JPS5874614A - 蛋白複合体及びその製造法 - Google Patents
蛋白複合体及びその製造法Info
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- JPS5874614A JPS5874614A JP56172910A JP17291081A JPS5874614A JP S5874614 A JPS5874614 A JP S5874614A JP 56172910 A JP56172910 A JP 56172910A JP 17291081 A JP17291081 A JP 17291081A JP S5874614 A JPS5874614 A JP S5874614A
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- avidin
- biosynthesis
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- inhibiting
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な蛋白複合体とその製造法並びにそれを用
い九特定細胞群の破壊方法に関する。
い九特定細胞群の破壊方法に関する。
l!に詳しくは、零発@杜、蛋白生合成阻害活性蛋白を
アビジンに結合せしめて得られる蛋白複合体とその製造
法並びkその複合体とビオチニル化抗体とを用いる、抗
体が1鐵する特定−胞fI#管破壊する方法に閤するも
のである。
アビジンに結合せしめて得られる蛋白複合体とその製造
法並びkその複合体とビオチニル化抗体とを用いる、抗
体が1鐵する特定−胞fI#管破壊する方法に閤するも
のである。
種々O#I胞群の混合体O中から成る特定0@胞詳を選
択的に破壊することは、種ha生化学的操作、例えば、
細胞レベルでの免疫応答機構の解明、薬物の作用機作o
s@、或い社臨床検査において必要とされる場合が多い
。このよう繊する抗体を補体とと−に用いて、補体依存
性#ll!iiI解反応を起ヒさせる方法が用いられて
来九。しかしながら仁の方法では、例えば、ヒト”1E
Gt k トrgG4 9yトIgG亀 マりX X
gG&モル壱ットIgG1などの如<、IIs%/%る
抗体のクラス、tブタラスによっては補体結合性がなく
、JII胞溶解反応を起ヒし得ないし、又、補体結合性
抗体であって亀、用いる補体の動物種によっては補体依
存性omsts解反応をゝ2し′〈“場合がある。II
!に、補体練として用−る血清中には、補体以外の各種
の血清成分、例えば、アルプンン、免疫グロブリン、オ
ノホカイン等が含まれているので、これらの成分が目的
とする細胞の選択的溶解反応を阻ける場合がある。
択的に破壊することは、種ha生化学的操作、例えば、
細胞レベルでの免疫応答機構の解明、薬物の作用機作o
s@、或い社臨床検査において必要とされる場合が多い
。このよう繊する抗体を補体とと−に用いて、補体依存
性#ll!iiI解反応を起ヒさせる方法が用いられて
来九。しかしながら仁の方法では、例えば、ヒト”1E
Gt k トrgG4 9yトIgG亀 マりX X
gG&モル壱ットIgG1などの如<、IIs%/%る
抗体のクラス、tブタラスによっては補体結合性がなく
、JII胞溶解反応を起ヒし得ないし、又、補体結合性
抗体であって亀、用いる補体の動物種によっては補体依
存性omsts解反応をゝ2し′〈“場合がある。II
!に、補体練として用−る血清中には、補体以外の各種
の血清成分、例えば、アルプンン、免疫グロブリン、オ
ノホカイン等が含まれているので、これらの成分が目的
とする細胞の選択的溶解反応を阻ける場合がある。
本発明者ら・は、これらの欠点を有し′&い、殺すべ龜
特定+CS胞詳を選択的に効率よく破壊すゐ強力な殺細
胞法、tLびkその方法kW4%fh得る試剤を開発す
べく鋭意研究の結果、不発I!1lIK11達した。
特定+CS胞詳を選択的に効率よく破壊すゐ強力な殺細
胞法、tLびkその方法kW4%fh得る試剤を開発す
べく鋭意研究の結果、不発I!1lIK11達した。
即ち、本発明は、アビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白と
を共有結合、例えばジスルフィド結合によって架橋する
辷とkより得られる蛋白複合体であシ、かかる蒼白複合
体と特定の細胞を1鐵するビオチニル化抗体とを用いで
、アビジンのビオチンに対する鳥い親和性を利用して、
抗体が41異的に1織する細胞を破壊する仁とを特徴と
する選択的殺細胞法である。
を共有結合、例えばジスルフィド結合によって架橋する
辷とkより得られる蛋白複合体であシ、かかる蒼白複合
体と特定の細胞を1鐵するビオチニル化抗体とを用いで
、アビジンのビオチンに対する鳥い親和性を利用して、
抗体が41異的に1織する細胞を破壊する仁とを特徴と
する選択的殺細胞法である。
本111jlにおいて、アビジンとは卵白中に存在する
分子量約・亀oeoの塩基性糖蛋白質であ)、ビタ々ン
Hとして知られるビオチンと極めて痛い親和性(覇和性
定# 1 @” M”’ )を有することが知られてい
る。アピジνは%4個のすプエニットから成ることが知
られているが、不発−のアビジンとはこれらOfプエエ
ットも含む。
分子量約・亀oeoの塩基性糖蛋白質であ)、ビタ々ン
Hとして知られるビオチンと極めて痛い親和性(覇和性
定# 1 @” M”’ )を有することが知られてい
る。アピジνは%4個のすプエニットから成ることが知
られているが、不発−のアビジンとはこれらOfプエエ
ットも含む。
不発@において用いられる蛋白生合成阻害活性蛋白とし
ては、蛋白生合成阻害活性を有する蛋白質であればいか
なるものでもよいが、41に望ましいのは、リシンのム
鎖、ジフテリア毒素のフラグメントム、ツルレイシよ抄
抽出される蛋白生合成阻害活性蛋白、アメリカヤマゴボ
ウより抽出される蛋白生合成阻害活性蛋白である。
ては、蛋白生合成阻害活性を有する蛋白質であればいか
なるものでもよいが、41に望ましいのは、リシンのム
鎖、ジフテリア毒素のフラグメントム、ツルレイシよ抄
抽出される蛋白生合成阻害活性蛋白、アメリカヤマゴボ
ウより抽出される蛋白生合成阻害活性蛋白である。
リシンとは、植物ヒマ(Rlcinug aolIWu
Jllg )の種子より全知の方法、例えばオルスンズ
とビール[11,01snss anaム、Pikl、
Aイオケixトリー(Bioch@m1stry)1
2巻、目! 1〜31 !・貞。
Jllg )の種子より全知の方法、例えばオルスンズ
とビール[11,01snss anaム、Pikl、
Aイオケixトリー(Bioch@m1stry)1
2巻、目! 1〜31 !・貞。
197s都〕の方法によって抽出精製することができる
蛋白毒素をいう。リシンは分子量纂zoooのずプエニ
ットムと分子量14oooのサブエエット造から成って
おり、一本0ジスルフィド結合によって一緒ばれている
〔第1図tuft) )。
蛋白毒素をいう。リシンは分子量纂zoooのずプエニ
ットムと分子量14oooのサブエエット造から成って
おり、一本0ジスルフィド結合によって一緒ばれている
〔第1図tuft) )。
リシンを還元剤で処理すると第tgo←)に示し九如く
各々少なくとt1傭のメルカプト基(−一)を有するナ
プ二ニットム(ム鎖)とナプ瓢ニッ)B(B鎖)とに分
類する。切断前のりシン線動物に対する非常な毒性を有
しているが、ム鎖は七のttでは弱い毒性を有するのみ
であ)、またB111d若干の毒性を有するのみである
。リシンは蛋白の生合成を、ペプチド鎖の伸長に不可欠
な成分を不活化することkよって阻害し、細胞毒性を発
揮すると考えられている。ム鎖は無Jllll系での蛋
白生合成阻害活性を有しているOK対し、B鎖はそのよ
うな活性を有しないが、ム鎖には見られない細胞のリセ
プターとの結合能を有している。本発明において社ム鎖
が用いられる。
各々少なくとt1傭のメルカプト基(−一)を有するナ
プ二ニットム(ム鎖)とナプ瓢ニッ)B(B鎖)とに分
類する。切断前のりシン線動物に対する非常な毒性を有
しているが、ム鎖は七のttでは弱い毒性を有するのみ
であ)、またB111d若干の毒性を有するのみである
。リシンは蛋白の生合成を、ペプチド鎖の伸長に不可欠
な成分を不活化することkよって阻害し、細胞毒性を発
揮すると考えられている。ム鎖は無Jllll系での蛋
白生合成阻害活性を有しているOK対し、B鎖はそのよ
うな活性を有しないが、ム鎖には見られない細胞のリセ
プターとの結合能を有している。本発明において社ム鎖
が用いられる。
不発−においてジフテリア毒素とはジフテリア薗又はそ
の変異株が貴生する蛋白毒素をいう。
の変異株が貴生する蛋白毒素をいう。
例えば、ジフテリア薗が産生するジフテリア毒素は1分
子量約・tooo〜6亀000の単一のポリペプチド鎖
からな〉、これはインタクトトキシンと呼ばれている。
子量約・tooo〜6亀000の単一のポリペプチド鎖
からな〉、これはインタクトトキシンと呼ばれている。
インタクトトキシンは第3図のH)K模式的に示しえ如
く、その分子内にジスルフィド結合(−g−a−結合)
を3個有している。このインタクトトキシンを、例えば
、トリプシンOような蛋白分解酵素で温和な一条件で処
理すると、ア建ノ基末端に近い@Oジスルフィド結合O
間0411定の一部位に分割がおこシ、第意図の(ロ)
に示すごときエツタドト中シンとなる。
く、その分子内にジスルフィド結合(−g−a−結合)
を3個有している。このインタクトトキシンを、例えば
、トリプシンOような蛋白分解酵素で温和な一条件で処
理すると、ア建ノ基末端に近い@Oジスルフィド結合O
間0411定の一部位に分割がおこシ、第意図の(ロ)
に示すごときエツタドト中シンとなる。
このニツクドトキグンを゛還元剤で処理すると、筒雪I
I Of4IK示し九如く分子量約3411@(10フ
ラダメ/トムと約a@ooo〜1%OOOのフラグメン
トilK分離する。
I Of4IK示し九如く分子量約3411@(10フ
ラダメ/トムと約a@ooo〜1%OOOのフラグメン
トilK分離する。
ジフテリア毒素に於いてこのフラグメント8に相当する
部分(B部分)は毒素が細胞と結合する丸めの部分であ
〕、フラグメントムに相当する部分(ム部分)社B部′
分の細胞との結合を介して細胞内に人〉蛋白合成を阻害
し細胞を死Kjlらしめる部分である。かかるジフテリ
ア毒素のフラグメントムは不発@に゛おける蛋白合成阻
害活性蛋白としそ用いることがで龜る。ジフテリア変異
株、例えば0ツ0Jl(1) +a智(/41)が書生
する、例えばORM!10 + 01M4111のとと
き無毒変異蛋白(分子中にジスルフィド結合を!個有し
ている)や、これらを例えばチオール試薬等の還元剤の
存在下でトリプシンで温和に処理して得られる7ラダメ
ントも、不発@におけるフラグ不発@KThいて、ツk
Vイシ(Momoraioaaharantia )よ
シ得られる蛋白生合成阻害活性を有す為蛋白(MOM)
と社、植物ツルレイシの種子より公知の方法、例えばパ
ルビエリら(シ。
部分(B部分)は毒素が細胞と結合する丸めの部分であ
〕、フラグメントムに相当する部分(ム部分)社B部′
分の細胞との結合を介して細胞内に人〉蛋白合成を阻害
し細胞を死Kjlらしめる部分である。かかるジフテリ
ア毒素のフラグメントムは不発@に゛おける蛋白合成阻
害活性蛋白としそ用いることがで龜る。ジフテリア変異
株、例えば0ツ0Jl(1) +a智(/41)が書生
する、例えばORM!10 + 01M4111のとと
き無毒変異蛋白(分子中にジスルフィド結合を!個有し
ている)や、これらを例えばチオール試薬等の還元剤の
存在下でトリプシンで温和に処理して得られる7ラダメ
ントも、不発@におけるフラグ不発@KThいて、ツk
Vイシ(Momoraioaaharantia )よ
シ得られる蛋白生合成阻害活性を有す為蛋白(MOM)
と社、植物ツルレイシの種子より公知の方法、例えばパ
ルビエリら(シ。
11arbi・rl・tal、、パイオケ電カル ジャ
ーナ& (B1oah6m、J、)、 all t s
s巻、448〜48雪真、toss年参照)の方法に
よって抽出精製することができる分子量約zaoooの
蛋白であシ、つずギ網状赤血球のライゼート(1ysa
t・)による蛋白合成に対して強力な阻害活性をもつで
いるが、m111表面に結合性を示すリシンのB鎖相尚
部分を元々持たないのでMOM単独で社低い細胞毒性し
か示さない。
ーナ& (B1oah6m、J、)、 all t s
s巻、448〜48雪真、toss年参照)の方法に
よって抽出精製することができる分子量約zaoooの
蛋白であシ、つずギ網状赤血球のライゼート(1ysa
t・)による蛋白合成に対して強力な阻害活性をもつで
いるが、m111表面に結合性を示すリシンのB鎖相尚
部分を元々持たないのでMOM単独で社低い細胞毒性し
か示さない。
本41@において、アメリカヤマゴlつ(Phy−to
xagoa amsrloana )より得られる蛋白
生合成阻害活性を有する蛋白(PAP)とは、植物アメ
リカヤマゴボウの葉よ〕公知の方法、例えばアーピン(
J、D、Irrln、アーカイプス オプ バイオケζ
ストリー アンド バイオフイジクス ゛(ムrahi
ves at BLoab・wiltry ana I
Hohysics)。
xagoa amsrloana )より得られる蛋白
生合成阻害活性を有する蛋白(PAP)とは、植物アメ
リカヤマゴボウの葉よ〕公知の方法、例えばアーピン(
J、D、Irrln、アーカイプス オプ バイオケζ
ストリー アンド バイオフイジクス ゛(ムrahi
ves at BLoab・wiltry ana I
Hohysics)。
第1−・寺、S31438頁、l・1!!年参照)の方
法によって抽出精製することができる、分子量約3y、
oooの単一のポリペプチド鎖からなる蛋白であり、M
OMと同様につ!ギ網状赤血球のライ!−) (lya
at・)Kよる蛋白合成に対して強力ellll性をも
りているが、細胞表面に結合性を示すリシンB#111
相轟部分を元々持たないのでPAP単独では低い細胞毒
性しか示さない。
法によって抽出精製することができる、分子量約3y、
oooの単一のポリペプチド鎖からなる蛋白であり、M
OMと同様につ!ギ網状赤血球のライ!−) (lya
at・)Kよる蛋白合成に対して強力ellll性をも
りているが、細胞表面に結合性を示すリシンB#111
相轟部分を元々持たないのでPAP単独では低い細胞毒
性しか示さない。
PAPは瀧からだけでなく、アメリカヤマゴlつの種子
、根等からも抽出精製できる。
、根等からも抽出精製できる。
不発@に於いて用いられるビオチニル化抗体社、抗体を
公知の方法によ)ビオチンの活性エステル体と反応せし
めるととによ〉得ることができる。ビオチニル化に用い
る抗体、は、破壊すべ*S+胞を九はその膜抗原をナル
、ウマ、ウシ。
公知の方法によ)ビオチンの活性エステル体と反応せし
めるととによ〉得ることができる。ビオチニル化に用い
る抗体、は、破壊すべ*S+胞を九はその膜抗原をナル
、ウマ、ウシ。
ヤギ、ヒツジ、つ中ギ等の動物に過免疫し九血清から、
コーンのエタノール分−法、硫安分画法、イオン交換タ
ロマトダラフイー法等O会知の手RKよって調製さ、れ
、さらに必要によりては各種細胞を用いて吸収、吸着操
作をはとむして得ることができる。を九破゛嬢すべき細
sitたはその膜抗原で免疫した動物から得たリンパ球
を、例えば骨髄腫と細胞融合させ、目的とする抗体産生
性のクローンを選別して融合細胞(ハイプリドーマ)を
作製し、これの培養液から、またはこれを動−に接種し
てその血清または腹腔液からも抗体を得ることができる
。抗体(免疫グロブリン)Kは、IgG、工gム* ”
gMs XgD。
コーンのエタノール分−法、硫安分画法、イオン交換タ
ロマトダラフイー法等O会知の手RKよって調製さ、れ
、さらに必要によりては各種細胞を用いて吸収、吸着操
作をはとむして得ることができる。を九破゛嬢すべき細
sitたはその膜抗原で免疫した動物から得たリンパ球
を、例えば骨髄腫と細胞融合させ、目的とする抗体産生
性のクローンを選別して融合細胞(ハイプリドーマ)を
作製し、これの培養液から、またはこれを動−に接種し
てその血清または腹腔液からも抗体を得ることができる
。抗体(免疫グロブリン)Kは、IgG、工gム* ”
gMs XgD。
工g鳳のS種類があることが知られているが、そのどれ
でも零発@に用いることができる。
でも零発@に用いることができる。
不発IIIK於いて抗体はそのt〜でも、或いは杭原と
結合し得る部分(図3のIPab)を含む限りKs?い
ては、そのフラグメント(例えば、tab部分とからな
るνmb’、 Tab’の2量体?(ab’)■)でも
ビオチニル化して用いることができる。本発明でいうビ
オチニル化抗体には、かかる抗体の7ツグメントをビオ
チニル化したものも含まれる。
結合し得る部分(図3のIPab)を含む限りKs?い
ては、そのフラグメント(例えば、tab部分とからな
るνmb’、 Tab’の2量体?(ab’)■)でも
ビオチニル化して用いることができる。本発明でいうビ
オチニル化抗体には、かかる抗体の7ツグメントをビオ
チニル化したものも含まれる。
不発@Oアビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白より成る蛋
白複合体は、両蛋白を共有結合によ)架橋するととによ
って製造される。共有結合によって架橋する方法として
は1例えば、シフQへdPVルカルボジ4iVや1−Z
fk−1−(嘉−ジメチルアミノプロピル)カルボシイ
建ド塩酸塩等のカルボジイミド試薬(縮合剤)を用いて
、両蛋白を直接結合させてもよいし、あるいは、分子中
に複数個の官能基を有する榮−剤、例えば、グルタルア
ルデヒド、トルエンジイノシアネート、&l−ジカルポ
中シー44′−アゾフエニレンジイソシアネート、ジエ
チルマロンイ々デートニ塩酸塩、M−ナタシンイ電ジル
m−(輩−マレイミド)ヘンゾエートヲ用いて、両蛋白
を結合させてもよい。共有結合としては、ジスルフィド
結合を含有する結合が41KmtL<、ジスルフィド結
合を形成する2個の硫黄原子は両蛋白に元に存在してい
た硫黄原子であっても、また外部から架橋剤によって導
入されえ硫黄原子であってもよい。本発明のアビジンと
蛋白生合成阻害活性蛋白がジスルフィド結合によ〉架橋
された蛋白複合体を製造するには、例えば、蛋白複合体
を構成するアビジンま丸線そのナプエニットと蛋白生合
成阻害活性蛋白のどちらか(任意の一方の蛋白をPIで
他方の蛋白をP!で表わす)に活性ジスルフィドを導入
しておき、他方にチオール基を導入あるいは生成させて
おき、両者をジスルフィド結合で架橋する方法をとるこ
とができる。すなわち、PIK例えば下記式(I)、 !−8−8−1−0−Z ・−−−−”@(1)
關 で表わされる架橋剤、あるいは下記式(至)、!−11
−8−R−0−Q ・・・・・命・・(1)観 MH・E! で表わされる架橋剤を反応せしめ〔反応(1) # (
り]るか、 lid (、。
白複合体は、両蛋白を共有結合によ)架橋するととによ
って製造される。共有結合によって架橋する方法として
は1例えば、シフQへdPVルカルボジ4iVや1−Z
fk−1−(嘉−ジメチルアミノプロピル)カルボシイ
建ド塩酸塩等のカルボジイミド試薬(縮合剤)を用いて
、両蛋白を直接結合させてもよいし、あるいは、分子中
に複数個の官能基を有する榮−剤、例えば、グルタルア
ルデヒド、トルエンジイノシアネート、&l−ジカルポ
中シー44′−アゾフエニレンジイソシアネート、ジエ
チルマロンイ々デートニ塩酸塩、M−ナタシンイ電ジル
m−(輩−マレイミド)ヘンゾエートヲ用いて、両蛋白
を結合させてもよい。共有結合としては、ジスルフィド
結合を含有する結合が41KmtL<、ジスルフィド結
合を形成する2個の硫黄原子は両蛋白に元に存在してい
た硫黄原子であっても、また外部から架橋剤によって導
入されえ硫黄原子であってもよい。本発明のアビジンと
蛋白生合成阻害活性蛋白がジスルフィド結合によ〉架橋
された蛋白複合体を製造するには、例えば、蛋白複合体
を構成するアビジンま丸線そのナプエニットと蛋白生合
成阻害活性蛋白のどちらか(任意の一方の蛋白をPIで
他方の蛋白をP!で表わす)に活性ジスルフィドを導入
しておき、他方にチオール基を導入あるいは生成させて
おき、両者をジスルフィド結合で架橋する方法をとるこ
とができる。すなわち、PIK例えば下記式(I)、 !−8−8−1−0−Z ・−−−−”@(1)
關 で表わされる架橋剤、あるいは下記式(至)、!−11
−8−R−0−Q ・・・・・命・・(1)観 MH・E! で表わされる架橋剤を反応せしめ〔反応(1) # (
り]るか、 lid (、。
式(至)、
X−R−CJ−Z −會・
・・・・嶋(至)鵬 で表わされる架橋剤を反応させ九後、生成物(W)をチ
オ傭酸イオンで処理〔反応(S)〕するか、(W) (釦 あるいは、PIt式(@あるいは((2)で表わされる
架橋剤(それぞれ、2−イ電ノチラクトン1M−アセチ
ルホモシスティン)と反□ 応せしめて生成し丸穴(1
[) tたは(夏)で表わされる蛋白、またはPlを式
(K) 0 で表わされる架橋剤(8−アセチルメルカプトコハタ酸
無水物)と反応せしめて生成した蛋白を脱ア七チル化し
て得られる式(夏)で表わされる蛋白を、チオール基を
活性ジスルフィド基に変換する試薬〔例えば、亀2′−
ジピリジルジスで躯環して〔反応(4) 、 (!0ま
たは(・)〕、活性ジス〔!O定義は式(1>の場合に
同じである。 〕〔!O定義は式(Qの場合に同じ
である。 〕(!0定義は式(!)の場合に同じであ
る。
・・・・嶋(至)鵬 で表わされる架橋剤を反応させ九後、生成物(W)をチ
オ傭酸イオンで処理〔反応(S)〕するか、(W) (釦 あるいは、PIt式(@あるいは((2)で表わされる
架橋剤(それぞれ、2−イ電ノチラクトン1M−アセチ
ルホモシスティン)と反□ 応せしめて生成し丸穴(1
[) tたは(夏)で表わされる蛋白、またはPlを式
(K) 0 で表わされる架橋剤(8−アセチルメルカプトコハタ酸
無水物)と反応せしめて生成した蛋白を脱ア七チル化し
て得られる式(夏)で表わされる蛋白を、チオール基を
活性ジスルフィド基に変換する試薬〔例えば、亀2′−
ジピリジルジスで躯環して〔反応(4) 、 (!0ま
たは(・)〕、活性ジス〔!O定義は式(1>の場合に
同じである。 〕〔!O定義は式(Qの場合に同じ
である。 〕(!0定義は式(!)の場合に同じであ
る。
が導入されたP!〔式(厘)s (t)、 (厘−”)
e (1−1)。
e (1−1)。
(厘−鵞)tえは(厘−3)で表わされる蛋白〕を得る
。
。
他方、もう一方の蛋白P冨より上記式(t) e (り
tたは(x) o如くして作った、下記式(1厘)
、 (xv)1九は(扁−1)で表わされるジスルフィ
ド基が導入された蛋白のジスルフィド基を、例えば3−
メルカプトエタノールtえはジチオスレイトール等のチ
オール試薬でR覚する〔反応(?) 、 (1) tえ
はく・)〕か、★九は ” (xv) %) (冨−1) 反応式(4)または(i)の第一一−の反応また社反応
式(6)O第−及び二段階の反応と同様にしてチオール
基が導入されえPs〔式(廟、(冨)、 (IOF−1
)。
tたは(x) o如くして作った、下記式(1厘)
、 (xv)1九は(扁−1)で表わされるジスルフィ
ド基が導入された蛋白のジスルフィド基を、例えば3−
メルカプトエタノールtえはジチオスレイトール等のチ
オール試薬でR覚する〔反応(?) 、 (1) tえ
はく・)〕か、★九は ” (xv) %) (冨−1) 反応式(4)または(i)の第一一−の反応また社反応
式(6)O第−及び二段階の反応と同様にしてチオール
基が導入されえPs〔式(廟、(冨)、 (IOF−1
)。
(m−t )★たは(m−s)で表わされる蛋白)を得
る。
る。
ON100OHs
o oa諺00嘗II
〔式(1)、 (W)tたは(璽−!)中のRと式(W
) を九は(罵)中のR線間−でもt九は互に異なりて
いてもよい〕。例えば、上記の如くして製造したチオー
ル基が導入され九P3を、岡じ(上記の如くして製造し
九活性ジスルフィド基が導入され九PIと反応させしめ
て、本発明のアビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白が活性
ジスルフィド基で架橋され九蛋自複合体を製造すること
ができる。1お、ジスルフィド結合によって架橋され九
不発−の蛋白複合体を得るため、一方の蛋白がシスチン
!I基の一部としてのジスルフィド結合をもっていると
きに杜、場合によりでスルホ化分解を行うことkよって
、或−は蛋白がチオール基を持りている場合には、上に
記し表如きチオール基を活性ジスルフィド基に変換する
試薬で魁迩するととによって、直接に活性ジスルフィド
基をもつ九蛋白に導くことができ、かかる蛋白もt九チ
オ−に基を発生または導入され九他方の蛋白と反応せし
めて本発明の蛋白複合体を製造することができる。また
、一方の蛋白が−yt、hチオール基をもっている場合
には、そのth、を九Vスチン残基〇一部としてのジス
ルフィド結合をもっているときKは、場合によってジス
ルフィド結合よ)還元等の操作によ抄チオール基を発生
させ丸後、直IIK、活性ジスルフィド結合をもつ九他
方O蛋白と反応せしめて本慟IIO蛋白複合体を製−す
ることができる。
) を九は(罵)中のR線間−でもt九は互に異なりて
いてもよい〕。例えば、上記の如くして製造したチオー
ル基が導入され九P3を、岡じ(上記の如くして製造し
九活性ジスルフィド基が導入され九PIと反応させしめ
て、本発明のアビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白が活性
ジスルフィド基で架橋され九蛋自複合体を製造すること
ができる。1お、ジスルフィド結合によって架橋され九
不発−の蛋白複合体を得るため、一方の蛋白がシスチン
!I基の一部としてのジスルフィド結合をもっていると
きに杜、場合によりでスルホ化分解を行うことkよって
、或−は蛋白がチオール基を持りている場合には、上に
記し表如きチオール基を活性ジスルフィド基に変換する
試薬で魁迩するととによって、直接に活性ジスルフィド
基をもつ九蛋白に導くことができ、かかる蛋白もt九チ
オ−に基を発生または導入され九他方の蛋白と反応せし
めて本発明の蛋白複合体を製造することができる。また
、一方の蛋白が−yt、hチオール基をもっている場合
には、そのth、を九Vスチン残基〇一部としてのジス
ルフィド結合をもっているときKは、場合によってジス
ルフィド結合よ)還元等の操作によ抄チオール基を発生
させ丸後、直IIK、活性ジスルフィド結合をもつ九他
方O蛋白と反応せしめて本慟IIO蛋白複合体を製−す
ることができる。
!で表わされる、結合している硫黄原子と共に活性ジス
ルフィド基を形成し得る1価の有機□ 4−ピリジル基(−Q)、−一カルー中シー4−できる
。Rで表わされる2価の有機基は、化学的に不活性であ
ればIIK@定されないが、一般的には分岐を有するか
有しないアル中しン基。
ルフィド基を形成し得る1価の有機□ 4−ピリジル基(−Q)、−一カルー中シー4−できる
。Rで表わされる2価の有機基は、化学的に不活性であ
ればIIK@定されないが、一般的には分岐を有するか
有しないアル中しン基。
フェニレン1轡から遭宣選ばれる。2″e*わされる活
性エステルのアル冨 とができる。Qで表わされbイミドエステルのア#プー
ル残基O具体例としてはメトキシ、エト午シ基等を挙げ
ることができる。!で表わされるハロゲン原子の異体例
としては塩素、A素等を挙けることができる。
性エステルのアル冨 とができる。Qで表わされbイミドエステルのア#プー
ル残基O具体例としてはメトキシ、エト午シ基等を挙げ
ることができる。!で表わされるハロゲン原子の異体例
としては塩素、A素等を挙けることができる。
架橋剤の具体例としては、式(1)で表わされる架橋剤
として1.I−ナクVンイ電ジル1−(鵞−ピリジルジ
チオ)プロピオネート。亀4−ジニト四フェニルa−(
a−ピリジルジチオ)フロビオネートを、式1)で表わ
される架橋剤として、メチル8−(2−ピリジルジテオ
)グロピオンイミデート塩鹸塩t1式(V)で表わされ
る架橋剤として、M−!クシンイミジル3−ブロモプロ
ピオネートを挙ける仁とができる。
として1.I−ナクVンイ電ジル1−(鵞−ピリジルジ
チオ)プロピオネート。亀4−ジニト四フェニルa−(
a−ピリジルジチオ)フロビオネートを、式1)で表わ
される架橋剤として、メチル8−(2−ピリジルジテオ
)グロピオンイミデート塩鹸塩t1式(V)で表わされ
る架橋剤として、M−!クシンイミジル3−ブロモプロ
ピオネートを挙ける仁とができる。
上記のアビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白の架橋反応に
おいて、アビジン或いは蛋白生合成阻害活性蛋白に架橋
剤會反応させる場合は、反応せしめる蛋白1モルに対し
、架橋剤を1〜露04#用いるのが好ましい。反応はア
ビジン或いは蛋白生合成阻害活性蛋白の、pH!i−1
の緩衝液中蛋白濃度がam!−11)6吋/−(よシ好
ましくは1〜! OWIII/sJ )になるように調
製されたl液に、O〜易・℃て攪拌しながら架−剤の水
製*1九は架橋剤が水K11lけない場合には、架橋剤
を少量の有機溶Is1例えd、waw−ジメテルホルム
アζド、ジメチルスル本中シト。
おいて、アビジン或いは蛋白生合成阻害活性蛋白に架橋
剤會反応させる場合は、反応せしめる蛋白1モルに対し
、架橋剤を1〜露04#用いるのが好ましい。反応はア
ビジン或いは蛋白生合成阻害活性蛋白の、pH!i−1
の緩衝液中蛋白濃度がam!−11)6吋/−(よシ好
ましくは1〜! OWIII/sJ )になるように調
製されたl液に、O〜易・℃て攪拌しながら架−剤の水
製*1九は架橋剤が水K11lけない場合には、架橋剤
を少量の有機溶Is1例えd、waw−ジメテルホルム
アζド、ジメチルスル本中シト。
L雪−ジメト命シエタン、メタノール、エタノール、ア
セトン等に溶かし九mmを添加して行なわれる。反応時
間は反応スケール、反応条件によるが、−鍍に3日間以
内である。反応終了後、透析または分子ふるいのカラム
クロマトグラフィーにより、未反応の架橋剤及び低分子
生成物を除いた後、得られた架橋剤が導入され九蛋白溶
液に複合体のもう一方の構成に分である蛋白(または架
橋剤によ)架橋用官能基が導入されえ蛋白)のpH5−
90緩衝液の滴液く好ましい蛋白鎖直の範@社上に記載
し九のと同じである)を添加して、0−SO℃で反応せ
しめる。
セトン等に溶かし九mmを添加して行なわれる。反応時
間は反応スケール、反応条件によるが、−鍍に3日間以
内である。反応終了後、透析または分子ふるいのカラム
クロマトグラフィーにより、未反応の架橋剤及び低分子
生成物を除いた後、得られた架橋剤が導入され九蛋白溶
液に複合体のもう一方の構成に分である蛋白(または架
橋剤によ)架橋用官能基が導入されえ蛋白)のpH5−
90緩衝液の滴液く好ましい蛋白鎖直の範@社上に記載
し九のと同じである)を添加して、0−SO℃で反応せ
しめる。
複合体の反応混合物からの分離、精製は通常用いられる
操作1例えば分子ふるいのカラムクロマトグラフィーに
よって行なうことができる。
操作1例えば分子ふるいのカラムクロマトグラフィーに
よって行なうことができる。
なお、複合体の一方の成分の蛋白の滴液に1架橋剤が導
入され九他方の成分の蛋白の溶液を添加して複合体を製
造することもできる。さもK。
入され九他方の成分の蛋白の溶液を添加して複合体を製
造することもできる。さもK。
架橋剤が導入された蛋白を、低分子の試薬で処理して特
定の架橋用官能基を有する蛋白に変換する場合(例えば
架橋剤によって導入された活性ジスルフィド基をチオー
ル基に変換する場合)、或いは、アイジン或いは蛋白生
合成阻害活性蛋白を低分子試薬を用い直接活性化−導体
に変換チオール基を活性ジスルフィドに変換する場合)
の反応条件も上記の蛋白に架橋剤を反応せしめる場合O
反応条件と同様である。
定の架橋用官能基を有する蛋白に変換する場合(例えば
架橋剤によって導入された活性ジスルフィド基をチオー
ル基に変換する場合)、或いは、アイジン或いは蛋白生
合成阻害活性蛋白を低分子試薬を用い直接活性化−導体
に変換チオール基を活性ジスルフィドに変換する場合)
の反応条件も上記の蛋白に架橋剤を反応せしめる場合O
反応条件と同様である。
本発明で得られるアビジンと蛋白生金−阻害活性蛋白と
t共有結合によって架橋することkよって得られる蛋白
複合体は、特定Os胞詳を認識するビオチニル化と、ア
ビジンのピオチンに対すゐ強い親和性を利用して、結合
せしめることにより、抗体が認識すゐ特定細胞群を選択
的に砿壊すゐ九めに使用することができる。
t共有結合によって架橋することkよって得られる蛋白
複合体は、特定Os胞詳を認識するビオチニル化と、ア
ビジンのピオチンに対すゐ強い親和性を利用して、結合
せしめることにより、抗体が認識すゐ特定細胞群を選択
的に砿壊すゐ九めに使用することができる。
即ち1本発明者らは、蛋白生合成阻害活性蛋白を一アビ
ジンとビオチンの強い親和力に基づく非共有的結合を介
して、抗体と結合させることKよって、蛋白生合成阻害
活性蛋白が抗体が1識する特定細胞群に対し細胞毒性を
発揮するに到るということを見い出し友。かかる特定細
胞群破壊システムの優れた点の一つは、既に述ぺ大過〉
、補体依存性細胞溶解反応が、抗体のクラス、?ブタラ
スによっては補体との結合性が&いために1或いは補体
結合性がある場合でも用いる動物種によっては補体依存
性細胞溶解反応・が起こ抄−いために、適用できない場
合でも本発明のシステムは適用できることである。
ジンとビオチンの強い親和力に基づく非共有的結合を介
して、抗体と結合させることKよって、蛋白生合成阻害
活性蛋白が抗体が1識する特定細胞群に対し細胞毒性を
発揮するに到るということを見い出し友。かかる特定細
胞群破壊システムの優れた点の一つは、既に述ぺ大過〉
、補体依存性細胞溶解反応が、抗体のクラス、?ブタラ
スによっては補体との結合性が&いために1或いは補体
結合性がある場合でも用いる動物種によっては補体依存
性細胞溶解反応・が起こ抄−いために、適用できない場
合でも本発明のシステムは適用できることである。
を九、選択□的補体依存性細胞溶解反応が、補体源とし
て用いる血□清中の補体以外の成分で阻けられる場合が
あるのに対し、本尭明方快ではそのようなことがない。
て用いる血□清中の補体以外の成分で阻けられる場合が
あるのに対し、本尭明方快ではそのようなことがない。
さもに本発明方法の特徴は、蛋白生合成阻害活性蛋白と
してアビジンとの蛋白複合体を作る九めに好適に用いら
れるリシンのム鎖、ジフデリア毒素の7ラグメントム。
してアビジンとの蛋白複合体を作る九めに好適に用いら
れるリシンのム鎖、ジフデリア毒素の7ラグメントム。
ツルレイシよ如得られる蛋白生合成阻害活性蛋白及びア
メリカヤマゴlつよ砂得られる蛋白生合成阻害活性蛋白
が、いずれ奄それ自体では、細胞表−と結合する部位を
欠いているが九めk。
メリカヤマゴlつよ砂得られる蛋白生合成阻害活性蛋白
が、いずれ奄それ自体では、細胞表−と結合する部位を
欠いているが九めk。
極めて弱い細胞毒性しか示さないことと、一旦杭体を中
ヤリアーとして、細胞内へ導入着れると極めて強い細胞
毒性を発揮する点にある。加えて、ビオチニル化抗体上
には、一般にアビジンと結合する部位が複数個存在する
ので、本発明方法の如く、蛋白生合成阻害蛋白をアビジ
ン−ビオチン結合体を介して抗体に結合させ丸場合、抗
体1分子0、−数個OII白生合成阻害活性蛋白が付く
ととにな〕、細胞破壊効果の増幅が得られることも本!
l!一方法の特長としで挙げる仁とができる。
ヤリアーとして、細胞内へ導入着れると極めて強い細胞
毒性を発揮する点にある。加えて、ビオチニル化抗体上
には、一般にアビジンと結合する部位が複数個存在する
ので、本発明方法の如く、蛋白生合成阻害蛋白をアビジ
ン−ビオチン結合体を介して抗体に結合させ丸場合、抗
体1分子0、−数個OII白生合成阻害活性蛋白が付く
ととにな〕、細胞破壊効果の増幅が得られることも本!
l!一方法の特長としで挙げる仁とができる。
本lN11方法によって特定l5ll!群を破壊する望
゛★しい実施態様は、破壊し九い細胞群を含む細胞集団
を先ず、その細胞群舎選択的Kll鐵する杭休めビオチ
ニル化体(ビオチニル化抗体)溶O分接触反応させ、 細胞培養培地もしくは緩衝化食塩水で洗うことによ〉過
剰の未反応抗体を除去した後、さらに1アビジンと蛋白
生合成阻害活性蛋白と゛を共有結合によりて架橋すると
とkよ)得られる蛋白複合体を加えて、0〜3丁℃で凰
〜3□O分接触反“応させ、細胞培養培地屯しくけ緩衝
化食塩水で洗って過剰C+蛋白複合体を除去し先後、績
胞培−すゐ方法である。細胞培養は通常の条件、即ちi
z oo−加■雰囲気下s1℃で通常8時間〜S日間
行えばよい。なお、ビオチニル化抗体と、アビジノと蛋
白生合成阻害活性蛋白の複合体は、同時に細胞に加えて
もよく、ま九予めビオチニル化抗体と不発IJIIO蛋
白複合体とを接触させてアビジン・ビオチン結合体を作
らせた後、その結合体で細胞集団を処理してもよい。
゛★しい実施態様は、破壊し九い細胞群を含む細胞集団
を先ず、その細胞群舎選択的Kll鐵する杭休めビオチ
ニル化体(ビオチニル化抗体)溶O分接触反応させ、 細胞培養培地もしくは緩衝化食塩水で洗うことによ〉過
剰の未反応抗体を除去した後、さらに1アビジンと蛋白
生合成阻害活性蛋白と゛を共有結合によりて架橋すると
とkよ)得られる蛋白複合体を加えて、0〜3丁℃で凰
〜3□O分接触反“応させ、細胞培養培地屯しくけ緩衝
化食塩水で洗って過剰C+蛋白複合体を除去し先後、績
胞培−すゐ方法である。細胞培養は通常の条件、即ちi
z oo−加■雰囲気下s1℃で通常8時間〜S日間
行えばよい。なお、ビオチニル化抗体と、アビジノと蛋
白生合成阻害活性蛋白の複合体は、同時に細胞に加えて
もよく、ま九予めビオチニル化抗体と不発IJIIO蛋
白複合体とを接触させてアビジン・ビオチン結合体を作
らせた後、その結合体で細胞集団を処理してもよい。
以下、実−例によ抄本発明を詳述する。
実施例L
アビジンとりシンム鎖とをジスフィト結合を含む共有結
合によって架橋することkよ〉得□ られ為蛋白複合体 O) アビジノへの活性ジスルフィド基の導入° 龜・
噌アビジンを11M塩化ナトリウムを含むa1MI3ン
酸緩衝゛液pli?i(以下ム液と略す。)xmK溶解
し、これに、エタノール中に11L 4mMの賢−すタ
シンイ禮ジル3−(2−ピリジルジチオ)グロピオネー
ト(以下8PDPと略す。)を含む溶液αO雪−を加え
、室温で30分間反応させえ。この反応液を、a14M
塩化ナトリクムとIIIMエチレンシア建ン四酢酸ナト
リウム(以下IDTAと略す。)とを會む111M酢酸
緩衝液PIE翫易(以下B液と略す。)で平衡化したセ
ファデックスG!sカラムクロマトグラフィーkかけて
、未反応物と低分子生成分を除き活性ジスルフド基が導
入され九アビジンを得た。
合によって架橋することkよ〉得□ られ為蛋白複合体 O) アビジノへの活性ジスルフィド基の導入° 龜・
噌アビジンを11M塩化ナトリウムを含むa1MI3ン
酸緩衝゛液pli?i(以下ム液と略す。)xmK溶解
し、これに、エタノール中に11L 4mMの賢−すタ
シンイ禮ジル3−(2−ピリジルジチオ)グロピオネー
ト(以下8PDPと略す。)を含む溶液αO雪−を加え
、室温で30分間反応させえ。この反応液を、a14M
塩化ナトリクムとIIIMエチレンシア建ン四酢酸ナト
リウム(以下IDTAと略す。)とを會む111M酢酸
緩衝液PIE翫易(以下B液と略す。)で平衡化したセ
ファデックスG!sカラムクロマトグラフィーkかけて
、未反応物と低分子生成分を除き活性ジスルフド基が導
入され九アビジンを得た。
(ハ) リシンム鎖の調製法
ヒw (Rleinus communeg)のマメよ
シリジンを精製し、リシンよシそのム鎖を分離する方法
はオルスンズとビール(8,11snes and A
。
シリジンを精製し、リシンよシそのム鎖を分離する方法
はオルスンズとビール(8,11snes and A
。
Pihl、バイオケ<2トリー(Biooh@m、)、
12巻、1111〜81!@買、t*ts離]。
12巻、1111〜81!@買、t*ts離]。
報告に基いて行なった。得られ九ム鎖の溶液には8−メ
ルカプトエタノールが含まれているので、使用直前に上
記&>1)セファデックスG2sカラムクロ!トダラフ
イーにより除去し丸。ζOム鎖には、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアタリルア電ドゲル電気泳動(以下BDB
−FAG鳳と略す)において1鎖もインタタトリシン
も認めもれなかつえ。
ルカプトエタノールが含まれているので、使用直前に上
記&>1)セファデックスG2sカラムクロ!トダラフ
イーにより除去し丸。ζOム鎖には、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアタリルア電ドゲル電気泳動(以下BDB
−FAG鳳と略す)において1鎖もインタタトリシン
も認めもれなかつえ。
fi 活性ジスルフィド基が導入され九アビジンとり
シンム鎖との架橋及び蛋白複合体の精製上記(至)項で
得られた、活性ジスルフィド基が導入されたアビジンを
含むB液(21(Innの吸°光直は龜Sであり九。)
ty@Iと、リシンム鎖(チオール基を有する)を含む
B液(2II (Innの吸光11a t 4 ”t’
あ−pg。)L8−と、1011M IDTAを含む6
4Mす/mk緩衝液pH7゜S(以下c液と略す。)a
3411jを混合し、室温で一晩反応させえ。
シンム鎖との架橋及び蛋白複合体の精製上記(至)項で
得られた、活性ジスルフィド基が導入されたアビジンを
含むB液(21(Innの吸°光直は龜Sであり九。)
ty@Iと、リシンム鎖(チオール基を有する)を含む
B液(2II (Innの吸光11a t 4 ”t’
あ−pg。)L8−と、1011M IDTAを含む6
4Mす/mk緩衝液pH7゜S(以下c液と略す。)a
3411jを混合し、室温で一晩反応させえ。
この反応液を生理食塩水で平衡化したセファデックスG
150スーパーフアイン・カラムクロマトグラフィー(
カラムナイズLll!IIX 115 am ) Kか
けた。第4図の如く1分子量9万ないし五6万〈らいの
流出位置に大きなピークが−められ九。この分1121
番から2@番まで(mlの斜線部)をプールした。ζう
して得られ九蛋白溶液をドデシル硫酸ナトリウム−ボリ
アクリルアζドゲル電気泳動にかけた。第S図のディス
ク1紘リシンム鎖。
150スーパーフアイン・カラムクロマトグラフィー(
カラムナイズLll!IIX 115 am ) Kか
けた。第4図の如く1分子量9万ないし五6万〈らいの
流出位置に大きなピークが−められ九。この分1121
番から2@番まで(mlの斜線部)をプールした。ζう
して得られ九蛋白溶液をドデシル硫酸ナトリウム−ボリ
アクリルアζドゲル電気泳動にかけた。第S図のディス
ク1紘リシンム鎖。
ディスク3社アビジン、ディスク3は架橋。
精製され九蛋白複合体、ディスク4はその蛋白複合体を
鵞−メルカプトエタノールで還元した生成物をかけたも
のである。ディスク3かも、分子量約Li万(右端)く
らいのアビジン吻豐プエエットの4kK分子量約41万
とy、置方(左端)くらいの生成物が1められる。
鵞−メルカプトエタノールで還元した生成物をかけたも
のである。ディスク3かも、分子量約Li万(右端)く
らいのアビジン吻豐プエエットの4kK分子量約41万
とy、置方(左端)くらいの生成物が1められる。
これらの分子量はアビジン!プエニツ34分子、ナプエ
二ットとりシンム鎖五分子の和及びすプエニット真分子
とりシンム鎖2分子の和にそれぞれ一致する(系中にド
デシル硫酸ナトリウムが存在して−るため、アビジンは
tプエエットに分離して検出される。)実S%これらの
生成物をII覚すると、ディスク40如く、かな〉の量
Ovvンム鎖が生成する。
二ットとりシンム鎖五分子の和及びすプエニット真分子
とりシンム鎖2分子の和にそれぞれ一致する(系中にド
デシル硫酸ナトリウムが存在して−るため、アビジンは
tプエエットに分離して検出される。)実S%これらの
生成物をII覚すると、ディスク40如く、かな〉の量
Ovvンム鎖が生成する。
従って得られた蛋白複合体は菖畳図の如く、4つのアビ
ジン・すプエエットのいくりががリシンム鎖1個と結合
し九(S個結合したものもわずかに存在する)構造をと
っている。
ジン・すプエエットのいくりががリシンム鎖1個と結合
し九(S個結合したものもわずかに存在する)構造をと
っている。
実施例t
アイジンとジフテリア毒素の7ラグメントムとをジスル
フィド結合を含む共有結合によって架橋するととによ)
得られる蛋白複合体(カ ジフテリア毒素の7ツグメン
トムの調製ジフテリア毒素210噌を含むaoiM)リ
ス・塩91−111Mエチレンシアζン四酢酸水溶液(
pH&s )1 tsmK、ausl/5di1度のト
リプシン溶液をals−加えて、36℃で50分間分解
し、そ0後asqp/5IJl11度の大豆トリプシン
阻害物質溶液a3−を加えて反応を停止した。この分解
生成物に尿素(最終1111j6M)、亜硫酸す) I
Jウム(最終濃度a16畠V)およびデトラチオン酸ナ
トリウム(最終1111ao4zM)を加えて、31℃
で■I8−スルホ化分解を行なり九。得られ九反応液を
、6M尿素−103M酢酸緩衝液(pH!Lm )中で
セフアゾylxck t @ @カラムクロマトグラフ
ィー(カラムナイズ龜Samxttsas)Kかけて、
遅れて流出する7ラダメントム両分のみを取シ出し、l
!に蒸留水に透析することによって純粋なフラグメント
ム溶液を得た(B−スルホ基をIII有するん得られえ
8−スルホ化フラダメントム溶液をトリス塩酸緩衝液(
pilM4 ) K対して透析後、雪−メルカプトエタ
ノール(最終濃度10101lでS丁Cで1時間処理し
、実施例1641項記載のセファデックスG霊5カラム
タロマトダツフイーに付し、チオール基を1領有するジ
フテリア毒素の7ツダメントムを得た。
フィド結合を含む共有結合によって架橋するととによ)
得られる蛋白複合体(カ ジフテリア毒素の7ツグメン
トムの調製ジフテリア毒素210噌を含むaoiM)リ
ス・塩91−111Mエチレンシアζン四酢酸水溶液(
pH&s )1 tsmK、ausl/5di1度のト
リプシン溶液をals−加えて、36℃で50分間分解
し、そ0後asqp/5IJl11度の大豆トリプシン
阻害物質溶液a3−を加えて反応を停止した。この分解
生成物に尿素(最終1111j6M)、亜硫酸す) I
Jウム(最終濃度a16畠V)およびデトラチオン酸ナ
トリウム(最終1111ao4zM)を加えて、31℃
で■I8−スルホ化分解を行なり九。得られ九反応液を
、6M尿素−103M酢酸緩衝液(pH!Lm )中で
セフアゾylxck t @ @カラムクロマトグラフ
ィー(カラムナイズ龜Samxttsas)Kかけて、
遅れて流出する7ラダメントム両分のみを取シ出し、l
!に蒸留水に透析することによって純粋なフラグメント
ム溶液を得た(B−スルホ基をIII有するん得られえ
8−スルホ化フラダメントム溶液をトリス塩酸緩衝液(
pilM4 ) K対して透析後、雪−メルカプトエタ
ノール(最終濃度10101lでS丁Cで1時間処理し
、実施例1641項記載のセファデックスG霊5カラム
タロマトダツフイーに付し、チオール基を1領有するジ
フテリア毒素の7ツダメントムを得た。
に)活性ジスルフィド基が導入されたアビジンとジフテ
リア毒素の7ツダメントムとO架橋及び蛋白複合体の精
製 上記O)項の如くして得え?フチリア毒素の7ツダメン
トムと、実施例1のピ)項の如くして得九活性ジスルフ
ィド基が導入され九アビジンとを用い、実施例1OfJ
項の鳩舎と同様の操作によ〉、アビジンとジフテリア毒
素7ラダメントムとがジスルフィド結合を含む共有結合
で架橋された蛋白複合体を得た。
リア毒素の7ツダメントムとO架橋及び蛋白複合体の精
製 上記O)項の如くして得え?フチリア毒素の7ツダメン
トムと、実施例1のピ)項の如くして得九活性ジスルフ
ィド基が導入され九アビジンとを用い、実施例1OfJ
項の鳩舎と同様の操作によ〉、アビジンとジフテリア毒
素7ラダメントムとがジスルフィド結合を含む共有結合
で架橋された蛋白複合体を得た。
実施例龜
アビジンとツルレイシより得られる蛋白生合成阻害活性
蛋白とを、ジスルフィド結合を有する共有結合によって
架橋する仁とによシ得られる蛋白複合体 、(へ) ツルレイシの種子よ〕蛋白生合成阻害活性を
有する蛋白(以下MOMという)の抽出・稍ツルレイシ
の種子tart乳バチですりつぶし、エーテルで脂質を
除去した。こうして得た脱脂管体に%iml M Qン
酸緩債液−■1塩化す) IJtム溶液(pH?、!
) S @ mlを加えて、4℃で一晩攪拌を続けた。
蛋白とを、ジスルフィド結合を有する共有結合によって
架橋する仁とによシ得られる蛋白複合体 、(へ) ツルレイシの種子よ〕蛋白生合成阻害活性を
有する蛋白(以下MOMという)の抽出・稍ツルレイシ
の種子tart乳バチですりつぶし、エーテルで脂質を
除去した。こうして得た脱脂管体に%iml M Qン
酸緩債液−■1塩化す) IJtム溶液(pH?、!
) S @ mlを加えて、4℃で一晩攪拌を続けた。
その後、遠心分離によって不溶物を除去し、硫安を5o
qII飽和になるように2M見た。OCで1時間攪拌後
、遠心分離によってその上清を取〕、この上清にさらK
it安を加えて7o91飽和として、01℃で2時間攪
拌後、遠心分離によってその沈澱を分離した。沈澱物K
imの!!i1Mリン酸緩@191(peal)を加え
て溶解し、同じりン酸緩債液に対して十分に透析し良。
qII飽和になるように2M見た。OCで1時間攪拌後
、遠心分離によってその上清を取〕、この上清にさらK
it安を加えて7o91飽和として、01℃で2時間攪
拌後、遠心分離によってその沈澱を分離した。沈澱物K
imの!!i1Mリン酸緩@191(peal)を加え
て溶解し、同じりン酸緩債液に対して十分に透析し良。
その透析内液を、同じリン酸緩衝液で平衡化したセファ
デツタスGl!i0スーパーファイン・カツムタロマト
ダラフイー(カラム・ずイズ54cs x t S e
x ) Kかけて、分子量約3万の位置に流出する蛋白
をプールしえ。仁れを0M4フアデツクスO−1!(I
カラムタロマトグツフイ(カラム・豐イズL @ as
ss x S 4 ex )にかけた。V?yはS I
LMリンリン酸緩衝液H4Ls)K平衡化されているが
、aOsMリン酸緩衝液(puts)、atmリン酸緩
衝液(peal )さら6ca冨Mリン酸緩衝液(pi
lM )という翼合に塩ll)度を上げていくと、(L
IOM4DとζろでMOMが流出してき丸。この分画の
蛋白□は、分子量約2?、 000であ砂、他の蛋白を
含★ぬことはsDe −piem+ Kよって確g″S
れた。
デツタスGl!i0スーパーファイン・カツムタロマト
ダラフイー(カラム・ずイズ54cs x t S e
x ) Kかけて、分子量約3万の位置に流出する蛋白
をプールしえ。仁れを0M4フアデツクスO−1!(I
カラムタロマトグツフイ(カラム・豐イズL @ as
ss x S 4 ex )にかけた。V?yはS I
LMリンリン酸緩衝液H4Ls)K平衡化されているが
、aOsMリン酸緩衝液(puts)、atmリン酸緩
衝液(peal )さら6ca冨Mリン酸緩衝液(pi
lM )という翼合に塩ll)度を上げていくと、(L
IOM4DとζろでMOMが流出してき丸。この分画の
蛋白□は、分子量約2?、 000であ砂、他の蛋白を
含★ぬことはsDe −piem+ Kよって確g″S
れた。
(ロ) チオール基が導入され九MOMの調製上記ピ)
項の如くして抽出精製され九、ム液K Mo1t t
1 ! @噌/−の一度で含む博液4−に、雪@ Ia
Mの8PDP o工り)−’kflj液亀19液管19
−室温で30分間反応させた。この反応液K 10 m
1M IDテム、 !! 0011M冨−メルカ・ブト
エタノールを含む6061LM )リス塩酸緩側1m(
peal)を(L 1 sIj加j−(,1illle
ts分間反応させ、B液で平衡化したセファデックスG
−j!!!カラムクロマトグラツイーkかけてチオール
基が導入され九MOMを得た。
項の如くして抽出精製され九、ム液K Mo1t t
1 ! @噌/−の一度で含む博液4−に、雪@ Ia
Mの8PDP o工り)−’kflj液亀19液管19
−室温で30分間反応させた。この反応液K 10 m
1M IDテム、 !! 0011M冨−メルカ・ブト
エタノールを含む6061LM )リス塩酸緩側1m(
peal)を(L 1 sIj加j−(,1illle
ts分間反応させ、B液で平衡化したセファデックスG
−j!!!カラムクロマトグラツイーkかけてチオール
基が導入され九MOMを得た。
fう 活性ジスルフィド基が導入され九アビ°ジンと、
チオール基が導入されたMOMとの架橋及び蛋白複合体
の精製 実施例1のピ)項で得られた活性ジスルフィド基の導入
されたアビジンを含むB液(200nmの吸光度は瓢O
であった。)11)11jと、上記に)項で得られたチ
オール基O導入されたMOMを含むB液(!11Onn
o吸光度は凱8であつ九。)へ6−と、o@a鵞@df
混舎し、室温−で−跪反応させた。
チオール基が導入されたMOMとの架橋及び蛋白複合体
の精製 実施例1のピ)項で得られた活性ジスルフィド基の導入
されたアビジンを含むB液(200nmの吸光度は瓢O
であった。)11)11jと、上記に)項で得られたチ
オール基O導入されたMOMを含むB液(!11Onn
o吸光度は凱8であつ九。)へ6−と、o@a鵞@df
混舎し、室温−で−跪反応させた。
仁の反応液を生理食塩水で平衡化したセファデックスe
−1!!(Iスーパーファインタロマドグラフィー(カ
ラムナイズLIX・gas)にかけえ。第7図がそのク
ロマトグラフィーの図である。分−28番から3S番、
34番から11111でをそれぞれプールして分111
゜璽としえ。この■、麗分画をドデシル硫酸す・トリウ
ム−ポリアタ呼ルア叱ドゲル電気泳論kかけ第8図の如
き結果を得た。第8図のディスク1はMOM 、ディス
ク雪はアビジン、ディスタ3は分−I、ディスク4は分
−置、ディスタS、Sはそれぞれ分画I、鳳を雪−メル
カプトエタノールで還元した生成物をかけたものである
。
−1!!(Iスーパーファインタロマドグラフィー(カ
ラムナイズLIX・gas)にかけえ。第7図がそのク
ロマトグラフィーの図である。分−28番から3S番、
34番から11111でをそれぞれプールして分111
゜璽としえ。この■、麗分画をドデシル硫酸す・トリウ
ム−ポリアタ呼ルア叱ドゲル電気泳論kかけ第8図の如
き結果を得た。第8図のディスク1はMOM 、ディス
ク雪はアビジン、ディスタ3は分−I、ディスク4は分
−置、ディスタS、Sはそれぞれ分画I、鳳を雪−メル
カプトエタノールで還元した生成物をかけたものである
。
ディスク3よII分−は分子量約LIS万(右端)のア
ビジンナプエニットのほかに分子量約tS万、6万と?
、i万(左端)の生成物が認められ、これらの分子量は
それ(れアビジン!ブエニット1分子と輩6M 1分子
、アビジンナプエニット3分子とMOM 1分子量して
アビージンナプエニット1分子とMOM 1分子の分子
量の和に一致し、を九ディスク4よ)10分画社分子量
約表1万と6万の生成物が認められ、これらはそれぞれ
!分画の分子量也5万、6万め生成物と同様のものであ
る。
ビジンナプエニットのほかに分子量約tS万、6万と?
、i万(左端)の生成物が認められ、これらの分子量は
それ(れアビジン!ブエニット1分子と輩6M 1分子
、アビジンナプエニット3分子とMOM 1分子量して
アビージンナプエニット1分子とMOM 1分子の分子
量の和に一致し、を九ディスク4よ)10分画社分子量
約表1万と6万の生成物が認められ、これらはそれぞれ
!分画の分子量也5万、6万め生成物と同様のものであ
る。
セしてこれらの生成物を還元するとディスク4・のどと
< MOMとアビジンナプエニットだけとなる。従って
得られ九複合体は、アビジンの4つのすプエニットのい
くつかがMOM 1個と結合した(3個結合したものも
わずかに存在する)構造をとっていることがわかる。
< MOMとアビジンナプエニットだけとなる。従って
得られ九複合体は、アビジンの4つのすプエニットのい
くつかがMOM 1個と結合した(3個結合したものも
わずかに存在する)構造をとっていることがわかる。
実施例也
アビジンとアメリカヤマゴボウより得られる蛋白生合成
阻害活性蛋白を、ジスルフィド結合含有する共有結合に
よって架橋することにより得られる蛋白複合体 0) アメリカヤマゴぽつの葉よ)蛋白生合成阻害活性
を有する蛋白(以下PAPという)の抽出精製 アメリカヤマゴlつの6薬5ootを、5OOdの水を
加えて、々午伊−でホモゲナイズし九。このホモジエネ
イトより、アービン(Irマin)の方法(アーカイプ
ス オプ )(イオケ電ストリー アンド バイオツイ
ジクス(ムrahiv+es of Biooki
smlstry ana Blophysias)
。
阻害活性蛋白を、ジスルフィド結合含有する共有結合に
よって架橋することにより得られる蛋白複合体 0) アメリカヤマゴぽつの葉よ)蛋白生合成阻害活性
を有する蛋白(以下PAPという)の抽出精製 アメリカヤマゴlつの6薬5ootを、5OOdの水を
加えて、々午伊−でホモゲナイズし九。このホモジエネ
イトより、アービン(Irマin)の方法(アーカイプ
ス オプ )(イオケ電ストリー アンド バイオツイ
ジクス(ムrahiv+es of Biooki
smlstry ana Blophysias)
。
第1・・4Ik、s!1〜I鵞$頁、117!s年)′
に基づいて、硫安分画、 DIムlセル田−ス・タロマ
ドグラフィーおよびホスホセルロース・クロマトグラフ
ィーによりてPAPを精製した。
に基づいて、硫安分画、 DIムlセル田−ス・タロマ
ドグラフィーおよびホスホセルロース・クロマトグラフ
ィーによりてPAPを精製した。
このPAPはEID8− PAGI において、分子
量約2?、@・Oの位置に一つのバンドを形成した。
量約2?、@・Oの位置に一つのバンドを形成した。
なお、アメリカヤマゴボウの種子、根からも同様に抽出
、精製し、PAN’が取れることt8D1i1− PA
GI で確認した。以下の実験では葉よ)精製したPA
Pを用いた。
、精製し、PAN’が取れることt8D1i1− PA
GI で確認した。以下の実験では葉よ)精製したPA
Pを用いた。
(→ チオール基が導入され九PAP O@製上記0)
項の如く抽出精製され九PAP & 1■を含む、aO
冨Mすy鐵緩@Il−a14M塩ILM IDテム
水湊液 (PH7,1S)L@IIJK、1111輩の
8PIIP ?含むエタノール溶液をa・・−加え、室
温で30分関反応させた。
項の如く抽出精製され九PAP & 1■を含む、aO
冨Mすy鐵緩@Il−a14M塩ILM IDテム
水湊液 (PH7,1S)L@IIJK、1111輩の
8PIIP ?含むエタノール溶液をa・・−加え、室
温で30分関反応させた。
この反応液に1011MIliDTA、 2001LM
2−メルカプトエタノールを含むI OOIIM
)リス塩酸緩衝液(pHal )をa04−加えて、3
7℃で3・、分−間反応させ、反応液な%B液゛5で平
衡化したセファデックスa−ZSカラムクロマトグラフ
ィーKかけてチオール基が導入され九PAPを得九。
2−メルカプトエタノールを含むI OOIIM
)リス塩酸緩衝液(pHal )をa04−加えて、3
7℃で3・、分−間反応させ、反応液な%B液゛5で平
衡化したセファデックスa−ZSカラムクロマトグラフ
ィーKかけてチオール基が導入され九PAPを得九。
(i 活性ジスルフィド基が導入され九アビジンと°チ
オ、−ル基が導入されたPAPとの架橋及び蛋白複合体
の精製 実施例xofO項の如くして得られた活性ジスルフィド
基が導入されたアビジンと、上記(→項の如くして得ら
れたチオ・・ル基が導入され九PAPよ)、実施例3の
f1項と同様にして、アビジンとPAPがジスルフィド
結合を含む共有結合によって架橋された蛋白複合体を得
九。
オ、−ル基が導入されたPAPとの架橋及び蛋白複合体
の精製 実施例xofO項の如くして得られた活性ジスルフィド
基が導入されたアビジンと、上記(→項の如くして得ら
れたチオ・・ル基が導入され九PAPよ)、実施例3の
f1項と同様にして、アビジンとPAPがジスルフィド
結合を含む共有結合によって架橋された蛋白複合体を得
九。
実施例翫
111表面にイム71グロブリンをもつたリンパ球BJ
IIj!iK対する細胞傷害(そのl)f4) 抗体
(Ige)のビオチニル化a I M IIaHOOa
K透析し九つナギ抗マウスIgG抗体溶液(l呼/m)
tssJと、舅−とド四中シナクシニ之ドビオチンの翼
1M−ジメルチホルア電ド溶液(1wll/aJ )
a l−を混合し、室温で4時間反応させ丸。反応後、
10ILM−リン酸塩緩衝化食塩水(pli7.りに透
析して過剰の翼−ヒドロ中シ!クシエ電ドビオチンを除
き、ビオチニル化つずギ抗マウスIgG抗体(ビオチニ
ル化抗体)を得た。
IIj!iK対する細胞傷害(そのl)f4) 抗体
(Ige)のビオチニル化a I M IIaHOOa
K透析し九つナギ抗マウスIgG抗体溶液(l呼/m)
tssJと、舅−とド四中シナクシニ之ドビオチンの翼
1M−ジメルチホルア電ド溶液(1wll/aJ )
a l−を混合し、室温で4時間反応させ丸。反応後、
10ILM−リン酸塩緩衝化食塩水(pli7.りに透
析して過剰の翼−ヒドロ中シ!クシエ電ドビオチンを除
き、ビオチニル化つずギ抗マウスIgG抗体(ビオチニ
ル化抗体)を得た。
(ロ) ビオチニル化抗体とアビジン・リシンム鎖複合
体を用いる、表面イムノダ■プリンを持つたB細胞に対
する細胞傷害 ジェトロフェニル(DBIP)−キーホール・リンペッ
トeヘモシアニン(ICLH) ”eg作り九BALB
10マウスの牌#ll胞(DIPに対する表面イムノグ
ロブリン貴生前駆遭纏胞)雪X 10’@に、ビオチニ
ル化ウナギ抗マウスIgI:に抗体(1啼/ 1d)
60pLを加えて氷中婁O分反応させ(マウスのB、l
it@にビオチニル化抗体が結合する)、冷ハンクス溶
液で2−洗りえ後、〆にアビジン・リシンム鎖複合体(
可変濃度)l Ostを加えて氷中1s分反応させ(ビ
オチニル化抗体にアビジン・リシンム鎖複舎体が結合す
る)、冷ハンクス溶液で3回流つ九。
体を用いる、表面イムノダ■プリンを持つたB細胞に対
する細胞傷害 ジェトロフェニル(DBIP)−キーホール・リンペッ
トeヘモシアニン(ICLH) ”eg作り九BALB
10マウスの牌#ll胞(DIPに対する表面イムノグ
ロブリン貴生前駆遭纏胞)雪X 10’@に、ビオチニ
ル化ウナギ抗マウスIgI:に抗体(1啼/ 1d)
60pLを加えて氷中婁O分反応させ(マウスのB、l
it@にビオチニル化抗体が結合する)、冷ハンクス溶
液で2−洗りえ後、〆にアビジン・リシンム鎖複合体(
可変濃度)l Ostを加えて氷中1s分反応させ(ビ
オチニル化抗体にアビジン・リシンム鎖複舎体が結合す
る)、冷ハンクス溶液で3回流つ九。
ζうして前処置した牌細胞に、 DIP−区IIH(抗
原刺激の丸め) (40*g/114 ) 2−メルカ
プトエ・タノール(s (IsM )及び101gウシ
胎児血清を含むRPM工1640培地6 o osLを
加え、t OOpLずつ39に分けてそれぞれ6* O
Om加湿雰囲気下37′cでS日間培養した後、J@r
n・のプラーク法〔ヤーン及びノルディン(M、に、J
@rn@ana A、ムJorain )ナイエンス(
8aienas) 、第■」巻、 40111n!1年
参照〕kよって、抗DIP抗体産生細胞(累)比較例も
含めて結果を第9図に示した。図よ)、抗原(MP−K
LFl)の添加によシ、PFOが、著しく増化するが(
グループ2)、予め牌細胞をビオチニル化抗体で処理し
、l!にアビジン・リシンム鎖複合体で処理すると。
原刺激の丸め) (40*g/114 ) 2−メルカ
プトエ・タノール(s (IsM )及び101gウシ
胎児血清を含むRPM工1640培地6 o osLを
加え、t OOpLずつ39に分けてそれぞれ6* O
Om加湿雰囲気下37′cでS日間培養した後、J@r
n・のプラーク法〔ヤーン及びノルディン(M、に、J
@rn@ana A、ムJorain )ナイエンス(
8aienas) 、第■」巻、 40111n!1年
参照〕kよって、抗DIP抗体産生細胞(累)比較例も
含めて結果を第9図に示した。図よ)、抗原(MP−K
LFl)の添加によシ、PFOが、著しく増化するが(
グループ2)、予め牌細胞をビオチニル化抗体で処理し
、l!にアビジン・リシンム鎖複合体で処理すると。
PyO数が有意に抑制されることが分った。即ち、抗D
IP抗体産生−駆細胞(1細胞)が、ビオチニル化抗マ
ウスIgG抗体とこれに結合しうるアビジン・9Vンム
鎖複合体め殺細胞効果によって除去された仁とを示して
い為。
IP抗体産生−駆細胞(1細胞)が、ビオチニル化抗マ
ウスIgG抗体とこれに結合しうるアビジン・9Vンム
鎖複合体め殺細胞効果によって除去された仁とを示して
い為。
また駿#1ml効果を得るには、ビオチニル化抗体とア
ピジy−3JVンム鎖複舎体の両者−共に必要であるこ
とを示してい為。
ピジy−3JVンム鎖複舎体の両者−共に必要であるこ
とを示してい為。
実施倒置
膜表IIKイムノダロプリンを4つたリン六球B#l胞
に対する細胞傷害(七の鵞) DIP −tLH感作牌細胞を実施例Sと同様k。
に対する細胞傷害(七の鵞) DIP −tLH感作牌細胞を実施例Sと同様k。
ビオチニル化抗マウスXgG抗体とアビジン・MOM複
合体で前処置し先後、Ploを調べえ。
合体で前処置し先後、Ploを調べえ。
第L@gK示されるように1ビオチニル化抗体を丸線ア
ビジン・MOM複合体単独では、いずれもPyOを有意
に減少させなかつえが、両者を共に用いるとpyaが着
しく減少し、抗体が認識する抗DIIP抗体産生性B#
l胞群に#l胞傷書作用があつ九ことがわかる。
ビジン・MOM複合体単独では、いずれもPyOを有意
に減少させなかつえが、両者を共に用いるとpyaが着
しく減少し、抗体が認識する抗DIIP抗体産生性B#
l胞群に#l胞傷書作用があつ九ことがわかる。
実施例1゜
T細胞代換因子(テRν)受容体をもっ九Bll胞に対
する細胞傷害 (イ)抗BAIIB / Q・−BJI胞抗体のビオチ
ニル化ν(aカ宵の調製 ジニ)0フエニル(DMP)−キーホール・リンペット
・ヘモシアニン(xLii)で免疫Li2ムLB /
cr マウスの牌細胞を杭テhy L *抗体とつ!
ギ補体でI&場しテ細胞を除き、DIiP−KXiH感
作BJllIIliを得た。次にこのB!1m胞を水酸
化アル(=ラム4111Fと百日咳菌(11ord@t
@1lapsrtussis ) I X 10”個と
共l/C(DBム/!IaX11ALB / (1)(
Do)1Fm’m性マウxi(腹腔内投与し、更K11
l@だけチー週間411C@1m免疫した後、その−道
関目から、毎週採血した。得られ九抗血情はプールして
、硫安分画並びKD罵ム冨−セルロースカラムクロマト
グラフィーによ〉IgG画分を得、ペプシン処理及びセ
ファデックスG−150カラムク四マトダラアイーによ
)ν(at/)−を調製し丸。ν(ab’3m のビオ
チニル化社実施例Sのピ)項の如くして行った。
する細胞傷害 (イ)抗BAIIB / Q・−BJI胞抗体のビオチ
ニル化ν(aカ宵の調製 ジニ)0フエニル(DMP)−キーホール・リンペット
・ヘモシアニン(xLii)で免疫Li2ムLB /
cr マウスの牌細胞を杭テhy L *抗体とつ!
ギ補体でI&場しテ細胞を除き、DIiP−KXiH感
作BJllIIliを得た。次にこのB!1m胞を水酸
化アル(=ラム4111Fと百日咳菌(11ord@t
@1lapsrtussis ) I X 10”個と
共l/C(DBム/!IaX11ALB / (1)(
Do)1Fm’m性マウxi(腹腔内投与し、更K11
l@だけチー週間411C@1m免疫した後、その−道
関目から、毎週採血した。得られ九抗血情はプールして
、硫安分画並びKD罵ム冨−セルロースカラムクロマト
グラフィーによ〉IgG画分を得、ペプシン処理及びセ
ファデックスG−150カラムク四マトダラアイーによ
)ν(at/)−を調製し丸。ν(ab’3m のビオ
チニル化社実施例Sのピ)項の如くして行った。
(ロ) ビオチニル化抗体とアビジン・リシンム鎖複合
体を用いる、テRF受容体をもった細胞に対する細胞傷
害 DIP −KXaH感作牌細胞を、抗テhy L 2抗
体及びウナギ補体で処理してテ細胞を除き、次Kll論
例Sと同様に1ビオチニル化抗n1LB/cB細胞抗体
のIF(at/)1 とアビジン・リシンム鎖複舎体
で前処置し良後、nap−卵白アルブζン(Ofム)(
4onf/wj)、x−メルカプトエタノ−k (m
OjM ) 、 TRF (m @容量憾)及び10−
ウシ胎児血清を含むRPMXI@4・培地@ @ Os
Lを添加して、蕃−Gom加湿雰囲気下31℃5日間培
養しPro反応を関ぺえ。
体を用いる、テRF受容体をもった細胞に対する細胞傷
害 DIP −KXaH感作牌細胞を、抗テhy L 2抗
体及びウナギ補体で処理してテ細胞を除き、次Kll論
例Sと同様に1ビオチニル化抗n1LB/cB細胞抗体
のIF(at/)1 とアビジン・リシンム鎖複舎体
で前処置し良後、nap−卵白アルブζン(Ofム)(
4onf/wj)、x−メルカプトエタノ−k (m
OjM ) 、 TRF (m @容量憾)及び10−
ウシ胎児血清を含むRPMXI@4・培地@ @ Os
Lを添加して、蕃−Gom加湿雰囲気下31℃5日間培
養しPro反応を関ぺえ。
第111IIK示す通)、肺細胞から、Tsemiを除
いてしまうと、抗原(1)IIP −OVム)刺歇だけ
ではPPo反応がおこら′&<&るが(グループ!)、
培地中K ?RIFを添加するとPFO@が着しく1復
した。しかし、肺細胞を予めビオチニル化抗BALB/
c B#iB胞抗体とアビジン・リシンム鎖で処理す
ることKよ]、rRyのpyo IgB復効果が、抑制
された。この結果はDots雄性マウスをBALB /
OのB細胞で免疫するとTRIF受容体に対する抗体
ができ、かかる抗体のビオチニル体とアビジン・リシン
ム鎖複合体によってBIs胞を処理すると、?RF受容
体を有するBJI胞詳が除去され九ことを示している。
いてしまうと、抗原(1)IIP −OVム)刺歇だけ
ではPPo反応がおこら′&<&るが(グループ!)、
培地中K ?RIFを添加するとPFO@が着しく1復
した。しかし、肺細胞を予めビオチニル化抗BALB/
c B#iB胞抗体とアビジン・リシンム鎖で処理す
ることKよ]、rRyのpyo IgB復効果が、抑制
された。この結果はDots雄性マウスをBALB /
OのB細胞で免疫するとTRIF受容体に対する抗体
ができ、かかる抗体のビオチニル体とアビジン・リシン
ム鎖複合体によってBIs胞を処理すると、?RF受容
体を有するBJI胞詳が除去され九ことを示している。
第1図のげ)はりシン、←)社そのム鎖とB鎖の構造を
示す模式図である。第3−はジフテリア毒素の模式図で
あシ、 &)はインククトト中クン。 ←)はニックトドキシン、f→社フラグメントムとフラ
グメントBの構造を示す。第3図社、抗体(免疫グロブ
リン)の基本構造を示す模式図である。第4図は、活性
ジスルフィド基が導入され九アビジンとりシンム鎖の反
応生成物のセファデックスG110スーパーフアインカ
テムクーマトダツフイーでO流出パターンであ)、斜一
部は蛋白複合体としでプールして用いた部分を示す。嬉
111a% ドデシル硫酸ナトリクムーポリアタリルア
擢ドゲル電気泳動(spa−pies)のパターンであ
り、ディスク!はりシンム鎖を、ディスク鵞はアビジン
を、ディスタ3はアビジンとりシンム鎖の架橋・精製さ
れ九蛋白複合体を、ディスク4は蛋白複合体を3−メル
カプトエタノールで還元し九生成物を泳動させ九パター
ンを示す。第6図は、アピーンとリシンム鎖の蛋白複合
体の模式図である。第1図は、活性ジスルアイド基が導
入されえアビジンとチオール基が導入され九MOM O
反応生成物Oセアアデツクス9180スーパーファイン
カツムタロマトダラアイーでの流出パターンである。第
8図は、8D8− PAGI Oパターンであ)、ディ
スク1はMOMを、ディスク雪はアビジンを、ディスク
3は第711O分jut、ディスク4は第1図の分−■
を、ディスク易、・はそれぞれ分画l。 量を3−メルカプトエタノールで還元した生成物を泳−
させえパターンを示す。第1図は、ビオチニル化抗体と
アビジン・リシンム鎖複合体を用いる、膜表面イムノグ
ロブリンを持つ九B績胞に対する細胞傷害実験の結果を
示す。第i。 図は、ビオチニル化抗体とアビジン・MOM複合体を用
いる、膜表面イムノグロブ啼ンを持ったBIIA@に対
する細胞傷害実験の結果を示す。第11gは、ビオチニ
ル化抗体とアビジン・リシ受容体をもつ九3細胞に対す
る細胞傷害実験のはそれぞれ、ビオチニル化抗体、蛋白
複合体。 抗原またはTRPを系に加り九ことと細見なかり九こと
を示す。 me出願人 帝人株式会社 第1図 B@ 第2511 7ラクソシト4 7ラデtノドB第
3図 c 第4図 分画 第5図 体動方向 第6図 第7図 分画 第δ図 手続補正書 特許庁長官殿 1、事件の表示 特願昭 56 − 1721110 号2、発明の名
称 蛋白複合体及びその製造法並びk それを用いた選択的殺細胞法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区南本町1丁目11番地 (300)帝人株式金社 代表者 徳 末 知 夫(ほか1名) 5′補正の対象 明細書の[発明の詳細な説、、ld、’)欄及び図面6
、補正の内容 (1) 明細書の6頁の2行目k「分類」とあるな、
「分離」と訂正する。 (2)同to頁の18行行目「例えば、Fab」とある
を、[例えば、Feb 、 Fab Jと訂正する。 (3) 同14真の3行目に「チ・オ硫酸Jとあるな
、「チオ亜硫酸」と訂正する。 (4) 同14頁の下から4行IKFイミノチ」とあ
るな、「イミノチオ」と訂正する。 (6) 同17j[の下から6行目にある2つのrt
t」のうち、右側のrnJを削除する。 (6) 同=3真の8行目K「ビオチ化」とあるな、
「ビオチール化」と訂正する。 (7) 同29][010行目行目サブユニット」と
、「サブ!ニット1分子」と訂正する。 (8)同32真の3〜4行目k「有する」とあるな、「
含む」と訂正する。 (9) 同33][の18〜19行IKr精製された
、A甑に・・・・・・溶液」とあるな、「精製されたM
OMを119M9/−の負度で含むA箪」と訂正する。 ・嗜 同39頁の6行目K「ルチホルアミド」とあるな
、「チルホルムアミド」と訂正する。 tll)同40頁の19行@ll’増化」とあるな、「
増加」と訂正する。 n 同41頁の2行目に「抑制される1とあるを、「減
少する」と訂正する。 拳3 同41真の下からS行目K rPFCJとあるを
、「抗体鑞生能」と訂正する。 04 同aslf)下カラ2行目ト1行@KrPFC
−1゜とおるな、いずれもrPFe数」と訂正する。 119 同42頁の1行目に[II!生性]とあるを
、r*隼前駆]と訂正する。 −同427@の下から16行目KF代換」とあるな、「
代替」と釘止する。 (l 同42頁の下から14 行目K rBALB/
e −B 劃1とあるを、rBALB/e BJI胞」
と訂正する。 舖 −42頁の下から7行目k「フル虐ニウム」とある
を、「アルミニウムゲル」と訂正する。 鱈 同42員の下から3行目k「その−週間目」とある
を、[敞終免疫の一週間後]と訂正する。 −同44員の8行目Krビオチニル体」とあるな、「ビ
オチニル化体」と訂正する。 ―り同46真の10行行目「住換」とあるな、「代替」
と訂正する。 −第9図を別紙嬉9図とさしかえる。 −第10図と縞11図を別紙第10IlQと第11図と
さしかえる。 以 上
示す模式図である。第3−はジフテリア毒素の模式図で
あシ、 &)はインククトト中クン。 ←)はニックトドキシン、f→社フラグメントムとフラ
グメントBの構造を示す。第3図社、抗体(免疫グロブ
リン)の基本構造を示す模式図である。第4図は、活性
ジスルフィド基が導入され九アビジンとりシンム鎖の反
応生成物のセファデックスG110スーパーフアインカ
テムクーマトダツフイーでO流出パターンであ)、斜一
部は蛋白複合体としでプールして用いた部分を示す。嬉
111a% ドデシル硫酸ナトリクムーポリアタリルア
擢ドゲル電気泳動(spa−pies)のパターンであ
り、ディスク!はりシンム鎖を、ディスク鵞はアビジン
を、ディスタ3はアビジンとりシンム鎖の架橋・精製さ
れ九蛋白複合体を、ディスク4は蛋白複合体を3−メル
カプトエタノールで還元し九生成物を泳動させ九パター
ンを示す。第6図は、アピーンとリシンム鎖の蛋白複合
体の模式図である。第1図は、活性ジスルアイド基が導
入されえアビジンとチオール基が導入され九MOM O
反応生成物Oセアアデツクス9180スーパーファイン
カツムタロマトダラアイーでの流出パターンである。第
8図は、8D8− PAGI Oパターンであ)、ディ
スク1はMOMを、ディスク雪はアビジンを、ディスク
3は第711O分jut、ディスク4は第1図の分−■
を、ディスク易、・はそれぞれ分画l。 量を3−メルカプトエタノールで還元した生成物を泳−
させえパターンを示す。第1図は、ビオチニル化抗体と
アビジン・リシンム鎖複合体を用いる、膜表面イムノグ
ロブリンを持つ九B績胞に対する細胞傷害実験の結果を
示す。第i。 図は、ビオチニル化抗体とアビジン・MOM複合体を用
いる、膜表面イムノグロブ啼ンを持ったBIIA@に対
する細胞傷害実験の結果を示す。第11gは、ビオチニ
ル化抗体とアビジン・リシ受容体をもつ九3細胞に対す
る細胞傷害実験のはそれぞれ、ビオチニル化抗体、蛋白
複合体。 抗原またはTRPを系に加り九ことと細見なかり九こと
を示す。 me出願人 帝人株式会社 第1図 B@ 第2511 7ラクソシト4 7ラデtノドB第
3図 c 第4図 分画 第5図 体動方向 第6図 第7図 分画 第δ図 手続補正書 特許庁長官殿 1、事件の表示 特願昭 56 − 1721110 号2、発明の名
称 蛋白複合体及びその製造法並びk それを用いた選択的殺細胞法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区南本町1丁目11番地 (300)帝人株式金社 代表者 徳 末 知 夫(ほか1名) 5′補正の対象 明細書の[発明の詳細な説、、ld、’)欄及び図面6
、補正の内容 (1) 明細書の6頁の2行目k「分類」とあるな、
「分離」と訂正する。 (2)同to頁の18行行目「例えば、Fab」とある
を、[例えば、Feb 、 Fab Jと訂正する。 (3) 同14真の3行目に「チ・オ硫酸Jとあるな
、「チオ亜硫酸」と訂正する。 (4) 同14頁の下から4行IKFイミノチ」とあ
るな、「イミノチオ」と訂正する。 (6) 同17j[の下から6行目にある2つのrt
t」のうち、右側のrnJを削除する。 (6) 同=3真の8行目K「ビオチ化」とあるな、
「ビオチール化」と訂正する。 (7) 同29][010行目行目サブユニット」と
、「サブ!ニット1分子」と訂正する。 (8)同32真の3〜4行目k「有する」とあるな、「
含む」と訂正する。 (9) 同33][の18〜19行IKr精製された
、A甑に・・・・・・溶液」とあるな、「精製されたM
OMを119M9/−の負度で含むA箪」と訂正する。 ・嗜 同39頁の6行目K「ルチホルアミド」とあるな
、「チルホルムアミド」と訂正する。 tll)同40頁の19行@ll’増化」とあるな、「
増加」と訂正する。 n 同41頁の2行目に「抑制される1とあるを、「減
少する」と訂正する。 拳3 同41真の下からS行目K rPFCJとあるを
、「抗体鑞生能」と訂正する。 04 同aslf)下カラ2行目ト1行@KrPFC
−1゜とおるな、いずれもrPFe数」と訂正する。 119 同42頁の1行目に[II!生性]とあるを
、r*隼前駆]と訂正する。 −同427@の下から16行目KF代換」とあるな、「
代替」と釘止する。 (l 同42頁の下から14 行目K rBALB/
e −B 劃1とあるを、rBALB/e BJI胞」
と訂正する。 舖 −42頁の下から7行目k「フル虐ニウム」とある
を、「アルミニウムゲル」と訂正する。 鱈 同42員の下から3行目k「その−週間目」とある
を、[敞終免疫の一週間後]と訂正する。 −同44員の8行目Krビオチニル体」とあるな、「ビ
オチニル化体」と訂正する。 ―り同46真の10行行目「住換」とあるな、「代替」
と訂正する。 −第9図を別紙嬉9図とさしかえる。 −第10図と縞11図を別紙第10IlQと第11図と
さしかえる。 以 上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 L アビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白とを共有結合に
よって架橋することkよシ得られる蛋白複合体。 i 蛋白生合成阻害活性蛋白がリシンのム鎖である特許
請求の範囲第1現記go蛋白複舎体。 1 蛋白生合成阻害活性蛋白がジフテリア毒素のフラグ
メントムである特許請求のl1llil謔1項記載の蛋
白複合体。 也 蛋白生合成阻害活性蛋白がツルレイシより得られる
蛋白生合成阻害活性蛋白である特許−求OIs囲第1項
記載の蛋白複合体。 瓢 蛋白生合成阻害活性蛋白がアメリカヤマゴIつより
得られる蛋白生合成阻害i性蛋白である5ets求の範
S第1現記−〇蛋白複合体。 a 共有結合がジスルフィド結合を含む共有結合である
特許請求の範囲第1項記載の蛋白複合体。 7、 アビジンと蛋白生合成阻害活性蛋白のいずれか一
方の蛋白に導入した活性ジスフィト基に、他方の蛋白に
発生または導入したチオール基管反応せしめることを特
徴とする蛋白複合体の製造法。 龜 アビジンと蛋白生合成阻害性蛋白とを共有結合によ
って架橋することによシ得られる蛋白複合体と、特定の
細胞を1識するビオチニル化抗体とを用いて、抗体が特
異的に認識する細胞を破壊することを特徴とする選択的
殺細胞法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56172910A JPS5874614A (ja) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | 蛋白複合体及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56172910A JPS5874614A (ja) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | 蛋白複合体及びその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5874614A true JPS5874614A (ja) | 1983-05-06 |
JPH0428719B2 JPH0428719B2 (ja) | 1992-05-15 |
Family
ID=15950606
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56172910A Granted JPS5874614A (ja) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | 蛋白複合体及びその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5874614A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6028997A (ja) * | 1983-07-26 | 1985-02-14 | Sumitomo Chem Co Ltd | 新規なポリペプチドおよびその製造法 |
JPS6069033A (ja) * | 1983-06-21 | 1985-04-19 | ザ・ボ−ド・オブ・リ−ジエンツ・ザ・ユニバ−シテイ・オブ・テキサス・システム | 免疫毒素複合体 |
JPH05221875A (ja) * | 1991-10-24 | 1993-08-31 | Q P Corp | リゾチーム含有医薬組成物 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5549321A (en) * | 1978-09-28 | 1980-04-09 | Clin Midy | Cellular toxin product formed by covalent bond of lysine a chain with antibody |
-
1981
- 1981-10-30 JP JP56172910A patent/JPS5874614A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5549321A (en) * | 1978-09-28 | 1980-04-09 | Clin Midy | Cellular toxin product formed by covalent bond of lysine a chain with antibody |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6069033A (ja) * | 1983-06-21 | 1985-04-19 | ザ・ボ−ド・オブ・リ−ジエンツ・ザ・ユニバ−シテイ・オブ・テキサス・システム | 免疫毒素複合体 |
JPS6028997A (ja) * | 1983-07-26 | 1985-02-14 | Sumitomo Chem Co Ltd | 新規なポリペプチドおよびその製造法 |
JPH05221875A (ja) * | 1991-10-24 | 1993-08-31 | Q P Corp | リゾチーム含有医薬組成物 |
JP2646048B2 (ja) * | 1991-10-24 | 1997-08-25 | キユーピー 株式会社 | リゾチーム含有医薬組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0428719B2 (ja) | 1992-05-15 |
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