JPS5874614A - 蛋白複合体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な蛋白複合体とその製造法並びにそれを用
い九特定細胞群の破壊方法に関する。

ｌ！に詳しくは、零発＠杜、蛋白生合成阻害活性蛋白を
アビジンに結合せしめて得られる蛋白複合体とその製造
法並びｋその複合体とビオチニル化抗体とを用いる、抗
体が１鐵する特定−胞ｆＩ＃管破壊する方法に閤するも
のである。

種々Ｏ＃Ｉ胞群の混合体Ｏ中から成る特定０＠胞詳を選
択的に破壊することは、種ｈａ生化学的操作、例えば、
細胞レベルでの免疫応答機構の解明、薬物の作用機作ｏ
ｓ＠、或い社臨床検査において必要とされる場合が多い
。このよう繊する抗体を補体とと−に用いて、補体依存
性＃ｌｌ！ｉｉＩ解反応を起ヒさせる方法が用いられて
来九。しかしながら仁の方法では、例えば、ヒト”１Ｅ
Ｇｔ　　ｋ　トｒｇＧ４　９ｙトＩｇＧ亀　マりＸ　Ｘ
ｇＧ＆モル壱ットＩｇＧ１などの如＜、ＩＩｓ％／％る
抗体のクラス、ｔブタラスによっては補体結合性がなく
、ＪＩＩ胞溶解反応を起ヒし得ないし、又、補体結合性
抗体であって亀、用いる補体の動物種によっては補体依
存性ｏｍｓｔｓ解反応をゝ２し′〈“場合がある。ＩＩ
！に、補体練として用−る血清中には、補体以外の各種
の血清成分、例えば、アルプンン、免疫グロブリン、オ
ノホカイン等が含まれているので、これらの成分が目的
とする細胞の選択的溶解反応を阻ける場合がある。

本発明者ら・は、これらの欠点を有し′＆い、殺すべ龜
特定＋ＣＳ胞詳を選択的に効率よく破壊すゐ強力な殺細
胞法、ｔＬびｋその方法ｋＷ４％ｆｈ得る試剤を開発す
べく鋭意研究の結果、不発Ｉ！１ｌＩＫ１１達した。

即ち、本発明は、アビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白と
を共有結合、例えばジスルフィド結合によって架橋する
辷とｋより得られる蛋白複合体であシ、かかる蒼白複合
体と特定の細胞を１鐵するビオチニル化抗体とを用いで
、アビジンのビオチンに対する鳥い親和性を利用して、
抗体が４１異的に１織する細胞を破壊する仁とを特徴と
する選択的殺細胞法である。

本１１１ｊｌにおいて、アビジンとは卵白中に存在する
分子量約・亀ｏｅｏの塩基性糖蛋白質であ）、ビタ々ン
Ｈとして知られるビオチンと極めて痛い親和性（覇和性
定＃　１　＠”　Ｍ”’　）を有することが知られてい
る。アピジνは％４個のすプエニットから成ることが知
られているが、不発−のアビジンとはこれらＯｆプエエ
ットも含む。

不発＠において用いられる蛋白生合成阻害活性蛋白とし
ては、蛋白生合成阻害活性を有する蛋白質であればいか
なるものでもよいが、４１に望ましいのは、リシンのム
鎖、ジフテリア毒素のフラグメントム、ツルレイシよ抄
抽出される蛋白生合成阻害活性蛋白、アメリカヤマゴボ
ウより抽出される蛋白生合成阻害活性蛋白である。

リシンとは、植物ヒマ（Ｒｌｃｉｎｕｇ　ａｏｌＩＷｕ
Ｊｌｌｇ　）の種子より全知の方法、例えばオルスンズ
とビール［１１，０１ｓｎｓｓ　ａｎａム、Ｐｉｋｌ、
　Ａイオケｉｘトリー（Ｂｉｏｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ）１
２巻、目！　１〜３１　！・貞。

１９７ｓ都〕の方法によって抽出精製することができる
蛋白毒素をいう。リシンは分子量纂ｚｏｏｏのずプエニ
ットムと分子量１４ｏｏｏのサブエエット造から成って
おり、一本０ジスルフィド結合によって一緒ばれている
〔第１図ｔｕｆｔ）　）。

リシンを還元剤で処理すると第ｔｇｏ←）に示し九如く
各々少なくとｔ１傭のメルカプト基（−一）を有するナ
プ二ニットム（ム鎖）とナプ瓢ニッ）Ｂ（Ｂ鎖）とに分
類する。切断前のりシン線動物に対する非常な毒性を有
しているが、ム鎖は七のｔｔでは弱い毒性を有するのみ
であ）、またＢ１１１ｄ若干の毒性を有するのみである
。リシンは蛋白の生合成を、ペプチド鎖の伸長に不可欠
な成分を不活化することｋよって阻害し、細胞毒性を発
揮すると考えられている。ム鎖は無Ｊｌｌｌｌ系での蛋
白生合成阻害活性を有しているＯＫ対し、Ｂ鎖はそのよ
うな活性を有しないが、ム鎖には見られない細胞のリセ
プターとの結合能を有している。本発明において社ム鎖
が用いられる。

不発−においてジフテリア毒素とはジフテリア薗又はそ
の変異株が貴生する蛋白毒素をいう。

例えば、ジフテリア薗が産生するジフテリア毒素は１分
子量約・ｔｏｏｏ〜６亀０００の単一のポリペプチド鎖
からな〉、これはインタクトトキシンと呼ばれている。

インタクトトキシンは第３図のＨ）Ｋ模式的に示しえ如
く、その分子内にジスルフィド結合（−ｇ−ａ−結合）
を３個有している。このインタクトトキシンを、例えば
、トリプシンＯような蛋白分解酵素で温和な一条件で処
理すると、ア建ノ基末端に近い＠Ｏジスルフィド結合Ｏ
間０４１１定の一部位に分割がおこシ、第意図の（ロ）
に示すごときエツタドト中シンとなる。

このニツクドトキグンを゛還元剤で処理すると、筒雪Ｉ
Ｉ　Ｏｆ４ＩＫ示し九如く分子量約３４１１＠（１０フ
ラダメ／トムと約ａ＠ｏｏｏ〜１％ＯＯＯのフラグメン
トｉｌＫ分離する。

ジフテリア毒素に於いてこのフラグメント８に相当する
部分（Ｂ部分）は毒素が細胞と結合する丸めの部分であ
〕、フラグメントムに相当する部分（ム部分）社Ｂ部′
分の細胞との結合を介して細胞内に人〉蛋白合成を阻害
し細胞を死Ｋｊｌらしめる部分である。かかるジフテリ
ア毒素のフラグメントムは不発＠に゛おける蛋白合成阻
害活性蛋白としそ用いることがで龜る。ジフテリア変異
株、例えば０ツ０Ｊｌ（１）　＋ａ智（／４１）が書生
する、例えばＯＲＭ！１０　＋　０１Ｍ４１１１のとと
き無毒変異蛋白（分子中にジスルフィド結合を！個有し
ている）や、これらを例えばチオール試薬等の還元剤の
存在下でトリプシンで温和に処理して得られる７ラダメ
ントも、不発＠におけるフラグ不発＠ＫＴｈいて、ツｋ
Ｖイシ（Ｍｏｍｏｒａｉｏａａｈａｒａｎｔｉａ　）よ
シ得られる蛋白生合成阻害活性を有す為蛋白（ＭＯＭ）
と社、植物ツルレイシの種子より公知の方法、例えばパ
ルビエリら（シ。

１１ａｒｂｉ・ｒｌ・ｔａｌ、、パイオケ電カル　ジャ
ーナ＆　（Ｂ１ｏａｈ６ｍ、Ｊ、）、　ａｌｌ　ｔ　ｓ
　ｓ巻、４４８〜４８雪真、ｔｏｓｓ年参照）の方法に
よって抽出精製することができる分子量約ｚａｏｏｏの
蛋白であシ、つずギ網状赤血球のライゼート（１ｙｓａ
ｔ・）による蛋白合成に対して強力な阻害活性をもつで
いるが、ｍ１１１表面に結合性を示すリシンのＢ鎖相尚
部分を元々持たないのでＭＯＭ単独で社低い細胞毒性し
か示さない。

本４１＠において、アメリカヤマゴｌつ（Ｐｈｙ−ｔｏ
ｘａｇｏａ　ａｍｓｒｌｏａｎａ　）より得られる蛋白
生合成阻害活性を有する蛋白（ＰＡＰ）とは、植物アメ
リカヤマゴボウの葉よ〕公知の方法、例えばアーピン（
Ｊ、Ｄ、Ｉｒｒｌｎ、アーカイプス　オプ　バイオケζ
ストリー　アンド　バイオフイジクス　゛（ムｒａｈｉ
ｖｅｓ　ａｔ　ＢＬｏａｂ・ｗｉｌｔｒｙ　ａｎａ　Ｉ
Ｈｏｈｙｓｉｃｓ）。

第１−・寺、Ｓ３１４３８頁、ｌ・１！！年参照）の方
法によって抽出精製することができる、分子量約３ｙ、
ｏｏｏの単一のポリペプチド鎖からなる蛋白であり、Ｍ
ＯＭと同様につ！ギ網状赤血球のライ！−）　（ｌｙａ
ａｔ・）Ｋよる蛋白合成に対して強力ｅｌｌｌｌ性をも
りているが、細胞表面に結合性を示すリシンＢ＃１１１
相轟部分を元々持たないのでＰＡＰ単独では低い細胞毒
性しか示さない。

ＰＡＰは瀧からだけでなく、アメリカヤマゴｌつの種子
、根等からも抽出精製できる。

不発＠に於いて用いられるビオチニル化抗体社、抗体を
公知の方法によ）ビオチンの活性エステル体と反応せし
めるととによ〉得ることができる。ビオチニル化に用い
る抗体、は、破壊すべ＊Ｓ＋胞を九はその膜抗原をナル
、ウマ、ウシ。

ヤギ、ヒツジ、つ中ギ等の動物に過免疫し九血清から、
コーンのエタノール分−法、硫安分画法、イオン交換タ
ロマトダラフイー法等Ｏ会知の手ＲＫよって調製さ、れ
、さらに必要によりては各種細胞を用いて吸収、吸着操
作をはとむして得ることができる。を九破゛嬢すべき細
ｓｉｔたはその膜抗原で免疫した動物から得たリンパ球
を、例えば骨髄腫と細胞融合させ、目的とする抗体産生
性のクローンを選別して融合細胞（ハイプリドーマ）を
作製し、これの培養液から、またはこれを動−に接種し
てその血清または腹腔液からも抗体を得ることができる
。抗体（免疫グロブリン）Ｋは、ＩｇＧ、工ｇム＊　”
ｇＭｓ　ＸｇＤ。

工ｇ鳳のＳ種類があることが知られているが、そのどれ
でも零発＠に用いることができる。

不発ＩＩＩＫ於いて抗体はそのｔ〜でも、或いは杭原と
結合し得る部分（図３のＩＰａｂ）を含む限りＫｓ？い
ては、そのフラグメント（例えば、ｔａｂ部分とからな
るνｍｂ’、　Ｔａｂ’の２量体？（ａｂ’）■）でも
ビオチニル化して用いることができる。本発明でいうビ
オチニル化抗体には、かかる抗体の７ツグメントをビオ
チニル化したものも含まれる。

不発＠Ｏアビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白より成る蛋
白複合体は、両蛋白を共有結合によ）架橋するととによ
って製造される。共有結合によって架橋する方法として
は１例えば、シフＱへｄＰＶルカルボジ４ｉＶや１−Ｚ
ｆｋ−１−（嘉−ジメチルアミノプロピル）カルボシイ
建ド塩酸塩等のカルボジイミド試薬（縮合剤）を用いて
、両蛋白を直接結合させてもよいし、あるいは、分子中
に複数個の官能基を有する榮−剤、例えば、グルタルア
ルデヒド、トルエンジイノシアネート、＆ｌ−ジカルポ
中シー４４′−アゾフエニレンジイソシアネート、ジエ
チルマロンイ々デートニ塩酸塩、Ｍ−ナタシンイ電ジル
ｍ−（輩−マレイミド）ヘンゾエートヲ用いて、両蛋白
を結合させてもよい。共有結合としては、ジスルフィド
結合を含有する結合が４１ＫｍｔＬ＜、ジスルフィド結
合を形成する２個の硫黄原子は両蛋白に元に存在してい
た硫黄原子であっても、また外部から架橋剤によって導
入されえ硫黄原子であってもよい。本発明のアビジンと
蛋白生合成阻害活性蛋白がジスルフィド結合によ〉架橋
された蛋白複合体を製造するには、例えば、蛋白複合体
を構成するアビジンま丸線そのナプエニットと蛋白生合
成阻害活性蛋白のどちらか（任意の一方の蛋白をＰＩで
他方の蛋白をＰ！で表わす）に活性ジスルフィドを導入
しておき、他方にチオール基を導入あるいは生成させて
おき、両者をジスルフィド結合で架橋する方法をとるこ
とができる。すなわち、ＰＩＫ例えば下記式（Ｉ）、 ！−８−８−１−０−Ｚ　　　　・−−−−”＠（１）
關 で表わされる架橋剤、あるいは下記式（至）、！−１１
−８−Ｒ−０−Ｑ　　　　　・・・・・命・・（１）観 ＭＨ・Ｅ！ で表わされる架橋剤を反応せしめ〔反応（１）　＃　（
り］るか、 ｌｉｄ　　（、。

式（至）、 Ｘ−Ｒ−ＣＪ−Ｚ　　　　　　　　　　　　　　−會・
・・・・嶋（至）鵬 で表わされる架橋剤を反応させ九後、生成物（Ｗ）をチ
オ傭酸イオンで処理〔反応（Ｓ）〕するか、（Ｗ） （釦 あるいは、ＰＩｔ式（＠あるいは（（２）で表わされる
架橋剤（それぞれ、２−イ電ノチラクトン１Ｍ−アセチ
ルホモシスティン）と反□　応せしめて生成し丸穴（１
［）　ｔたは（夏）で表わされる蛋白、またはＰｌを式
（Ｋ） ０ で表わされる架橋剤（８−アセチルメルカプトコハタ酸
無水物）と反応せしめて生成した蛋白を脱ア七チル化し
て得られる式（夏）で表わされる蛋白を、チオール基を
活性ジスルフィド基に変換する試薬〔例えば、亀２′−
ジピリジルジスで躯環して〔反応（４）　、　（！０ま
たは（・）〕、活性ジス〔！Ｏ定義は式（１＞の場合に
同じである。　　　〕〔！Ｏ定義は式（Ｑの場合に同じ
である。　　〕（！０定義は式（！）の場合に同じであ
る。

が導入されたＰ！〔式（厘）ｓ　（ｔ）、　（厘−”）
ｅ　（１−１）。

（厘−鵞）ｔえは（厘−３）で表わされる蛋白〕を得る
。

他方、もう一方の蛋白Ｐ冨より上記式（ｔ）　ｅ　（り
　ｔたは（ｘ）　ｏ如くして作った、下記式（１厘）　
、　（ｘｖ）１九は（扁−１）で表わされるジスルフィ
ド基が導入された蛋白のジスルフィド基を、例えば３−
メルカプトエタノールｔえはジチオスレイトール等のチ
オール試薬でＲ覚する〔反応（？）　、　（１）　ｔえ
はく・）〕か、★九は ”　（ｘｖ）　　　　　％） （冨−１） 反応式（４）または（ｉ）の第一一−の反応また社反応
式（６）Ｏ第−及び二段階の反応と同様にしてチオール
基が導入されえＰｓ〔式（廟、（冨）、　（ＩＯＦ−１
）。

（ｍ−ｔ　）★たは（ｍ−ｓ）で表わされる蛋白）を得
る。

ＯＮ１００ＯＨｓ ｏ　　　ｏａ諺００嘗ＩＩ 〔式（１）、　（Ｗ）ｔたは（璽−！）中のＲと式（Ｗ
）　を九は（罵）中のＲ線間−でもｔ九は互に異なりて
いてもよい〕。例えば、上記の如くして製造したチオー
ル基が導入され九Ｐ３を、岡じ（上記の如くして製造し
九活性ジスルフィド基が導入され九ＰＩと反応させしめ
て、本発明のアビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白が活性
ジスルフィド基で架橋され九蛋自複合体を製造すること
ができる。１お、ジスルフィド結合によって架橋され九
不発−の蛋白複合体を得るため、一方の蛋白がシスチン
！Ｉ基の一部としてのジスルフィド結合をもっていると
きに杜、場合によりでスルホ化分解を行うことｋよって
、或−は蛋白がチオール基を持りている場合には、上に
記し表如きチオール基を活性ジスルフィド基に変換する
試薬で魁迩するととによって、直接に活性ジスルフィド
基をもつ九蛋白に導くことができ、かかる蛋白もｔ九チ
オ−に基を発生または導入され九他方の蛋白と反応せし
めて本発明の蛋白複合体を製造することができる。また
、一方の蛋白が−ｙｔ、ｈチオール基をもっている場合
には、そのｔｈ、を九Ｖスチン残基〇一部としてのジス
ルフィド結合をもっているときＫは、場合によってジス
ルフィド結合よ）還元等の操作によ抄チオール基を発生
させ丸後、直ＩＩＫ、活性ジスルフィド結合をもつ九他
方Ｏ蛋白と反応せしめて本慟ＩＩＯ蛋白複合体を製−す
ることができる。

！で表わされる、結合している硫黄原子と共に活性ジス
ルフィド基を形成し得る１価の有機□ ４−ピリジル基（−Ｑ）、−一カルー中シー４−できる
。Ｒで表わされる２価の有機基は、化学的に不活性であ
ればＩＩＫ＠定されないが、一般的には分岐を有するか
有しないアル中しン基。

フェニレン１轡から遭宣選ばれる。２″ｅ＊わされる活
性エステルのアル冨 とができる。Ｑで表わされｂイミドエステルのア＃プー
ル残基Ｏ具体例としてはメトキシ、エト午シ基等を挙げ
ることができる。！で表わされるハロゲン原子の異体例
としては塩素、Ａ素等を挙けることができる。

架橋剤の具体例としては、式（１）で表わされる架橋剤
として１．Ｉ−ナクＶンイ電ジル１−（鵞−ピリジルジ
チオ）プロピオネート。亀４−ジニト四フェニルａ−（
ａ−ピリジルジチオ）フロビオネートを、式１）で表わ
される架橋剤として、メチル８−（２−ピリジルジテオ
）グロピオンイミデート塩鹸塩ｔ１式（Ｖ）で表わされ
る架橋剤として、Ｍ−！クシンイミジル３−ブロモプロ
ピオネートを挙ける仁とができる。

上記のアビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白の架橋反応に
おいて、アビジン或いは蛋白生合成阻害活性蛋白に架橋
剤會反応させる場合は、反応せしめる蛋白１モルに対し
、架橋剤を１〜露０４＃用いるのが好ましい。反応はア
ビジン或いは蛋白生合成阻害活性蛋白の、ｐＨ！ｉ−１
の緩衝液中蛋白濃度がａｍ！−１１）６吋／−（よシ好
ましくは１〜！　ＯＷＩＩＩ／ｓＪ　）になるように調
製されたｌ液に、Ｏ〜易・℃て攪拌しながら架−剤の水
製＊１九は架橋剤が水Ｋ１１ｌけない場合には、架橋剤
を少量の有機溶Ｉｓ１例えｄ、ｗａｗ−ジメテルホルム
アζド、ジメチルスル本中シト。

Ｌ雪−ジメト命シエタン、メタノール、エタノール、ア
セトン等に溶かし九ｍｍを添加して行なわれる。反応時
間は反応スケール、反応条件によるが、−鍍に３日間以
内である。反応終了後、透析または分子ふるいのカラム
クロマトグラフィーにより、未反応の架橋剤及び低分子
生成物を除いた後、得られた架橋剤が導入され九蛋白溶
液に複合体のもう一方の構成に分である蛋白（または架
橋剤によ）架橋用官能基が導入されえ蛋白）のｐＨ５−
９０緩衝液の滴液く好ましい蛋白鎖直の範＠社上に記載
し九のと同じである）を添加して、０−ＳＯ℃で反応せ
しめる。

複合体の反応混合物からの分離、精製は通常用いられる
操作１例えば分子ふるいのカラムクロマトグラフィーに
よって行なうことができる。

なお、複合体の一方の成分の蛋白の滴液に１架橋剤が導
入され九他方の成分の蛋白の溶液を添加して複合体を製
造することもできる。さもＫ。

架橋剤が導入された蛋白を、低分子の試薬で処理して特
定の架橋用官能基を有する蛋白に変換する場合（例えば
架橋剤によって導入された活性ジスルフィド基をチオー
ル基に変換する場合）、或いは、アイジン或いは蛋白生
合成阻害活性蛋白を低分子試薬を用い直接活性化−導体
に変換チオール基を活性ジスルフィドに変換する場合）
の反応条件も上記の蛋白に架橋剤を反応せしめる場合Ｏ
反応条件と同様である。

本発明で得られるアビジンと蛋白生金−阻害活性蛋白と
ｔ共有結合によって架橋することｋよって得られる蛋白
複合体は、特定Ｏｓ胞詳を認識するビオチニル化と、ア
ビジンのピオチンに対すゐ強い親和性を利用して、結合
せしめることにより、抗体が認識すゐ特定細胞群を選択
的に砿壊すゐ九めに使用することができる。

即ち１本発明者らは、蛋白生合成阻害活性蛋白を一アビ
ジンとビオチンの強い親和力に基づく非共有的結合を介
して、抗体と結合させることＫよって、蛋白生合成阻害
活性蛋白が抗体が１識する特定細胞群に対し細胞毒性を
発揮するに到るということを見い出し友。かかる特定細
胞群破壊システムの優れた点の一つは、既に述ぺ大過〉
、補体依存性細胞溶解反応が、抗体のクラス、？ブタラ
スによっては補体との結合性が＆いために１或いは補体
結合性がある場合でも用いる動物種によっては補体依存
性細胞溶解反応・が起こ抄−いために、適用できない場
合でも本発明のシステムは適用できることである。

を九、選択□的補体依存性細胞溶解反応が、補体源とし
て用いる血□清中の補体以外の成分で阻けられる場合が
あるのに対し、本尭明方快ではそのようなことがない。

さもに本発明方法の特徴は、蛋白生合成阻害活性蛋白と
してアビジンとの蛋白複合体を作る九めに好適に用いら
れるリシンのム鎖、ジフデリア毒素の７ラグメントム。

ツルレイシよ如得られる蛋白生合成阻害活性蛋白及びア
メリカヤマゴｌつよ砂得られる蛋白生合成阻害活性蛋白
が、いずれ奄それ自体では、細胞表−と結合する部位を
欠いているが九めｋ。

極めて弱い細胞毒性しか示さないことと、一旦杭体を中
ヤリアーとして、細胞内へ導入着れると極めて強い細胞
毒性を発揮する点にある。加えて、ビオチニル化抗体上
には、一般にアビジンと結合する部位が複数個存在する
ので、本発明方法の如く、蛋白生合成阻害蛋白をアビジ
ン−ビオチン結合体を介して抗体に結合させ丸場合、抗
体１分子０、−数個ＯＩＩ白生合成阻害活性蛋白が付く
ととにな〕、細胞破壊効果の増幅が得られることも本！
ｌ！一方法の特長としで挙げる仁とができる。

本ｌＮ１１方法によって特定ｌ５ｌｌ！群を破壊する望
゛★しい実施態様は、破壊し九い細胞群を含む細胞集団
を先ず、その細胞群舎選択的Ｋｌｌ鐵する杭休めビオチ
ニル化体（ビオチニル化抗体）溶Ｏ分接触反応させ、 細胞培養培地もしくは緩衝化食塩水で洗うことによ〉過
剰の未反応抗体を除去した後、さらに１アビジンと蛋白
生合成阻害活性蛋白と゛を共有結合によりて架橋すると
とｋよ）得られる蛋白複合体を加えて、０〜３丁℃で凰
〜３□Ｏ分接触反“応させ、細胞培養培地屯しくけ緩衝
化食塩水で洗って過剰Ｃ＋蛋白複合体を除去し先後、績
胞培−すゐ方法である。細胞培養は通常の条件、即ちｉ
　ｚ　ｏｏ−加■雰囲気下ｓ１℃で通常８時間〜Ｓ日間
行えばよい。なお、ビオチニル化抗体と、アビジノと蛋
白生合成阻害活性蛋白の複合体は、同時に細胞に加えて
もよく、ま九予めビオチニル化抗体と不発ＩＪＩＩＯ蛋
白複合体とを接触させてアビジン・ビオチン結合体を作
らせた後、その結合体で細胞集団を処理してもよい。

以下、実−例によ抄本発明を詳述する。

実施例Ｌ アビジンとりシンム鎖とをジスフィト結合を含む共有結
合によって架橋することｋよ〉得□　られ為蛋白複合体 Ｏ）　アビジノへの活性ジスルフィド基の導入°　龜・
噌アビジンを１１Ｍ塩化ナトリウムを含むａ１ＭＩ３ン
酸緩衝゛液ｐｌｉ？ｉ（以下ム液と略す。）ｘｍＫ溶解
し、これに、エタノール中に１１Ｌ　４ｍＭの賢−すタ
シンイ禮ジル３−（２−ピリジルジチオ）グロピオネー
ト（以下８ＰＤＰと略す。）を含む溶液αＯ雪−を加え
、室温で３０分間反応させえ。この反応液を、ａ１４Ｍ
塩化ナトリクムとＩＩＩＭエチレンシア建ン四酢酸ナト
リウム（以下ＩＤＴＡと略す。）とを會む１１１Ｍ酢酸
緩衝液ＰＩＥ翫易（以下Ｂ液と略す。）で平衡化したセ
ファデックスＧ！ｓカラムクロマトグラフィーｋかけて
、未反応物と低分子生成分を除き活性ジスルフド基が導
入され九アビジンを得た。

（ハ）　リシンム鎖の調製法 ヒｗ　（Ｒｌｅｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｅｇ）のマメよ
シリジンを精製し、リシンよシそのム鎖を分離する方法
はオルスンズとビール（８，１１ｓｎｅｓ　ａｎｄ　Ａ
。

Ｐｉｈｌ、バイオケ＜２トリー（Ｂｉｏｏｈ＠ｍ、）、
　１２巻、１１１１〜８１！＠買、ｔ＊ｔｓ離］。

報告に基いて行なった。得られ九ム鎖の溶液には８−メ
ルカプトエタノールが含まれているので、使用直前に上
記＆＞１）セファデックスＧ２ｓカラムクロ！トダラフ
イーにより除去し丸。ζＯム鎖には、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアタリルア電ドゲル電気泳動（以下ＢＤＢ
　−ＦＡＧ鳳と略す）において１鎖もインタタトリシン
も認めもれなかつえ。

ｆｉ　　活性ジスルフィド基が導入され九アビジンとり
シンム鎖との架橋及び蛋白複合体の精製上記（至）項で
得られた、活性ジスルフィド基が導入されたアビジンを
含むＢ液（２１（Ｉｎｎの吸°光直は龜Ｓであり九。）
ｔｙ＠Ｉと、リシンム鎖（チオール基を有する）を含む
Ｂ液（２ＩＩ　（Ｉｎｎの吸光１１ａ　ｔ　４　”ｔ’
あ−ｐｇ。）Ｌ８−と、１０１１Ｍ　ＩＤＴＡを含む６
４Ｍす／ｍｋ緩衝液ｐＨ７゜Ｓ（以下ｃ液と略す。）ａ
３４１１ｊを混合し、室温で一晩反応させえ。

この反応液を生理食塩水で平衡化したセファデックスＧ
１５０スーパーフアイン・カラムクロマトグラフィー（
カラムナイズＬｌｌ！ＩＩＸ　１１５　ａｍ　）　Ｋか
けた。第４図の如く１分子量９万ないし五６万〈らいの
流出位置に大きなピークが−められ九。この分１１２１
番から２＠番まで（ｍｌの斜線部）をプールした。ζう
して得られ九蛋白溶液をドデシル硫酸ナトリウム−ボリ
アクリルアζドゲル電気泳動にかけた。第Ｓ図のディス
ク１紘リシンム鎖。

ディスク３社アビジン、ディスク３は架橋。

精製され九蛋白複合体、ディスク４はその蛋白複合体を
鵞−メルカプトエタノールで還元した生成物をかけたも
のである。ディスク３かも、分子量約Ｌｉ万（右端）く
らいのアビジン吻豐プエエットの４ｋＫ分子量約４１万
とｙ、置方（左端）くらいの生成物が１められる。

これらの分子量はアビジン！プエニツ３４分子、ナプエ
二ットとりシンム鎖五分子の和及びすプエニット真分子
とりシンム鎖２分子の和にそれぞれ一致する（系中にド
デシル硫酸ナトリウムが存在して−るため、アビジンは
ｔプエエットに分離して検出される。）実Ｓ％これらの
生成物をＩＩ覚すると、ディスク４０如く、かな〉の量
Ｏｖｖンム鎖が生成する。

従って得られた蛋白複合体は菖畳図の如く、４つのアビ
ジン・すプエエットのいくりががリシンム鎖１個と結合
し九（Ｓ個結合したものもわずかに存在する）構造をと
っている。

実施例ｔ アイジンとジフテリア毒素の７ラグメントムとをジスル
フィド結合を含む共有結合によって架橋するととによ）
得られる蛋白複合体（カ　ジフテリア毒素の７ツグメン
トムの調製ジフテリア毒素２１０噌を含むａｏｉＭ）リ
ス・塩９１−１１１Ｍエチレンシアζン四酢酸水溶液（
ｐＨ＆ｓ　）１　ｔｓｍＫ、ａｕｓｌ／５ｄｉ１度のト
リプシン溶液をａｌｓ−加えて、３６℃で５０分間分解
し、そ０後ａｓｑｐ／５ＩＪｌ１１度の大豆トリプシン
阻害物質溶液ａ３−を加えて反応を停止した。この分解
生成物に尿素（最終１１１１ｊ６Ｍ）、亜硫酸す）　Ｉ
Ｊウム（最終濃度ａ１６畠Ｖ）およびデトラチオン酸ナ
トリウム（最終１１１１ａｏ４ｚＭ）を加えて、３１℃
で■Ｉ８−スルホ化分解を行なり九。得られ九反応液を
、６Ｍ尿素−１０３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ！Ｌｍ　）中で
セフアゾｙｌｘｃｋ　ｔ　＠　＠カラムクロマトグラフ
ィー（カラムナイズ龜Ｓａｍｘｔｔｓａｓ）Ｋかけて、
遅れて流出する７ラダメントム両分のみを取シ出し、ｌ
！に蒸留水に透析することによって純粋なフラグメント
ム溶液を得た（Ｂ−スルホ基をＩＩＩ有するん得られえ
８−スルホ化フラダメントム溶液をトリス塩酸緩衝液（
ｐｉｌＭ４　）　Ｋ対して透析後、雪−メルカプトエタ
ノール（最終濃度１０１０１ｌでＳ丁Ｃで１時間処理し
、実施例１６４１項記載のセファデックスＧ霊５カラム
タロマトダツフイーに付し、チオール基を１領有するジ
フテリア毒素の７ツダメントムを得た。

に）活性ジスルフィド基が導入されたアビジンとジフテ
リア毒素の７ツダメントムとＯ架橋及び蛋白複合体の精
製 上記Ｏ）項の如くして得え？フチリア毒素の７ツダメン
トムと、実施例１のピ）項の如くして得九活性ジスルフ
ィド基が導入され九アビジンとを用い、実施例１ＯｆＪ
項の鳩舎と同様の操作によ〉、アビジンとジフテリア毒
素７ラダメントムとがジスルフィド結合を含む共有結合
で架橋された蛋白複合体を得た。

実施例龜 アビジンとツルレイシより得られる蛋白生合成阻害活性
蛋白とを、ジスルフィド結合を有する共有結合によって
架橋する仁とによシ得られる蛋白複合体 、（へ）　ツルレイシの種子よ〕蛋白生合成阻害活性を
有する蛋白（以下ＭＯＭという）の抽出・稍ツルレイシ
の種子ｔａｒｔ乳バチですりつぶし、エーテルで脂質を
除去した。こうして得た脱脂管体に％ｉｍｌ　Ｍ　Ｑン
酸緩債液−■１塩化す）　ＩＪｔム溶液（ｐＨ？、！　
）　Ｓ　＠　ｍｌを加えて、４℃で一晩攪拌を続けた。

その後、遠心分離によって不溶物を除去し、硫安を５ｏ
ｑＩＩ飽和になるように２Ｍ見た。ＯＣで１時間攪拌後
、遠心分離によってその上清を取〕、この上清にさらＫ
ｉｔ安を加えて７ｏ９１飽和として、０１℃で２時間攪
拌後、遠心分離によってその沈澱を分離した。沈澱物Ｋ
ｉｍの！！ｉ１Ｍリン酸緩＠１９１（ｐｅａｌ）を加え
て溶解し、同じりン酸緩債液に対して十分に透析し良。

その透析内液を、同じリン酸緩衝液で平衡化したセファ
デツタスＧｌ！ｉ０スーパーファイン・カツムタロマト
ダラフイー（カラム・ずイズ５４ｃｓ　ｘ　ｔ　Ｓ　ｅ
ｘ　）　Ｋかけて、分子量約３万の位置に流出する蛋白
をプールしえ。仁れを０Ｍ４フアデツクスＯ−１！（Ｉ
カラムタロマトグツフイ（カラム・豐イズＬ　＠　ａｓ
ｓｓ　ｘ　Ｓ　４　ｅｘ　）にかけた。Ｖ？ｙはＳ　Ｉ
ＬＭリンリン酸緩衝液Ｈ４Ｌｓ）Ｋ平衡化されているが
、ａＯｓＭリン酸緩衝液（ｐｕｔｓ）、ａｔｍリン酸緩
衝液（ｐｅａｌ　）さら６ｃａ冨Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ
ｌＭ　）という翼合に塩ｌｌ）度を上げていくと、（Ｌ
ＩＯＭ４ＤとζろでＭＯＭが流出してき丸。この分画の
蛋白□は、分子量約２？、　０００であ砂、他の蛋白を
含★ぬことはｓＤｅ　−ｐｉｅｍ＋　Ｋよって確ｇ″Ｓ
れた。

（ロ）　チオール基が導入され九ＭＯＭの調製上記ピ）
項の如くして抽出精製され九、ム液Ｋ　Ｍｏ１ｔ　ｔ　
１　！　＠噌／−の一度で含む博液４−に、雪＠　Ｉａ
Ｍの８ＰＤＰ　ｏ工り）−’ｋｆｌｊ液亀１９液管１９
−室温で３０分間反応させた。この反応液Ｋ　１０　ｍ
１Ｍ　ＩＤテム、　！！　００１１Ｍ冨−メルカ・ブト
エタノールを含む６０６１ＬＭ　）リス塩酸緩側１ｍ（
ｐｅａｌ）を（Ｌ　１　ｓＩｊ加ｊ−（，１ｉｌｌｌｅ
ｔｓ分間反応させ、Ｂ液で平衡化したセファデックスＧ
−ｊ！！！カラムクロマトグラツイーｋかけてチオール
基が導入され九ＭＯＭを得た。

ｆう　活性ジスルフィド基が導入され九アビ°ジンと、
チオール基が導入されたＭＯＭとの架橋及び蛋白複合体
の精製 実施例１のピ）項で得られた活性ジスルフィド基の導入
されたアビジンを含むＢ液（２００ｎｍの吸光度は瓢Ｏ
であった。）１１）１１ｊと、上記に）項で得られたチ
オール基Ｏ導入されたＭＯＭを含むＢ液（！１１Ｏｎｎ
ｏ吸光度は凱８であつ九。）へ６−と、ｏ＠ａ鵞＠ｄｆ
混舎し、室温−で−跪反応させた。

仁の反応液を生理食塩水で平衡化したセファデックスｅ
−１！！（Ｉスーパーファインタロマドグラフィー（カ
ラムナイズＬＩＸ・ｇａｓ）にかけえ。第７図がそのク
ロマトグラフィーの図である。分−２８番から３Ｓ番、
３４番から１１１１１でをそれぞれプールして分１１１
゜璽としえ。この■、麗分画をドデシル硫酸す・トリウ
ム−ポリアタ呼ルア叱ドゲル電気泳論ｋかけ第８図の如
き結果を得た。第８図のディスク１はＭＯＭ　、ディス
ク雪はアビジン、ディスタ３は分−Ｉ、ディスク４は分
−置、ディスタＳ、Ｓはそれぞれ分画Ｉ、鳳を雪−メル
カプトエタノールで還元した生成物をかけたものである
。

ディスク３よＩＩ分−は分子量約ＬＩＳ万（右端）のア
ビジンナプエニットのほかに分子量約ｔＳ万、６万と？
、ｉ万（左端）の生成物が認められ、これらの分子量は
それ（れアビジン！ブエニット１分子と輩６Ｍ　１分子
、アビジンナプエニット３分子とＭＯＭ　１分子量して
アビージンナプエニット１分子とＭＯＭ　１分子の分子
量の和に一致し、を九ディスク４よ）１０分画社分子量
約表１万と６万の生成物が認められ、これらはそれぞれ
！分画の分子量也５万、６万め生成物と同様のものであ
る。

セしてこれらの生成物を還元するとディスク４・のどと
＜　ＭＯＭとアビジンナプエニットだけとなる。従って
得られ九複合体は、アビジンの４つのすプエニットのい
くつかがＭＯＭ　１個と結合した（３個結合したものも
わずかに存在する）構造をとっていることがわかる。

実施例也 アビジンとアメリカヤマゴボウより得られる蛋白生合成
阻害活性蛋白を、ジスルフィド結合含有する共有結合に
よって架橋することにより得られる蛋白複合体 ０）　アメリカヤマゴぽつの葉よ）蛋白生合成阻害活性
を有する蛋白（以下ＰＡＰという）の抽出精製 アメリカヤマゴｌつの６薬５ｏｏｔを、５ＯＯｄの水を
加えて、々午伊−でホモゲナイズし九。このホモジエネ
イトより、アービン（Ｉｒマｉｎ）の方法（アーカイプ
ス　オプ　）（イオケ電ストリー　アンド　バイオツイ
ジクス（ムｒａｈｉｖ＋ｅｓ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｏｋｉ
ｓｍｌｓｔｒｙ　　ａｎａ　　Ｂｌｏｐｈｙｓｉａｓ）
。

第１・・４Ｉｋ、ｓ！１〜Ｉ鵞＄頁、１１７！ｓ年）′
に基づいて、硫安分画、　ＤＩムｌセル田−ス・タロマ
ドグラフィーおよびホスホセルロース・クロマトグラフ
ィーによりてＰＡＰを精製した。

このＰＡＰはＥＩＤ８−　ＰＡＧＩ　　において、分子
量約２？、＠・Ｏの位置に一つのバンドを形成した。

なお、アメリカヤマゴボウの種子、根からも同様に抽出
、精製し、ＰＡＮ’が取れることｔ８Ｄ１ｉ１−　ＰＡ
ＧＩ　で確認した。以下の実験では葉よ）精製したＰＡ
Ｐを用いた。

（→　チオール基が導入され九ＰＡＰ　Ｏ＠製上記０）
項の如く抽出精製され九ＰＡＰ　＆　１■を含む、ａＯ
冨Ｍすｙ鐵緩＠Ｉｌ−ａ１４Ｍ塩ＩＬＭ　　ＩＤテム　
水湊液　（ＰＨ７，１Ｓ）Ｌ＠ＩＩＪＫ、１１１１輩の
８ＰＩＩＰ　？含むエタノール溶液をａ・・−加え、室
温で３０分関反応させた。

この反応液に１０１１ＭＩｌｉＤＴＡ、　２００１ＬＭ
　　２−メルカプトエタノールを含むＩ　ＯＯＩＩＭ　
）リス塩酸緩衝液（ｐＨａｌ　）をａ０４−加えて、３
７℃で３・、分−間反応させ、反応液な％Ｂ液゛５で平
衡化したセファデックスａ−ＺＳカラムクロマトグラフ
ィーＫかけてチオール基が導入され九ＰＡＰを得九。

（ｉ　活性ジスルフィド基が導入され九アビジンと°チ
オ、−ル基が導入されたＰＡＰとの架橋及び蛋白複合体
の精製 実施例ｘｏｆＯ項の如くして得られた活性ジスルフィド
基が導入されたアビジンと、上記（→項の如くして得ら
れたチオ・・ル基が導入され九ＰＡＰよ）、実施例３の
ｆ１項と同様にして、アビジンとＰＡＰがジスルフィド
結合を含む共有結合によって架橋された蛋白複合体を得
九。

実施例翫 １１１表面にイム７１グロブリンをもつたリンパ球ＢＪ
ＩＩｊ！ｉＫ対する細胞傷害（そのｌ）ｆ４）　　抗体
（Ｉｇｅ）のビオチニル化ａ　Ｉ　Ｍ　ＩＩａＨＯＯａ
Ｋ透析し九つナギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ｌ呼／ｍ）
ｔｓｓＪと、舅−とド四中シナクシニ之ドビオチンの翼
１Ｍ−ジメルチホルア電ド溶液（１ｗｌｌ／ａＪ　）　
ａ　ｌ−を混合し、室温で４時間反応させ丸。反応後、
１０ＩＬＭ−リン酸塩緩衝化食塩水（ｐｌｉ７．りに透
析して過剰の翼−ヒドロ中シ！クシエ電ドビオチンを除
き、ビオチニル化つずギ抗マウスＩｇＧ抗体（ビオチニ
ル化抗体）を得た。

（ロ）　ビオチニル化抗体とアビジン・リシンム鎖複合
体を用いる、表面イムノダ■プリンを持つたＢ細胞に対
する細胞傷害 ジェトロフェニル（ＤＢＩＰ）−キーホール・リンペッ
トｅヘモシアニン（ＩＣＬＨ）　”ｅｇ作り九ＢＡＬＢ
１０マウスの牌＃ｌｌ胞（ＤＩＰに対する表面イムノグ
ロブリン貴生前駆遭纏胞）雪Ｘ　１０’＠に、ビオチニ
ル化ウナギ抗マウスＩｇＩ：に抗体（１啼／　１ｄ）　
６０ｐＬを加えて氷中婁Ｏ分反応させ（マウスのＢ、ｌ
ｉｔ＠にビオチニル化抗体が結合する）、冷ハンクス溶
液で２−洗りえ後、〆にアビジン・リシンム鎖複合体（
可変濃度）ｌ　Ｏｓｔを加えて氷中１ｓ分反応させ（ビ
オチニル化抗体にアビジン・リシンム鎖複舎体が結合す
る）、冷ハンクス溶液で３回流つ九。

ζうして前処置した牌細胞に、　ＤＩＰ−区ＩＩＨ（抗
原刺激の丸め）　（４０＊ｇ／１１４　）　２−メルカ
プトエ・タノール（ｓ　（ＩｓＭ　）及び１０１ｇウシ
胎児血清を含むＲＰＭ工１６４０培地６　ｏ　ｏｓＬを
加え、ｔ　ＯＯｐＬずつ３９に分けてそれぞれ６＊　Ｏ
Ｏｍ加湿雰囲気下３７′ｃでＳ日間培養した後、Ｊ＠ｒ
ｎ・のプラーク法〔ヤーン及びノルディン（Ｍ、に、Ｊ
＠ｒｎ＠ａｎａ　Ａ、ムＪｏｒａｉｎ　）ナイエンス（
８ａｉｅｎａｓ）　、第■」巻、　４０１１１ｎ！１年
参照〕ｋよって、抗ＤＩＰ抗体産生細胞（累）比較例も
含めて結果を第９図に示した。図よ）、抗原（ＭＰ−Ｋ
ＬＦｌ）の添加によシ、ＰＦＯが、著しく増化するが（
グループ２）、予め牌細胞をビオチニル化抗体で処理し
、ｌ！にアビジン・リシンム鎖複合体で処理すると。

ＰｙＯ数が有意に抑制されることが分った。即ち、抗Ｄ
ＩＰ抗体産生−駆細胞（１細胞）が、ビオチニル化抗マ
ウスＩｇＧ抗体とこれに結合しうるアビジン・９Ｖンム
鎖複合体め殺細胞効果によって除去された仁とを示して
い為。

また駿＃１ｍｌ効果を得るには、ビオチニル化抗体とア
ピジｙ−３ＪＶンム鎖複舎体の両者−共に必要であるこ
とを示してい為。

実施倒置 膜表ＩＩＫイムノダロプリンを４つたリン六球Ｂ＃ｌ胞
に対する細胞傷害（七の鵞） ＤＩＰ　−ｔＬＨ感作牌細胞を実施例Ｓと同様ｋ。

ビオチニル化抗マウスＸｇＧ抗体とアビジン・ＭＯＭ複
合体で前処置し先後、Ｐｌｏを調べえ。

第Ｌ＠ｇＫ示されるように１ビオチニル化抗体を丸線ア
ビジン・ＭＯＭ複合体単独では、いずれもＰｙＯを有意
に減少させなかつえが、両者を共に用いるとｐｙａが着
しく減少し、抗体が認識する抗ＤＩＩＰ抗体産生性Ｂ＃
ｌ胞群に＃ｌ胞傷書作用があつ九ことがわかる。

実施例１゜ Ｔ細胞代換因子（テＲν）受容体をもっ九Ｂｌｌ胞に対
する細胞傷害 （イ）抗ＢＡＩＩＢ　／　Ｑ・−ＢＪＩ胞抗体のビオチ
ニル化ν（ａカ宵の調製 ジニ）０フエニル（ＤＭＰ）−キーホール・リンペット
・ヘモシアニン（ｘＬｉｉ）で免疫Ｌｉ２ムＬＢ　／　
ｃｒ　　マウスの牌細胞を杭テｈｙ　Ｌ　＊抗体とつ！
ギ補体でＩ＆場しテ細胞を除き、ＤＩｉＰ−ＫＸｉＨ感
作ＢＪｌｌＩＩｌｉを得た。次にこのＢ！１ｍ胞を水酸
化アル（＝ラム４１１１Ｆと百日咳菌（１１ｏｒｄ＠ｔ
＠１ｌａｐｓｒｔｕｓｓｉｓ　）　Ｉ　Ｘ　１０”個と
共ｌ／Ｃ（ＤＢム／！ＩａＸ１１ＡＬＢ　／　（１）（
Ｄｏ）１Ｆｍ’ｍ性マウｘｉ（腹腔内投与し、更Ｋ１１
ｌ＠だけチー週間４１１Ｃ＠１ｍ免疫した後、その−道
関目から、毎週採血した。得られ九抗血情はプールして
、硫安分画並びＫＤ罵ム冨−セルロースカラムクロマト
グラフィーによ〉ＩｇＧ画分を得、ペプシン処理及びセ
ファデックスＧ−１５０カラムク四マトダラアイーによ
）ν（ａｔ／）−を調製し丸。ν（ａｂ’３ｍ　のビオ
チニル化社実施例Ｓのピ）項の如くして行った。

（ロ）　ビオチニル化抗体とアビジン・リシンム鎖複合
体を用いる、テＲＦ受容体をもった細胞に対する細胞傷
害 ＤＩＰ　−ＫＸａＨ感作牌細胞を、抗テｈｙ　Ｌ　２抗
体及びウナギ補体で処理してテ細胞を除き、次Ｋｌｌ論
例Ｓと同様に１ビオチニル化抗ｎ１ＬＢ／ｃＢ細胞抗体
のＩＦ（ａｔ／）１　　とアビジン・リシンム鎖複舎体
で前処置し良後、ｎａｐ−卵白アルブζン（Ｏｆム）（
４ｏｎｆ／ｗｊ）、ｘ−メルカプトエタノ−ｋ　（ｍ　
ＯｊＭ　）　、　ＴＲＦ　（ｍ　＠容量憾）及び１０−
ウシ胎児血清を含むＲＰＭＸＩ＠４・培地＠　＠　Ｏｓ
Ｌを添加して、蕃−Ｇｏｍ加湿雰囲気下３１℃５日間培
養しＰｒｏ反応を関ぺえ。

第１１１ＩＩＫ示す通）、肺細胞から、Ｔｓｅｍｉを除
いてしまうと、抗原（１）ＩＩＰ　−ＯＶム）刺歇だけ
ではＰＰｏ反応がおこら′＆＜＆るが（グループ！）、
培地中Ｋ　？ＲＩＦを添加するとＰＦＯ＠が着しく１復
した。しかし、肺細胞を予めビオチニル化抗ＢＡＬＢ／
ｃ　　Ｂ＃ｉＢ胞抗体とアビジン・リシンム鎖で処理す
ることＫよ］、ｒＲｙのｐｙｏ　ＩｇＢ復効果が、抑制
された。この結果はＤｏｔｓ雄性マウスをＢＡＬＢ　／
　ＯのＢ細胞で免疫するとＴＲＩＦ受容体に対する抗体
ができ、かかる抗体のビオチニル体とアビジン・リシン
ム鎖複合体によってＢＩｓ胞を処理すると、？ＲＦ受容
体を有するＢＪＩ胞詳が除去され九ことを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図のげ）はりシン、←）社そのム鎖とＢ鎖の構造を
示す模式図である。第３−はジフテリア毒素の模式図で
あシ、　＆）はインククトト中クン。 ←）はニックトドキシン、ｆ→社フラグメントムとフラ
グメントＢの構造を示す。第３図社、抗体（免疫グロブ
リン）の基本構造を示す模式図である。第４図は、活性
ジスルフィド基が導入され九アビジンとりシンム鎖の反
応生成物のセファデックスＧ１１０スーパーフアインカ
テムクーマトダツフイーでＯ流出パターンであ）、斜一
部は蛋白複合体としでプールして用いた部分を示す。嬉
１１１ａ％　ドデシル硫酸ナトリクムーポリアタリルア
擢ドゲル電気泳動（ｓｐａ−ｐｉｅｓ）のパターンであ
り、ディスク！はりシンム鎖を、ディスク鵞はアビジン
を、ディスタ３はアビジンとりシンム鎖の架橋・精製さ
れ九蛋白複合体を、ディスク４は蛋白複合体を３−メル
カプトエタノールで還元し九生成物を泳動させ九パター
ンを示す。第６図は、アピーンとリシンム鎖の蛋白複合
体の模式図である。第１図は、活性ジスルアイド基が導
入されえアビジンとチオール基が導入され九ＭＯＭ　Ｏ
反応生成物Ｏセアアデツクス９１８０スーパーファイン
カツムタロマトダラアイーでの流出パターンである。第
８図は、８Ｄ８−　ＰＡＧＩ　Ｏパターンであ）、ディ
スク１はＭＯＭを、ディスク雪はアビジンを、ディスク
３は第７１１Ｏ分ｊｕｔ、ディスク４は第１図の分−■
を、ディスク易、・はそれぞれ分画ｌ。 量を３−メルカプトエタノールで還元した生成物を泳−
させえパターンを示す。第１図は、ビオチニル化抗体と
アビジン・リシンム鎖複合体を用いる、膜表面イムノグ
ロブリンを持つ九Ｂ績胞に対する細胞傷害実験の結果を
示す。第ｉ。 図は、ビオチニル化抗体とアビジン・ＭＯＭ複合体を用
いる、膜表面イムノグロブ啼ンを持ったＢＩＩＡ＠に対
する細胞傷害実験の結果を示す。第１１ｇは、ビオチニ
ル化抗体とアビジン・リシ受容体をもつ九３細胞に対す
る細胞傷害実験のはそれぞれ、ビオチニル化抗体、蛋白
複合体。 抗原またはＴＲＰを系に加り九ことと細見なかり九こと
を示す。 ｍｅ出願人　帝人株式会社 第１図 Ｂ＠ 第２５１１ ７ラクソシト４　　　　　　　　　　７ラデｔノドＢ第
３図 ｃ 第４図 分画 第５図 体動方向 第６図 第７図 分画 第δ図 手続補正書 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭　５６　−　１７２１１１０　　号２、発明の名
称 蛋白複合体及びその製造法並びｋ それを用いた選択的殺細胞法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市東区南本町１丁目１１番地 （３００）帝人株式金社 代表者　徳　末　知　夫（ほか１名） ５′補正の対象 明細書の［発明の詳細な説、、ｌｄ、’）欄及び図面６
、補正の内容 （１）　　明細書の６頁の２行目ｋ「分類」とあるな、
「分離」と訂正する。 （２）同ｔｏ頁の１８行行目「例えば、Ｆａｂ」とある
を、［例えば、Ｆｅｂ　、　Ｆａｂ　Ｊと訂正する。 （３）　　同１４真の３行目に「チ・オ硫酸Ｊとあるな
、「チオ亜硫酸」と訂正する。 （４）　　同１４頁の下から４行ＩＫＦイミノチ」とあ
るな、「イミノチオ」と訂正する。 （６）　　同１７ｊ［の下から６行目にある２つのｒｔ
ｔ」のうち、右側のｒｎＪを削除する。 （６）　　同＝３真の８行目Ｋ「ビオチ化」とあるな、
「ビオチール化」と訂正する。 （７）　　同２９］［０１０行目行目サブユニット」と
、「サブ！ニット１分子」と訂正する。 （８）同３２真の３〜４行目ｋ「有する」とあるな、「
含む」と訂正する。 （９）　　同３３］［の１８〜１９行ＩＫｒ精製された
、Ａ甑に・・・・・・溶液」とあるな、「精製されたＭ
ＯＭを１１９Ｍ９／−の負度で含むＡ箪」と訂正する。 ・嗜　同３９頁の６行目Ｋ「ルチホルアミド」とあるな
、「チルホルムアミド」と訂正する。 ｔｌｌ）同４０頁の１９行＠ｌｌ’増化」とあるな、「
増加」と訂正する。 ｎ　同４１頁の２行目に「抑制される１とあるを、「減
少する」と訂正する。 拳３　同４１真の下からＳ行目Ｋ　ｒＰＦＣＪとあるを
、「抗体鑞生能」と訂正する。 ０４　　同ａｓｌｆ）下カラ２行目ト１行＠ＫｒＰＦＣ
−１゜とおるな、いずれもｒＰＦｅ数」と訂正する。 １１９　　同４２頁の１行目に［ＩＩ！生性］とあるを
、ｒ＊隼前駆］と訂正する。 −同４２７＠の下から１６行目ＫＦ代換」とあるな、「
代替」と釘止する。 （ｌ　　同４２頁の下から１４　行目Ｋ　ｒＢＡＬＢ／
ｅ　−Ｂ　劃１とあるを、ｒＢＡＬＢ／ｅ　ＢＪＩ胞」
と訂正する。 舖　−４２頁の下から７行目ｋ「フル虐ニウム」とある
を、「アルミニウムゲル」と訂正する。 鱈　同４２員の下から３行目ｋ「その−週間目」とある
を、［敞終免疫の一週間後］と訂正する。 −同４４員の８行目Ｋｒビオチニル体」とあるな、「ビ
オチニル化体」と訂正する。 ―り同４６真の１０行行目「住換」とあるな、「代替」
と訂正する。 −第９図を別紙嬉９図とさしかえる。 −第１０図と縞１１図を別紙第１０ＩｌＱと第１１図と
さしかえる。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌ　アビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白とを共有結合に
   よって架橋することｋよシ得られる蛋白複合体。 ｉ　蛋白生合成阻害活性蛋白がリシンのム鎖である特許
   請求の範囲第１現記ｇｏ蛋白複舎体。 １　蛋白生合成阻害活性蛋白がジフテリア毒素のフラグ
   メントムである特許請求のｌ１ｌｌｉｌ謔１項記載の蛋
   白複合体。 也　蛋白生合成阻害活性蛋白がツルレイシより得られる
   蛋白生合成阻害活性蛋白である特許−求ＯＩｓ囲第１項
   記載の蛋白複合体。 瓢　蛋白生合成阻害活性蛋白がアメリカヤマゴＩつより
   得られる蛋白生合成阻害ｉ性蛋白である５ｅｔｓ求の範
   Ｓ第１現記−〇蛋白複合体。 ａ　共有結合がジスルフィド結合を含む共有結合である
   特許請求の範囲第１項記載の蛋白複合体。 ７、　アビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白のいずれか一
   方の蛋白に導入した活性ジスフィト基に、他方の蛋白に
   発生または導入したチオール基管反応せしめることを特
   徴とする蛋白複合体の製造法。 龜　アビジンと蛋白生合成阻害性蛋白とを共有結合によ
   って架橋することによシ得られる蛋白複合体と、特定の
   細胞を１識するビオチニル化抗体とを用いて、抗体が特
   異的に認識する細胞を破壊することを特徴とする選択的
   殺細胞法。