CH647411A5 - Procede de preparation de produits cytotoxiques. - Google Patents

Description

La présente invention a pour objet un procédé de préparation de produits cytotoxiques pour le traitement du cancer, constitués par un agent cytotoxique couplé à une immunoglobuline spécifique de cellules cancéreuses. Ces substances présentent la particularité de demeurer inactives pendant leur transfert et de ne devenir actives qu'après fixation sur les cellules cibles et pénétration dans ces cellules. L'immunoglobuline utilisée peut être un anticorps spécifique d'un antigène déterminé ou encore un fragment de cette molécule possédant la capacité de reconnaissance spécifique vis-à-vis de l'antigène tel que par exemple les fragments habituellement désignés sous le nom de Fab, F(ab)' ou F(ab')2. En ce qui concerne la substance cytotoxique, la chaîne A de la ricine semble constituer une substance très intéressante.

Il est en effet connu que la ricine, lectine toxique extraite des graines de Ricinus communis, est constituée par l'association par un pont disulfure de deux chaînes polypeptidiques. La chaîne A ou ef-fectomère porte une activité intense de cytotoxicité par inhibition de la protéosynthèse dans les cellules d'Eucaryotes. Mais cette chaîne A ne possède pas la propriété de pénétrer efficacement dans les cellules pour y exercer son activité biologique. Par ailleurs, la chaîne B de la ricine ou haptomère possède la propriété de reconnaître à la surface des cellules des motifs saccharidiques avec lesquels elle crée une association de haute affinité. Des phénomènes naturels permettent alors de faire pénétrer la molécule de ricine dans le contenu cellulaire où la chaîne A vient exercer son activité toxique. La toxicité de la ricine est dénuée de toute spécificité vis-à-vis de tel ou tel type de cellules dans la mesure où la quasi-totalité des cellules animales porte des déterminants saccharidiques reconnus par la chaîne B.

Le procédé de préparation de produits cytotoxiques selon l'invention est caractérisé en ce qu'on provoque la formation d'une liaison covalente au moyen d'un pont disulfure entre un composé cytotoxique, soit la chaîne A de la ricine, et un anticorps, dirigé contre un antigène donné, ce dernier porté par les cellules que l'on veut détruire. Il tend à réaliser des molécules mixtes artificielles désignées par le terme conjugués dans lesquelles la chaîne A de ricine est associée par une liaison covalente convenable, de préférence du type disulfure, non pas à la chaîne B mais à une structure protéique capable de reconnaître sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses de cet antigène. Ainsi que nous l'avons indiqué précédemment, cette structure protéique sera une immunoglobuline spécifique de l'antigène désiré ou tout fragment de cette immunoglobuline possédant la même spécificité de reconnaissance.

Le choix de la chaîne A de ricine comme constituant cytotoxique des conjugués découle principalement des raisons suivantes : - un niveau d'activité cytotoxique extrêmement élevé lorsque et seulement lorsque la chaîne A a pénétré dans le contenu cellulaire des cellules visées,

— un mécanisme de cytotoxicité basé sur la perturbation d'une fonction fondamentalement vitale de la cellule, à savoir sa capacité de protéosynthèse,

— un niveau de toxicité non spécifique très bas par rapport au niveau de toxicité spécifique dans la mesure où la chaîne A ne possède pas par elle-même la propriété de pénétrer dans les cellules sans qu'elle soit liée à une autre molécule convenable permettant la fixation aux membranes cellulaires. Cette molécule convenable est la chaîne B dans le cas de la ricine, et dans le cas de l'invention, une immunoglobuline spécifique capable de reconnaître à la surface des cellules-cibles un récepteur spécifique et de créer avec ce récepteur une association présentant une constante d'association élevée.

Une tentative pour réaliser des conjugués entre immunoglobuli-nes et chaînes peptidiques constitutives de la ricine a été signalée [«Annals of the New York Academy of Sciences», 277, 690 (1976)]. Toutefois, la spécificité obtenue in vitro dans cet essai est extrêmement faible, et cela pour diverses raisons:

— la chaîne A de la ricine n'a pas été isolée de la chaîne B avant conjugaison avec l'anticorps,

— les anticorps utilisés n'étaient pas purs et contenaient des quantités importantes de protéines non anticorps et d'anticorps autres que ceux qui sont spécifiquement dirigés contre l'antigène-cible,

— le couplage de la toxine avec l'anticorps a été réalisé en utilisant du glutaraldéhyde, produit susceptible de provoquer la dénaturation de l'anticorps ou de la toxine par formation de ponts d'une façon non spécifique à l'intérieur d'une chaîne peptidique ou entre les diverses chaînes peptidiques, ce qui revient à une polymérisation aléatoire.

La présente invention permet de surmonter toutes ces difficultés et d'obtenir des conjugués présentant une spécificité marquée pour les cellules-cibles et utilisables pour le traitement du cancer.

Isolement et purification de la ricine et de sa chaîne A

La graine de Ricinus communis contient la lectine toxique connue sous le nom de ricine. Elle contient en outre une autre lectine moins toxique désignée sous le nom d'agglutinine par suite de ses propriétés agglutinantes pour les cellules et particulièrement pour les hématies. Cette agglutinine est constituée de deux sous-unités dont chacune résulte, comme la ricine, de l'association par un pont disulfure de deux chaînes glycoprotéiques.

Enfin, la graine de Ricinus communis contient d'autres protéines de natures diverses ainsi qu'une grande quantité de lipides qui sont les constituants de l'huile de ricin.

L'extraction de la ricine commence par un broyage des graines de Ricinus communis fournissant une pâte qui doit être débarrassée de son huile au moyen d'un solvant des lipides, par exemple par épuisements répétés avec de l'éther éthylique. Après séchage, la poudre obtenue est extraite à froid par agitation avec une solution de chlorure de sodium en milieu légèrement acide, de préférence à une température ne dépassant pas 4° C. Après séparation des sédiments, l'extrait est longuement dialysé d'abord contre de l'eau, puis contre un tampon de faible force ionique (TRIS-HCl, 10 mM, pH = 7,7). Au cours de la dialyse, il intervient une légère précipitation; le précipité est séparé par filtration ou centrifugation.

L'extrait ainsi obtenu contient l'ensemble des protéines solubles de la graine de Ricinus communis, à savoir la ricine, l'agglutinine et diverses autres protéines. Cette solution peut être congelée à —20° C, température à laquelle elle se conserve pendant plusieurs semaines.

La purification de la ricine à partir de l'extrait brut a déjà été décrite dans la littérature. En général, elle fait appel à des techniques chromatographiques: Chromatographie par échange d'ions, Chromatographie sur tamis moléculaire ou encore Chromatographie d'affinité. Le plus souvent, ces différentes méthodes sont combinées entre elles, conduisant à des techniques longues et délicates, difficilement applicables pour obtenir des quantités importantes de ricine. Selon

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l'invention, il est possible d'obtenir la ricine pure par une unique Chromatographie d'affinité qui permet de séparer la ricine successivement des protéines étrangères puis de l'agglutinine. Pour cela, l'extrait brut est déposé sur une colonne de Sépharose 4B (gel d'agarose en particles sphériques, à la concentration de 4%, commercialisé par la société Pharmacia), puis élué de façon séquentielle. En utilisant un tampon TRIS-HCl, 50 mM, pH=7,7, on élue les protéines de la graine qui ne sont pas des lectines, puis en utilisant une solution de galactose de concentration comprise entre 0,28 et 0,56 mM, on obtient la ricine pure. Enfin, avec une solution de galactose 0,1 M on obtient l'agglutinine. La séparation entre les constituants est totale en une seule Chromatographie si le volume de Sépharose 4B utilisé est tel que la charge en protéines totales appliquées sur la colonne ne dépasse pas la capacité de celle-ci.

Après cette étape, une concentration par ultrafiltration permet d'obtenir aisément une solution de ricine pure contenant de 5 à 10 mg/ml de produit dans un tampon de faible force ionique. La solution contient en outre un peu de galactose (environ 0,4 mM). Congelée à —20° C, cette solution peut se conserver plusieurs semaines.

Les deux chaînes constitutives de la ricine peuvent être séparées après coupures sélective de l'unique pont disulfure qui les réunit. Cette coupure est effectuée par un agent réducteur tel que le mercapto-2 éthanol ou le dithiothréitol dont la concentration dans le milieu réactionnel doit être d'au moins 2%.

La séparation des deux chaînes a déjà été décrite par des méthodes utilisant l'échange d'ions sur divers types de supports, méthodes basées essentiellement sur les différences des points isoélectriques des deux chaînes. Selon l'invention, un procédé de séparation des deux chaînes A et B de la ricine a été mis au point, utilisant non seulement la différence des points isoélectriques des deux chaînes, mais également leurs affinités différentes vis-à-vis des supports chromatogra-phiques polysaccharidiques contenant des dérivés du galactose. L'emploi de tels supports présente également l'avantage de retenir les traces éventuelles de ricine non coupée qui pourraient subsister dans le mélange.

Dans la pratique, la solution de ricine dans le tampon de faible force ionique obtenue précédemment est additionnée à température ambiante de l'agent réducteur (mercapto-2 éthanol, par exemple) à la concentration de 2,5% Vol/Vol, puis la solution est déposée sur une colonne constituée de DEAE CL Sépharose 6B (gel commercialisé par la société Pharmacia et utilisé pour la Chromatographie par échange d'ions; il est préparé à partir de Sépharose, ou gel d'agarose, par réticulation avec du dibromo-2,3 propanol et élimination des groupes sulfate par hydrolyse alcaline, puis introduction des groupes diéthylaminoéthyle; concentration 6% dans le gel) dans le même tampon contenant de l'agent réducteur. Les deux chaînes se fixent sur la colonne par liaisons ioniques vis-à-vis des groupements DEAE, et la chaîne B se fixe en outre par affinité sur la matrice de Sépharose.

L'élution de la chaîne A est effectuée par augmentation de la force ionique et du pH toujours en présence de l'agent réducteur afin d'empêcher toute recombinaison entre les deux chaînes (tampon d'élution: TRIS-HCl 0,1M, pH 8,4 contenant NaCl 0,1M et mercapto-2 éthanol à 2,5%).

Dans ces conditions, la chaîne B reste totalement fixée. Elle peut être éluée par un mélange de chlorure de sodium 0,2M et de galactose 0,1M dans le même tampon.

Une variante du procédé de séparation des chaînes A et B consiste à utiliser pour la Chromatographie un support sur lequel les phénomènes d'échange d'ions et de tamisage moléculaire interviennent simultanément. Ainsi en utilisant le QAE Séphadex A50 (échangeur d'ions, basique fort, obtenu par fixation de groupements ammonium quaternaire sur Séphadex, ou gel de dextrane, par liai-sions éther; commercialisé par la société Pharmacia), on peut éluer la chaîne A pure avec le tampon TRIS-HCl 100 mM, pH = 8,4 contenant 0,5% de mercapto-2 éthanol, tandis que la chaîne B est éluée avec le même tampon contenant en plus du chlorure de sodium 75 mM.

Dans un cas comme dans l'autre, le choix du support chromato-graphique est très important et divers autres supports essayés n'ont pas permis d'obtenir une bonne séparation de la chaîne A.

La chaîne A obtenue par l'un ou l'autre de ces procédés s'est révélée pure vis-à-vis des différents critères analytiques et ne nécessite pas d'autre purification. Toutefois, pour effectuer son couplage ultérieur avec des anticorps, il est nécessaire de disposer de solutions assez concentrées et dépourvues en particulier de l'agent réducteur. Pour ce faire, la solution de chaîne A dans le TRIS obtenue précédemment est dialysée contre un tampon phosphate 10 mM pH=6,5, ce qui élimine à la fois le TRIS, le chlorure de sodium, le mercapto-2 éthanol et les traces de galactose.

La solution ainsi obtenue est déposée sur colonne de carboxy-méthylcellulose, puis la chaîne A est éluée en augmentant simultanément la concentration et le pH du tampon de 10 mM, pH=6,5 à 125 mM, pH=7,0 en présence d'EDTA 1 mM. On obtient ainsi une solution assez concentrée (environ 5 mg/ml) prête pour les réactions de couplage.

On peut également concentrer et purifier la solution diluée obtenue en soumettant cette solution à une étape de concentration sur support C. M Sépharose® combinant les effets d'échange d'ions et d'affinité; on peut obtenir une solution présentant à la fois une concentration élevée et une très grande pureté. En outre, une telle solution laisse déposer par refroidissement la chaîne A sous forme cristallisée.

La chaîne A ainsi préparée (à l'état de solution concentrée ou à l'état de cristaux) est dépourvue de toxicité non spécifique envers des systèmes cellulaires ou des organismes animaux et est donc utilisable pour la confection de conjugués dont la spécificité est strictement apportée par l'anticorps.

Préparation d'anticorps purs

Selon l'invention, la préparation des anticorps est menée de façon à obtenir des anticorps purs exempts de molécules sans activité anticorps, cela afin de conférer aux conjugués préparés ultérieurement la spécificité d'action la plus complète, caractéristique non observée dans les préparations décrites dans la littérature.

L'immunisation est effectuée répétitivement pendant plusieurs mois selon un procédé classique, afin d'obtenir une hyperimmunisa-tion des animaux. On recueille ainsi plusieurs litres d'immun-sérum que l'on peut stocker à —20° C avant de le soumettre aux opérations de purification.

La purification est effectuée par immuno-adsorption en utilisant un gel de Sépharose 4B activé par le bromure de cyanogène sur lequel a été fixé un antigène correspondant à l'anticorps spécifique à purifier. Après séparation de la phase liquide, un lavage intense permet d'éliminer toutes les protéines non fixées sur le gel, puis avec un éluant convenable on libère les anticorps fixés sur le gel. Cette méthode peut s'appliquer à divers anticorps de spécificités différentes. Selon l'invention, la population d'anticorps du sérum peut' être ainsi fractionnée de façon à sélectionner les anticorps de la plus haute affinité pour l'antigène. En excès d'anticorps par rapport à la quantité d'antigène fixée sur le gel, le gel retient préférentiellement les anticorps de la plus haute affinité.

Dans la pratique, on opère avec un excès d'anticorps tel que seulement une fraction des anticorps de l'immun-sérum est fixée sur la colonne, tandis que le reste est éliminé par lavage. Dans ces conditions, l'affinité moyenne des anticorps éliminés par lavage est plus faible que celle des anticorps fixés sur la colonne et élués ensuite. On obtient ainsi une population d'anticorps d'une affinité plus homogène que celle contenue dans l'immun-sêrum de départ.

Lorsque l'on veut opérer sur des quantités élevées d'anticorps, ce qui nécessite des colonnes de grandes dimensions, on détermine au préalable la quantité d'immun-sérum à utiliser sur un gel donné contenant l'antigène en effectuant une série de micro-immuno-adsorp-tions avec des quantités croissantes d'antisérum. Le dosage des anticorps par la méthode radio-immunologique dans la phase liquide éliminée permet de déterminer le rapport antigène/anticorps laissant

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échapper dans cette phase la fraction indésirable de l'anticorps introduit au départ.

Préparation des conjugués chaîne A de ricine - anticorps

Cette partie de l'invention a pour objet d'associer par une liai-sion covalente de type disulfure, d'une part, une immunoglobuline spécifique d'un antigène déterminé ou tout fragment de cette molécule possédant la capacité de reconnaissance spécifique vis-à-vis de l'antigène avec, d'autre part, la chaîne A de la ricine. Le choix d'une liaison disulfure entre la chaîne A et l'immunoglobuline s'appuie sur les arguments suivants:

— ce type de liaison est celui qui existe dans la molécule naturelle de ricine, et on peut espérer qu'il est particulièrement apte à présenter la chaîne A sous une conformation qui facilite sa pénétration dans la cellule tout en respectant au mieux sa propriété biologique fondamentale d'inhiber la protéosynthèse,

— ce type de liaision est biochimiquement labile, ce qui assure à la chaîne A ainsi couplée la possibilité d'être libérée de sa protéine porteuse dans le contenu cellulaire,

— la chaîne A de ricine possède un seul résidu de cystéine dans sa structure, donc un seul groupement SH capable de créer une liaison disulfure. Par suite, les conjugués formés en engageant ce groupe SH dans un pont disulfure seront chimiquement bien définis et ne modifieront en rien la structure de la chaîne A, assurant ainsi le maintien intégral de son activité biologique,

— il existe des méthodes efficaces permettant de réaliser une telle liaison disulfure dans des conditions assez douces pour assurer l'intégrité des propriétés biologiques des constituants protéiques des conjugués formés.

Pour réaliser de tels conjugués, il est nécessaire que les protéines à coupler portent chacune au moins un atome de soufre naturellement apte ou artificiellement rendu apte à créer la liaison disulfure recherchée, que ces atomes de soufre préexistent dans les protéines ou aient été chimiquement introduits sur ces protéines. Comme indiqué précédemment, la chaîne A de ricine présente naturellement un seul atome de soufre permettant le couplage souhaité. C'est celui de la fonction thiol de l'unique résidu de cystéine inclus dans la chaîne A. En ce qui concerne l'immunoglobuline ou ses fragments, plusieurs cas sont à considérer:

1. Dans le cas d'une immunoglobuline entière, il n'existe pas naturellement dans ces protéines de fonction thiol libre ni d'autres atomes de soufre susceptibles d'être utilisés pour le couplage. Il conviendra donc, dans ce cas, d'introduire artificiellement sur la molécule d'immunoglobuline un ou plusieurs atomes de soufre de façon que:

— les propriétés biologiques de l'immunoglobuline ne soient pas profondément altérées,

— ce ou ces atomes de soufre puissent ultérieurement être engagés dans la liaison disulfure à établir avec une ou plusieurs molécules de chaîne A de ricine.

2. Dans le cas d'un fragment Fab, la situation est absolument identique à celle décrite ci-dessus.

3. Si l'on emploie un fragment de type Fab', on peut utiliser l'atome de soufre contenu dans la fonction thiol libre pour réaliser le couplage à la chaîne A. Toutefois, on peut utiliser également l'introduction artificielle d'un ou plusieurs atomes de soufre; il convient dans ce cas de bloquer au préalable la fonction thiol libre de façon stable par exemple par alkylation.

4. Enfin, si l'on veut coupler un fragment F(ab')2 d'immunoglobuline, il est nécessaire, comme pour l'immunoglobuline entière, d'introduire artificiellement sur F(ab')2 un ou plusieurs groupements soufrés.

Dans tous les cas où l'introduction dans l'immunoglobuline ou ses fragments d'un ou plusieurs radicaux soufrés est effectuée, il est nécessaire d'éviter toute substitution dans le site de reconnaissance de l'antigène ou dans son environnement immédiat qui pourrait perturber les propriétés de reconnaissance de l'anticorps. Afin d'exclure ce risque, on peut bloquer temporairement le site de reconnaissance de l'antigène pendant la réaction de substitution en traitant préalablement l'anticorps par l'antigène spécifique ou un autre antigène présentant une réaction croisée suffisante ou encore un haptène convenable.

L'opération de protection temporaire peut être effectuée:

— soit en phase liquide si le complexe anticorps/antigène (ou haptène) est soluble dans le milieu réactionnel,

— soit en phase hétérogène si ce complexe est spontanément insoluble ou encore si on l'a volontairement insolubilisé par une procédure convenable et notamment en fixant l'antigène (ou l'haptène) sur un support insoluble de telle sorte que le support modifié ainsi obtenu présente une affinité suffisante pour l'anticorps.

Après l'étape de substitution, il conviendra de débloquer le site de reconnaissance de l'antigène sur l'anticorps par une procédure convenable d'élimination de l'antigène afin de régénérer les capacités de reconnaissance spécifique de l'anticorps.

Pour réaliser le pont disulfure entre les deux protéines, il n'est pas possible de mettre en présence les deux constituants du conjugué portant chacun un groupement SH et de procéder à une oxydation. Dans ces conditions, en effet, la réaction de couplage est une réaction équilibrée très difficile à rendre complète. De plus, la réaction souhaitée est accompagnée de la formation de polymères de chacun des deux constituants d'où résulteraient un rendement très bas en produit désiré et la présence d'impuretés très difficiles à éliminer.

Selon l'invention, la préparation du conjugué est effectuée en mettant en présence l'une des protéines porteuse de son groupement SH libre avec l'autre protéine dans laquelle le groupement SH est activé par transformation en un disulfure mixte avec un radical organique soufré convenable. La préparation du conjugué peut être représentée par le schéma:

pj-sh + p2-s-s-x - pj-s-s-p2 + xsh dans lequel Pi et P2 représentent les deux protéines à coupler et X désigne le radical activateur. De ce schéma, il découle immédiatement que dans chaque cas la réaction de couplage peut être effectuée selon deux variantes suivant que Pi rèprésente l'immunoglobuline ou son fragment et P2 représente la chaîne A de ricine ou inversement.

Cas où P, représente l'anticorps ou un fragment et P2 représente la chaîne A de ricine

Pour effectuer l'activation du SH libre de la chaîne A de ricine, on utilise la solution de chaîne A préparée comme indiqué précédemment et on la soumet à une réaction d'échange:

ash + xssxü a-s-s-x + xsh (1)

dans laquelle ASH représente la chaîne A de ricine et X le radical activateur.

En particulier, X peut désigner un groupe pyridyl-2 ou -4 éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyle, halogène ou des groupes carboxyliques, ou encore X peut représenter un noyau phényle éventuellement substitué par un ou des groupements nitrés ou carboxyliques. La réaction 1 est équilibrée, mais l'équilibre peut être déplacé aisément vers la droitee en utilisant un grand excès molaire du réactif XSSX qui est généralement peu coûteux et facilement accessible. Il est possible de contrôler l'avancement de la réaction 1 par spectrophotométrie dans l'ultraviolet ou le visible, car le composé XSH qui se forme y manifeste une absorption intense. Lorsque la réaction a atteint le degré d'avancement souhaité, l'excès de réactif X—S—S—X ainsi que le produit de réaction X—SH sont éliminés par dialyse ou filtration sur gel de tamis moléculaire. Finalement, on obtient une solution pure du composé A—S—S—X dans le tampon choisi. Si nécessaire, cette solution après congélation peut être conservée pendant plusieurs semaines.

Par ailleurs on prépare l'immunoglobuline substituée par un groupement SH. Pour ce faire, on utilise la solution d'immunoglobuline obtenue précédemment soit telle quelle, soit après blocage de son site de reconnaissance de l'antigène par l'haptène correspondant

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suivi d'une élimination de l'excès d'haptène. Par action sur cette protéine d'anhydride S-acétylmercaptosuccinique, il est possible de fixer sur la protéine par ses groupements aminés libres un ou plusieurs groupes S-acétylmercaptosuccinyle par mole de protéine, puis de libérer les fonctions thiol par action de l'hydroxylamine, ainsi que 5 cela a été décrit [«Archives of Biochemistry and Biophysics», 119, 41-49 (1967)]. Une dialyse permet d'éliminer l'excès de réactifs ainsi que les produits de réaction de faible masse moléculaire.

L'ensemble de ces opérations est effectué dans un tampon phosphate à pH=7,0 et à des températures ne dépassant pas la tempéra- 10 ture ambiante. La solution finalement obtenue est débarrassée de l'haptène éventuellement utilisé comme bloqueur temporaire. Si cela est nécessaire, elle peut être concentrée par exemple par ultrafiltra-tion. Le couplage entre les deux réactifs ainsi préparés s'effectue par simple contact en solution aqueuse à température ambiante pendant 15 un temps variant de quelques heures à un jour, selon le schéma:

Prot NH—CO—CH—SH + A-S-S-X-

CH,

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ProtNHCO—CH—S—S—A + XSH

CH,

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L'avancement de la réaction est suivi par dosage spectrophoto-métrique du composé XSH formé. Celui-ci est éliminé par dialyse, et on obtient une solution du conjugué attendu qui doit encore être purifié. Il est en effet indispensable, en particulier, d'éliminer les mo- 30 lécules de A—S—S—X qui n'auraient pas réagi et qui, si elles étaient présentes dans le conjugué, pourraient entraîner une toxicité non sélective.

La purification peut être effectuée par diverses méthodes connues telles que la précipitation fractionnée à l'aide de solvants organiques 35 miscibles à l'eau ou de sels, la Chromatographie de perméation de gel ou encore la Chromatographie d'affinité sur une colonne formée d'un support insoluble sur lequel est fixé l'antigène (ou l'haptène) vis-à-vis duquel est dirigé l'anticorps employé dans la préparation du conjugué. 40

Ces méthodes de purification peuvent être appliquées directement à la solution dialysée provenant de l'étape de couplage. Toutefois on obtient de meilleurs résultats, et en particulier on évite ultérieurement la formation de polymères du conjugué, en bloquant au préalable les fonctions SH restant libres par un réactif tel que le N- 45 éthylmaléimide.

Cas où Pi représente la chaîne A de ricine et où P2 représente l'anticorps

Les produits nécessaires au couplage sont ici la chaîne A de ricine et l'immunoglobuline (ou son fragment) substituée par un groupement porteur d'un ou plusieurs atomes de soufre activés. La chaîne A de ricine est utilisée telle qu'elle est obtenue par la procédure de purification décrite. L'immunoglobuline substituée par un atome de soufre activé est préparée à partir de l'immunoglobuline elle-même, par substitution, à l'aide d'un réactif lui-même porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma:

Prot + Y-R-S-S-X -» Prot-R-SS-X

dans lequel

Prot désigne l'immunoglobuline,

Y représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif sur la protéine,

R désigne un groupement pouvant porter simultanément lçs substituants Y et —S—SX,

X désigne le radical activateur.

Un tel type de réaction avait déjà été utilisé pour coupler par un pont disulfure deux protéines (identiques ou différentes), mais l'application de ce principe au couplage d'une immunoglobuline avec la chaîne A de ricine est nouveau.

Le groupement fonctionnel Y est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quelconque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine à substituer. Parmi celles-ci, les fonctions aminées terminales des radicaux lysyle contenues dans la protéine sont particulièrement indiquées. Dans ce cas, Y pourra notamment représenter:

— un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonctions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodi-imide, et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-1 (diéthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide,

— un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible de réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler,

— un ester dit activé tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro- ou di-nitrophényle, ou encore un ester de N-hydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler,

— un anhydride interne d'un diacide carboxylique tel par exemple l'anhydride succinique qui réagit spontanément avec les fonctions aminés pour créer des liaisons amides,

^NH .

— un groupement iminoester —C^ ou R! est un groupe

NORx alkyle réagissant avec les groupes aminés de la protéine selon la réaction:

H N

HN\ Il

Prot—NH2 + /C-R2 - Prot NH-C-R2 + Ri OH R10/

X désignant un groupement fonctionnel capable de réagir avec un radical thiol libre.

En particulier, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4 éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène, carboxylique. X peut encore désigner un groupe phényle, de préférence substitué par un ou des groupes nitro- ou carboxyliques. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle tel que le groupe méthoxycarbonyle.

Le radical R désigne tout radical capable de porter simultanément les substituants Y et S—S—X. Il devra être choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés. En particulier, le groupe R peut être un groupe — (CH2)n avec n compris entre 2 et 10, ou encore un groupe r3-CH-

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CH-

I

R4

dans lequel R4 désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone et R3 désigne un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement, tel qu'un groupe amide

—NH—C—OR,

O

où R5 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. 60 La réaction du composé Y—R—S—S—X avec l'immunoglobuline est effectuée en phase liquide homogène, le plus souvent dans l'eau ou dans une solution-tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqu'à 20% en volume d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool, et 65 notamment le butanol tertiaire.

La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques heures à 24 h. Après quoi une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et en par-

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ticulier les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants, par mole de protéine, compris entre 1 et 5.

En utilisant de tels composés, le couplage avec la chaîne A de ricine est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux protéines à une température ne dépassant pas 30° C pendant un temps variant de quelques heures à un jour. La réaction a lieu selon le schéma:

Prot-R-S-S-X + ASH - Prot-R-S-S-A + XSH

dans lequel Prot—R—S—S—X représente l'immunoglobuline (ou son fragment) substituée, activée sur l'atome de soufre, et ASH représente la chaîne A de ricine. La solution obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues, ainsi qu'il a été indiqué dans le premier procédé d'obtention des conjugués.

Les caractéristiques de la présente invention seront mieux comprises à la lumière des exemples suivants qui illustrent l'invention sans en limiter la portée.

Dans les exemples qui suivent, on désignera par TPE le tampon phosphate 0,125M, pH=7,0 contenant du sel disodique de l'acide éthylènediaminetétracétique 1 mM.

Exemple 1:

Préparation de la ricine a) Extraction

On broie 1 kg de graines entières non décortiquées de Ricinus communis dans un hachoir à couteaux de façon à obtenir une pâte que l'on triture soigneusement avec 21 d'éther éthylique refroidi à 4° C. Après élimination de l'éther, on répète l'opération de délipida-tion deux autres fois avec chaque fois 21 d'éther. Après la dernière élimination de l'éther, le résidu est séché à l'air et fournit 400 g de poudre dégraissée. Cette poudre est mise en suspension dans 3400 ml de solution de chlorure de sodium 0,14M refroidie à 4° C, puis le pH de la suspension est amené à une valeur de 4 par addition d'acide acétique. La suspension refroidie dans un bain de glace est soumise à une opération d'homogénéisation par vive agitation dans le bol d'un broyeur à couteaux pendant 30 s, suivie d'une période de repos de 30 min avec refroidissement au bain de glace. Ce cycle homogénéisation/repos est effectué à 8 reprises.

Après achèvement de l'extraction, la suspension est centrifugée et fournit environ 3400 ml d'une solution claire. Celle-ci est transvasée dans un tube à dialyse de largeur à plat de 10 cm et dialysée d'abord contre de l'eau distillée (renouvelée en continu) pendant 48 h, puis pendant 24 h contre du tampon TRIS-HCl, 10 mM, pH=7,7, renouvelé en continu à un débit de 11/h. Au cours de la dialyse, il se forme un précipité qui est éliminé par filtration sur verre fritté. On recueille ainsi 3400 ml de solution brute contenant 12 mg/ml de protéines. Cette solution peut être stockée à — 20° C.

b) Purification

Une colonne de diamètre intérieur 100 mm est remplie de 51 de Sépharose 4B Pharmacia et équilibrée avec le tampon TRIS-HCl 10 mM, pH=7,7, refroidie à 4° C.

On dépose au sommet de cette colonne 1700 ml, soit la moitié de la solution brute obtenue précédemment, avec un débit de 300 ml/h. On lave ensuite la colonne avec 3 1 de tampon TRIS-HCl 10 mM, pH=7,7, en maintenant le même débit, et on élimine le filtrat qui contient les protéines non fixées par affinité sur la colonne.

On élue ensuite toujours au même débit, par 41 du même tampon contenant 0,050 g (0,28 mM) de galactose par litre et on recueille cette fraction. On élue ensuite, toujours avec un débit de 300 ml/h, par 41 du même tampon contenant 0,100 g (0,56 mM) de galactose par litre. Cette fraction est jointe à la précédente, fournissant 8 1 de solution contenant environ 300 |ig de ricine par millilitre.

Afin de pouvoir réutiliser la colonne pour une opération ultérieure, celle-ci est éluée par 1 1 du tampon TRIS-HCl, pH = 7,7, contenant 18 g (0,1 M) de galactose par litre, fournissant une fraction contenant essentiellement l'agglutinine qui est éliminée. Après lavage avec encore 1 1 du même tampon, puis avec plusieurs litres du tampon pur TRIS-HCl, pH = 7,7, la colonne est à nouveau prête à l'emploi.

Une opération identique est effectuée sur l'autre moitié de la solution brute obtenue au paragraphe a. La fraction éluée est jointe à la précédente, conduisant à 16 1 de solution de ricine dans le tampon TRIS-HCl, 10 mM, pH = 7,7 chargé en moyenne de 0,075 g de galactose par litre.

Cette solution est concentrée sur membrane d'ultrafiltration de porosité permettant le passage de molécules globulaires de poids moléculaire <30000, dans une cellule de diamètre 150 mm. On obtient finalement 762 ml de solution de ricine dans le tampon d'origine à 6,7 mg/ml. Cette solution peut être stockée à —20° C.

La ricine ainsi obtenue présente les caractéristiques suivantes: Poids moléculaire: 66 000 + 5000 déterminé par êlectrophorèse en présence de dodécylsulfate de sodium, selon «Journal of Biological Chemistry», 244, 4406-4412 (1969),

Point isoélectrique: 7,1 déterminé par êlectrophorèse en veine liquide [«Laboratory technique in biochemistry and molecular biology», vol. 5, partie II, p. 501, Ed. Work T.S. et Work E. (North Holland)].

Toutes les méthodes analytiques classiques appliquées à la ricine ainsi obtenue permettent de conclure à la pureté du produit.

Exemple 2:

Préparation de la chaîne A de ricine

150 ml de la solution de ricine obtenue à l'exemple 1 et contenant environ 1 g de ricine sont additionnés de 3,75 ml de mercapto-2 éthanol et la solution et laissée pendant 2 h à 20° C.

Cette solution est ensuite déposée en tête d'une colonne de diamètre intérieur 50 mm remplie de 1800 ml de DEAE CL Sépharose 6B Pharmacia, et équilibrée avec du tampon TRIS-HCl, 0,1M, pH = 8,4, contenant 2,5% (Vol/Vol) de mercapto-2 éthanol.

La colonne est lavée par 300 ml du tampon TRIS-HCl, 0,1 M, pH = 8,4, contenant du chlorure de sodium 0,1M et 2,5% (Vol/Vol) de mercapto-2 éthanol. On recueille une fraction unique depuis le dépôt (environ 450 ml) qui contient la chaîne A, identifiée par êlectrophorèse, à la concentration d'environ 0,89 mg/ml.

Cette fraction est soigneusement dialysée dans un tube à dialyse de largeur à plat 10 mm contre du tampon phosphate 10 mM, ph=6,5. Cette solution est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 25 mm contenant 300 ml de carboxyméthylcellulose CM52, commercialisée par Whatman équilibrée avec le tampon phosphate 10 mM, pH = 6,5. Dans ces conditions de pH et de force ionique, la chaîne A se fixe et on l'élue ensuite avec du TPE. On recueille ainsi 67 ml d'une solution de chaîne A contenant 5,72 mg/ml.

La chaîne A présente les caractéristiques suivantes déterminées de façon identique à celle mentionnée pour la ricine (exemple 1): Poids moléculaire : 30000 ± 3000,

Point isoélectrique: 7,5.

Par ailleurs, selon la méthode au DTNB [«Methods in Enzymo-logy», 25, 457 (1972) (Academic Press)], on a dosé 0,96 équivalent SH par mole de chaîne A estimée à 30 000 de poids moléculaire. La colonne de DEAE CL Sépharose 6B ayant servi à la séparation peut être régénérée en vue d'une nouvelle utilisation par lavage avec le tampon TRIS-HCl, 0,1 M, pH = 8,4, contenant du chlorure de sodium 0,1 M et du galactose 0,1 M qui élue la chaîne B fixée sur la colonne. La colonne doit être ensuite rééquilibrée avec le tampon TRIS-HCl, 0,1 M, pH=8,4, contenant 2,5% de mercapto-2 éthanol, en vue d'une nouvelle préparation de chaîne A.

Concentration de la chaîne A de ricine

La chaîne A obtenue en solution diluée est déposée sur une colonne de Chromatographie de diamètre intérieur 16 mm contenant 10 ml de Carboxyméthyl Sépharose" équilibrée avec le même tampon. Dans ces conditions, la chaîne A se fixe; elle est ensuite éluée avec le tampon TPE. La récupération est quantitative.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647441

Un dépôt de 150 mg de chaîne A permet d'éluer des fractions à la concentration moyenne de 10 mg/ml en chaîne A, représentant au total 90% de la quantité déposée sur la colonne.

La solution concentrée obtenue est d'une très grande pureté.

Obtention de cristaux de chaîne A

Une solution de chaîne A de concentration égale à 10 mg/ml est abandonnée à 4° C. Il apparaît après quelques jours des cristaux dont l'analyse, après redissolution, révèle qu'ils possèdent les mêmes propriétés physico-chimiques (poids moléculaire, point isoélectrique) et biologiques (inhibition de protéosynthèse) que la chaîne A en solution dont ils sont issus.

Exemple 3:

Préparation de la chaîne A de ricine

70 ml d'une solution de ricine obtenue selon la technique de l'exemple 1 et contenant 4 mg/ml de ricine sont additionnés de 1,75 ml de mercapto-2 éthanol et la solution est laissée 2 h à 20° C.

Cette solution est déposée sur une colonne contenant 800 ml de QAE Séphadex A50 Pharmacia équilibrée avec du tampon TRIS-HCl, 100 mM, pH = 8,4, contenant 0,5% (Vol/Vol) de mercapto-2 éthanol. L'élution est effectuée avec le même tampon.

On recueille, depuis le dépôt, une fraction de 170 ml contenant 0,9 mg/ml de chaîne A que l'on traite ensuite, comme indiqué dans l'exemple 2, à partir de l'opération de dialyse. La chaîne A ainsi obtenue présente les mêmes caractéristiques que celles obtenues dans l'exemple 2. Pour régénérer la colonne, on peut éluer la chaîne B fixée par le tampon TRIS-HCl, 100 mM, pH = 8,4, additionné de chlorure de sodium 0,15M, puis laver la colonne par le tampon TRIS-HCl, 10 mM, pH=7,7.

Exemple 4:

Préparation d'anticorps anti-DNP purs

Sous l'appellation anticorps anti-DNP, on désigne des anticorps spécifiquement dirigés contre le radical dinitro-2,4 phényle.

a) Immunisation des animaux

On réalise l'immunogène souhaité en faisant réagir le dinitro-2,4 benzènesulfonate sur la '/-globuline bovine selon une technique classique conduisant à la fixation de 52 groupements dinitro-2,4 phényle par mole de protéine (DNP52-BGG). Par immunisation avec ce produit, une fraction des anticorps formés sera spécifiquement dirigée contre l'haptène dinitro-2,4 phényle.

Trois boucs sont immunisés chacun par injection de 5 mg de DNP52-BGG dans une émulsion obtenue à partir de 2 volumes d'eau physiologique tamponnée à pH=7,4 pour un volume d'adjuvant complet de Freund. La première immunisation est suivie de 7 rappels échelonnés pendant un an. Parallèlement, chaque animal subit 12 prélèvements veineux de 11 de sang. Le sérum est préparé et conservé à —20° C. Avant l'étape de purification, on réunit 17 prélèvements dont on inactive le complément par chauffage. On centrifuge ensuite pendant 30 min à 20 000 x g pour éliminer les protéines dénaturées et les aggrégats, et enfin on filtre sur papier pour retenir les graisses en suspension. Le sérum ainsi préparé est prêt pour l'étape de purification.

b) Purification

Cette étape a pour but l'adsorption spécifique des anticorps anti-DNP du sérum sur une protéine porteuse de l'haptène dinitro-2,4 phényle fixée sur un support solide. Les substances libres ou non spécifiquement liées sont ensuite éliminées, puis les anticorps purs sont élués.

— Préparation du support d'immuno-adsorption

Le gel d'immuno-adsorption est constitué par couplage de 1630 mg d'albumine du sérum humain portant 35 groupements dini-trophényl (DNP3S-HSA) et 100 g (poids sec) de Sépharose 4B selon la technique classique. Un dosage spectrophotométrique à 280 nm et

360 nm des eaux de lavage après couplage permet de constater un rendement de fixation de 95% en DNP35-HSA. Deux cycles de lavage sont effectués: d'abord à pH = 3,0 (tampon chlorhydrate de glycine 0,8M contenant du chlorure de sodium 1M), puis à pH = 10,0 (tampon borate 0,1M contenant du chlorure de sodium 1M). Le gel est ensuite équilibré dans le tampon de travail: tampon phosphate 0,1 M, pH=7, contenant de l'azide de sodium 0,01% (poids/volume).

— Adsorption des anticorps

Avant de procéder à l'adsorption sur le gel préparé ci-dessus, il convient de déterminer le rapport volumique sérum/gel à utiliser pour ne fixer sur le support que les anticorps anti-DNP présentant la plus forte affinité. Pour obtenir ce résultat, il a été choisi de ne fixer sur la colonne que 50% de l'activité anticorps globale du sérum, laissant les autres 50% dans le liquide surnageant.

Pour un sérum donné, la détermination de la quantité de gel à utiliser est effectuée en opérant sur de petites quantités dans les conditions analytiques. Des aliquotes de 125 fil du gel immuno-absor-bant sont mises en présence de volumes de sérum en progression géométrique de raison 2 de 0,5 ml à 8 ml. Après incubation, le surnageant est dosé pour son activité anticorps anti-DNP par un dosage radio-immunologique classique («Handbook of Expérimental Immunology», vol. 1, chap. 15, pp. 1-18, Ed. Weir D.M., 2e éd. 1973) utilisant la s-N-(dinitro-2,4 phényl) L-lysine titrée sur le noyau phényle en positions 3 et 5.

On peut ainsi, pour chaque essai, exprimer l'activité anticorps restée dans le surnageant par un pourcentage (A) de l'activité de l'immun-sérum de départ avant traitement par le gel et tracer la courbe correspondant A (%) = f (rapport volumique sérum/gel). Sur cette courbe, on lit la quantité de sérum nécessaire avec 125 (il de gel pour que 50% de l'activité anticorps reste dans le liquide surnageant. Cette quantité est, dans l'expérience décrite, de 4 ml ou encore 32 ml de sérum/ml de gel d'immuno-adsorption.

Ce rapport ayant été déterminé, on agite, dans un récipient de 10 1, 6150 ml d'immun-sérum avec 193 ml de gel immuno-adsorbant pendant I h à température ambiante puis pendant une nuit à 4° C.

Après centrifugation (1000 x g, 10 min), on sépare le gel et on remet le culot solide en suspension dans 1 volume de liquide surnageant. On transvase cette suspension dans une colonne à Chromatographie (diamètre 26 mm, longueur 400 mm) équipée d'une jaquette de refroidissement à 4° C, d'un dispositif d'enregistrement des densités optiques à 280 nm et d'un collecteur de fractions. On procède alors à un lavage de la colonne avec 81 de tampon phosphate 0,1M, pH=7,0, contenant 0,01 % d'azide de sodium. Le lavage est effectué pendant 40 h à 4° C puis pendant 24 h à température ambiante. En fin de lavage, la densité optique à 280 nm est extrêmement faible (DO <0,04).

— Elution des anticorps

L'élution des anticorps anti-DNP fixés sur la colonne est effectuée par un large excès d'une solution de l'haptène dinitro-2,4 phénol.

On utilise une solution de dinitro-2,4 phénol 0,2M dans le même tampon phosphate qu'utilisé précédemment et dont l'acidité a été neutralisée jusqu'à pH=7,0 par addition de soude. La solution ainsi obtenue doit être conservée à l'abri de la lumière. Pour l'élution, on utilise 2,8 1 de cette solution passés sur la colonne à raison de 125 ml/h. Pour éliminer le dinitro-2,4 phénol de la solution éluée, celle-ci est passée immédiatement sur une seconde colonne contenant 300 ml de résine Dowex 1x10 (résine échangeuse d'ions, constituée par un polymère de styrène/divinylbenzène portant des radicaux amine quaternaire) équilibrée dans le tampon phosphate de lavage.

Les anticorps sont élués en un pic unique de protéines suivi d'une traînée. On regroupe, d'une part, les fractions obtenues de densité optique ^"0,9 (fraction B,, 700 ml) et, d'autre part, les autres fractions (fraction B2, 2000 ml). La concentration en protéines de chacune des fractions est déterminée selon «Journal of Immunologi-cal Methods», 15,101-119 (1977).

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

647 411

La fration B! contient 15,4 g d'anticorps, soit 22 g/1, et la fraction B2 contient environ 1 g d'anticorps, soit 0,5 g/1. La conservation s'effectue à — 20° C dans le tampon de lavage phosphate 0,1 M, pH = 7,0, contenant 0,01% d'azide de sodium.

Les diverses méthodes physico-chimiques utilisées et notamment l'électrophorèse en gel d'agarose sur lames, l'immuno-èlectropho-rèse, le passage sur colonne de Séphadex G200 (gel de dextrane sous forme de perles, obtenu par réticulation par l'épichlorhydrine de fractions de dextrane, utilisé pour filtration sur gel) permettent de conclure à la pureté des anticorps obtenus et notamment à l'absence de quantités décelables d'albumine (inférieure à 1/500 des anticorps) et d'immunoglobulines M dans les préparations obtenue.

L'activité immunologique des anticorps purifiés a été déterminée par la méthode de NAHM [«Journal of Immunology», 119,1 301 (1977)] en comparaison avec celle de l'immun-sérum de départ et celle des anticorps contenus dans le surnageant de l'immuno-adsorp-tion (fraction Aa).

Constante d'association moyenne

Indice de dispersion des affinités

Immun-sérum

2,0-107 M"1

0,50

Fraction At

5-105 M-1

0,22

Fraction Bj

2,5-107 M"1

0,75

Ces résultats indiquent que les anticorps purifiés (fraction Bt) présentent:

— une plus haute affinité moyenne que l'immun-sérum de départ et, bien sûr, que la fraction A1;

— une plus grande homogénéité d'affinité que l'immun-sérum. Exemple 5:

Préparation du conjugué obtenu à partir d'anticorps anti-DNP mercaptosuccinylês et de la chaîne A de ricine activée a) Préparation de la chaîne A de ricine activée

15 ml d'une solution de chaîne A dans le tampon phosphate (exemple 2) contenant 1,4 mg/ml de chaîne A sont mélangés avec 8 ml d'une solution 1,425 mM de dipyridyle-2,2' disulfure dans le même tampon. La solution est laissée au repos à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 1 lA h. On obtient ainsi une solution de chaîne A activée sur la fonction thiol contenant 0,9 mg de protéine par millilitre. Après réaction, un dosage spectrophoto-métrique à 343 nm indique que le produit formé contient 0,9 groupement activé

0"s"s"

par mole de chaîne A. La solution est purifiée par dialyse en continu pendant 18 h à la température de 5° C contre le TPE. La solution pure est conservée à —20° C.

b) Préparation de l'anticorps anti-DNP mercaptosuccinyle

A 3,3 ml d'une solution d'anticorps anti-DNP (exemple 4) contenant 25,8 mg/ml d'anticorps purs, on ajoute 0,37 ml d'une solution aqueuse de dinitro-2,4 phénol à 0,57 mg/ml, et on agite pendant 10 min à température ambiante. On additionne quantitativement cette solution à 3,06 mg d'anhydride S-acétylmercaptosuccinique [«Archives of Biochemistry and Biophysics», 96,605-612 (1962)] et on laisse sous agitation pendant 2 h à température ambiante.

A cette solution, on ajoute 0,47 ml de solution aqueuse d'hydroxylamine 0,1 M, pH = 8,0, et on laisse l'A h à température ambiante. La préparation est dialysée contre quatre fois 3 1 de TPE pendant 89 h à 5° C, puis la solution dialysée est centrifugée à 27 000 x g pendant 10 min à 4° C. Le surnageant est passé sur une colonne de résine Dowex 1 x 8 de granulation 200 à 400 mesh, sous forme phosphate, afin d'éliminer le dinitro-2,4 phénol fixé sur le site de reconnaissance de l'antigène.

On élue avec le TPE à température ambiante, puis on concentre la solution par ultrafiltration. Finalement, on obtient 4,55 ml de solution contenant 17,0 mg/ml d'anticorps mercaptosuccinylé.

Selon la méthode décrite dans «Archives of Biochemistry and Biophysics», 119, 41-49 (1967), on peut déterminer que la molécule d'anticorps substituée porte 4 groupements mercaptosuccinyle par mole d'anticorps.

c) Conjugué

On mélange 12,4 ml de solution de chaîne A de ricine activée (préparée selon la technique du paragraphe a) à 1 mg/ml, soit 0,413 [xmol, avec 6,5 ml d'une solution d'anticorps anti-DNP portant 4 groupes mercaptosuccinyle (préparée suivant la méthode du paragraphe b) à 15 mg/ml, soit 0,658 (imol. On laisse le mélange au repos pendant 20 h à température ambiante et à l'abri de la lumière.

Le dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridinethione-2 libérée dans le milieu réactionnel indique que 0,251 jimol de chaîne A a été couplée à 0,658 jxmol d'anticorps. La préparation est dialysée contre trois fois 5 1 de TPE pendant 75 h à 5° C, puis la solution obtenue (17 ml) est filtrée sur membrane stérilisante (0,45 |im) et conservée à —20° C. On procède ensuite à une purification par filtration sur gel de Séphadex G200. Pour ce faire, 7 ml de la solution obtenue ci-dessus sont centrifugés à 27 000 x g pendant 10 min, et le liquide surnageant est traité par 0,6 ml d'une solution de N-éthyl-maléimide à 0,645 mg/ml dans le TPE pendant 30 min au repos à température ambiante. La solution est filtrée dans le sens ascendant sur une colonne (diamètre 26 mm) contenant 473 ml de gel de Séphadex G200. Le produit est élué par le TPE à un débit de 16 ml/h et l'efïluent est recueilli par fractions de 2 ml.

Dans chaque fraction, on mesure la concentration de l'anticorps par spectrophotométrie à 280 nm et celle de la chaîne A par son pouvoir inhibiteur sur la protéosynthèse acellulaire. On met ainsi en évidence l'existence de deux pics d'élution contenant à la fois de l'anticorps et de la chaîne A, et l'on regroupe les fractions correspondant à chacun de ces pics pour obtenir les solutions a et b.

Au premier pic (solution a) correspond le conjugué de poids moléculaire moyen supérieur ou égal à 800 000. Cette préparation correspond à un conjugué issu d'anticorps polymérisés par ponts disulfure intermoléculaires formés lors de l'isolement de l'anticorps mercaptosuccinylé.

Le second pic (solution b) est constitué de protéines de poids moléculaire moyen 190000 correspondant à des conjugués dans lesquels l'anticorps n'est pas polymérisé.

Les déterminations analytiques effectuées permettent de montrer que la solution a contient 423 (xg/ml d'anticorps et 20 ng/ml de chaîne A, soit environ et en moyenne 0,2 mol de chaîne A par mole d'anticorps. De même, la solution b contient 171 |xg/ml d'anticorps et 13 (xg/ml de chaîne A, soit environ et en moyenne 0,4 mol de chaîne A par mole d'anticorps.

Exemple 6:

Préparation du conjugué obtenu à partir d'anticorps anti-DNP substitués par des atomes de soufre activés et de chaîne A de ricine a) Acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique

Ce produit s'obtient en deux étapes à partir de dipyridyle-2,2' disulfure sans purification du produit intermédiaire.

n rri2fii ^ s-s-VV\scl

HS-CH2-CH2-C00H J^jj

► tî ^^S-S-CKL-CH.j-C-OH

L L f |

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647411

10

On dissout 4 g de dipyridyie-2,2' disulfure dans 25 ml de chlorure de méthylène et on fait barboter du chlore dans la solution pendant environ 30 min. Il se forme un précipité au cours de la réaction. On évapore à siccité sous vide poussé et on utilise le résidu sec pour l'opération suivante.

On dissout 2,4 g de chlorure de sulfényl-2 pyridine dans 40 ml de chlorure de méthylène et, en refroidissant par un bain de glace, on ajoute lentement sous agitation la solution de 1,75 g d'acide mer-capto-3 propionique dans 10 ml de chlorure de méthylène. L'addition terminée, on laisse sous agitation à température ambiante pendant 15 h. On ajoute 50 ml d'eau et on amène le pH à 4,5 par addition de soude IN. On sépare la phase organique, on sèche sur sulfate de sodium, et on évapore le solvant à siccité. Il reste un produit huileux qui cristallise (1,8 g). On le purifie par dissolution dans 16,8 ml de solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,5M. On ajoute du charbon activé et on filtre la solution, puis on précipite le produit attendu par addition d'acide acétique concentré (0,5 ml) de façon à amener le pH entre 3 et 3,5. On essore le précipité que l'on sèche sous vide poussé et l'on obtient un solide (1,3 g); Fc: 62-64 C.

b) Préparation d'anticorps anti-DNP activés

Afin d'alkyler toute trace de groupement thiol qui pourrait exister dans le produit utilisé, on mélange 13 ml d'une solution d'anticorps anti-DNP à 23,6 mg/ml dans un tampon phosphate 0,1M, 25 pH = 7,0, avec 1 ml de solution N-éthylmaléimide à 1,29 mg/ml dans le TPE. On agite pendant 5 h à température ambiante, puis on soumet la solution à une dialyse en continu à 5° C contre le TPE pendant 15 h à un débit de 500 ml/h.

Le contenu du sac de dialyse (12 ml à 21,4 mg/ml) est mélangé 30 avec 24 ml d'eau contenant 19,9 mg d'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, 55,7 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique et 14 mg d'hydroxy-1 benzotriazole. Le mélange est agité pendant 16 h à température ambiante puis centrifugé à 27 000 x g pendant 10 min. La solution est dialysée en continu à 5° C contre le TPE pendant 23 h à un débit de 500 ml/h. On obtient ainsi 34 ml de solution à 7,2 mg de protéine par millilitre. Par dosage spectropho-tométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le glutathion réduit, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant quatre groupements activateurs par mole d'anticorps.

\

0 n s-s-ch2ch2c-oh c) Conjugué

16 ml de solution d'anticorps activés à 5,9 mg/ml obtenue comme ci-dessus sont mélangés avec 20 ml de solution de chaîne A de ricine à 2,8 mg/ml dans le TPE. On laisse le mélange pendant 24 h au repos à température ambiante et à l'abri de la lumière. On centrifuge à 27 000 x g à 4° C pendant 10 min.

Le dosage de la pyridine thione-2 libérée au cours de la réaction indique que 1,123 [imol de chaîne A a été couplée à la 0,638 |imol d'anticorps utilisé, soit en moyenne 1,76 Eq de chaîne A par mole d'anticorps.

La solution est dialysée en continu à 5° C contre le TPE avec un débit de 720 ml/h pendant 21 h. Le contenu du sac de dialyse (34 ml) est traité par 1 ml d'une solution de N-éthylmaléimide à 12,5 mg/ml pendant 5 h à température ambiante, puis conservée à —20° C.

Cette solution de conjugué est fractionnée sur colonne de gel de Séphadex G200 dans les conditions décrites à l'exemple 5.

On obtient ainsi 3 solutions:

— la solution c représente le conjugué de masse moléculaire moyenne 300 000,

— la solution d celui de masse moléculaire 190 000,

— la solution e celui de masse moléculaire 160 000.

La composition du conjugué dans les différentes solutions obtenues est décrite dans le tableau suivant:

Hg de chaîne A couplée

à l'anticorps par millilitre de solution

Mole chaîne A

Mole d'anticorps

Solution c

13

0,9

Solution d

48

1,0

Solution e

3

0,2

Exemple 7:

Préparation du conjugué obtenu à partir d'anticorps anti-DNP substitué par un groupe disulfure activé et de chaîne A de ricine a) Acide [(pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionylamino]-6 hexanoïque

Cet acide s'obtient en deux étapes à partir de l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique sans purification du produit intermédiaire.

h2n-(ch2)5cooh

>

0

II

0

II

s-s-ch2ch2c-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c-oh

0,430 g de l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique obtenu comme décrit dans l'exemple 6a est dissous dans 3 ml de pyridine. La solution est refroidie dans un bain de glace. A cette solution sont ajoutés 0,230 g de N-hydroxysuccinimide en poudre puis 0,453 g de dicyclohexylcarbodiimide, également en poudre. Le mélange est agité pendant 20 h à 4° C. Le milieu réactionnel est filtré pour éliminer le précipité de dicyclohexylurée formé, le précipité est lavé à la pyridine. La solution de lavage est jointe au filtrat puis la pyridine est évaporée à siccité sous vide poussé. Le résidu obtenu est repris dans l'acétate d'éthyle; un nouveau précipité de dicyclohexylurée se forme; il est éliminé par filtration. L'acétate d'éthyle est évaporé à siccité sous vide poussé, puis l'opération de lavage à l'acétate d'éthyle est reprise deux fois. On obtient ainsi 0,610 g de l'ester attendu.

55 Le produit obtenu est dissous en totalité dans 5 ml de tétra-hydrofuranne. A cette solution est ajouté 0,288 g d'acide amino-6 caproïque en solution dans 2,5 ml d'eau. De la triéthylamine est ajoutée en quantité stœchiomêtrique par rapport à l'acide amino-6 caproïque (0,222 g) pour maintenir le pH à 7,0. La réaction est so poursuivie 20 h à 4° C sous agitation. Le milieu réactionnel est évaporé à siccité sous vide poussé. Le résidu est repris par 10 ml d'eau. Le milieu est acidifié jusqu'à pH 4,5 par addition d'acide acétique. Il se forme un précipité qui est récupéré par décantation, puis solubilisé dans l'acétate d'éthyle. La solution est séchée par le sulfate 65 de magnésium puis filtrée et évaporée à siccité sous vide poussé.

On obtient 0,600 g du produit à purifier. La purification est opérée par Chromatographie de partage sur colonne de silice, dans des conditions définies par analyse du produit en Chromatographie

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sur couche mince dans un mélange acétone/chloroforme/acide acétique (15/80/5).

0,410 g du produit obtenu est déposé sur une colonne de diamètre intérieur 2 cm contenant 160 ml de gel de silice (N° 60, 60-230 mesh Merck) équilibrée avec le chloroforme. L'élution est opérée en gradient discontinu de méthanol dans le chloroforme; le produit pur est élué avec le mélange à 2% de méthanol. Les solvants sont évaporés à siccité sous vide poussé.

Le produit obtenu jaune pâle et de consistance pâteuse est caractérisé par son spectre de résonance magnétique nucléaire.

b) Préparation d'anticorps anti-DNP activés

A 9 ml de la solution d'anticorps anti-DNP à la concentration de 11,4 mg/ml dans le tampon TPE sont ajoutés 9 ml d'un mélange eau/t-butanol 2/1 (volume/volume) contenant 5,3 g d'éthyl-1 (diméthyIamino-3 propyl)-3 carbodiimide et 13,7 mg d'acide [(pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionylamino]-6 hexanoïque. Les opérations sont ensuite menées comme décrit dans l'exemple 6.

Le dosage des anticorps indique un taux moyen de substitution de 0,6 groupement activateur par mole d'anticorps.

La solution d'anticorps ainsi obtenue est concentrée par ultrafil-tration jusqu'à 11,1 mg/ml.

c) Conjugué

48,8 g d'anticorps modifiés sont mis en réaction avec 35,6 mg de la chaîne A de ricine à 7,9 mg/ml dans le tampon TPE. La préparation est menée dans les conditions déjà décrites dans l'exemple 6 de la demande principale. Le taux de couplage moyen obtenu est de 0,5 chaîne A par mole d'anticorps. La purification du conjugué par filtration est effectuée comme décrit dans l'exemple 6.

Exemple 8:

Préparation du conjugué obtenu à partir du fragment F( ab)', de l'anticorps anti-DNP et de la chaîne A de ricine a) Préparation du fragment F( ab)'2 de l'anticorps anti-DNP

La solution d'anticorps (exemple 4) est dialysée contre le tampon acétate 120 mM, pH=4,7. A 45 ml de cette solution contenant 500 mg d'anticorps, on ajoute 3 ml d'une solution de pepsine à la concentration de 10 mg/ml dans le même tampon (pepsine E.C. 3.4.1. de porc, deux fois cristallisée, à 3200 (i/mg - Sigma). L'incubation est maintenue pendant 20 h à 37° C; l'avancement de l'hydrolyse est vérifié en êlectrophorèse en présence de dodécylsulfate de sodium [«J. Biol. Chem.», 244, 4406-4412 (1969)] par disparition de la bande à 150 000 daltons correspondant à l'anticorps non hydro-lysé.

L'hydrolyse est arrêtée par ajustement du pH du milieu réactionnel à 7,0 à l'aide d'une solution de soude IN, puis la solution est centrifugée et l'insoluble éliminé. Le surnageant de centrifugation est déposé sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1800 ml de Séphadex Gl 50® équilibrée avec le tampon phosphate 100 mM, pH=7,0.

L'élution est effectuée avec le même tampon: le premier pic obtenu est recueilli en deux fractions; la première (200 ml) renferme 70 mg de fragment F(ab)'2 de l'anticorps, la deuxième (100 ml) renferme 70 mg d'un mélange de fragment F(ab)'2 et d'un fragment contaminant de poids moléculaire 50 000 daltons. Le deuxième pic contient des fragments protéiques de poids moléculaire moyen 10 000 daltons; il est écarté.

Le fragment F(ab)'2 obtenu pur dans la première fraction du premier pic est concentré par ultrafiltration (protocole décrit dans l'exemple 1 de la demande principale) jusqu'à la concentration de 16 mg/ml et conservé à —20° C.

Le fragment F(ab)'2 ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes:

Poids moléculaire : 95000 daltons (déterminé après étalonnage du gel Séphadex G150®).

Point isoélectrique: compris entre pH 7,7 et 8,8 (obtenu par isoélec-trofocalisation sur plaque LKB).

b) Préparation du fragment F( ab ) \ activé

A 15 ml de la solution F(ab)'2 à la concentration de 15,6 mg/ml sont ajoutés 15,3 ml d'un mélange eau/t-butanol 2/1 (volume/volume) contenant 17,3 mg d'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide et 50,4 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique. Le mélange est incubé pendant 20 h à 30° C. La solution est ensuite dialysée en continu contre le tampon TPE à 4° C pendant 23 h à un débit de 500 ml/h. Le dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridinethione-2 libérée par échange avec le glutathion réduit montre que l'activation du fragment F(ab)'2 a conduit au taux moyen de substitution de 1,5 groupement activateur par mole de F(ab)'2.

La solution de F(ab)'2 activé ainsi obtenue est concentrée par ultrafiltration jusqu'à 10 mg/ml.

c) Conjugué

A 13,8 ml de la solution à 10 mg/ml en F(ab)'2 activé obtenue comme décrit ci-dessus sont ajoutés 13,8 ml de solution de chaîne A de ricine à 8 mg/ml dans le tampon TPE.

Le mélange est incubé à température ambiante pendant 24 h sous atmosphère d'azote et à l'abri de la lumière. La solution est ensuite centrifugée à 27 000 x g, à 4° C pendant 10 min, et le surnageant est récupéré. Le dosage de la pyridinethione-2 libérée au cours de la réaction indique que le taux moyen de couplage est de 1,2 Eq de chaîne A par mole de F(ab)'2.

La solution est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1730 ml de Séphadex G200®. L'élution est effectuée avec le tampon TPE. Les fractions sont recueillies sous un volume de 8,4 ml et l'analyse des fractions est effectuée comme décrit dans les exemples 5 et 6. Le produit de conjugaison sort en un pic.

Les fractions composant le pic du conjugué sont regroupées en trois solutions qui sont respectivement:

Solution f: front du pic;

Solution g: partie centrale du pic;

Solution h: queue du pic.

L'analyse de la solution g par dosage de son activité inhibitrice de la protéosynthèse (test 1) et le dosage des protéines donnent les résultats suivants:

(ig de chaîne A couplée

à F(ab)'2 par millilitre de solution

Equivalents de chaîne A par mole de F(ab)'2

Solution g

148

1,4

d) Concentration du conjugué

En une première étape, la concentration est effectuée par ultrafiltration: 255 ml de la solution g du conjugué (à 148 |ig/ml en chaîne A) sont ainsi concentrés jusqu'à 381 |xg/ml. La solution est ensuite diluée dix fois dans l'eau distillée afin d'abaisser la force ionique du milieu.

La solution obtenue (400 ml à 38 ng/ml en chaîne A) est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 9 mm contenant 5,7 ml de C. M. Sépharose® équilibrée avec le tampon phosphate 10 mM, pH = 6,5, additionné de sel disodique de l'acide éthylènediamino-tétracétique 1 mM.

Le dépôt est effectué au débit de 80 ml/h. Dans ces conditions, la totalité du conjugué se fixe sur la colonne. A la fin du dépôt, on laisse passer 4,5 ml du même tampon, puis l'élution du conjugué est réalisée avec le tampon TPE, au même débit.

Le conjugué sort en un seul pic. La queue du pic, contenant peu de protéines, est écartée; les fractions restantes sont regroupées et la concentration en chaîne A est déterminée.

Le dosage indique que l'opération de concentration sur C. M. Sépharose® a permis de porter la concentration de la chaîne A du con5

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jugué à 3,6 mg/ml. L'opération est quantitative et les fractions composant la solution à 3,6 mg/ml représentent au total 76% de la quantité de conjugué déposé sur la colonne.

Exemple 9:

Préparation du conjugué obtenu à partir de l'anticorps IgM anti-Thy 1.2 et de la chaîne A de ricine a) Préparation de l'anticorps IgM anti-Thy 1.2

L'IgM pure est préparée à partir du liquide d'ascite obtenu auprès d'OLAC LTD (Thy-1.2 F7 D5 monoclonal IgM cytotoxic antibody).

A 50 ml de liquide d'ascite contenant l'anticorps sont ajoutés 15 g de sulfate d'ammonium en poudre. Après dissolution, le mélange est incubé pendant 1 h à 4e C, puis l'ensemble est centrifugé pendant 20 min à 17 000 x g.

Le surnageant de centrifugation est écarté. Le culot est dissous dans 20 ml de tampon phosphate 100 mM, pH=7,0, puis la solution est dialysée en continu contre 101 du même tampon. La solution obtenue est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1800 ml de Sépharose 6B® équilibrée avec le tampon phosphate 100 mM, pH=7,0. L'élution est effectuée avec le même tampon: le premier pic obtenu correspond à des agrégats d'IgM. Le deuxième pic obtenu est recueilli en deux fractions: la première fraction (du front jusqu'au sommet du pic) est composée d'IgM pure; la deuxième fraction renferme un mélange de l'IgM et d'une protéine contaminante de poids moléculaire évalué à environ 660 000 daltons. Cette deuxième fraction est traitée à nouveau par le sulfate d'ammonium et le précipité obtenu est centrifugé puis redissous dans le tampon phosphate 100 mM, pH=7,0. La solution obtenue est déposée sur la colonne de Sépharose 6B® convenablement lavée après la première opération. L'élution par le tampon phosphate 100 mM, pH = 7,0, donne lieu, comme lors de la première opération, à l'apparition de deux pics. Le deuxième pic obtenu contient l'IgM pure. Chacune des deux opérations de filtration sur Sépharose 6B® a ainsi permis d'obtenir une fraction renfermant l'IgM pure. Ces deux fractions sont réunies, puis l'ensemble est traité par le sulfate d'ammonium à la concentration finale de 300 mg/ml, à 4° C; la préparation est centrifugée pendant 20 min à 17 000 x g, puis le culot est repris dans le tampon phosphate 100 mM, pH=7,4, additionné de chlorure de sodium 400 mM.

L'ensemble des opérations permet de préparer 8 ml d'une solution à 6,4 mg/ml d'IgM pure. L'analyse en êlectrophorèse en présence de dodécylsulfate de sodium a été utilisée pour caractériser les fractions; l'IgM pure ainsi obtenue présente à l'analyse deux bandes très proches, d'intensités égales correspondant aux poids moléculaires très voisins de 900 000 daltons.

b) Préparation de l'anticorps anti-Thy 1.2 activé

A 7,6 ml de la solution d'IgM à la concentration de 7,0 mg/ml sont ajoutés 0,46 ml d'un mélange eau/t-butanol 1/5 (volume/volume) contenant 2,9 mg d'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbo-diimide et 7,7 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique. Le mélange est incubé pendant 20 h à 30° C. La solution est ensuite dialysée en continu contre le tampon phosphate 100 mM, pH=7,4, additionné de chlorure de sodium 400 mM et du sel disodique de l'acide éthylènediaminotétracétique 1 mM. La dialyse est poursuivie pendant 23 h à 4° C à un débit de 500 ml/h. La solution est ensuite centrifugée à 27 000 x g à 4° C pendant 10 min et le surnageant récupéré. Le dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridinethione-2 libérée par échange avec le glutathion réduit montre que l'activation de l'anticorps a conduit au taux moyen de substitution de 13 groupements activateurs par mole d'IgM.

c) Conjugué

La solution de chaîne A obtenue comme décrit dans l'exemple 2 est dialysée en continu contre le tampon phosphate 100 mM, pH=7,4, additionné de chlorure de sodium 400 mM et de sel disodique de l'acide éthylènediaminotétracétique 1 mM; la dialyse est menée à débit de 500 ml/h pendant 20 h à 4° C.

A 6,8 ml de la solution d'IgM activée obtenue comme décrit ci-dessus sont ajoutés 3,9 ml de chaîne A dialysée, à la concentration de 7,4 mg/ml. Le mélange est incubé pendant 24 h à température ambiante, sous atmosphère d'azote et à l'abri de la lumière. Le dosage de la pyridinethione-2 libérée au cours de la réaction indique que le taux moyen de couplage est de 9,7 Eq de chaîne A par mole d'IgM.

La solution est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1727 ml de Sépharose 6B® équilibrée avec le tampon de conjugaison. L'élution est menée avec le même tampon. Les fractions sont recueillies sous un volume de 3,7 ml et l'analyse des fractions est effectuée comme décrit dans les exemples 5 et 6 de la demande principale. Le produit de conjugaison sort en deux pics: le premier correspond au conjugué de poids moléculaire moyen supérieur à celui de l'IgM, le second pic correspond au conjugué de poids moléculaire moyen approximativement équivalent à celui de l'IgM. La partie centrale de ce pic (solution i) est retenue.

La composition du conjugué de la solution i correspond aux caractéristiques suivantes:

Hg de chaîne A couplée

à l'IgM par millilitre de solution

Equivalents de chaîne A par mole d'IgM

Solution i

23,7

3,2

Les conjugués selon l'invention ainsi que les composés utilisés dans l'élaboration desdits conjugués ont été étudiés en ce qui concerne leurs propriétés biologiques et tout particulièrement leur action anticancéreuse. Le principe des différents tests utilisés est exposé ci-après.

Tests in vitro

1. Inhibition de la protéosynthèse

La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la protéosynthèse microsomale par altération de la sous-unité ribosomale 60S.

a) Modèle acellulaire (test 1)

Le protocole in vitro correspondant à un modèle de protéosynthèse acellulaire utilise des fractions subcellulaires de foie de rat convenablement complémentées et capables d'incorporer la 14C-phényl-alanine en présence d'un ARN messager artificiel: l'acide polyuridy-lique.

Le mode opératoire employé pour préparer les fractions subcellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14C-phénylalanine est une adaptation de la méthode décrite dans «Biochimica Biophysica Acta», 312, 608-615 (1973), mettant en œuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépatocytes de rat. L'échantillon contenant la chaîne A est introduit sous la forme d'une solution convenablement diluée dans un tampon TRIS-HCl 50 mM, pH=7,6, contenant du mercapto-2 éthanol à 0,2% et de la sérumalbumine bovine à 15 |ig/ml.

A partir des données de comptage on calcule, par rapport à un milieu témoin sans inhibiteur, le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 14C-phénylalanine dans les protéines par chaque milieu réactionnel contenant de la chaîne A de ricine.

A partir de ces résultats, on peut calculer la concentration de la chaîne A dans le milieu réactionnel qui inhibe de 50% l'incorporation de radioactivité dans les protéines. Cette concentration inhibi-trice 50 (CI 50) permet de caractériser toute préparation contenant de la chaîne A.

Le même protocole permet aussi de doser la chaîne A présente dans un échantillon en comparant le pourcentage d'inhibition donné par cet échantillon à une gamme étalon obtenue dans les mêmes

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conditions en utilisant des solutions de concentration connue en chaîne A pure.

b) Modèle cellulaire (test 2)

Ce test mesure l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans des cellules cancéreuses en culture.

Les cellules utilisées sont les cellules Hela, issues d'une biopsie d'adénocarcinome cervical humain maintenues en lignée continue par culture en monocouche.

Ces cellules sont incubées en présence de préparations des substances à étudier puis soumises en fin d'incubation à une mesure de leur taux d'incorporation de 14C-leucine. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la technique décrite dans «Journal of Biological Chemistry», 249 (11), 3557-3562 (1974) utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du taux de protéosynthèse. La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration.

A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/ doses présentant en abscisse la concentration des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation par des cellules témoins en l'absence de la substance à étudier.

On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe de 50% l'incorporation de 14C-leucine, ou concentration inhibitrice 50 (CI 50). On a vérifié que la mesure d'incorporation de la 14C-leucine dans les cellules entières conduit à la détermination de CI 50 identiques à celles obtenues par la méthode classique de mesure de la protéosynthèse.

Lorsque l'on veut étudier des conjugués préparés avec les anticorps anti-DNP, il est nécessaire que les cellules Hela puissent être reconnues par ces anticorps et portent donc des motifs hapténiques à leur surface. Les cellules Hela sont donc transformées en cellules-cibles par marquage avec un haptène convenable. On a choisi dans la pratique d'utiliser comme haptène le groupement trinitro-2,4,6 phényl ou TNP. La fixation des groupements TNP sur les cellules Hela est effectuée par action du trinitro-2,4,6 benzènesulfonate (TNBS) selon une adaptation des techniques décrites dans «Biochimica Biophysica Acta», 255,79-90 (1972) et «Journal of Immuno-logy», 111, 930-937 (1973).

La modification de la méthode consiste essentiellement dans le choix des paramètres de la réaction: température 4° C et arrêt par un excès de lysine après 15 s de réaction.

Ce marquage a été retenu pour diverses raisons:

— faible toxicité du TNBS sur les cellules Hela,

— haut niveau de réaction croisée entre DNP et TNP,

— niveaux d'incorporation de 14C-leucine comparables entre cellules marquées et cellules non marquées.

La concentration de TNBS dans le milieu réactionnel (10 mg/ml) entraîne la fixation sur chaque cellule de 7 • 107 motifs hapténiques accessibles aux anticorps. La constante d'association entre anticorps anti-DNP et motifs hapténiques est de 1,2 ■ 107.

Pour le conjugué à spécificité anti-Thy 1.2, les cellules utilisées sont de la lignée WEHI-7 (lymphome de souris Balb/C) obtenue auprès du Salk Institute, San Diego (Californie). Ces cellules ne subissent aucune étape de marquage, car elles portent naturellement l'antigène Thy 1.2 à leur surface. L'incubation avec le conjugué puis la mesure du taux de protéosynthèse se déroulent comme décrit précédemment.

2. Hémagglutination

Le test d'hémagglutination [«Journal of Biological Chemistry», 249, 803 (1974)] est destiné à comparer la capacité des différentes préparations étudiées à se fixer sur la membrane d'hématies humaines de groupe O Rhésus négatif.

Le test peut être:

— soit direct (test 3) par mise en présence de la substance à étudier avec des hématies et il conduit, selon la dose de substance, à une réponse négative ou positive,

— soit indirect (test 4). Dans ce cas, après le test direct, on sensibilise la détection de la substance éventuellement fixée sur les hématies par addition aux hématies séparées par décantation du milieu réactionnel d'un immun-sérum contenant des anticorps susceptibles de reconnaître la substance étudiée et dont l'activité hémagglutinante propre a été éliminée par absorption sur hématies du même groupe.

Test in vivo

1. Toxicité aiguë {Issi 5)

L'étude de la toxicité aiguë est faite par injection intrapéritonéale ou intraveineuse de la substance à étudier mise en solution isotonique, à des lots d'animaux. Les animaux sont observés pendant 7 d et on note la mortalité pour chaque dose étudiée. On détermine ensuite la dose létale 50% (DL 50).

2. Effet des conjugués sur le développement de cellules cancéreuses

Le modèle choisi consiste à étudier l'effet des substances à essayer sur la prise, sous forme de tumeurs solides, de cellules cancéreuses injectées à l'animal.

La méthode expérimentale consiste à injecter à des souris nude (nu/nu congéniques Bomlholtgaard), connues pour ne pas rejeter les greffes allogéniques ou xénogéniques, des cellules Hela portant l'haptène TNP et à traiter ces souris par injection simultanée ou ultérieure du composé à étudier.

Divers essais ont été réalisés:

a) Test 6: Préincubation des cellules Hela-TNP avec le conjugué, suivie de l'injection à l'animal par voie sous-cutanée.

On détermine ensuite la taille des tumeurs éventuellement développées par mesure de deux diamètres orthogonaux de la tumeur selon la technique décrite dans «Annales d'Immunologie» (Institut Pasteur), 124 C, 567-572 (1973).

b) Test 7 : Injection intrapéritonéale des cellules Hela-TNP suivie de l'injection, également dans la cavité intrapéritonéale, du composé à étudier.

A la fin de l'expérience, la taille des tumeurs est déterminée par mesure du poids des tumeurs collectées après sacrifice des animaux.

Les différents tests in vitro et in vivo ainsi décrits ont été utilisés pour étudier les propriétés des conjugués ainsi que des subtances utilisées pour la préparation des conjugués.

Ricine et chaîne A

La ricine et la chaîne A ont été soumises aux différents tests in vitro ainsi qu'au test de toxicité in vivo-, de plus, la chaîne A purifiée par l'étape de concentration sur C. M. Sépharose indiquée dans le tableau par chaîne (A)p a été soumise aux mêmes tests.

Les résultats obtenus figurent dans le tableau I ci-après.

Ces résultats indiquent que la ricine possède un fort pouvoir inhibiteur de la protéosynthèse, tant dans un système acellulaire que dans un système cellulaire. En milieu acellulaire, la chaîne A inhibe également fortement la protéosynthèse mais, par contre, ne peut exercer son effet en milieu cellulaire lorsqu'elle est séparée de la chaîne B.

On observe le même phénomène sur les tests d'hémagglutination et le test de toxicité aiguë dans lesquels la ricine se révèle beaucoup plus active que la chaîne A.

Ces résultats indiquent en outre que l'étape de concentration sur C. M. Sépharose permet d'abaisser encore la toxicité non spécifique de la chaîne A par une augmentation notable de la pureté de la préparation. La chaîne A purissime ainsi produite est dépourvue de toxicité non spécifique envers un système cellulaire; cela est clairement montré par le rapport d'activité entre la ricine et la chaîne (A)p dans ce test, qui est supérieur à 10000.

Des essais d'absorption exhaustive de la chaîne A ont été menés en utilisant successivement des excès de cellules Hela et d'hématies mises en contact de la chaîne A et en mesurant la toxicité cellulaire de la chaîne A dans le surnageant d'absorption (test 2):

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— la toxicité cellulaire de la solution de chaîne A non concentrée sur C.M. Sépharose est abaissée par absorption et ramenée ainsi au niveau de la toxicité de la solution de chaîne A concentrée sur C. M. Sépharose et non absorbée;

— au contraire, la toxicité de la préparation concentrée sur C. M. Sépharose n'est plus diminuée par les essais d'absorption, ce qui confirme l'absence totale d'affinité de la chaîne (A)p ainsi préparée envers les membranes plasmiques des cellules et, par voie de conséquence, le degré extrême de pureté obtenu.

Anticorps anti-DNP

Les anticorps anti-DNP sur le test d'inhibition de la protéosynthèse en système cellulaire ne produisent aucun effet jusqu'à la plus forte concentration testée, soit 10_6M.

Par ailleurs, dans le test de toxicité aiguë, aucune manifestation de toxicité n'a été relevée jusqu'à la dose la plus forte testée, soit 1,6 mg d'anticorps par animal.

Conjugués

Une première série d'essais a pour but de vérifier l'intégrité des propriétés de la chaîne A, d'une part, et de l'anticorps, d'autre part, dans les conjugués préparés.

Tout d'abord, par un test radio-immunologique («Handbook of Expérimental Immunology», vol. 1, chapitre 15, pp. 1 à 18; Ed. D.M. Weir, 2e éd. 1973), on a pu constater que l'activité anticorps anti-DNP du conjugué est équivalente à l'activité de l'anticorps seul.

Par ailleurs, en ce qui concerne la chaîne A du conjugué, l'activité inhibitrice vis-à-vis de la protéosynthèse acellulaire a été déterminée sur un échantillon de conjugué (exemple 4, solution a), d'une part, et sur un autre échantillon identique incubé pendant 30 min avec une solution de mercapto-2 éthanol à 0,2% en vue de rompre le pont disulfure, d'autre part.

On a obtenu une CI 50 de 59,4 ng/ml de chaîne A dans le premier cas et de 9,2 ng/ml de chaîne A dans le second, soit un rapport d'activité de 1 à 6,6.

Cela montre que l'essentiel de l'activité inhibitrice de la protéosynthèse n'apparaît qu'après que le conjugué a été préalablement traité par le mercapto-2 éthanol pour rompre la liaison disulfure créée.

Le fait qu'une activité inhibitrice soit décelable sans traitement par le mercapto-2 éthanol ne contredit pas cette conclusion dans la mesure où le milieu de dosage utilisé contient des thiols qui interviennent partiellement dans la libération de la chaîne A couplée à l'anticorps.

En conclusion, les conjugués obtenus selon l'invention respectent les propriétés de chacun de leurs constituants.

Une autre série d'essais a pour objet de déterminer l'efficacité thérapeutique des conjugués.

a) Effet sur le modèle cellulaire (test 2)

— Les fig. 1 et 2 donnent les courbes représentant, en fonction de la dose du conjugué utilisé (dose exprimée en concentrations (nM) de chaîne A), le pourcentage d'inhibition d'incorporation de la 14C-leucine par les cellules Hela marquées au TNP. Le conjugué utilisé sur ces figures est le conjugué d'anticorps anti-DNP et de la chaîne A tel que décrit dans les exemples 5 et 6. A titre de comparaison, l'action du conjugué sur des cellules Hela non marquées est également représentée (traits discontinus).

Ces courbes ont été obtenues, respectivement pour les fig. 1 et 2, avec le conjugué de l'exemple 5 (solution b) et avec le conjugué de l'exemple 6 (solution e). Ces courbes montrent que l'effet inhibiteur à 50% de la protéosynthèse cellulaire des cellules Hela-TNP est obtenu pour des concentrations très inférieures (CI50 = 11 x 10~9M pour la solution b et 7,5 x 10"9M pour la solution e), à celles nécessaires pour obtenir le même effet avec des cellules Hela non marquées (CIS0 = 130 x 10_9M pour la solution b et 1000 x 10_9M pour la solution e).

D'autre part, si le milieu d'incubation est additionné de sérumal-bumine bovine-DNP (1 mg/ml), l'effet inhibiteur du conjugué est entièrement annulé.

— La fig. 3 représente les résultats obtenus avec le conjugué

5 formé à partir de la chaîne A de ricine et du fragment F(ab)'2 d'IgG anti-DNP. Les coordonnées sont les mêmes que celles des fig. 1 et 2. Les résultats sont fournis pour:

(I) la ricine CIS0 (en chaîne A) 5,5 • 10-UM,

(II) la chaîne A CIJ0 9 • 10"7M,

io (III) le conjugué sur Hela CU50 non déterminable > 10" 5M,

(IV) le conjugué sur Hela-a TNP CI50 4,5 ■ 10_9M.

— La fig. 4 présente l'inhibition de l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules WEHI-7 en utilisant le conjugué formé à partir de la chaîne A et de l'IgM anti-Thy 1.2. Les coordonnées sont

15 les mêmes que celles des fig. 1 et 2. Les résultats sont fournis pour:

(I) la ricine CIJ0 (en chaîne A) 2,4 • 10"11M,

(II) la chaîne A CI50 8,1 • 10~7M,

(III) le conjugué CIS0 (en chaîne A) 5,2- 10_11M.

Enfin, on peut signaler que le conjugué formé à partir de la 20 chaîne A de ricine et de l'IgG anti-DNP, en utilisant comme activateur de l'IgG l'acide [(pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionylamino]-6 hexanoïque, a une toxicité et une spécificité identiques à celles du conjugué préparé dans l'exemple 6.

On peut en conclure que les conjugués préparés selon l'invention 25 ont une action spécifique; en administrant une dose convenablement choisie du conjugué, il est possible de n'agir que sur les cellules portant l'antigène correspondant à l'anticorps utilisé.

L'établissement du pont disulfure entre la chaîne A et un anticorps spécifique d'un antigène naturellement porté par des cellules 30 cancéreuses permet la destruction des cellules cancéreuses avec une très grande efficacité et une spécificité d'action importante.

b) Test in vivo

A. Essais effectués sur le conjugué de chaîne A et d'anticorps anti-35 DNP (solutions cet d de l'exemple 6)

1. Le test 6 décrit précédemment a été utilisé avec des cellules Hela-TNP à la concentration de 10s cellules par millilitre incubées pendant 90 min à 37° C avec le conjugué (solution c) à la concentration de 10~8M exprimée en chaîne A.

40 Après centrifugation (700 x g, 10 min), le culot est remis en suspension dans le PBS [solution isotonique tamponnée sans calcium ni magnésium, «J. Exp. Med.», 99,167 (1954)] à la concentration de 107 cellules par millilitre. Les animaux (âgés de 14 semaines) reçoivent par voie sous-cutanée 0,1 ml de cette suspension, soit 10® cellu-45 les.

Un lot témoin reçoit des cellules non incubées avec le conjugué. Une observation journalière des animaux est effectuée, qui s'accompagne de la mesure de la surface des tumeurs. On considère comme prise toute tumeur dont la surface est supérieure ou égale à 50 10 mm2 (limite de sensibilité du test).

— La fig. 5 représente le pourcentage cumulatif des prises de tumeurs de surface > 10 mm2 en fonction du temps après avoir injecté aux souris soit des cellules Hela (courbe en trait plein), soit des cellules Hela marquées au TNP (courbe en traits interrompus),

55 soit des cellules Hela marquées au TNB et préincubées avec le conjugué (courbe en traits interrompus et pointillés). Sur la figure, on peut constater l'efficacité du conjugué qui diminue fortement la prise des tumeurs.

L'observation jusqu'au 50e jour montre la prise des tumeurs dans 60 80% des cas pour les cellules Hela non traitées par le conjugué et dans 70% des cas pour les cellules Hela TNP non traitées par le conjugué.

Ce pourcentage n'est que de 20% dans le cas de cellules Hela-TNP préincubées avec le conjugué.

65 La différence est statistiquement significative au risque de 5 %.

2. On utilise le test 7 en injectant par voie intrapéritonéale aux animaux (âgés de 10 semaines) 2-10® cellules Hela-TNP en suspension dans 0,1 ml d'un milieu de culture.

15

647 411

On injecte ensuite 0,1 ml de conjugué contenant 36 |ig de chaîne A (solution d concentrée 7,5 fois par ultrafiltration).

Un lot témoin reçoit la même injection de cellules Hela-TNP,

mais ne reçoit pas de traitement par le conjugué.

Au 25e jour aprè le début de l'expérience, les animaux sont sacri- s fiés et les tumeurs sont pesées.

Sur la fig. 6 est représenté pour chacun des animaux des 2 lots, témoins à gauche, traités à droite, le logarithme décimal du poids des tumeurs en milligrammes. Le seuil de détection est de 5 mg, soit un logarithme décimal de 0,7. io

Sur cette figure, on peut constater que pour le lot témoin la prise tumorale a eu lieu dans 14 cas sur 15 (14 points au-dessus du seuil de détection, 1 seul point au-dessous). A l'inverse, dans les cas des animaux traités, la prise tumorale ne s'est effectuée que dans 1 cas sur 15 (1 seul point au-dessus du seuil de détection). is

B. Essais effectués sur le conjugué de la chaîne A et de l'anticorps IgM anti-Thy 1.2 (solution i de l'exemple 9)

Les cellules cancéreuses utilisées sont de la lignée WEHI 22.1, 20 obtenue auprès du Salk Institute, San Diego (Californie), provenant d'un lymphome de souris Balb/C. Elles sont injectées à des souris Balb/C obtenues auprès de Bomholtgaard (Danemark) et maintenues depuis leur naissance et pendant la durée du test en zone indemne d'organismes pathogènes spécifiques (SPF). 25

Dans le test, les cellules WEHI 22.1 maintenues en culture continue sont collectées au 3e jour après repiquage de la culture, lavées par centrifugation et resuspendues dans un tampon phosphate isotonique (PBS) à la concentration de 12- 10e cellules/ml.

0,2 ml de la suspension est injecté par voie intrapéritonéale aux 30 souris au préalable réparties au hasard dans leurs cages et repérées individuellement par marquage des pattes.

Chez les souris non traitées par le conjugué, l'injection intrapéritonéale de cellules WEHI 22.1 est suivie du développement de ces cellules en tumeurs dispersées dans le péritoine avec formation d'une 35 ascite. Le développement des cellules s'accompagne d'une augmentation du poids corporel. L'ascite est détectée par l'observation de l'augmentation du volume abdominal.

Une heure après injection des cellules, les animaux traités par le conjugué reçoivent intrapéritonéalement 1 ml de solution du conju- 40 gué (solution i, 23,7 ng/ml en chaîne A) préalablement dialysée ex-

tensivement contre le tampon PBS, puis stérilisée par filtration. Les lots d'animaux témoins reçoivent 1 ml de tampon PBS ne contenant pas de conjugué.

Au 7e jour après incubation des cellules, les animaux traités reçoivent une deuxième injection de conjugué dans les mêmes conditions et les animaux témoins une deuxième injection de tampon PBS.

Les résultats du test apparaissent sur les fig. 7 et 8. La fig. 7 décrit la chronologie de l'apparition des ascites chez les animaux traités et non traités, la fig. 8 décrit l'évolution du poids corporel chez les animaux traités et non traités. L'évolution du poids est exprimée en augmentation (grammes) de poids par rapport au poids des mêmes animaux, 3 d avant l'inoculation des cellules.

La fig. 7 (abscisse représentant le nombre de jours après l'inoculation des cellules WEHI 22.1 et l'ordonnée représentant l'effectif des animaux en % présentant une ascite) montre l'existence d'une inhibition de la formation des ascites chez les animaux traités par le conjugué; cette inhibition se traduit par un décalage dans l'apparition des ascites (courbe en trait plein représentant les animaux traités et celle en tirets les animaux non traités).

La fig. 8 (abscisse représentant le nombre de jours après l'inoculation des cellules WEHI 22.1 et l'ordonnée l'augmentation moyenne (en grammes) de poids corporel) permet de constater également une inhibition de l'augmentation de poids corporel chez les animaux traités (trait plein) par le conjugué par rapport aux animaux témoins (tirets).

Ces observations sont validées par l'analyse statistique des résultats:

— l'inhibition par le conjugué de la formation des ascites est significative au seuil de confiance de 1 % (test x 2),

— l'inhibition par le conjugué de l'augmentation pondérale est significative au seuil de confiance 5% (test de comparaison des pentes des ajustements linéaires).

Le test in vivo permet de démontrer l'activité anticancéreuse du conjugué formé à partir de la chaîne A de ricine et de l'IgM anti-Thy 1.2. Cette activité est révélée par l'inhibition du développement de cellules cancéreuses WEHI 22.1 injectées à la souris Balb/C.

Les conjugués préparés selon l'invention présentent une spécificité d'action telle qu'il est possible d'envisager leur utilisation en thérapeutique humaine dans le traitement du cancer. Ils sont préparés pour être utilisés par voie injectable et peuvent être utilisés soit seuls, soit associés à un autre traitement du cancer.

Tableau

Désignation du test

Expression de l'activité

Ricine

Chaîne A

Chaîne (A)p

Rapport d'activité

ricine/ chaîne A

Rapport d'activité

ricin'e/ chaîne (A)p

Test 1

CI50 (mol/1)

3.10-1°

1,3- IO-10

1,3-10"10

0,43

Test 21

CI50 (mol/1)

4-10-11

5-10~8

68,6-10-8

1250

17150

Test 3

Concentration minimale hémagglutinante (mol/1)

4,2 • 10-8

8,4-10~5

2000

Test 4

3,3-10~9

1,3-10-6

400

Test 5 2

DLS0 (ng/animal)

0,25

450

1800

1 Ces résultats ont été obtenus sur cellules Hela portant ou non l'haptène TNP.

2 Par injection intrapéritonéale de 0,5 ml de solution isotonique à des souris CD-1 de provenance Charles

River France (poids moyen: 20,3 g).

R

7 feuilles dessins

Claims (16)

1. 647 411

   2

   REVENDICATIONS

   1. Procédé de préparation de produits cytotoxiques, caractérisé en ce qu'on provoque la formation d'une liaison covalente au moyen d'un pont disulfure entre un composé cytotoxique, soit la chaîne A de la ricine, et un anticorps, dirigé contre un antigène donné, ce dernier étant porté par les cellules que l'on veut détruire.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on provoque la formation d'une liaision covalente au moyen d'un pont disulfure entre un composé cytotoxique, soit la chaîne A de la ricine, et une immunoglobuline ou une fraction d'immunoglobuline spécifique d'un antigène donné, porté par les cellules que l'on veut détruire.
3. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir un composé de formule Pj—SH avec un autre composé de formule P2—S—S—X selon la réaction: Pj—SH + P2—S—S—X -► Pj —S—S—P2 + XSH, formules dans lesquelles, lorsque Px est le radical de la chaîne A de la ricine, sur lequel est fixé le groupe thiol libre de cette molécule, P2 est une immunoglobuline ou un fragment d'immunoglobuline et, inversement, quand Pi est une immunoglobuline ou un fragment d'immunoglobuline, P2 est le radical de la chaîne A de la ricine, et X est un radical organique activateur.
4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, Pj étant une immmunoglobuline ou un fragment d'immunoglobuline dans lequel on doit introduire un groupe thiol libre, avant de faire réagir l'immunoglobuline ainsi protégée avec l'anhydride S-acétyl-mercaptosuccinique et de libérer les groupes thiol par action de l'hydroxylamine, on bloque d'abord le site de reconnaissance par traitement préalable de l'anticorps avec l'antigène ou un autre antigène présentant une réaction croisée, ou encore un haptène convenable et, enfin, on débloque ce site par un procédé connu d'élimination de l'antigène.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 4, caractérisé en ce que, P2SH représentant la chaîne A de la ricine, on transforme celle-ci en disulfure par la réaction d'échange:

   P2SH + X-S-S-X i; P2-S-S-X + XSH dans laquelle X représente un radical activateur choisi parmi les suivants: un groupe pyridyl-2 ou -4, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes alkyle, halogéno ou carboxyliques, et un groupe phényle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes nitrés ou carboxyliques, la réaction s'effectuant avec un grand excès molaire du réactif XSSX, que l'on élimine en fin de réaction par dialyse ou filtration sur gel de tamis moléculaire.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que l'ensemble des réactions est effectué à pH 7,0 dans un tampon phosphate et à la température ambiante.
7. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, PiSH représentant la chaîne A de la ricine et P2 représentant l'immunoglobuline ou un fragment de celle-ci, on transforme P2 en disulfure activé selon la réaction :

   P2 + Y-R-S-S-X -» P2-R-S-S-X

   dans laquelle Y représente un groupe fonctionnel capable de se lier par covalence à l'un quelconque des groupements fonctionnels, en particulier des groupes amino, portés par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de l'immunoglobuline, R représente un groupe — (CH2)n—, n étant un entier compris entre 2 et 10, ou un groupe R3—CHCH—R4, R4 désignant un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de 1 à 8 atomes de carbone et R3 désignant un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement, tel qu'un groupe amide de formule — NH—C—ORs où R5 est un

   II

   O

   groupe alkyle droit ou ramifié de 1 à 5 atomes de carbone, et X désigne un radical activateur tel que défini ci-dessus, et pouvant être de plus un groupe alcoxycarbonyle, la réaction s'effectuant en phase liquide homogène et à température ambiante.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce qu'une fois l'ensemble des réactions terminées on purifie le conjugué obtenu pour le débarrasser du composé P2 — S—S—X n'ayant pas réagi, tel qu'une précipitation fractionnée par des solvants organi-

   5 ques miscibles à l'eau, une Chromatographie de perméation de gel, de préférence une filtration sur gel de Séphadex G200, ou une Chromatographie d'affinité sur une colonne d'un support insoluble sur lequel est fixé l'antigène correspondant à l'anticorps.
9. 9. Procédé de préparation de la chaîne A de la ricine, à l'état io pur, en tant que produit de départ du procédé selon la revendication 1 en partant de la ricine pure, caractérisé en ce qu'une solution de ricine pure dans un tampon de faible force ionique, additionnée à température ambiante d'un agent réducteur, de façon à couper sélectivement le pont disulfure, est ensuite chromatographiée sur colonne

   15 de DE-AE CL Sépharose 6B ou de QAE Séphadex A50 dans le même tampon et en présence de l'agent réducteur, et on élue sélectivement la chaîne A de la ricine par une solution-tampon de pH et de force ionique plus élevés que la précédente, toujours en présence de l'agent réducteur.

   20 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'agent réducteur est le mercapto-2 éthanol.
10. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que, après élution de la chaîne A de la ricine, la solution concentrée obtenue est refroidie et ladite chaîne A est recueillie à l'état cristallisé. 25 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que la solution d'élution de la chaîne A adsorbée sur colonne de DE-AE CL Sépharose 6B est constituée par un tampon TRIS-HCl 0,1M, de pH 8,4, contenant NaCl 0,1M et 2,5% de mercaptoétha-nol, et la solution d'élution de la chaîne A adsorbée sur colonne de 30 QAE Séphadex A50 est constituée par un tampon TRIS-HCl 100 mM, de pH 8,4, et contenant 0,5% de mercapto-2 éthanol.
11. 13. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que la solution d'élution de la chaîne A est dialysée contre un tampon phosphate 10 mM, de pH 6,5, la solution ainsi obtenue est

    35 déposée sur colonne de carboxyméthylcellulose d'où la chaîne A pure est éluée en augmentant simultanément la concentration et le pH du tampon de 10 mM et pH 6,5 à 125 mM et pH 7,0, en présence d'EDTA 1 mM.
12. 14. Procédé de préparation de la chaîne A de la ricine à l'état 4o pur en tant que produit de départ du procédé selon la revendication 1 en partant de graines de Ricinus communis, caractérisé en ce que l'extrait brut obtenu est purifié par une Chromatographie unique sur une colonne de Sépharose 4B, la charge en protéines totales ne dépassant pas la capacité de la colonne et l'élution s'effectuant de

    45 façon séquentielle, d'abord avec une solution-tampon TRIS-HCl, 50 mM, pH 7,7 qui élue les protéines qui ne sont pas des lectines,

    puis avec une solution de galactose de concentration comprise entre 0,25 et 0,56 mM qui élue la ricine pure qui est mise en solution dans . un tampon de faible force ionique et additionnée à température am-50 biante d'un agent réducteur, de façon à couper sélectivement le pont disulfure, de manière connue, et est ensuite chromatographiée sur colonne de DE-AE CL Sépharose 6B ou de QAE Séphadex A50 dans le même tampon et en présence de l'agent réducteur, et on élue sélectivement la chaîne A de la ricine par une solution-tampon de 55 pH et de force ionique plus élevés que la précédente, toujours en présence de l'agent réducteur.
13. 15. Produit cytotoxique obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un composé dit conjugué dans lequel la chaîne A de la ricine est couplée par un pont

    «o disulfure à un anticorps, capable de reconnaître sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses que l'on veut atteindre.
14. 16. Produits selon la revendication 15, caractérisés en ce que l'anticorps est un anticorps anti-DNP.
15. 17. Produits selon la revendication 15, caractérisés en ce que 65 l'anticorps est le fragment F(ab)'2 de l'anticorps anti-DNP.
16. 18. Produits selon la revendication 15, caractérisés en ce que l'anticorps est l'IgM anti-Thy 1.2.

    3

    647 411

    Depuis de nombreuses années, le traitement du cancer a donné lieu à de multiples recherches. Plus particulièrement, de très nombreuses substances ont été proposées pour le traitement chimiothéra-peutique du cancer par destruction plus ou moins sélective des cellules cancéreuses. Bien que certains résultats aient pu être obtenus, la chimiothérapie du cancer est limitée par la toxicité non spécifique des agents antinéoplasiques vis-à-vis des cellules normales à forte croissance telles que par exemple les cellules souches des lignées sanguines. Par suite, l'efficacité du traitement est insuffisante pour permettre l'élimination des dernières cellules cancéreuses, lesquelles provoqueront ultérieurement de nouvelles poussées du cancer.

    Afin de diminuer la toxicité des cancérostatiques vis-à-vis des cellules normales, divers essais ont été réalisés [voir en particulier: «C.R. Académie des Sciences de Paris», 246, 1626 (1958); «British Medicai Journal», 3, 495 (1972); «Science», 169, 68, (1970) et «Cancer Research», 35, 1182 (1975)]. Ces essais visaient à coupler des molécules à activité cytotoxique avec des anticorps dirigés contre les cellules cancéreuses dans le but d'obtenir leur fixation uniquement sur les cellules-cibles. Toutefois ces essais n'ont pas obtenu dans la pratique de résultats notables, essentiellement parce que la substance cytotoxique portée par l'anticorps restait active pendant son transfert dans l'organisme et pouvait inhiber la croissance de cellules normales avant la rencontre des cellules cancéreuses.