JPH03502098A - 酸性化された細胞内小胞内で開裂可能な蛋白質架橋試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酸性化された細胞内小胞内で開裂可能な蛋白質架橋試薬本発明は、酸性条件下で 切断できる蛋白質架橋試薬に関する。このようにして形成された架橋生成物は受 容器−仲介とシ込みを利用して、架橋蛋白質として運命された非架橋蛋白質又は 他の分子を細胞内に貯蔵し；治療性プロドラッグを構成し；そして合成およびク ロマトグラフィーの目的で蛋白質をマトリックスに可逆的に合体する（　ｃｏｕ ｐｌｅ　）ために使用できる。

発明の背景 アミノ基含有物質の液体媒体中への放出を制御するのが望ましい場合が多くある ０例えば、アミノ基含有薬剤又は細胞毒素が細胞集団又は細胞集団の特定の部員 に放出するのを制御するのが望ましいであろう、また、例えばペプチド又は蛋白 質のような大きいアミノ基含有分子の僅合体において空間的関係を分析する場合 、稽々の架橋蛋白質又はペプチドの開裂を制御するのが望ましいであろう。

制御された放出が望ましい一つの特定例は、生物学的活性化合物を、細胞膜を通 って細胞内構造体に運ぶ際に、例えば該化合物が細胞膜の外側の媒体中に捕獲さ れたなら低い又は低減された作用を有するが、細胞内で一旦放出されるともっと 強力になる場合である。

生物学的活性化合物を不均一細胞集団中の選ばれた細胞に運ぶことができるのも また望ましい０例えば、ウィルス感染細胞又は変形した又は悪性の細胞のような 病んだ又は感染した細胞を治療する場合、細胞毒素抗ウィルス剤又は成長調節因 子を病んだ又は悪性の細胞に運ぶが正常細胞には運ばないのが望ましい。

生物学的活性化合物を急性細胞にねらいを定めるために開示された一つの方法で は、抗体−毒素抱合体（ｃｏｎ−ｊｕｇｍｔｅ　）を用いる。抗体は毒性細胞に 対して特異性であシそして毒素を該細胞に運ぶ、有効となるためには、これらの 系が毒素を活性物質の効力を不必要に減じることなく、高選択的に標的細胞に運 ばなければならない、こ場合、特に重要である。

多様の蛋白質架橋試薬が市販されている。これらの架橋剤は最も広い用途では、 マレイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用したヘテロ三官 能性試薬である。二つの蛋白質の非開裂性チオエーテル結合を介する特定の合体 （ｃｏｕｐｌｉｎｇ　）は、キタガワによる米国特許第４，１５０，０３３号に 開示されているように、蛋白質の一方にＳＲ基を導入することにより達成される 。市販の開裂性架橋剤はジスルフィド、カルボン酸エステルおよびビシナルグリ コール基に限られ、−３Ｈ試薬、強求核剤又は過ヨウ素酸塩酸化を必要とし、こ れらは多くのＪ、　Ｃｈｅｍ、　１２　’：　３７５〜３７８頁；ラター（Ｌｕ ｔｔｅｒ　）外のフィト試薬は細胞内ではゆっくシしか裂かれない。

ジスルフィド結合で結合されたホロ（ｈｏｌｏ）　−Ｉｔ累抱合体の効能はチオ エーテル架橋よシも優れていないことが見出された。

追加の開裂性二官能性架橋試薬が知られており、ラン裂性ジスルフィド結合を含 む二官能性架橋試薬が開示されている。該試薬は生化学系を特徴づけるのに使用 される。

カールソン（、Ｃａｒｌｓｏｎ　）外によるＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７５　 　ニア２３〜７３７頁（１９７８年）は、二官能性試薬Ｎ−スクシンイミジル− ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを使用して二つの異なる蛋白質問に ジスルフィド結合を形成するための方法を開示している。

更に詳しくは、ある櫓の単クローン性抗体、毒素およびそれらの抱合体が知られ ている。

面構造に〜異性の毒素と単クローン性抗体とのジスルフィド結合抱合体を開示し ている。これらの抱合体は、毒素を抗体により認識された表面構造を有する特定 の細胞にねらいを定めるのに使用される。

年）は、ヤマゴボウ雑ｊＥ　（ｐｏｋｅｗｅｅｄ　）抗ウイルス蛋白質（ＰＡＰ ）を単クローン性抗体である抗−Ｔｈｙ　１−１と抱合することを開示している 。該抱合体はＴｈｙ　１−１の明らかな標的である白血病細胞内で選択的に蛋白 質合成を阻止するのに使用される。該抱合体を形成するのに使用される連結剤は Ｎ−スクシンイミジル−５−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートである。ジ スルフィド結合が切断された場合、遊離のＰＡＰ毒素が生成する。

５８３〜５８５頁（１９８０年）は、通常の急性リンパ芽球腫性白血病抗原に特 異性の単クローン性抗体（Ｊ５）を開示〜６９５５頁（１９８０年）は、蛋白質 細胞毒素であるゲロニンの製造法を開示している。

バーバリ（Ｂａｒｂｉｅｒｉ　）外のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２０３　：　５ ５〜５９頁（１９８２年）は、ヤマゴボウ抗ウイルス性蛋白質（”ＰＡＰ−５″ ）として知られる抗ウイルス性蛋白質の精製および部分的な特性指摘を開示して いる。

ネビイル（、Ｎｅｖｉｌｌｅ　）外の米国特許第４．３５９．４５７号は、リン パ１ｌｉｌ　Ｋ対する腫瘍抑制組成物として使用される、抗−Ｔｈｙ　　１．２ 単クロ一ン性抗体とりチンとの抱合体を開示している。使用される連結剤ｕｒｎ −マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。

上記の方法は、抗体−福素抱台俸の毒性に依存するか或いはジスルフィド結合開 裂に依存し、Ｓ素が標的細胞に運ばれる前に放出されるのを一時的および空間的 に回避するように制御する現象は相違する〃・もしれない。

歌開裂性蛋白賞架橋剤は、ブラットラ−（Ｂ１１ｔｔｌｅｒ　）外による米国特 許第４，５４２，２２５号および４．ｉｓＩ＆４９２号で、無水シトラコン酸基 に基づいて記載されている。この機構における欠陥には、加水分解速度が水素イ オン濃度と直線状に相関しないという事実が含゛まれ（（Ｈ＋〕の６００倍の変 化に対して加水分解の変化は３０倍）、細胞ＳＨ基が二重結合に付加するミカエ ル型付加反応によシ、不可逆的架橋結合が形成される可能性があり、小胞内ｐＨ の最低値（ｉ４）において架橋生成物がかなり加水分解する（即ちｐＨ！＞５１ Ｃて１０時間でく２５チの加水分解がある）ということを説明できず、そして組 域培養による又は生体内での蛋白質とり込みを含む系中で、非開裂性架橋剤を越 える効力を説明することができず、そして長い合成反応式を説明できない、とい う欠点がある。

カービー（Ｋｉｒｂｙ）外のＰｒｏｃ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ−５ｏｃ−Ｓｙｍｐ、 　５１　：９９〜１０３頁（ｆ９７０年）は、マレイン酸アミドにｐＨ５以下で 急速に加水分解され％そしてマレイン酸を置換するとその速度が増大し、ｔ−ブ チル直換基は敢も大きく増大させそしてメチル置換基は増大が最も小さい、とい うことを開示している。

ディクソン（Ｄｉｘｏｎ　）外のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１０９　：　５　ｆ 　２〜６１４頁（１９６８年）は、封鎖剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ　） として無水２−メチル−マレイン酸（シトラコン酸）ヲ使用してアミノ基を可逆 的に封鎖することを開示している。

シトラコニル残基とインシユリンのりジン残基との間のアミン結＠　Ｆｉｐ８６ ．５にては裂かれなかった７２０℃にて一晩ｐＨを五５に下げると、インシユリ ンは変化せずに、封鎖基が完全に放出された。

プロドラッグの概念は新しくなく、アルバート（ＡＩ−ｂｅｒｔ　）によｐ　Ｎ ａｔｕｒｅ　１８２　：　４２１〜４２３頁、１９７５年、に記載されている。

オルトエステル、アセタールおよびケクールの酸触媒加水分解性が、特にコーデ ス（Ｃａｒｄｅｓ　）外のＣｈｅｍ、　Ｒｅｖ、　７４　：　５８１〜６０３頁 、１９７４年によく記載されており、そして皮下に移殖したステロイド避妊剤を 固体のオルトエステルポリマーマトリックスからゆついアセタールプロドラッグ からアセトアミノフェンヲ胃で放出する場合〔フサイン（Ｈｕｓｓａｉｎ　）、 米国特許第４７８６．０９０号〕のプロドラッグを作るのに使用されている。

この薬剤の加水分解速度定数の対数（ｌｏｇ）　＃′ｉ、　ｐＨ２〜６の範囲で ｐＨと直線関係にあることが見出された（フサイン外、Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｓ ｅｔ、　６７　：　５４６〜５４６頁）。

細胞内の区画（ｃｏｍｐａｒｔｒｎｅｎｔ　）内で放出できる蛋白質架橋剤へ上 記の基礎的化学を延長することは、無意味なことではない、オルトエステル合成 の出発物質であるケテンアセタールは、カチオン性重合制反応のため、取扱いが 周知の逍シ躯かしい。合成経路で強酸条件を用いることができす、そして所望の マレイミド官能性が多くの方法、例えばビンナーの合成法、を制限した。これら の制限は、伝統的にきびしい条件を用いるヘテロ三官能性試薬の合成には特に煩 わしかった。

ネビイル外の米国特許第４，３５６，１１７号；４，３５ジ４５７号；４，４４ ０，７４７号：４，５ｆ６３７号；４，５２（ＬＯ１１号および４，５２へ２６ 号は、荷電の望ましくない標的細胞に向けられる単りローン性抗体−蛋白質毒素 函合体（免疫毒素）の構成の概念および利用を解明する。全リチン基材免疫Ｗ素 はりチンＡ釦免疫毒素よりも効力が大きい、かかる全毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ 　）抱合体が毒素Ａ−銭で構成されたものよシも効力が大きいことが証拠づけら れた。標的細胞と非標的細胞との区別は、リチン毒素Ｂ餉結合位置をラクトース で可逆的に封鎖することにより維持していた。

何故なら、ラクトースはとり込みの後に細胞から押し出されるので、この位Ｉｆ Ｆ′ｉ完全な免疫毒素効力に不可欠であることが示されたからである。リチン結 合位置は細胞内でリチンが効率良く膜転位するのに必要とされ、そしてラクトー スは、細胞の外側に積極的に運ばれるので、リチン結合を細胞の内側でなく細胞 の外側で封鎖する。

しかしながら、ラクトースで可逆的に封鎖されたかかる抱合体は、生体内効力に ついては制限される。何故なら、生体内で不利な影響を与えることなくラクトー スを高濃度に維持できないからである。

酸開裂性架橋剤はアシアログリコプロティン（ａｓｉａ−１ｏｇｌｙｃｏｐｒｏ ｔｅｉｎｓ　）、およびアシアログリコペプチド（ｉｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｅ ｐｔｉｄｅｓ　）、およびマンノース結合蛋白質を、酸性化した小胞内で解離し える位置に架橋することにより、リチン結合位置を可逆的に封鎖する。更に１従 米の架橋剤を用いて単りローン性系抗体と合体させることにより、部分的に封鎖 されたＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７のような突然変異体ジフテリア毒素の転 位機能〔グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆ　１ｅｌｄ　）外のサイエ７ス　２ ５８：５５６〜５３９頁、１９８７年〕は、開裂性架橋剤を用いて細胞内で切シ 離すことができる。結合領域突然変異体であるこれらの毒素変異体は、初めから 非標的細胞特異性が低減しているので、生体内の使用に適しているであろう。

酸開裂性架橋剤で構成されたＣＲＭ　１ｏｓおよびＣＲＭ１０７の免疫毒素は、 効力が従来の架橋剤よシも対数１ないし２（１〜２　ｌｏｇｓ　）だけ大きいで あろう。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、生体内である官能領域を封鎖するための 糧々の方法によシ、蛋白質に抱Ｂｊｏ１．Ｃｈｅｍ、　２５２　：　３５８２− ３５８６頁、１９７６年〕。これらのＰＥＧ抱合体は、酵素欠乏疾病を矯正する ために、身体に不足している酵素蛋白質を投与するのに使用できる。ＰＥＧ合体 物は二つの問題、即ち、抗体又は抗体以外のもの（ｅｘｔｒａ　ａｎｔｉｂｏｄ ｙ　）が仲介して血管系から未変性蛋白質を急速に除去すること、および抗体が 異質の蛋白質になること、を最小限にすることができる。急速な除去および抗原 の刺激もまた免疫毒素の生体内使用に関して問題となる。しかしながら、ＰＥＧ は抗体合体物と同様に、１８素の転位を妨害する。

発明の要旨 本発明の目的は、従来技術の上述の欠点を克服することである。

本発明の別の目的は、穏やかな酸性条件下で開裂（ｃｌｅａｖｅｄ　）できる蛋 白質用の架橋剤を提供することである。

本発明の更に別の目的は、架橋剤の合成法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、受容器仲介とり込みを用いて、架橋した蛋白質又は他 の分子として前もって細胞に運ばれた非架橋蛋白質又は他の分子を効率良く細胞 内に蓄積する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、治療用プロドラッグを提供することである。

本発明の更に別の目的は、合成およびクロマトグラフィーの目的で、蛋白質をマ トリックスと可逆的に合体（ｃｏｕ、ｐｌｅ　）さぜることである。

本発明の更に別の目的は、ガンの治療に使用できる組成物を提供することである 。

本発明の更に別の目的は、後天性免疫欠乏症候群〔エイズ（ＡＩＤＳ））の治療 に便用できる組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、ウィルスの感染サイクルを破ることができる組成物を 提供することである。

本発明の更に別の目的は、Ｔ細胞を殺すのに使用できる組成物を提供することで ある。

本発明によって、ｐＨ７よシ大にて二つのアミンおよび／またはスルフヒドリル 基含有物質を架橋し、そして穏やかな酸性条件下で、活性を殆んど又は全く弱め ることなく、これらの物質を放出する化合物が提供される。

本発明の方法によシ細胞に運ばれる好ましい生物学的活性物質は、蛋白質又はペ プチド又は薬剤又は酵素又は核酸である。最も好ましくは、活性物質は選ばれた 細胞に運ぶだめの細胞毒素、例えばリチン、ジフテリア毒素、アブリン、および その他のリポソーム−不活性化蛋白質又は延長因子２の不活性化蛋白質である。

ペプチドＳ素が好ましい、何故なら、それらは容易に試薬に結合するからであり 、そしてそれらは細胞の内側に啄めて僅かな量で存在すると、細胞蛋白質合成を 阻止する極めて強力な毒素であるからである。ペプチドでない他のアミノ基含有 細胞毒素、例えばメルフアラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ　）、プレオマイシン（ｂ ｌｅｏｍｙｃｉｎ　）、アドリアマイシン（ａｄｒｔａ−ｍｙｃｉｎ）、および ダウノマイシｙ　（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ　）、もまた本発明の範囲内である。

抱合体は、細胞表面の特性（ｆｅａｔｕｒｅｓ　）に対する結合パートナ−によ り、選択された細胞に運ばれる。好ましい結合パートナ−は細胞表面抗原に対す る抗体である０％に好ましいのは、病んだ、感染した、変形した又は突然変異の 細胞に特効性であるが正常細胞には特効性でない細胞表面抗原に対する単一分校 系抗体である。排他的ではないが特にそれらは、細胞に取り込まれる抗体である 。

非標的細胞は特定の抗原を全く欠いている必要はない。

但し、該抗原は該非標細胞上に、該細胞によるかなりの量の活性物質摂取を許容 するほど多くの数で存在してはならない。

かかる抗体の例は色素細胞腫表面抗原に対応する抗体およびＴ−ｍ胞およびＴ− 細胞リンパ腫上に見られる表面抗原に対応する抗体、例えばＣＤ−５、ＣＤ−４ 、ＣＤ−５、ＣＤ−１１およびＣＤ−１２である。

使用できる他の結合パートナ−には非抗体細胞膜運搬剤、例工ばトランスフェリ ンおよび蛋白質ホルモン、又は成長因子、例えばインク、　ＩＪン、が含まれる 。

加水分解速度は、これらの架橋剤が酸性化した細胞小胞のｐＨ１即ちｐＨａ４で 数分又は数時間内に開裂されるが血管内のｐＨであるｚ４では１００倍史に安定 であシ、そしてｐＨａ４で貯蔵すると１０００倍更に安定であるような速度であ る。

本発明の要点は、切断を引き起こす細胞成分が血清中に測定し得るほど存在せず 、免疫毒素がターゲット部分（を鳳ｒｇｅｔｉｎｇ　ｍｏｉｅｔｙ　）によシ送 ばれる区画内に切断を引き起こす細胞成分が存在し、そして細胞内開裂が、活性 分子の活性度を実質的に完全に回復させるほど十分に急速であることである。

本発明の架橋剤は下記の単位を含む： 上記式中、Ａは、架橋されるべき蛋白質又は他の分子と非反応性でありそしてマ レイミド基に匹敵する官能価を有する橋単位である。該ａｉはペプチド鎖、芳香 族置換基および同様のものを含んでもよい。Ａは好ましくは（ＣＨｍ）ｎ（ここ でｎは１ないし８の整数である）である。

メチル基（ＣＨｍ）＃′ｉ好ましい中心炭素置換基であるが、同様の電子供与能 力を有する他の基、例えばＣ，−Ｃ，アルキル、フェニル又は置換フェニル基を 使用できる。

本発明の第２の観点においては、アミノ基含有物質を第２の化合物上のスルフヒ ドリル基に結合するのに適したヘテロニ官能性酸開裂性架橋剤が提供される。こ の試薬は下記の一般式を有する： 上記式中、ＡおよびＢｌｆｉ橋単位であシ、Ａは前に定義した通りであシ、セし てＢは： （上記式中、ｎは小さくとも１の整数である）である。

本発明の第３の観点においては、市販のケタールとマレイミド官能価を含むアル コールとの間のケタール又換反応による、或いはＮ−ヒドロキシスクシンイミド エステル基を用いて誘導体化されたフェノールを、マレイミド部分を有するビニ ルエーテルへ酸触媒付加することによる、本発明の架橋試薬の合成法が提供され る。

本発明の第４の観点においては、酸不安定性部分がオルトエステルの機能により 、そしてスルフヒドリル含有化合物との反応用にマレイミド基を含む、ホモ三官 能性架橋剤が提供される。これらの架橋剤は下記の一般式構造を有する： 上記式中、Ａは前に定義した橋単位である。

本発明の第５の観点は、適当なアルコールとビス−ケテンアセタールとの反応に よるオルトエステル系の架橋剤の合成法を特徴とする。第１．２および３図は、 ケタール、アセタールおよびオルトエステル系の架橋剤の合成をフローダイアグ ラムの形体で示す。

図面の簡単な説明 第１図は、架橋剤１の合成を示す。

第２図は、ヘテロニ官能性架橋剤２の合成を示す。

第３図は、オルトエステル架橋剤６および４の合成を示す。

第４図は、ｐＨ＆４への酸性化後に時間経過と共に観察される、架橋剤３（○印 ）および架橋剤４（ｘ印）で架橋されたＤＴ二量体の減少率（小数）を示す。二 量体の減少は単量体の出現と関係する。反応速度は１次である。

第５図は、免役ｍ累の減少率（小数）を対数尺度でプロットし、次いでｐＨ五５ ，４．５およびＳ５での遊ｌｌ！１Ｔ１０１抗体の出現を示す、各ｐＨでの勾配 は観察された一次の解離速度定数ｋを規定し、そして押入図においては、ｌｏｇ ｋをｐＨに対してプロットしたが、特異的酸触媒作用の特徴である直庫状の依存 性を明らかにしている。

第６図は、ＤＴ襖【が増大すると、ベロ細胞の蛋白質合成が次第に阻止されるこ とを示す。架橋剤５で架橋された二量体は毒性が低く、同じ阻止に３０倍の高濃 度を必要とする。架橋さハた二を体をｐＨ４５にて２時間処理すると、二貧体の 約半分が単量体に変換し、もとの毒性が部分的に回復する。

第７ａおよびＺｂ図は、蛋白質合成阻止によシ評価した、ＤＴの効力と、非開裂 性架橋剤ＢＭＨおよび開裂性ケタール架橋剤１を用いて製造したＤＴのＴ１０１ （抗ＣＤ５）抱合体の効力を示し、ＣＤ５表面抗原のない非標的（ベロ）細胞（ パネル第７ｂ図、右）と、ＣＤｓを有する標的（ジャルカット）細胞（パネル第 ７ａ図、左）とについて比較している。ケタール架橋抱合体は標的細胞上でＢＭ Ｈ抱合俸よりも５０倍効力が大きい。ジャルヵット検定、３７℃にて６時間。

第８ａおよび８ｂ図は、リチンの効力および非開裂性架橋剤ＢＭＨおよび開裂性 ケタール架橋剤１ｔｌ−用いて製造したりチンのＴ１０ｉ　（抗ＣＤ５）抱合体 の効力を蛋白質合成阻止で評価し、ＣＤ５表面抗原のない非標的（ベロ）細胞（ パネル第８ｂ図、石）上とＣＤ５を有する標的（ジャルカット）細胞（パネル第 ８ａ図、左）上で比較したものを示す。ケタール架橋剤合体は標的細胞上で１０ 倍効力が大きい、破線はｉｏＯミＩＪモルのラクトースを添加した場せである。

第９１および９ｂ図は、架橋剤１を介してリチンに連結されたアシアロフェツイ ンを含まぜることにより可逆的に、Ｗ８した抗ＣＤ　５　（Ｔ１０１　）免疫毒 素のりチン結合位置の比較を示す（第９　ａ図）、類似するが非可逆的に封鎖し た免役毒素は、ＢＭＨを用いて構成した（第９ｂ図）。

第１０図は、抱合体トランスフェリン−架橋剤１から１６５−システィンの細胞 内加水分解を示す。

第１１図は、蛋白質ｔｚ　）リックスに可逆的に合体させる際の架橋剤１の適用 を例示する。

発明の詳細な説明 本発明の開裂性架橋剤は下記の三つの主な用途を有する： ｔｄ架橋剤は、架橋された蛋白質の一つによシ指示される受容器（ｒｅｃｅｐｔ ｏｒ　）−仲介とり込みを利用して、架橋された蛋白質として細胞内に運搬され た非架橋蛋白質又は他の高分子を細胞内に効率的に貯蔵するのに使用できる。こ の例は、リチンおよびジフテリア毒素を、抗−ＣＤ５単りｎ−ン性抗体−毒素複 合体（免疫毒素）を介して細胞内に効率的に負性することであり、これＦｉＴ細 胞の殺害に使用できる。これらの開裂性架橋剤を用いて構成された免疫毒素は、 標的細胞に対して従来の最も良い非開裂性架橋剤を用いたものよシも１０〜５０ 倍の毒性がある。

２　本発明の架橋剤は治療用プロドラッグを構成するのに使用できる。投与され た治療用蛋白質又は蛋白質に付着した薬剤の特異性機能は、標的細胞の外側では 封鎖されているが、標的細胞内では封鎖されていない、このことは、蛋白質をあ る細胞又は器官に導く機能を可逆的に変更することにより、治療比をより高くす る。血管区画内の寿命、前もって存在する抗体による一掃（ｃｌｅａｒａ−ｎｃ ｅ　）、および抗原性刺激本またこの方法で変更できる。

蛋白賞官油性の可逆的Ｍ釦の一例は、細胞毒性と関連する蛋白質毒索結台位置の 封鎖および解除である。

Ｓ　非叢注条件下で開裂性の架橋剤は、合成２よびクロマトグラフィーのために 蛋白質２よび了ミノおよび／またはスルフヒドリル基を有する他の化合物をマト リックスと可逆的に付体さぜ％隣り士の相互作用を評価し、高分子のａ脂肉区画 （それらのいくつかは酸性化されている）の通過を追跡し、そして分子誘導体化 過程の阻害効果を評価するための、貴重な研究手段である。

化合物２を除く本発明の全ての架橋剤は、マレイミド官能＋ＩＩｉを含むホモ三 官能性試薬である。マレイミド基は、当兼界に良く知られた方法で蛋白質又は他 のアミノ基含胃物質上に容易に発生するスルフヒドリル基に非常に特異性である 。−＼テロ三官能性試薬２は、−成分上のアミン基と他の成分上のスルフヒドリ ル基との間に架橋結合を形成する。

本発明に関して、二つの蛋白質分子を結合する架橋剤の性′ＪＲは十分に規定さ れる。該架橋剤は多量に合成するのが容易でなければならず、そしで長期間の貯 蔵に対して安定性が良くなければならない。合体反応は蛋白質の構造又は活性度 に影響を及ぼさない穏やかな条件下で起きなければならない、架橋生成物は貯蔵 中に適度に安定であυそして時機尚早に開裂されてはならない、即ち該結合は少 くとも７．４のｐＨで不活性であるが、ｐＨ５〜６の範囲で急速に切断されて、 活性度を弱めることなく個々の蛋白質を放出しなければならない。

とスーマレイミドケタール架橋剤の合成（第１図）この合成法は、Ｎ−（２−ヒ ドロキシエチル）マレイミドと２，２−ジメトキシプロパンとの間のケタール交 換反応を包含する。該交換は微量の散、例えばｐ−）ルエンスルホン酸、により 触媒される。

Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）マレイミドはコソワー（Ｋｏｓｏｖｅｒ　）外に よるＪ、　Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ、　１４　：　８７５〜８３８頁、１９７１年、の 方法に従って製造した。この物質１４１■をベンゼン１０１中に懸濁し、そして ２．２−ジメトキシプロパン７５〜を添加した。混合物を室温でアルゴン雰囲気 下にて攪拌し、セしてｐ−）ルエンスルホン酸α２５〜α５ＩＩｌｖを触媒とし て添加した。反応混合物が均一になった彼、溶媒を留去し、そして別にベンゼン １０ｄ中の２゜２−ジメトキシプロパン５０′ｌＮｉを添加した。攪拌を室温に て更に２時間続けた。ピリジン２〜５滴を加えて酸を中和した。溶媒を留去し、 そしてベンゼン１０１１１７を残留物に加えた。ベンゼン可溶性部分をデカント しそして蒸発乾固した。残留物をアセトン−ヘキサンから結晶させて、白色の柔 らかい結晶、融点１２４〜１２６’、ｉ得た。

架橋剤１と類似するが各種牛でＣＨ，基が１個少ない架橋剤５を同様にして製造 しそして結晶性固体として単離した。

この合成法は、Ｎ−ヒドロキシスフフンイミドエステル官能価を用いて誘導体化 したフェノールを、マンイミド基含有ビニルエーテルに添加することを含む。添 加は酸で触媒される。

２−マレイミドエチルビニルエーテルの製造Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）マレ イミド１．１８　Ｆを２５ｗ１１！のエチルビニルエーテル中に懸濁させ、そし てアルゴン雰囲気下で攪拌しながら還流し、酢酸第二水銀を番別し、そして反応 を：Ｉ！流下で２４時間続けた。２４時間後、反応混合物を室温に放冷し、無水 炭酸カリウムｔＳＯηを添加した。史に数分間攪拌した後、混合物を濾過しそし て沈殿物を酢酸エチルで十分洗浄した。洗浄液をＰ液と会わせ、そして真空中で 蒸発乾固して油状残留物を得だ。この油状残留物を中性アルミナ５０ｔ１活性度 ■、上で溶出用に塩化メチレン−へキサ７（１：１）を用いてクロマトグラフィ ーに付した。初期の部分を収集しそして合わせると、粗製の２−マレイミドエチ ルビニルエーテル２００１Ｎｉを得た。該生成物は次の工程の架橋剤の製造に使 用するのに適していたが、分析のためにアルミナ上のクロマトグラフィー又はク ーゲルロー（ｋｕｇｅ−１ｒｏｈｒ　）蒸留により棺製できる。

架橋剤 ５−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピオ／酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミドエステル１２０■を無水酢酸エチル１０ａ／中に浴解し、マレイミドビニル エーテル２００■を加えた。反応混合物を室温にてアルゴン下で攪拌し、無水酢 酸エチル１１中にｐ−トルエンスルホン酸ａ５■を含む＠液を触媒として加えた 。６時間の反応時間後、ピリジン数滴を加えて該［ｋ中和し、そして反応混合物 を蒸発乾固して粘性淡黄色油状物を得た。ヘキサンをこの残留物に加え、混合物 を数時間冷却した。沈殿した白色固体２００■を収集しそしてヘキサンで洗浄し た。

塩化メチレン−ヘキサンからの結晶で白色結晶、融点１３４〜１４７°、を得た 。

オルトエステル架橋剤の合成（第５図）これらの架橋剤は、適当なアルコールＲ ＯＨヲビスーケに添加して一般式： （上記式中、Ｒは炭素原子数１ないし９のアルキル基である）を生成することに よシ製造した。

（Ｈｅ１ｆｅｒ　）外の方法に従って、スピロ化８物：から製造した。

タウネ４　（Ｔａｗｎｅｙ　）外、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　２６　：　１ ５〜２１．１９６１、の方法に従ってマレイミドから調製したＮ−ヒドロキシメ チルマレイミド２５０■を無水エーテル５０ｇｊ中に溶解し、そして溶液をケテ ンアセタール２２０ｗｑで処理した。均一な反応混合物をアルゴン雰囲気下で室 温にて１〜２時間攪拌した。僅かな濁りが観察されたが、多分ケテンアセタール の一部分の重合の結果であろう。反る混合物をＦ適しそして凝縮して、溶媒の全 部ではないが殆んどを除去した。ヘキサンを滴加して結晶化を開始さぜた。混合 物を冷蔵庫内で冷却して結晶化を完了させた。濾過により白色結晶を単離しそし て乾燥して、オルトエステル４、融点１４５〜１４６″（ｄ）、を３５０１ｎｇ 得た。

オルトエステル架橋剤５を同じ方法で、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドの代り にＮ−ヒドロキシエチルマレイミドを用いて灸遺した。この例の架橋剤は無色油 状物を形成した。

酸開裂性架橋剤の他の例は次の通りである：下記式で表わされるヘテロニ官能性 酸開裂性架橋剤：（上記式中、ｎ〉である） （上記式中、ＡはＰｌｏに関して記載したような橋単位である。メチル基（、Ｃ Ｈｓ）に好ましい中央炭素置換基であるが、類似の成子供与能力を有する他の基 、例えば炭素原子数２ないし７のアルキル基、フェニル基又は他の置換フェニル 基、も使用できる。） （上記式中、Ａ１グ前に定義した通りである。）次式で表わされるヘテロニ官能 性酸開裂性アセタール架倫剤： （上記式中、Ａは前に定義した通りである。）下記式で表わされるホモニ官舵性 酸開敦注オルトエステル架憫卸］： （上記式中、Ｒは炭素原子数１ないし８のアルキル基であり、そしてｎ≧１であ る。う （上記式中、Ｒは炭素原子数１ないし８のアルキル基であり、セしてｎ≧１であ る） 〔上記式中、ｎ≧１、Ｒ′はメチル基又はそれより高級のアルキル基（炭素原子 数１ないし８）、セしてＲは水素又は炭素原子数１ないし８のアルキル基である 〕。

複数の架橋単位の利点 第５図の誉込みから、１ｏｇＫｏｂｓ対ｐＨの勾配が１であることがわかる。Ｋ ｏｂｓ＝に’（Ｈ）Ｊ　（ここで指数Ｘは小さくとも２である）とするのが有利 である。この式は、血管区画と赤血球内質区画との間の１００倍の〔Ｈ＋〕変化 に対して１へ０００匿以上の加水分解速度の変化を与えるであろう。これは、〔 Ｈ＋〕に関して反応次数を少なくとも２とすることにより達成される。代表的な 化学的例は、四酢暇塩−酢酸覆合体から重金属の解離である。現在の化学を使用 すると、二つの架橋単位はＫ。ｂｌＩ−に′〔Ｈ）″　（ここでＸは、加水分解 された物質の部分が低い値である時、２に近づく）に依存することを示すであろ う、この訪導はターゲット理論から導き出され、ポアッソンの公式を利用する。

該公式は、一つのターゲット中のランダムな事象の平均数をａとすると、正確に ｎ個の事象を有するターゲットの部分は であり、そして残存するターゲットの部分ｐは、ｎ＝。

の場合　６ｍに等しいことを予測ｊする。

この解析法はｎ個のターゲットを含む複数ターゲットモデルに拡げることができ る（ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎ−ｓｏｎ　）　２よびボラード（Ｐｏ１ｌａ ｒｄ　）のメカニズムズ　インラジオバイオロジー（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉ ｎ　Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ）。

第１巻、ゼネラル　ブリンシブル〔エレーラ（Ｅｒｒｅｒａ　）およびフォスパ ート（Ｆｏｓｓｂｅｒｔ　）　Ｍ　）　、　１　ｑ　６　ｆ　、アカデミツク　 プレス、ニューヨークおよびロンドン）、２個のターゲットについて、ｐ＝、− ａ（ｊ＋ａ）であシ、そしａ雪 て５個のターゲットについては、ｐ　＝　６１（１＋　ａ　＋　７　）である。

複数のヒツトターゲットについての結果は、ａが小さい値において（これＶ′ｉ 酸に非依存性の１次加水分解速度定数に′の生成物、〔Ｈ＋〕および時間に等し いとすることができる）、ｐは増加する０例えばＢ＝＝Ｑの場合、ｐ＝ｃ１であ る。１＝＝４において、ｐ＝１３７である。ｐＨが１００＠高くなると（時間は 一定に保つ）、ｐはα９９に増加する。

平行な二つの架橋剤について、二つのヒツトモデルはｐ＝［Ｌ３７に対してａ＝ ２．２となる。しかしｎ＝α０２２（１００倍０２化）に対して、ｐは（１９９ ９７６となり、著しい増加となる。実際上の条件で、立体障害毒素結合位置の複 数の架橋は三つの方法で達成される：１）開裂性架橋剤とＭＡｂ−ｍｌｌ素置合 体形成し、ここで該僚合体は式ＭＡｂ−Ｘ−毒素−Ｘ　−ＭＡｂを有する。実際 上の条件下で、これは毒素のチオール誘導体化を２回繰返し、　ＭＡｂのチオー ル化をα５だけ低下させ、そしてＭＡｂ対Ｓ索の比１：１ないし４：１にて反応 体を投入する。

２）蛋白質合体単位ＹおよびＺの間に置かれた平行な開裂性結合（Ｘ）を富む下 記の架橋剤を合成する：（ここでＢは橋かけ単位、好ましくは炭素原子数１ない し８のアルキルである）。

５）ｉｎ個のポリエチレングリコール単位が開裂性架橋剤Ｘを介して毒素に結合 した下記式のポリエチレングリコールのような立体封鎖基金用いる：ＭＡｂ−Ｘ −毒素−（Ｘ−ＰＥＧ）、　　（ここでｎは２よシも大である） 本発明による別の群の架橋剤は、光重合開始架橋用のアジド基を含む改訂逆性架 橋剤である。この種の架橋剤の特定の例は、 ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＯＮｌ である。

不発明の酸開裂性架橋剤は蛋白質をマトリックスに可逆的に仕俸するのに使用で きる。これらの動けなくされた蛋白質は仄に容易に＠酸処理でき、そして最後に はｐＨを調節することによりマトリックスから放出させることができる。第１１ 図はかかる使用法の特定例である。

開裂性へテロニ官能性試薬との架橋のための反応条件は、架橋剤２を用いると合 体が史に効率的であるようにみえる以外は、非開裂性架橋剤ｍ−マレイミド−ベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いる場合の条 件と同様である。

抗−ＣＤ５−ジフテリアＳ素および抗−ＣＤ５−リチンの台底 ＣＤ５は全身性Ｔ細胞（ｐａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　）に特Ｍの人間Ｔ細胞表面膜エ ピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ　）である、ジフテリア毒素（ＤＴ）およびリチンの 両褐素は、毒素１モル当り１モルの架橋剤２を無水メチルアルデヒド甲に浴解し そしてｐＨ８ないしａ５にて添加して、架橋剤２で誘導体化する。

禾反応試楽を、Ｇ２５−Ｆ（ファーマシア（Ｆｈａｒｍａｃｉａ　）　）の小さ いカラムを通すことにより除去する。マレイミド誘４　ｍ　化ＩＩ　Ｘを、１５ ｍ９／ｗＪのＴｊｏｌをｐＨａ　Ｏのイミノチオラ／ｃＬ６ミリモルで３０分間 処理しそして引続きＧ　２５−Ｆを通過さぞて得たチオール化抗体と（＠素：抗 体＝２　：　１　）反応させる。両蛋白質を２００分間反応せる。反応物および 生成物を、デエボン社の製品のＺｏｒｂａｘ（ｚ）−２５０カラム上でのＨＰＬ Ｃクロマトグラフィーによシ、Ｎａ！ＳＯ４９０ミリモル、ＮａＰｊ　（−およ び二塩基性リン酸ナトリウムの混合物）１０ミリモルｐ　Ｈ＆　５　、Ｅ　Ｄ　 Ｔ　Ａ１ミリモル（９０／１０／１緩衝液、Ｎ幻５ｏ４９０ミリモル、リン酸ナ トリウム１０ミリモル、ｐＨ＆　５、ＥＤＴＡ　１ミリモル）中で分離する。収 量は投入抗体の２０チから５０係の間で変わる。全てのチオール化はアルゴン下 で、ジスルフィド結合の形成を防止するために１ミリモルの）：ＤＴＡの存在下 で行った。この操作はとのＩｇＧ単一分枝系抗体の抱合に使用できる。

ジフテリア寸素二を体を、６０　Ｘ　２−５ｃｍ（７）ＴＳＫ力７ム（ＬＫＢ） を使用してｐ　Ｈ７，１のＮａＰｉ１０ミリモ／ｌ／中で、前に冷凍したジフテ リア毒素の分別により分離した。該二に体をｐ　Ｈａ　Ｏのイミノチオラン１ミ リモル、ホウ酸ナトリウムα４モルを用いて２０分間チオール化した。該二重体 から過剰のイミノチオランおよび七ツマ−を２−２５０クロマトグラフイーによ り除去し、そして７倍モル過刺電の架橋剤３又は４のいずれかと、自由なＳＨ一 度Ｃｌ１ｊＸ　１．　ｓ　ｓ　Ｈモルジフテリア毎素モノマー）ＴｐＨ＆５にて ５分間反応させた６次に溶液金１０倍の水で希釈しそしてＤＭＳＯ中４０％にし て、未架橋！Ｓを分離した。架橋した二重体をｚ−２５０カラムのクロマトグラ フィーにより分離した。

同じ操作を、架橋剤１を用いてアブリンの架橋二重体およびアシアロフェツイン （ｍ５ｉａ−１ｏｆｅｔｕｉｎ　）　トリチンとの架橋慎せ体を得るのに使用し た。

非共有性凝集体を形成【、２ない蛋白質抗−ＣＤ５−ＤＴ剤合体を架橋剤１を用 いて架橋した。

刻み目を入れた。ｐＨａＯのホウ酸ナトリウムＣＬ４モル中のＤＴ七ツマ−１０ 〜１５■１ｍｌをイミノチオラン［１５〜１ミリモルを用いて３０分間誘導体化 し、そしてＧ−２５Ｆ上のクロマトグラフィーによりｐＨａ５の緩衝液中に残留 し念イミノチオランを除いた。誘導体化ジフテリア＠素を、無水ジメチルホルム アミド中に溶解した１５倍モル１モル過剰量の架橋剤１と反応させ、そして５分 後にＧ−２５Ｆ上で再度クロマトグラフィーを行った。誘導体化ジフテリア毒素 はその時点では、内部架橋されたジフテリア％累２よび１個の遊離マノイミド基 を含むジフテリア１に素の混合物であった。このジフテリア毒素混合物の２０倍 過喘］童を次に、上記のようにしてｐＨａ５にてチオール化Ｔ１０１と５００分 間反応せた。反応物および生成物をｚ−２５０上のクロマトグラフィーで分離し た。架橋された抱合体の収量は、投入抗体を基準にして約７０ないし約９（ｌｔ ｊｔ％であった。モノ−およびビー毒素抱合体をＺ−２５０クロマトグラフイー により分離した。

架橋剤１で架橋された抗−ＣＤ５１Ｊチンを本質的に同じ操作で製造した・ 対照研究のために、同様のりチンおよびジフテリア毒素全合体を、非開裂性架橋 試薬ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＷ）を用いて類似の方法論で架橋した。非 開裂性生成物の収量およびクロマトグラフィーパターンは開裂性類似物と本質的 に同一であシ、非開裂性対照体として架橋きれた蛋白質をｐＨａ５にて９０／１ ０／１　　級Ｓ液中に４℃で貯祇した。嘔のパルス反応（ａｅｊｄ　ｐｕｌｓｉ ｎｇ　）を、緩Ｓ症力がもつと扁い＊漬液をある電加えることにより行って、２ ５℃にて所望のより低いｐｌ（にした、［１１チＳＤＳ中でｐＨａ５にて操作さ れたＺｏｒｂａｘ　４５０サイズ除外ＨＰＬＣカラムに注入することにより反応 を停止させた。

単債体および二重体のジフテリア毒素および抗体毒素およびリチンは全て、積分 器（ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ　）に供給された紫外線検知器を用いて大きさで分離 可能である。架橋物の減少は未架橋物の外観により定量化した。

ｐＨ６，３より下では、ジフテリア毒素の酸パルス反応を、ジフテリア毒素の沈 殿を防止するためにＳＤＳの存在下で行った。第４図は、架橋剤５および４用い て架橋されたジフテリア１１！索二量体の単量体への解離を示す。

残った二量体部分の対数（ｌｏｇ）は時間と共に直線状に減少し、単純な一次反 応過程を示す。酸誘発解離もまた、ＳＤＳの非存在下にて９０７ｊＯ／ｊ緩衝液 を用いるクロマトグラフィーによシ観察された。

開裂の程度は架橋物が［Ｌ０５へと減少するのが観察され、そして非開裂性ジス ルフィド結せの形成度合だけに制限される。架橋剤２により架橋された免疫＃Ｓ 素Ｔ　１０１−ＤＴの酸誘発解離は第５図に５のｐＨ単位範囲にわたって示され る。実験誤差の範囲内で、観察された一次解離速度定数には水素イ万ン濃度と直 線的な関係にある。この直線状の依存性は、二つの異なるｐＨ値において解離速 度が最も広範囲で変化する可能性を与え、そして比較的に安定な状態から不安定 な状態へと変化させるために、２個のｐＨ単位変化（血管から酸性化された小胞 区画へ）を利用する架橋剤の望ましい特徴である。特定の酸触媒作用はｋが〔Ｈ ＋〕に直線状に依存することの原因であり、そしてそれはアセタール、ケタール およびオルトエステル加水分解の特徴である。

第１表は、４個の異なる酸開裂性架橋剤について２５℃にて測定した架橋蛋白質 の解離の生成期の比較を示す。

２５℃から３７℃の間で加水分解速度は２倍以上変化する。該系列のｐＨ安定性 はアセタール〉ケタール〉オルトエステルであシ、母体化合物についての文献と 一般に一致している。これらの架橋剤は、広範囲の加水分解速度を包囲するよう に合成された。酸感受性（ａｃｉｄ　１Ｌａｂｉ　−１ｉｔｙ）を促進する主な 可変因子（変数）には、電子供与基によるカルボニウムイオン中間体の安定化お よび母体アルコールの酸性度の増加が宮まれる。

第　１　表 架橋蛋白質の解離の比較 ４　　ホモニ官能住　　　オルトエステル　ビスマレイミド　　α１５　　　ホ モニ官能性　　オルトエステル　ビスマレイミド　　ｃＬ３１　　　ホモニ官籠 性　　ケタール　　　ビスマレイミド（半減期は４および３についてはｐＨ＆ｓ ±１にて測定し、そしてＫｄｉｓｓが〔Ｈ＋〕に直線的に依存すると仮定して、 ｐＨ！ｌｈ５について推測した。全ての測定は２５ｃ′にてジフテリア毒素の冷 間誘発二量体化は、ジフテリア毒素結合領域の官能性の減少およびそれに対応し た毒性の減少をもたらすことになることが示された〔キャロール（Ｃａ、ｒｒｏ ｌ　Ｉ　）外、ビオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　２５　：２ ４２５〜２４３０　、１９８６年〕。二重体をＤＭＳＯで処理すると、二重体は 単量体（切れ目がない）に変換し、そして結合性および男性を回復する。

切れ目のない（ｕｎｎｉｃｋｅｄ　）ジフテリア褐素二址体を分離し、セして架 橋剤５で架橋すると、４０％ＤＭＳＯで解離できない共有結合安定性の二重体が 形成される。第６図に示されるように、架橋二電体毒注の９０％以上が失われる ことが、３０分間の培養、洗浄、および２．５時間の毎培養の後にベロ細胞（Ｖ ｅｒｏ　ｃｅｌｌｇ　）上の蛋白質合成が阻止されることで検定された。該二重 体をｐＨａ５からｐＨ＆５へと２１寺闇酸パルス反応させ、そし、て９０／１０ ／１緩面液中でＺ−２５０上のクロマトグラフィーに付した。

二せ体最高飯の約１／２は単破俸に変換した。両ピークを分離した。二を体最高 毒性は変化しなかったが、単を体髪藺毒法Ｃゴ増大した。イミノチオランを用い る切れ目のないジフテリア毒素の誘導体化は、未処理の切れ目のないジフテリア 毒素単盪体よりもジフテリア毒素の毒性がｌｏｇ　１５減少することの説明とな る。

開裂性架橋剤１を中いて構成さり、た抗ＣＤ５免疫毒素の効力（１、非開裂性架 纜剤Ｂ　Ｐｉｅ　Ｈよりもジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ　）標的細胞に対して高 められている。該効力の１加は、それぞれ第７ｍおよび８ａ図に示されるように 、ジフテリア基材免役毒素について（１対数１７５（１，７５１ｏｇｓ）又Ｆ′ ｉ５０倍、セしてリチン暴材免疫会累については対数１（１１ｏｇ）である。ジ フテリア毒素抱合体についての５０倍の増加は抗体経路にほぼ完全に特異的であ 夛、非標的ベロ細胞上では見られない（第７ｂ図と比較参照）、。

第７ｂ図でＢＭＨを用いた抗体との剤什によシ、ジフテリア毒素の効力は５０倍 減少することに気づく、抗体抱付による立体的影響が、中毒経路に沿った下記を 含むいくつかの段階で毒性を減少させるように作用するであろう； １）ジフテリア毒素受容器への結合の阻止；２）サイトツル（ｃｙｔｏｓｏｌ　 ）への膜転位の阻止；３）毒性を生じる区画へのジフテリア毒素受容器仲介摂取 の阻止：および ４）上記のｉ々の組合−＋！：。

開裂住抱合俸は、転位の抗体で誘発された立体阻害により生じた効力の減少を回 復するものと予想される。効力の増加（グ襟（ｔＶ細胞および非襟的叱胞の両者 上で起こるであろう。或いは、ジフテリア毒素結合の抗体誘発立体的抱采による 非標的細胞上の効力の減少は、細胞内切断ｅこよっでは克服されないであろう。

更に、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＷ）および開裂性抱合体に対して、過剰 の抗体によりそれぞれ高濃度へと１　ｌｏｇおよび２２−５１ｏシフトすること で示されるように、侵入経路が大部分抗体で媒介される場け、標的細胞上の効力 増加は期待できないであろう。開裂性抱合体は非標的細胞に毒性を回復さぞない 。しかしながら、侵入経路が標的細胞上の抗体を介する場合は、ＢＭＷ５合体の 失われた効力は開裂性抱合体により完全に回復される。

このことは、毒性を生じる区画へのジフテリア毒素の受各器媒弁摂取は阻止され たか、或いに上記の可能性が種々に組合わされたことを示唆する。

摂取が抗体性路を経由する場合、ジフテリア毒素毒住全生じる区画への接近（ａ ｃｃｅｓｓ　）は明らかに抗体部分の切断により増大する。リチン抱合体につい ては、ＢＭＷ抱合体を用いた場合の１０倍の効力減少の手分は非標的細胞上で回 復し、そし、て全部の１０倍量は架橋剤１を用いて標的細胞上で回復するが、立 体因子の組合せがこの抱合体に働くことを示している。

非開裂性対照架橋剤としてＢ　Ｍ　Ｗを適訳したのは、それが架橋剤３と類似の ｅ／！４造であるためである。ＢＭＷはビス−マレイミド部分を分離する６個の 柔軟性（口６ｘｉｂｌｅ）メチレン基金有する。架橋剤はこの位置に７個の残基 （５イ固のメチレン、２１固の酸素）を有し、そして１２０℃の酸素納付角度と ケクールのメチル暴による立体障害により、幾分柔軟性が小さい。ＢＭＨは最も 柔軟性の市販のマレイミド架橋剤である。ＢＭＷよりも柔軟性が少ない架橋剤、 例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキンスクシンイミドエステルおよ びスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートは、非標的細胞 上で検定されたＢＭＨと比して％Ｔ１０１と抱合された場合にリチンおよびジフ テリア毒素の毒性をより大きく減少させる。

ジャルカット（Ｊｕｒｋａｔ　）細胞のりチンに対する感度が高いので、リチン 抱合体はラクトースにより部分的に阻止する。毒性全体が抗体経路により仲介さ れるのではない、ジフテリア毒素抱合体は抗体性路により太きく仲介される。伺 故なら、１００倍過剰量のＴ１０１は投与感応曲線を対Ｈ２−ｓ　（２Ｌ５１ｏ ｇｓ）だけ抱合体濃度にシフトさせる。

平均分子ｊｉ　５０００のモノメトキシポリエチレングリコールは、アミノ基に 合体可能なアシル化基、例えばＮＨＳエステル（ポリサイエンス）；フェニルー クロロホルメー力ルポニルジイミダゾール〔ビューチャムプ（Ｂｅａｕ−Ｃｈａ ｍｐ）外ｓ　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　’＋　３１　：　２５〜Ｓ　５頁 、１９８３年〕、を用いて活性化できる。活性化したポリエチレングリコールを ２０倍モル過過剰量システアミン、２ＨＣ１（ｃｙｓ　−ｔｅａｍｉｎｅ、　２ ＨＣｔ）とＰＨ＆５で反応させた。誘導体化されたジスルフィドを次にジチオト レイトール５０ミリモルを用いて還元し、そしてポリエチレングリコール−５Ｈ 訪導体からサイズ除去クロマトグラフィーにより過剰の反応体を除去した。ポリ エチレングリコール−５Ｈを１５倍過熱量の架橋剤１とｐＨ＆０にて反応させた 。マレイミド誘導体からサイズ除去クロマトグラフィーにより過剰の反応体を除 去し、そして直ちに、イミノチオランを用いて誘導体化したチオール化リチン又 はチオール化ジフテリア毒素と反応させて、毒素１モル当り４個のＳＨｉを付与 した。ポリエチレングリコール−雪素の抗体への合体は、上記のように行うか、 或いは２ないし４個のＯＨ？ｋｋ含むポリエチレングリコールを用いそして上記 のように続行することにより％　２個のマレイミド残ｉｔ含むポリエチレングリ コールを介して行った。立体封ｆｄＡの増大は、ＰＥＧ２０のような高分子菫ポ リエチレングリコール部分を用いることにより得られる。

ａ　ａ　＋ｉのポリエチレングリコール分子は架橋剤１を介してジフテリア毒素 に合体された。非標的細胞に対する毒性の立体阻止が達成された（、　２．５　 ｌｏｇｓ　）。ｐＨ５５ないしん５の間での遊喘ジフテリア毒素の放出加水分解 速度の研究で、〔Ｈ＋〕依存性は１を越える指数（ｐｏｗｅｒ　）　　であるこ とが示される。

鉄運命性蛋白質ジ第二鉄トランスフェリン、Ｔｆｎ％は下記の循環段階を経るこ とが示された：１）細胞表面受答６粕８： ２）受ｇ器−仲介とり込み； ３）赤血球内＊酸性化Ｋｆ＜、赤血球内質内での酸に促進される鉄の放出； ４）受容器に結合されたアポトランスフェリンの細胞外放出； ５）アポトランスフェリ／の媒質（ｍｅｄｉｕｍ　）への解離。

〔クラウスナ−（Ｋｌａｕｓｎｅｔ　）外、ＪＢＣ２５８；　４７１５〜４７２ ４頁、１９８３年；チカノバー（Ｃ４ｅｃｂａｎｏｖｅｒ　）外、ＪＢＣ２５８ ：　９６Ｂ１〜９６８９頁、１９８３年〕。段階２〜５の平均通過時間は約１５ 分である。

俵せ体Ｔｆ１−５−　（ｍａｌ　−ｘ−ｍａｌ　）３１５−７ステイン（ここで （ｍａｌ　−ｘ−ｍａｔ　）は架橋剤１を表わす）を合成した。

Ｔｆｎをイミノチオランを用いてチオール化し、過剰量の架橋剤１と反応さゼ、 そして久に３５Ｓ−放射性標識システィンと反応させた。同様の非開裂性抱合体 を、ＢＭＨを用いて構成した。該抱合体は大部分子ｆｎから成るが、幾分のアポ Ｔｆｎを含んでいた。はぼ７７ｎＭにて、５ｘ１０’のに５６２細胞による特異 な結合および摂取は、架橋剤１およびＢＭ）１抱合体に３０分間曝した後で、そ れぞれ投入トｖ−９−（、２ｘ　１０’ＣＰＭ）（７）５．７　％および４．８ ％であった。

エネルギー阻止剤（５０ＭＭのデオキシグリコースお工び１０ミリモルのＮａア ジド）の存在下２よび不在下で行った上記のような負荷（ｌｏａｄｉｎｇ　）期 間の後、細胞を洗いそして３０マイクログラム／　ｒａｔの冷Ｔｆｎを含む、エ ネルギー阻止剤が存在する又は存在しない新鮮な媒質全７ＪＬえた。細胞を６７ ℃にて３０分間再培誉した。

上澄ＩＶｊ、′（ｉｌ−取り入れ、５ＤＳ（Ｌ５％とし、そして１１モルのＮａ Ｐｉ　（−および二ｒｊＬ基性すン醒ナトリウム）ｐＨａ５．１ミリ％　＃　ｔ Ｄ　ＥＤＴＡ中（７）ＣＬｊ％（７）ＳＤＳを用いてＺ−４５０カラム上にてサ イズ除去によるクロマトグラフィーに付した。このクロマトグラフィー操作はＴ ｆｎから分離し、そして両者を架橋剤１箔台体の低分子量加水分解生成物である ａ離の３１５−システィン−８−マレイミドアルコールから分離する。

エネルギー阻止剤は１サイクル後にＴｆｎの循環を停止させるので、エネルギー 阻止された細胞からの上澄液は、細胞内に入れられそしてぜいぜい１サイクルの 後に細胞を通って表面膜から放出されたＴｆゎおよびアポＴｆｎを含む、非阻止 ＃ｆｒＪ＠からの上澄液は、１回目の培養全体中に負荷されそして２回目の培養 中に細胞外放出されたアポ”ｆｎ％並びに膜に関係した寄与によるアポＴｆｎを 含む。

阻止細胞の”Ｕ刀・ら非阻止細胞の値を引くことにより、膜に関係した寄与を除 去し、そしてこれらの細胞の赤血球内質区［１ｉｉＩを通過する循環を経た物質 の寄与を得る。

第１０図は、２回目の培養の上澄液からの両抱合体について％３８５−７ステイ ン計７７５　（ｃｏｕｎｔｓ　）対カラム上の保持時間をグラフで表わしたもの である。非開裂性抱合体はアポ”ｆｎの保持時間に顕われ、該抱合体は細胞を通 過して循環しそして鉄分を失ったことを示している。計数の３％未満は加水分解 により遊離された。それと対照的に、架橋剤１でＷ４成された抱合体（２その３ ６５−　システィンと同時に溶出する部分に失った（カラム　Ｓ−システィン− マレイミドアルコール加水分解生成物から５ｓＳ−システィンを分解することは できない）、加水分解生成物は、遊離された鉄と遵って、媒質へ殆んど細胞外放 出された。

このことは多分、鉄とは対照的に、低分子量の加水分解生成物に対する受容器又 は受体が欠乏していることを反映しているであろう。この開裂性抱合体のｐＨ５ ，５における加水分解の牛減期はＴｆｎ逍過時間とほぼ等しいので（２の因子内 ）、かなりの部分、即ちα３５、が加水分解されないで残る。

＄９図において、抗−ＣＤＳ（Ｔ１０１）免疫毒素のりチン結合位には、架橋剤 １を介してリチンに連結されたアシアロフェツイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ 　）　ｆ含まぜることにより、可逆的に封鎖された。類似するが非可逆的に封鎖 された免疫毒素を、ＢＭＩ（を用いて構成した。標記細胞上で、可逆的に封鎖さ れた抱合体はＢＭＨ抱合体より覗１１ｏｇだけ効力が大きい。非標的細胞上で、 両者の毒性はりチンよシ本２　ｌｏｇｓだけ低い。酸処理すると、リチン毒性に もとの毒性の［１５１ｇｇの範囲で回復する。

第１０図において、抱合体トランスフェリン−架橋剤１３′Ｓ−システィンから の５ｓ５−システィンの細胞内加水分解力、Ｋ５６２　細胞（２ｘ　１０’ＣＰ Ｍ）　中へ３０　分間負荷しそして新鮮な媒質へ３２０分間細胞外放出した後に 観察された。矢印Ｈｚ−４５０カラム上でＳＤＳを用いた場合のアポトランスフ ェリン、ジ第二鉄トランスフェリンおよびシスティンの溶出時間を示す。グラフ の計数は、エネルギー阻止剤のない上澄液からエネルギー阻止剤を含む上澄液を 引いた差である。

り数個（２〜４）の分子とジフテリア毒素とを架橋剤１を介して合体した。非標 的他胞に対する毒性の立体阻害もまた達成された（λｓ　ｆｏｇｓ　）。

不−開明によると、蛋白質又は毒素は本発明の酸開裂性架橋剤を用いることによ り立体的に阻止できるので、（Ｈ’　）依存性が１よりも大きい作用力で増加す る。抱合体の加水分解の遅れは、高い血管ｐＨ埴では初期に達成される。これは 免役毒素又は可逆的に封鎖された高分子プロドラッグの治療比を広げる。

本究明１１、リチノ結合性ｆｚｒ細胞の外側で泗鎖するラクトースの使用法に対 する改良である。何故なら、リチンｂ　８　位置ｆ’！　、　　リチンおよびア シアロフェツイン（ＡＳＦ）の非共有結曾復せ体と架橋さゼることに↓り可逆的 に封鎖されるからである。これらのａ合体は、ＡＳＦ上のガラクトース残基およ びリチンガラクトース結合位ｍｔ介して結合する。リチンおよびＡＳＦは前述し たように５ミリモルのＩＴを用いてチオール化する。ｍ−マレイミド−ベンゾイ ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）をＴ１０１に添加すると 、Ｔ１０ｉの１分子当り１個の誘導体化マレイミドが生成する。ＡＳＦは１モル のＴ１０１当り１モルの１甘で添加する。Ｔ１０ｌ−ＡＳＦｔｌｏ体１’１Ｚ− ２５０上のクロマトグラフィーにより分離する。

凝集ｔ−低減さぜるためにホウ暇塩緩衝液の存在にて、チオール化すチ／を、抗 体１モルあたり１モルの割付のＴｊｏｌ−ＡＳＦ複仕体に添加する。架橋剤１を 過剰に添加し、そしてｙ　Ａ　Ｓ　Ｆの残存するＳＩ基をリチンのＳＩ（基に架 橋させる。９０：１０１の緩衝液および１００ｍＭのラクトース（非架橋のりチ ンを分離するために使用）中の２−２５０を用いるクロマトグラフィによって、 該Ｔ　１０１−ＡＳＦ−リチン複合体を梢シする。遊離のりチンまたはＴ１０１ −リチンと比較して、ＡＳＦ−セファロース　カラムを用いる親和クロマトグラ フィにおいて該複合体が結合または遅緩しない事実によって、リチン　ガラクト ースの結合位置の効果的な封鎖が実証きれる。

生体内の使用のため、反応のｐＨをｐ　ＨＥＬ　Ｏに上昇させる以外は供給者の 指針に従って、ＣＭＰ：ＮＡＮＡ−ガルベータ（１，４）ＧｌｃＮＡＣ−フル７ ７−２．６−７７リルトラ／スーフエラーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、　） 　ｆ用いて、Ｔ１０ｔ　−ＡＳＦのＡＳＦ部分の露出したアジアローガラクトー ス基をシアル化（５ｉａｆｆａｔｅ　）する、この反応は、肝臓のアシアログリ コプロティン受容器を経由する免役毒素への肝臓の摂取を防止するために実施さ れる。

第９図のパネルＢは、該Ｔ１０ｌ−ＡＳＦ−ＩＪチン複合体が非標的細胞に対す る毒性（リチン経路）が１００倍低減されたことを示す。５０倍の壽性増加によ って判断されるように、酸処理により該リチンの大部分が放出される。

この事実はＨＰＬＣによって証明される。第９図のパネルＡＶこおいて、１００ ｍＭのラクトース（リチンの毒性に対して標準化されている）の存在にて架橋剤 １と架橋さぞ′＃−Ｔ１０１−リチンの毒性を、ラクトースを使用しないＴ１０ ｌ−ＡＳＦ−リチンと比較する。ＡＳＦ封鎖したりチンの免役毒素に、ラクトー ス封鎖を利用した免疫毒素と比較して有利である。該ＡＳＦ封鎖免疫毒素に、過 剰の対抗するＴ１０１を添加して得られる毒性の減少（データを省略）によって 実証されるように、　Ｔ１０１柱路に大きく依存する。

該Ｔ１０１−ＡＳＦ　−ＩＪチンの免疫毒素の充分な効能のために、リチンの官 能性結合位置が細胞内の区画内に存在することが必要であることが、第９図のデ ータによって実証される。こ０−５ことＶｉ、官能性結合位置が不足している非 開裂性（ＢＭＷ）架橋剤を用いた免疫１Ｂ索の効能低減によって実証される。従 って、細胞内成分（この場合は希酸）により開を注である架橋剤を使用すること によって、封鎖されたリチンの結合位蓋は細胞内にて封鎖解除され得る。

上記から理解されるように、免疫毒素中の毒素結合位澹を可逆的に封鎖して標的 細胞の特異性分維持しながら向上した効能を達成する概念が、このデータによっ て成立する。この概念げ、広範囲の毒素、単一分校系抗体および他の標的リガン ドにて構成される免疫毒素に適用できる。グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆ　 １ｅｌｄ　）他による（１９８７）Ｓｃｆｅｎｃｅ　２３８：６５５−６５９に 開示されているように、迅速に内部化する（　１ｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ　）小 種類の標的リガンド〔例えばトランスフェリン、および抗ＣＤ３卓−分枝抗体、 および非常に大きな数（細胞１めたシ［１５Ｘ　１０’以上）にて受容器に作用 する他のターゲット部分〕は、充分な免疫毒素の効能のために該Ｗ素結合位置を 必要としないであろう。しかし一般的に、大部分の単一分枝抗体毒素抱合体げ、 充分な効能のためにこの特質を必要とする。

従って、本発明の抱合体は、生体内（１ｎｖ（ｖｏ　）および生体外（ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ　）において１壕しくない徨−〇細胞を殺すために効果的に使用できる 。

本発明によれは、切断の原因となる細胞成分は血清中に認識されるほどには存在 ゼす、該細胞成分は免疫毒素がターゲット部分によって送られる区画内に存在し 、そしてその細胞内の切断は充分に迅速であって、血清中の切断の割合が少くも α０１倍そして好ましくけそれ以下である実質的に完全な活性を回復する。

本発明による抱合体の他の例は、内部小胞およびゴルギ（Ｇｏｌｇｉ）区画中に それぞれ存在する細胞内のカテグシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ　）またはグリコ シダーゼ（ｇｌｙｅｏｓｉｄａｓｅｓ　）によって切断さｎ傅るペプチド結合ま たはグリコシド単位からなる連結体である。これらの連結体は、毒素の結合位置 を妨害する楽剤（例えば、前記のようなりチン用のＡＳＦｔたはグリコベグチド 、お上び種々の毒素用のポリエチレン　グリコール）に関連して、使用されるべ きである。

本究明の抱合体は、エイズすなわち後天性免疫欠乏症候群の治療に袴に有用であ る。これらの抗人体パンＴ細胞慰せ体は、多くの１類の細胞に存在するＨＩＶ、 　Ｔ細胞およびマクロファージを殺して、エイズの感染サイクルを破壊する。Ｔ 　１０１−ＡＳＦ　−Ｕチン免疫毒素の機付、Ｔ細胞に抗−ＣＤ５部分を柱内し て殺され；そしてマクロファージは、マクロファージに高度の親和性を有するリ チンマンノース機基を経由して殺される（Ｃｅｌｌ　１９　：　２０７−２１５ ．１９８０参照）。該抱合体は、腹腔内または静脈内に投与するのが好ましい、 最適の投与量は、体ｉ！１ｋｆあたり約１０〜約１００マイクログラムの単一投 与である。

ウィルスＣＤ４ｉ宿すＴ細胞の部分集合はＣＤ５によって包まれているので、該 仇−ＣＤ５部分が選定された。しかし、Ｃ０４抗原密度が感染およびウィルスの 復製の後に実質的Ｋ　Ｖｋ　減することが知られており、このエピトープはター ゲットの目的に不満足となる。

結合して封鎖されているが転位していない突然変異ジ７テｌＪ７ｍ素（例、ｔｌ ’ｆ、ＣＲＭ　ｉ　０７　オよびＣＲＭ１０３、または切断された毒素変異体、 または拳似の特性を有する化学変化毒素）によって形成された抗−ＣＤ５免役毒 素もまた、これらの免疫毒素がマクロファージおよび単核細胞を殺す北方に不足 しない限り、上記のようにエイズの治１ｉに有用である。参照用に記載する米国 特許４．５２０，２２６号におけるように、必要とされる全てのエピトープに特 異性である免疫毒素混合物を利用して、これらの機能が達成される各でろる。こ の改＠は、各免役毒素が切断可能な架橋剤によって形成されそして向上した効能 を与えることによる。

ＣＲＭ　ｉ　０７系の免役毒素の投与１ｔは、１回だけの投与にて、ジフテリア 突然変異体に関して体重１ｋｆあたり約３０〜約３００マイクログラムであり； 七してＣＲＭ１０３系抱合体の場合、体重１呟あたり約３〜約５０マイクログラ ムの範囲である。

本発明の架慣した抱合体を用いて、プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇｓ　）を製造 することができる。該プロドラッグは、選ばれたａ胞の細胞表面受容器に特異性 である細胞結合パートナ−に活性物質を架橋さぞて形成し六複合体に、細胞を露 出することによって、不均一に分布しているｆｍ胞中の選ばれた細胞にアミノ基 含有動物学的活性物質を提供するために使用できる。該化合物はこれらの細胞に 選択的に結合するａ該活性物質と架橋剤との架橋剤結合を切断するのに充分低い ｐＨにさらすことにより、該グ合体から活性物質が放出される。

本発明の抱合体は、種々の形態にて患者に投与できる。

しかし、適当な医薬的に容認されたベヒクルを用いた該活性成分を、静脈内また は腹腔内に投与するのが好ましい投与ｄ路である。

本発明の範囲内の組成物には、該活性成分がその目的を達成する有効量で含有さ れている組成物が含まれる。

該有効量の決定は、吃ちろん当業者が容易になし得る。

本発明の抱合体に追加して、本発明の医薬組成物は、該抱合体を薬学的に好都合 に使用できる製剤に容易に加工する補形剤２よび補助剤を包含する、薬学的に容 認される適当な担体を官有し得る。

非経口投与用の適当な配合物には、水溶性の形態である該抱合体の水溶液が含ま れる。更に、適当な油状注射剤として％核剤合体の懸濁液も投与することができ る。

適当な溶剤またはベヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルま たはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステルが含まれる。注射用の水性！１ａ液 は、ナトリウム　カルボキシメチル　セルロース、ノルビトールおよび／または デキシトラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。また、該＠？ ｆ！液は安定剤を任意に含有し得る。

二つの異分子を連結するためには、ホモ三官能性架橋剤よりもヘテロニ官能性架 橋剤が優れている。しかし、ヘテロニ官能性架橋剤の方が合成するのが困難であ る。

本発明を特定の態様に関して記述したが、多くの変形が可能であること、および 本発明の範囲内にてこれらに代る材料および薬品が使用できることが理解される 。このような変形および変更は実験を必要とする場合もあり得るが％通常のテス トだけで可能である。

特定の態様の上記の記述によって本発明の一般的性質が充分に開示されているの で、本発明の基本概念の範囲内にて第三者が本発明の特定態様を容易に修正およ び／または採用することができる。従って、このような修正および採用は開示さ れた態様の意味および範囲に含まれる。本明細書中の文体および用語は、記述の ためのものであり、本発明を限定するものではない。

へ ［１１間　（時間） ＦＩＧ、４ 残存する把冶４杢のｉ！＋］台 ＬＯＧ（ＤＴモル渫廣）（単量体単位）ＦｉＧ、６ ＦＩＧ、７ａ ＬＯＧ（を斧ズ１ズ兎残番免のモル５戻寝）ＬＯＧ（泰素、！１ス児残けの七ル 濃席）ＦＩＧ、８ａ ＬＯＧ（巻票ヌ１ス兇ル辱乗のモル膿虐）ＬＯＧ（毒素ス１２免痙会索のモルミ 藤贋）ＦＩＧ、９ａ −１３−１２−１１−１０〜９−８ ＬＯＧ（器素ヌ１ズ先茂番索のモルミ呆覆）ＦＩＧ、９ｂ −１２−ｉｉ　　−１０−９−５ ＬＯＧ（舌素又１；え４電票のモル１度）保１升時間　（分） ＦＩＧ、Ｉ○ 国際調査報告 Ｉｎｔ＠ｒｎａｔｉｏｎａｌ　　人ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　　Ｎｏ、　　ＰＣＴ ／υＳ８９１０２３４９

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の群から選ばれる、穏やかな酸性条件下で開裂できる架橋試薬： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ａは、架橋されるべき蛋白質又は他の分子と非反応性でありそして マレイミド基に匹敵する官能価を有する橋単位であり、該橋はペプチド鎖、芳香 族置換基および同様のものを含んでもよく、Ａは好ましくは（ＣＨ２）ｎ（ここ でｎは１ないし８の整数である）であり、メチル基（ＣＨ３）は好ましい中心炭 素置換基であるが、同様の電子供与能力を有する他の基例えば炭素原子数２ない し９のアルキル基、フェニル基、又は置換フェニル基を使用できる。）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ａは前に定義した通りである。）、▲数式、化学式、表等がありま す▼ （上記式中、ｎは１以上である。）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ｎは１以上であり、そしてＭは１以上である。）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、 ｎは１以上である。）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ａは前に定義した通りであり、Ｂは▲数式、化学式、表等がありま す▼である。）、▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、ｎは１以上である。）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ｒは−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＣＨ３であり、そしてｎは１以上である 。）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ｒは−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＣＨ３であり、そしてｎは１以上である 。）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、ｎは１以上であり；Ｒ′は炭素原子数１ないし９のアルキル基であ り；そしてＲは水素原子又は炭素原子数１ないし９のアルキル基である。）およ び▲数式、化学式、表等があります▼
2. （２）Ｂが ▲数式、化学式、表等があります▼ であり、そしてｎは小さくとも１の整数である請求項１記載の架橋試薬。
3. （３）望ましくない細胞を殺すためのターゲット部分に架橋された成分を含み、 該成分は請求項１記載の酸開裂性架橋剤によりターゲット部分に可逆的に連結さ れている望ましくない細胞を殺すための組成物。
4. （４）上記の成分がリボソマル−不活性化蛋白質および延長因子２−不活性化蛋 白質から成る群から選ばれる請求項３記載の組成物。
5. （５）上記のリボンマル−不活性化および延長因子２−不活性化蛋白質がリチン 、ジフテリア毒素、アブリン、およびメルフェラン、ブレオマイシン、アドリア マイシンおよびダウノマイシンから成る群から選ばれる細胞毒素薬剤から成る群 から選ばれる請求項４記載の組成物。
6. （６）上記のターゲット部分が単クローン性抗体から成る群から選ばれる請求項 ３記載の組成物。
7. （７）上記の単クローン性抗体がＴ細胞上に見られる表面抗原に対する抗体およ びＴ細胞リンパ腫上に見られる表面抗原に対する抗体から成る群から選ばれる請 求項５記載の組成物。
8. （８）上記のターゲット部分が細胞膜運搬剤から成る群から選ばれる請求項３記 載の組成物。
9. （９）上記の細胞膜運搬剤がトランスフェリンおよび蛋白質ホルモンから成る群 から選ばれる請求項８記載の組成物。
10. （１０）上記のターゲット部分がＴ１０１であり、そして上記の成分がジフテリ ア毒素、突然変異ジフテリア毒素およびリチンから成る群から選ばれる請求項３ 記載の組成物。
11. （１１）上記のジフテリア毒素がＣＲＭ１０７およびＣＲＭ１０３突然変異ジフ テリア毒素から成る群から選ばれる請求項１０記載の組成物。
12. （１２）薬学的に許容される担体中に請求項１０記載の組成物を含むことより成 るエイズ治療用組成物。
13. （１３）請求項１２記載の組成物の有効量をエイズ罹患者に投与することより成 るエイズの治療法。
14. （１４）Ｎ−ヒドロキシアルキルマレイミドを２，２−ジアルコキシプロパンと 反応させてケタール交換を行い；そして ビス−マレイミドケタール架橋剤を回収するとことより成り、ここでアルキル基 は炭素原子数１ないし９のアルキル基よりなる群から選ばれ、そしてアルコキシ 基は炭素原子数１ないし９のアルコキシ基より成る群から選ばれる請求項１記載 のビス−マレイミド架橋剤の合成法。
15. （１５）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで誘導体化したフェノールをマ レイミド基含有ビニルエーテルと反応させ；そして ヘテロ二官能性アセタール架橋剤を回収することより成る請求項１記載のヘテロ 二官能性アセタール架橋剤の合成法。
16. （１６）炭素原子数１ないし８のマレイミドアルコールをビスケテンアセタール と反応させ；そしてオルトエステル架橋剤を回収することより成る請求項１記載 のオルトエステル架橋剤の合成法。
17. （１７）上記の成分がアミノ基含有の生物学的活性物質であるところの請求項３ 記載の組成物より成るプロドラッグ。
18. （１８）蛋白質を請求項１記載の酸開裂性架橋剤と抱合させることより成る蛋白 質の立体阻害を誘発する方法。
19. （１９）請求項１記載のホモ二官能性架橋剤と架橋された免疫毒素。
20. （２０）請求項１記載の架橋剤を用いて免疫毒素に連結されたアジアロフェッイ ンを含ませることより成る免疫毒素のリチン結合位置を可逆的に封鎖する方法。