acid buffer

(pH = 7,4) inneholdende 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2- Den således dialyserte væske ble inndampet til 3 ml og en 1 ml porsjon ble så ført gjennom en kolonne (diameter 0,5 cm, lengde 2 cm) for affinitetskromatografering, fylt med (pH = 7.4) containing 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2 and 2 mM MgCl2- The thus dialyzed liquid was evaporated to 3 ml and a 1 ml portion was then passed through a column (diameter 0.5 cm, length 2 cm) for affinity chromatography, filled with

den samme PNA-"Sepharose" som anvendt ovenfor som var blitt ekvilibrert med en Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 0,005 % "TRITON X-100", 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2. Etter fullstendig vasking med den samme buffer som anvendt ovenfor, ble den eluert med en 0,01 M Tris-saltsyrebuf f er (pH = 7,4) inneholdende 0,1 M laktose, 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 og 0,005 % "TRITON X-100" og den således eluerte porsjon ble dialysert i 48 timer med en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og MgCl2 til å gi 2 ml av en GRA-oppløsning. Med den således oppnådde GRA-oppløsning var mengden av protein og mengden av sukker henholdsvis 156 ug og 94 ug. Denne omtales i det følgende som "GRA-M-1". (c) Omtrent 120 g (våt vekt) av KATO-III ble homogenisert i 100 ml PBS ved hjelp av en Waring-blander. Etter sentrifugering ved 100.000 x g i 1 time ble pelleten oppløst med 100 ml 2 % "TRITON X-100" i en 0,01 M Tris-HCl-buffer (pH = 7,6) inneholdende 0,15 M NaCl. Supernatanten samlet ved sentrifugering ved 100.000 x g i 1 time ble tilført en kolonne av PNA-"Sepharose 4B" (0,8 x 15 cm) ekvilibrert med 0,15 % "TRITON X-100" i 0,01 M Tris-HCl (pH =7,6) inneholdende 0,15 M NaCl. Etter vasking med 50 ml buffer ble GRA eluert med bufferen inneholdende 0,1 M laktose. Den eluerte GRA ble dialysert mot 0,85 % NaCl, konsentrert ved hjelp av "Sephadex" og lagret ved -20°C før bruk. the same PNA "Sepharose" used above which had been equilibrated with a Tris-hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing 0.005% "TRITON X-100", 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2 . After complete washing with the same buffer as used above, it was eluted with a 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing 0.1 M lactose, 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 0.005% "TRITON X-100" and the thus eluted portion was dialyzed for 48 hours with a 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2 and MgCl2 to to provide 2 ml of a GRA solution. With the GRA solution thus obtained, the amount of protein and the amount of sugar were respectively 156 µg and 94 µg. This is referred to below as "GRA-M-1". (c) Approximately 120 g (wet weight) of KATO-III was homogenized in 100 ml of PBS using a Waring blender. After centrifugation at 100,000 x g for 1 hour, the pellet was dissolved with 100 ml of 2% "TRITON X-100" in a 0.01 M Tris-HCl buffer (pH = 7.6) containing 0.15 M NaCl. The supernatant collected by centrifugation at 100,000 x g for 1 hour was applied to a column of PNA-"Sepharose 4B" (0.8 x 15 cm) equilibrated with 0.15% "TRITON X-100" in 0.01 M Tris-HCl (pH =7.6) containing 0.15 M NaCl. After washing with 50 ml of buffer, GRA was eluted with the buffer containing 0.1 M lactose. The eluted GRA was dialyzed against 0.85% NaCl, concentrated using "Sephadex" and stored at -20°C before use.

Mengdene av protein og sukker bestemt på samme måte som under (a) ovenfor ble funnet å være 2,0 mg, henholdsvis 0,8 mg. Dette omtales i det følgende som "GRA-2". (d) På samme måte som under (c) ovenfor ble følgende GRA-prøver oppnådd. (e) På samme måte som under (c) ovenfor med unntagelse av at MKN-45 (omtrent 29 g) ble anvendt i stedet for Kato-III, DBA-"Sepharose" oppnådd under (1)-B ovenfor ble anvendt i stedet for PNA-"Sepharose 4B" og eluering ble gjennomført med N-acetylgalaktosamin, ble det oppnådd et GRA-preparat med et proteininnhold på 0,03 mg og et sukkerinnhold på 0,01 mg. Dette omtales i det følgende som "GRA-8". (f) GRA-3 fremstilt under (d) ovenfor (5 ml) ble innført i en DBA-"Sepharose" kolonne og eluert med Tris-HCl-buffer (0,015 %) "Triton X-100", 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,85 % NaCl til å gi 4 ml fraksjoner nr ltill2. Fraksjoner nr ltil3 betegnes "GRA-3-A" og nr 4till2 betegnes "GRA-3-B". Deretter ble kolonnen eluert med samme buffer, men inneholdende 0,1 M N-acetylgalaktosamin til å oppnå fraksjoner som betegnes "GRA-3-C". The amounts of protein and sugar determined in the same manner as under (a) above were found to be 2.0 mg and 0.8 mg respectively. This is referred to below as "GRA-2". (d) In the same manner as under (c) above, the following GRA samples were obtained. (e) In the same manner as in (c) above except that MKN-45 (about 29 g) was used instead of Kato-III, DBA-"Sepharose" obtained in (1)-B above was used instead for PNA-"Sepharose 4B" and elution was carried out with N-acetylgalactosamine, a GRA preparation with a protein content of 0.03 mg and a sugar content of 0.01 mg was obtained. This is referred to in the following as "GRA-8". (f) GRA-3 prepared under (d) above (5 ml) was loaded onto a DBA-"Sepharose" column and eluted with Tris-HCl buffer (0.015%) "Triton X-100", 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.85% NaCl to give 4 ml fractions no ltill2. Fractions no. 1 to 3 are designated "GRA-3-A" and no. 4 to 2 are designated "GRA-3-B". Then the column was eluted with the same buffer but containing 0.1 M N-acetylgalactosamine to obtain fractions designated "GRA-3-C".

(g) SDS gel-elektroforese. (g) SDS gel electrophoresis.

Hver av GRA-preparatene i samsvar med de ovennevnte metoder ble underkastet elektroforese i samsvar med metoden beskrevet av Fairbanks et al: Biochemistry, bind 10, side 2606, 1971. De oppnådde resultater er vist i fig. 18til22. I fig. 18till9 indikerer tallene ltil5 følgende: ltilstandard; 2tilGRA-M-3; 3tilGRA-7; Each of the GRA preparations in accordance with the above methods was subjected to electrophoresis in accordance with the method described by Fairbanks et al: Biochemistry, vol. 10, page 2606, 1971. The results obtained are shown in fig. 18 to 22. In fig. 18to9 the numbers lto5 indicate the following: ltostandard; 2 to GRA-M-3; 3 to GRA-7;

4tilGRA-l; og 5tilGRA-2. 4 to GRA-1; and 5 to GRA-2.

I fig. 20 indikerer tallene ltil4 følgende: In fig. 20, the numbers l to 4 indicate the following:

ltilstandard; 2tilGRA-M-2; 3tilGRA-6; ltill standard; 2 to GRA-M-2; 3 to GRA-6;

4tilGRA-5. 4 to GRA-5.

I fig. 21 indikerer tallene ltil3 følgende: In fig. 21 the numbers l to 3 indicate the following:

ltilGRA-M-4; 2tilGRA-M-5; 3tilstandard. ltilGRA-M-4; 2 to GRA-M-5; 3 to standard.

I fig. 22 indikerer tallene ltil4 følgende: In fig. 22, the numbers l to 4 indicate the following:

ltilGRA-3; 2tilGRA-3-A; 3tilGRA-3~B; ltilGRA-3; 2 to GRA-3-A; 3toGRA-3~B;

4tilGRA-3-C. 4 to GRA-3-C.

Fig. 18 viser tilstanden for GRA underkastet proteinfarge-reaksjonen i henhold til C.B.B, metoden (Fairbanks et al. : Biochemistry, bind 10, side 2606, 1971). Fig. 19til21 viser tilstanden for kreftceller behandlet med sukker-fargereaksjon i henhold til PAS-metoden (R.M. Zacharius et al., Anal. Biochem., bind 30, side 148 (1962)). Fig. 22 viser em skjematisk illustrasjon av resultatene ved farging i samsvar med C.B.B.-metoden beskrevet ovenfor. Fig. 18 shows the condition of GRA subjected to the protein color reaction according to the C.B.B, method (Fairbanks et al.: Biochemistry, volume 10, page 2606, 1971). Figs. 19 to 21 show the condition of cancer cells treated with sugar-dye reaction according to the PAS method (R.M. Zacharius et al., Anal. Biochem., vol. 30, page 148 (1962)). Fig. 22 shows a schematic illustration of the results of staining in accordance with the C.B.B. method described above.

For standard-substanser gjengitt i det følgende ble det anvendt henholdsvis: For standard substances reproduced in the following, the following were used respectively:

Fremstilling av kreftcellecytotoksiske lymfocytter ved hjelp av GRA oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse er gjenstand for avdelt ansøkning nr 85.3541 og behandles ikke detaljert her. Production of cancer cell cytotoxic lymphocytes using the GRA obtained by the present invention is the subject of separate application no. 85.3541 and is not dealt with in detail here.

TESTEKSEMPEL 1 TEST EXAMPLE 1

(i) "GRA-M-1" som oppnådd under Eksempel 1 ((2) (b)) ble fortynnet med fysiologisk saltløsning slik at mengdene av sukker og protein var 1,0 ug/ml, henholdsvis 1,6 ug/ml for derved å fremstille et anti-kreftmiddel nr 1. (ii) En kreftklump av C3H/He spontant opptredende brystkreft ble sterilt kuttet til 5 mm kubisk klump og transplantert inn under rygghuden av 10 C3H/He mus av samme stammer som ovenfor (7 uker gamle, hannmus). 7 døgn etter transplantasjonen ble fiksering og formering av tumoren bekreftet. 5 av musene ble hver tilført subkutant anti-kreftmiddel nr 1 som fremstilt under i) ovenfor i en dose på 300 ul pr døgn med 2 døgns mellomrom. De resterende 5 mus ble holdt som ubehandlede kontrolldyr. 10 døgn etter den første tilførsel ble tumoren skåret ut ved operasjon og den midlere vekt ble målt. Samtidig ble det gjennomført pato-histologisk undersøkelse. (i) "GRA-M-1" as obtained under Example 1 ((2) (b)) was diluted with physiological saline so that the amounts of sugar and protein were 1.0 µg/ml and 1.6 µg/ml, respectively to thereby produce an anti-cancer agent No. 1. (ii) A cancerous lump of C3H/He spontaneously occurring breast cancer was sterilely cut into a 5 mm cubic lump and transplanted under the dorsal skin of 10 C3H/He mice of the same strains as above (7 weeks old, male mice). 7 days after the transplant, fixation and multiplication of the tumor was confirmed. 5 of the mice were each injected subcutaneously with anti-cancer agent no. 1 as prepared under i) above in a dose of 300 ul per day at 2-day intervals. The remaining 5 mice were kept as untreated control animals. 10 days after the first administration, the tumor was surgically excised and the average weight was measured. At the same time, a patho-histological examination was carried out.

Dette betyr at der var en 86,3 % reduksjon i tumoren. Pato-histologisk undersøkelse: I kontrollgruppen (Fig. 16) ble det tildannet fuglelignende kreftkropper og typen av vev var lik medulær kanalikulær kreft og formering av kreftcellene ble iakttatt over hele vevet. På den annen side, i den gruppe som har tilført midlet (Fig. 17) bevirket krefcellene likvifiserende nekrose av de steder hvor kreftcellene ble- dannet, og kalsifisering og fibrose opptrådte, etterlatende bare en meget begrenset mengde av kreftceller. På denne måte ble anti-tumoregen-skapene av anti-kreft-midlet fremstilt på basis av oppfinnelsen iakttatt. This means that there was an 86.3% reduction in the tumor. Patho-histological examination: In the control group (Fig. 16), bird-like cancer bodies were formed and the type of tissue was similar to medullary canalicular cancer and proliferation of the cancer cells was observed throughout the tissue. On the other hand, in the group that has supplied the agent (Fig. 17), the cancer cells caused liquefying necrosis of the places where the cancer cells were formed, and calcification and fibrosis occurred, leaving only a very limited amount of cancer cells. In this way, the anti-tumor properties of the anti-cancer agent prepared on the basis of the invention were observed.

TESTEKSEMPEL 2 (H-2 forsøk) TEST EXAMPLE 2 (H-2 trial)

GRA-M-1, GRA-M-3 og GRA-M-4 oppnådd under Eksempel 1 i det foregående ble seriefortynnet med PBS (0,85 % NaCl) for fremstilling av prøver. GRA-M-1, GRA-M-3 and GRA-M-4 obtained in Example 1 above were serially diluted with PBS (0.85% NaCl) to prepare samples.

Anti-H-2 serum fra National Institute of Genetic Research og den ovennevnte prøve ble blandet og inkubert ved 4°C i to timer og en målcelle tilsvarende det anvendte anti-H-2-serum ble tilsatt dertil. Miltceller eller lymfeknuteceller oppnådd fra B10 (H-2<b>) og B10 • BR(H-2<k>) mus ved hjelp av konvensjonelle metoder ble anvendt som målceller. Etter vasking av cellene med PBS ble komplement (kanin) tilsatt til cellene som ble inkubert ved 37°C i 1 time og farget med 0,2 % trypan-blått-PBS for bestemmelse av prosent cytotoksisitet. Anti-H-2 serum ble anvendt i maksimal fortynning slik at det viste i det minste 95 % cytotoksisitet i fravær av GRA. Anti-H-2 serum from the National Institute of Genetic Research and the above sample were mixed and incubated at 4°C for two hours and a target cell corresponding to the used anti-H-2 serum was added thereto. Spleen cells or lymph node cells obtained from B10 (H-2<b>) and B10 • BR(H-2<k>) mice using conventional methods were used as target cells. After washing the cells with PBS, complement (rabbit) was added to the cells which were incubated at 37°C for 1 hour and stained with 0.2% trypan blue-PBS to determine percent cytotoxicity. Anti-H-2 serum was used at the maximum dilution such that it showed at least 95% cytotoxicity in the absence of GRA.

Blokkeringseffekten av GRA ble bestemt for systemer vist i Tabell 4 som følger. The blocking effect of GRA was determined for systems shown in Table 4 as follows.

De oppnådde resultater er vist i Tabell 5. The results obtained are shown in Table 5.

Fra resultatene vist i Tabell 5 i det foregående kan det sees at GRA-M-1, GRA-M-3 og GRA-M-4 mangler H-2. From the results shown in Table 5 above, it can be seen that GRA-M-1, GRA-M-3 and GRA-M-4 lack H-2.

TESTEKSEMPEL 3 TEST EXAMPLE 3

C57BL/6 mus ble transplantert under S.C. med LLC (2'IO<6>) fra den samme stamme og etter 6 døgn ble 1 ng (protein) av GRA-M-3 oppnådd i Eksempel 1 (d) tilført subkutant. Deretter ble tilførsel gjentatt i 4 døgn en gang daglig ved samme dosering. Dagen etter den endelige tilførsel ble tumorcellene skåret ut og veiet. Som en kontroll ble anvendt dyr tilført fysiologisk saltløsning. Hver testgruppe omfattet 5 dyr. C57BL/6 mice were transplanted under s.c. with LLC (2'IO<6>) from the same strain and after 6 days 1 ng (protein) of GRA-M-3 obtained in Example 1 (d) was administered subcutaneously. The administration was then repeated for 4 days once a day at the same dosage. The day after the final infusion, the tumor cells were excised and weighed. As a control, animals fed physiological saline solution were used. Each test group comprised 5 animals.

Som et resultat ble gjennomsnittlig tumorvekt av kontrollgruppen funnet å være 500 mg. Den GRA-M-3 tilførte gruppe 3 viste forsvinning av tumor og to hadde gjennomsnittlig tumorvekt på omtrent 100 mg. As a result, the average tumor weight of the control group was found to be 500 mg. The GRA-M-3 supplied group 3 showed disappearance of tumor and two had average tumor weight of about 100 mg.

TESTEKSEMPEL 4 TEST EXAMPLE 4

C57BL/6 mus ble immunisert subkutant med 1 ng (protein) av GRA-M-3 oppnådd i Eksempel 1 (d) en gang i døgnet i 3 døgn og det femte døgn ble miltceller samlet fra dyret for oppnåelse av effektorceller. En blanding av effektorcellene og Lewis lungekarcinom (LLC) som målcelle i et forhold på E/T = 50/1 ble fremstilt og en del (1-10<5>) derav ble transplantert til mus av den samme stamme og Winn-bedømmelse ble gjennomført (J. Immunol. 86, side 228til239 (1961)). C57BL/6 mice were immunized subcutaneously with 1 ng (protein) of GRA-M-3 obtained in Example 1 (d) once a day for 3 days and on the fifth day spleen cells were collected from the animal to obtain effector cells. A mixture of the effector cells and Lewis lung carcinoma (LLC) as a target cell in a ratio of E/T = 50/1 was prepared and a portion (1-10<5>) thereof was transplanted into mice of the same strain and Winn's score was conducted (J. Immunol. 86, pp. 228 to 239 (1961)).

De oppnådde resultater er vist i den følgende Tabell 6. The results obtained are shown in the following Table 6.

Bemerk: Gruppe A representerer miltceller fra GRA-M-3 Note: Group A represents spleen cells from GRA-M-3

immune mus. immune mice.

Gruppe B representerer miltceller fra normale mus. Gruppe c representerer miltceller fra mus etter 10 døgn fra transplanteringen av LLC (1*10^). Group B represents spleen cells from normal mice. Group c represents spleen cells from mice after 10 days from the transplantation of LLC (1*10^).

Tumorveksttakt ble beregnet i samsvar med følgende ligning: Tumor growth rate was calculated in accordance with the following equation:

Tumorveksttakt l Tumor growth rate l

hvori T^ representerer tykkelsen av fotputen på den side hvor tumoren ble transplantert og T^j representerer tykkelsen av den normale fotpute. where T^ represents the thickness of the footpad on the side where the tumor was transplanted and T^j represents the thickness of the normal footpad.

TESTEKSEMPEL 5 TEST EXAMPLE 5

C3H/He mus ble immunisert med 4,5 ug (protein) av GRA-M-4 oppnådd i Eksempel 1 (d) og 0,1 ml av Freund's Complete Adjuvant i sakro-coccygeal-partiet. Etter to uker ble lymfeknuteceller samlet ved hjelp av konvensjonell metode og ble anvendt som respondercelle for bestemmelse av formerings-respons ved GRA-M-4. C3H/He mice were immunized with 4.5 µg (protein) of GRA-M-4 obtained in Example 1 (d) and 0.1 ml of Freund's Complete Adjuvant in the sacro-coccygeal portion. After two weeks, lymph node cells were collected by means of a conventional method and were used as responder cells for determining the proliferation response by GRA-M-4.

For dette formål ble responderceller (4-10^) inkubert i RMPI-1640 medium inneholdende 15 % FCS i nærvær av GRA-M-4 i 5 døgn. Under endelig 18 timers inkubasjonsperiode ble 1 uCi av ^H-thymidin (-^H-TdR) tilsatt til mediet og dets innlem-melse i cellene ble telt. For this purpose, responder cells (4-10^) were incubated in RMPI-1640 medium containing 15% FCS in the presence of GRA-M-4 for 5 days. During the final 18 hour incubation period, 1 uCi of ^H-thymidine (-^H-TdR) was added to the medium and its incorporation into the cells was counted.

De oppnådde resultater er vist i den følgende Tabell 7. The results obtained are shown in the following Table 7.

TESTEKSEMPEL 6 TEST EXAMPLE 6

Hypersensitivitet av forsinket type (DTH) respons av C3H/He normale mus, X5563 immune mus og MH134 immune mus (gjenstand for avdelt ansøkning nr 85.3541) og GRA-M-4 immune mus og GRA-M-5 immune mus oppnådd på samme måte som i Testeksempel 5 ble bestemt ved hjelp av fotputereaksjonen (FPR). Det vil si at GRA eller MMC-behandlede tumorceller ble innført ved fotputeenden av bakfoten av dyret og svelling av fotputen 24 timer etter tilførslen ble bestemt. Graden av DTH respons ble beregnet ved å trekke svellingen før tilførselen fra svellingen etter tilførsel (lO-^ mm). Delayed-type hypersensitivity (DTH) response of C3H/He normal mice, X5563 immune mice and MH134 immune mice (subject of divisional application no. 85.3541) and GRA-M-4 immune mice and GRA-M-5 immune mice obtained in the same manner which in Test Example 5 was determined using the foot pad reaction (FPR). That is, GRA or MMC-treated tumor cells were introduced at the footpad end of the rear foot of the animal and swelling of the footpad 24 hours after the injection was determined. The degree of DTH response was calculated by subtracting the swelling before administration from the swelling after administration (lO-^ mm).

De oppnådde resultater er vist i Tabellene 8till2. The results obtained are shown in Tables 8 to 2.

Bemerk: Gruppe 1; syngenisk normal milt 1*10^/20 ul medium Note: Group 1; syngeneic normal spleen 1*10^/20 ul medium

(Hanks oppløsning) (Hank's Resolution)

Gruppe 2; MH134 celler l-10<6>/20 pl medium Group 2; MH134 cells l-10<6>/20 µl medium

Gruppe 3; Medium 20 ul Group 3; Medium 20 ul

Gruppe 4; GRA-M-4, 0,8 ug (protein)/20 ul medium Gruppe 5; GRA-M-4, 0,4 ] ig, (protein)/20 ul medium Group 4; GRA-M-4, 0.8 µg (protein)/20 µl medium Group 5; GRA-M-4, 0.4 µg, (protein)/20 µl medium

Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul Gruppe 2; GRA-M-4, 4 \ xg (protein)/20 ul medium Gruppe 3; GRA-M-5, 4 ] ig (protein)/20 ul medium Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul Gruppe 2; GRA-M-4, 4 ] ig (protein)/20 ul medium. Note: Group 1; medium (Hank's solution) 20 ul Group 2; GRA-M-4, 4 µg (protein)/20 µl medium Group 3; GRA-M-5, 4 µg (protein)/20 µl medium Note: Group 1; medium (Hank's solution) 20 ul Group 2; GRA-M-4, 4 µg (protein)/20 µl medium.

Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul Gruppe 2; GRA-M-4, 3,8 ug (protein) /20 ul medium Gruppe 3; 4 pg (protein)/20 ul medium av fraksjonen som passerte gjennom PNA-kolonnen ved tidspunktet for GRA-M-4 (heretter Note: Group 1; medium (Hank's solution) 20 ul Group 2; GRA-M-4, 3.8 µg (protein) /20 µl medium Group 3; 4 pg (protein)/20 µl medium of the fraction that passed through the PNA column at the time of GRA-M-4 (hereafter

"CP. ") . "CP. ").

Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul Note: Group 1; medium (Hank's solution) 20 ul

Gruppe 2; GRA-M-4, 3,8 \ xg (protein)/20 ul medium Gruppe 3; 3,8 rø (protein)/20 ul medium av "CP." Group 2; GRA-M-4, 3.8 µg (protein)/20 µl medium Group 3; 3.8 r (protein)/20 µl medium of "CP."

ovenfor above

Gruppe 4; 3,8 ] ig (protein) av GRA-M-4 og 3,8 \ ig (protein)/20 ul medium av "CP.". Group 4; 3.8 µg (protein) of GRA-M-4 and 3.8 µg (protein)/20 µl medium of "CP.".

Terapeutiske forsøk med de sensitiverte kreftcellecytotoksiske lymfocytter som kan oppnås ved at de utsettes for GRA oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse, er også gjenstand for ovennevnte avdelte ansøkning nr 85.3541. Therapeutic trials with the sensitized cancer cell cytotoxic lymphocytes which can be obtained by exposing them to the GRA obtained by the present invention are also the subject of the above-mentioned divisional application no. 85.3541.

REFERANSETEST REFERENCE TEST

Miltceller fra X5563 immune mus ble anvendt som effektor-celle og effektorceller (IO<7>) og målcellene (X5563, IO<5>) ble sammen transplantert til mus av samme stamme. Winnforsøk ble Spleen cells from X5563 immune mice were used as effector cells and effector cells (IO<7>) and the target cells (X5563, IO<5>) were transplanted together into mice of the same strain. The winning attempt was

gjennomført på samme måte som i Testeksempel 4. carried out in the same way as in Test example 4.

De oppnådde resultater er vist i Fig 23 hvori abscissen indikerer døgn og koordinat viser midlere tumorstørrelse (cm<2>) ± S.E. og forskjellige merker representerer følgende: • ~— • : Gruppe hvori ef f ektorceller ikke ble tilsatt. 0—. q : Gruppe hvori ikke-behandlede effektorceller ble tilsatt. The results obtained are shown in Fig 23, in which the abscissa indicates the day and the coordinate shows mean tumor size (cm<2>) ± S.E. and different marks represent the following: • ~— • : Group in which effector cells were not added. 0—. q : Group in which untreated effector cells were added.

^ : Gruppe hvori effektorcellene behandlet med ^ : Group in which the effector cells treated with

kaninkomplement ble tilsatt. rabbit complement was added.

x m^ : Gruppe hvori effektorceller behandlet med x m^ : Group in which effector cells treated with

anti-Thy 1 og kaninkomplement ble tilsatt. q : Gruppe hvori effektorceller behandlet med anti-Thy 1 and rabbit complement were added. q : Group in which effector cells treated with

anti-Lyt 1 og kaninkomplement ble tilsatt. B % : Gruppe hvori effektorceller behandlet med anti-Lyt 2 og kaninkomplement ble tilsatt. anti-Lyt 1 and rabbit complement were added. B%: Group in which effector cells treated with anti-Lyt 2 and rabbit complement were added.

Fra resultatene vist i Fig. 23 kan det sees at Lyt 1 type T-celler spiller en viktig rolle ved mekanismen til in vivo effektorceller ved tumor-immunitet. From the results shown in Fig. 23, it can be seen that Lyt 1 type T cells play an important role in the mechanism of in vivo effector cells in tumor immunity.

Det er videre kjent at DTH respons formidles ved hjelp av Lyt-1 T-celler (J. Exp. Med. 143, s. 1534 - 39 (1976)). It is further known that the DTH response is mediated by Lyt-1 T cells (J. Exp. Med. 143, pp. 1534-39 (1976)).

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av et glykorelatert antigen (GRA) som sensitiverer lymfocytter til kreftcellecytotoksiske lymfocytter, og som også i seg selv kan anvendes som et anti-kreftmiddel,Process for the production of a glyco-related antigen (GRA) which sensitizes lymphocytes to cancer cell cytotoxic lymphocytes, and which can also be used in itself as an anti-cancer agent,

karakterisert ved at GRA isoleres fra humane eller muse-kreftcellemembrankomponenter ved affinitetskromatografering på en peanøttlektin-(PNA)- og eller Dolichos bønneagglutinin-lektin(DBA)-holdig uoppløselig bærer.characterized in that GRA is isolated from human or mouse cancer cell membrane components by affinity chromatography on a peanut lectin (PNA)- and or Dolichos bean agglutinin-lectin (DBA)-containing insoluble support.