JPS61200925A - 長期作用型免疫毒素および製造方法 - Google Patents
長期作用型免疫毒素および製造方法Info
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- JPS61200925A JPS61200925A JP60274840A JP27484085A JPS61200925A JP S61200925 A JPS61200925 A JP S61200925A JP 60274840 A JP60274840 A JP 60274840A JP 27484085 A JP27484085 A JP 27484085A JP S61200925 A JPS61200925 A JP S61200925A
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- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、多糖単位が修飾された糖タン/ダク質(又は
グリコペプチド)から誘導され、かっタンノ4り質の合
成を阻害する?リペプテド型の成分に共有結合した少く
とも一種の抗体を含有する菓効のある新しい分子(関す
る。
グリコペプチド)から誘導され、かっタンノ4り質の合
成を阻害する?リペプテド型の成分に共有結合した少く
とも一種の抗体を含有する菓効のある新しい分子(関す
る。
米国特許第4,340,535号並びにフランス国特許
第81107596号及び同第81/21836号は、
包合体と呼ばれる抗ガン生成物の#i法を開示している
。この生成物は、破壊される細胞についている抗原を標
的とする抗体又は抗体断片と、リシンの入at共有結合
によりてカップリングすることKよCiられる。この種
の生成物は今まで免疫毒素という包括的な名称によって
称されてき九が、本発明におiても同様である。ところ
でリシンの^@を含有する既に公知の免疫毒素に虜似す
る包合体は知られている。こ九は抗ガン剤として適して
りるが、轡ニグロニウムフルナイフaルム(欧州生化学
ジャーナル−1981年、@116号、447−454
FJ及び”ガン研究’ 1984年、第44号、129
−133頁)から抽出されたグσニン、又はモモルジカ
カランテイス(MOM、米国特許第4,368,149
号)から抽出された阻害剤のよ5なりポソームを不活性
化する他のグリコペプチドと、抗体又は抗体断片を共有
結合(よつてカップリングさせることにより慢らnる。
第81107596号及び同第81/21836号は、
包合体と呼ばれる抗ガン生成物の#i法を開示している
。この生成物は、破壊される細胞についている抗原を標
的とする抗体又は抗体断片と、リシンの入at共有結合
によりてカップリングすることKよCiられる。この種
の生成物は今まで免疫毒素という包括的な名称によって
称されてき九が、本発明におiても同様である。ところ
でリシンの^@を含有する既に公知の免疫毒素に虜似す
る包合体は知られている。こ九は抗ガン剤として適して
りるが、轡ニグロニウムフルナイフaルム(欧州生化学
ジャーナル−1981年、@116号、447−454
FJ及び”ガン研究’ 1984年、第44号、129
−133頁)から抽出されたグσニン、又はモモルジカ
カランテイス(MOM、米国特許第4,368,149
号)から抽出された阻害剤のよ5なりポソームを不活性
化する他のグリコペプチドと、抗体又は抗体断片を共有
結合(よつてカップリングさせることにより慢らnる。
上述のリボソーム(GPIRという略号を使う。)を不
活性にし、またリシンの^鎖と同じような性實を有する
糖タンパク′Xはzo、ooo〜30.000の分子f
を有する(“ガン・サーベイ” 1982年、第1巻、
489−520頁)0本明細書で用いる“リボソームを
不活性化する糖タンーダクjt#は、リボソームを不活
性化し、その結果真核細胞におけるタンパク貿の合成を
阻害する巨大な分子量の糖類単位を有する物質を指す。
活性にし、またリシンの^鎖と同じような性實を有する
糖タンパク′Xはzo、ooo〜30.000の分子f
を有する(“ガン・サーベイ” 1982年、第1巻、
489−520頁)0本明細書で用いる“リボソームを
不活性化する糖タンーダクjt#は、リボソームを不活
性化し、その結果真核細胞におけるタンパク貿の合成を
阻害する巨大な分子量の糖類単位を有する物質を指す。
その他にも同じ不活性化特性を育するならば、その物質
の何らかの断片でもよい。リーソームを不活性化する前
記糖タンノ9り質は天然のものであるか、又は遺伝子型
がこの目的のために修飾された細胞から生合成によって
誘導して得られる。
の何らかの断片でもよい。リーソームを不活性化する前
記糖タンノ9り質は天然のものであるか、又は遺伝子型
がこの目的のために修飾された細胞から生合成によって
誘導して得られる。
これら免疫毒性はアンモニウム塩、種々のアミンのよう
なアジエバント@買又はモネンシン若しくはナイジェリ
シンのようなある種のカルダキシルイオノフオアーなど
様々な物質によって強化さルる〇 しかしながら免疫毒素の治療効果は、活性化されている
ものであつてもそうでなくても、その免疫毒素がその抗
体部分を通して活性な形態で、破壊される標的細胞上に
生体内局在化することができるという条件(いかなる免
疫毒素活性の発現においても必須の条件)でのみ十分発
揮される。標的細胞上に局在化される免疫毒素の効力は
、まず第一に血流及び細胞外液にある免疫11#eが活
性な形態で一定の時閣内に標的細胞に十分な濃度で到達
し、目的とする抗原を高い割合で捕捉する能力に依存す
る。
なアジエバント@買又はモネンシン若しくはナイジェリ
シンのようなある種のカルダキシルイオノフオアーなど
様々な物質によって強化さルる〇 しかしながら免疫毒素の治療効果は、活性化されている
ものであつてもそうでなくても、その免疫毒素がその抗
体部分を通して活性な形態で、破壊される標的細胞上に
生体内局在化することができるという条件(いかなる免
疫毒素活性の発現においても必須の条件)でのみ十分発
揮される。標的細胞上に局在化される免疫毒素の効力は
、まず第一に血流及び細胞外液にある免疫11#eが活
性な形態で一定の時閣内に標的細胞に十分な濃度で到達
し、目的とする抗原を高い割合で捕捉する能力に依存す
る。
多くの研究によつて免疫毒素が嘩ぐな動物の静脈内に注
射された場合の血漿からの消失キネティックスが確立さ
れた。その結果注射後くけ産物学的(活性な免疫毒素の
血漿中の11闇は急速に低下することがわがつた〇 ヒトのTIJン/4球の抗原T65を標的とするモノク
ロナル抗体とりシンの^鎖をジスルフィド結合を含む連
鎖でカップリングさせて得られる免疫毒素についてウサ
ギを使ったモデルで調べ九ところ、注射直後に血流中に
存在する免疫毒素は、30分後にはその97%が、17
時間後にはその99.9%が消失した。この免疫II索
の急速な消失によってその細胞障害力は減じられる。と
いうのは、免疫m素と破壊される細胞についfc標的細
胞との恒久的な結合が妨げられるからである。さらに免
疫毒素の血漿からの消失キネティックスを対応する非包
合抗体と比較してみたところ、この抗体fl!漿中に相
対的に長い時間高いa度で留まることがわかった0冥際
どんなに高度に免疫8″Rを絹製しても、常に一定看の
非包合体は残留する。免疫11素と非包合抗木の消失速
度の違いから、鰻切はごく少な4割合でしかない非包合
抗体は、徐々にその割合が増え、数時間後には半数を超
える割合になる。そのため抗体は徐々に、免疫m素が°
標的に結合する際の強力なアンタボ−ストになる。
射された場合の血漿からの消失キネティックスが確立さ
れた。その結果注射後くけ産物学的(活性な免疫毒素の
血漿中の11闇は急速に低下することがわがつた〇 ヒトのTIJン/4球の抗原T65を標的とするモノク
ロナル抗体とりシンの^鎖をジスルフィド結合を含む連
鎖でカップリングさせて得られる免疫毒素についてウサ
ギを使ったモデルで調べ九ところ、注射直後に血流中に
存在する免疫毒素は、30分後にはその97%が、17
時間後にはその99.9%が消失した。この免疫II索
の急速な消失によってその細胞障害力は減じられる。と
いうのは、免疫m素と破壊される細胞についfc標的細
胞との恒久的な結合が妨げられるからである。さらに免
疫毒素の血漿からの消失キネティックスを対応する非包
合抗体と比較してみたところ、この抗体fl!漿中に相
対的に長い時間高いa度で留まることがわかった0冥際
どんなに高度に免疫8″Rを絹製しても、常に一定看の
非包合体は残留する。免疫11素と非包合抗木の消失速
度の違いから、鰻切はごく少な4割合でしかない非包合
抗体は、徐々にその割合が増え、数時間後には半数を超
える割合になる。そのため抗体は徐々に、免疫m素が°
標的に結合する際の強力なアンタボ−ストになる。
従つて血漿中の免慶II素を高い割合で存続させること
は標的である抗原が結合さnる割合と持続時間を増加さ
せ、その結果免疫褌素の治療効果を増進することf:;
を味する。
は標的である抗原が結合さnる割合と持続時間を増加さ
せ、その結果免疫褌素の治療効果を増進することf:;
を味する。
リシンのA鎖を含有する免疫毒素の生体同局在化につい
て、免疫$1素を放射va職し、特定の標的をもたない
動物に注射して実験したところ、包合体な注射後数分で
肝臓に時異的に局在化した。同じ実験をカップリングし
ない形態のりシンのAfiについて行ったところ、同様
な結果が得らnた。これは免疫毒素に包まれる細胞毒性
サブユニットが肝臓と結合することを強(示唆する。
て、免疫$1素を放射va職し、特定の標的をもたない
動物に注射して実験したところ、包合体な注射後数分で
肝臓に時異的に局在化した。同じ実験をカップリングし
ない形態のりシンのAfiについて行ったところ、同様
な結果が得らnた。これは免疫毒素に包まれる細胞毒性
サブユニットが肝臓と結合することを強(示唆する。
リシンの入偵は七のポリオサン基が、マンノ−xiiと
N−アセチルグルフサミン残基からなる糖タン・−り質
である。そしてそのうちのいくつかの7ンノース基は、
末端に位置する(°^芸生物化学”1978年、第42
巻、501頁)。
N−アセチルグルフサミン残基からなる糖タン・−り質
である。そしてそのうちのいくつかの7ンノース基は、
末端に位置する(°^芸生物化学”1978年、第42
巻、501頁)。
またこれら末端に位置するマンノース残基金倉む糖タン
・fり*をa別する受容体は肝臓的にあることが発見さ
れた。これらの受容体(クツパー細胞中に存する。)は
これらを代謝する細胞と結合することによつて血液中か
ら消失する。
・fり*をa別する受容体は肝臓的にあることが発見さ
れた。これらの受容体(クツパー細胞中に存する。)は
これらを代謝する細胞と結合することによつて血液中か
ら消失する。
これKcAしてはβ−グルクロニダーゼとりボヌクレア
ーゼBの場&について詳しい報告がある(°生物化学と
生物物厖”1978年、188号、418頁、°酵素学
の進歩”マイスター編、ニエーヨーク、1974年およ
び1小児科学研y?、”1977年、M11巻、816
頁)。
ーゼBの場&について詳しい報告がある(°生物化学と
生物物厖”1978年、188号、418頁、°酵素学
の進歩”マイスター編、ニエーヨーク、1974年およ
び1小児科学研y?、”1977年、M11巻、816
頁)。
これらを総合すると、リシンの^鎖を含有する免疫毒素
の急速な消失は、リシンの^鎖のマンノース残基が肝細
胞特にクツ/#−細胞によって認知されるためと説明で
きる0 動物の静脈内に注射した後の他のGP I R、例えば
ゲロニン又ij MOM 、についての血漿からの消失
キネティックスの研兜が進められた結果、リシンの^鎖
についてはGPIRの血漿中濃度は注射後急速に大部分
消失することがわかった。
の急速な消失は、リシンの^鎖のマンノース残基が肝細
胞特にクツ/#−細胞によって認知されるためと説明で
きる0 動物の静脈内に注射した後の他のGP I R、例えば
ゲロニン又ij MOM 、についての血漿からの消失
キネティックスの研兜が進められた結果、リシンの^鎖
についてはGPIRの血漿中濃度は注射後急速に大部分
消失することがわかった。
り゛サギについて公知(゛生化学ジャーナル”l980
年、255号、6947−6953頁)の方法によって
精製し九ゲaニンを注射したところ、注射直後に血流中
に存在したグaニンは、その14間後には93%、24
時間後には99、99%が/g失した。
年、255号、6947−6953頁)の方法によって
精製し九ゲaニンを注射したところ、注射直後に血流中
に存在したグaニンは、その14間後には93%、24
時間後には99、99%が/g失した。
糖タン・1夕に含存されるものを含む炭水化物揖造の、
過ヨード酸イオンによる酸化に、2つの隣接する炭素原
子は第1又は第2ヒドロキシル基を有する場合にな、R
#:鍼の分割を生せしめる。
過ヨード酸イオンによる酸化に、2つの隣接する炭素原
子は第1又は第2ヒドロキシル基を有する場合にな、R
#:鍼の分割を生せしめる。
2つの隣接するヒドロ中シル基が′に2ヒドロキシル基
の#に曾には、GPIRに存在する場合のように、酸化
は、その間に分割が生ずる炭gm子に2つのアルデヒド
基金虫取する。
の#に曾には、GPIRに存在する場合のように、酸化
は、その間に分割が生ずる炭gm子に2つのアルデヒド
基金虫取する。
本明細書にSいて、「過ヨード酸塩」なる語はIO,−
イオンを示し、この#は[メタベリオデート」の名で文
献にも見出される。
イオンを示し、この#は[メタベリオデート」の名で文
献にも見出される。
リボソームを不活性化する糖タンΔりの炭水化物ユニッ
トが過ヨード酸イオンによる酸化によつ天変性されるな
らば、生物活性を保持する特性と生体内で血流から極め
てゆっく〕除去されろ籍性の2つの時性を有する、す〆
ソームを不活性化する看しい循タンパクが辱られること
がわかつ7をn ま次、こ1らの新しいa延作用金有し、リーソームを不
活性化する循タンパクが抗体と結合すると、生じた結・
オ体は抗毒素の公知の生物時性を保付し、遅い血漿除去
運動機能を示すこともわかり九。
トが過ヨード酸イオンによる酸化によつ天変性されるな
らば、生物活性を保持する特性と生体内で血流から極め
てゆっく〕除去されろ籍性の2つの時性を有する、す〆
ソームを不活性化する看しい循タンパクが辱られること
がわかつ7をn ま次、こ1らの新しいa延作用金有し、リーソームを不
活性化する循タンパクが抗体と結合すると、生じた結・
オ体は抗毒素の公知の生物時性を保付し、遅い血漿除去
運動機能を示すこともわかり九。
従って、本発明は、その自然な形で用いられ又は変性さ
れた抗体又は抗体フラグメントと、遅延作用を有しリボ
ソームを不活性化する糖タンパクとの共1′結廿によっ
て得られた、抗葛4のクラスに属する生成物に関・する
。
れた抗体又は抗体フラグメントと、遅延作用を有しリボ
ソームを不活性化する糖タンパクとの共1′結廿によっ
て得られた、抗葛4のクラスに属する生成物に関・する
。
明鋪を期するため、社々のタンパク又はそれらのM5を
示−J″記号および種々の記号を示す表現の意味につい
て以下に説明する。
示−J″記号および種々の記号を示す表現の意味につい
て以下に説明する。
記号Pは、任意の抗体又は抗体フラグメント、任意の免
疫グミプリン又は免疫グロブリンフラグメント、又はそ
れらの官能基の変性によシ上紀のものから誘導された分
子からなる群から選択されたタンパクを意味し、このよ
うにして選択されたタン/ダグが、その抗原を有する細
胞特に標的細胞の表面において、与えらnた抗原を選択
的Kui繊し得る限)において、上記タンノ4りを有す
る炭水化物構造を含む。出発タンパクは、天然のもので
も、そのゼノタイプがこの目的のために変性された測置
から誘導さnた生物合成されたものでもよい。
疫グミプリン又は免疫グロブリンフラグメント、又はそ
れらの官能基の変性によシ上紀のものから誘導された分
子からなる群から選択されたタンパクを意味し、このよ
うにして選択されたタン/ダグが、その抗原を有する細
胞特に標的細胞の表面において、与えらnた抗原を選択
的Kui繊し得る限)において、上記タンノ4りを有す
る炭水化物構造を含む。出発タンパクは、天然のもので
も、そのゼノタイプがこの目的のために変性された測置
から誘導さnた生物合成されたものでもよい。
記号GPIR−1aは、遅延作用を育し、リボソームを
不活性化するタンノダクを表わすが、このタンパクは、
そのチオール基が任意に保aされている、リボソームを
不活性化する糖タン/#りを、過ヨード酸アルカリ金属
の水溶液(より、光がない状態で0〜15℃で0.2〜
24時間処理することにより、また必要ならばそのチオ
ール基の保護を除去することによって得られたものであ
る□また、そのタン/ダグは、本しこのよりにして選ば
れたタンパクが、細胞研究モデルで示し得るように、ユ
ーカリ細胞におけるリボソームタンパクの合成′fr:
阻止し得る特性を保持するならば、このタン/#りが有
する官能基の変性により上記糖タンパクから誘導された
分子を含む。抗毒素において蝶、1部のGPIR−11
は細胞毒素性チプユニットとしても示さルている。
不活性化するタンノダクを表わすが、このタンパクは、
そのチオール基が任意に保aされている、リボソームを
不活性化する糖タン/#りを、過ヨード酸アルカリ金属
の水溶液(より、光がない状態で0〜15℃で0.2〜
24時間処理することにより、また必要ならばそのチオ
ール基の保護を除去することによって得られたものであ
る□また、そのタン/ダグは、本しこのよりにして選ば
れたタンパクが、細胞研究モデルで示し得るように、ユ
ーカリ細胞におけるリボソームタンパクの合成′fr:
阻止し得る特性を保持するならば、このタン/#りが有
する官能基の変性により上記糖タンパクから誘導された
分子を含む。抗毒素において蝶、1部のGPIR−11
は細胞毒素性チプユニットとしても示さルている。
記号^−11は、遅延作用を有し、すメソー五を不活性
化する糖タンパクを示すが、この物タンノ々りは、その
システィンZ7Zおzヒzsyのチオール基の少なくと
も1つが任意に保映されているりシンのAM?過ヨード
酸アルカリ金属の水溶液によシ光の不存在下で0〜15
℃で0.2〜24時間処理することによシ、また必要に
応じて上記チオール基の説保幽によシ得らnるi 記号P′は、上記タンパクP又はそれを化学的に変性し
た4のから誘導されたラジカルを表わし、そこからそれ
自体の基の1つ又はそれ以上が除去され、また他の官能
基が任意に保護されているものである。
化する糖タンパクを示すが、この物タンノ々りは、その
システィンZ7Zおzヒzsyのチオール基の少なくと
も1つが任意に保映されているりシンのAM?過ヨード
酸アルカリ金属の水溶液によシ光の不存在下で0〜15
℃で0.2〜24時間処理することによシ、また必要に
応じて上記チオール基の説保幽によシ得らnるi 記号P′は、上記タンパクP又はそれを化学的に変性し
た4のから誘導されたラジカルを表わし、そこからそれ
自体の基の1つ又はそれ以上が除去され、また他の官能
基が任意に保護されているものである。
記号GPIR−1a’は上記タン−譬りGPIR−11
又はそれを化学的に変性したものから誘導されたものを
表わし、そこからそれ自体の基の1つ以上が除去され、
他の官能基が任意に保護されているものである。
又はそれを化学的に変性したものから誘導されたものを
表わし、そこからそれ自体の基の1つ以上が除去され、
他の官能基が任意に保護されているものである。
記号^−1a /は、そのシスティン111および25
7のチオール基の少なくとも1つが除去さnた、タンノ
ダクA−1aから誘導され次ラジカルを表わす。
7のチオール基の少なくとも1つが除去さnた、タンノ
ダクA−1aから誘導され次ラジカルを表わす。
記号P、は、上記タンパクりGPIR−1aおよびPo
lつを表わし、それは上記タンパクにj[接又はスペー
ス構造を介して結合さnた遊離チオール基を有する。
lつを表わし、それは上記タンパクにj[接又はスペー
ス構造を介して結合さnた遊離チオール基を有する。
記号p、は、タン/4りGPXR−1aおよびPのうち
の一方であるがPlとは異なるものであ〕、遊離チオー
ルと反応し得る1種以上の官能基を有するものである。
の一方であるがPlとは異なるものであ〕、遊離チオー
ルと反応し得る1種以上の官能基を有するものである。
記号P、′はタン・ダクPIKRする基に結合したタン
パクりPlのラジカルを表わし、%K、(システィンの
)8H基、(タン/ダグの末端位置又はリシンのイプシ
aン位置にある)N)i、基、(チロシンの)OH基、
又は(アルパルt:/#又はグルタミン酸の)COOH
基であシ、又はP、が抗体又は抗体フラグメントである
場合にのみ、公知の方法により過ヨード酸との反応によ
り炭水化物構造の開始部から発生するタンパクP、のラ
ジカルである。
パクりPlのラジカルを表わし、%K、(システィンの
)8H基、(タン/ダグの末端位置又はリシンのイプシ
aン位置にある)N)i、基、(チロシンの)OH基、
又は(アルパルt:/#又はグルタミン酸の)COOH
基であシ、又はP、が抗体又は抗体フラグメントである
場合にのみ、公知の方法により過ヨード酸との反応によ
り炭水化物構造の開始部から発生するタンパクP、のラ
ジカルである。
記号22′は、特徴的官能基(タン)4りの末端位置に
あるか又はリシンのイプンロン位置にある)NHt、C
tロジンの)OH又は(アスパラテン酸およびグルタミ
ン@)のCo0HK結合されたタンパクりPlのラジカ
ルを表わす0例えば、P、、−88は(抗体又は抗体フ
ラグメントP又はタンパクGPIR−1aであり得る)
タンパクP1を表わすが、このタンパクP、は、システ
ィンの5を114が遊離しておシ、他の官能基は任意に
保護されているものである。
あるか又はリシンのイプンロン位置にある)NHt、C
tロジンの)OH又は(アスパラテン酸およびグルタミ
ン@)のCo0HK結合されたタンパクりPlのラジカ
ルを表わす0例えば、P、、−88は(抗体又は抗体フ
ラグメントP又はタンパクGPIR−1aであり得る)
タンパクP1を表わすが、このタンパクP、は、システ
ィンの5を114が遊離しておシ、他の官能基は任意に
保護されているものである。
同様に、P、、−〇〇−は、その末端力ルメキシル基又
はそのグルタミン酸およびアスノ4うtン酸のカルボキ
シル基が、SH基を導入する基と結合されているタンパ
クPlをff?)ス。
はそのグルタミン酸およびアスノ4うtン酸のカルボキ
シル基が、SH基を導入する基と結合されているタンパ
クPlをff?)ス。
P、、−NH−は(抗体又は抗体フラグメントP又はタ
ンパクapxR−1aでらp辱る)タンパクP、を表わ
すが、とのタンパクPtは、その末端アミ7基又はその
りシンのアミ7基がタンパクP、のチオールと連結し優
る基に結合している本のである。
ンパクapxR−1aでらp辱る)タンパクP、を表わ
すが、とのタンパクPtは、その末端アミ7基又はその
りシンのアミ7基がタンパクP、のチオールと連結し優
る基に結合している本のである。
「不活性スペーシング構造」なる峰は、このプロセスに
用いる反応体に対し不活性な2価の有機ラジカルを示し
、例えば1〜15の炭素原子を有する[0又は側鎖アル
キレン基であり、1つ以上の二重結合を含んでもよく、
また酸素原子によつて中断されていてもよく、あるいは
またメトキシ基、遊離の又はエステル化されたカルボキ
シル基、ジアルキルアミン基又はカルバメート基のよう
な1種以上の不活性官能基によつて置換されているもの
であってもよい。同シJeはまた。上でアルキレンTs
Vcついて示り、 タように、l橿以との不活性官能基
−よつて置換され得る6〜15の炭素原子を有するアリ
レン基をも示す。
用いる反応体に対し不活性な2価の有機ラジカルを示し
、例えば1〜15の炭素原子を有する[0又は側鎖アル
キレン基であり、1つ以上の二重結合を含んでもよく、
また酸素原子によつて中断されていてもよく、あるいは
またメトキシ基、遊離の又はエステル化されたカルボキ
シル基、ジアルキルアミン基又はカルバメート基のよう
な1種以上の不活性官能基によつて置換されているもの
であってもよい。同シJeはまた。上でアルキレンTs
Vcついて示り、 タように、l橿以との不活性官能基
−よつて置換され得る6〜15の炭素原子を有するアリ
レン基をも示す。
ここでYおよびY′に関して用いられている「共有結合
し得る官能基」という表現は、共有結合を形成するため
にタンノダクP1およびPtに属する基と反応し得るい
かなる基をも意味する。−〇〇−基および−(C,N)
I)−基は、タンパクの遊離アミン、チオールおよびフ
ェノール性水酸基と結合し得る適当な官能基である。同
様に、−N)1−基もタンパクの遊離カルがキシル基と
a盆し得る適当なN能基である。−N−基は過ヨウ素酸
イオンによる酸化のあとにタンパクP、およびP!OS
@の2つの炭素原子と結合し得る適当な官能基である。
し得る官能基」という表現は、共有結合を形成するため
にタンノダクP1およびPtに属する基と反応し得るい
かなる基をも意味する。−〇〇−基および−(C,N)
I)−基は、タンパクの遊離アミン、チオールおよびフ
ェノール性水酸基と結合し得る適当な官能基である。同
様に、−N)1−基もタンパクの遊離カルがキシル基と
a盆し得る適当なN能基である。−N−基は過ヨウ素酸
イオンによる酸化のあとにタンパクP、およびP!OS
@の2つの炭素原子と結合し得る適当な官能基である。
ただしそれは、P宜およびPlが抗体または抗体断片で
ある場合に限る・ ここで2及び2′として示されている「蛋白質に属する
基」なる表現は、蛋8質P1及びPlを形成するアミノ
酸の特有な基から作られたラジカルを示す。例示すれば
、チロシンやセリンアミノ酸の水#lt基から生ずる*
g原子、アスパラギン酸やグルタミン酸の末端カルがキ
シルや遊離カルゲキシルから生じたカルボキシル基、蛋
白質の末端アミンから生じた一NH−5(例えばリジン
)するいはシスティンのチオールかう生じた硫黄原子が
ある。同様(、この表現は、過ヨウ素酸イオンの処理に
よシ、蛋白j[P r及びPlの訣水化物構造の一つ1
:a化し之後得られるジアルデヒド機造から生じた基を
示す。しかしこの場せ、P、及びP、は抗体又は抗体断
片である。
ある場合に限る・ ここで2及び2′として示されている「蛋白質に属する
基」なる表現は、蛋8質P1及びPlを形成するアミノ
酸の特有な基から作られたラジカルを示す。例示すれば
、チロシンやセリンアミノ酸の水#lt基から生ずる*
g原子、アスパラギン酸やグルタミン酸の末端カルがキ
シルや遊離カルゲキシルから生じたカルボキシル基、蛋
白質の末端アミンから生じた一NH−5(例えばリジン
)するいはシスティンのチオールかう生じた硫黄原子が
ある。同様(、この表現は、過ヨウ素酸イオンの処理に
よシ、蛋白j[P r及びPlの訣水化物構造の一つ1
:a化し之後得られるジアルデヒド機造から生じた基を
示す。しかしこの場せ、P、及びP、は抗体又は抗体断
片である。
ここでXで示される「活性ラジカル」なる用tf!は−
8−8−ブリクジに結合さnた基を示し、これは遊離チ
オールと反応してX−8Hを解放した二硫化物を形成す
る。適切な活性ラジカルはピリジン−2−イル及びピリ
ジン−4−イル基で、これらは置換さnていないもの、
あるいは1又は2以のへaグン又はアルキル基、カルボ
キシル基、アルフキジカルボニル幕によってrit換さ
れたものである。フェニル基は置換されていないもの又
は好ましくはl又は2以上のへログン基又はニトロ基、
アルコキシル基、カルボキシル基又はアルコキシルカル
がニル基によって置換されたものである。
8−8−ブリクジに結合さnた基を示し、これは遊離チ
オールと反応してX−8Hを解放した二硫化物を形成す
る。適切な活性ラジカルはピリジン−2−イル及びピリ
ジン−4−イル基で、これらは置換さnていないもの、
あるいは1又は2以のへaグン又はアルキル基、カルボ
キシル基、アルフキジカルボニル幕によってrit換さ
れたものである。フェニル基は置換されていないもの又
は好ましくはl又は2以上のへログン基又はニトロ基、
アルコキシル基、カルボキシル基又はアルコキシルカル
がニル基によって置換されたものである。
「アル中ル」及び「アルコキシ」といつ用語は、5炭素
原子以下を含む越を示す。
原子以下を含む越を示す。
「アルキレン」なる用ilfは、炭素原子10以下を含
むl[jffl又は分枝した飽和脂肪族基を示す。
むl[jffl又は分枝した飽和脂肪族基を示す。
こnらは1又は2以上の不活性官能基(例えばアルコキ
シルカル基)によって置換されたものでもよい。
シルカル基)によって置換されたものでもよい。
とくにこの発明は、イムノトキシンのクラスに属する生
産物に関する。そしてこ1らは、一方では抗体父な抗体
断片に共有結合して得らnlその自然の形又は適切に修
正されて(シンがルP)使用され、こnは所定のターゲ
ットセルによつて運ばnた抗原を選択的に認識する能力
を待うている。他方、これらは長期活性のグリコプロテ
ィンを有しており、これはり〆ソームを不活性化するも
ので、リケソームを不活性化スるダリコブaティンの処
理(よって得られる。
産物に関する。そしてこ1らは、一方では抗体父な抗体
断片に共有結合して得らnlその自然の形又は適切に修
正されて(シンがルP)使用され、こnは所定のターゲ
ットセルによつて運ばnた抗原を選択的に認識する能力
を待うている。他方、これらは長期活性のグリコプロテ
ィンを有しており、これはり〆ソームを不活性化するも
ので、リケソームを不活性化スるダリコブaティンの処
理(よって得られる。
そのチオール基は、過ヨウ素酸のアルカリ金属化物の水
溶液で選択的に保護される。その期間は、0.2〜24
時間、温度0〜15℃、光のない状態である。そしてチ
オール基をブロッキングしないことKより、(シンボル
oprR−ja)を用いた場合、2つの蛋白質の結分は
2硫化物の結合又はチオエーテル結合のいずnかを介し
て有効となる。
溶液で選択的に保護される。その期間は、0.2〜24
時間、温度0〜15℃、光のない状態である。そしてチ
オール基をブロッキングしないことKより、(シンボル
oprR−ja)を用いた場合、2つの蛋白質の結分は
2硫化物の結合又はチオエーテル結合のいずnかを介し
て有効となる。
抗体Pを長期活性グリコプロティン(これはりlソーム
、GPIR−1を不活性とする)と結合させて形成され
たイムノトキシンは、次の統計的な式で示される。
、GPIR−1を不活性とする)と結合させて形成され
たイムノトキシンは、次の統計的な式で示される。
P’−W −GPIR−1a’
ここでP′は蛋白質の基を示し、この蛋白質は抗体又は
抗体断片Pであり、あるいはこれらを適宜化学的に修正
し次ものである。また他の官能基は必要によりブロック
されておシ、GPIR−11/はGPIR−1aやこn
を適宜化学的に6正した蛋白質のラジカルを示す。他の
官能基は必要によジブロックされ、Wはチオエチル基又
は二硫化it含む2価の共有S4iで、これらの基では
硫黄原子はP及びGPIR−J、のシスティンのそれで
あり、あるいはP及び/又はGPIR−1a K 14
する上記基KM曾して官能基を待九せた窄関($ρmc
ing )構造によりて、P及び/又はGPIR−Jj
K属する基に結合している。
抗体断片Pであり、あるいはこれらを適宜化学的に修正
し次ものである。また他の官能基は必要によりブロック
されておシ、GPIR−11/はGPIR−1aやこn
を適宜化学的に6正した蛋白質のラジカルを示す。他の
官能基は必要によジブロックされ、Wはチオエチル基又
は二硫化it含む2価の共有S4iで、これらの基では
硫黄原子はP及びGPIR−J、のシスティンのそれで
あり、あるいはP及び/又はGPIR−1a K 14
する上記基KM曾して官能基を待九せた窄関($ρmc
ing )構造によりて、P及び/又はGPIR−Jj
K属する基に結合している。
2つの蛋白X間のチオエーテル納会は、以下のタイプの
結合として理解される。
結合として理解される。
ここでZ、Y及びBは以下に定義さルる。
この発明は、好ましくは下記の統計的な式で示すイムノ
トキシンに関する。
トキシンに関する。
P’−W’ −GP I R−11’
ここで P/及び0PXR−1,’は、先に定義し九通
シである。W′は以下(1)〜(diから選ばれた共有
構造である。
シである。W′は以下(1)〜(diから選ばれた共有
構造である。
(c) −Z−Y−g−8−8−(E’−Y’−Z’
) 、 −(d) −(Z’−Y’−W’) n−8
−8−E−Y−Z、−これらの式で、2及び2′は、蛋
白質GPIR−11及びPKMする基を示し IF−0
7ン残滓(residue@)の一つのヒドロキシルか
ら生じる酸素原子、 GPIR艷i及びPのアスパラギ
ン酸及び/又はグルタミン酸の末端カルボキシル又は遊
離カルボキシルの1つから生じるカルがキシル基、GP
IR−1,及びPの末端アミンの1つ又はリジン残滓の
1つのニブシロン位置のアミンの1つから生じる一Nl
(−基から選ばrLるものであり、更に上記共有構造(
b)及び(C1中の2についてのみ、公知の方法でPの
炭水化物構造の一つを過ヨウ素酸で酸化させた後得らn
るジアルデヒド構造から生じる基である。
) 、 −(d) −(Z’−Y’−W’) n−8
−8−E−Y−Z、−これらの式で、2及び2′は、蛋
白質GPIR−11及びPKMする基を示し IF−0
7ン残滓(residue@)の一つのヒドロキシルか
ら生じる酸素原子、 GPIR艷i及びPのアスパラギ
ン酸及び/又はグルタミン酸の末端カルボキシル又は遊
離カルボキシルの1つから生じるカルがキシル基、GP
IR−1,及びPの末端アミンの1つ又はリジン残滓の
1つのニブシロン位置のアミンの1つから生じる一Nl
(−基から選ばrLるものであり、更に上記共有構造(
b)及び(C1中の2についてのみ、公知の方法でPの
炭水化物構造の一つを過ヨウ素酸で酸化させた後得らn
るジアルデヒド構造から生じる基である。
Y及びY′は、蛋白’M GP IR−t a及ヒP(
71)Z及び2′基の任意の一つと共有結合可能な官能
基を示す。
71)Z及び2′基の任意の一つと共有結合可能な官能
基を示す。
B及びE′は不后***闇構造と示し、nは0又は1であ
る。
る。
イムノトキシンは上述の式1及びnによって藺単に表現
できる。しかし、2価共有ma−w−又は−W′は少な
くとも1分子のP及び少なくとも1分子のGPIR−1
aに結合さnる。蛋白質P及びGPIR−Jaとの結合
数は、結合操作中に含まれる上記蛋白質にある基の数に
よる。
できる。しかし、2価共有ma−w−又は−W′は少な
くとも1分子のP及び少なくとも1分子のGPIR−1
aに結合さnる。蛋白質P及びGPIR−Jaとの結合
数は、結合操作中に含まれる上記蛋白質にある基の数に
よる。
例えば、リシン自体のサブユニフ)Aを抗体P(例えば
抗体Tl0I )に結合してイムノトキシン全形底する
際、2硫化基を持つ2価の共有構!1!ヲ経て行なう場
合(ここで2硫化基の一方の硫黄はりシンの長期活性^
釧のシスティン257に属し、他方の硫黄はオキシプロ
ピル基によって抗体Pのチロシンのフェノール酸素と結
合している。)、下記統計的な式を有する。
抗体Tl0I )に結合してイムノトキシン全形底する
際、2硫化基を持つ2価の共有構!1!ヲ経て行なう場
合(ここで2硫化基の一方の硫黄はりシンの長期活性^
釧のシスティン257に属し、他方の硫黄はオキシプロ
ピル基によって抗体Pのチロシンのフェノール酸素と結
合している。)、下記統計的な式を有する。
P’(0−CO−CI−1,−CI(を8−8−人−g
a’)tここでIは結合中に含まルる抗体(例えば抗体
Tl0I )中のチロシンの数を示す−得らnたイムノ
トキシンは、式星の生産物に対応している。この式中、 P′は上述した通りであるが、とくに結合中に含まれて
いるチロシンのフェノール基を除去し九抗体T1θ1の
ラジカルである。
a’)tここでIは結合中に含まルる抗体(例えば抗体
Tl0I )中のチロシンの数を示す−得らnたイムノ
トキシンは、式星の生産物に対応している。この式中、 P′は上述した通りであるが、とくに結合中に含まれて
いるチロシンのフェノール基を除去し九抗体T1θ1の
ラジカルである。
入−ts′はシスティン257のチオール基を除去した
りシンの長期活性人鎖のラジカルであるO Wは下記の(C)基である。
りシンの長期活性人鎖のラジカルであるO Wは下記の(C)基である。
−Z−Y−E−8−4−(E’−Y’−Z’) n+こ
こで2は結合中に含まれるフェノールハイドロキシルの
酸素であり、Yは−co−、gFi不活性空間構造−C
H2−CH!−、nは0である^荷に好適なイムノトキ
シンはりシンの長期活性ナプユニット^と単一抗体Pと
を含むl又は2以上の構造物によって形式されたもので
、下式で示される。
こで2は結合中に含まれるフェノールハイドロキシルの
酸素であり、Yは−co−、gFi不活性空間構造−C
H2−CH!−、nは0である^荷に好適なイムノトキ
シンはりシンの長期活性ナプユニット^と単一抗体Pと
を含むl又は2以上の構造物によって形式されたもので
、下式で示される。
P’ (W’−A−1、’ ) m
ここでp/ 、 w/及び八−1,/は上述した通りで
ある。mは結合中に含まれる蛋白質PKIEする基の数
を示す。mの数は0.3〜12.好ましくは0.5〜1
0の範囲で変化する。
ある。mは結合中に含まれる蛋白質PKIEする基の数
を示す。mの数は0.3〜12.好ましくは0.5〜1
0の範囲で変化する。
rmtvFは0.3〜12、好ましくはO,S 〜10
の範囲で変化する。」とは、mの値は統計的な値である
ということである。なぜなら、抗体分子の中でに結合は
均一には生じないためである。従ってmは整数ではない
。
の範囲で変化する。」とは、mの値は統計的な値である
ということである。なぜなら、抗体分子の中でに結合は
均一には生じないためである。従ってmは整数ではない
。
mの値はとくに使用される抗体により、更には抗体の分
子量による。
子量による。
従りて断片Fib又はFab’を!に初の抗体Pとして
使用すると、mの価は0.3と約2の間で変化する。断
片F(ab’)tを使用すると、mは0、5と約4の間
で変化する。IgGタイプの抗体では、mは0.5と約
6との閣で変化する。抗体■gMではmは1と約12の
間で変化する。
使用すると、mの価は0.3と約2の間で変化する。断
片F(ab’)tを使用すると、mは0、5と約4の間
で変化する。IgGタイプの抗体では、mは0.5と約
6との閣で変化する。抗体■gMではmは1と約12の
間で変化する。
しかし、好ましくは抗体Pの置換の8度は、mが0.5
以上であり、10を越えないのがよい。
以上であり、10を越えないのがよい。
一般く、上述の構造式■及び1は、簡略式(記載さnた
一般式を示す。
一般式を示す。
同様に以下の式+V、V及び■はnが1のときはいつも
統計的な式である。なぜなら結合反応体は蛋白質P1及
びP、中から選択され、これら蛋白質は全て抗体Pとし
て上述の如く考慮されるものとしてまったく同じ性′X
を有している。
統計的な式である。なぜなら結合反応体は蛋白質P1及
びP、中から選択され、これら蛋白質は全て抗体Pとし
て上述の如く考慮されるものとしてまったく同じ性′X
を有している。
この場合蛋白’X P I及びP、は抗体P又は蛋白質
GPIR−1,自体であることを問わない。
GPIR−1,自体であることを問わない。
この発明の他の態様としては抗体と、すメソーム不活性
化抛タンパクとの間にジスルフィド又はチオエーテル型
の共有結合を有する長期作用型免f&福素の製造方法で
あつて、糖タンノIり(そのチオール基を適宜保超して
)を過ヨウ素酸アルカリ金jIi塩の水溶液で0〜15
℃で、光の不存在下で0.2〜24時間処理して得るよ
うにしたことを9?!1とする方法を提供する。
化抛タンパクとの間にジスルフィド又はチオエーテル型
の共有結合を有する長期作用型免f&福素の製造方法で
あつて、糖タンノIり(そのチオール基を適宜保超して
)を過ヨウ素酸アルカリ金jIi塩の水溶液で0〜15
℃で、光の不存在下で0.2〜24時間処理して得るよ
うにしたことを9?!1とする方法を提供する。
本発明の好ましい態様は上記構造■の免疫毒素の製造方
法であつて、タンノダクPI(リボソーム不活性化長期
作用!!7糖タンパク、GPIR−11又は抗体もしく
は抗体断片であって、遊離チオール基が直接又は介在原
子団を介して結合したもの)′をを水中液中温でタンノ
ぐりP。
法であつて、タンノダクPI(リボソーム不活性化長期
作用!!7糖タンパク、GPIR−11又は抗体もしく
は抗体断片であって、遊離チオール基が直接又は介在原
子団を介して結合したもの)′をを水中液中温でタンノ
ぐりP。
(’iと異なり、リボソーム不活性化長期作用型糖タン
/9り、GPIB −1a又は抗体もしくは抗体断片で
あってタンパクP、の遊離チオール基と結合し得る基を
有するもの)と反応させ、チオエーテル又はジスルフィ
ド結合を形成させること七脣徽とする方@を提供するも
のである。
/9り、GPIB −1a又は抗体もしくは抗体断片で
あってタンパクP、の遊離チオール基と結合し得る基を
有するもの)と反応させ、チオエーテル又はジスルフィ
ド結合を形成させること七脣徽とする方@を提供するも
のである。
本発明の物に好ましい態様は上記構造Uの免疫毒素の製
造法であって、P’、W’およびGPIR−1a’が上
記定義のものからなるもので、下記一般式のタンパク、
すなわち一般式、P、 ’ −(Z−Y−g) nS
Hのタンノヤクを一般式、 P、’−Z’−Y’−E’−G のタンノータと反応させることを特徴とする免疫毒素の
製造方法、 (ただし、式中P、′およびP、′はこnらタンパクに
属する基に結合されたタンノシクP、およびP富のラジ
カル、又はP、およびP、が抗体もしくは抗体断片であ
るときは過ヨウ素酸との反応によp糖鎖核の開鎖によシ
生じたタンパクP。
造法であって、P’、W’およびGPIR−1a’が上
記定義のものからなるもので、下記一般式のタンパク、
すなわち一般式、P、 ’ −(Z−Y−g) nS
Hのタンノヤクを一般式、 P、’−Z’−Y’−E’−G のタンノータと反応させることを特徴とする免疫毒素の
製造方法、 (ただし、式中P、′およびP、′はこnらタンパクに
属する基に結合されたタンノシクP、およびP富のラジ
カル、又はP、およびP、が抗体もしくは抗体断片であ
るときは過ヨウ素酸との反応によp糖鎖核の開鎖によシ
生じたタンパクP。
およびP、05ジカル、Z、Z’、Y、Y’、g、g’
は前記同様、Gは (九だし、Xは活性化基)である) を提供するものである。
は前記同様、Gは (九だし、Xは活性化基)である) を提供するものである。
したがって上記PおよびGPIR−1a Fi下記の基
金逼宜含むタンノダクである、 (1) 結合に関与するチオール基又はその他の晶、
(2) 上記チオール基と反応しジスルフィド又はチ
オエステル結合を形底し得る1以上の官能基。
金逼宜含むタンノダクである、 (1) 結合に関与するチオール基又はその他の晶、
(2) 上記チオール基と反応しジスルフィド又はチ
オエステル結合を形底し得る1以上の官能基。
本発明によれば上記チオール基および官能基は天然のタ
ンノヤクP又はGPIR−1a、又はこれらを人工的に
導入し之ものである。
ンノヤクP又はGPIR−1a、又はこれらを人工的に
導入し之ものである。
リボソームを不活性化し、過ヨウ素酸塩で酸化するため
に出発物質として用いられる糖タンノ臂りはすべてGP
IR,たとえばリシンA鎖であり、こnらはそn目体、
細胞毒性が極めてわずかである。なぜならばこnらは細
胞に付着することができない。他方、特定の細胞を認識
する抗体と結合したのちは、この抗体が目標glli!
2を認臓したときはこれら細胞に対し細胞毒性が極めて
大きいものとなる。
に出発物質として用いられる糖タンノ臂りはすべてGP
IR,たとえばリシンA鎖であり、こnらはそn目体、
細胞毒性が極めてわずかである。なぜならばこnらは細
胞に付着することができない。他方、特定の細胞を認識
する抗体と結合したのちは、この抗体が目標glli!
2を認臓したときはこれら細胞に対し細胞毒性が極めて
大きいものとなる。
代表的な出発化合物は、リシンの^頒、グミーニン及び
モモルデイカ カランテイス(ML)M )からの抽出
操作により得られた抽出物質である。
モモルデイカ カランテイス(ML)M )からの抽出
操作により得られた抽出物質である。
過ヨウ素酸イオンとの酸化に用いる出発物質として有用
な他の0FIn−は、以下の通シでらる0 ・ディアンチン30 (Dianthin 30 )デ
ィアントロス カリ夏フィルス(DinnthumCa
ryophyljum )から ―デ4.7 ンf ン32 (Diarithin 3
2 )ティアントフス カリyフィルス(Dianth
usCsryophyljus )から ゆアグクスティンA (Agrostin A)アゲロ
ステーマ シターゴ(Agroi lemmagith
ago )から 費アゲCrXテ478 (Agroa(in B )7
グロステーマ ジターゴ(^grostemm*g自b
ag□ )から ・アy o xテ4 ンC(Agrostin C)ア
ゲロステーマ ジターゴ(^groslemmagi
tbmgo )から −I(CI フラ クレビタンス(Hura crepitans)
から1アスパラゲス オフィテナリス阻害剤アスパラゲ
ス オフィf f リス(Aspa rmguioff
jeinaNa ) カら この目的のために遺伝子IJ:J1:修飾した細胞で生
合成的に生産された同じ物質も、ま九適当な化合物であ
る。
な他の0FIn−は、以下の通シでらる0 ・ディアンチン30 (Dianthin 30 )デ
ィアントロス カリ夏フィルス(DinnthumCa
ryophyljum )から ―デ4.7 ンf ン32 (Diarithin 3
2 )ティアントフス カリyフィルス(Dianth
usCsryophyljus )から ゆアグクスティンA (Agrostin A)アゲロ
ステーマ シターゴ(Agroi lemmagith
ago )から 費アゲCrXテ478 (Agroa(in B )7
グロステーマ ジターゴ(^grostemm*g自b
ag□ )から ・アy o xテ4 ンC(Agrostin C)ア
ゲロステーマ ジターゴ(^groslemmagi
tbmgo )から −I(CI フラ クレビタンス(Hura crepitans)
から1アスパラゲス オフィテナリス阻害剤アスパラゲ
ス オフィf f リス(Aspa rmguioff
jeinaNa ) カら この目的のために遺伝子IJ:J1:修飾した細胞で生
合成的に生産された同じ物質も、ま九適当な化合物であ
る。
上記GPIRzのフラグメントは、もしそれらが元のG
PfRft%徴付ける不活性リゲソームの全部または一
部の性′Xtを保持しているとするならば、同様に出(
l!!初寅として用いることができる0 リシンの天然の^鎖のうち、チオール基の少なくとも一
つが保護さ九ているものは好ましい出発物質である。
PfRft%徴付ける不活性リゲソームの全部または一
部の性′Xtを保持しているとするならば、同様に出(
l!!初寅として用いることができる0 リシンの天然の^鎖のうち、チオール基の少なくとも一
つが保護さ九ているものは好ましい出発物質である。
リシンの細枠の入蜆の製造については、米国特許第43
40535号に記載されている。グローニン及びMOM
についても記載さnている。
40535号に記載されている。グローニン及びMOM
についても記載さnている。
出発物質におけるチオール基の保禮は、そのチオール基
が抗体との結合に用^らnるものである場合にのみ必要
とさnる。例えばテロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、n記の保獲
は行なわれない。
が抗体との結合に用^らnるものである場合にのみ必要
とさnる。例えばテロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、n記の保獲
は行なわれない。
保dのためのブロッキングは、”H九t、引続いて還元
反応ま九はチオール/ジスルフィド変換反応で除去でき
るような官能基で置換することができるような試薬、例
えば2.2−ジニトロ−5,5−ジベンゾジ安息香酸(
DTNB)、或いri3−(ヒIjシンー2−イルージ
スルフ7ニル)ブaピオン酸等との反応によって行なわ
れる。
反応ま九はチオール/ジスルフィド変換反応で除去でき
るような官能基で置換することができるような試薬、例
えば2.2−ジニトロ−5,5−ジベンゾジ安息香酸(
DTNB)、或いri3−(ヒIjシンー2−イルージ
スルフ7ニル)ブaピオン酸等との反応によって行なわ
れる。
このような試薬が存在しない条件下では、^鎖中の遊i
afオール基は酸化反応中に消失してしまい、たとえ2
−メルカプトエタノールのような還元剤との反応によっ
ても全体的に再生することはできない。過剰のブロック
剤は透析により除去する。
afオール基は酸化反応中に消失してしまい、たとえ2
−メルカプトエタノールのような還元剤との反応によっ
ても全体的に再生することはできない。過剰のブロック
剤は透析により除去する。
リボソームを不活性化する糖蛋白(そのチオール基がブ
ロックさ几たもの)は、次いで過ヨウ素酸イオンとの酸
化を受ける。他方、もし細胞aチプユニットがチオール
を含まず、或いはチオールまたはtオール績が結合に用
いられないならば、上記のブロッキングは行なわれない
。
ロックさ几たもの)は、次いで過ヨウ素酸イオンとの酸
化を受ける。他方、もし細胞aチプユニットがチオール
を含まず、或いはチオールまたはtオール績が結合に用
いられないならば、上記のブロッキングは行なわれない
。
過ヨウ素酸による酸化反応はpH3〜7、好ましくは5
〜6.5の酸性下で実施される。過ヨウ素酸塩は過11
J Ic用いる。よシ望ましくは、過ヨウ素酸アルカリ
金属塩の11度が、酸化さるべきビチナルジオールの濃
度よりも高くなるようにする。例えば、繻胞嵩すブユニ
ットa度1〜10 mg/ml;に対し、過ヨウ#:酸
ナトリウム濃實はlO〜50 m Mが適している。処
理は0〜15℃、好“ましくは1〜5℃の暗所において
、0.2〜24時間行なう。
〜6.5の酸性下で実施される。過ヨウ素酸塩は過11
J Ic用いる。よシ望ましくは、過ヨウ素酸アルカリ
金属塩の11度が、酸化さるべきビチナルジオールの濃
度よりも高くなるようにする。例えば、繻胞嵩すブユニ
ットa度1〜10 mg/ml;に対し、過ヨウ#:酸
ナトリウム濃實はlO〜50 m Mが適している。処
理は0〜15℃、好“ましくは1〜5℃の暗所において
、0.2〜24時間行なう。
残存する過ヨウ*#壇金消費する試薬、例えば過剰のエ
チレングリコールの添加によって反応を停止させ、副生
g物を透析により除去する。
チレングリコールの添加によって反応を停止させ、副生
g物を透析により除去する。
反応終了時に得らルた生成物は、通常の手法により単層
する。
する。
もし出発物質のチオール基がプayりさルて−れば、公
知の方法でブロッキングを解除する。
知の方法でブロッキングを解除する。
例えば2−メルカプトエタノールのよう(、ブロックさ
九る前のチオール基を遊離させ得る還元剤と反応させれ
ばよい。これにより、す〆ソームを不活性化するII低
蛋白新規な持続作用が与えられ、これは抗体と結合して
免疫毒素を得るために用いることができる。
九る前のチオール基を遊離させ得る還元剤と反応させれ
ばよい。これにより、す〆ソームを不活性化するII低
蛋白新規な持続作用が与えられ、これは抗体と結合して
免疫毒素を得るために用いることができる。
リシンの^鎖の場合、この方法で得られる新しい分子(
以下記号^−1で表わす)は、次の主要な性質を有して
いる。
以下記号^−1で表わす)は、次の主要な性質を有して
いる。
・分子t1は、天然の人頌の分子量とそnはど変らない
。ポリアクリルアミドにょるイ気泳動で観察する1り、
この修飾反応は極く少量の蛋白質の宜曾体を生成するだ
けで、分解生成物は何等生じない◇ −aa+オール基の比率は、Q、7./molヨりも大
きい。
。ポリアクリルアミドにょるイ気泳動で観察する1り、
この修飾反応は極く少量の蛋白質の宜曾体を生成するだ
けで、分解生成物は何等生じない◇ −aa+オール基の比率は、Q、7./molヨりも大
きい。
・リシンの^@七基準とした兎抗体に対する免疫反応時
性は、天然の^鎖のそnと区別できない。
性は、天然の^鎖のそnと区別できない。
・無細胞系における蛋白曾成の阻害活性は、等社の天然
^偵で生じるものの50%より大きい0 ・最後に、兎に約0.4mg/Kg体重の投与量で一回
静脈注射した後、静注後23時間での血流中における長
期作用型へ鎖(^−1)の血漿レベルは、投与時おける
血漿レベルの10%よシも大きい(天然へ鎖の場合のこ
の時点での値は0.015%であるから、血漿レベルの
上昇因子は5゛00倍よシもかなシ大きい)。
^偵で生じるものの50%より大きい0 ・最後に、兎に約0.4mg/Kg体重の投与量で一回
静脈注射した後、静注後23時間での血流中における長
期作用型へ鎖(^−1)の血漿レベルは、投与時おける
血漿レベルの10%よシも大きい(天然へ鎖の場合のこ
の時点での値は0.015%であるから、血漿レベルの
上昇因子は5゛00倍よシもかなシ大きい)。
同様く、r口一二ンの場合に過ヨウ素酸酸化により得ら
れる分子は次の主要な性質を有している。
れる分子は次の主要な性質を有している。
・分子量は、天然のグa−二ンの分子量七それほど変ら
ない。
ない。
・抗グローニン兎抗体に対する免疫反応時性は、天然の
グローエンの反応特性と区別できない。
グローエンの反応特性と区別できない。
・最後に、兎に約0.3 m g /Kg体重の投与量
で一回静脈注射した後、静注後24時間での血流中にお
ける修飾グローニンのff1L漿レベルは、投与時にお
ける血漿レベルの3%よりも大きい(天然グローニンの
場合のこの時点での値は0.01%であるから、血漿レ
ベルの上昇因子は200倍よりも大きい)。
で一回静脈注射した後、静注後24時間での血流中にお
ける修飾グローニンのff1L漿レベルは、投与時にお
ける血漿レベルの3%よりも大きい(天然グローニンの
場合のこの時点での値は0.01%であるから、血漿レ
ベルの上昇因子は200倍よりも大きい)。
リボソームを不活性化する長期作用型S+*白から結合
体、即ち免疫ffi素を調製するには、米国特許第43
40535号く記載されている方法のなかから適当に選
択した方法を用いればよい。もし、選択した細胞毒チプ
ユニットが、結合に逼した少なくとも一つのチオール基
を天然に含んでいるならば、この基は活性化さルたジス
ルフィド基をもつた抗体または抗体フラグメントとの反
応に好適に用いられる。もし、選択した細胞毒サブユニ
ットが、結合に適したチオール基を天然には含んでいな
いならば、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の後、遊離チ
オールをもった少なくとも一つの官能基を公知の何等か
の方法で人為的に1紀ナプユニツトに導入し、上記の結
合反応f:lle行する。
体、即ち免疫ffi素を調製するには、米国特許第43
40535号く記載されている方法のなかから適当に選
択した方法を用いればよい。もし、選択した細胞毒チプ
ユニットが、結合に逼した少なくとも一つのチオール基
を天然に含んでいるならば、この基は活性化さルたジス
ルフィド基をもつた抗体または抗体フラグメントとの反
応に好適に用いられる。もし、選択した細胞毒サブユニ
ットが、結合に適したチオール基を天然には含んでいな
いならば、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の後、遊離チ
オールをもった少なくとも一つの官能基を公知の何等か
の方法で人為的に1紀ナプユニツトに導入し、上記の結
合反応f:lle行する。
前記官能基の導入は、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の
前、i九は酸化処理の後のどの段階で行なってもよい。
前、i九は酸化処理の後のどの段階で行なってもよい。
但し、酸化処理の旧に行なう場合には、酸化処理の閣は
チオール基をブロックしておき、酸化処理の後に七のブ
ロックを解除する必要がある。
チオール基をブロックしておき、酸化処理の後に七のブ
ロックを解除する必要がある。
ヒトの癌細胞に対するモノクロ−゛ナル抗体の調製につ
いては、既に科学文献で広く報告されており、また現在
では多数のこ几ら抗体が商業的に入手可能である。
いては、既に科学文献で広く報告されており、また現在
では多数のこ几ら抗体が商業的に入手可能である。
本発明の方法において、GPIR−1−と抗体(または
抗体フラグメント)との化学的な結合は、結合体の二つ
の成分(抗体およびGPN?−1a)の夫々の生物学的
活性を保持し、満足すべき再現性および艮好な収率で結
合体が得らn5ま九慢ら几た結合体中におけるGjJI
R−1a/抗体の比率制御を可能とすると共に、更には
安定且つ水溶性の生成物に導くような方法で行なうこと
ができる。
抗体フラグメント)との化学的な結合は、結合体の二つ
の成分(抗体およびGPN?−1a)の夫々の生物学的
活性を保持し、満足すべき再現性および艮好な収率で結
合体が得らn5ま九慢ら几た結合体中におけるGjJI
R−1a/抗体の比率制御を可能とすると共に、更には
安定且つ水溶性の生成物に導くような方法で行なうこと
ができる。
こnらの特徴に対応し恵方法の中で、二つの蛋白の間の
結合形成において、ltたは2以上のチオール基を含む
ものを優先すべきである。
結合形成において、ltたは2以上のチオール基を含む
ものを優先すべきである。
事実、こnらのチオール基は、ジスルフィド結合または
チオエーテル結合の形成に籍に適し、両者共に上記の一
般的条件を満たす◎同時に免疫1a素の調製についても
以下の特徴を有している。
チオエーテル結合の形成に籍に適し、両者共に上記の一
般的条件を満たす◎同時に免疫1a素の調製についても
以下の特徴を有している。
・リシンの^鎖と抗体との間の共有結合は、ジスルフィ
ド基を含んでいる。
ド基を含んでいる。
・ジスルフィド結合を形成している硫黄原子の一つは、
常り、リシン^鎖の257位置(での7ステイン残基に
属する硫黄原子である。
常り、リシン^鎖の257位置(での7ステイン残基に
属する硫黄原子である。
・まな、リシンのA鎖を抗体く結合するリンクは、抗体
のNH,側基またはペプチド鎖の末端基に結合しており
、抗体とりシン^鎖とのカップリングによシ形成さnる
◇これらについては、米国荷許第4340535号に詳
細に記載されている。
のNH,側基またはペプチド鎖の末端基に結合しており
、抗体とりシン^鎖とのカップリングによシ形成さnる
◇これらについては、米国荷許第4340535号に詳
細に記載されている。
同じ方法が、同様の特徴を有し、且つ抗体または抗体フ
ラグメントとGPIR−1aとの結合で形成さnる免疫
毒素−のtJs製にも適用できる。
ラグメントとGPIR−1aとの結合で形成さnる免疫
毒素−のtJs製にも適用できる。
抗体または抗体フラグメントとGPIR−1aとの結合
、及び異なつた官能基におけるジスルフィドtfF、は
チオエーテル型の共有結合によシ形成される免疫違素癲
の調製について、以下に詳細に説明する。
、及び異なつた官能基におけるジスルフィドtfF、は
チオエーテル型の共有結合によシ形成される免疫違素癲
の調製について、以下に詳細に説明する。
一般的に、峙り交叉結合の乱れを排除して蛋白間くうま
く結合反応を行なうため(は、安定屯で且つ明確に定ま
った共有結合が形成されるように、結合さるべき一方の
蛋白(一方のみ)は使用さnるチオールまたはチオール
基だけを有し、他方の蛋白はpH5〜9.30℃を越え
ない温度の水性媒質中においてtオール虜と反応し得る
1または2以上の基のみを有することが重要である。
く結合反応を行なうため(は、安定屯で且つ明確に定ま
った共有結合が形成されるように、結合さるべき一方の
蛋白(一方のみ)は使用さnるチオールまたはチオール
基だけを有し、他方の蛋白はpH5〜9.30℃を越え
ない温度の水性媒質中においてtオール虜と反応し得る
1または2以上の基のみを有することが重要である。
以下に詳細に説明するように、蛋白P、およびP鵞の特
徴は出発吻實として用いらnる。Bの立体構造は、より
好ましい構造R〜RB(これは実施例としてのみ与えら
ルる)に直代えることができる。
徴は出発吻實として用いらnる。Bの立体構造は、より
好ましい構造R〜RB(これは実施例としてのみ与えら
ルる)に直代えることができる。
1、 タンパクp。
このタンノ臂りは、どんなm曾も結合に関与する1つか
1つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況は
タン・臂りPlの性′XK応じて異なる。
1つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況は
タン・臂りPlの性′XK応じて異なる。
(^) 天然の状態でタンパクP1は、夕ンパクP、と
の結合に関与する1つ以上のチオール基を有している。
の結合に関与する1つ以上のチオール基を有している。
このことは!に次のような場合に言える。すなわち、タ
ンパクP、が、ペプシンの存在下で抗体を限定分解し、
続いて高分子間のジスルフィド結合を還元して通常得ら
れるようなF (ab )’として知られる抗体断片で
ある場合である。このことは、タン/デクPIがリシン
の^鎖またはAilの誘導体である場合にもあてはまる
。この場合、天黙りシンの171誉目のシスティン残基
および257f目のシスティン残基に付いている少なく
とも1つのチオール哉が未結合であって化学結合を庄じ
ゃすい。
ンパクP、が、ペプシンの存在下で抗体を限定分解し、
続いて高分子間のジスルフィド結合を還元して通常得ら
れるようなF (ab )’として知られる抗体断片で
ある場合である。このことは、タン/デクPIがリシン
の^鎖またはAilの誘導体である場合にもあてはまる
。この場合、天黙りシンの171誉目のシスティン残基
および257f目のシスティン残基に付いている少なく
とも1つのチオール哉が未結合であって化学結合を庄じ
ゃすい。
これらすべての場合において、天然のチオール基を有す
るタンパクP、はこのような状態で結合工程に使用され
る。
るタンパクP、はこのような状態で結合工程に使用され
る。
(Bl 天然の状態でタンパクP、は、タンノダクP
、との結合に関与するチオール基を有していない。この
ことは峙に次のような場合に言える。
、との結合に関与するチオール基を有していない。この
ことは峙に次のような場合に言える。
すなわち、タンパクPKが天然の免疫グミプリンであつ
て、抗体全体か抗体の断片時に通常F(−b )’また
はF(ab)と呼ばれる断片の1つである場合。天然の
状態でタン/#りPIが結合に関与する1つのチオール
基を持たない場合のいま1つの例は、このタンパクP1
が、2つのシスティン残基それぞれがアルキル化により
探題されているか、または化学修飾を受けないリシンの
^鎖である場合である。全ての場合において、結合を可
能にする1つ以上のチオール基をそのような分子に導入
することが妥当といえる03つの型の反応がチオール基
を導入する丸めに好ましく用いられる。
て、抗体全体か抗体の断片時に通常F(−b )’また
はF(ab)と呼ばれる断片の1つである場合。天然の
状態でタン/#りPIが結合に関与する1つのチオール
基を持たない場合のいま1つの例は、このタンパクP1
が、2つのシスティン残基それぞれがアルキル化により
探題されているか、または化学修飾を受けないリシンの
^鎖である場合である。全ての場合において、結合を可
能にする1つ以上のチオール基をそのような分子に導入
することが妥当といえる03つの型の反応がチオール基
を導入する丸めに好ましく用いられる。
(1) 最初の型の反応は、S−アセtルメルカブト
コへり酸無水物との反応である。この酸無水物は、タン
パクのアミノ基のア七デル化を可能にする。その後当該
チオール基をヒドロキシアミンと反応させることにより
てアセチル保諌基を除くことができる。この方法はすで
にアーテープズ・オプ・バイオケミストリー・アンド拳
バイオフイジクス(Archives of Bloc
hemi −airy sod Biophysjcm
)、119 、41−49(1967)に記載されて
いる。このように保護基が導入されたチオール基を続い
て活性型ジスルフィド基と反応させる場合、ヒドロキシ
アミンによって前もつて保護基をはずさなくて済む1l
iJ脂性がある。事実、この発明の物質を形成する反応
体を使ってジスルフィド結合を形成する反応は、遊離チ
オール基金使つた場合と同様KS−アセチル基を使つて
も生じる。
コへり酸無水物との反応である。この酸無水物は、タン
パクのアミノ基のア七デル化を可能にする。その後当該
チオール基をヒドロキシアミンと反応させることにより
てアセチル保諌基を除くことができる。この方法はすで
にアーテープズ・オプ・バイオケミストリー・アンド拳
バイオフイジクス(Archives of Bloc
hemi −airy sod Biophysjcm
)、119 、41−49(1967)に記載されて
いる。このように保護基が導入されたチオール基を続い
て活性型ジスルフィド基と反応させる場合、ヒドロキシ
アミンによって前もつて保護基をはずさなくて済む1l
iJ脂性がある。事実、この発明の物質を形成する反応
体を使ってジスルフィド結合を形成する反応は、遊離チ
オール基金使つた場合と同様KS−アセチル基を使つて
も生じる。
文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。
にチオール基を導入するために使うことができる。
(2)第2の型の反応はタンパクをカルボキシル基を介
して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジア
ミノ分子と反応させることである。
して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジア
ミノ分子と反応させることである。
H,N−R,−8−8−R1−NH1
上式中、R1は炭素数2から5の脂肪族原子団である。
この反応では、カルボジイミド%に1−エチル−3ジメ
tルアミ/プaピル−3−カルメジイミドのような水溶
性の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
[”R1−−(CIt)を]と反応させ、用いた化学1
論tK応じて次に示す誘(体の1つか双方の混合物を形
成させることが好ましい。
tルアミ/プaピル−3−カルメジイミドのような水溶
性の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
[”R1−−(CIt)を]と反応させ、用いた化学1
論tK応じて次に示す誘(体の1つか双方の混合物を形
成させることが好ましい。
Pr ’−CO−N H−RI−R3−S −RをN
H* (l m )P、’−Co−NH−R,−
8−8−R,−N)(−Co−P、 (lりこの夕の反
応生1!1.′aは次の2つの工程のいずれかに供され
る。
H* (l m )P、’−Co−NH−R,−
8−8−R,−N)(−Co−P、 (lりこの夕の反
応生1!1.′aは次の2つの工程のいずれかに供され
る。
(1) 式11ま九は1bにおいて、タンパクP。
がリシンの^鎖またはその誘導体の1種ならば、得られ
た反応溶液は分別せずに2−メルカプトエタノールのよ
うな還元剤との反応に供せられる。それによつて次式の
1植函のタンパク誘導体が得られる。
た反応溶液は分別せずに2−メルカプトエタノールのよ
うな還元剤との反応に供せられる。それによつて次式の
1植函のタンパク誘導体が得られる。
P、 ’−〇〇N)(−R,−8)(
こうして得られた生成物は続いて透析かグル濾過によ)
精製される。
精製される。
(b) 式12およびIbにおいて、ラジカルP、′
が抗体またはその断片の1種から成る、タンパクPのラ
ジカルならば、得られた反応溶液はそのtまカップリン
グに用いられ、その場合チオール/ジスルフィド交換法
が用いられる。この交換法は、例えばギリランド(GN
I口and ) トコリエール(Co11ier )
Kよってキャンナー・リサーチ(Cancer Re5
ercb ) 、40.3564(x9so)K記載さ
れている。
が抗体またはその断片の1種から成る、タンパクPのラ
ジカルならば、得られた反応溶液はそのtまカップリン
グに用いられ、その場合チオール/ジスルフィド交換法
が用いられる。この交換法は、例えばギリランド(GN
I口and ) トコリエール(Co11ier )
Kよってキャンナー・リサーチ(Cancer Re5
ercb ) 、40.3564(x9so)K記載さ
れている。
(3) 第3の反応は、導入しようとするチオールを
有するラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことで
ある。このII[1位は天然の状態で抗体に#圧してい
るものである。続いてタンパクは、S鎖単位にアルデヒ
ド基を生じさせる丸めに過ヨウ素酸で酸化される。過剰
の工tレンゲリコールを加えて反応を停止させ、副産物
と過剰の反応体を透析によシ除いた後、得られた成生物
を次の一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。
有するラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことで
ある。このII[1位は天然の状態で抗体に#圧してい
るものである。続いてタンパクは、S鎖単位にアルデヒ
ド基を生じさせる丸めに過ヨウ素酸で酸化される。過剰
の工tレンゲリコールを加えて反応を停止させ、副産物
と過剰の反応体を透析によシ除いた後、得られた成生物
を次の一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。
H,N−R,−8−8−R,−NH。
上式中R3は炭素数2ないし5の脂肪!!に量である。
得られた付加生成物は、続いて金属水素化物(轡には、
水素化ホウ素ナトリ9ム)との反応により第2または第
3アミンに還元される。この反応はシスタミンCR+−
一(CHy)を)を用いて実施することが好ましく、用
いた化学を論量に応じて次式のIn体の1方かその両方
の混合物が形成される。
水素化ホウ素ナトリ9ム)との反応により第2または第
3アミンに還元される。この反応はシスタミンCR+−
一(CHy)を)を用いて実施することが好ましく、用
いた化学を論量に応じて次式のIn体の1方かその両方
の混合物が形成される。
H
H
得られた反応液を、!atたはlbの構造式で表わされ
る生成物であって21′が抗体または抗体断片であるも
のく関して上記し九とお)の処理を行なってもよい。
る生成物であって21′が抗体または抗体断片であるも
のく関して上記し九とお)の処理を行なってもよい。
チオール基を人工的に導入(対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ)するための上に述べた後二者の
反応において、タンパクP。
ド反応体を使うタイプ)するための上に述べた後二者の
反応において、タンパクP。
は遊離8 H基または遊離アミノ基を持たないことが好
ましい。^鑓とその誘導体の場合には、N−エチルマレ
イミドまたはヨード酢酸のようなチオール基に対する通
常の試薬との反応により天然のチオール基をアルキル化
し、およびミイーンズ(MEAN8)およびフィーニー
(FF、ENEY)によってバイオケミストリー(Bi
ochemj s t ry )7.2192(19
68)K記載された還元的メチル化法に従って天然のN
H,基をメチル化することによシ常に遊離のチオール基
を持たなくさせ得る。このようにして天黙りシンの^鎖
に1モル当り6個までのメチル基を導入することができ
る。このようにして修飾されたタンパクには、生物学的
な荷性(脣には、真核細胞のリボソームにおけるタンパ
ク合成を阻害する能力)が備わっている。抗体または抗
体断片さらに8g1群のすべての物質の場合には、1記
したようにそれらは天然の遊、1isH基を持たないの
で、還元的メチル化を例えばミーンズおよびフィーニー
の方法により実施するほうがよい。このようにして通常
抗体1モル当)数十のメチル基を導入することができる
。その場合抗体の細胞表面上の抗原を認識する能力を変
化させない。
ましい。^鑓とその誘導体の場合には、N−エチルマレ
イミドまたはヨード酢酸のようなチオール基に対する通
常の試薬との反応により天然のチオール基をアルキル化
し、およびミイーンズ(MEAN8)およびフィーニー
(FF、ENEY)によってバイオケミストリー(Bi
ochemj s t ry )7.2192(19
68)K記載された還元的メチル化法に従って天然のN
H,基をメチル化することによシ常に遊離のチオール基
を持たなくさせ得る。このようにして天黙りシンの^鎖
に1モル当り6個までのメチル基を導入することができ
る。このようにして修飾されたタンパクには、生物学的
な荷性(脣には、真核細胞のリボソームにおけるタンパ
ク合成を阻害する能力)が備わっている。抗体または抗
体断片さらに8g1群のすべての物質の場合には、1記
したようにそれらは天然の遊、1isH基を持たないの
で、還元的メチル化を例えばミーンズおよびフィーニー
の方法により実施するほうがよい。このようにして通常
抗体1モル当)数十のメチル基を導入することができる
。その場合抗体の細胞表面上の抗原を認識する能力を変
化させない。
■ タンパクpt
あらゆる場合、このタン/−りは、タン/4りP。
のチオール基と反応してジスルフィドまたはチオエーテ
ル結合を形成し得る1つ以上の官能基を有するタン・ぐ
りである。これらの官能基は、常にタンパクP!に人工
的に導入されるが、それがジスルフィド結合によシカツ
ブリングされるのかチオエーテル結合によりカップリン
グされるのかに応じて異なっている。具体的には以下に
記載する。
ル結合を形成し得る1つ以上の官能基を有するタン・ぐ
りである。これらの官能基は、常にタンパクP!に人工
的に導入されるが、それがジスルフィド結合によシカツ
ブリングされるのかチオエーテル結合によりカップリン
グされるのかに応じて異なっている。具体的には以下に
記載する。
(1) ジスルフィド結合
この場合、包合体のU!Aは以下の式で表わされる。
P、’−(Z−Y−g)n−3H十F、’−Z’−Y’
−B’−8−8−X→P、 ’−(Z−Y−E)n−8
−8−Ej−Y’−Z’−Pt’−f−X−SH。
−B’−8−8−X→P、 ’−(Z−Y−E)n−8
−8−Ej−Y’−Z’−Pt’−f−X−SH。
活性イオウ原子により置換されるタン/4りP!はタン
ノイクP!または適切に保護されたタンパクP!からそ
れ目体活性イオウ原子を有する試薬による置換により得
られる。これは次の式で示される。
ノイクP!または適切に保護されたタンパクP!からそ
れ目体活性イオウ原子を有する試薬による置換により得
られる。これは次の式で示される。
P 、−)−f、−Y’−R−8−8−X−+P、 ’
−Z’−Y−R’−8−8−X上式中、P、は置換され
るべきタン・ダクを示し、L−Y’は試薬をタンパクに
共有結合させる基を示す。官能基L−Y’は、置換され
るべきタンパクの構成アミノ酸の側鎖に付いているいず
れか1つの基と共有結合し得る基である。これらの基の
中で、特に次のものが選び出せる。
−Z’−Y−R’−8−8−X上式中、P、は置換され
るべきタン・ダクを示し、L−Y’は試薬をタンパクに
共有結合させる基を示す。官能基L−Y’は、置換され
るべきタンパクの構成アミノ酸の側鎖に付いているいず
れか1つの基と共有結合し得る基である。これらの基の
中で、特に次のものが選び出せる。
(al ヘプt)鑓の末端アミ7基またはタンパクに
含まれるリシン残基のアミ7基。この場合、L−Y’は
時に次のように表わせる。
含まれるリシン残基のアミ7基。この場合、L−Y’は
時に次のように表わせる。
・カルメジイミド、符に1−エチル−3−ジメチルアミ
/プロピル−3−カルメジイミドの如き水溶性誘導体の
ようなカップリング剤の存在下でタンノダクのアミノ基
と結合し優るカルボキシル基。
/プロピル−3−カルメジイミドの如き水溶性誘導体の
ようなカップリング剤の存在下でタンノダクのアミノ基
と結合し優るカルボキシル基。
・アミ7基とi!接反応して、それをアシル化し辱るカ
ルゲン酸塩化物。
ルゲン酸塩化物。
豐オルト−または/4ラーニトロフェニルfりtf−ジ
ニトロフェニルエステル、i ft p’i N−ヒト
ミキシコハク酸イミドエステルのようないわゆる「活性
型」エステル。これはアミ7基とI[接反応して、それ
をアシル化し得る。
ニトロフェニルエステル、i ft p’i N−ヒト
ミキシコハク酸イミドエステルのようないわゆる「活性
型」エステル。これはアミ7基とI[接反応して、それ
をアシル化し得る。
・フハクtR無水物のようなジヵルーン酸の内部無水物
。これはアミ7基と自然に反応して、アミド結合を形成
させる。ま九は ・イミとエステル基 上式中、R2はアルキル基で、次式のようにタンパク?
tのアミン基と反応する。
。これはアミ7基と自然に反応して、アミド結合を形成
させる。ま九は ・イミとエステル基 上式中、R2はアルキル基で、次式のようにタンパク?
tのアミン基と反応する。
上式中、R1は−R−8−8X基を示す。
[b) タンパクに含まれるチロシン残基のフェノー
ル基。この場合、L−Y’は峙にイミダゾール−1−イ
ルカルボニル基を示すことがある。
ル基。この場合、L−Y’は峙にイミダゾール−1−イ
ルカルボニル基を示すことがある。
それは次の弐に従ってタンノ櫂りの7エノール基と反応
する。
する。
上式中、Lがイミダゾール−1−イルで y/がCo玉
で、R4が−R−8−8−X基である。
で、R4が−R−8−8−X基である。
−5−S−Xはa離チオール基と反応し得る活性型ジス
ルフィドを示す。神に、このジスルフィドにおいて、X
#i1つ以上のアルキル、へログンまたはカルボキン基
で置換されていることのあるピリジン−2−イルまたは
ピリジン−4−イル基を指すことがある。Xもまた1つ
以上のフェニル基またはカルボキシル基で好ましくは置
換されているフェノール&を指すことがある。
ルフィドを示す。神に、このジスルフィドにおいて、X
#i1つ以上のアルキル、へログンまたはカルボキン基
で置換されていることのあるピリジン−2−イルまたは
ピリジン−4−イル基を指すことがある。Xもまた1つ
以上のフェニル基またはカルボキシル基で好ましくは置
換されているフェノール&を指すことがある。
またはXはメトキシカルボニル基のようなアルコキシカ
ルボニル基を指すこともある。
ルボニル基を指すこともある。
Riは、ram?Isy’*よび5−s−xを同時に結
合し得る介在分子(削成中の8のような)を示す。それ
は、後の反応において、使用される反応物質と合成され
る庄成物を妨害するような基を含まないようなものでな
ければならない。をに、R基ペー(CHt)−でもちり
得(nは1ないしio)、−tた次の基でもあ)得る。
合し得る介在分子(削成中の8のような)を示す。それ
は、後の反応において、使用される反応物質と合成され
る庄成物を妨害するような基を含まないようなものでな
ければならない。をに、R基ペー(CHt)−でもちり
得(nは1ないしio)、−tた次の基でもあ)得る。
上式中、R6は水素または炭素alないし8のアルキル
基を指し、R1は続いて使われる次式のカルカルバメイ
ト基のような反応体に不活性な置換基を指す。
基を指し、R1は続いて使われる次式のカルカルバメイ
ト基のような反応体に不活性な置換基を指す。
−NH−C−OR。
上式中、8丁は炭素数1から5の直@または分枝アルキ
ル基、台に第3ブチル基を示す。化合物L−Y’−R−
8−8−Xとタン1フ2重との反応は均質な液相、鰻も
一般的には水または緩閏液中で進行する。反応体の溶解
性を高めるには、水に可溶性の有接溶媒を反応溶液に加
えることができる。その最終S度を、第3ブタノールの
ような第3アルコールの場合には容量比で20%までに
することができ、ジメチルホルムアミドまたはテトラヒ
ドロ7ランの場合には容量比で10%までにすることが
できる。
ル基、台に第3ブチル基を示す。化合物L−Y’−R−
8−8−Xとタン1フ2重との反応は均質な液相、鰻も
一般的には水または緩閏液中で進行する。反応体の溶解
性を高めるには、水に可溶性の有接溶媒を反応溶液に加
えることができる。その最終S度を、第3ブタノールの
ような第3アルコールの場合には容量比で20%までに
することができ、ジメチルホルムアミドまたはテトラヒ
ドロ7ランの場合には容量比で10%までにすることが
できる。
反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および時には過剰の反応
体を透析i九はグル濾過によって除去することができる
。この方法によp1タンパク1モルあたプlないし15
の遊侠基を導入することが可能となる。そのような化合
物を用いる場合、タンパクP、とのカップリングは、P
H6から8の溶液中(て30’Cを越えない温度で、1
時間から24時間かけておこなう。
る。その後、低分子量の生成物および時には過剰の反応
体を透析i九はグル濾過によって除去することができる
。この方法によp1タンパク1モルあたプlないし15
の遊侠基を導入することが可能となる。そのような化合
物を用いる場合、タンパクP、とのカップリングは、P
H6から8の溶液中(て30’Cを越えない温度で、1
時間から24時間かけておこなう。
低分子量の生g物を除くために適宜、得られた水溶液を
透析する。ついで包合体を既知の方法の変法によpfl
f製できる。
透析する。ついで包合体を既知の方法の変法によpfl
f製できる。
(2)fオニ−チル結合
この場合、包合体をP、’−(z−y−g) a−3H
と前もって1つ以上のフレイミド基を導入しておいたタ
ンノ卆りP、とを反応させることKより調製する。1例
として、反応を次の式で示す。
と前もって1つ以上のフレイミド基を導入しておいたタ
ンノ卆りP、とを反応させることKより調製する。1例
として、反応を次の式で示す。
上式中、R8は炭素a1ないし15の脂肪族ま九は芳香
族介在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に
対して不活性である。2は、結合に関与するタンパクP
、の官能基の積項に従うて変化し優る基を示す。すなわ
ち、2は、!!X(テaシン残基(チロシル基)の7エ
ノール基のエステルの場合L NH(タンパクの7ミ/
T&と活性型カルボキシル基のカップリングの場合)ま
たはN H−CHt (タンパクのアミ7基とクロσメ
tルケトンの場合)である、マレイミドで置換されたタ
ン/?りP、は、それ目体マレイミド基を有する試薬に
よってタンパクの適当な基を置換することによって、タ
ンパクP、自体からま之は適当に保護されたタンパクP
、から得られる。これらに適した基の5ち、臀に次のも
のが選ばれる。
族介在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に
対して不活性である。2は、結合に関与するタンパクP
、の官能基の積項に従うて変化し優る基を示す。すなわ
ち、2は、!!X(テaシン残基(チロシル基)の7エ
ノール基のエステルの場合L NH(タンパクの7ミ/
T&と活性型カルボキシル基のカップリングの場合)ま
たはN H−CHt (タンパクのアミ7基とクロσメ
tルケトンの場合)である、マレイミドで置換されたタ
ン/?りP、は、それ目体マレイミド基を有する試薬に
よってタンパクの適当な基を置換することによって、タ
ンパクP、自体からま之は適当に保護されたタンパクP
、から得られる。これらに適した基の5ち、臀に次のも
のが選ばれる。
リ ペプチド鎖の末端アミン基またはタンノぐりに含ま
れるリシン残基(リシル基)の側蝋アミ7基。この場合
、フレイミド基を有する試薬は次のよりなものがある。
れるリシン残基(リシル基)の側蝋アミ7基。この場合
、フレイミド基を有する試薬は次のよりなものがある。
ア)次の一般式の試薬
上式中、L−Co−は次のとおシである。
拳カルゲキシル基。その場合、カルボジイミドのような
カップリング剤および時には!−二チルー3−ジメチル
アミツブaピル−3−カルボジイミドのような水溶性誘
辱体の存在下でカルボキシル基を活性化したのち、反応
が進行する。
カップリング剤および時には!−二チルー3−ジメチル
アミツブaピル−3−カルボジイミドのような水溶性誘
辱体の存在下でカルボキシル基を活性化したのち、反応
が進行する。
・またはオルト−若しくはパラ−ニトロ7エ二ルマタハ
ジニトロフエニルエステルtたHN−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル。
ジニトロフエニルエステルtたHN−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル。
これは直接アミノ基と反応し、それをアシル化する。こ
のような試薬の調製は、奇にヘルベテイ力・ケミ力・ア
クタ()lelve口CaChimfca Acta
) 、 58 、531−541 (1975)に記載
されている。同じようなりラスの他の薬剤は市販品とし
て手に入る。
のような試薬の調製は、奇にヘルベテイ力・ケミ力・ア
クタ()lelve口CaChimfca Acta
) 、 58 、531−541 (1975)に記載
されている。同じようなりラスの他の薬剤は市販品とし
て手に入る。
イ)次の一般式の試薬
C)
り
これは次の反応式に従ってタン・1りPヨのアミノ基と
反応し得る。
反応し得る。
リ タンノーりに含まれるtロンン残基のフェノール基
。この場合、7レイミド基金有する試薬は次の一般式で
示される。
。この場合、7レイミド基金有する試薬は次の一般式で
示される。
す
これは次の反応式に従ってタン/譬りの7エノール基と
反応する。
反応する。
マレイミドを有する試薬とタン・ぐりPl との反応は
均質な液相、鰻も一般的には水または媛淘液中で進行す
る。反応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶
媒と反I2;溶液に加えることができる。その最終濃度
を、第3ブタ/−ルのような第3アルコールの場合には
容量比で20%までにすることができ、ジメチルホルム
アミドまたはテトラヒドロフランの場合には容量比で1
0%までにすることができる。反応は室温にて数分から
数時間かけておこなう。
均質な液相、鰻も一般的には水または媛淘液中で進行す
る。反応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶
媒と反I2;溶液に加えることができる。その最終濃度
を、第3ブタ/−ルのような第3アルコールの場合には
容量比で20%までにすることができ、ジメチルホルム
アミドまたはテトラヒドロフランの場合には容量比で1
0%までにすることができる。反応は室温にて数分から
数時間かけておこなう。
そののち、低分子鼠生底物、轡に過剰の反応物を透析、
又はグル濾過によシ取り除く。
又はグル濾過によシ取り除く。
この方法によシ、通常、タンパク1そり当シ1〜13の
置換基を導入することができるnこのような化合物を用
いる場合、タンノザク質Pとのカップリングは、2つの
タンパク質をpH6〜8の水溶液中に30℃以下の温度
で1ないし2458間かけて溶解すること(よっておこ
なう。鴎られた溶液を、所望に応じて透析して低分子m
生成物を除去し、抱合体を檀々の既知の手法によって精
製する。
置換基を導入することができるnこのような化合物を用
いる場合、タンノザク質Pとのカップリングは、2つの
タンパク質をpH6〜8の水溶液中に30℃以下の温度
で1ないし2458間かけて溶解すること(よっておこ
なう。鴎られた溶液を、所望に応じて透析して低分子m
生成物を除去し、抱合体を檀々の既知の手法によって精
製する。
ぜ“
(ここで、EおよびGは上記の通#))で示される化合
物は、式 %式% (ここで、GおよびEは上記の通))で示される化合物
を、有機溶媒中10ないし40℃の温度で、式 で示されるカルボニルジイミダゾールと反応させること
によって奉られる。
物は、式 %式% (ここで、GおよびEは上記の通))で示される化合物
を、有機溶媒中10ないし40℃の温度で、式 で示されるカルボニルジイミダゾールと反応させること
によって奉られる。
式■の化合物は、タンメゼク質GPIR−1gおよびP
のチロシンの水酸基とのカップリング用試薬として時に
有用である。
のチロシンの水酸基とのカップリング用試薬として時に
有用である。
この発明は、また、統計式
%式%
の残基もしくはその官能基のいずれか1つを修飾するこ
とによってGPrR−1nからt5導された分子でらっ
て、チロシンのフェノール水酸基が1つ以上除去されて
いるものを表し、酸素IQ子は、残基GPIR−1a“
から離脱した上記フェノール水酸基に属するものを表し
、および Eおよび0は上記の通りである)で示される新規生成物
にも関する。
とによってGPrR−1nからt5導された分子でらっ
て、チロシンのフェノール水酸基が1つ以上除去されて
いるものを表し、酸素IQ子は、残基GPIR−1a“
から離脱した上記フェノール水酸基に属するものを表し
、および Eおよび0は上記の通りである)で示される新規生成物
にも関する。
時に好ましい化合物は、式■で示される化合物であって
Eが、基−fcHt”r”’;−へここで、pd2ない
し7の整数)または基 、−CH− CJ(、C00)i であり、かつGが式−8−8−X(ここで、Xは、1つ
以上のへ口rン、アルキル基、カルボニル基、アルコキ
シカルボニル基、1つ以上のへログン、ニトル、アルコ
キシ、カルが中シルモしくはアルコキシ力ル〆ニルで置
換されもしくはに換されていないフェニル基もしくはア
ルコキシカルボニル基でそれぞれ置換されまたは置換さ
れていないピリジン−2−イルおよびピリジン−4−イ
ルよシ表る群の中から選ばれ九活性基であるものである
。
Eが、基−fcHt”r”’;−へここで、pd2ない
し7の整数)または基 、−CH− CJ(、C00)i であり、かつGが式−8−8−X(ここで、Xは、1つ
以上のへ口rン、アルキル基、カルボニル基、アルコキ
シカルボニル基、1つ以上のへログン、ニトル、アルコ
キシ、カルが中シルモしくはアルコキシ力ル〆ニルで置
換されもしくはに換されていないフェニル基もしくはア
ルコキシカルボニル基でそれぞれ置換されまたは置換さ
れていないピリジン−2−イルおよびピリジン−4−イ
ルよシ表る群の中から選ばれ九活性基であるものである
。
式■の生成物は、式
GPIJ(−1a ” −0H
(ココテ、GPIR−1a’は上記の通シーおよび水酸
基は残iGPIR−1a“のtロジンから脱離するフエ
/−ル水酸基である)で示される化合@を、場合に応じ
て水混和性有機溶媒(例えばジオキチンやテトラヒドロ
7ランのようなエーテル系溶媒)を含有する水系溶媒中
、IOないし40℃の温度で、式■の化合物と反応させ
ることによって得られる。
基は残iGPIR−1a“のtロジンから脱離するフエ
/−ル水酸基である)で示される化合@を、場合に応じ
て水混和性有機溶媒(例えばジオキチンやテトラヒドロ
7ランのようなエーテル系溶媒)を含有する水系溶媒中
、IOないし40℃の温度で、式■の化合物と反応させ
ることによって得られる。
GE’LR−1sがリシンの長期作用型A@である場合
、4られた免疫褌素IT(^−1a)の性質は以下の通
りである。
、4られた免疫褌素IT(^−1a)の性質は以下の通
りである。
+1) 抗体1モル当りの修飾^頌のモル数で表現さ
れる半均カップリング度は、通常、0,5ないし5であ
り、侍に1ないし3である。
れる半均カップリング度は、通常、0,5ないし5であ
り、侍に1ないし3である。
(21ホl) 7 ?リルアミドグル嵯気泳動法によっ
てI T(A−11) を分離すると、抗体の分装置と
1d30000ダルトンづつ連続的に異なる分子址を有
する住iJi、物に相当する一連のバンドに分れる。
てI T(A−11) を分離すると、抗体の分装置と
1d30000ダルトンづつ連続的に異なる分子址を有
する住iJi、物に相当する一連のバンドに分れる。
(3) ナイトフルオロメトリーによって、抗体は活
性化およびカップリング反応中にどのような実質的な労
化をも受けていないことおよび抱合体自体の内部におい
てそれが指向された抗原をなお認識し得ることが示され
イ薯る。
性化およびカップリング反応中にどのような実質的な労
化をも受けていないことおよび抱合体自体の内部におい
てそれが指向された抗原をなお認識し得ることが示され
イ薯る。
(4)修飾され抗体とカップリングし九^鎖の、タンノ
4り買合成に刈する阻害活性は、2−メルカプトエタノ
ールの存在下くおいて無細胞モデルで測定すると、全体
的に保持されている。
4り買合成に刈する阻害活性は、2−メルカプトエタノ
ールの存在下くおいて無細胞モデルで測定すると、全体
的に保持されている。
免疫#S素ZT(^−1a)の細胞毒性活性は、活性化
剤の存在下において標的抗原を有する細胞につめて細胞
モデル中でのタン/4り合戊賦験で測定したとき、標的
抗原を待たない細胞について同一条件でおこなったとき
よ5もtoo。
剤の存在下において標的抗原を有する細胞につめて細胞
モデル中でのタン/4り合戊賦験で測定したとき、標的
抗原を待たない細胞について同一条件でおこなったとき
よ5もtoo。
倍以上大きい。例えば、ジスルフィド架橋を含む結きに
よってリシンの修飾^鯨を、ある種のヒト白血病細胞表
面に存在する抗原T65に指向される単一りσ−ン抗体
(抗体Tl0Iで表示)とカップリングして優た免&a
aX(IT(^−1a)で表示)は、趨性T65細胞に
対してよりも約105倍陽性T65砒胞VC対して細胞
毒性である。
よってリシンの修飾^鯨を、ある種のヒト白血病細胞表
面に存在する抗原T65に指向される単一りσ−ン抗体
(抗体Tl0Iで表示)とカップリングして優た免&a
aX(IT(^−1a)で表示)は、趨性T65細胞に
対してよりも約105倍陽性T65砒胞VC対して細胞
毒性である。
免疫播ネIT(A−11)の細胞磁性効率は、クローン
原性(clonogeoic )試験で測定したとき、
相応する通常のrTQについて得られたものと同等であ
る。例えば、lQmMの塩化アンモニウムの存在下に1
0 Mもの低い投与量でIT(A−1a)は初期値
の99.999%のオーダーの特異的ナイトリダクシI
I ン(e710redLIcIion )に至る。こ
の結果は、同じ抗体およびリシンの非修飾^鎖で形成さ
れたIT TIQlについて得たものと同一である。
原性(clonogeoic )試験で測定したとき、
相応する通常のrTQについて得られたものと同等であ
る。例えば、lQmMの塩化アンモニウムの存在下に1
0 Mもの低い投与量でIT(A−1a)は初期値
の99.999%のオーダーの特異的ナイトリダクシI
I ン(e710redLIcIion )に至る。こ
の結果は、同じ抗体およびリシンの非修飾^鎖で形成さ
れたIT TIQlについて得たものと同一である。
^鎖として換算してIT(A−1a)をウナギに0、4
mg/K g体重のオーダーで血管円投与した後、投
与から23時間後の血液流に存在するIT(^−1n)
の血漿中レベルは、同一条件で測定した通常のITの血
漿中レベルよシも10ないし200倍高い。かくして、
ウサギが関与する典型的な例において、投与23時間後
の血液流中のIT(^−1i)の血漿中レベルは、時間
0のときに存在するレベルの7%でらシ、同一時間にお
ける通常のIT Tl0Iの場合のO,OS%と比べ
て、140倍であることがわかる。
mg/K g体重のオーダーで血管円投与した後、投
与から23時間後の血液流に存在するIT(^−1n)
の血漿中レベルは、同一条件で測定した通常のITの血
漿中レベルよシも10ないし200倍高い。かくして、
ウサギが関与する典型的な例において、投与23時間後
の血液流中のIT(^−1i)の血漿中レベルは、時間
0のときに存在するレベルの7%でらシ、同一時間にお
ける通常のIT Tl0Iの場合のO,OS%と比べ
て、140倍であることがわかる。
これによって、桑理的性買に関して新たな性質が付与さ
れた修飾免疫′JB六が得られるのである。
れた修飾免疫′JB六が得られるのである。
さらに詳細には、la胞毒性サブユニットを逼当に修飾
することによって、免疫毒素の特異的細胞毒性に、これ
を阻害することなく、新たな固有の性質すなわち遅延さ
れた血漿中における消失キネティックスを示す能力を付
与できるのである。
することによって、免疫毒素の特異的細胞毒性に、これ
を阻害することなく、新たな固有の性質すなわち遅延さ
れた血漿中における消失キネティックスを示す能力を付
与できるのである。
以下、この発明の実施例を記載する。
実施例 1
この実施例は過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したりシン人
鎖f!:#脈注射した場合の消失の逓砥性を証明するた
めのものである。
鎖f!:#脈注射した場合の消失の逓砥性を証明するた
めのものである。
1 過ヨフ累酸ナトリウムにょろりシンA鎖の修飾
(1) 1)TNHi用いた天然SHのブaツキング
リシンA蟻を米国’F?IfN0.4,340,535
に記載されている方法で製造、絹製した。2,2′−ジ
ニ)+17−5.5’−ジテ第2安息香e11(DTN
B ) +7)#液20当鼠、すなわち、pH7の12
5mMリン酸塩復閏液に溶かしたDTNHの0.1M溶
液、385μt(この溶液は水酸化ナトリウムでpi(
ニアに調節した)を、PBS緩tj4液に溶かした5、
6mg/mlの割合で含むリシン^鎖iomg溶液に加
えた(りん酸塩については20 mM 、 NmC7j
については150mMのp)(: 7の援衛液)。培養
は20℃で20分間続けた。この溶液を4℃でPB8援
衛液を用いて透析し、チオール紙をブロッキングしたへ
鎖を53mg f:5 rng/mlの割合で含む溶液
として得た。
リシンA蟻を米国’F?IfN0.4,340,535
に記載されている方法で製造、絹製した。2,2′−ジ
ニ)+17−5.5’−ジテ第2安息香e11(DTN
B ) +7)#液20当鼠、すなわち、pH7の12
5mMリン酸塩復閏液に溶かしたDTNHの0.1M溶
液、385μt(この溶液は水酸化ナトリウムでpi(
ニアに調節した)を、PBS緩tj4液に溶かした5、
6mg/mlの割合で含むリシン^鎖iomg溶液に加
えた(りん酸塩については20 mM 、 NmC7j
については150mMのp)(: 7の援衛液)。培養
は20℃で20分間続けた。この溶液を4℃でPB8援
衛液を用いて透析し、チオール紙をブロッキングしたへ
鎖を53mg f:5 rng/mlの割合で含む溶液
として得た。
(2) ブロッキングされた^鎖の過ヨウ素酸塩によ
る酸化 過ヨウ累酸ナトリウムの0.5M水溶液120μeを、
1M酢酸でpH:6に調整したブロッキング済み^鎖を
5mg/ml含む溶液6mg中に加えた。培養は暗所で
4℃で16時間おこなった。酸化反応停止は工tレンゲ
リコールの1M水浴液620/i6を加えることにより
おこなった。
る酸化 過ヨウ累酸ナトリウムの0.5M水溶液120μeを、
1M酢酸でpH:6に調整したブロッキング済み^鎖を
5mg/ml含む溶液6mg中に加えた。培養は暗所で
4℃で16時間おこなった。酸化反応停止は工tレンゲ
リコールの1M水浴液620/i6を加えることにより
おこなった。
培養後、20℃で15分間、反応媒体を4℃でPBS緩
爾液で透析した。この過ヨウXI!Il!塩による酸化
によシタンパク質のわずかな析出を得た。これを30分
間、10,0OOXGで遠心分離し除去し、酸化および
ブロッキングされたA鎖を3.4mg/meの濃度で2
4mg得た。
爾液で透析した。この過ヨウXI!Il!塩による酸化
によシタンパク質のわずかな析出を得た。これを30分
間、10,0OOXGで遠心分離し除去し、酸化および
ブロッキングされたA鎖を3.4mg/meの濃度で2
4mg得た。
(3) チオール基のブロッキング解放2−メルカブ
トエタ/−ルを還元剤として般終儂度1%で酸化、ブロ
ッキング化Ad(PBSW 園f’& 中K 3.4
mg/m6含む)flim7!に加えた。
トエタ/−ルを還元剤として般終儂度1%で酸化、ブロ
ッキング化Ad(PBSW 園f’& 中K 3.4
mg/m6含む)flim7!に加えた。
培養を20℃で1時間おこない、ついでこの溶液を4℃
でPBStl改液を用いて透析した。七の結果酸化され
た入U t” 2.8 rn 17m lの濃度で19
mg得た。
でPBStl改液を用いて透析した。七の結果酸化され
た入U t” 2.8 rn 17m lの濃度で19
mg得た。
DTNB法(gntymology 、 l 972
、25.457Acmdcmjc Press )を用
い、この修飾されたへ鎖が1モル当り0.70の遊離チ
オール基を有することが判明した。この修飾AMの分子
鑞はト。
、25.457Acmdcmjc Press )を用
い、この修飾されたへ鎖が1モル当り0.70の遊離チ
オール基を有することが判明した。この修飾AMの分子
鑞はト。
デシルナルフェートの存在下での?リアクリルアミド勾
配峨気泳動により30,000±3,000であること
が判明した。
配峨気泳動により30,000±3,000であること
が判明した。
多糖単位が酸化された^SAを、タン・臂り質合成の抑
止における酵素活性および薬理学的付性について1lc
lf死した。
止における酵素活性および薬理学的付性について1lc
lf死した。
I 持続法A鎖の酵素活性の非細胞モデルによる測定
抑止活性を実施例1の方法で測定した。その結果、酸化
^鎖のIC,、は3X10−”モル/lであり、対照^
鎖のx c、、は1.2x10−toモル/lであった
。し九がって修飾によるA鎖の活性損失は認められなか
った。
^鎖のIC,、は3X10−”モル/lであり、対照^
鎖のx c、、は1.2x10−toモル/lであった
。し九がって修飾によるA鎖の活性損失は認められなか
った。
I 持続性^g(A−La)の薬理効果このAMをラビ
ットに耳を介して静脈投与した。この^頌投与道は0.
415mg/Kgでちった。
ットに耳を介して静脈投与した。この^頌投与道は0.
415mg/Kgでちった。
血液サンプルをへ/4’リン上に間隔をおいて採取した
。この血漿を下記にi(IM−1の記号で示したラジオ
イムノアッセイテストで分析したOこの方法はA11i
を修飾することなしに判定し得る利点を存する。この判
定をマイクロ滴定プレートを用いておこなった。このプ
レートの蓋体には過吸収剤スパイクが設けられていて、
こ1がベース中の穴に浸入するようになっている。
。この血漿を下記にi(IM−1の記号で示したラジオ
イムノアッセイテストで分析したOこの方法はA11i
を修飾することなしに判定し得る利点を存する。この判
定をマイクロ滴定プレートを用いておこなった。このプ
レートの蓋体には過吸収剤スパイクが設けられていて、
こ1がベース中の穴に浸入するようになっている。
これらのスパイクは固体相からなるものである0リシン
の^鎖を示し、親和性クロフトグラフイで精製された維
手抗体(以下に^C!の記号で示す)をこの固体相上に
吸収させた。この目的のため、PBall#J液中に1
0 、a g/me含む^crの溶液を上記穴に分けて
注入した。上記スノタイクを4℃で244時間^cl溶
液と鰻初に接触させ、ついで20℃で3時間、胎児ウシ
血清と接触させ、全ての固定部位を飽和させた。この飽
和した免疫吸収剤を20℃、3時間、種々の濃度の血漿
チンプル、又は既知の濃度のA@浴溶液接触させ、目盛
白線を作成した。PBJj!陶液で洗浄後、この免&吸
収剤Jをリシン人類を示す雌羊抗体(It相クロマトグ
ラフィで侑製し、放射能ラベルを施したもの、以下^C
2と記す)と20℃で2時115接触させた。この^C
2の放射能ラベルはクロラミンTの存狂下でヨウ素12
5を用い、GreenwoodおよびHunterの方
法(Biochem、J、、1963,89,114)
でおこなった。このラベルした^C2抗体は5〜lOマ
イクロキ工−リー/μgを示し九〇このラベル化^c2
1Qcpmを200μgとして、0.1%クシ血清アル
ブミンを含むPBS緩鷺液中に導入し次。FBI援衛液
中で洗浄ののち、上スノーイクを取りはずし、結合した
八C2の量を放射能測定により計量した。サンプル中の
A釧の濃度は、異なる既知の濃度で^韻を導入すること
によって作られ九目I&市線に対して参照することくよ
り測定した。愕続性入鎖を動物に注射し死際、同じ^頌
を用い相当する目盛白線を作成し九。
の^鎖を示し、親和性クロフトグラフイで精製された維
手抗体(以下に^C!の記号で示す)をこの固体相上に
吸収させた。この目的のため、PBall#J液中に1
0 、a g/me含む^crの溶液を上記穴に分けて
注入した。上記スノタイクを4℃で244時間^cl溶
液と鰻初に接触させ、ついで20℃で3時間、胎児ウシ
血清と接触させ、全ての固定部位を飽和させた。この飽
和した免疫吸収剤を20℃、3時間、種々の濃度の血漿
チンプル、又は既知の濃度のA@浴溶液接触させ、目盛
白線を作成した。PBJj!陶液で洗浄後、この免&吸
収剤Jをリシン人類を示す雌羊抗体(It相クロマトグ
ラフィで侑製し、放射能ラベルを施したもの、以下^C
2と記す)と20℃で2時115接触させた。この^C
2の放射能ラベルはクロラミンTの存狂下でヨウ素12
5を用い、GreenwoodおよびHunterの方
法(Biochem、J、、1963,89,114)
でおこなった。このラベルした^C2抗体は5〜lOマ
イクロキ工−リー/μgを示し九〇このラベル化^c2
1Qcpmを200μgとして、0.1%クシ血清アル
ブミンを含むPBS緩鷺液中に導入し次。FBI援衛液
中で洗浄ののち、上スノーイクを取りはずし、結合した
八C2の量を放射能測定により計量した。サンプル中の
A釧の濃度は、異なる既知の濃度で^韻を導入すること
によって作られ九目I&市線に対して参照することくよ
り測定した。愕続性入鎖を動物に注射し死際、同じ^頌
を用い相当する目盛白線を作成し九。
この方法で測定された血漿中のA@の濃度は再現性がら
り、信租できるものである。この探知しきい直はI n
g/mlである。各実験間の再現性の検討の結果、変化
関数が1〜200ng/mlの11度について10%以
下であった。
り、信租できるものである。この探知しきい直はI n
g/mlである。各実験間の再現性の検討の結果、変化
関数が1〜200ng/mlの11度について10%以
下であった。
これらの実験の結果はIfIIIMで示され、時間はf
ttt軸に、零時の血漿?1度理論値に対する記録され
九生底物の血漿濃度の%をlogスケールで縦軸に示し
た。この値、すなわち、°相対血is度”(RPC)は
下肥の式で計算される〇血gRtは動物の体重のI K
P当り36m/で考えられている。
ttt軸に、零時の血漿?1度理論値に対する記録され
九生底物の血漿濃度の%をlogスケールで縦軸に示し
た。この値、すなわち、°相対血is度”(RPC)は
下肥の式で計算される〇血gRtは動物の体重のI K
P当り36m/で考えられている。
第1図は天然りシン入鎖を静脈注射し九場合の血漿にお
ける消失曲線を時間の関数として示したものである。こ
の白線(11は2つの相を示している。第1にこの天黙
りシン^@を注射後3時間で血漿中に残る率はわずか0
.1%(投与量に対して)であり、血液から急赦に消失
することを示している。第2の相においてはこの71%
矢がよりゆるやかである。
ける消失曲線を時間の関数として示したものである。こ
の白線(11は2つの相を示している。第1にこの天黙
りシン^@を注射後3時間で血漿中に残る率はわずか0
.1%(投与量に対して)であり、血液から急赦に消失
することを示している。第2の相においてはこの71%
矢がよりゆるやかである。
しかし、多糖単位が酸化され九へ鎖においては、この消
失性は著るしく改められる。すなわち、入鎖製品の大部
分が消失するもととなる第1の消失相は著るしく抑制さ
れ、その結果、^鎖の血漿における残留レベルが著るし
く増大する。注射20時間後では酸化^鎖の濃度は修飾
されていない^@(曲@2)の場合の600倍にも々る
。
失性は著るしく改められる。すなわち、入鎖製品の大部
分が消失するもととなる第1の消失相は著るしく抑制さ
れ、その結果、^鎖の血漿における残留レベルが著るし
く増大する。注射20時間後では酸化^鎖の濃度は修飾
されていない^@(曲@2)の場合の600倍にも々る
。
実施例 2
この実施例は、酸化処理時間が酸化入鎖の薬物動態学的
性質に及ぼす重要性を検討するものである。
性質に及ぼす重要性を検討するものである。
過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた以外Vi
実施例2の手法を用いて6種の酸化A鎖のI!!列を消
失した。処理時間は次の通シであった。すなわち、O(
エチレングリフールを用いて反応を直ちに停止)、20
分、40分、2.5時間、4時間、および188時間あ
った。
実施例2の手法を用いて6種の酸化A鎖のI!!列を消
失した。処理時間は次の通シであった。すなわち、O(
エチレングリフールを用いて反応を直ちに停止)、20
分、40分、2.5時間、4時間、および188時間あ
った。
これら6種の製剤をウサギに注射し、234閣経過後の
^鎖の血漿中相刈fi変を実施例1の手法によりIl!
!I定した。
^鎖の血漿中相刈fi変を実施例1の手法によりIl!
!I定した。
結果を:s2図に示す。この結果から、1)^鑓の血漿
中濃度の増加は、確かに、過ヨウ索酸堰による酸化に基
づくこと(反応を直ちに停止しなときは、^頌の血漿中
濃度は生の^鎮についてのものと同一であるからである
)、および2ン晟週の効果を得るためには、反応処理時
開を比較的長くすることが必要であることがわかる。
中濃度の増加は、確かに、過ヨウ索酸堰による酸化に基
づくこと(反応を直ちに停止しなときは、^頌の血漿中
濃度は生の^鎮についてのものと同一であるからである
)、および2ン晟週の効果を得るためには、反応処理時
開を比較的長くすることが必要であることがわかる。
実施例 3
本実施例においては生のゲロニンを動物に靜脈注射した
場とのその急消失と過ヨウ素酸ナトリウムによって変性
させ九グσニンを同様に注射した後のそのゆっくりとじ
九消失について説明する。
場とのその急消失と過ヨウ素酸ナトリウムによって変性
させ九グσニンを同様に注射した後のそのゆっくりとじ
九消失について説明する。
1) 過ヨウ素酸ナトリウムによるゲロニンの修飾
ゲロニンをグロニウムムルチ70−ルム((Jelon
iummu1口florum )から生化学ジャーナル
、第255巻、6947−6953頁、1980年に述
べである方法で抽出し、絹製した。実施例2でリシン人
類1(ついて述べたのと同じ方法で酸化反応を行また。
iummu1口florum )から生化学ジャーナル
、第255巻、6947−6953頁、1980年に述
べである方法で抽出し、絹製した。実施例2でリシン人
類1(ついて述べたのと同じ方法で酸化反応を行また。
しかしチオール基のDTNBによるマスクは行っていな
い。
い。
実際ゲロニンの天然のチオール基を用いてゲロニンと抗
体をカップリングさせることはあまり行なわれていない
ので、tオール哉は、酸化後、ガン研究(Cancer
Res、) 、 @ 44巻、129−133頁、1
984年において説明された技術と用いて人工的に導入
しな。過ヨウXf!!tナトリウム0.5 M水溶11
i21/JJを1 m4当たp l mgのグσ二ノを
含む溶液IJにリン酸緩衝溶液中で加え、1M酢酸でp
Hを6にした。これを暗所で16時間4℃に保った。反
応は1Mエチレングリコール水溶液を105μe加えて
終結させた。これを20℃で4分間保温した後、反応物
を4℃でリン酸緩^液中において透析した。
体をカップリングさせることはあまり行なわれていない
ので、tオール哉は、酸化後、ガン研究(Cancer
Res、) 、 @ 44巻、129−133頁、1
984年において説明された技術と用いて人工的に導入
しな。過ヨウXf!!tナトリウム0.5 M水溶11
i21/JJを1 m4当たp l mgのグσ二ノを
含む溶液IJにリン酸緩衝溶液中で加え、1M酢酸でp
Hを6にした。これを暗所で16時間4℃に保った。反
応は1Mエチレングリコール水溶液を105μe加えて
終結させた。これを20℃で4分間保温した後、反応物
を4℃でリン酸緩^液中において透析した。
30分間to、oooxyで遠心分離にかけると、ココ
かう2mI K 2.5 m g/rnlの酸化ゲロニ
ン2゜9mg25j得られた。
かう2mI K 2.5 m g/rnlの酸化ゲロニ
ン2゜9mg25j得られた。
リシン^頽と同じように、ゲロニンの基本的時性はり〆
ソームの608サブユニツトの分解によって真核細胞に
おけるタンパク員合成を阻害することである(バイオケ
ミカルジャーナル。
ソームの608サブユニツトの分解によって真核細胞に
おけるタンパク員合成を阻害することである(バイオケ
ミカルジャーナル。
第207%、505〜509頁、1982手)。ゲロニ
ンの場合にも過ヨウ素酸酸化による修飾は、活性の損失
を生じさせないことがわがつ九。
ンの場合にも過ヨウ素酸酸化による修飾は、活性の損失
を生じさせないことがわがつ九。
1 ゲロニンにおける条物動態学的特性の維持生の、或
いは上述の手続で修飾され次グロ二ノをうさぎの耳の血
管から一回注射した。投与したゲロニンの量は0.3な
いし0.4mg/に2であった。ヘノ41)ンの存在下
で血液を時々採取した。
いは上述の手続で修飾され次グロ二ノをうさぎの耳の血
管から一回注射した。投与したゲロニンの量は0.3な
いし0.4mg/に2であった。ヘノ41)ンの存在下
で血液を時々採取した。
血漿は以下RIM−4と略称する放射線免疫試験を用い
て分析した。
て分析した。
この試験はRIM−1試験と同じ技術を用いる。
ただし^C1溶液が本例ではアフィニティークロットグ
ラフィーで絹製された抗rロ二ノウサギ抗体溶液である
。^C2抗体はRjM−1試験と同じ抗体を放射性同位
体で標識したものである。
ラフィーで絹製された抗rロ二ノウサギ抗体溶液である
。^C2抗体はRjM−1試験と同じ抗体を放射性同位
体で標識したものである。
同−標本中の生のゲロニンと修飾したゲロニンの濃度を
それぞれ標本とは異つた既知の濃度の検ffi線と比較
することによって決定した。放射標識の技術はRIM−
1で説明したものと同じである。RIM−2試験はRI
M−1試験と同等の信頼性と再現性を示した。本実験の
結果は実施例2でリシンのA@について示したのと同じ
方法で示す。
それぞれ標本とは異つた既知の濃度の検ffi線と比較
することによって決定した。放射標識の技術はRIM−
1で説明したものと同じである。RIM−2試験はRI
M−1試験と同等の信頼性と再現性を示した。本実験の
結果は実施例2でリシンのA@について示したのと同じ
方法で示す。
図3は生の及び修飾したゲロニンを静脈注射した場合の
血漿中濃度IIIIB縁を時間の関数として表わしてい
る。生のゲロニンは99.99%が24時間で消失し九
ことから、生のりシン入鎖と同じように血中から非常に
急速に消失することがわかる(臼Ml)。ゲロニンのポ
リサツカリド単位が酸化されている場合は曲線形が大き
く違う。投与24時間後に酸化し九ゲロニンのS度は生
のゲロニンの300倍ある(曲線2)。
血漿中濃度IIIIB縁を時間の関数として表わしてい
る。生のゲロニンは99.99%が24時間で消失し九
ことから、生のりシン入鎖と同じように血中から非常に
急速に消失することがわかる(臼Ml)。ゲロニンのポ
リサツカリド単位が酸化されている場合は曲線形が大き
く違う。投与24時間後に酸化し九ゲロニンのS度は生
のゲロニンの300倍ある(曲線2)。
従つてこれらの結果はりシン入鎖と同じようく、過ヨI
7素酸酸化はゲロニンの消失を測るのに用いられる糖鵡
を、この機能を妨げる8度にまで修飾することを示して
いる。
7素酸酸化はゲロニンの消失を測るのに用いられる糖鵡
を、この機能を妨げる8度にまで修飾することを示して
いる。
実施例 4
リシン人類を活性化されたジスルフィド基で置換し人間
のT、lfi廁を阻害する抗体と反応させた抱合体を準
備する。
のT、lfi廁を阻害する抗体と反応させた抱合体を準
備する。
a)大関のTi胞を阻害する抗体(TIOI抗体)
この抗体は免疫学ジャーナル(Journal orI
mrnunology )第125 (2)巻、725
−737i、1980年において説明された方法によつ
て準備した。
mrnunology )第125 (2)巻、725
−737i、1980年において説明された方法によつ
て準備した。
b) eR化されたりシンのA鎖
リシンの^鎖は実施例2で説明した方法によって準備し
た。
た。
■)人間のT細胞を阻害する活性化抗体l−エチル−3
−ジメtルアミノプaピルー3−カルボジイミドを1
ml当り60.3mg含す溶液20μ6を3−(ピリジ
ニル−2−ジスファニル)プロピオン酸を1 ml当り
20 mg含む溶液100μJKterl−ブタノール
中で加え、混合物を3分間室温で放置し九。こうして得
られた溶液68pe1fc、 xrrri当り抗体8
.9mgを含む溶液2meにリン酸is液中で加えた。
−ジメtルアミノプaピルー3−カルボジイミドを1
ml当り60.3mg含す溶液20μ6を3−(ピリジ
ニル−2−ジスファニル)プロピオン酸を1 ml当り
20 mg含む溶液100μJKterl−ブタノール
中で加え、混合物を3分間室温で放置し九。こうして得
られた溶液68pe1fc、 xrrri当り抗体8
.9mgを含む溶液2meにリン酸is液中で加えた。
この混合物を15分間30℃で攪拌し、その後4℃下で
リン酸緩衛液において透析した。次いでタン・ククj[
浴液を遠心分離し、活性化抗体を7.9m g / m
A!のg[で15mg4た。2−メルカ1トエタ/−
ルとの交換反応によって放出され九ピリジンー2−fオ
ンの343 nmにおける吸収をみると、この抗体は1
aol当り3.8個の活性化された混合ジスルフィド基
を有していることがわかっ之。
リン酸緩衛液において透析した。次いでタン・ククj[
浴液を遠心分離し、活性化抗体を7.9m g / m
A!のg[で15mg4た。2−メルカ1トエタ/−
ルとの交換反応によって放出され九ピリジンー2−fオ
ンの343 nmにおける吸収をみると、この抗体は1
aol当り3.8個の活性化された混合ジスルフィド基
を有していることがわかっ之。
I)持続作用のあるリシン人類を含有する免疫m素の準
備 修飾された^鎖をl ml当り2.87rnz含む溶液
2.46m#と上述の方法によりて得られた活性化抗体
の溶液i、5rntを準備しく濃度7.9mg/m1H
JaIち活性化抗体を11.8ms:含む)、この混合
物’i20℃で20af閣放置した。この溶液を遠心分
離にかけ、セフ1デツクスGI00f用いてf過し、n
l製した。溶出物の光学@度を280nm″C測定した
。抗体とAdの両方と含む分画を合わせると免疫毒素を
tmg当シ0.7 mg含む溶液xsmB即ち免疫毒素
は10.5rng)が得られ比0この溶液は抗体とカッ
プリングされfcI!!I化A#Aをl ml当り0.
14rng含有する。
備 修飾された^鎖をl ml当り2.87rnz含む溶液
2.46m#と上述の方法によりて得られた活性化抗体
の溶液i、5rntを準備しく濃度7.9mg/m1H
JaIち活性化抗体を11.8ms:含む)、この混合
物’i20℃で20af閣放置した。この溶液を遠心分
離にかけ、セフ1デツクスGI00f用いてf過し、n
l製した。溶出物の光学@度を280nm″C測定した
。抗体とAdの両方と含む分画を合わせると免疫毒素を
tmg当シ0.7 mg含む溶液xsmB即ち免疫毒素
は10.5rng)が得られ比0この溶液は抗体とカッ
プリングされfcI!!I化A#Aをl ml当り0.
14rng含有する。
従ってこの方法による平均カップリング度は抗体1ao
lにつき酸化^鎖L2molである。
lにつき酸化^鎖L2molである。
上記の方法で得た酸化されたりシン^fiAを含む免疫
1@素IT(A−La)TIOIにライて、その桑初動
態学的舛性と標的細胞に対する細胞毒性を調べた。
1@素IT(A−La)TIOIにライて、その桑初動
態学的舛性と標的細胞に対する細胞毒性を調べた。
実施例 5
本実施例においては、持続作用をもつりシン^@を含む
免疫毒素(IT(^−Lm)TIOIと略す)の血漿中
濃度がゆっくシと減少するという性質を獲得することを
示す。
免疫毒素(IT(^−Lm)TIOIと略す)の血漿中
濃度がゆっくシと減少するという性質を獲得することを
示す。
■方法
実施例4で説明した手続で11!傭された抱合体をうさ
ぎの耳の血管に一度注射しな。投与された曽はA鎖につ
いて体1ic I Kp当たシ0.415ff1gであ
る。ヘノタリンの存狂下で二液を時々採血した。血漿を
放射線免疫試験(RIM−jと略す)によって(2箇所
)分析した。
ぎの耳の血管に一度注射しな。投与された曽はA鎖につ
いて体1ic I Kp当たシ0.415ff1gであ
る。ヘノタリンの存狂下で二液を時々採血した。血漿を
放射線免疫試験(RIM−jと略す)によって(2箇所
)分析した。
このpt、験はRIM−1と同じ技術を用いて行われた
。但しkc2溶液は本試験においてはRIM−1の技術
を用いてアフィニティークロットグラフィーによりて絹
製され、放射機織され九マウスのrgGを阻害するヤギ
の抗体である。このサンプルにおける修飾された免疫毒
素の濃度#i既知の異った濃度から導いた検量線を用い
て決定した。RlA4−:1賦験はRIM−1と同じ信
頼性及び再現性を有する□ 比較対照のため、生のりシン人類を活性化され九ジスル
フィド基で置換した抗体の反応から得られたITTro
!抱合体と同じ条件下で比較例の試験を行った。この抱
合体の準備と細菌毒性はフランス国時許出IX第2,5
16,794号で説明した方法によりて行った。これら
の実験結果は実施例2でカップリングされていないA鎮
について行ったのと同じ方法で示した。
。但しkc2溶液は本試験においてはRIM−1の技術
を用いてアフィニティークロットグラフィーによりて絹
製され、放射機織され九マウスのrgGを阻害するヤギ
の抗体である。このサンプルにおける修飾された免疫毒
素の濃度#i既知の異った濃度から導いた検量線を用い
て決定した。RlA4−:1賦験はRIM−1と同じ信
頼性及び再現性を有する□ 比較対照のため、生のりシン人類を活性化され九ジスル
フィド基で置換した抗体の反応から得られたITTro
!抱合体と同じ条件下で比較例の試験を行った。この抱
合体の準備と細菌毒性はフランス国時許出IX第2,5
16,794号で説明した方法によりて行った。これら
の実験結果は実施例2でカップリングされていないA鎮
について行ったのと同じ方法で示した。
Q結果
図4はfIP脈注射されたITTIOI及びIT(^−
Lm)TIOZの血漿中′a度曲婦を示している、投与
24時間後にIT(^−Lm)TIOI活性細胞毒素は
ITTIOIの140倍になっていた。この事実は酸化
された^鎖の薬物動態学的符性は抗体とカップリングさ
れた後も保持されていることを示している。
Lm)TIOZの血漿中′a度曲婦を示している、投与
24時間後にIT(^−Lm)TIOI活性細胞毒素は
ITTIOIの140倍になっていた。この事実は酸化
された^鎖の薬物動態学的符性は抗体とカップリングさ
れた後も保持されていることを示している。
実施例 6
本実施例においてはIT(A−Lm)TIOIの標的細
胞に対する細胞#A素時特性保存について述べる。
胞に対する細胞#A素時特性保存について述べる。
リシン人類の基本的な生物学的特性は細胞中のタンパク
質合成tす〆ンームの608チブユニツトの分解によっ
て阻害することである。
質合成tす〆ンームの608チブユニツトの分解によっ
て阻害することである。
この方法は培養中のガン細胞に140で標識したロイシ
ン(以下14C−ロイシンをいう)を取シ込ませて研究
されている物質の効果を測定する細胞系を用いる。
ン(以下14C−ロイシンをいう)を取シ込ませて研究
されている物質の効果を測定する細胞系を用いる。
用いられる細胞は、抗原T65を運ぶ人間のT白血病か
ら誘導されるCEMM胞系に栖する。
ら誘導されるCEMM胞系に栖する。
この細胞は目的の物質の存在下で保温した後、細胞への
140−ロイシンの取り込みの程度を測定した。この測
定には生物化学ジャーナル(Journal o(B
iological Chemistry ) 第
249巻11号、3557−3562頁で説明された
、タンノ1り質合成量を測定するのに140−ロイシン
のトレーサーを用いる方法によりて行50取シ込まれた
放射能はろ過した細胞の全体について測定し九〇 定置の基準として紐激/効果[ifl線を描くことがで
きる。この白線横軸には目的物質中のA鎖Oモル1度、
縦軸には、タンパク質倉成を阻害する物質の存在しない
比較細胞における140−ロイシンの取り込み1に対す
る百分率をプロットして得られる。
140−ロイシンの取り込みの程度を測定した。この測
定には生物化学ジャーナル(Journal o(B
iological Chemistry ) 第
249巻11号、3557−3562頁で説明された
、タンノ1り質合成量を測定するのに140−ロイシン
のトレーサーを用いる方法によりて行50取シ込まれた
放射能はろ過した細胞の全体について測定し九〇 定置の基準として紐激/効果[ifl線を描くことがで
きる。この白線横軸には目的物質中のA鎖Oモル1度、
縦軸には、タンパク質倉成を阻害する物質の存在しない
比較細胞における140−ロイシンの取り込み1に対す
る百分率をプロットして得られる。
こうしてそれぞれの物質について14C−ロイシン取シ
込み11kso%阻゛与する1度または50%阻’il
!Fii1度(IC’、、)を決定することができる。
込み11kso%阻゛与する1度または50%阻’il
!Fii1度(IC’、、)を決定することができる。
図5は恒温媒体中でl Q mM塩化アンモニウムの存
在下でI ’r (^−La)TIOIとカップリング
されていないAfiてついて行った同じ実験から曲at
示している。この図をみると工1゛(^−Lx)T10
1は同一条件で測定されたカップリングも酸化されてい
ないAuK比べ約8万倍の非常に強い細胞毒性(IC,
。−5,5XLOM)を有することがわかる。
在下でI ’r (^−La)TIOIとカップリング
されていないAfiてついて行った同じ実験から曲at
示している。この図をみると工1゛(^−Lx)T10
1は同一条件で測定されたカップリングも酸化されてい
ないAuK比べ約8万倍の非常に強い細胞毒性(IC,
。−5,5XLOM)を有することがわかる。
実施例 7
本実施例はクローン原性試験において確認されたOEM
標的細胞に対するIT(A−La )TlolとITT
z0IOa胞徴性的効能の比較を示す。
標的細胞に対するIT(A−La )TlolとITT
z0IOa胞徴性的効能の比較を示す。
免疫m素は標的細胞を一つ一つ破壊する作用と担う。こ
の作用は感度の高い技術を用いて測定することができる
。コ0ニー形成阻害試験によれば、−個の住存細胞を数
百万の死んだ細胞から見い出せるためこの可能性がある
。これは人間のOEM+jンパ系に応じたグル媒体にお
ける最適な培養条件によって可能になる。
の作用は感度の高い技術を用いて測定することができる
。コ0ニー形成阻害試験によれば、−個の住存細胞を数
百万の死んだ細胞から見い出せるためこの可能性がある
。これは人間のOEM+jンパ系に応じたグル媒体にお
ける最適な培養条件によって可能になる。
■、コσニー形成阻害試験による細廐毒素の測定技術
クローニングに用いられる媒体はケトグルタル酸ナトリ
ウム1ミリmol、オキサロ酢酸ナトリウム1ミリmo
l、5%の不活性仔ウシ血清及び10%の不活性ウマ血
渭が加えられ九RPM11640である。最初に0.3
%の寒天溶液(アガロースvI型、シグマ(SIGM^
)研兜/m艮)tベトリ皿のこの媒体中に薄層のようK
して用意し、4℃で凝固させた。細胞は37℃に保温し
た0、275%寒天溶液と混ぜ合せ、それから1&初の
寒天層上に流し込んで凝固させた。これに用いft、、
寒天の潤度は、クローニングの効率、コロニーの大きさ
及び媒体の均一性の王者を同時に9遍化する目的で行っ
た予@iII試験の結果から定めた。恒温に保ってから
15日後に1自動コロニー計数器(“アルチック″、ダ
イナチック社。
ウム1ミリmol、オキサロ酢酸ナトリウム1ミリmo
l、5%の不活性仔ウシ血清及び10%の不活性ウマ血
渭が加えられ九RPM11640である。最初に0.3
%の寒天溶液(アガロースvI型、シグマ(SIGM^
)研兜/m艮)tベトリ皿のこの媒体中に薄層のようK
して用意し、4℃で凝固させた。細胞は37℃に保温し
た0、275%寒天溶液と混ぜ合せ、それから1&初の
寒天層上に流し込んで凝固させた。これに用いft、、
寒天の潤度は、クローニングの効率、コロニーの大きさ
及び媒体の均一性の王者を同時に9遍化する目的で行っ
た予@iII試験の結果から定めた。恒温に保ってから
15日後に1自動コロニー計数器(“アルチック″、ダ
イナチック社。
米国)を用いてコロニーを計数した。クローニング効率
、即ち免疫毒素処理で生き残った細胞の正確な数を決定
するには、接種された細胞の数を形成されたコロニーの
数の関数として表す検針線をつくることが大切である。
、即ち免疫毒素処理で生き残った細胞の正確な数を決定
するには、接種された細胞の数を形成されたコロニーの
数の関数として表す検針線をつくることが大切である。
発明者等はこの検11線から得られるクローニング効率
は、細胞を免疫′iBX処理した場合よくみられるよう
(、死んだね胞が高い割合でbっても#響されないこと
を鉦明した。
は、細胞を免疫′iBX処理した場合よくみられるよう
(、死んだね胞が高い割合でbっても#響されないこと
を鉦明した。
免疫毒素処理は、10%の不活性仔りシ血r#と10ミ
リrr+olL1)塩化アンモニウムを含むRPM11
640媒体の全1111111#ic対してそれぞれ異
った1度のIT(A−La)TIOI及びITTJi1
7Jの免疫毒素処理用い、指数的に成長している細胞を
保温することによりて行う。保温は5%の二酸化炭素を
含む雰囲気下で試験管を水平方向く振ること(二二−ブ
ルンスウイツク社“シラトリーG−2”攪拌器を用いて
2500rpmのベース)iCよって37℃に保うた。
リrr+olL1)塩化アンモニウムを含むRPM11
640媒体の全1111111#ic対してそれぞれ異
った1度のIT(A−La)TIOI及びITTJi1
7Jの免疫毒素処理用い、指数的に成長している細胞を
保温することによりて行う。保温は5%の二酸化炭素を
含む雰囲気下で試験管を水平方向く振ること(二二−ブ
ルンスウイツク社“シラトリーG−2”攪拌器を用いて
2500rpmのベース)iCよって37℃に保うた。
生存細胞の数が検量線によって最大感度範囲で測定でき
るようIC寒天溶液と混合する前に、細胞を洗浄し、そ
れぞれ異り九希釈にして準備した。結果は次の関係式を
用い、りa−ユング効率から外挿して生存細胞の絶対数
で表した。生存細胞の絶対数Xd は次式で表わされる。 8 、ここでCはベトリ皿1皿
当)のりσ−ンの数、dは細胞の希釈因子、Bは検ms
の勾配から求められ九りa −ユング効率である。それ
ぞれの値は3回の試験結果の平向をとった□ I結果 図6は塩化アンモニクムIOミリmofの存在下におけ
る14M細胞に対するIT(^−La)T101及びI
TTJi7Z免疫毒素の細胞毒性曲線を免疫ll素の濃
度(A鎖のモル濃度)の関数として表している。これら
2つの毒素の効率は同じオーダーの大きさであることは
明らかである。
るようIC寒天溶液と混合する前に、細胞を洗浄し、そ
れぞれ異り九希釈にして準備した。結果は次の関係式を
用い、りa−ユング効率から外挿して生存細胞の絶対数
で表した。生存細胞の絶対数Xd は次式で表わされる。 8 、ここでCはベトリ皿1皿
当)のりσ−ンの数、dは細胞の希釈因子、Bは検ms
の勾配から求められ九りa −ユング効率である。それ
ぞれの値は3回の試験結果の平向をとった□ I結果 図6は塩化アンモニクムIOミリmofの存在下におけ
る14M細胞に対するIT(^−La)T101及びI
TTJi7Z免疫毒素の細胞毒性曲線を免疫ll素の濃
度(A鎖のモル濃度)の関数として表している。これら
2つの毒素の効率は同じオーダーの大きさであることは
明らかである。
刊胞数減少の度合は両者とも大きいが、これは10”’
f) M程度の低い濃度においては残σ生存細胞の割合
は初期値に比べてO,OO1%のオーダーになってしま
うからである。この効果は高度に%異的である。何故な
らこれらの濃度においてはカップリングされていないA
@と非轡異的な免疫毒素は、これらの細胞に対して効果
をもっていないことが証明されたからである。
f) M程度の低い濃度においては残σ生存細胞の割合
は初期値に比べてO,OO1%のオーダーになってしま
うからである。この効果は高度に%異的である。何故な
らこれらの濃度においてはカップリングされていないA
@と非轡異的な免疫毒素は、これらの細胞に対して効果
をもっていないことが証明されたからである。
本実施例によってIT(A−Lm)TIOIは従来のf
TTJ177と実質的に同一な時$4細胞毎性を有する
ことがわかる□ 実施例 8 酸化されたAfAの動物の体全体への毒物学的時性(免
疫#S木の毒性は等モル量における^鎖と同じオーダー
の大きさである)を調べることは重要である。これはt
ヤールズリバーフランスCDrフクスに!脈注射された
酸化^鎖の半数致装置を生のA鎖との比較において決定
することによつて行われる。
TTJ177と実質的に同一な時$4細胞毎性を有する
ことがわかる□ 実施例 8 酸化されたAfAの動物の体全体への毒物学的時性(免
疫#S木の毒性は等モル量における^鎖と同じオーダー
の大きさである)を調べることは重要である。これはt
ヤールズリバーフランスCDrフクスに!脈注射された
酸化^鎖の半数致装置を生のA鎖との比較において決定
することによつて行われる。
その結果を下表に示す。
上の結果Fi酸化された^鎖の速性は生のA@より低い
ことを示している。これはへ頌が°酸化によって修飾さ
れるとA釧の血漿中濃度は著しく増加するけれども、そ
の毒性は増加するどころか、反対にかなり減少すること
を意味しているO 従って修飾された細胞速性サブユニットを包む免疫毒素
は入閣の治療楽として使える。これらの修飾された免疫
連索は、標的細胞が免疫連累をr$儂するのに用いられ
る抗体によって猷別されるようなガンまたはガンでない
病気の治療に用いられる。i&通な投与量と治療時間は
問題の病気にか゛かった患者とその病気の特質に応じて
定められるべきである。
ことを示している。これはへ頌が°酸化によって修飾さ
れるとA釧の血漿中濃度は著しく増加するけれども、そ
の毒性は増加するどころか、反対にかなり減少すること
を意味しているO 従って修飾された細胞速性サブユニットを包む免疫毒素
は入閣の治療楽として使える。これらの修飾された免疫
連索は、標的細胞が免疫連累をr$儂するのに用いられ
る抗体によって猷別されるようなガンまたはガンでない
病気の治療に用いられる。i&通な投与量と治療時間は
問題の病気にか゛かった患者とその病気の特質に応じて
定められるべきである。
より一般的な言葉でいえば、糖質単位が過ヨウ素イオン
によって修飾され、対応する修飾のない抗腫%糖タンパ
ク質よシも半減期の長い抗腫燭糖タンノ臂り質は薬とし
て有用だということである。
によって修飾され、対応する修飾のない抗腫%糖タンパ
ク質よシも半減期の長い抗腫燭糖タンノ臂り質は薬とし
て有用だということである。
従ってもう一つの特徴によれば、本発明は糖質単位が過
ヨウ素酸イオンの酸化によつて修飾されている抗−場糖
タンノ々り質が注射好ましくはぎす脈注射に適して形態
1cなっている抗m*薬に関する。
ヨウ素酸イオンの酸化によつて修飾されている抗−場糖
タンノ々り質が注射好ましくはぎす脈注射に適して形態
1cなっている抗m*薬に関する。
第1図ないし第6図は本発明の抛タンノクク貿の時性を
示す線区である。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦伍りさ千8月
とつ蛇nりしζ 田 14cmロイシシ/)才す0國) 手続補正書は式) %式% 1、事件の表示 特願昭60−274840号 2、発明の名称 長期作用型免疫毒素および製造方法 3、補正?する者 事件との関係 特許出願人 名称 チノフイ 4、代理人 明細書、図面 7、補正の内容 号・lトi通・1 f11 明細書の浄8(内容に変更なし)。 (2) 図面の浄書(内容に変更なし)。
示す線区である。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦伍りさ千8月
とつ蛇nりしζ 田 14cmロイシシ/)才す0國) 手続補正書は式) %式% 1、事件の表示 特願昭60−274840号 2、発明の名称 長期作用型免疫毒素および製造方法 3、補正?する者 事件との関係 特許出願人 名称 チノフイ 4、代理人 明細書、図面 7、補正の内容 号・lトi通・1 f11 明細書の浄8(内容に変更なし)。 (2) 図面の浄書(内容に変更なし)。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)チオエーテル基又はジスルフィド基を含む2価の
共有結合構造を介して抗体又は抗体断片がリボソームを
不活性化する糖タンパクと結合した包合体からなり、そ
の炭水化物単位が過ヨウ素酸イオンによる酸化により変
性されていることを特徴とする長期作用型免疫毒素。 (2)チオエーテル基又はジスルフィド基を含む2価の
共有結合構造を介して抗体又は抗体断片がリボソームを
不活性化する長期作用型糖タンパクと結合した包合体か
らなり、該長期作用型糖タンパクがリボソームを不活性
化する糖タンパク(そのチオール基を適宜保護して)を
過ヨウ素酸アルカリ金属塩の水溶液で0〜15℃で、光
の不存在下で0.2〜24時間処理して得られたもので
あることを特徴とする長期作用型免疫毒素。 (3)下記一般式、 P′−W−GPIR−1a′ (式中、P′は抗体または抗体断片であるタンパクPの
ラジカルで他の官能基が適宜ブロックされ、GPIR−
1a′はリボソームを不活性にする糖タンパクであり、
その炭水化物単位が過ヨウ素酸イオンで酸化変性された
タンパクGPIR−1aのラジカルを表わし、Wはチオ
エーテル基またはジスルフィド基を含む2価の共有結合
構造であってイオウ原子がPおよびGPIR−1aのシ
スティンか、又はP又はGPIR−1aのいずれかに属
する官能基を有する介在基を介してP又はGPIR−1
aに属する基に結合していることを特徴とする長期作用
型免疫毒素。 (4)下記一般式、 P′−W−GPIR−1a′ (式中、P′は抗体または抗体断片であるタンパクPの
ラジカルで他の官能基が適宜ブロックされ、GPIR−
1a′はリボソームを不活性にする糖タンパクであり、
そのGPIR−1a′がリボソームを不活性化する糖タ
ンパク(そのチオール基を適宜保護して)を過ヨウ素酸
アルカリ金属塩の水溶液で0〜15℃で、光の不存在下
で0.2〜24時間処理して得られたものであり、Wは
チオエーテル基またはジスルフィド基を含む2価の共有
結合構造であってイオウ原子がPおよびGPIR−1a
のシスティンか、又はP又はGPIR−1aのいずれか
に属する官能基を有する介在基を介してP又は GPIR−1aに属する基に結合していることを特徴と
する長期作用型免疫毒素。 (5)下記一般式で表わされる免疫毒素。 P′−W′−GPIR−1a′ (式中、P′およびGPIR−1a′は特許請求の範囲
第3項の場合と同じ。W′は下記群から選ばれる共有結
合構造を示す。 (a)▲数式、化学式、表等があります▼ (b)▲数式、化学式、表等があります▼ (c)−Z−Y−E−S−S−(E′−Y′−Z′)_
n−(d)−(Z′−Y′E′)_n−S−S−E−Y
−Z−、(上式中、ZおよびZ′はGPIR−1aおよ
びPに属する原子団を示し、1つのチロシン残基の水酸
基に由来する酸素原子、GPIR−1aとPのグルタミ
ン酸およびアスパラギン酸またはそのいずれかの末端な
いし遊離カルボキシル基の1つに由来のカルボニル基、
Pの糖鎖を過ヨウ素酸で酸化したあと得られるジアルデ
ヒド構造に由来の基、および1つのリシン残基のε位の
アミンの1つ若しくはGPIR−1aとPの末端アミン
の1つに由来の−NH−基から選ばれる。上記(b)、
(c)の共有結合構造体のZはPの糖鎖構造の一つの酸
化により得られるジアルデヒド構造から生ずる基。 EおよびE′は不活性な介在分子を示す。 そして、nは0または1である。) (6)下記一般式で表わされる免疫毒素。 P′(W′−A−1a′)m (式中、mは0.3ないし12の数値、P′は抗体また
は抗体断片であるタンパクPのラジカルで他の官能基を
適宜ブロックしたもの、A−1a′はシスティン171
および257のチオール基の少なくとも一つを保護した
リシンA鎖を過ヨウ素酸アルカリ金属水溶液で0〜15
℃、光不存在下で0.2〜24時間処理し、チオール基
の脱保護をおこなうことにより得られるリボソーム非活
性化糖タンパクのラジカルを示し、W′は下記群から選
ばれる共有結合構造を示す。 (2)▲数式、化学式、表等があります▼ (b)▲数式、化学式、表等があります▼ (c)−Z−Y−E−S−S−(E′−Y′−Z′)_
n−(d)−(Z′−Y′−E′)_n−S−S−E−
Y−Z−(式中、Z、Z′、Y、Y′、E、E′および
nは特許請求の範囲第3項と同じ) (7)一般式 P′(W′−A−1a′)_m (式中、W′およびA−1a′は特許請求の範囲第6項
と同様、P′は抗体断片Fab又はFab′、mは0.
3〜2である。) で表わされる特許請求の範囲第6項記載の免疫毒素。 (8)一般式 P′(W′−A−1a′)_m (式中、W′およびA−1a′は特許請求の範囲第6項
と同様、P′は抗体断片F(ab′)_2、mは0.5
〜4である。) で表わされる特許請求の範囲第6項記載の免疫毒素。 (9)一般式 P′(W′−A−1a′)_m (ただし、P′はIgGタイプの抗体、mは0.5〜6
である。) で表わされる特許請求の範囲第6項記載の免疫毒素。 (10)一般式 P′(W′−A−1a′)_m (ただし、P′はIgMタイプの抗体、mは1〜12で
ある。) で表わされる特許請求の範囲第6項記載の免疫毒素。 (11)ジスルフィド又はチオエーテル結合を直接又は
分圧原子団を介して抗体又は抗体断片と糖タンパクとの
間に形成させ、その糖鎖単位を過ヨウ素酸イオンで酸化
修飾させたことを特徴とするチオエーテル基又はジスル
フィド基を含む2価の共有結合構造を介して抗体又は抗
体断片がリボソームを不活性化する糖タンパクと結合し
た包合体からなり、その炭水化物単位が過ヨウ素酸イオ
ンによる酸化により変性されていることを特徴とする長
期作用型免疫毒素の製造方法。 (12)抗体と、リボソーム不活性化糖タンパクとの間
にジスルフィド又はチオエーテル型の共有結合を有する
長期作用型免疫毒素の製造方法であって、糖タンパク(
そのチオール基を適宜保護して)を過ヨウ素酸アルカリ
金属塩の水溶液で0〜15℃で、光の不存在下で 0.2〜24時間処理して得るようにしたことを特徴と
する方法。 (13)タンパクP_1(リボソーム不活性化長期作用
型糖タンパク、GPIR−1a又は抗体もしくは抗体断
片であって、遊離チオール基が直接又は介在原子団を介
して結合したもの)を水溶液中、室温でタンパクP_2
(P_1と異なり、リボソーム不活性化長期作用型糖タ
ンパク、GPIR−1a又は抗体もしくは抗体断片であ
ってタンパクP_1の遊離チオール基と結合し得る基を
有するもの)と反応させ、チオエーテル又はジスルフィ
ド結合を形成させることを特徴とする特許請求の範囲第
4項記載の免疫毒素の製造方法。 (14)一般式 P_1′−(Z−Y−E)_nSH (IV)のタンパク
を一般式 P_2′−Z′−Y′−E′−G (V) のタンパクと反応させることを特徴とする特許請求の範
囲第5項記載の免疫毒素の製造方法。 (ただし、式中P_1′およびP_2′はこれらタンパ
クに属する基に結合されたタンパクP_1およびP_2
のラジカル、又はP_1およびP_2が抗体もしくは抗
体断片であるときは過ヨウ素酸との反応により糖鎖核の
開鎖により生じたタンパクP_1およびP_2のラジカ
ル、Z、Z′、Y、Y′、E、E′は前記同様、Gは ▲数式、化学式、表等があります▼又は−S−S−X (ただし、Xは活性化基) である) (15)一般式 GPIR−1a″−O−CO−E−G (IX)で表わさ
れる免疫毒素。 (ただし、GPIR−1a″はGPIR−1a又はチロ
シンのフェノール水酸基の1以上を除去する官能基の修
飾によりGPIR−1aから得られる分子であり、酸素
原子がP_2″ラジカルから除かれたフェノール水酸基
に属するものであり、Eは不活性介在構造であり、Gが ▲数式、化学式、表等があります▼ 又は−S−S−X(ただし、Xは活性化基である)であ
る。)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8502068A FR2577135B1 (fr) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | Immunotoxines a longue duree d'action comportant un constituant glycopeptidique inactivant les ribosomes modifie sur ses motifs polysaccharidiques |
FR8502068 | 1985-02-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61200925A true JPS61200925A (ja) | 1986-09-05 |
JPH0725701B2 JPH0725701B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=9316241
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60274840A Expired - Lifetime JPH0725701B2 (ja) | 1985-02-13 | 1985-12-06 | 長期作用型免疫毒素および製造方法 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0192002B1 (ja) |
JP (1) | JPH0725701B2 (ja) |
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