NL7907251A - Cytotoxische produkten gevormd door covalente binding van de a-keten van ricinus met een anti-lichaam alsmede werkwijze ter bereiding daarvan. - Google Patents

Description

TC 3U32

Cytctcxische produkten gevormd door ccvaiente binding ran de A-keten ran ricinus net een anti-licraan alsmede werkvijze ter be-** ^

Te uitvinding heeft betrekking op cytotoxische rrodukten gevormd deer de a ovalen te binding van de A-keten van ricinus net een anti-iichaan alsmede een werkwijze ter bereiding daarvan.

^ Sedert vele jaren is de behandeling van kanker «et onderwerp van vele onderseekingen geweest. In het bijzonder zijn voer de chemo-therapeutische behandeling van kanker vele stoffen voorgestel! rcor de min of meer selectieve vernietiging van kankercellen. Hoewel bepaalde resultaten zijn verkregen is „n de chemotherapie Tan kanker beperkt door de niet-speeifieke gif- ; uf zigheid van de anti-necolasisohe verbindingen ten opzichte van normale cellen met sterk groeivermegen. Aldus is het effect van

Ie behandeling onvoldoende cm de laatste kankercellen te vervijce- ren, die uiteindelijk otnieuw kanker doen ontstaan.

de -iftighsid van cancerostatische mid-1? ~ .

42den ten oozichte -.-an normals cellen te verminderen zijn ver— -chillcude troeven u’-r-evoerd (zie in het bijzonder: C.R. Acaaemie des Sciences de Paris 2^c; Tc26, (1958]; British laical Journal 3, -*9t, \-972}; Science ^9, 68, (-970) en Cancer Research 35- ,'32 (*97?'-'. -ν·-,ρ·'β2 beogen de moleculen met evtotoxiscne 20 ~ t _ a-tiviteit te koppelen me' antilichamen gericht tegen de kamer- -ellen met het doel deze aldsen te fixeren aan de cellen die men wenst te bestrijden, poch hebben deze onderzoekingen m ae praktijd £eer- bij zenders resultaten opgeleverd omdat ae cymctoxiscne c 3tof die deer het antiliohaam wordt gedragen actief bleef gedu-^ - o- o^anisme en voordat deze m contact , van normale cellen kon remmen.

- Λ^-ν-inm heeft als hoofddoel te voorzien . · -«η >arker samengesteld *'n actieve stoffen ->v>-v de ces ——& <au — w „____. . _ , ^ irmuncglcculine steal t een cytctoxisch zrddeJ- 5--1----- ------- o-1 790 72 51 2 * . u cifiek voor kankercellen. Deze stoffen hebben de eigenschap tijdens hun transport inactief te blijven en slechts actief te wor-den na hun fixatie op de beoogde cellen en penetratie in deze cellen. Het gebruikte immunoglobuline kan een antilichaam spe-5 cifiek voor een bepaald antigeen zijn of ook een fragment van dit molecuul kan de capaciteit van een specifieke herkenning van het antigeen bezitten, zoals b.v, de fragmenten die gewoonlijk worden aangeduid onder de naamFab, F(ab)' of F(ab' )^. Wat betreft de cytotoxische stof blijkt de A-keten van Ricinus een. zeer interes-10 santé stof te vormen.

Het is inderdaad bekend.dat Ricinus, een giftig lectine geëxtraheerd uit de zaden van Ricinus Communis, is gevormd uit de koppeling van twee polypeptideketens door een disulfide-brug. De A-keten of "effectcmeer" bezit een intense cytotoxische 15 activiteit door remming van de eiwit synthese in Sucaryotes cellen. Deze A-keten bezit echter niet de eigenschap effectief te kunnen doordringen in de cellen cm daar zijn biologische activiteit uit te oefenen. Verder hezit de B-keten van Ricinus of "hapto-meer" de eigenschap aan het oppervlak: van de cellen saccharidi-20 sche structuren te herkennen waarmee deze een associatie met sterke affiniteit tot stand brengt. Door natuurlijke verschijnselen is het dan mogelijk het ricinus molecuul in de cellulaire inhcud te laten doordringen, waar de A-keten zijn toxische activiteit zal gaan uitoefenen. De giftigheid van ricinus heeft geen enkele spe-25 cificiteit ten opzichte van welk type cellen dan ook aangezien bijna alle dierlijke cellen de saccharidische determinanten herkend door de B-keten dragen.

De uitvinding heeft ten doel gemengde kunstmatige moleculen te realiseren aangeduid door de term "conjugatec" waar-30 in de A-keten van ricinus '\cor een geschikte covalente binding, bij voorkeur van het disulfidetype, niet alleen is verbonden met de 3-keten maar met een proteinestructuur die in staat is selectief een gegeven antigeen aan het oppervlak van de cellen, die dit antigeen dragen, te herkennen. Zoals reeds eerder vermeld zal deze proteïne— 790 72 51 * * 3 structuur een specifiek immunoglobuline van het gevenste antigeen zijn cf eik fragment van dit issuncgioonline dat dezelfde specifi-citeit van herkenning bezit.

Se keuze van de A-keten van ricinus als cytσιορ xisch bestanddeel van de conjugaten vloeit in hcofdzaak voort uit de volgende ovsrvegingen: - een extreem, hoog cytotoxisch activiteitsniveau vanneer en alleen vanneer de A-keten in de celinhoud van de beoogde cellen is dóórgedrongen, 10 - sen cytotoxiciteitsneehanisre gebaseerd op de verstoring van een vitale fundamentele functie van de cel, t.v. zijn eivit-synthesecapaciteit, - een zeer laag niet-specifiek toxiciteitsniveau ten oozichte van het specifieke toxociteitsniveau aangezisn de A-

15 keten op zich zelf niet de eigenschap heeft in de cellen door te dringen zonder gebonden te zijn aan een ander geschikt molecuul dat de fixatie aan de celmemhranen mcgelijk maakt. Dit, geschikte molecuul is in het geval van ricinus de 3—keten en in het geval van de uitvinding een specifiek immunoglobuline dat in staat is 20 EL2.H Cw"C52TV2-8^kL de "bsOOgC.0 SSH S"CCcii*I.5ÏS 0Ό” C2T

— 0 %p,mi- son -^2^00220^ 23S"v

Sr is een poging vermeld conjugaten tussen innunc-glcbulinen en teptideketens van ricinus te realiseren (Annals of 25 the lev fork Academy of Sciences 2T7, 693, (^9Tc}}. loch is de in vitro verkregen specificiteit bij deze proef extreem zvak en vel cm de volgende redenen: — de A—keten van ricinus is niet geïsoleerd van ri ^ o -π ^ r* m-i- η Λ*· q 1 ' ^ S o m

Ww —» * ·»* —i. — M -taf^ ^ J ü ta. taf taf —-w -»..CU> „1,1 J

30 — de toetstests antilichamen varen niet zuiver en bevatten grote hoeveelheden nroteinen als niet-antilichamen en S2/*b** ds.^ dl»e VeZOce S*O0C"bSOO^C-S σ ί dz.·— & * —- ö ----'3 — de icppeling rax r_ea tcxixe nez; het antilichaax 79 0 7 2 51 P - * k.. - is uitgevoerd onder toepassing van glutaaraldehyde, een prcdukt dat in staat is het antilichaam of het toxine te denatureren door de niet-specifieke vorming van bruggen in het inwendige van een peptideketen of tussen diverse peptideketens, hetgeen tot een 5 niet beheerste polymerisatie voert,

De uitvinding maakt het mogelijk deze moeilijkheden te overwinnen en eonjugaten te verkrijgen die een markante specificiteit voor de beoogde nellen hebben en bruikbaar zijn voor de bestrijding van kanker.

10 Het isoleren en zuiveren van ricinus en de A-keten daarvan

De zaden van Ricinus communis bevatten het giftige lectine bekend onder de naam ricinus. Deze bevat onder andere een. ander lectine dat minder giftig, is,.aangeduid onder de naam van agglutinine, wegens zijn agglutinerende eigenschappen voor 15 de cellen en in het bijzonder voor de rode bloedlichaampjes. Dit agglutinine is samengesteld uit twee suo-eenheden waarvan elk, zoals ricinus, afkomstig is van.de koppeling van twee glycoprotexne-ketens door een disulfidebrug.

Toorts bevat het zaad van Ricinus communis an-20 dere proteïnen van verschillende aard evenals een grote hoeveelheid lipiden die de bestanddelen van ricinusolie vormen. De extractie van ricinus begint door een verpulvering van de zaden van Ricinus communis waardoor een pasta ontstaat die ontvet wordt door middel van een oplosmiddel voor vetten, b.v. door herhaalde 2:5 extracties met ethylether. Ka droging wordt het verkregen poeder in de koude geëxtraheerd onder roeren met een oplossing van na-triumchloride in een licht zuur milieu, bij voorkeur bij een temperatuur niet hoger dan U°C. Ka afscheiding van sedimenten wordt h.et extract lange tijd gedialyseerd eerst tegen water, daarna te-30 gen een zwak-ionische buffer (TRIS-EC1». 10 mH, pH = 7,.7) * Tijdens de dialyse vindt een lichte precipitatie plaats; het preci-pitaat wordt afgescheiden door filtratie of centrifugering. Het aldus verkregen extract bevat de totale oplosbare proteïnen van het zaad van Ricinus communis, t.w. ricinus, agglutinine, en ver- 790 7 2 51 <- 1 5 schillende andere proteïnen. Deze oplossing kan hij -20°C worden ingevroren, hij welke temperatuur deze verschillende maanden of weken kan worden bewaard.

De zuivering van ricinus uitgaande van het ruwe 5 extract is in de literatuur beschreven. Γη het algemeen wordt gebruik gemaakt van ehromatografische technieken: chromatografie door ionenuitwisseling, chromatografie met moleculaire zeven of ook wel affiniteitschromatogr af ie. Meestal worden deze verschillende methoden gecombineerd, hetgeen leidt tot langdurige en ge-10 voelige technieken, waarvan de toepassing voor het verkrijgen van grote hoeveelheden ricinus moeilijk is. Volgens de uitvinding is het mogelijk zuiver ricinus te verkrijgen door een enkele affini-teitschromatografie waardoor het mogelijk is ricinus achtereenvolgens te isoleren van de vreemde proteïnen en daarna van aggluti-15 nine. Voor dit doel wordt het ruwe extract aangebracht in een kolom. van sepharose lB (agarose cel van bolvormige deeltjes, in een concentratie van in de handel gebracht door de firma Pharmacia), daarna stapsgewijze geëlueerd. Bij gebruik van een buffer THIS-HC1, 50 mM, pH = 7,.7, elueert men de proteïnen van het zaad die 20 geen lectines zijn waarna men onder toepassing van een oplossing van galactose met een concentratie tussen 0,28 en 0,56 mH het zuivere ricinus verkrijgt. Tenslotte verkrijgt men met een oplossing van galactose 0,1 M het agglutinine. De scheiding van deze bestanddelen is na een enkele chromatografie totaal indien het 25 gebruikte volume sepharose lB zodanig is dat de lading van de totale hoeveelheid proteïnes, die over de kolom.worden gevoerd, niet groter is dan de capaciteit daarvan.

üa deze trap kan men door concentrering met ultrafiltratie gemakkelijk een oplossing van zuiver ricinus verkrij-30 gen die 5-10 mg/ml produkt bevat in een zwak icnische buffer.

Be oplossing bevat onder andere een weinig galactose (ongeveer 0,1 mM). Bij -20°C ingevroren kan deze oplossing verschillende weken worden geconserveerd.

De twee samenstellende ketens van ricinus kunnen 790 72 51 6 na selectieve splitsing van de enige dizwavelbrug die hen verbindt worden gescheiden. Deze splitsing wordt uit gevoerd door een reductiemiddel zoals mereapto-2-ethanol of het dithiothrerbol waarvan de concentratie in het reactiemilieu tenminste 2% moet zijn.

5 .De scheiding van de twee ketens met behulp van methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van ionenuitwisseling op verschillende typen dragers, welke methoden in hoofdzaak zijn gebaseerd op de- verschillen in de iso-electrische punten van de twee ketens is reeds beschreven. Yolgens de uitvinding wordt een werk-10 wijze voor het scheiden van de A- en B-ketens van ricinus uitgevoerd waarbij niet alleen gebruik wordt gemaakt -van het verschil van de isoelectrische punten van de twee ketens maar tevens van.

•hun verschillende affiniteiten ten opzichte van chromatografische polysaccharide dragers die derivaten van galactose bevatten. De 15 toepassing van. dergelijke dragers biedt tevens het voordeel dat eventuele sporen van niet-afgesplitst ricinus, die in het mengsel zouden kunnen blijven bestaan, worden vastgehouden.

In de praktijk wordt aan de oplossing van ricinus in de zwak ionische buffer, als eerder verkregen,, bij omgevings— 20 temperatuur een reductiemiddel toegevoegd (b.v. mercapto-2-

ethanol) bij een concentratie van 2,5# V/V, waarna de oplossing wordt aangebracht in een kolom samengesteld uit DEAE seph.arose.6B

(gel in de handel gebracht door de firma Pharmacia en toegepast .........

voor chromatografie door ionen-uitwisseling; deze wordt bereid 25 uitgaande van sepharose- of agarose-gel, door verknoping met di-broom-2,3-propanol en verwijdering van de sulfaatgroepen door alkalische hydrolyse, gevolgd door invoering van diêthylaminoethyl-groepen; concentratie 6# in de gel), in dezelfde buffer die het reductiemiddel bevat, De twee ketens fixeren zich in de kolom door 30 ionische bindingen ten opzichte van de DEAE groepen, waarbij de B-keten zich onder meer fixeert door affiniteit met de sepharose-matrix.

79 0 7 2 51

De elutie van de A-keten wordt uitgevoerd door de ionische kracht en de pïï, steeds in aanwezigheid van het re- 3» « τ ductiemiddel, te vergroten opdat elke recombinatie tussen de twee ketens wordt verhinderd (elutiebuffer: TRIS-HC1 0,1 M pH = 8,U, die Sa Cl 0,1 M en mercapt o-2-etbanol a 2,5% bevat). In deze omstandigheden blijft de B-keten totaal gefixeerd. Deze kan worden geëlu-5 eerd door een mengsel van natriumchloride 0,2 M en galactose 0,1 M in dezelfde buffer·.

Een variant van de scheidingswerkwijze van de ketens A en B bestaat uit het voor de chromatografie toepassen van een drager waarop de ionenuitwisselverschijnselen en de mole— 10 culaire zeefvorming tegelijkertijd plaatsvinden. Tevens kan men door-toepassing van QAE sephadex A.50 (ionenuitwisselaar, sterk basisch, verkregen door fixatie van quaternaire ammoniumgroepen op sephadex of een dextrangel, door etherbindingen%. in de handel gebracht 'door de firma Pharmacia) de zuivere A-keten elueren met 15 de buffer TRIS-HC1 100 mM, pH die 0,5^ mercapto-2-ethanol bevat, terwijl de B-keten met dezelfde buffer wordt geêlueerd die tevens natriumchloride 75 mM bevat.

In het ene zowel als het andere geval is de keuze van de ehromatografische drager zeer belangrijk en is het niet 20 mogelijk gebleken met diverse andere dragers een goede afscheiding van de A-keten te bereiken.

De A-keten verkregen door één van deze werkwijzen blijkt zuiver te zijn ten opzichte van de verschillende analytische kriteria en behoeft geen verdere zuivering. Toch is het nood-25 zakelijk om de uiteindelijke koppeling daarvan met het antili-chaam tot stand te brengen over tamelijk geconcentreerde oplossingen te beschikken die in het bijzonder ontdaan zijn van reduc-tiemiddel. Om dit uit te voeren wordt de oplossing van de A-keten in het TRIS als eerder verkregen gedialyseerd tegen een fosfaat-30 buffer, 10 mM pH = 6,5, waardoor tegelijk het TRIS, het natriumchloride, het mereapto-2-ethanol en sporen galactose worden verwijderd.

De aldus verkregen oplossing wordt aangebracht in een carboxymethylcellulose-kolom, daarna wordt de A-keten geëlu- 790 72 51 8 ; £ - ·* eerd door gelijktijdig de concentratie en de pE van de tuff er van 10 nM, pH - 6,5 op te voeren tot T25 mM, pE = 7*0 in aanwezigheid van. 1 iflM EDTA. Men verkrijgt, aldus een tamelijk geconcentreerde oplossing (ongeveer 5 mg/ml) die gereed is voor de 5 koppelingsreacties -

Men kan tevens de verkregen verdunde oplossing concentreren en zuiveren door deze te onderwerpen aan een con— centreringstrap op de drager C.M. Sepharose, waarbij de ionenuitwisseling s— en affiniteitseffeeten worden gecombineerd. Men. kan 10 een oplossing verkrijgen die tegelijk een verhoogde concentratie en een zeer- grote zuiverheid bezit. Tevens kan uit een der— gelijke oplossing door koeling de A-keten. in de vorm van kristal— .len worden neergeslagen..

De1 aldus bereide A-keten (in de toestand van een 1 5 geconcentreerde oplossing of in kristaltoestand) bezit' geen niet-specifieke giftigheid ten opzichte van celsystemen of dierlijke organismen en is. aldus bruikbaar voor'de samenstelling van geconjugeerde verbindingen, waarvan de. specificiteit nauwkeurig wordt ingebracht door het anti-lichaam.

20 Bereiding van zuivere anti-lichamen

Volgens de uitvinding wordt de bereiding van de antilichamen zodanig geleid dat zuivere antilichamen worden, verkregen bevrijd van moleculen zonder anti-lichaamactiviteit, waarmee beoogd wordt aan de uiteindelijk bereide geconjugeerde ver— 25 bindingen de meest volledige specifieke werking te verlenen, een eigenschap die niet is waargenomen bij de bereiding van preparaten als beschreven in de literatuur.

Eet immuniseren wordt herhaaldelijk gedurende verschillende, maanden volgens een klassieke methode uitgevoerd, 30 teneinde een hyperimmunisatie. van de dieren te verkrijgen. Men verzamelt aldus verschillende liters immunoserum die men bij -2.0°C kan opslaan voordat dit wordt onderworpen aan zuiveringsbehande-lingen.

De zuivering wordt uitgevoerd door immunoadsorp- 790 72 51 - . a 9 tie onder toepassing van een gel ran. sepharose UB geactiveerd door cyanobromide waarop een antigeen corresponderend met het te zuiveren specifieke antiliciiaam is gefixeerd. Na afscheiding van de vloeibare fase kan men door een intense wassing alle niet aan 5 de gel gefixeerde proteïnen elimineren; daarna bevrijdt men met een geschikt eluent de op de gel gefixeerde anti-lichamen. Deze methode is bruikbaar voor diverse antilichamen met verschillende specificiteiten. Volgens de uitvinding kan aldus de populatie van antilichamen van het serum zodanig worden gefractioneerd, dat de 10 antilichamen met de hoogste affiniteit voor het antigeen worden gekozen. Bij een overmaat antilichamen ten opzichte van de hoeveelheid op de gel gefixeerd antigeen behoudt de gel pref eren— * tieel de anti-lichamen met de hoogste affiniteit.

In de praktijk werkt men met een zodanige over— TJ maat antilichamen dat alleen een fractie van de antilichamen van v het immuno-serum in de kolom wordt gefixeerd,, terwijl de rest door wassing- wordt verwijderd. Onder deze omstandigheden is de gemiddelde affiniteit van. de door wassing verwijderde antilichamen zwakker dan die van de op de kolom gefixeerde en vervolgens ge— 20 elueerde antilichamen. Men verkrijgt aldus een populatie van antilichamen met een meer homogene affiniteit dan die aanwezig in het uitgangsimmuno-serum.

Wanneer men verhoogde hoeveelheden antilichamen wil behandelen waardoor het noodzakelijk is kolommen met grotere 25 afmetingen toe te passen, bepaalt men van te voren de voor een gegeven antigeen-bevattende gel te gebruiken hoeveelheid immuno-serum door een reeks van micro-immuno adsorpties uit te voeren met steeds toenemende hoeveelheden antiserum. De dosering van de anti-lichamen door de radio-immunologische methode in de verwij-30 derde vloeibare fase maakt het mogelijk de verhouding antigeen-antilichaam te bepalen waarbij men in deze fase de bij het begin geïntroduceerde ongewenste fractie van antilichamen laat ontsnappen.

Bereiding wan conjugaten ricinus A-keten-antiliehaam

Dit deel van de uitvinding heeft ten doel door 790 72 51 * V ·

TO

een covalente binding van bet disulfidetype enerzijds een specified immunoglobuline van een bepaald antigeen of elk fragment van dit molecuul, dat de capaciteit van specifieke herkenning ten opzichte van het antigeen. bezit, te associëren met anderzijds 5 de A-keten van 'ricinus·* De keuze van een disulfidebinding tus-! sen de A-keten en het. immunoglobuline steunt op de volgende argumenten:-

Dit type binding is het type dat in het natuurlijke molecuul van ricinus bestaat en men kan verwachten dat het 10 bijzonder geschikt is om de A-keten in. een conformatie te brengen die. de penetratie daarvan, in de cel vergemakkelijkt waarbij toch de biologische fundamentele eigenschap daarvan de eiwit synthese te· remmen wordt gehandhaafd;.

. Dit type binding is' biochemisch labiel, hetgeen 15 garandeert: dat de aldus gekoppelde A-keten. in. de celinhoud van zijn proteïnedrager kan worden bevrijd.

De- A-keten van: ricinus bezit een enkele cysteïne-rest in de structuur daarvan, aldus een enkele SH-groep die in staat is een. disulfidebinding te vormen» Bij gevolg zijn de conju-20 gaten gevormd door gebruikmaking van deze SH-groep in.een disulfi— debrug chemisch goed gedefinieerd. en zullen zij de structuur van de A-keten niet wijzigen, waardoor wordt verzekerd dat de biologische activiteit daarvan in zijn geheel, wordt gehandhaafd.

Er bestaan doeltreffende methoden waarmede het 25 mogelijk is een dergelijke disulfideverbinding te realiseren onder voldoende milde omstandigheden om de volledige biologische eigenschappen van de proteïne-bestanddelen van de gevormde conju-gaten te verzekeren.

Voor het realiseren van deze conjugaten is het 30 noodzakelijk dat de te koppelen proteïnen elk tenminste ëën zwavelatoom dragen dat van nature geschikt is of kunstmatig geschikt kan worden gemaakt voor het vormen van. de nagestreefde -disulfidebinding, en dat deze swavelatomen van te voren in de proteïnen aanwezig zijn of chemisch in. de proteïnen worden inge- 790 72 51 !* ·* T1 yoerd. Zoals eerder aangeduid "bezit de A-keten van ricinus van nature.' éen enkel zwavelatoom dat de gewenste koppeling mogelijk maakt. Het is het atoom van de thiolfunctie van het enige residu van cysteine omvat in de A-keten. Wat "betreft het immunoglobuline 5 of fragmenten daarvan dienen verschillende gevallen te worden beschouwd: 1) In het geval van een compleet immunoglobuline bestaat er van nature geen vrije thiolfunctie in deze proteïnen noch andere zwavelatomen die benut zouden kunnen worden voor de koppe-10 ling. Het is aldus geschikt in dit geval kunstmatig in het immunoglobuline molecuul een of meer zwavelatomen te introduceren zodanig dat: - de biologische eigenschappen van. het immunoglobuline niet verregaand worden gewijzigd, 15 - dit zwavelatoom of deze zwavwlatomen uiteinde— ’ lijk kunnen worden betrokken in de tot stand te brengen disulfidebinding met één of meerdere moleculen van de A-keten van ricinus.

2) In het geval van een fragment Fab, is de situa-20 tie identiek aan de bovenbeschreven situatie .- 3) Indien men een fragment van. het type Fab1 toe— past kan men het in de vrije thiolfunctie aanwezige zwavelatoom benutten voor het realiseren van de koppeling van. de A-keten. Men kan echter ook de kunstmatige introductie van een of meer zwavel— 25 atomen toepassen; het volstaat in dit geval van te voren de vrije thiolfunctie op stabiele wijze te blokkeren, b.v. door alkylering.

Ij·) indien men een fragment F(ab’ van immunoglobuline wenst te koppelen is het noodzakelijk, zoals voor het complete immunoglobuline, kunstmatig in F(ab1 een of meer zwa-30 velbevattende groepen te introduceren.

In alle gevallen dat in het immunoglobuline of fragmenten daarvan een of meerdere zwavelradicalen worden ingevoerd is het noodzakelijk elke substitutie op de herkenningsplaats van het antigeen of de onmiddellijke omgeving daarvan te vermij- 7S0 72 51 12 den, waardoor de eigenschappen van herkenning van het antilichaam. zouden worden gestoord. Teneinde.dit risico uit te sluiten kan . men tijdelijk de herkenningsplaats van het antigeen gedurende de substitutiereactie blokkeren door van te voren het antilichaam ; 5 met het. specifieke antigeen of een ander antigeen dat een voldoen- de verknopingsreactie biedt of ook nog een geschikt hapteen te behandelen.

De tijdelijke bescherming kan tot stand worden gebracht: 10 — Hetzij in vloeibare fase· indien.het complexe an- tilichaam-antigeen (of hapteen) in het reactiemilieu oplosbaar is; — Hetzij in. heterogene fase indien dit complex spontaan onoplosbaar is of ook nog indien men het vrijwillig met een. geschikte procedure onoplosbaar heeft gemaakt, in het bijzon— 15" der door het antigeen (of hapteen) zodanig op een onoplosbare drager te fixeren dat de aldus verkregen gewijzigde drager een voldoende affiniteit voor het antilichaam. vertoont.

Ha de substitutietrap is het geschikt de plaats van herkenning van het antigeen op het antilichaam te deblokke— 20 ren door een. geschikte elimineringsprocedure van het antigeen teneinde de specifieke herkenningscapaciteiten van het antilichaam te regenereren. Voor het realiseren van de disulfidebrug tussen de twee proteïnen is het niet mogelijk de twee bestanddelen van het conjugaat die elk een SH-groep bedragen bij elkaar 25 te brengen en tot. een oxydatie over te gaan. In deze omstandigheden is inderdaad de koppelingsreactie een evenwichtsreactie die men zeer moeilijk volledig kan laten verlopen. Bovendien wordt de gewenste reactie begeleid door de vorming van. polymeren van elk van de twee bestanddelen, waardoor een zeer laag rendement van 30 gewenst produkt kan ontstaan alsmede de aanwezigheid van moeilijk te verwijderen onzuiverheden.

Volgens de uitvinding wordt de bereiding van het conjugaat tot stand gebracht door een van de proteïnen die de vrije SH-groep draagt in aanraking te brengen met het andere pro- 790.7 2 51 • * 13 teïne waarvan de SH-groep is geactiveerd door transformatie in een gemengd disulfide met een geschikt gezwaveld organisch radicaal.

De bereiding van het conjugaat kan worden voorgesteld door het schema: : J P1-SE* +· P2-S-S-X —^-S-S^ + XSH, waarin en ?2 de twee te koppelen proteïnen voorstellen,, en X'de activerende groep is. Uit dit schema volgt onmiddellijk dat de koppelingsreactie in elk geval kan worden nitgevoerd volgens twee varianten waarbij het immunoglobuline of het fragment 10 daarvan, en de AAketen van ricinus voorstelt of omgekeerd.

Het geval dat het antilichaam of een fragment en P2 de A-keten van ricinus- voorstelt.

1 Toarr het uxtvoeren van de activering van de vrije SH-groep van de A-keten van ricinus maakt men gebruik van 15 de oplossing van A-keten bereid als eerder aangegeven die men aan * een- uitwis selingsreact ie onderwerpt: ASH. + XSSX-* A-S-S-X + XSH (1) -: waarin ASH de A-keten van ricinus en X de activator groep voorstelt .

20 In het bijzonder kan X een 2- of 4-pyridylgroep voorstellen die eventueel gesubstitueerd kan zijn met een of meerdere alkylgroepen, halogeen of carbonzuurgroepen, of X kan ook een fenylketen voorstellen, eventueel gesubstitueerd met een of meerdere genitreerde of gecarboxyleerde groepen. Reactie (l) is 25 een evenwicht sreact ie,. maar het evenwicht kan gemakkelijk naar rechts worden verschoven onder toepassing van een grote molaire overmaat van de XSSX-reactant die in het algemeen minder kostbaar en gemakkelijk verkrijgbaar is. Het is mogelijk de voortzetting van reactie (1) door spectrofotometrie in het ultraviolette of 30 zichtbare gebied te controleren want de zich vormende XSH-ver- bihding vertoont een intense absorptie. Fanneer de reactie de gewenste voortgang heeft bereikt, worden de overmaat van reactant X-S-S-X evenals het reactieprodukt S-SH door dialyse of filtra- 790 72 51 <s * » · ' Ilf .

I .

\ tie over een moleculaire zeef géi verwijderd. Tenslotte verkrijgt men een zuivere oplossing van de verbinding A-S-S-X in de gekozen buffer. Zo nodig kan deze oplossing na invriezen verschillende weken worden bewaard.

; 5 .Verder bereidt men het immunoglobuline gesubsti tueerd door een. SH-groep. Om dit uit te voeren maakt men gebruik van de eerder verkregen oplossing van immunoglobuline als zodanig, of na blokkering van zijn herkenningsplaats van· het antigeen door het overeenkomstige hapteen gevolgd door eliminering van overmaat 10 hapteen. Door de inwerking op dit proteïne van S-acetylmercapto— barnsteenzuur-anhydride, is het mogelijk aan, het proteïne via .zijn. vrije aminegroepen een of meerdere S-acetylmercaptosuecinyl-groepen per proteïne molecuul te fixeren, en daarna de. thiol— functies vrij te maken door de inwerking van hydroxylamine zoals ,T5 reeds beschreven (Archives of Biochemistry and Biophysics 119,

If1 — h9a (1967]) · Door een. dialyse kan men overmaat., reactiecompo— neuten verwijderen evenals de reactieprodukten met klein mole-cuulgewicht,.

. ' Al deze handelingen worden uitgevoerd in een fos— 20 faatbuffar bij een pH =7,0 en bij temperaturen niet hoger dan de omgevingstemperatuur. De uiteindelijk verkregen oplossing wordt ontdaan van. het' hapteen dat eventueel is toegepast als tijdelijk blokkeringsmiddel. Indien dit noodzakelijk blijkt kan deze b.v. worden geconcentreerd, door ultrafiltratie. De koppeling tussen de 25 aldus bereide twee reactiecomponenten vindt plaats, door eenvoudig contact in waterige oplossing- bij omgevingstemperatuur- gedurende ....... een tijd van enige uren tot een dag, volgens reactieschema A van het formuleblad;

Prot NÏÏ-CO-CH-SH + A-S-S-X-> Prot HH.C0 Cïï-S-S-A + XSH

t ! CH2 CHg (Λ) coo® coo® 30 Het voortschrijden van de reactie wordt gevolgd door spectrofotometrische dosering van de gevormde XSH-verbinding.

790 72 51 15

Deze wordt door dialyse verwijderd en men verkrijgt een oplossing van het verwachte conjugaat dat nog moet worden gezuiverd. Eet is inderdaad onvermijdelijk in het bijzonder de A-S-S-X moleculen te verwijderen die niet hebben gereageerd en die, indien • 5 zij in het conjugaat aanwezig zouden zijn, een niet-selectieve giftigheid zouden kunnen opleveren.

De zuivering kan worden uitgevoerd volgens verschillende békende methoden zoals gefractioneerde precipitatie met behulp van organische water-mengbare oplosmiddelen of zouten, .10 gelpermeatiechromatografie of ook affiniteitschramatografie over een kolom gevormd uit een onoplosbare drager waarop het antigeen wordt gefixeerd (of het hapteen) ten opzichte waarvan het anti-liehaam toegepast bij de bereiding van- het conjugaat wordt gericht.

15 Deze zuiveringsmethoden kunnen rechtstreeks op de gedialyseerde oplossing afkomstig uit- de koppelingstrap worden toegepast. Toch verkrijgt men betere resultaten en in het bijzonder vermijdt men de uiteindelijke vorming van polymeren van het conjugaat, wanneer men van te voren de vrijblijvende SH-functies 20 door een reagens blokkeert, zoals E-ethylmaleïmide.

Eet geval dat de A-keten. van ricinus en P„ het antilichaam voorstelt

De voor de koppeling noodzakelijke produkten zijn hier de A-keten van ricinus en het immunoglobuline (of fragment 25 daarvan) gesubstitueerd door een. groep die een of meer geactiveerde zwavelatamen draagt. De A-keten van ricinus wordt benut als verkregen door de beschreven zuiveringsprocedure. Eet immunoglobuline gesubstitueerd door een geactiveerd zwavelatoom weidt bereid uitgaande van het. immunoglobuline zelf, door substitutie, met 30 behulp van een reagens dat zelf een geactiveerd zwavelatoom draagt volgens het schema:

Frot + r-B-S-S-X-Prot-E-SS-X

waarin Prot het immunoglobuline voorstelt, Y een functie is waarmee de covalente fixatie van het reagens op het proteïne mogelijk 790 72 51 ' 16 f is, R een groep is die gelijktijdig- de substituenten Y en -S-SX kan dragen, en X de activerende groep voorstelt* Een dergelijk type reactie is reeds toegepast voor bet koppelen door een disul-fidebrug van twee proteïnen (identiek of verschillend) maar de 5 toepassing vair dit principe voor het koppelen van een immuno— : globuline met de- A-keten van. ricinus- is nieuw*

De functionele Y-groep is een functie die in staat is een covalente binding aan te gaan met een van de functies gedragen door de zijketens van de aminozurencomponenten van 10 het te substitueren proteïne*. Hieronder zijn in het bijzonder de eindstandige geamineerde functies van de lysylgroepen aanwezig I in het proteïne aangewezen*

In dit geval kan Y in het. bijzonder voorstellen: een carbonylgroep die., zich kan binden met geamineerde functies 15 van het. proteïne in aanwezigheid, van een koppelingsmiddel, zoals; een carbodiïmïde en in het bijzonder een .in. water oplosbaar derivaat.,. zoals het ethyl—1 -(.di'ëthylamino-3-pr opyl) —3-c arbodi Snide, - een carbonzuurchlori de. dat direct kan. worden gereageerd met de· geamineerde; functies om deze te acyleren, 20 — een "geactiveerde ester", zoals een. ortho- of . parafenylester of een nitro- of een. dinitrofenylester. of ook een. ester van H-hydroxy-succinimide die rechtstreeks reageert met de geamineerde· functies en deze acyleert, - een. inwendig anhydride van een dicarbonzuur zo-25 a-s b.v* barnsteenzuuranhydride dat spontaan reageert’ met de geamineerde functies onder vorming van amide-bindingen, - èen imino-estergroep -C s » waarin R^ een al-kylgroep is die reageert met --de gesmine erfde groepen van· het proteïne volgens het- reactieschema B van het formuleblad H ..... .......

HH ^ w 30 Prot-ΗΗο + C-Rp -* Frot Iïï-Ö-Rp + R-OH , waarin X een functionele groep voorstelt die in staat is tot reactie met een vrije thiolgroep.

790 7 2 51 / * -z

1T

In het bijzonder kan X een 2-pyridyl— of ^-py-ridyl-groep aanduiden eventueel gesubstitueerd met een of meer alkyl-, halogeen— of earboxylgroepen. X kaa tevens een fenyl— groep aanduiden die bij voorkeur gesubstitueerd is met een of : 5 meer nitro- of carbonylgroepen. X kan ook een alkoxycarbonyl- ? groep voorstellen zoals de methoxycartonylgroep.

De R-groep duidt elke groep aan die in staat is gelijktijdig de substituenten Y en S-S-X te dragen» Deze moet zodanig worden gekozen dat deze geen functies omvat die het ver— 10 loop van de reacties die- uiteindelijk met de toegepaste reactan— ten plaatsvinden en de gesynthetiseerde produkten» kunnen, storen» lór het· bijzonder kan de R-groep een -(CH^^-groep zijn, waarin n 2 — 10. is, of ook een groep, : CE- r waarin R^ waterstof of een alkylgroep met 1-8 koolstofatomen 15 voorstelt en R^ een substituent is die inert is ten opzichte van de uiteindelijk toegepaste. reactanten, zoals een amidegroep -HE-C(0)-QRS, waarin R^ een rechte of vertakte alkylgroep met 1-5 koolstofatomen voorstelt,, in.het bijzonder de tertiaire butylgroep.

20 De reactie van de verbinding Yr-R-S-S-X met het immunoglobuline wordt in de .homogene vloeibare fase tot damp gebracht, meestal in water of in een gebufferde oplossing. Fanneer de oplosbaarheid van de reactanten het vereist is het mogelijk aan het reactiemilieu tot 20 ύο1.% van een organisch oplos— 25 middel, dat mengbaar is met water,, toe te voegen, zoals een alcohol en in het bijzonder· tertiaire butanol.

De reactie wordt uitgevoerd bij omgevingstemperatuur gedurende een tijd die varieert van enige uren tot 2b uur.

Daarna is het mogelijk met een dialyse produkten met kleine mole-30 cuulgewichten te elimineren en in het bijzonder de overmaat reactanten. Door deze methode is het mogelijk een aantal substituent- 790 72 51 η 18 / · - • ί groepen per molecuul proteïne tussen 1 en 5 te introduceren.

Bij toepassing van dergelijke verbindingen wordt de koppeling met de A-keten van ricinus gerealiseerd door de twee proteïnen in. aanwezigheid van een waterige oplossing te- bren— 5 gen op een temperatuur niet hoger dan 30°C gedurende een tijd van : enige uren tot een dag. De reactie vindt- plaats volgens het schema:

Prot-R-S-S-X + ASE-> Prot-R-S-S-A + XSH

waarin Prot-R-S-S-X het gesubstitueerde immunoglobuline (of een 10 fragment daarvan) voor stelt,, geactiveerd aan het zwavelatoom en-ASH de- A-keten van ricinus voorstelt. De verkregen oplossing wordt, gedialyseerd ter eliminatie, van- de produkten. met klein molecuul— gewicht * waarna, het conjugaat kan. worden gezuiverd- volgens verschillende bekende- methoden:, zoals· reeds vermeld bij de eerste :15 methode, voor het verkrijgen van de conjugates.

De uitvinding zal nu verder worden, toegelicht .*>- 1 met de- voorbeelden.die niet beperkend zijn bedoeld. Inde nu volgende voorbeelden wordt .met TPE de fosfaatbuffer 0,125 M, pH = 7,0 aangeduid die· het dinatriumzout van ethyleendiaminotetra-azijn-20 zuur bevat y 1 mM,

Voorbeeld Γ

Bereiding van 'het ricinus a) Extractie

Men maakt 1 kg· gehele ongeschilde zaden van.

25 Ricinus communis fijn met een snijmolen zodanig dat men een pasta verkrijgt die men zorgvuldig aanwrijft; met 2 liter ethylether gekoeld tot k°C, Ha eliminering van de ether herhaalt men de ontvetting tweemaal.met steeds 2 liter ether. Ra de laatste verwijdering van de ether wordt het residu aan.de lucht gedroogd en le— 30 verb UOO g ontvet poeder. Dit poeder wordt in suspensie gebracht in 3^00. ml natriumchloride-oplossing 0,1¾. M afgekoeld tot U°C, waarna de pH van de suspensie wordt gebracht op een waarde van ¾ door toevoeging van azijnzuur. De suspensie afgekoeld in een - · ijsbad wordt onderworpen aan een homogeniseringsbehandeling door 790 72 51 ' 19- * 4 snelle roerig in een kern. ran. een snijmolen gedurende 30 sec gevolgd door· een rustperiode van 30 onder afkoeling in het ijsbad. Deze kringloop van homogenisering/rusten wordt 8 maal , herhaald» Fa het tot- stand brengen van de extractie wordt de sus-|5 pais ie gecentrifugeerd en levert ongeveer 3^00 mL van een helde-1 .re oplossing. Deze wordt, overgebracht in een dialysebuis met een breedte van 10 cm. en eerst gedialyseerd tegen gedestilleerd va-; ter (dat continu wordt ververst) gedurende U8 uur, daarna, gedu-. rende 2h uur tegen de buffer TRIS-HC1 10 mM, pE =· 7,7, continu 10 ververst met een debiet van 1 liter per uur. Tijdens de dialyse vormt zich een neerslag dat door filtratie met gefrit glas wordt . verwijderd. Men verzamelt aldus 3^00 mL van de ruwe oplossing die 12 mg/ml proteïne bevat. Deze oplossing kan bij -20°(T worden op— geslagen.

15 b) Zuivering

Een kolom met een inwendige diameter van 100 mm wordt gevuld met- 5 .liter sepharose kB Pharmacia en in evenwicht gebracht met de buffer TRIS-EC1-10 mM, pH — 7,7 af gekoeld tot -ka{J. Mien brengt in de top van deze kolom 1700 ml d.w.z. de helft 20 van de eerder verkregen ruwe oplossing in een debiet, van 300 ml/ uur. Vervolgens wordt de kolom gewassen met 3 1 buffer TRIS-HC1 10 mM, pH = 73-7 onder handhaving van hetzelfde debiet, waarna men het filtraat dat de niet-gefixeerde proteïnen bevat verwijdert door affiniteit aan de kolom.

25 Men elueert vervolgens steeds met hetzelfde de biet per k liter van dezelfde buffer die Q,Q5Q g (0,28 mM) galactose per liter bevat en verzamelt deze fractie. Vervolgens elueert men nog steeds met een debiet van 300 ml per uur per k liter van dezelfde buffer die 0,100 S (0,56 mm) galactose per liter bevat.

30 Deze fractie wordt toegevoegd aan de voorafgaande, hetgeen 8 liter oplossing levert die ongeveer 300 meg ricinus per ml bevat.

Teneinde de kolom opnieuw te kunnen gebruiken voor een slot-bewerking wordt deze geëlueerd met 1 liter buffer TRIS-EC1 pE = 7,7 die 18 g (0,1 Mi galactose per liter bevat, hetgeen een frac- 790 72 51 ? e -· * r .

i • ; 20 i · { toe levert die in vezen het agglutinine, dat is verwijderd, "bevat . Fa. was sing met nog' eens 1 liter van. dezelfde "buffer, ver— ; volgens met verschillende liters van de zuivere "buffer TEIS-HC1 I pa = 7,7 is de kolom opnieuw gereed voor gebruik..

! 5 Een., identieke behandeling- wordt uitgevoerd: met t ! .de andere helft: van de ruwe oplossing: verkregen in. a. De geëlu-eerde fractie wordt, gevoegd, bij de voorafgaande, hetgeen 16 liter oplossing van ricinus, levert in de buffer TRIS-HC1 10 mM pH =

TyJ' die gemiddeld, is. beladen, met 0,075 g galactose per liter.

;10 Deze oplossing wordt, geconcentreerd via een. ultrafiltratie mem— ! braan met een zodanige porositeit dat passage van. bdLvormige mole— I. culenmet een molecuulgewicbt. kleiner dan. 30 »000 mogelijk is, in een cel met een diameter van 150 mm.' Men verkrijgt tenslotte JÖ2 ml van de ricinus-opióssing, in. de oorspronkelijke buffer a 6,7 g .15-.., per ml. Deze· oplossing karr bij.-2Q°C. worden, opgeslagen..

! ' Eet aldus- verkregen, ricinus bezit de· volgende eigenschappen: molecuulgewicht: 66000 + 5000 bepaald, door elek— tr of ore se in. aanwezigheid, van. nat riumdodecyisulfaat volgens het Journal of Biological Chemistry 2bk, ^06” — ^1+12., (.1969), Iso-20· electrisch punt:-"Τ,-1 bepaald, door electroforese in vloeibaar bloed (Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology Yol.

5, deel II, biz. 501,· uitgevers: T.S. Fork en E. Fork (loord Holland).

Alle klassieke analytische methoden toegepast 25 op het aldus verkregen, ricinus leiden tot de conclusie dat het . ...

produkt zeer zuiver is.

Voorbeeld II

Bereiding van de'A-keten'van ricinus

Aan 150 ml wan de ricinus-oplossing verkregen 30 in voorbeeld I die ongeveer 1 g ricinus bevat wordt 3,75 ml mer-capto-2-ethanoi toegevoegd en men laat de. oplossing gedurende 2 uur bij 20°C staan. Deze oplossing wordt vervolgens aangebracht in de top van een. kolom met een inwendige diameter van 50 mm ge— .......... . , vuld met 1800 ml DEAE CL sepharose 6B Pharmacia en in evenwicht 790 72 51 21 gebracht met de "buffer TRIS-HC1 0,1 M, pH = 8,k die 2.,5% (VoliVol) mercapto-2-rethanol "bevat.

De kolom wordt gewassen: met 300" ml van de· buffer IRIS-HCl 0,1 M, pH = die natriumchloride 0,1 M bevat en 2,5% : 5 (Yol/Vol) mercapto-2-ethanoI. Men verzamelt een enkele fractie na. het aanbrengen (ongeveer k50 ml) die de A-keten bevat, gexden-• tificeerd door electroforese, in een concentratie van ongeveer 0,89 mg/ml.

Deze fractie wordt zorgvuldig gedialyseerd in 10 een. dialysebuis met een platte breedte van 20 mm tegen de fos— faatbuffer 10 mM, pH' — 6,5. Deze oplossing wordt gedeponeerd in een kolom met een inwendige diameter van 25 am die 300 ml car-boxymethylcellulose CM 52 bevat,. in-de· handel gebracht door Whatman, in evenwicht gebracht'met fos faatbuffer 10 mM, pE — 6,5. Onder * 15 déze pE omstandigheden en ionxsche kracht- fixeert, de A-keten zich en men elueert deze vervolgens met TEE- Men verzamelt aldus 6T ml van een oplossing van de A-keten die 5»J2. mg/ml bevat.

De A-keten heeft de volgende eigenschappen die op identieke wijze zijn. bepaald als die vermeld voor ricinus 20 (voorbeeld I]:

Molecuulgewicht: 3Q.OOO +; 3.000

Tso-electrisch punt: 7,5.

Vérder heeft men volgens de methode van DTEB (Mé-thods in Enz^mology 25, ^5T (19T2] (Academic Press] 0,96 equiva-25 lent SE per mol van keten A geschat op 30.000 molecuulgewicht gedoseerd. De kolom van DEAE CD sepharose 6B die heeft gefungeerd voor de scheiding kan voor nieuw gebruik worden geregenereerd door wassen met de buffer TRIS EC1 0,1 M, pH = 8,U die natriumchloride 0,1 M en galactose 0,1 M bevat, die de B-keten gefixeerd in de 30 kolom elueert. De kolom kan vervolgens opnieuw in evenwicht worden gebracht met de buffer THIS EC1 0,1 M, pH = 8,¼ die 2,5% mer— eapto-2-ethanol bevat, teneinde opnieuw de A-keten te bereiden. Concentrering van de A-keten van ricinus

De A-keten verkregen in verdunde oplossing wordt 79072 51 ; 22.

/ . ... ; I

aangebracht in een chromatografiekolom mét een inwendige diameter van 16 mm die 10 ml carboxymethyl-sepharose "bevat in even— wicht gebracht met dezelfde buffer.. Onder deze omstandigheden ; wordt de A-keten. gefixeerd; deze wordt vervolgens geëlueerd met i. 5 de buffer TFE» De winning is kwantitatief » ί „ ' ' ; Een afzetting van. 150. mg A-keten maakt. het. moge- lijk fracties, te elueren met de gemiddelde concentratie van 10 mg/ ml- in A-keten, hetgeen in totaal 9% van de in de kolom af gezet— ! te hoeveelheid voorstelt. De aldus verkregen geconcentreerde op— . jo lossing, heeft een zeer hoge zuiverheid.

; Hef verkrijgen- van kristallen van de A-keten

Een oplossing van de A-keten in. een gelijke concentratie van 10 mg/ml wordt, bij 4°C bewaard». Deze blijkt na enkele dagen kristallen te leveren waarvan de analyse, na her— "IJ oplossing, uitmaakt dat zij dezelfde fysicochemische eigenschappen (molecuulgewicht,, iso-electrisch punt) en biologische eigen-s schappen (remming'van. de eiwit-synthese) bezitten, als de A-keten in oplossing waarvan, zij zijn afgeleid.

Voorbeeld III

20, Bereiding van de A-keten van de ricinus.

Aan 70 ml. van een oplossing van ricinus verkregen volgens de techniek van voorbeeld I die k mg/ml ricinus bevatte, wordt toegevoegd 1,75 ml mercapto-2-ethanol en men laat de oplossing 2 uur bij 20°C staan. Deze oplossing wordt aangebracht 25 in een kolom die 800 ml QAE Sephadex A50 Pharmacia bevat, in evenwicht gebracht met de buffer TRIE HC1 100 mM, pïï = 8,Λ die 0,5% (Vol/Vol) mercapto-2-ethanol bevat. De elutie wordt met dezelfde buffer uitgevoerd. Men verzamelt tijdens, het depot een fractie van 170 ml die 0,9 mg/ml A-keten bevat die men vervolgens behan-30 delt als aangegeven in voorbeeld IX.uitgaande van. de dialyse- behandeling. De aldus verkregen A-keten heeft dezelfde eigenschappen als die verkregen in voorbeeld II. Voor het regenereren van de kolom kan men de gefixeerde B-keten elueren door de buffer TRIS HC1 100 mid, pK = 8,1+, waaraan natriumchloride 0,15 M is toegevoegd, 790 7 2 51 / X > 23 « waarna de kolom wordt gewassen met de buffer THIS HC1 10 mM, pH -7,7.

Voorbeeld IT

Bereiding van zuivere anti-DÏÏP antilichamen I 5 Onder de aanduiding· anti-DÏÏP antilicbaam ver- ? . staat men antilichamen die specifiek zijn gericht tegen de groep dinitro-2,U-fenyl .. a} Immunisering van dieren:

Men realiseert de gewenste, immuniteit door di— 10 nitro-2 3 U-benzeen-sulfonaat. te laten reageren met het γ-globu— line van runderen volgens een klassieke techniek die leidt tot het fixeren van 52- groepen dinitró-2,U-fenyl per mol proteïne (DÏÏP^-BGG·) - Door immunisering met. dit produkt zal een fractie van de gevormde antilichamen specifiek worden gericht tegen het '15 hapteen dinitro-2 ,1-fenyl.

Drie bokken worden elk gelïïimuniseerd door injectie van 5 mg DHP^-EGG in een. emulsie verkregen uitgaande van 2__ valume-delen fysiologisch water gebufferd tot'pBT 7 Λ per volume volledig toevoegsel van Preund. De eerste immunisering wordt ge— 20 volgd door T herhalingen met tussenpozen gedurende een jaar. Parallel hieraan ondergaat elk dier 12 bloedbemonsteringen van 1 liter bloed» Eet serum wordt bereid en geconcentreerd bij -20°C.

Voor de zuiveringstrap verenigt men 17 monsters waarvan men het complement door verhitting activeert. Vervolgens wordt gedurende 25 30 min bij 20.000 g gecentrifugeerd ter eliminering van de gedena tureerde proteïnen en de aggregaten* waarna men tenslotte over papier filtreert om de vetten in suspensie te houden. Het aldus bereide serum is gereed voor de zuiveringstrap» b) Zuivering; 30 Deze trap heeft ten doel de specifieke adsorp tie van anti-DÏÏP antilichamen van het serum op een proteïne die het hapteen dinitro-2,fenyl gefixeerd op een vaste drager draagt.

De vrije of niet-specifiek gebonden stoffen worden vervolgens geëlimineerd, waarna de zuivere antilichamen. worden geëlueerd.

79072 51 A ...... 5 ί ..... - : “ ' ' : 2k ’ / < · .

1 Bereiding van, de imm'uiioad.s orpt ie drager

De immunoads orpt ie geL is samengesteld door koppeling van 1Ö30. mg albumine van menselijk serum dat 35 dinitro-fenylgroepen draagt (DHP^-HSA) en 100 g (droog gewicht) Sepharose I 5 hB volgens de klassieke techniek.* Een spectrofotometrische dosis van 28Ο nm. en 360 nm. van- waswater na· de koppeling maakt het- mogelijk een rendement van de fixatie van 95% van DHF^-HSA te constateren. Twee wastrappen worden uitgevoerd: eerst hij een pH * 3*0 (glycine-chloorhydraat buffer 0,S M die. natriumchloride 1M he— · . TO vat.)* daarna hij" een pH - 10,0 (horaat. buffer 0,1' M* die natrium-chloride 1M bevat)., De gel..wordt vervolgens in evenwicht gebracht in de werkbuffer:· fosfaathuffer 0 *1' M, pH = T die natriumazide bevat 0,01$ (gewicht/volume).

Adsorptie van antilichamen: - \J Alvorens over te· gaan .tot adsorptie op de als bo ven bereide gel‘is het· geschilct de; volumetrische. verhouding van serum/gel te bepalen die moet .worden gebruikt om op de drager slechts de anti-DUF antilichamen met' de grootste affiniteit te fixeren. Om. dit: resultaat te· bereiken verkiest, men op de kolom niet 20 meer dan 50% van·, de globale- antilichaam-activiteit van. het serum, te fixeren, waarbij de- andere 50% in de bovenstaande vloeistoflaag wordt achtergelaten.

Voor een gegeven serum, wordt de. bepaling van de. hoeveelheid te gebruiken gel uitgevoerd..door te werken met klei-25 ne hoeveelheden onder, analytische omstandigheden. Aliquots van 125 microliter immunoabsorberende gel. worden, in aanraking gebracht met serumvolumes ineen meetkundige, progressie van 2 tot 0,5 ml. tot 8 ml. Ha de incubering wordt de bovenstaande vloei— stoflaag voor zijn anti-DNP antilichaam-activiteit gedoseerd met 30 een klassieke radio-immunologische dosis (Handbook of Experimental Immunology Vol. 1, hoofdst. 15» blz. 1 — 18, uitgever: D.M.

Weir, tweede druk. 1973) onder toepassing van £ -H-( dinitro-2, U-fenyl)-L-lysine getitreerd op de fenylkern op plaats 3 en 5*

Men kan tevens voor elke proef de antilichaam- 79072 51 25 activiteit, die in de "bovenstaande laag· overblijft, uitdrukken door het percentage (A) van de activiteit van het uitgangsimmuno-serum voor de behandeling door de gel en de overeenkomstige kromme A (%) - f (volumeverhöuding serum/gel) uitzetten. Op deze krom-5 me leest men de hoeveelheid serum af noodzakelijk met 125 micro-' liter· gel opdat 50% van de autolichaam activiteit in de vloei- stof-bovenlaag achterblijft- Deze hoeveelheid is, bij het beschreven experiment, ml of nog 32 ml serum per ml immunoadsorptie-gel- 10 Wanneer deze verhouding is bepaald roert men in een houder van 10 liter, 6150 ml immunoserum met 193 ml immuno— adsorptiegel gedurende een uur* bij een omgevingstemperatuur en daarna gedurende de nacht bij U°C-

Fa centrifugering (1000 x g, 10 min) wordt de gel 15 afgescheiden en brengt men. de vaste koek in suspensie in een volume bovenstaande vloeistof . Men· giet deze suspensie over in een. chromatografiekolom (diameter 26 mm, lengte ^00 mm) uit ge— * ,o ...

rust met een koelmantel bi«j k C",. een inrichting voor het registreren van de optische dichtheden, bij 280 nm en. een fractie verza— 20 melinrichting,. "Vervolgens wordt de kolom gewassen met 8 liter fos— faatbuffer 0,1 M, pH = 7,0 die 0,01¾ natriumazide bevat. De wassing wordt uitgevoerd gedurende U0 uur bij 4°0, daarna gedurende 2b uur bij omgevingstemperatuur. Bij beëindiging van het wassen is de optische dichtheid bij 280 nm buitengewoon klein (DO < 0,04).' 25 Elutie van de antilichamen:

De elutie van de anti-DHP antilichamen gefixeerd in de kolom wordt uitgevoerd door een grote overmaat van een oplossing van het hapteen dinitro-2,^—fenol.

Men maakt gebruik van een oplossing van dini-30 tro-2, H-fenol 0,2 M in dezelfde fosfaatbuffer als eerder toegepast en waarvan de zuurgraad is geneutraliseerd tot een pH = 7,0 door toevoeging van natronloog. De aldus verkregen oplossing moet beschut tegen licht worden bewaard. Voor de elutie maakt men gebruik van 2,8 liter van deze oplossing die gepasseerd is door de 790 72 51 «r i ....... .....

: 2 6 .· · kolom in een hoeveelheid, van 125 ml/uur. Ter eliminering van het dinitr0-2,1—fenol van de gellueerde oplossing wordt deze onmiddellijk over een tweede kolom gepasseerd die 300 ml hars Dowex 1 x 10 "bevat... (ionenuitwisselingshars, samengesteld uit: een sty— I 5 ' reen-divinylbeazeenpolymeer, dat quaternaire aminegroepen be— 't vat) in evenwicht gebracht in de fosfaatwasbuffer.

De: antilichamen worden geëlueerd in een afzonderlijke piek: van. proteïnes gevolgd door een spoor.. Enerzijds worden de verkregen, fracties, met een. optische dichtheid ^ 0,9 (frac-10 tie B1,. 700 ml) en anderzijds de andere fracties (fractie· B^, 2000 ml) hergroepeer!.. De proteïneconeentratie van elk van de frac— . . | _ ties wordt bepaald, volgens het Journal of· Immunological. Methods;,, i 15, 101 - 119,. (1977)·. '

De -fractie bevat 15,1 g antilichamen d.w. z* 15' 22 g/1, terwijl de- B^-fractie ongeveer 1 g. antilichamen bevat, d.w.z. 0,5 g/1. De conservering wordt, uitgevoerd: bij -20°C in • de buffer van wasfosfaat" (0,1 M, pE * 7,0) die. 0,0.1 ^ natrinmazide bevat .

De verschillende toegepaste fysieochemische me— 20 thoden en in het bijzonder de electroforese met agarosegel over dunne- lagen, de immuno-electroforese, de passage over een sepha— dex G-kolom (dextran gel in de vorm van parels, verkregen door verknoping van- dextranfraeties met epiehloorhydrine, toegepast voor* gelfiltratie) maken het mogelijk de zuiverheid van de ver-25 kregen antilichamen te bepalen, en. vooral de afwezigheid van opspoorbare hoeveelheden albumine (kleiner dan 1/500 van de antilichamen) en immunoglobuline Min de verkregen preparaten.

De immunologische activiteit van de gezuiverde antilichamen is bepaald volgens de methode van ΜΞΜ (Journal of 30 Immunology 119, 1, 301, (1977)) in. vergeli jking met die van het uitgangsimmunoserum en die van de antilichamen aanwezig in de bovenstaande laag van de immuno-adsorptie (fractie ).

79072 51 ƒ

2T

t

Gemiddelde Verspreidingsindex.

_associa^ieconfffcsmte____22n_de_a^initeiten_— — 7 li '

Immunoserum. 2,0 , 10 M 0,50

Fractie A1 5 * 10^ 0,22 ; 5 Fractie BT 2,5 . IQ^ 0,75

Deze resultaten geven aan dat de gezuiverde anti— lichamen (fractie B^) een veel grotere gemiddelde affiniteit dan het uitgangs—immunoserum. en. zeker dan de fractie en een. veel grotere homogeniteit van affiniteit dan het immunoserum- "bezitten. 10 Voorbeeld' V

Bereiding van het cónjugaat verkregen uitgaande, van mercapto-ge— succinyleerde anti-DHP antilichamen en van de A-këten van geactiveerd ricinus a} Bereiding van de'A-keten van geactiveerd ricinus 15 15 ml Van een oplossing van de A-keten in de fosfaathuffer (voorbeeld IT) .die 1,1 mg/ml van de A-keten bevat, worden gemengd met·. 8 ml van een oplossing van 1 ,452 mM dipyridyl— 2,2'-disulfide in dezelfde, buffer. De oplossing laat men bij omgevingstemperatuur beschut tegen licht- gedurende een uur en 30 20 min staan. Men verkrijgt aldus een oplossing van. de A-keten geactiveerd aan de thiolfunctie die Q,9 mg proteïne per ml bevat.

Ba de reactie geeft een spectrofotometrische dosering bij 3^3 nm aan dat het gevormde produkt 0,9 de actieve groepen -S-S -9 per mol A-keten bevat. De oplossing wordt continu gedurende 18 uur 25 bij een temperatuur van 5°C door dialyse tegen het TPE gezuiverd.

De zuivere oplossing wordt bij -2Q°C bewaard.

bl Bereiding van mercapto-gesueeinyleerd. anti-BBP antiliehaam

Aan een 3,3 ml oplossing van anti-DHP antiliehaam (voorbeeld IV) die 25,8 mg/ml zuivere antilichamen bevat wordt 30 0,37 ml van een waterige oplossing van dinitro-2,4-fenol (0,57 mg/ ml} toegevoegd, waarbij gedurende 10 min bij omgevingstemperatuur wordt geroerd. Deze oplossing wordt kwantitatief toegevoegd aan 790 72 51 28· 3,06 mg van het S-acetyl-mercapto barnsteenzuuranhydride (Archives of Biochemistry and. Biophysics 96, 605 - 612, (1962)) en. men laat het mengsel onder- roeren gedurende 2 uur hij omgevingstemperatuur staan.

5 . Aan. deze oplossing wordt 0,47 ml van een vate— „. rige oplossing van hydroxylamine, 0,.1 M pïï = 8,0,. toegevoegd en ’ men laat het mengsel 1 uur en 30 min hij omgevingstemperatuur staan. Het preparaat wordt'tegen 4 x 3 liter TPE gedialysee.rd gedurende 89 uur hij 5°C,. waarna de gedialyseerde oplossing wordt 10 gecentrifugeerd met 271000 x g gedurende 10 min. hij 4°C. De bovenlaag· wordt door een Dower harskolom gevoerd 1 x 8 met een kor-relgrootteverdeling van 0,θ4θ — 0.,075 mm (200 — 400 mesh) in de vorm. van. fosfaat, teneinde het dinitro-2,4-fenol dat gefixeerd is aan. de plaats- van herkenning' van het antigeen te· elimineren.

15 Vervolgens, wordt met het TPE hij omgevingstemperatuur- geelu- eerd, waarna- de oplossing door ultrafiltratie wordt geconcentreerd.

" · . Tenslotte1 verkrijgt men 4,55 mL oplossing, die· 1T,0 mg/ml mer-capto. gesuccinyleerde antiliehamen bevat».

... .. Volgens de. methode beschreven. in Archives Bio- 20 chemistiy and Biophysics 119, 4i - 49 (1967), kan men bepalen dat het molecuul van het gesubstitueerde antilichaam if· mercaptosueci- -nylgroepen per mol antiliehamen draagt, c.) Conjugaat 12,4 ml Van de oplossing van de geactiveerde A-25 keten van ricinus (bereid volgens de techniek van paragraaf a) (1 mg/ml, d.w. z. 0,413 micromol) wordt gemengd met 6,5 ml. van een oplossing van anti-DHP antiliehamen die 4 mercaptosuccinyl-groepen dragen (bereid volgens de methode van paragraaf b) (15 mg/ ml d.w.z. 0,658 micromol). Men laat het mengsel gedurende 20 uur 30 bij omgevingstemperatuur beschut tegen licht staan.

De spectrofotometrische dosis bij 3^3 nm van het in het reactiemilieu bevrijde 2-pyridine thiol wijst aan dat 0,251 micromol van de A-keten. is gekoppeld, aan 0,658 micromol anti-lichamen. Het preparaat wordt gedialyseerd tegen 3x5 liter TPE

790 7 2 51 29 gedurende 75 uur "bij 5°C, .waarna de -verkregen oplossing (17 ml) wordt gefiltreerd met een steriliserend membraan (0,45 micrometer} en bij -2Q°C geconserveerd. Vervolgens wordt gezuiverd door . filtratie over Sephadex G2Q0 gel*. Om. dit uit te voeren worden 7 ml 5 van. de boven verkregen oplossing gecentrifugeerd, met 27-000 x g gedurende 10 min,, waarna de bovenstaande vloeistof wordt behandeld met 0,6 ml van een oplossing van H-ethylmaleïmide (0,645 mg/ml) in het TEE. gedurende. 30 min rust bij omgevingstemperatuur.

De oplossing wordt in opwaartse richting gefiltreerd in een ko— 10 lom (diameter 26 mm) die 473 ml Sephadex gel G200 bevat. Het produkt wordt geeluee-rd door het TEE met een debiet can ΐ6 ml/uur en de afvoer wordt per fracties van 2 mL verzameld.

In elke fractie meet men de concentratie van anti-lichamen door spectrofotometrie bij .280 nm. en die van de A-ke— 15 ten door zijn remmend vermogen op de acellulaire-eiwitsynthese.

Aldus wordt het bewijs geleverd van het bestaan van 2 elutiepie— : ' ken die tegelijkertijd het antilichaam. en de A-keten bevatten, waarbij men de fracties die overeenkomen met elk van deze pieken hergroepeert ter verkrijging van de oplossingen a en h. Met de 20 eerste piek (oplossing a) komt het conjugaat met een gemiddeld molecuulgewicht groter of gelijk, aan 800.000 overeen. Dit prepa--raat komt overeen met een conjugaat afkomstig van. gepolymeriseer-de anti lichamen door intermoleculaire dizvavelbruggen gevormd tij- . dens de isolering var het mercapto-gesuccinyleerde antilichaam.

25 De tweede piek (oplossing b) is gevormd- uit proteïnen met een gemiddeld molecuulgewicht van 190.000 hetgeen overeenkomt met con-jugaten waarin het antilichaam niet is gepolymeriseerd. De uitgevoerde analytische bepalingen tonen aan dat de oplossing a) 423 micro-gram/ml antilichaam en. 20 micro-gram/ml. A-keten bevat, d.w.z. 30 ongeveer gemiddeld 0,2 mol A-keten per mol antilichaam. Eveneens bevat oplossing b] 171 micro-gram/ml antilichaam en 13 micro-gram/ ml A-keten, d.w.z. ongeveer gemiddeld 0,4 mol A-keten per mol antilichaam.

79072 51 • 30

Voorbeeld VI

Con.jugaatpreparaat verkregen uitgaande van. anti-DNP antilichamen gesubstitueerd mét 'geactiveerde zwavelatomen en de A-keten van ricinus ' i 5 a) (Byridyl-2-disulfonyl) —3-~pro~pionzuur t ; Dit produkt verkrijgt men in twee trappen uitgaan de van dipyridyl-2,2'-disulfide zonder zuivering van het tussen-produkb.

(Zie reactieschema C. van. het formuleblad).

10 Men lost U g. dipyridyl-2j 2* -disulfide op in 25“ ml. methyleenchloride waarna, men-gedurende ongeveer 30 min chloor in de oplossing: laat borrelen. Er vormt zich tijdens de- reactie, een. neerslag. Het mengsel, wordt onder sterk vacuum, drooggedampt, ί waarbij men het droge· residu gebruikt voor de volgende behandeling. 13 g Sulfenyl-2-pyridinechloride- wordt opgelost in Uo ml methyleenchloride waarbij· onder afkoeling door. een ijsbal langzaam onder roeren van de oplossing 1,/75 g mercapto-3-propionzuur wordt toegevoegd, in 10 ml methyleenchloride.. Na. beëindiging van. de toevoeging laat men. het mengsel gedurende 15 uur 20 bij omgevingstemperatuur staan onder roeren. Er wordt 50 ml water toegevoegd en de pH op ^,5 gebracht· door toevoeging van 1N loog. De organische fase wordt, afgescheiden, er wordt, met natriumsulfaat gedroogd en het oplosmiddel verdampt tot het prödükt droog is.

Er blijft een olieachtig produkt over dat uitkristalliseert (1,8 g). ' 25 Dit wordt gezuiverd door oplossen, in l6,8 ml van. een waterige oplossing van natriumbicarbonaat (.0,5 M). Er wordt actieve kool toegevoegd en de oplossing gefiltreerd,, waarna het verkregen produkt door toevoeging van geconcentreerd azijnzuur (0,5 ml) zodanig dat de pH tussen 3 en 3,5 wordt gejouden wordt neergeslagen.

30 Het neerslag wordt uitgeloogd, waarna men .het. onder sterk vacuum droogt en een vaste stof verkrijgt (1.,3 g) met een Fc = 62 - 6h°C.

b) Bereiding van geactiveerde anti-DNP antilicbamen

Teneinde elk spoor van een thiolgroep die zou kunnen bestaan in het gebruikte produkt te alkyleren wordt 13 ml van 790 7 2 51 ; 31 * * * * een anti-DNP antilichaam. oplossing (23,6 mg/ml) opgelost in een fosfaathuffer, 0,1 M, pE = 7,0, met 1 ml van een E-ethylmaleïmide oplossing (1,29 mg/ml) in het TPE» Er wordt gedurende 5 uur hij kamertemperatuur geroerd, waarna, de oplossing continu hij 5°C : 5 wordt, gedialyseerd tegen het TEE gedurende 15 uur hij een debiet van 500 ml/uur. De inhoud van de dialysezak: (12 ml a 21,3 mg/ml) wordt gemengd met 2h ml water· dat 19,9 mg 1 -(dimethylamino-3-pr o-pyl)-3-ethylcarhodiimide, 55,7 mg (pyridyl-2-disulfonyl)-3-pro-pionzuur en 1¼ mg hydroxy—1-henzotriazool bevat·. Het mengsel wordt 10 gedurende 16 uur hij omgevingstemperatuur geroerd en daarna met 27-000 x g gedurende 10 min gecentrifugeerd. De oplossing wordt continu hij 5°C gedurende 23 uur gedialyseerd tegen. TEE hij een dehiet van 500 ml/uur. Aldus wordt 3¾ ml oplossing verkregen met 7,2 mg proteïne per ml. Door speetrofotometrische dosering hij 3^3 15 um van het pyridine thion-2, bevrijd door uitwisseling met gereduceerd glutathion^ wordt geconstateerd dat een antilichaam is verkregen dat vier activerende, groepen per mol antilichaam he—___ vat..

cj Conjugaat 20 16 ml Oplossing van geactiveerde antilichamen * (5,9 mg/ml), verkregen als hoven vermeld, worden gemengd met 20 . ml van de oplossing van de A-keten van ricinus (2,8 mg/ml) in het TPE. Men laat het mengsel gedurende 2k. uur hij omgevingstemperatuur beschut tegen licht staan. Dan wordt gedurende 10 min ge-25 centrifugeer! met 27,000 x g hij k°C. De dosis pyridine-thion-2 vrijgekomen gedurende, het verloop van de reactie wijst aan dat 1,123 micromol A-keten is gekoppeld aan 0,638 micromol toegepast anti— lichaam, d.v.z. gemiddeld 1,76 equivalenten A-keten per mol antilichaam. De oplossing wordt continu gedurende 21 uur hij 5°C ge-30 dialyseerd tegen TPE met een dehiet van 720 ml/uur. De inhoud van de dialysezak (3¼ ml] wordt behandeld met 1 ml van een oplossing van ïT-ethylmaleïmide (12,5 mg/ml] gedurende 5 uur hij omgevingstemperatuur en daarna bewaard hij -20°C.

Deze oplossing van het conjugaat wordt gefractio- 790 72 51 ? 32. i....

/ * 1 f . ; neerd over een Sèphadex gel-kolom. G- 200. onder de omstandigheden als- "beschreven in voorbeeld, T.

Men. verkrijgt aldus drie oplossingen:

Oplossing c) die het conjugaat met een gemiddel-; 5 de molecuulmassa. van 300.000 voor stelt,. oplossing d) met een mole-cuulgewicht van 190..000, oplossing e) met: een molecuulgewicht van: ! 160.000..

De· samenstelling van het conjugaal in de verschillende verkregen oplossingen wordt in. de volgende.- tabel aan— . ia gegeven.

Microgram· keten-A MoL A^keten gekoppeld aan. het mol antilichaam.

• antilichaam per ml _ oplossing _' 15 Oplossing c 13· 0,9-

Oplossing d U8 1,0 . Oplossing e · 3 .0,1 !

Toonbeeld VIT

Bereiding van het conjugaat verkregen uitgaande. vanVantl-DHP-20 ' antilic hamen ge sub s ti tue er d 'met een geactiveerde disulfide groep en de A-keten van ricinus a) ((Pyridyl-2-disulfanyl)-3-propionylamino)-6-h.exaanzuur

Dit zuur wordt in twee trappen.verkregen uitgaande van het (pyridyl-2-disulfanyl}-3-propionzuur zonder- zuive-25' ring· van het tussenprodukt. ' (Zie reactieschema D van het formuleblad}.

0,^30 g Tan het (Pyridyl-2-disulfanyl)-3-pro-pionzuur verkregen als beschreven in. voorbeeld TIa, worden opgelost in 3 ml pyridine. De oplossing wordt. af gekoeld in. een ijs— 30 bad. Aan deze oplossing worden 0,230 g H-hydroxysuccinimidepoeder, daarna 0,1+53 g hicyclohexylcarbodiïmide,.eveneens als poeder, toegevoegd. Het mengsel wordt gedurende 20 uur bij 1°C geroerd.

Het reactiemilieu wordt gefiltreerd ter eliminatie van het gevormde neerslag van dicyclohexylureum, waarna het neerslag wordt 79072 51 33 gewassen met pyridine. De wasoplossing wordt toegevoegd aan het ' · filtraat waarna het pyridine onder een sterk vacuum wordt ver dampt tot een droog produkt wordt verkregen. Het verkregen residu: wordt opgenomen in ethylacetaat ; en nieuw precipitaat van di— • 5 cyclohexylureum wordt gevormd; dit wordt· door filtratie verwijderd. Het ethylacetaat wordt droog- gedampt onder een sterk vacuum», waarna de washehandeling met ethylacetaat twee keer wordt herhaald. Men verkrijgt aldus: 0,6-10 g van de verwachte ester.

Het verkregen prodhkt wordt, in totaal opgelost 10 in 5 ml tetrahydrofuran. Aan deze oplossing wordt 0,288 g amino— 6-eapronzuur oplossing in 2,5 ml. water toegevoegi. Het triëthyl— amine wordt in stoecheometrisehe hoeveelheid betrokken op het \ amino-6-capronzuur (0,222 g) toegevoegd ter handhaving van de pH op 7»Q- De reactie wordt voortgezet onder roeren hij ^°C' geduren-15 de 20 uur. Het reactiemilieu wordt drooggedampt onder sterk vacuum - Het residu, wordt aangewreven met 10 ml water. Het milieu wordt aangezuurd tot aan een pH van k,5 door toevoeging van azijnzuur. Er vormt zich een. precipitaat dat door af schenken . wordt gewonnen, en daarna opgelost in ethylacetaat. De oplossing 20 wordt gedroogd door magnesiumsulfaat, daarna, gefiltreerd en droog— gedampt onder sterk vacuum. Er worden aldus 0,600 g van het te zuiveren produkt verkregen. De zuivering wordt uitgevoerd door verdelingschromatografie. over een silicakolom, onder de gedefinieerde omstandigheden door analyse van het produkt door dunne— 25 laagchromatografie in een mengsel van aeeton-chloroform-azijn-zuur (15 — 80 - 5) · 0,410 g Van het verkregen produkt worden aangetracht in een kolom met een inwendige diameter van. 2 cm die 16o ml silieagel bevat (Ho. 6θ,6θ - 23Q mesh MERCK} in evenwicht getracht 30 met het chloroform. De elutie wordt met een discontinue gradiënt van methanol in chloroform uitgevoerd;. het zuivere produkt wordt geëlueerd met een 2% methanol-mengsel. De oplosmiddelen worden onder sterk vacuum verdampt tot het produkt droog is. Het geelbleke produkt met een pasta-achtige consistentie dat wordt ver- 79072 51 J» • ; 34 / · - t kregen wordt gekenmerkt door zijn magnetische kernresonantie— spectrum.

b) Bereiding van de geactiveerde anti-DHP antilichamen

Aan 9 ml ran de oplossing Tan- anti-DNP anti-; 5 . lichamen bij. een. concentratie- van 1t sU mg/ml in.de buffer TPS wor-' den 9 ml van een mengsel water/t-butanol 2/1 (vol:, vol),.. dat 5,3 mg · ethyl 1-(dimethylamine-3-propyl)-3 carbodilmide en 13,7 mg ((pyri-dyl-2-disulfanyl) 3-propionylamino)-6-hexaanzuur bevat toegevoegd. De behandelingen worden vervolgens uitgevoerd als beschre-1Q. ven in voorbeeld VT-De dosering van de geactiveerde antilichamen wijst, een gemiddelde, substitutiegraad. van 0,6 activerende groepen . per mol antilichaam aan.. De aldus verkregen oplossing van. anti.— lichamen wordt door ultrafiltratie tot 11,1 mg/ml geconcentreerd. - c) Conjugaat 15 45,8 mg. Gemodificeerde- antilichamen worden in.

reactie gebracht met 35,6 mg van de. A-keten van ricinus (7,9 mg/ ml) .in de buff er TFE. De bereiding wordt onder de· reeds in voorbeeld VI beschreven omstandigheden uitgevoerd. De graad van gemiddelde koppeling die wordt, verkregen ia 0,-5- A-keten per mol anti— 20 lichaam-· De zuivering van. het conjugaat. door filtratie· wordt uit— gevoerd als beschreven in voorbeeld VT.

Voorbeeld VIIX

Bereiding van het conjugaat verkregen uitgaande van het fragment F(ab)'„ van het anti-DNP antilichaam en de A-keten van ricinus 25' a).Bereiding van het, fragment F (ah) * ^ van het anti-DN? antilichaam

De oplossing van. het antilichaam (voorbeeld IV) wordt gedialyseerd tegen de acetaatbuffer 120 mM, pE 4,7· Aan 45· ml van deze oplossing·.die 500 mg antilichaam bevat, voegt men 3 ml toe van een. oplossing van .pepsine met een concentratie van 30 10 mg/ml in dezelfde buffer (Pepsine E.O. .3-4,1. van. varkens, twee maal gekristalliseerd, a 3200 microg./mg - SIGMA). De incubatie wordt gedurende 20 uur op 37°C gehandhaafd; de voortgang van de hydrolyse wordt geverifieerd door electroforese in aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat (J..Biol. Chem. 244, 44o6 - 4412 (19&9)) 790 7 2 51 « " 35 » door verdwijning van de "band van 150.QQQ .dalton die overeenkomt • met bet niet-gehydroliseerde aatilichaam.

De hydrolyse wordt gestaakt, door instelling van * de pH van het reactiemilien op Τ,Ο met hehnlp van een oplossing 5 van loog 1ΙΓ, waarna de oplossing - wordt gecentrifugeerd en de on- . ' - · . . . i oplosbare stof verwijderd. De "bovenlaag van de centrifugering wordt aangebracht in een kolom met inwendige diameter van 50 mm die l800 ml Sephadex S 150 bevat in evenwicht gebracht met een fos-faatbuffer-100 mK, pH f»ö.

10 De elutie wordt uitgevoerd, met. dezelfde buffer: ; de eerste verkregen piek wordt in twee- fracties, verzameld, De eerste (200 ml) omvat TO mg van het fragment F(ah)van het anti— lichaam», het tweede (.100 ml} omvat JQ. mg van een.mengsel van het fragment F(ab)’^ en het verontreinigingsfragment met een .molecuul-15 gewicht van 50.000 dalton. De tweede piek bevat, de proteïne— fragmenten met een gemiddeld molecuulgevicht van .10.0Q0 dalton; deze wordt - af gevoerd.

Het fragment FSabl1^ dat. zuiver wordt verkregen in de eerste fractie van de eerste piek. wordt door ultrafiltra-20 tie geconcentreerd (methode beschreven in.voorbeeld. I van de hoofdaanvrageI tot aan een concentratie van 16 mg/ml en bij -20°C geconserveerd. ·. ··:

Het aldus. verkregen fragment F(ah) beeft de volgende kenmerken: molecuulgewicht: 95.000 dalton (bepaald na 25 ijken van Sephadex G 150 gel).

Iso-electrisch punt: tussen pH 7*7 en 8,8 (verkregen door iso-eleetrofocussering op een EKB plaat), b) Bereiding van het 'geactiveerde fragment

Aart 15 ml van de oplossing F (ah )^ met een con-30 centratie van 15*6 mg/ml worden 15,3 ml van een mengsel van wa- ter/t-butanol 2/1 (vol/vol) dat 17,3 mg 1-(dimethylamino-3-progyl)- 3-ethylcarbodiïmide en 50 Λ mg (pyridyl-2-disulfanyl)-3-propion-zuur bevat toegevoegd. Het mengsel wordt gedurende 20 uur bij 30°C geïncubeerd. De oplossing wordt vervolgens continu gedialyseerd 790 72 51 ; 36 f · ] \ tegen de "buffer- TPE tij ^°C gedurende 23 uur; met: een debiet- van 500 ml/uur. De spectrofotometrische. dosis bij 3^-3 nm van bet pyridinethion-2 dat is. bevrijd door uitwisseling. met bet gereduceerde glutatbion toont aan. dat de activering van het fragment ' 15' riabJ-Sg, beeft, geleid tot een., gemiddelde* suhstitutiëgraad van Inactiverende groepen per mol F (.ah)'* g.

' De oplossing- van aldus verkregen geactiveerd FCabJ.'g wordt door ultrafiltratie..tot aan 10.mg/ml geconcentreerde c) Conjugaat 10 Aan 13,8 ml van de oplossing, van 10 mg/ml in F(ab] ‘2 geactiveerd als bovenbeschreven worden. 13,8 ml oplossing* van de A-keten van- ricinus. (S. mg/ml) in de buffer TEE toegevoegd.

Het: mengsel, wordt. bij: omgevingstemperatuur gedurende: 2k uur onder een stikstof atmosfeer en beschut., te gen-licht geïncubeerd. De op— .15- lossing wordt· vervolgens- met.2T.000 x g„ bijl. ^°0 gedurende 10 min. . - gecentrifugeerd, en de bovenlaag gewonnen.. De dosis van het pyri-dinethion-2;. bevrij,d tijdens het verloop.: van. de reactie wijst, aan dat de gemiddelde koppelingsgraad is-' 1 ^2-équivalent A.-keten per mölF(ab)‘2^ 20 De oplossing wordt aangebracht, in een kolom, met een inwendige* diameter van. 50 mm die 1-730 ml Sephadex G 20 bevat.

De elutie wordt uitgevoerd met de buffer- TEE- De fracties worden verzameld, in een volume van 8,k ml en de analyse, van de fractie wordt uitgevoerd als beschreven in voorbeeld V en VI. Eet produkt 25- wan de conjugering verschijnt als een piek-

De fracties die de piek van. het. conjugaat uit— maken worden hergroepeerd in drie oplossingen die resp. zijn: - oplossing f: voorkant van. de piek; — oplossing g: centraal deel van de piek; 30 — oplossing h: achterkant vaa.de piek.

De analyse van oplossing g door dosering van zijn remmende activiteit van.de eiwit-synthese (proef 1) en de dosering van de proteïnen geeft de volgende resultaten: 790 72 51 3T ' ft „ r

Microgram A-keten Equivalenten A-keten gekoppeld aan F(ab ) ^ per mol F(ab) _per ml oplossing__

Oplossing g 1½ 1 f - \ : 5 d) Concentrering van, het conjugaat . In. een eerste trap wordt de concentrering uitgevoerd door ultrafiltratie: 255 ml van de oplossing g van het conjugaat (1U8 micro-g/ml in A-keten) wordt aldus geconcentreerd tot’ 3&1 micro-g/ml. De oplossing wordt vervolgens tienvoudig ver— 10 dund in. gedestilleerd water teneinde de ionische kracht van het milieu te laten af nemen. De verkregen oplossing (^00 ml hij 38 micro-g/ml in A-keten) wordt aangebracht in? een. kolom, met- een inwendige diameter van 9 mmr die 5,T ml E’.M» Sepharose bevat in evenwicht-gebracht met de fosfaat buff er 10 mM» pE 6,5 waaraan het 15· dinatriumzout van ethyleendiamine tetraazijn is toegevoegd, ImM.

Het aanbrengen wordt uitgevoerd met een debiet van 80 rnl/uur» Onder deze omstandigheden wordt het totale conjugaat op de kolom gefixeerd. Aan het einde van het aanbrengen laat men h,5 ml van dezelfde buffer passeren waarna de elutie 20 van het conjugaat wordt uitgevoerd met de TEE. tampon, met hetzelfde debiet. Het conjugaat treedt uit in een enkele piek. De achterkant van de piek die weinig proteïnen bevat wordt af gevoerd; de resterende fracties worden hergroepeer! en de concentratie van de A-keten bepaald.

25 De dosering geeft aan dat de concentreringstrap over C.M.. Sepharose het mogelijk heeft gemaakt de concentratie van de A-keten van het conjugaat op 3,6 mg/ml te brengen. De behandeling is kwantitatief en de fracties, die de oplossing van 3,6 mg/ml samenstellen vormen in totaal 76% van de hoeveelheid van het 30 in de kolom aangebrachte conjugaat.

Voorbeeld IX

Bereiding van het conjugaat verkregen uitgaande van het anti-Thy 1,2 IgM antilichaam en de A-keten van ricinus 79072 51 • 38 .....' / * * a) Bereiding van "het "IgM anti-Thy 1,2 antilichaam .

Eet zuivere IgM wordt "bereid uitgaande van. de ascitische Vloeistof verkregen van OLAC Ltd. (Thy-1,2 FT D5 monoclonaal. IgM cytotoxisch. antilichaam).

t I 5 Aan 50 ml van. de ascitische- vloeistof die het ' antilichaam' "bevat worden 15 S ammoniumsulf aat in poedervorm toe— gevoegd. Ba. oplossing daarvan wordt het mengsel gedurende een uur bij k-°C geincubeerd, waarna, het gedurende 20 min, bij.....17.000 ! maal g -wordt gecentrifugeerd. De bovenlaag van de centrifugering 10 wordt afgevoerd,. De koek. wordt opgelost in 20 ml bufferfosfaat , 100 mM pH TjO,. waarna de. oplossing continu wordt gedialyseerd.

tegen TO ml van dezelfde- buffer» De verkregen oplossing wordt aan— gebracht, in, een kolom, met een diameter' kleiner dan 50. mm,, die * 1800 ral Sepharose 6b in evenwieht gebracht.met de fosfaatbuffer, 15 100 mM,. pH Τ»0„ bevat. De elutie wordt uitgevoerd met dezelfde buffer r de·, eerste Verkregen piek komt. overeen met aggregaten van IgM. De? tweede verkregen piek wordt in twee fracties verzameld: de eerste fractie- (aan de voorkant tot aan de· top van de piek) is, samengesteld uit zuiver IgM;, de tweede- fractie omvat een meng— 20 sel van. IgM en een verontreinigd, proteïne met een. molecuulgewicht dat wordt geëvalueerd op ongeveer 660 000 dalton» Deze tweede fractie wordt opnieuw behandeld' door ammoniumsulf aat en het verkregen. neerslag gecentrifugeerd, en daarna opnieuw, opgelost in de fosfaatbuffer, 100 mM, pE 7,0, De verkregen oplossing wordt aan— 25 gebracht in de Sepharose 6b kolom die na de eerste· behandeling is gewassen, De elutie door de fosfaatbuffer. 100 mM,. pE 7-,0, leidt, zoals tijdens de eerste behandeling, tot het. verschijnen van twee pieken. De tweede verkregen piek bevat zuiver IgM, Door elk van de twee filtratiebehandelingen. over Sepharose 6b kan. men aldus 30 een fractie verkrijgen die zuiver IgM omvat. Deze twee fracties worden verenigd, waarna het totaal door ammoniumsulfaat wordt be-' handeld tot de eindconcentratie van 300 mg/ml bij 1°C; het preparaat wordt gedurende 20 min, bij 17.000 maal g gecentrifugeerd, waarna de koek opnieuw in de fosfaat buff er 100 mM, pE 7,^, waar- 790 72 51 / 39 aan natriumchloride, ^00 mM, is toegevoegd wordt gebracht.

De totale behandelingen maken het mogelijk 8 ml van een. oplossing van. 6, if- mg/ml zuiver IgM te bereiden. Analyse volgens electroforese ih aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat * 5 is toegepast voor het karakteriseren van de fracties; het aldus , verkregen zuiver IgM geeft bij analyse twee dicht bij elkaar staande banden, met gelijke intensiteit die overeenkomen met molecuul-gewiehten naburig aan 900.000 dalton.

b) Bereiding van het anti-Thv t ,2 geactiveerde antilichaam 10 Aan 7,8. ml van de IgM oplossing met een concen tratie van 7,0 mg/ml wordt 0,½ ml van een mengsel water/t— butanol 1/5 (vol/volj toegevoegd, dat 2,9 mg 1-(dimethylamino-3-propyl·}—3-ethyl-carbodiïmide· en 7,7-mg (pyrxdyl-2-disulfanyl) -3— propionzuur bevat. Eet mengsel wordt gedurende 20 uur bij 30°C 15 gexncubeerd. De oplossing wordt vervolgens continu, gedialyseerd tegen de fosfaatbuffer, 100 mM, pE 7,½- waaraan natriumchloride IfOO mM is toegevoegd alsmede het dinatriumzout van ethyleendiamine— • tetraazijnzuur 1 mM. De dialyse wordt voortgezet gedurende 23 uur bij if-°C met een debiet van 500 ml/uur. De oplossing wordt 20 vervolgens met 27.000 x g bij 4°0 gedurende 10 min gecentrifugeerd en de bovenlaag gewonnen. De spectrofotometrische dosering bij 3¾ urn van 2-pyridine-thion bevrijd door uitwisseling met gereduceerd glutathion toont aan dat de. activering van het aatili— chaam geleid heeft tot een gemiddelde substitutiegraad van 13 aeti— 25 verende groepen per mol IgM. cl Conjugaat.

De oplossing van de A-keten verkregen als beschreven in voorbeeld U wordt continu gedialyseerd tegen de fosfaatbuffer, 100 mM, pE 7,^» waaraan natriumchloride, Uoo mM, en het 30 dinatriumzout van ethyleendiaminetetraazijnzuur, 1 mM. is toegevoegd; de dialyse wordt gedurende 20 uur bij if°C uitgevoerd met een debiet van 500 ml/uur.

Aan 8,8 ml van de geactiveerde IgM oplossing verkregen als boven beschreven worden 3,9 ml gedialyseerde A-keten 790 72 51 1+0 toegevoegd, met een. concentratie van 7f.h mg/ml. Het mengsel wordt gedurende 2 uur bij omgevingstemperatuur geincubeerd onder een stikstofatmosfeer en beschut tegen licht- De dosering van het 2-pyridinethion dat tijdens de reactie is bevrijd wijst aan dat . - - 5 de gemiddelde koppelingsgraad 9,7 equivalenten A-keten per mol IgM' is* " De. oplossing wordt- aangebracht in een kolom met een. inwendige diameter van 50 mm- die 1727 ml Sepharose 6b bevat, in. evenwicht gebracht met de buffer van de conjugering. De· T0 elutie wordt uit gevoerd: met dezelfde buffer. De fracties worden verzameld in een volume van 3,T ml en de analyse van de fracties wordt, uitgevoerd als beschreven, in voorbeelden V en VI. van de hoofdaanvrage.. Het conjugeringsprodukt 'treedt uit in twee pieken: De· eerste komt overeen met het conjugaat met een gemiddeld mole— 15 cuulgewicht. groter dan dat van IgM, de tweede piek komt overeen met het. conjugaat met' een gemiddeld molecuulgewicht dat bij be-' nadering equivalent, is aan dat van IgM. Het centrale deel van. de piek. (oplossing I] wordt achtergehouden.

De samenstelling van. het conjugaat van oplos— 20 sing i heeft de· volgende kenmerken

Microgram A-keten Equivalenten A-keten

gekoppeld, aan IgM per mol IgM

_ -per ml oplossing ___

Oplossing i 23,7 3,2 25 De. conjugaten volgens de uitvinding evenals de bij de vorming van de genoemde conjugaten toegepaste verbindingen zijn bestudeerd wat betreft hun biologische eigenschappen en in het bijzonder hun anti-kankerwerking. Het principe van de verschillende toegepaste proeven wordt hierna uiteengezet.

30 Proeven in vitro T] ReTnming wan de eiwit-synthese

De fundamentele biologische eigenschap van de A— keten van ricinus is de remming van de microsomale eiwit-synthese 790 7 2 51

In door wijziging van de ribosomale subeenheid 60S. a) -Acellnlair- model Eroef (1)

De in vitro methode die overeenkomt met een acel- 5- lulaire eiwit-synthese model maakt gebruik van subcellulaire- frac-ties, van de rattenlever die geschikt zijn gee omplementeerd en in - staat zijn het CT-fenylanaline te bevatten in aanwezigheid van een. kunstmatige AM boodschappens polyuridylzuur.

De toegepaste handelwijze ter bereiding van de 10 subcellulaire fracties en voor het meten van het opnemen van het 11f.

C—fenylanaline bestaat uit eeir aanpassing van de methode beschreven in Bioehemiea. Biophys-iea Acta 312, 6θ8 - 615 (1973)» waarbij tegelijkertijd een microsomale fractie en een cytosol— fractie van de hepatycyten. van ratten worden toegepast. Het mon— 15 ster dat de A-keten bevat wordt ingevoerd in de vorm, van een oplossing geschikt verdund in een buffer TRIS-HC1 50 mM, pH = die mercapto-2-ethanol (0,2#) en runderalbumine serum (15 micro-g/ ml] bevat..

Uitgaande van de meetgegevens kan men met betrek— 20 king tot het blanco milieu zonder remmer het percentage remming 1 If. . „ door het opnemen van C-fenylanaline in de proteïnen, berekenen per elk reactiemilieu dat de A-keten van ricinus bevat.

Uitgaande van deze resultaten kan men de concentratie van de A-keten in het reactiemilieu berekenen die een 25 50/£ remming van het opnemen van de radio-activiteit in de proteï nes geeft. Deze remmende concentratie 50 (Cl 50) kan. gebruikt worden voor het karakteriseren van elk. preparaat dat de A-keten bevat.

Met dezelfde methode kan men tevens de in een 30 monster aanwezige A-keten doseren waarbij het door dit monster in een standaardreeks gegeven remmingspercentage verkregen bij toepassing onder dezelfde omstandigheden van oplossingen met een bekende concentratie van zuivere A-keten wordt vergeleken.

790 7 2 51 * kZ i / ·. bj Cellulair model

Proef (2)

Deze proef meet bet effect van de bestudeerde 1I4.

stoffen op bet opnemen van . C-leucine in de kankercellen m de ; 5; cultuur*

De· toegepaste cellen zijn de Hela cellen, verkregen. uit', een biopsie van een cervicaal menselijk adenocarc inoom dat continu in'groei is gehouden door een monolaagcultuur. Deze cellen worden, gelncubeerd in aanwezigheid, van. preparaten, van te IC bestuderen stoffen en vervolgens aan bet eind van de incubering 11|_ onderworpen, aan een meting van de graad. van. opname van. C-leucine. Deze meting is 'uitgevoerd, volgens een techniek aangepast, aan de techniek beschreven in het Journal of Biolocical Chemistry 2k9 .. *1 Ij.

(T1) r 355T'— 3562 (197^) onder toepassing-van de tracer C— T5 leucine ter bepaling van de. graad van eiwit-synthese. De bepaling van de opgenomen radio-activiteit wordt hier uitgevoerd op gehele cellen geïsoleerd door filtratie..

. . Uitgaande van deze bepalingen, kan men de krommen effect/doses uitzetten die op de abseis de concentratie van de- 1k 20 bestudeerde stoffen en op de ordinaat de opname van C-leucme uitgedrukt als percentage opname door de blanco cellen in afwezigheid van de te bestuderen stof weergeven.

Men kan aldus voor elke bestudeerde stof de concentratie bepalen die de 50% opname van C-leucme remt of- 25 wel de "remmende 50-concentratie" (Cl 50). Er is vastgesteld dat ik ...

meting van het opnemen van het C-leueme m de gej ele cellen leidt tot een bepaling van Cl 50 die identiek is aan. die verkregen door de klassieke meetmethode van de eiwit-synthese.

Fanneer men de conjugaten, bereid met de anti-DNP 30 antilichamen, wenst te bestuderen is het noodzakelijk dat de Hela— cellen kunnen worden herkend door de anti-lichamen en zij dragen aldus haptenische motieven aan hun oppervlak. De Hela-cellen worden aldus getransformeerd in. te treffen cellen door markering met een geschikt hapteen. Men heeft in de praktijk als hapteen de 79072 51 k3 t / r groep trinitro-2,k,6-fënyl of TUP gekozen. De fixatie van de TUP groepen aan dê Hela-cellen -wordt- uitgevoerd door de inwerking van trinitro-2,^,6-benzeensulfonaat (TUBS) door aanpassing van de technieken beschreven in. Biochimica Biophysica- Acta 255, 79 -! 5 9Q-(t972) en Journal of Immunology 11T, 930 - 937, (1973).

De modificatie van. de methode· bestaat in wezen uit. de keuze van de reactieparametersr temperatuur k°C en stoppen door een overmaat lysine na 15 sec reactie. :

Deze markering wordt cm verschillende redenen 10 vastgehouden:

Geringe giftigheid van TUBS op de Hela-cellen;.

Hoog- kruis-reactieniveau tussen DHP en TNP en ~ tl·

Opneemniveaurs van C-leucine vergelijkbaar tussen gemarkeerde cellen en niet-gemarkeerde cellen.

De concentratie- van TUBS in het reactiemilieu 7 (10 mg/ml) brengt de fixatie op elke cel van 7-10 haptenische motieven, die toegankelijk gijn .νοο-τ antiIif».ha.TnPTi -,-trvh g-ha.nd. Tig _ _;— aésociatie-constante tussen anti-DHP antilichamen en haptenische

T

motieven is 1,2.10 . Voor het conjugaat met een anti-Thy 1.2 spe— 20 cificiteit, zijn de toegepaste cellen van de stam WEHI-7 (lymf oom van muizen Balbh/C) verkregen van het SAEïC Institute — San Diego,

California. Deze cellen worden niet gemerkt, want zij dragen van nature het Thy 1.2 antigeen aan hun oppervlak. De incubering met het conjugaat en daarna de meting van de graad van eiwit-syn-25 these verloopt als eerder beschreven.

2) Hemagglutinering

De hemagglutineringsproef (Journal of Biological Chemistry 2^9» 803 (197101 is bestemd ter vergelijking van de capaciteit van de verschillende bestudeerde preparaten cm zich op 30 het membraan van menselijke rode bloedlichaampjes van de groep 0 Bhesus negatief te fixeren.

De proef kan zijn: — •hetzij direct (proef 3) door de te bestuderen stof in aanraking te brengen met de rode bloed- 79072 51 \ -* 1 . . · kk lichaampjes en deze leidt volgens de dosis van. de stof tot een negatieve of positieve respons, — hetzij indirect (proef 4). In dit geval wordt j 5 na de directe;proef de detectie van de stof die : eventueel is gefixeerd aan de rode bloedlichaampjes gevoelig gemaakt door· toevoeging van een immuno-serum aan de door' af schenken van het ‘ reactiemilieu gescheiden, rode bloedlichaampjes, 10 die antilichamen "bevat die in. staat zijn de· be- · studeerde·- stof te herkennen, en. waarvan de. eigen ' hemagglutinerende activiteit" is verwi jderd door* . absorptie op rode- bloedlichaampjes van dezelfde groep.

'15'. 1) Acute toxiciteit:

J

(Pröéf 5)

De· bestudering: van. de acute toxiciteit wordt uitgevoerd door een intraperitoneale of intraveneuze injectie van' de·.· te bestuderen stof in een isotone oplossing, aan groepen die-20; ren.. De dieren worden gedurende- 7 dagen waargenomen waarbij voor elke bestudeerde dosis de sterfte wordt: genoteerd. "Vervolgens dé 50% lethale dosis bepaald (DL. 50)., 2) Het effect van de conjugaten op de ontwikkeling van kankercellen 25 Het gekozen model bestaat uit de bestudering van het effect van de te beproeven stoffen, op de ontwikkeling van vaste tumoren, uit in het dier geïnjecteerde kankercellen. De experimentele methode bestaat uit het in muizen (wnude,f - van dezelfde stam - Bomlholtgaard), die ervoor bekend staan dat zij 30 geen allogene Of xenogene giffen afstoten, injecteren van Hela-cellen die het TNP-hapteen dragen en deze muizen te behandelen door gelijktijdig of als laatste de te bestuderen verbinding te. injecteren.

Er werden verschillende onderzoeken uitgevoerd: 790 72 51 ^5 a) Proef 6

Yoarincubatie van de gela-gHE:.cellen met: bet conjugaat, gevolgd door injectie van bet dier via subcutane veg.

Yervolgens -wordt de omvang van de eventueel ontwik-5 kelde tumoren bepaald door meting van 2 ortbogonale diameters van de tumor volgens de techniek beschreven in de Ann ales d’ Immunologie Clhstitut Pasteur), 12k C, 5èT - 572 0973), b) Proef 7

Ihtraperitoneale injectie van Hela-TIIP cellen 10 gevolgd door- injectie, eveneens in de intraperitoneale holte, van de te bestuderen verbinding.

Aan het eind van het experiment wordt de amvang van de tumoren bepaald door meting van het gewicht van de verzamelde- tumoren na. het doden van de dieren. De verschillende aldus 1 5 beschreven in vitro en in vivo proeven zijn toegepast voor het bestuderen van de eigenschappenvan.de conjugaten, evenals, van de stoffen toegepast voor de bereiding van conjugaten.»

Bicinus en A-keten

Hicinus en A-keten zijn onderworpen aan ver— 20 schillende proeven in vitro, evenals een toxiciteitsproef in vivo; bovendien is de A-keten gezuiverd door de eoncentratietrap over CM Sepharose, aangegeven in de tabel als (A) keten onderworpen

P

aan dezelfde proeven.

De resultaten worden in tabel A samengevat.

25 Deze resultaten geven aan dat het ricinus een sterk remmend vermogen op de eivit-synthese bezit zowel in een acellulair als in een cellulair systeem. Ih acellulair milieu raat de A-keten eveneens sterk de eiwit-synthese maar kan daarentegen zijn effect in het cellulaire milieu, wanneer afgescheiden 30 van de B-keten, niet uitoefenen.

Hetzelfde verschijnsel wordt waargenomen bij de hemagglutineringsproeven en de proef van de acute toxiciteit waarin blijkt dat het ricinus veel actiever is dan de A-keten.

De resultaten geven onder andere aan dat de con- 790 72 51 !---—:— -----:----:—' • : kè / .

centratietrap via C.M. Sepharose het mogelijk maakt de niet-specifieke giftigheid van de A-keten door' een aanmerkelijke ver-, · hoging van de zuiverheid van het preparaat te verlagen. De al— f dus verkregen gezuiverde A-keten bezit geen niet-specifieke gif- I 5Γ tigheid meer ten opzichte- van het cellulair syêteém; dit wcrdt .1 |. duidelijk aangetoond door de verhouding van de activiteit tussen het ricinus en de A-keten (A)p in deze proef, die groter is dan 10.000.

Uitgebreide absorptieproeven van de A-keten. zijn 10 uitgevoerd onder- achtereenvolgende toepassing van overmaat Hela— cellen en rode bloedlichaampjes in contact gebracht-met. deA— keten en door het meten van de cellulaire giftigheid van- de A-keten.

> in da bovenstaande absorptievloeistof (proef 2):; .. De cellulaire toxiciteit, van de oplossing van- niet 15 over CM Sepharose geconcentreerde A-keten -wordt " : verlaagd door absorptie en aldus opnieuw op het - niveau van de-toxiciteit van de over CM Sepharose geconcentreerde en niet geabsorbeerde A-keten oplossing gebracht.

20 ... Daarentegen wordt de toxiciteit van het over CM Sepharose geconcentreerde preparaat niet meer verminderd door de absorptieproeven, hetgeen de totale afwezigheid van affiniteit van de aldus bereide A-keten (A)^ ten opzichte van de plasmi-25 sc he membranen van de cellen en als· gevolg daar uit de extreme graad van verkregen zuiverheid bevestigt.

Anti-DUP antiliehamen

De anti-DïïP-antilichamen geven bij da rémmings-30 proef van de eiwit-synthese in een. celvarmig systeem tot aan de sterkste beproefde concentratie, d.v.z. 10~ M geen enkel ef--- f eet.

Tevens; wordt verder in. de acute toxiciteits-preef tot aan de sterkste beproevingsdosis, d.w.z. 1,6 mg anti- 790 7 2 51 * r / 1 lichamen per dier geen enkel teken van giftigheid waargenomen.

Conjugaten

Een eerste reeks proeven heeft ten doel de sa— menhang en stabiliteit van de eigenschappen van de A-keten ener-j 5 zijds en de antilichamen anderzijds in de bereide conjugaten te verifiëren. Allereerst heeft men door een radio-immunologische proef (Handbook of Experimental Immunology, Tol. 1, hoofdstuk 15, blz. 1 — l8j Uitgever D.M. We-ir, tweede druk, 19T3), kunnen waarnemen dat de antilichaam anti-MP activiteit van het conjugaat 10 equivalent is aan de activiteit van het antilichaam alleen- Tender is wat betreft de A-keten van het conjugaat de remmende, acti— ; viteit ten opzichte van de acellulaire eiwit-synthese bepaald met een monster van het conjugaat (voorbeeld ΓΤ, oplossing a) enerzijds en met een ander identiek monster geincubeerd gedurende 30 15 min met een 0,2%'s oplossing van mercapto-2-ethanol teneinde de disulfidebrug te breken, anderzijds.

Men heeft een Cl 50-· van 59 Λ ng/ml van de A-ke— ten in het eerste geval en van 9 »2 ng/ml van de A-keten in het tweede geval verkregen, d.w.z. een activiteitsverhouding van 1 -20 6,6.

Dit toont aan dat een wezenlijke remmende activiteit van de eiwit-synthese slechts verschijnt nadat, het conjugaat van te voren is behandeld met het mereapto-2-methanol voor het verbreken van de gecreëerde disulfidebinding. Het feit dat een rem— 25 mende activiteit ook zonder behandeling door mercapto-2-ethanol aantoonbaar is staat niet in tegenspraak met deze conclusie in zo verre het gebruikte doseringsmilieu thiolen bevat die gedeeltelijk de vrijmaking van de aan het antilichaam gekoppelde A-keten verstoren.

30 Aldus kan men vaststellen dat de conjugaten ver kregen volgens de uitvinding de eigenschappen van elk van hun bestanddelen handhaven. Een andere reeks proeven heeft ten doel de therapeutische effectiviteit van de conjugaten te bepalen.

790 7 2 51.

·. ! ka i : | a) Effect Q-p het cellulaire model (proef 2)

Figuren 1 en 2 geven krammen aain die, als . functie van.de dosis van het gebruikte conjugaat (dosis uitge- drukt in. concentraties (nM) van de A-keten) het remmingspercen- · 11j.

! 5 tage bij opname van het C-leucine door1 de gemerkte Hela cellen - i aan THP weergeven. Het toegepaste conjugaat. is het conjugaat van het. anti-DHP antilichaam en de A-keten zoals: beschreven in de voorbeelden V en TZ. Bij wij ze van vergelijking· wordt, tevens de werking van het conjugaat op de niet-gemerkte Hela-c ellen. voor— .10 gesteld (streeplijnen).

Dezer krommen zijn verkregen resp- voor figuren .1 en> 2 met. het conjugaat van: voorbeeld. T (oplossing- b) en met het * 1 conjugaat van: voorbeeld VT (oplossing e), Deze krommen tonen aan dat het 50$ remmende effect van de cellulaire· eiwit-synthese van ;15 de Hela-UIP-cellen wordt verkregen bij coneentraties di e zeer laag zijn (cr5Q: * TT x 10~^M).· voor oplossing b en (7,5 x 10-^ M) voor oplossing e, ten opzichte van die noodzakelijk voor het verkrij- . gen van hetzelfde effect met de niet-gemerkte ïïela-cellen. (Cl-- = —9 —9 130 x 10 7 M) voor oplossing' b en (1000 x 10 7 M) voor oplossing e.

20 Wanneer echter anderzijds aan. het incubatiemilieu runder-DHP albumine-serum wordt toegevoegd (1 mg/ml) is. het remmende effect van het conjugaat volkomen, verdwenen.

Figuur 3 stelt de resultaten voor verkregen met het conjugaat gevormd uitgaande van de A-keten van ricinus en 25 van het fragment F(ab}1 ^ van het anti-DUP IgQ. De coördinaten zijn. dezelfde als die van figuren 1 en 2. De resultaten worden geleverd voor: (I) ricinus Cï^q (in A-keten) 5,5.10 ^ (II) de A-keten CI,-n 9-10-¾.

30 (Hl) het conjugaat tegen Hela CI_n niet bepaalbaar 10 "M, _o (IV) het conjugaat tegen Hela-a TUP CI^Q U,5.T0 M.

- Figuur k stelt de remming van de opname van 1 ij.

het C-leucme in de WEHÏ-7 cellen voor onder toepassing van het . ... conjugaat gevormd uitgaande van. de A-keten en van het anti-Thy 1.2- 790 72 51 ! ’ ^9 * I$i. De coördinaten, zijn dezelfde als die van figuren. 1 en 2»

De resultaten worden gegeven voorr (X) ricinus CX^Q (in A-keten): 2,.^.10- M, j (II) de A-keten CI^-8,1.1 θ”Τ M, : 5 (UI) -het conjugaat CX^ (in A-keten) 5,2.. 10~11M.

! Aldus kan men waarnemen dat het. conjugaat ge vormd uitgaande van de A-keten van ricinus en van het anti-DHP IgO, onder benutting als activator van het IgS [(pyridyl-2-disulfanyl)- 3-propionyI-amino]-β-hexaanzuur een giftigheid en een specifici— 10 teit heeft identiek aan. die van het conjugaat bereid in voorbeeld.

I YI.

. Men kan. hieruit concluderen dat. de conjugaten > bereid volgens de. uitvinding een specifieke werking hebben; bij toediening van een. geschikt gekozen dosis van het conjugaat is 15" het slechts mogelijk. werking uit te oefenen op de cellen die· het ! antigeen dragen dat overeenkomt met het gebruikte antilichaam.

Het tot. stand brengen, van de disulfidebrug tussen de A-keten en een specifiek antilichaam van het antigeen dat van nature wordt gedragen door de kankercellen maakt, de vemieti-20 ging van de kankercellen met grote doelmatigheid, en. grote specifieke werking mogelijk» b) Proef in vivo A. Proeven uitgevoerd met. het conjugaat van de A-keten en het anti-DHP anti-lichaam (oplossingen c end van 25 voorbeeld VI).

1) De proef 6 als eerder beschreven is toegepast met de Hela-TNP cellen in een concentratie van 10 cellen per ml, geïncubeerd gedurende 90 min bij 37°G met het conjugaat (oplos- —8 sing c) met een concentratie van 10 M uitgedrukt in A-keten.

30 Ha centrifugeren (;700 x g, 10 min) wordt de koek opnieuw in suspensie gebracht in het PBS [isotone gebufferde oplossing zonder caleium of magnesium, J.. Exp. Mèd. 99, 1&7 (195^)1 j met een concentratie van 10 cellen per ml» De dieren (met een leeftijd van 1^ weken) ontvingen volgens subcutane weg 0,1 ml van 790 72 51 5° ; ζ : deze suspensie, d.w.z. 10 cellen.

. Een blanco groep ontving de niet met het conju-gaat geïncubeerde cellen. Een dagelijkse waarneming van de dieren ;..·... werd. uitgevoerd begeleid door de meting van het oppervlak: van de ] 5 tumoren. Men beschouwt als- relevant; elke tumor waarvan het., opper— ! 2. . | vlak groter is of' gelijk aan: 10 mm (grens van de gevoeligheid ! van. de proef ).

Figuur 5 geeft een voorstelling van het cumulatieve percentage gevormde tumoren met een. oppervlak ^ 10 mm^ 10 als· functie van de tijd. na de injectie, bij muizen, hetzij met i Hela-cellen (getrokken lijnj hetzij met ïïela-cellen gemerkt met . i TNF (streeplijn) hetzij Hela-cellen gemerkt met TUB en voorgexn- . .: ! cubeerd met het conjugaat (streep-stippellijn). In de figuur kan men de effectiviteit van het. conjugaat waarnemen dat sterk de '15 vorming van. tumoren vermindert, ! De waarneming tot aan de 50e dag toont de vor- ' · ming van tumoren in 80$ van de gevallen voor niet .met het conju gaat behandelde Hela-cellen en in 70$ van de gevallen voor de niet met het conjugaat behandelde Hela THF-cellen. Dit percentage 20 is slechts. 20$ in het geval van Hela-ΤΪΓΡ cellen die van tevoren zijn gelncubeerd met het conjugaat. Het verschil is statistisch, significant met een speling van 5$.

2) Men past de nroef 7 toe door via intraperito— 6 ' neale weg aan dieren (met een leeftijd van 10 weken) 2.10 Hela TIJP-25 cellen in suspensie in 0,1 ml kweekmilieu te injecteren» Men injecteert vervolgens 0,1 ml van het conjugaat dat 36 micro-g van de A-keten bevat (oplossing d 7,5 maal geconcentreerd door ultrafiltratie). Een blanco groep ontvangt dezelfde injectie van Hela-TNP-cellen maar zonder de behandeling door het conjugaat, 30 Op de 25e dag na. het begin van de proef worden de dieren gedood en de tumoren gewogen, In fig. 6 wordt voor elk van de dieren van de twee blanco groepen links, en de behandelde dieren rechts,* de decimale log van. het. gewicht van de tumoren in mg voorgesteld. De detectiedrempel is 5 mg, d.w.z. een decimale 790 7 2 51 51 log van 0,7*

Uit deze figuur kan men constateren dat voor de blancogroep de tumors zijn. gevormd, in 1¾ op de 15 gevallen (il· punten. boven de detectiedrempel, 1 punt er onder) .. In het tegenge-5 stelde geval van de behandelde dieren zijn geen tumoren ontstaan behalve in 1 geval op- 15 (l enkel punt boven de detectiedrempel) .

B. Eroeven uitgevoerd met het conjugaat van de A-keten en het anti-Thy 1,2 IgM antilichaam (oplossing i van voor— 10 beeld IX).

Dè toegepaste kankercellen zijn van de stam. WEHI.

22..T (verkregen van het Salic Institute — San Diego — Calif.) afkomstig van een lymfoem van muizen Balb/C. Deze worden geïnjecteerd in muizen BaXb/CT verkregen van Bomholtgaard (Denemarken) 15 en gedurende hun ontstaan en gedurende de duur van de proef gehandhaafd in een zone vrij .van specifieke- pathogens organismen (SEF). _________ __

In de- proef worden, de cellen WEHI 22,1, die continu worden gekweekt, verzameld op de 3e dag na het overbrengen 20 van de cultuur, door centrifugering gewassen en opnieuw gesuspendeerd in een isotone fosfaat buff er (EBS) met een concentratie van 12.10 /ml.

0,2 ml Tan de suspensie wordt langs intraperitone-ale weg geïnjecteerd in muizen die van te voren op willekeurige 25 wijze zijn verdeeld in hun kooien en individueel zijn aangeduid door merken van de staart.

Bij de niet met het conjugaat behandelde muizen wordt de intraperitoneale injectie van de WEET 20.1 cellen ge- * volgd door ontwikkeling van deze cellen tot tumoren verspreid in 30 het buikvlies onder vorming van waterzucht. De ontwikkeling van de cellen gaat gepaard met een vergroting van het lichaamsgewicht.

De waterzucht wordt gedetecteerd door het waarnemen van de vergroting van het huikvolume.

Een uur na de injectie van de cellen ontvangen 790 72 51 ? · . 52. .

( \ de dieren». behandeld met’, het conjugaat,' intraperitoneaal 1 ml van- de· oplossing-van-het conjugaat (oplossing i» 23,7 micro-g/ml van A-keten) van te voren intensief gedialyseerd tegen de buffer BPS en daarna door filtratie gesteriliseerd. De groepen, blanco ’ j. 5 dieren ontvangen. 1 ml. van de buffer BBS dat geen conjugaat bevat’.

Op de. Je dag na de incubatie van de cellen ontvangen de behandelde dieren een tweede injectie van het: conjugaal onder dezelfde omstandigheden en de blanco dieren een tweede injectie van de PBS: buffer.

10 De resultaten van de proef worden weergegeven in figuren J en 8- Figuur 7 beschrijft de chronologie van het verschijnen van waterzucht bij de- behandelde en niet-behandelde dieren» figuur 8 beschrijft de ontwikkeling van het lichaamsgewicht. bij de? behandelde en niet-behandelde dieren» De ontwikkeld ling van het gewicht wordt uitgedrukt in vergroting (grammen) van het géwicht ten opzichte van he— gewicht van dezelfde dieren, 3 dagen voor de inoculatie van de cellen.

Figuur T (de- abscis. stelt het aantal dagen na de inoculatie van. de cellen WEH1 22-1 en de ordinaat· het werke— 20 lijke aantal dieren (in percentage·’) die waterzucht vertonen voor) toont het bestaan van remming van de vorming van waterzucht bij dieren behandeld met het conjugaat; deze remming wordt vertaald in een verschuiving in het optreden, van waterzucht (de getrokken lijn stelt de behandelde dieren, voor en.de streeplijn de niet 25 behandelde dieren.).

Figuur 8 (de abscis stelt het. aantal, dagen na de inoculatie van de WEHI .22.1 cellen en de ordinaat de gemiddelde vermeerdering (in gram) van het lichaamsgewicht voor)..maakt het mogelijk eveneens een remming van de vermeerdering van het li-30 chaamsgewicht bij de dieren (getrokken lijn) behandeld met het conjugaat ten opzichte van de blanco dieren, (streeplijn) waar te nemen.

Deze waarnemingen worden bevestigd door statistische analyse van de resultaten: 790 72 51 53

De remming door het conjugaat van de vorming van waterzucht is significant hij de betrouwbaarheidsdrempel van \% (proef x 2).

De remming door het conjugaat van de gewichts-. J . vermeerdering is significant hij de betrouwbaarheidsdrempel van 5% (vergelijkingsproef van de hellingen van de lineaire instellingen ),

Mat de in vivo proef is het mogelijk de anti— . hanker activiteit van, het conjugaat gevormd uitgaande van de A— 10 keten van ricinus en van het anti-Thy 1.2 IgM te demonstreren.

Deze activiteit wordt aangetoond door de remming van de ontwikkeling van kankercellen WEHI 22,1 geïnjecteerd in de muizen Balb/CT.

De conjugaten hereid volgens de uitvinding leveren een specifieke werking zodat het mogelijk is hun toepassing 15 in de menselijke therapie hij de bestrijding van kanker te voorzien, Zij worden hereid. om via injectie te worden toegepast en zij kunnen hetzij alleen hetzij in combinatie met een andere bestrijding van kanker worden toegepast.

790 72 51 ! i i bOP <

«H-w O

•Η- UJ U\ <Ö P CD i— 0·<-» 0 C— , g > a a . if +3 ·Η ·Η <D ·Η a P ο -P J 3 (Ü Ο ·Η <D a-

I >- cd a M ® M

bo. ·Η ; , 0)+3 0 g bOP 1 a §' Ö -P < "O 2 •r! 0) "'v. CO ’ _ tJ +3 m p· aft 2 ·Η p « 0) ¢3

Ob»CCO Ο Ο Ο O a) _ Λ ·Η ·Η 0) ΙΑ Ο Ο O ' -P Ö

U Ρ O +> OJ O -d; 00 ft <U

0)Ο·Ρ0) i— OJ CON

> ώ a Μ. Λ ·Η ρ 04 s 1 - : - . |.

Ö*· P A

; 3 <u 0 :+3 O *r+ 0) r- CO- ö ö 34, I I -0

<0 1 Ο O O-ι CO

ft ^ O

* ·*- · bO

<0 co vo · Ha ·—<· a- « · CO ·Η 1+1- *- CO Μ

VO <U CO

Η ·Η O

-P H

m _ ft

Ö O

<d OJ

ö ο h a)

Eh 4) r— LA VO H Ö *

P 1 I I 0) O -TH

0 O OD Ο Ο σ Ο P bO

p *— I t— t~ ‘ LA I O

1 * O · · P" Cd CO CO ' •a}. CO t— p· CO Η ·Η a A A A' A- ¢0 ο

τ- LA CQ r~ 30 rg OJ

a €

Cd LA +3

LQ CÖ Λ CJ

Ο - Ο ·Η 2 co On a _ 13 H O ’— II a) £3 <u

Ο τ-r- 00 LA bO cd bO

•η I I <— T- oj a> p5 Ο O · · " a ·

t-· t- oj co 0 30 a>- S

A A n A H *ri a) co p- p· co a) p bo > 0 —' a; a "-a a; I T-3 0 0 03 bO Ή ·γΗ ö H cd n cd cd. S a) a) a _ <u a a) Ό *h a> a h ft pp +3CPP a) o3 •h ft a a aicö’p p a; a a)P aaiaejaiaanaa cd a a; pa ·Η P *rl p Η β) P 'v. ·Η3) p 0 > •Η Ό ·Η Ή cd Ρ Ρ Η ·Η rH +-3 *r-j

> <u oh oh s ·η aj ο ο <0 a ·η K

•ri bO LA*^- LA -Hpos LA ’— B3 a pp η h a a a _ bo aaien q *ri ho ho ·η h 0 a 1+1 0 afta)

< 0 og os si bo ο -H A S' -H

a; a a n p cd

aj a A

OHO

b0 ö ^ λ ·· ··

• H r- OJHCOP· LA OJ

rtf r- OJ

ft- ·Η ft ft · ft ft ft _*

a>a a; aiSai a) a)S +J

O'd 0 oft 0 0 oft SS

Jh a a a 0 a a a 0 ft ft ft ft w ft ft ft ' 00 790 72 51

Claims (10)

1. 5? * CQïCIUSIES 1v Werkwijze ter 'bereiding van. cytotoxische produk- teo, met bet kenmerk, dat men. door middel ran.· een. disulfidebrug een covalente Binding tot stand Brengt tussen een cytotoxisehe verbinding, de A^keten van ricinus, en een antiliehaam, een irnmuno— 5 gloBuline of een £mmunoglobuline-fractie specifiek, voor een gegeven antigeen, dat door de cellen, die men wil. vernietigen, wordt gedragen. 2«. . Werkwijze volgens conclusie. 1, met Bet. kenmerk, dat men een verbinding met de formule Pj-SE laat. reageren met een .10 andere verbinding met de formule Ρ^-Ε-Ε—Χ volgens de reactie: Rj-SH +· P^-S-S-X-^ P^-S-S-P^ + XSE, in welke formules wanneer P^ de A-ketengroep van ricinus is waarop, de vrije tBiolgroep van dit molecuul is gebonden, P^ een immunoglobuline of een immuno— globuline-fragment is ρπ nngpkpe~cd^-wsTmper Epeen-irnmunogl^buljnê_ T5 of een immunoglobuline-fragment is de .A-ketengroep van ricinus is, waarbij X een activerende organische groep is.
2. 3. Werkwijze volgens conclusie 2, met Bet. kenmerk, dat wanneer P een immunoglobuline of een immunoglobulinefragment -is waarin men een vrije tBiolgroep moet introduceren, men,voar-20 dat men Bet aldus beschermde immunoglobuline laat .reageren met $ — ·. acetylmercaptobarnsteenzuuranhydride en de thiolgroepen door de inwerking van bydroxylamine op bekende wijze vrijmaakt, eerst de Berkenningsplaats blokkeert door een voorafgaande behandeling van Bet antiliehaam. met Bet antigeen.of.een ander antigeen dat 25 een verknopingsreactie geeft, of. ook met een geschikt hapteen, en men tenslotte deze plaats door een op zich. zelf bekende werkwijze voor Bet elimineren van Bet antigeen deblokkeert, l·. Werkwijze volgens conclusies 2-3, met Bet ken merk, dat wanneer P^SH de. A-keten van .ricinus voorstelt men deze 30 omzet in disulfide door de uitwisselingsreactie: P2SE + X- S- S-X' ^ P2-S-S-X + XSK 790 72 51 * <r- 1 56 / · ; waarin X een activerende groep voorstelt gekozen uit een 2— of ^-pyridylgroep, eventueel gesubstitueerd met een of meer al— * kylgroepen, halogenen of c arboxylgr oepn, alsmede een fenylgroep, 1 eventueel· gesubstitueerd met een of' meer genitreerde groepen of I 5- gecarboxyleerde groepen, waarbij de reactie wordt uit gevoerd met |- een grote molaire overmaat van de XSSX reactant, die men aan, het eind van de reactie door dialyse tegen of filtratie door een mole— culaire zeef gel verwijdert. 5. 'Werkwijze volgens conclusies 3 — k, met het ken— TO: merk, dat alle reacties worden uitgevoerd bij een pH. van 7»0 in . 1 , een fosfaatbuffer en bij omgevingstemperatuur.. ; 6.· Werkwijze, volgens conclusie 2, met: het kenmerk, dat wanneer Ptj.SE de A-keten van. ricinus- en P^ immunoglobuline of een fragment daarvan voorstelt Fg in' geactiveerd disulfide wordt 115 omgezet volgens' de· reactie f2 +· x - r - s: - s - r—>Pa - r - s - s - x, • waarin Γ een functionele- groep voor stelt* die : .· covalent gebonden kan worden aan een: van de functionele groepen, in het bijzonder aminogroepen, gedragen-door de. zijketens van de 20 samenstellende aminozuren van het immunoglobuline, waarbij R een • groep -(CH2)n— voor stelt, waarin, n een geheel getal is: van 2 - 1.0, of een groep R--CH-CH-Rj,, waarin Rj, een waterstofatoom of een al-kylgroep met 1 - 8 koolstof at omen voorstelt en R^ een ten opzichte van. de uiteindelijk gebruikte reactanten inerte substituent 25 voor stelt, zoals een amidegroep met de formule -ÏÏH-C(0)-QR^, waarin een al of niet vertakte alkylgroep. met 1 - 5 koolstof— atomen is, en X een activerende groep is met de voornoemde betekenissen, die bovendien een alkoxyearbonylgroep .kan zijn, waarbij de reactie in.homogene vloeibare fase en bij omgevingstem-30 per at uur wordt uitgevoerd.
3. 7. Werkwijze volgens conclusies 2 - 6, met het kenmerk, dat wanneer eenmaal de totale reacties zijn beëindigd het verkregen conjugaat wordt gezuiverd om dit te ontdoen van de niet— omgezette verbinding Pg-S-S-X, volgens een op zich zelf bekende 790 72 51 α t ƒ methode, zoals een gefractioneerde precipit at ie, door met water mengbare organische oplosmiddelen, een gelpermeatiechromatogra-fie, bij voorkeur een filtratie over Sephadex-gel G200 of een af— finiteitschromatografie over een kolom van een onoplosbare dra— ' 5 ger,. waarop het antigeen dat overeenkomt met het antilichaam wordt gefixeerd.
4. 8. Werkwijze ter bereiding van de A-keten van rici nus in zuivere toestand, een uitgangsmateriaal dat noodzakelijk f is voor de werkwijze volgens conclusies 1 — 7» met het kenmerk, 10 dat een oplossing van zuiver ricinus in een zwak-ionische buffer, waaraan eerst bij kamertemperatuur een reductiemiddel, zo— . als mercapto-2-ethanol is toegevoegd,, teneinde op op zich zelf bekende wijze selectief de disulfidebrug te splijten, wordt ge— chromatografeerd over een kolom DE-AET Cl Sepharose 6B of QAE Se— 1? phadex A.-50 in dezelfde buffer en in aanwezigheid, van het reduc— tiemidde-I,. waarna selectief de A-keten van ricinus' door een buffer oplos sing met een hogere. pE en ionische sterkte van. de voorafgaande, steeds in aanwezigheid van het reductiemiddel, wordt ge— elueerd.
5. 9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat na elutie van de A-keten van ricinus de verkregen geconcentreerde oplossing wordt afgekoeld en de genoemde A-keten in gekristalliseerde toestand wordt verzameld.
6. 10. Werkwijze volgens conclusies 8-9, met het ken-25 merk, dat de elutie-oplossing van de A-keten geadsorbeerd op de DEAE CL Sepharose 6B kolom wordt gevormd door een TEIS-HC1 0,1 M buffer met pH 8,U, die 0,1 Had en 2.,5% mercaptoethanol bevat, en de elutie-oplossing van de A-keten geadsorbeerd op de QAE Sepha-dex A.50 kolom wordt gevormd door een TRIS-HC1 100 mM buffer, met 30 een pH van 8,U, die 0,5% mercapto-2-ethanol bevat.
7. 11. Werkwijze volgens conclusies 8 - 10,. met het kenmerk, dat de elutie-oplossing van de A-keten wordt gedialyseerd tegen een fosfaatbuffer 10 mM, met een pE van 6,5, waarbij de aldus verkregen oplossing wordt aangebracht in een kolom van car- 790 72 51 v et rt ; 58 boxymethylcellulose waaruit de zuivere A-keten wordt ge'êlueerd onder gelijktijdige verhoging· van de· concentratie en. de pH van. de "buffer van TO mM en een pH van 6,5 tot 125 ziM en een pH van 7,0 in aanwezigheid van 1 mM EDTA„
8. 12. Werkwijze ter bereiding' van zuiver ricinus nood— zakelijk voor de "bereiding van de A-keten volgens conclusies 8 — 11, met het kenmerk, dat het ruwe extract op "bekende wijze verkregen van de zaden van Ricinus communis wordt gezuiverd, door een enkele chromatografie over een Sepharose. kolom·, waarbij de 10 totale lading van proteïnes niet groter is dan. de capaciteit van de kolom en de elutie stapsgewijze wordt uitgevoerd, eerst met een bufferoplossing TRIS-HC1, 50 mM, pH 7VT üs de? proteïnes, die. geen Iectines zijn elueert, vervolgens met. een oplossing: van galactose met een concentratie tussen 0,25 en 0,56 mM die het 15" zuivere ricinus elueert.
9. 13. Qytotoxische produkt en, met het kenmerk, dat deze zijn samengesteld uit verbindingen, zogenaamde conjugaten, waarin de A-keten van ricinus door een disulfidebrug is gekoppeld aan. een proteïnestructuur, zoals een antilichaam, immunoglobu— 20 line of immunoglobuline-fragment, in staat, selectief, een gegeven s antigeen aan het oppervlak van de dragercellen, die men wil bereiken, te herkennen. 1^. Produkt volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het antilichaam een anti-DIIP antilichaam is» 25 15· Produkt volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het antilichaam het F(ah)fragment van het. anti-DHP antilichaam is.
10. 16. Produkt volgens conclusie 13, met. het kenmerk, dat het antilichaam. het anti-Thy 1.2 IgM is·. 790 72 51 (Reaetieschema A) j * Prot NH-CO-CH-SH + A-S-S-X->Prot NHCO CH-S-S-A + XSH CH_ CH2 COO®-- COO® (4) (Reaetieschema B) H H% 5 Prot-NH + /C-R*-> Prot NH-C-R + R-OH L L (Reaetieschema C) * C12 fr\ - HS-CH2-CH2-COOH ^'Sr^sci —:——► Si^s-s-ch0-ch9-c-oh L L· \\ 0 (Reaetieschema D) CX : "'Ö Cl . V S S CH2CH2C OH -(S__-^ ^!T^S-S-CH2CH20-0-N }— 0 h2h - (οη2 ) 5c00h 0 0 ^ S-S-CH2CH2C-NH-CH2eH2CH2CH2CH2-C-OH 790 7 2 5 1 CMiroUSTRIES