SE446303B - Cytotoxisk produkt bestaende av ricinets kedja a bunden till ett immunoglobulin eller immunoglobulinfragment genom en disulfidbrygga samt forfarande for framstellning derav - Google Patents
Cytotoxisk produkt bestaende av ricinets kedja a bunden till ett immunoglobulin eller immunoglobulinfragment genom en disulfidbrygga samt forfarande for framstellning deravInfo
- Publication number
- SE446303B SE446303B SE7907994A SE7907994A SE446303B SE 446303 B SE446303 B SE 446303B SE 7907994 A SE7907994 A SE 7907994A SE 7907994 A SE7907994 A SE 7907994A SE 446303 B SE446303 B SE 446303B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- chain
- solution
- immunoglobulin
- group
- reaction
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/47—Euphorbiaceae (Spurge family), e.g. Ricinus (castorbean)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6819—Plant toxins
- A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
- A61K47/6827—Ricin A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/806—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving IgM
- Y10S424/807—Monoclonal
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
- Y10S530/864—Monoclonal
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
.<
7907994-3
2
Kedjan B i ricin eller "haptomeren" har förmåga
känna igen sackaridiska grupper, till vilka
biologiska verkan.
att på cellernas yta
den bindes med hög affinitet. Dessa naturliga fenomen gör det allt-
så möjligt för ricinmolekylen att tränga in i cellmassan, där kedjan
A kan utöva sin giftiga verkan. Ricinets giftighet saknar all spe-
cíficitet gentemot den eller den typen av celler, då nästan alla djur-
celler uppbär sackaridíska determinanter som igenkännes av kedjan B.
Enligt föreliggande uppfinning åstadkommes konstgjorda blanda-
de molekyler kallade "konjugat", där kedjan A från ricin genom en
lämplig kovalent bindning av disulfidtyp är förbun-
den icke med kedjan B utan med en proteinstruktur, vilken har förmåga
att selektivt igenkänna ett givet antigen på ytan av celler uppbä-
rande detta antigen. Såsom ovan har angivits är denna proteinstruk-
tur ett immunoglobulin specifikt för det önskade antigenet eller
vilket som helst fragment av detta immunoglobulin som har samma spe-
cifika igenkänníngsförmåga.
Av nedan angivna skäl har ricinets kedja A valts såsom cyto-
toxisk beståndsdel i konjugaten enligt uppfinningen.
(1) Kedjan A har en ytterst hög cytotoxisk verkan, när och
endast när denna kedja har trängt in i de avsedda cellernas cellmas-
sa.
(2) Mekanismen för kedjans A cytotoxiska verkan är baserad
på störning av en livsviktig cellfunktion, dvs. cellens förmåga till
proteosyntes.
(3) Kedjan A har en mycket låg icke-specifik giftighet i för-
hållande till den specifika giftigheten, då kedjan A icke har för-
måga att själv tränga in i cellerna om den icke är bunden till en
annan lämplig molekyl, vilken möjliggör fixering vid cellmembranen.
När det gäller ricin utgöres denna lämpliga molekyl av kedjan B,
och när det gäller konjugatet enligt uppfinningen utgöres den lämp-
liga molekylen av ett specifikt immunoglobulin med förmåga att på
ytan av målställena känna igen en specifik receptor och med denna
receptor bilda en bindning med hög associationskonstant.
Ett försök att åstadkomma konjugat av immunoglobuliner och
ricinets peptidkedjor har beskrivits i Annals of the New York
Academy of Sciences 211, 690, (1976). Den specifika verkan som vid
försök in vitro har erhållits med dylika konjugat är emellertid
ytterst låg av följande skäl.
7907994-5
3
(1) Ricinets kedja A har icke isolerats från kedjan B före
kopplingen till antikroppen.
(2) De använda antikropparna har icke varit rena utan inne-
hållit avsevärda mängder av icke-antikroppsproteiner och andra anti-
kroppar än de som är specifikt riktade mot det avsedda antigenet.
(3) Kopplingen av toxinet till antikroppen har genomförts med
användning avglutaraldehyd, ett ämne som kæiframkalla denaturering
av antikroppen eller av toxinet genom bildning av icke-specifika
bryggor inuti en peptidkedja eller mellan olika peptidkedjor, vilket
leder till en slumpmässig polymerísation.
Föreliggande uppfinning gör det möjligt att övervinna alla
dessa svårigheter och erhålla konjugat, vilka uppvisar en mycket
specifik verkan gentemot målcellerna och kan användas för behandling
av kancer.
Isolering och rening av ricin och dess kedja A.
Fröna av Ricinus communis innehåller ett giftigt lektin känt
under namnet ricin. Fröna innehåller dessutom ett annat, minre
giftigt lektin, vilket är känt under namnet agglutinin på grund av
sin förmåga att agglutinera celler, särskilt röda blodkroppar. Det-
miaggmtinin består av två underenheter, som var och en liksom ricin
består av två glykoproteinkedjor förbundna med varandra genom en
disulfidbrygga.
Fröna av Ricinus communis innehåller dessutom andra proteiner
av olika natur samt en stor mängd lipider, vilka utgör beståndsde-
lar i ricinolja.
Vid utvinning av ricin börjar man med att mala frön av Rici-
nus communis till en pasta, vilken befrias från sin olja med hjälp
av ett lösningsmedel för lipider, t.ex. genom upprepade extraktioner
med etylcter. Eftrr torkning extraheras det erhållna pulvret i kyla
genom omrörning med en lösning av natríumklorid i svagt surt medium,
företrädesvis vid en temperatur som icke överstiger ÄOC. Efter av-
skiljande av sediment dialyseras extraktet under lång tid, först mot
vatten och sedan mot en buffert med låg jonstyrka (TRIS-H01, 10 mM,
pH=7,7). Under dialysen bildas en lätt fällníng, vilken avskiljes
genom filtrering eller centrifugering.
Det sålunda erhållna extraktet innehåller alla de lösliga pro-
teiner som förekommer i fröna av Ricinus communis, dvs. ricin, agglu-
tinin och diverse andra proteiner. Lösningen kan frysas vid -EOOC,
och vid denna temperatur kan extraktet förvaras under flera veckor.
7907994-3
4
Rening av ricin utgående från orent-extrakt har redan beskrivits
i litteraturen. Vanligen använder man härvid kromatografiska meto-
der, såsom jonbytarkromatografi, kromatografi på molekylsilar eller
affinitetskromatografi. Dessa olika metoder kombineras vanligen med
varandra, vilket leder till långvariga och besvärliga reningsprocedu-
rer, som är svåra att använda när man önskar erhålla stora mängder
-ricin. Enligt uppfinningen är det möjligt att erhålla rent ricin
genom en enda affinitetskromatografisk separation, som gör det möjligt
att separera ricínet först från främmande proteiner och därefter från
agglutininet. Det orena extraktet avsättes sålunda på en kolonn av
Sêpharose *UB (agarosgel i form av sfäriska partiklar med en kon-
centration av Ä% från Pharmacía AB), varefter stegvis eluering ge-
nomföres. Med användning av en TRIS-HC1-buffert (50 mM, pH=7,7)
eluerar man först de proteiner som icke är lektiner, och med använd-
ning av en galaktoslösning med en koncentration mellan 0,28 och 0,56
mM eluerar man därefter rent ricin. Slutligen elueras agglutininet
med användning av en 0,1M galaktoslösning. De olika beståndsdelarna
kan separeras fullständigt från varandra genom en enda kromatografisk
behandling, om den använda volymen av Sépharose ÄB är sådan, att den
på kolonnen anbragta totala mängden proteiner icke överstiger kolon-
nens kapacitet.
Efter detta steg genomföras en koncentrering genom ultrafilt-
rering, varigenom det är lätt att erhålla en lösning av rent ricin
innehållande 5-10 mg produkt per ml i en buffert med låg jonstyrka.
*Lösningen innehåller dessutom.en liten mängd galaktos (ca 0,U mM).
Efter frysning vid -2000 kan denna lösning förvaras under flera vec-
kor.
De två kedjorna i ricin kan separeras från varandra genom
selektiv spjälkning av den enda disulfidbrygga som förenar kedjorna
med varandra. Denna spjälkning genomföres med ett reduktionsmedel,
såsom 2-merkaptoetanol eller ditíotreitol, vars koncentration i reak-
tionsmediet bör vara minst 2%.
Det är känt att separera de båda kedjorna från varandra med
hjälp av jonbyte på olika typer av bärare. Dessa metoder är huvud-
sakligen baserade på skillnaden i isoelektrisk punkt mellan de båda
kedjorna. Enligt uppfinningen separeras de båda kedjorna A och B
i ricin från varandra genom att man utnyttjar icke endast skillnaden
i isoelektrisk punkt mellan de båda kedjorna utan även kedjornas
olika affinitet till kromatografiska polysackaridbärare innehållande
7907994-3
5
galaktosderivat. Dylika bärare har även den fördelen, att de kvarhål-
ler eventuella spår av icke spjälkat rícin som kan finnas kvar i
blandningen.
Till den ovan erhållna lösningen av ricin i bufferten med låg
jonstyrka sattes vid rumstemperatur ett reduktionsmedel (t.ex. mer-
kaptoetanol) i en koncentration av 2,5 volymprocent, varefter den re-
sulterande lösningen avsättes på en kolonn av DEAE CL Sépharose ® 6B
i samma buffert innehållande reduktionsmedel. (Denna Sêpharose-pro-
Aukt är ett gul som saluföres av Pharmacía och användes för jonbytar-
kromatografi; gelet framställes genom att Sépharose, eller agaros-
gel,tvärbindes med 2,3-dibrompropanol, varefter sulfatgrupperna av-
lägsnas genom alkalisk hydrolys, varpå dietylaminoetylgrupper införas;
koncentrationen i gelet är 6%.) De båda kedjorna bindes genom jon-
bindningar till DEAE-grupperna i gelet och kedjan B bindes dessutom
genom affinitet till Sépharose-grundmassan, e
Kedjan A elueras genom att man höjer jonstyrkan och pH-värdet,
hela tiden i närvaro av reduktionsmedlet så att förnyad bindning
mellan de båda kedjorna förhindras; såsom elueringsmedel användes
TRIS-HCl-buffert (O,1M, pH=8,H) innehållande 0,lM NaCl och 2,5% 2-
merkaptoetanol. Under dessa betingelser förblir kedjan B fullstän-
digt fixerad på kolonnen. Kedjan B kan sedan elueras med en bland-
ning av O,2M natriumklorid och O,1M galaktos i samma buffert.
Enligt en variant av förfarandet för separation av kedjorna
A och B användes on kromatografisk bärare, på vilken jonbyte och mo-
lekylsiktning äger rum samtidigt. Man kan sålunda använda QAE
Sêphadex :A.50 (en starkt basisk jonbytare från Pharmacia framställd
genom att man på Séphadex, eller dextrangel, fixerar kvaternära ammo-
niumgrupper med hjälp av eterbindningar). Härvid elueras ren kedja
A med hjälp av TRIS-HCl-buffert (100 mM, pH=8,H) innehållande O,5%
2-merkaptoetanol, under det att kedjan B elueras med samma buffert,
som dessutom innehåller 75 mM natriumklorid.
I det sistnämnda fallet år valet av kromatografisk bärare myc-
ket viktigt, eftersom olika andra provade bärare icke har möjliggjort
en god separation av kedjan A.
Den enligt den ena eller den andra metoden utvunna kedjan A
har visat sig vara ren enligt olika analytiska kriterier, och den
behöver icke renas ytterligare. För genomförande av den efterföljan-
de kopplingen till antikroppar är det emellertid nödvändigt att an-
vända ganska koneentrerade lösningar, vilka framför allt är fria från
7907994-3
s
reduktionsmedel. Den ovan erhållna lösningen av kedjan A i TRIS-
bufferten dialyseras därför mot en fosfatbuffert (10 mM, pH=6,5),
varigenom man på en gång avlägsnar TRIS, natriumklorid, 2-merkapto-
etanol och spår av galaktos. D
Den härvid erhållna lösningen anbringas på en kolonn av karboxi-
metylcellulosa, varefter kedjan A elueras genom samtidig höjning av
buffertens koncentration och pH-värde, från 10 mM och pH=6,5 till
125 mM och pH=7,0, i närvaro av 1 mM ÉDTA. Man erhåller härvid en
ganska koncentrerad lösning (ca 5 mg/ml) färdig att användas för
kopplingsreaktionen. 'A
Man kan även koncentrera och rena den erhållna utspädda lös-
ningen genåm att underkasta lösningen en koncentrering på C.M.
Sepharose*-'-bärare kombinerande jonbyteseffekter och affinitetseffek-
ter. Man kan härvid erhålla en lösning, vilken både har hög koncent-
ration och mycket hög renhet. Vid kylning av en dylik lösning erhål-
les dessutom kedjan A i kristalliserad form.
Den sålunda framställda kedjan A (i form av koncentrerad lös-
ning eller i form av kristaller) är fri från icke-specifik giftighet
gentemot cellsystem eller djurorganismer och kan sålunda användas för
framställning av konjugat, vars specifika verkan enbart beror på
antikroppen. _ w_ __ U
Framställning av“rena antikroppar.
Enligt uppfinningen framställes antikroppar på sådant sätt,
att man erhåller rena antikroppar fria från molekyler utan anti-
kropp-aktivitet för att de senare framställda konjugaten skall få
en fullständig specifik verkan, en egenskap som icke uppvisas av
de i litteraturen beskrivna preparaten.
Immunisering åstadkommas genom upprepade behandlingar under
flera månader enligt en klassisk metod för att man skall uppnå en
hyperimmunisering av djuren. Man uppsamlar härvid flera liter immun-
serum, som kan lagras vid -2000 före rening.
Reningen sker genom immunoadsorption med användning av ett
sgel av Sepharose UB, vilket har aktiverats med cyanbromid och vid
vilket man har fäst ett antigen motsvarande den specifika antikropp
som skall renas. Efter avskiljande av den flytande fasen kan man
genom en intensiv tvättning avlägsna alla de proteiner som icke
bindes till gelet. Med ett lämpligt elueringsmedel kan man sedan
frigöra de till gelet bundna antikropparna. Denna metod kan använ-
das för olika antikroppar med olika specificitot. Enligt uppfinning-
en kan antikroppmängden i serumet fraktíoneras pä sådant sätt, att
7907994-3
7
man utvinnen de antikroppar som har den högsta affiniteten till anti-
genet. Vid användning av ett överskott av antikroppar i förhållande
till den mängd antigen som är bunden till gelet kvarhåller gelet
preferonti~llt de antikroppar som har den högsta affiniteten.
I praktiken arbetar man med ett sådant överskott av antikroppar,
att endast en del av antikropparna i immunserumet bindes till kolon-
nen, under det att resten av antikropparna avlägsnas genom tvättning.
Under dessa betingelser har de genom tvättning avlägsnade antikrop-
parna en lägre genomsnittlig affinitet än de antikroppar, som bindes
till kolonnen och senare elueras. Man erhåller sålunda en sats av
antikroppar, som har en mera homogen affinitet än vad antikropparna
l det ursprungliga immunserumet har.
När man önskar arbeta med stora mängder antikroppar, vilket
kräver kolonner med stora dimensioner, bestämmer man i förväg den
mängd immunserum som skall användas för ett givet gel innehållande
antigenet genom att man genomför en serie mikroimmunoadsorptioner
med ökande mängder antiserum. Genom radioimmunologisk bestämning
av mängden antikroppar i den avlägsnade flytande fasen kan man be-
stämma det antigen-antikropp-förhållande som gör det möjligt att
med den flytande fasen avlägsna den oönskade delen av de ursprungli-
gen tillförda antikropparna. g
Framställning av konjugat av antikroppar och kedja A från
Enligt uppfinningen framställes ett konjugat genom att man
medelst en kovalent bindning av disulfidtyp förenar kedja A från
ricin med ett immunoglobulin specifikt för ett bestämt antigen el-
ler något fragment av denna molekyl med förmåga att specifikt känna
igen detta antigen. Nedan anges olika skäl för valet av en disulfid-
bindning mellan kedjan A och immunoglobulinet.
(1) Denna bindningstyp är den som förekommer i den naturliga
ricinmolekylen, och man kan hoppas att denna bindning är särskilt
lämpad att presentera kedjan A i en konformation som underlättar
kedjans inträngning i en cell under bibehållande av kedjans funda-
mentala biologíska egenskap, dvs. förmågan att hämma proteosyntesen.
(2) Denna typ av bindning är biokemiskt labil, vilket gör
det möjligt för den kopplade kedjan A att i cellmassan frigöras från
proteinbäraren.
(3) Kedjan A från ricin innehåller en enda cysteinrest i mo-
lekylen, dvs. en enda SH-grupp med förmåga att bilda en disulfid-
bindning. På grund härav är de konjugat, vilka framställes genom
7907994-3
8
- att denna SH-grupp får bilda en disulfidbrygga, kemiskt väl defini-
erade, och de modifierar på inget sätt strukturen av kedjan A, vil-
ket säkerställer att denna kedjas biologiska aktivitet bibehålles
1 oförändrad.
(Ä) Det finns effektiva metoder för åstadkommande av en dy-
lik disulfidbindning under ganska milda betingelser så att det
bildade konjugatets proteinbeståndsdelar bibehåller sina biologiska
egenskaper. i
För framställning av dylika konjugat är det nödvändigt att
vart och ett av de proteiner som skall hopkopplas innehåller minst
en svavelatom, som är naturligt lämpad eller på konstgjord väg har
gjorts lämpad att bilda den önskade disulfidbindningen. Dylika
svavelatomer kan vara närvarande i proteinerna från början eller ha
införts i proteinerna på kemisk väg. Såsom ovan har angivits inne-
håller kedjan A från ricin naturligen en enda svavelatom, som möj-
liggör den önskade kopplingsreaktionen. Denna svavelatom är svavel-
atomen i tiolgruppen i den enda cysteinresten i kedjan A. Vad be-
träffar immunoglobulinet eller dess fragment kan flera olika fall
föreligga. I
(1) När det gäller ett helt immunoglobulin, innehåller dyli-
ka proteiner icke naturlígen någon fri tiolgrupp eller några andra
svavelatomer som kan användas för den önskade kopplingsreaktionen.
I detta fall måste man alltså på konstgjord väg i immunoglobulin-
molekylen införa en eller flera svavelatomer på sådant sätt, att
immnnoglobulinets biologiska egenskaper icke undergår någon omfat-
tande förändring, och att svavelatomen eller svavelatomerna senare
kan användas för att bilda en disulfidbindning-med en eller flera
molekyler av kedjan A från ricin.
(2) När det gäller ett fragment-Fab, är situationen exakt
densamma som har angivits under (1) ovan.
(3) När det gäller ett fragment av typen Fab', kan man använ-
da svavelatomen í den fria tiolgruppen för att åstadkomma kopplingen
till kedjan A. Man kan emellertid även på konstgjord väg införa en
eller flera svavelatomer, och i detta fall är det lämpligt att i för-
väg blockera den fria tiolgruppen på stabilt sätt, t.ex. genom al-
kylering.
(U) När det gäller ett fragment F(ab')2 av immunoglobulin, är
det nödvändigt att liksom vid användning av ett helt immunoglobulin
på konstgjord väg införa en eller flera svavelhaltiga grupper i frag-
mentet ifråga.
9 7907994-3
I samtliga de fall då man i immunoglobulinet eller dess frag-
ment inför en eller flera svavelhaltiga grupper är det nödvändigt att
undvika all substitution på det ställe, som känner igen antigenet,
och i dess omedelbara omgivning, eftersom man annars skulle kunna för-
störa antikroppens igenkänningsegenskaper. För att utesluta denna
risk kan man tillfälligt blockera igenkänningsstället under substi-
tutionsreaktionen genom att i förväg behandla antikroppen med det
specifika antigenet eller med ett annat antigen som ger en tillräcklig
korsreaktion eller med ett lämpligt hapten.
Förfarandet för att åstadkomma ett tillfälligt skydd kan ge-
nomföras antingen i flytande fas, om komplexet av antikropp och anti-
gen (eller hapten) är lösligt i reaktionsmediet, eller i heterogen
fas, om komplexet är naturligen olösligt eller om det frivilligt har
gjorts olösligt enligt någon lämplig metod, särskilt fixering av
antigenet (eller haptenet) på en olöslig bärare på sådant sätt, att
den modifierade bäraren uppvisar en tillräcklig affinitet till anti-
kropparna.
Efter genomförande av substitutionsreaktionen avblockeras
igenkänningsställena på antikropparna enligt någon lämplig metod för
avlägsnande av antigenet, så att antikropparnas specifika igenkän-
ningsförmåga återställes.
Det är icke möjligt att åstadkomma disulfidbryggan mellan de
båda proteinerna genom att bringa de båda konjugatbeståndsdelarna
(vardera innehållande en SH-grupp) i kontakt med varandra och genom-
föra en oxidation. Under dessa betingelser är kopplingsreaktionen
en jämviktsreaktion, som det är mycket svårt att genomföra fullstän-
digt. Dessutom åtföljes den önskade reaktionen av en bildning av
polymerer av var och en av de båda beståndsdelarna, vilket medför
att den önskade produkten erhålles i ett mycket lågt utbyte och att
reaktionsblandningen kommer att innehålla föroreningar som är mycket
svåra att avlägsna.
Enligt uppfinningen framställes konjugatet genom att ett av
proteinerna, uppbärande en fri SH-grupp, bringas i kontakt med det
andra proteinet, vars SH-grupp har aktiverats genom att den har om-
vandlats till en blandad disulfid med en lämplig svavelhaltig or-
ganisk grupp. Framställningen av konjugatet kan illustreras med
följande reaktionsformel:
Pl-SH + Pz-s-s-X --> Pl-s-s-PQ + xsH
790799443
10
där P och P betecknar de två proteiner som skall hopkopplas, och
X betšcknar än aktiverande grupp. Av ovanstående reaktionsformel
framgår omedelbart, att kopplingsreaktionen i samtliga fall kan
genomföras enligt tvâ varianter. Sålunda kan P1 beteckna immuno-
globulinet eller dess fragment och P2 beteckna kedjan A, eller om-
vänt kan P1 beteckna kedjan A och P2 beteckna immunoglobulinet eller
dess fragment.
Fall 1. P1 betecknar en antikropp eller ett fragment därav,
och P2 betecknar kedjan A från ricin.
För att genomföra aktivering av den fria SH-gruppen i kedjan
A underkastas en lösning av kedjan A, framställd på ovan beskrivet
sätt, följande utbytesreaktion.
AsH + xssx çïi A-s-s-X + XSH (1)
där ASH betecknar kedjan A och X betecknar en aktiverande grupp.
X kan särskilt beteckna en 2- eller Ä-pyridylgrupp, eventuellt sub-
stituerad med en eller flera halogenatomer, alkylgrupper eller karb-
oxylgrupper, eller X kan beteckna en fenylkärna, eventuellt substi-
,tuerad med en eller flera nitrogrupper eller karboxylgrupper.
Reaktionen (1) är en jämviktsreaktion, men jämvikten kan lätt
förskjutas ät höger genom användning av ett stort molärt överskott
av reaktionskomponenten XSSX, som vanligen är billig och lättillgäng-
lig.. Det är möjligt att följa reaktionens förlopp genom spektrofoto-
metrisk analys i ultraviolett ljus eller synligt ljus, ty den bilda-
de föreningen XSH uppvisar en kraftig absorption. När reaktionen
har nått önskad omvandlingsgrad, elimineras överskottet av reaktions-
komponenten XSSX och reaktionsprodukten XSH genom dialys eller gel-
filtrering med användning av molekylsilar. Man erhåller slutligen
en ren lösning av föreningen A-S-S-X i den valda bufferten. Om så
är nödvändigt kan denna lösning efter frysning förvaras under flera
veckor.
Man framställer dessutom ett immunoglobulin substituerat med
en SH-grupp. För detta ändamål använder man den ovan framställda
immunoglobulinlösningen, antingen såsom sådan eller efter blockering
av igenkänningsställena för antigenet med motsvarande hapten, följt
av eliminering av överskottet av hapten. Genom att omsätta detta
protein med S-aceLylmerkaptobärnstenssyraanhydrid är det möjligt
att vid proteinets fria aminogrupper fästa en eller flera S-acetyl-
merkaptosuccinylgrupper per mol protein, varefter tiolgrupperna fri-
göres genom omsättning med hydroxylamin på känt sätt ¿Ãrchives
of Biochemistry and Biophysics 112, H1-H9 (1967)_7. Genom en dialys
7907994-5
11
är det möjligt att avlägsna överskottet av reaktionskomponenten samt
reaktionsprodukter med låg molekylvikt.
Samtliga dessa operationer genomföres i en fosfatbuffert med
pH = 7,0 och vid temperaturer som icke överstiger rumstemperatur.
Den erhållna slutliga lösningen befrias från det hapten som eventu-
ellt har använts såsom tillfälligt blockeringsmedel. Om så är nöd-
vändigt kan lösningen koncentreras, t.ex. genom ultrafiltrering.
Kopplingen mellan de två sålunda framställda reaktionskomponenterna
sker genom enkel kontakt i vattenlösning vid rumstemperatur under en
tid som varierar från några timmar till ett dygn. Kopplingsreaktio-
nen sker enligt följande reaktionsschema:
Pwu r-nl-co-cu-sn -|- A-s-s-x----->Proc Nnco mhs-s-A + xsn
| ¥
Q1 (M
' 2G ' 29
coo coo (a)
Reaktionens förlopp följes genom spektrofotometrisk bestämning
av den bildade föreningen XSH. Denna förening avlägsnas därefter
genom dialys, och man erhåller en lösning av det önskade konjugatet,
som bör renas. Rening är i själva verket nödvändig, särskilt för
att avlägsna icke omsatta molekyler av A-S-S-X, vilka skulle kunna
ge en icke-selektiv giftighet om de var närvarande i konjugatet.
Reningen kan genomföras enligt olika kända metoder, såsom
fraktionerad utfällning med hjälp av organiska lösningsmedel bland-
bara med vatten eller med hjälp av salter, gelpermeationskromatogra-
fi eller affinitetskromatografi på en kolonn bildad av en olöslig
bärare, vid vilken man har fästat det antigen (eller hapten) som
motsvarar den vid framställningen av konjugatet använda antikroppen.
Dessa reningsmetoder kan tillämpas direkt pä den dialyserade
lösning som erhålles efter kopplingssteget. Man erhåller emellertid
bättre resultat (framför allt undviker man en senare bildning av
polymerer av konjugatet) genom att i förväg blockera de kvarvarande
fria SH-grupperna med ett sådant reagens som N-etylmaleimid.
Fall 2. P1 betecknar kedjan A och P2 betecknar en antikropp
eller ett fragment därav.
Kopplingsreaktionen genomföres i detta fall med kedjan A från
ricin och ett immunoglobulin (eller fragment därav) substituerat med
en grupp uppbärande en eller flera aktiverade svavelatomer. Kedjan
A användes i den form den erhålles efter den ovan beskrivna renings-
processen. Det med en aktiverad svavelatom substituerade immunoglo-
bulínet framställes genom att immunoglobulinet substitueras med hjälp
7907994-3
12
av en reaktionskomponent uppbärande en aktiverad svavelatom i enlig-
het'med följande reaktionsschema:
Prot + Y-R~S-S-X---9 Prot-R~SS-X
där Prot betecknar immunoglobulinet, Y betecknar en grupp som möjlig-
egör kovalent bindning mellan reaktionskomponenten och proteinet, R
betecknar en grupp som samtidigt kan uppbära substituenterna Y och
-S-SX, och X betecknar en aktiverande grupp.
En dylik reaktionstyp har redan använts för att med hjälp av
en disulfidbrygga hopkoppla två identiska eller olika proteiner,
men tillämpning av denna princip för hopkoppling av ett immunoglobu-
lin med kedjan A från ricin är ny.
I Den funktionella gruppen Y är en grupp som kan ge en kovalent
bindning med vilken som helst av de funktionella grupper som uppbä-
res av sidokedjorna i de aminosyror som bildar det protein som skall
substitueras. Bland dessa grupper kan man särskilt nämna de ändstâ-
ende aminogrupperna i lysylgrupper i proteinet. I detta fall kan
symbolen Y särskilt beteckna någon av följande grupper:
(a)i en karboxylgrupp som kan bindas till aminogrupperna i proteinet
i närvaro av ett kopplingsmedel, såsom en karbodiimid, särskilt ett
vattenlösligt derivat, såsom 1-etyl-346-dietylamlnopropyl)karbodi-
imid;
(b) en karboxylsyrakloridgrupp som kan reagera direkt med aminogrup-
perna under acylering av dessa;
(c) en sek. aktiverad estergrupp, såsom en orto- eller para-, nitro-
eller dinitrofenylester eller en ester av N-hydroxisuccinimid, som
reagerar direkt med aminogrupperna under acylering av dessa:
(d) en inre anhydrid av en dikarboxylsyra, t.ex. bärnstenssyraanhyd-
rid, som reagerar spontant med aminogrupperna under bildning av
amidbindningar:
»NU N
(e) en iminoestergrupp 'C\0Rl , dar R1 betecknar en alkylgrupp som
reagerar med aminogrupperna i proteinet enligt följande reaktions-
formel:
'i u
N
\\ ll
c-R Pm: Nn-c-R + R ou
I: o" 2 2 1
L
HN
PLnL~NH7 4
. __. ...-- -.._-.._.-.-__..
7907994-3
15
Symbolen X betecknar en funktonell grupp som kan reagera med
en fri tiolgrupp. X kan särskilt beteckna en 2- eller U-pyridylgrupp,
eventuellt substituerad med en eller flera halogenatomer, alkylgrup-
per eller karboxylgrupper. X kan även beteckna en fenylgrupp, före-
trädesvis substituerad med en eller flera nitrogrupper eller karb-
oxylgrupper. X kan dessutom beteckna en alkoxíkarbonylgrupp, såsom
metoxikarhonyl.
Symbolen R betecknar vilken som helst grupp som samtidigt kan
uppbära substituenterna Y och S-S-X. Denna grupp bör väljas på
sådant sätt att den icke innehåller några grupper som kan störa
de reaktioner som senare genomföras eller påverka de bildade pro-
dukterna. Gruppen R är särskilt en grupp -(CH2)n-, där n är ett
tal från 2 till 10, eller en grupp med formeln
R3-(IIII-
mh
I
RA
där Ru betecknar en väteatom eller en alkylgrupp innehållande 1-8
kolatomer, och H3 betecknar en substituent som är inert gentemot de
senare använda reaktionskomponenterna, såsom en amidgrupp -mi4%0R3
ll
O
där R5 betecknar en rak eller förgrenad alkylgrupp innehållande 1-5
kolatomer, särskilt a1tert.butylgrupp. 7
Reaktionen mellan föreningen Y-R-S-S-X och immunoglobulinet
genomföres i homogen flytande fas, oftast i vatten eller i en buffert-
lösning. När reaktionskomponenternas löslighet så kräver, är det
möjligt att till reaktionsmediet sätta upp till 20 volym-% av ett
med vatten blandbart organiskt lösningsmedel, såsom en alkohol, sär-
skilt tertiär butanol.
Reaktionen genomföres vid rumstemperatur under en tid av mellan
några timmar och 2H timmar. Efter reaktionen genomföres en dialys
för avlägsnande av produkter med låg molekylvikt, särskilt överskot-
tet av reaktionskomponenter. Detta förfarande gör det möjligt att
införa 1-5 substituentgrupper per mol protein.
De sålunda framställda föreningarna hopkopplas med kedjan A
från ricin i en vattenlösning av de båda proteinerna vid en tempera-
tur som icke överstiger BOOC och under en tid av mellan några timmar
och ett dygn. Reaktionen sker enligt följande reaktionsschema:
Prot-R-S-S-X + ÅSH --) Prot-R-S-S-A + XS!!
790199443
lfl
där Prot-R-S-S-X betecknar det substituerade och aktiverade immuno-
globulinet (eller dess fragment), och ASH betecknar kedjan A från
ricin. Den resulterande lösningen dialyseras för avlägsnande av
föreningar med låg molekylvikt, varefter det bildade konjugatet
kan renas enligt olika välkända metoder, såsom ovan har angivits i
samband med beskrivningen av den första metoden för framställning av
konjugaten enligt uppfinningen.
_ Uppfinningen illustreras genom följande icke begränsande exem-
pel. Med uttrycket TPE avses i utföringsekemplen en fosfatbuffert
(0,125 M, pH = 7,0) innehållande 1 mM dinatriumsalt av etylendiamin-
tetraättiksyra.
Exempel 1. Framställning av ricin.
(a) Extraktion. i
1 kg hela, oskalade från av Ricinus communis males i en kött-
kvarn till en pasta, vilken rives grundligt med 2 l etyleter kyld
till NCC. Efter avlägsnande av etern upprepas förfarandet för av-
lägsnande av lipíder ytterligare två gånger, varje gång med 2 l eter.
Efter det sista avlägsnande av eter torkas återstoden i luft, varvid
man erhåller H00 g avfettat pulver. (Detta pulver suspenderas i
BÄOO ml 0,1NM natriumkloridlösning kyld till ROC, varefter suspensio-
nens pH-värde inställes på H genom tillsättning av ättiksyra. Sus-
pensionen kyles i ett isbad och underkastas en homogeniseringsopera-
tion genom kraftig omblandning i en malningsanordning under 30 se-
kunder, varefter suspensionen får vila under 30 minuter under kyl-
ning i isbadet. Denna cykel omfattande homogenisering och vila upp-
repas åtta gånger.
li Efter avslutad extraktion centrifugeras suspensionen, varvid
man erhåller ca 3400 ml av en klar lösning. Denna lösning överföres
till ett dialysrör, vars bredd i tillplattat tillstånd är 10 cm,
och lösningen dialyseras först mot destillerat vatten (förnyas kon-
tinuerligt) under Ä8 timmar och därefter under 2Ä timmar mot THIS-
) HCl-buffert (10 mM, pH = 7,7), som förnyas kontinuerligt med en has-
tighet av 1 l per timme. Under dialysen bildas en fällning, vilken
avlägsnas gcnmnavfiltrering på frittat glas. Man erhåller härvid
BÄOO ml oren lösning innehållande 12 mg proteiner per ml. Denna
lösning kan förvaras vid -2000.
(b) Rening.
En kolonn med en innerdiameter av 100 mm fylles med 5 l
Sépharose HB (Pharmacia), som bringas i jämvikt med TRIS-HC1-buf-
rer-t (10 mm, pH = 7,7) kyld till 4°c.
7907994-3
15
Hälften av den ovan erhållna orena lösningen, dvs. 1700 ml,
införes på toppen av denna kolonn med en hastighet av 300 ml per
timme. Man tvättar därefter kolonnen med 3 l TRIS-H01-buffert
(10 mM, pH = 7,7) med samma hastighet, och man avlägsnar det härvid
erhållna filtratet, vilket innehåller proteiner som icke bindes genom
affinitet till kolonnen.
Man eluerar därefter, fortfarande med samma hastighet, med 4 l
av samma buffert innehållande 0,050 g galaktos per l (0,28 mM), och
det härvid erhållna eluatet uppsamlas. Man eluerar sedan, fortfaran-
de med en hastighet av 300 ml/h, med 4 l av samma buffert innehållan-
de 0,100 g galaktos per l (0,56 mM). Det härvid erhållna eluatet
förenas med det föregående, varvid man erhåller 8 l lösning innehål-
lande ca 300 pg ricin per ml.
För att kolonnen skall kunna användas på nytt för en efterföl-
jande separationsoperation eluerar man slutligen med 1 l TRIS-HCl-
buffert (pH = 7,7) innehållande 18 g galaktos per l (0,1M), varvid
man erhåller ett eluat huvudsakligen innehållande agglutinin, som
bortkastas. Efter tvättning med ytterligare 1 l av samma buffert
och sedan med flera liter av ren TRIS-H01-buffert (pH = 7,7) är
kolonnen färdig för förnyad användning.
En identisk separationsoperation genomförs med den andra hälf-
ten av den under (a) erhållna orena lösningen. Det erhållna eluatet
förenas med det ovan erhållna eluatet, varvid man erhåller 16 1 av
en lösning av ricin i THIS-HCl-buffert (10 mM, pH = 7,7) innehållan-
de i medeltal 0,075 g galaktos per liter.
Denna lösning koncentreras genom ultrafiltrering med använd-
ning av ett membran, vars porositet tillåter passage av sfäriska
molekyler med en molekylvikt mindre än 30 000. Ultrafiltreringen
genomföres i en cell med diametern 150 mm. Man erhåller slutligen
762 ml av en lösning av ricin i ursprungsbufferten. Denna lösning,
vilken innehåller 6,7 mg ricin per ml, kan förvaras vid -2000.
Det erhållna ricinet uppvisar följande egenskaper.
Molekylvíkt: 66 000 É 5000, bestämd genom elektrofores i när-
varo av natriumdodecylsulfat enligt Journal of Biologícal Chemistry
E53, HH06-MH12, (1969). g
Isoelektrisk punkt: 7,1, bestämd genom elektrofores i ett fly-
tande skikt Äiaboratory techniques in biochemistry and molecular
biology, Vol. 5, del II, p. 501, Work T.S. och Work E. (North
Ho11and)_7.
Det framställda ricinets renhet kan bekräftas med hjälp av
37907994-3
16
alla klassiska analytiska metoder.
Exempel 2. Framställning av ricinets kedja A.
Till 150 ml av den i exempel 1 erhållna ricinlösningen (inne-
hållande ca 1 g ricin) sättes 3,75 ml 2-merkaptoetanol, och den re-
sulterande lösningen får stå under 2 timmar vid 2000.
Lösningen ínföres sedan på toppen av en kolonn med en inner-
diameter av 50 mm fylld med 1800 ml DEAE CL Sépharose G9 6B (Phar-
macia), som har bragts í jämvikt med TRIS-HCl~buffert (0,1 M, pH =
8,U) innehållande 2,5 volym-% 2-merkaptoetanol.
Kolonnen tvättas med 300 ml TRIS-HCl-buffert (0,1 M, pH =
8,ü) innehållande 0,1M natriumklorid och 2,5 volym-% 2-merkaptoetanol.
Alltifrån behandlingens början uppsamlas en enda eluatfraktion (volym
ca_N50 ml) innehållande kedjan A i en koncentration av ca 0,89 mg/ml.
Kedjan A har identifierats med hjälp av elektrofores.
I ett dialysrör med en bredd i tillplattat tillstånd av 10 mm
dialyseras den erhållna eluatfraktionen grundligt mot en fosfatbuf-
fert (10 mM, pH = 6,5). Den resulterande lösningen införes på top-
penaw en kolonn, vilken har en innerdiameter av 25 mm och innehåller
300 ml karboximetylcellulosa CM 52 (Whatman), som har bragts i jäm-
vikt med fosfatbuffert (10 mM, pH = 6,5). Vid detta pH-värde och
denna jonstyrka bindes kedjan A på kolonnen, och kedjan A elueras
därefter med TPE-buffert. Man erhåller härvid 67 ml av en lösning
innehållande 5,72 mg kedja A per mol.
Kedjan A uppvisar följande egenskaper (bestämda på samma sätt
som ovan har angivits för ricin i exempel 1).
Molekyivikt: 30 oøo ï zooo.
Isoelektrisk punkt: 7,5.
Enligt DTNB-metoden Åfiethods in Enzymology gå, H57 (1972)
(Academic Press)_7 har man dessutom bestämt, att produkten innehåller
0,96 ekvivalenter SH per mol kedja A (uppskattad molekylvikt 50 000).
Den för separationen använda kolonnen av DEAE CL Sepharose 6B kan
regenereras för förnyad användning genom tvättning med TRIS-HCl-
buffert (0,1M, pH = 8,Ä) innehållande 0,1M natriumklorid och 0,1M
galaktos. Härvid elueras den av kolonnen upptagna kedjan B. In-
nan kolonnen kan användas för en förnyad framställning av kedja A,
bör den på nytt bringas i jämvikt med TRIS-H01-buffert (0,1M, pH =
8,H) innehållande 2,5 volym-% 2-merkaptoetanol.
Koncentrering av kedjan A.
Den erhållna utspädda lösningen av kedjan A anbringas på en
kromatografisk kolonn, vilken har en innerdiameter av 16 mm och inne-
7907994-3
17
håller 10 ml karboximetyl-SepharoseeGQ som har bragits i jämvikt med
samma buffert. Under dessa betingelser bindes kedjan A på kolonnen.
Kedjan A elueras därefter med TPE-buffert. Ãtervinnignen är kvanti-
tativ.
En avsättning av 150 mg av kedjan A gör det möjligt att eluera
fraktioner med en genomsnittlig koncentration av 10 mg kedja A per
mol, motsvarande totalt 90% av den på kolonnen avsatta mängden.
Den erhållna koncentrerade lösningen har en mycket hög renhet.
Framställning av kristaller av kedja A.
En lösning av kedja A med en koncentration av 10 mg/ml får stå
vid UOC. Efter några dygn bildas härvid kristaller. Efter åter-
upplösning av dessa kristaller och analys kan man påvisa, att kristal-
lerna har samma fysikalisk-kemiska egenskaper (molekylvikt, iso-
elektrisk punkt) ooh samma biologiska egenskaper (hämning av proteo-
syntesen) som kedjan A i den ursprungliga lösningen.
Exempel 3. Framställning av ricinets kedja A.
Till 70 ml av en rioinlösning, erhållen enligt den metod som
beskrivits i exempel 1 och innehållande Ä mg ricin per mol, sättes
1,75 ml 2-merkaptoetanol, varpå-den resulterande lösningen får stå
vid 2000 under 2 timmar.
Lösningen anbringas sedan på en kolonn innehållande 800 ml
QAE Sephadex A50 (Pharmacia), som har bragts i jämvikt med TRIS-
HCl~buffert (100 mM, pH = 8,N) innehållande 0,5 volym-% 2-merkapto-
etanol. Elueringen genomförs med samma buffert.
Alltifrån behandlingens början uppsamlas en enda fraktion med
volymen 170 ml. Denna fraktion innehåller 0,9 mg kedja A per mol,
och fraktionen behandlas på samma sätt som beskrives i exempel 2
med början från dialysbehandlingen. Den erhållna kedjan A uppvisar
samma egenskaper som den i exempel 2 erhållna kedjan A. För regene-
rering av kolonnen elueras den bundna kedjan B med TRIS-HCl-buffert
(100 mM, pH = 8,H) innehållande 0,15M natriumklorid, varefter kolon-
nen tvättas med TRIS-HCl-buffert (10 mM; pH = 7,7).
Exempel 4. Framställning av rena anti-DNP-antikroppar.
Med beteckningen anti-DNP-antikroppar avses antikroppar speci-
fikt riktade mot gruppen 2,A-dinitrofenyl.
(a) Immunicering av djur.
Man åstadkommer ett lämpligt immunogen gaxmxatt omsätta 2,4-
dinitrobensensulfonat med X -globulin från nötkreatur enligt en
klassisk metod. Härvid bindes 52 2,Ä-dinitrofenylgrupper per mol
Ü ' D _ . . . .
pro ein ( NP52 BGG). Genom immunisering med denna produkt bildas
7907994-3 '
18
en antikroppfraktion specifikt riktad mot haptenet 2,4-dinitrofenyl.
_ Var och en av tre getabockar immuníseras genom injicering av
5 mg DNP52-BGC i en emulsion framställd av 2 volymer fysiologiskt
vatten buffrat till pH = 7,U och 1 volym av Freunds fullständiga
tillsatsmedel. Den första immuniseringen följes av 7 ytterligare
immuniceringar under en tid av 1 år. Samtidigt tages från varje
djur 12 blodprover om vartdera 1 l venöst blod. Serumet avskiljes
och förvaras vid -2000. Före reningsprocessen förenas 17 blodprover,
vari komplementet inaktiveras genom upphettning. Man centrifuge-
rar sedan under 30 min vid 20 000 X g för att avlägsna de denature-
rade proteinerna och aggregaten, och slutligen filtrerar man genom
filterpapper för att avlägsna de suspenderade fetterna. Det sålun-
da framställda serumet är färdigt för reningsprocessen.
(b) Reníng.
Reningen har till syfte att specifikt adsorbera anti-DNP-anti-
,kropparna i serumet på ett protein, vilket uppbär haptenet 2,4-di-
nitrofenyl och är fixerat på en fast bärare. De fria eller icke-
_specifikt bundna substanserna elimineras därvid, varefter de rena
antikropparna elueras.
Framställning av immunoadsorptionsbäraren.
Immunoadsorptionsgelet framställes genom att 1630 mg human-
serumalbumin innehållande 35 dín'trofenylgrupper (DNP35-HSA) kopplas
till 100 g (torrvikt) Sépharose HB enligt klassisk teknik. Genom
spektrofotometrisk analys av tvättlösningarna vid 280 nm och 560 nm
efter kopplingsreaktionen kan man konstatera ett bindningsutbyte
av 95% DNP55-HSA. Man genomför två tvättningsbehandlingar, först
vid pH = 3,0 (0,8M glycinhydrokloridbuffert innehållande 1M natrium-
klorid) och sedan vid pH = 10,0 (O,1M boratbuffert innehållande 1M
natriumklorid). Gelet bringas sedan i jämvikt med arbetsbufferten,
som är en fosfatbuffert (O,1M, pH ='7) innehållande 0,01 g natríum-
azid per 100 ml. 7
Adsorption av antikropparna.
Före adsorptionen på det ovan framställda gelet är det lämp-
ligt att bestämma det volymförhållande serum/gel som skall användas
för att på bärarcn endast adsorbera de anti-DNP-antikroppar som
uppvisar den kraftigaste'affiniteten. Man har valt att-på bäraren
endast fixera 50% av den totala antikroppaktiviteten i serumet och
låta resterande 50% bli kvar i den överstående vätskan.
För ett givet serum bestämmes den gelmängd som skall användas
genom att man genomför prov med små mängder under analytiska beting-
7907994-3
19
elser. Prover om 125 pl immunoadsorptionsgel bringas i kontakt
med serumprover med ökande volym, från 0,5 ml till 8 ml, varvid
serumvolymen ökas till det dubbla från försök till försök. Efter
inkubering bestämmas aktiviteten av anti-DNP-antikroppar i den över-
stående vätskan enligt en klassisk radioimmunologisk metod Äfiand-
book of Experimental Immunology Vol. 1, kap. 15, 1-18, Ed. Weir
D.M., 2-a uppl. 19757, varvid man titrerar fenylkärnan i ställning-
arna 3 och 5 med användning av 8 -N-(2,H-dinitrofenyl)-L-lysin.
Vid varje försök kan man härvid beräkna den kvarvarande anti-
kroppaktiviteten i den överstående vätskan i procent av aktiviteten
i det ursprungliga immunserumet, och man kan rita en kurva över det-
ta procentuella värde (A) som funktion av volymförhâllandet serum/
gel. Med hjälp av denna kurva kan man beräkna den serumvolym som
skall bringas i kontakt med 125 pl gel för att 50% av antikroppakti-
viteten skall bli kvar i den överstående vätskan. Vid det beskrivna
försöket är denna serumvolym lika med H ml, vilket motsvarar 32 ml
serum per ml imrnunoadsorptnflonsgel. .
När detta förhållande har bestämts, omrör man 6150 ml immun-
serum med 193 ml ímmunoadsorptionsgel i en behållare med volymen
10 l, först under 1 timme vid rumstemperatur och sedan över natten
vid 400.
Efter centrifugering (1000 x g, 10 min) avskiljes gelet, och
den fasta bottensatsen suspenderas i en volym av den översitående
vätskan. Den resulterande suspensionen införes i en kromatografisk
kolonn (diameter 26 mm, längd H00 mm) försedd med en mantel för
kylning till 400, en anordning för mätning av den optiska tätheten
vid 280 nm och en anordning för fraktionsuppsamling. Kolonnen tvät-
tas med 8 l fosfatbuffert (0,1M, pH = 7,0) innehållande 0,01 g natri-
umazid per 100 ml. Tvättningen genomförs först under Ä0 timmar vid
H00 och sedan under 2Ä timmar vid rumstemperatur. Vid slutet av
tvättningen är den optiska tätheten vid 280 nm ytterst låg (mindre
än 0,0H).
Eluering av antikropparna.
Elueringen av de på kolonnen fixerade anti-DNP-antikropparna
genomföras med ett stort överskott av en lösning av haptenet 2,H-
dinitrofenol.
Man använder en 0,2M lösning av 2,U-dinitrofenol i samma fos-
fatbuffert som har använts ovan; bufferten har neutraliserats till
pH = 7,0 genom tillsättning av natriumhydroxid. Den erhållna lös-
ningen bör förvaras i frånvaro av ljus. För elueringen använder
7907994-3
20
man 2,8 l av denna lösning, vilken ledes genom kolonnen med en hastig-
het av 1,25 mllßr tnmæ. För avlägsnande av 2,H-dínitrofenolen från
det erhållna eluatet ledes eluatet omedelbart genom en andra kolonn,
vilken innehåller 300 ml stark anjonbytare Dowex 1 X 10 (denna anjon-
bytare består av en styren-divinylbensen-polymer innehållande kvater-
nära ammoniumgrupper). Jonbytaren har bragts i jämvikt med den ovan
angivna fosfatbufferten. 7
Antikropparna elueras i en enda proteintopp, vilken följes av
en svans. Man förenar dels de eluatfraktioner som har en optisk tät-
het större än eller lika med 0,9 (fraktion B1,'700 ml) och dels de
andra fraktionerna (fraktion B2, 2000 ml). Proteinkoncentrationen
i var och en av dessa fraktioner bestämmes enligt den metod som be-
skrives i Journal of Immunological Methods lä, 101-119, (1977).
Fraktíon Bl innehåller 15,4 g antikroppar, dvs. 22 g/1, och
fraktion B2 innehåller ca 1 g antikroppar, dvs. 0,5 g/l. Fraktio-
nerna förvaras vid ~20°C i fosfatbuffert (O,1M, pH = 7,0) innehål-
lande 0,01 g natriumazid per 100 ml.
De framställda preparaten har analyserats enligt olika fysi-
kalisk-kemiska metoder, särskilt elektrofores på agarosgel lattor,
immunoelektrofores, kromatografi på en kolonn av Sêphadax¿àG-200
(dextrangel i form av pärlor framställda genom att dextranfraktioner
använda för gelfiltrering har tvärbundits med epiklorhydrin). Ana-
lyserna har bekräftat de erhållna antikropparnas renhet, särskilt
frånvaron av påvisbara mängder albumin (mindre än 1/500 av mängden
antikroppar) och immunoglobuliner M.
De renade antikropparnas immunologiska verkan har bestämts
enligt den metod som har beskrivits av Nahm [Üournal of Immunology
112, 1, 301 (1977)_7. Man har jämfört de renade antikropparnas im-
munologíska verkan med den immunologiska verkan av dels det ursprung-
liga immunserumet och dels antikropparna i den överstående vätskan
från immunoadsonmüonen.(fraktion A1). De erhållna resultaten är
sammanställda i nedanstående tabell.
Genomsnittlig Affinitetssprid-
associationskonstant ningsindex
Immunserum 2,5 :_107 M_1 0,50
rraktiøn A1 5 ¿ 105 M-1 0,22
Praktica sl - 2,5 . 107 M_1 - 0,75
790799458"
21
Av försöksresultaten framgår, att de renade antikropparna
(fraktion B1) uppvisar en högre genomsnittlig affinitet än det ur-
sprungliga immunserumet och en mycket högre affinitet än fraktion
A1 samt en mera homogen affinitet än immunserumet.
Exempel 5. Framställning av ett konjugat utgående från merkap-
tosuccinylerade anti-DNF-antikroppar och aktiverad kedja A från
ricin.
(a) Framställning av aktiverad kedja A.
15 ml av en lösning av kedja A i fosfatbuffert (exempel 2)
innehållande 1,U mg kedja A per ml blandas med 8 ml av en 1,Ä25 mM
lösning av 2,2'-dipyridyldisulfid i samma buffert. Reaktionsbland-
ningen får stå vid rumstemperatur i frånvaro av ljus under 1 timme
och 30 min. Man erhåller härvid en lösning av kedja A, vars tiol-
grupp är aktiverad, och denna lösning innehåller 0,9 mg protein per
ml. Efter avslutad reaktion genomförs en spektrofotometrisk analys
vid 3H3 nm. Denna analys visar, att den bildade produkten innehållet
fl
0,9 aktiverade grupper -s-S-lf
genom kontinuerlig dialys mot TPE-buffert under 18 timmar vid en
per mol kedja A. Lösningen renas
temperatur av 500. Den rena lösningen förvaras vid -2000.
(b) Framställning av merkaptosuccinylerade anti-DNP-antikrop-
BÉÉ' '
Till 3,3 ml av en lösning av anti-DNP-antikroppar (exempel H)
innehållande 25,8 mg rena antikroppar per ml sätter man 0,37 ml av
en vattenlösning innehållande 0,57 mg 2,Ä-dinitrofenol per mol. Den
resulterande lösningen omröres under 10 min vid rumstemperatur.
Till lösningen sättes därefter 3,06 mg Sfacetylmerkaptobärnstens-
syraanhydrid [Archives of Biochemistry and Biophysics 2§, 605-612,
(1962)_7, varpå man omrör under 2 timmar vid rumstemperatur.
Till den resulterande lösningen sätter man 0,H7 ml 0,1M vatten-
lösning av hydroxylamin (pH = 0,8), varpå reaktionsblandningen får,
stå vid rumstemperatur under 1 timme och 30 min. Lösningen dialyse-
ras därefter mot 4 x 3 1 TPE-buffert under 89 timmar vid 500. Den
dialyserade lösningen centrífugeras vid 27 000 X g under 10 min vid
AOC. Den erhållna överstående vätskan ledes genom en kolonn av den
starka anjonbytaren Dowex 1 X 8 (partikelstorlek 0,037-0,07H mm) i
fosfatform för avlägsnande av den 2,4-dinitrofenol som har bundits
vid igenkänningsställena för antígenet. _
Man eluerar med TPE-buffert vid rumstemperatur, varefter man
koncentrerar eluatet genom ultrafiltrering. Man erhåller härvid
7907994-3
2.?
H,55 ml av en lösning innehållande 17,0 mg merkaptosuccinylerade
antikroppar per ml.
Enligt den metod som beskrives i Archives of Biochemistry and
Biophysics 112, U1-H9 (1967) bestämmer man, att den substituerade
antikroppsmolekylen uppbär 4 merkaptosuccinylgrupper mer mol anti-
kropp.)
(c) Framställning av konjugat.
Man blandar 12,Ä ml av en lösning av aktiverad kedja A (fram-
ställd enligt den metod som beskrives under (a) ovan) innehållande
1 mg aktiverad kedja A per ml (dvs. O,Ä13 pmol) med 6,5 ml av en
lösning av anti-DNP-antikroppar innehållande 4 merkaptosuccinylgrup-
per.per mol (framställd enligt den metod som beskrives under (b) ovan)
innehållande 15 mg antikroppar per ml (dvs. 0,658 pmol). Reaktions-
blandningen får stå under 20 timmar vid rumstemperatur i frånvaro av
ljus.
Man bestämmer den i reaktionsmediet frigjorda pyridin-2-tio-
nen genom spektrofotometrisk analys vid BHB nm. Man finner härvid,
att 0,251 pmol kedja A har kopplats till 0,658 pmol antikroppar.
Reaktionslösningen dialyseras mot 3 x 5 l TPE-buffert under 75 tim-
mar vid 500. Den erhållna lösningen (17 ml) filtreras genom ett
steriliserande membran (0,H5 pm) och förvaras vid ~20°C. Produkten
renas därefter genom filtrering på ett gel av Sephadex G 200.
7 ml av den ovan erhållna lösningen centrifugeras först vid 27 000
x g under 10 min, och den överstående vätskan behandlas med 0,6 ml
av en lösning av N-etylmaleimid (0,645 mg/ml) i TPE-buffert under
30 min vid rumstemperatur; behandlingen sker utan omrörning. Den
resulterande lösningen filtreras i riktning nedifrån och uppåt genom
en kolonn (diameter 26 mm) innehållande H73 ml gel av Sephadex G 200.
Produkten elueras med TPE-buffert, varvid denna buffert ledes genom
kolonnen med en hastighet av 16 ml per timme. Man uppsamlar eluat-
fraktioner med volymen 2 ml. I
I varje fraktion mätes antikroppskoncentrationen genom spekt-
rofotometrisk analys vid 280 nm, och koncentrationen av kedjan A
bestämmes genom kedjans förmåga att hämma proteosyntes i cellfria
I system. Man erhåller två elueringstoppar, vilka innehåller både
antikropp och kedja A, och man förenar de fraktioner som motsvarar
var och en av dessa toppar tillfen lösning a respw en lösning bj
5 Den första toppen (lösning a) motsvarar konjugat med en genom-
snittlig. moiekylv-ikfi höïgr-.eränreller- lika med 800 øoø. Detta kbñju-
7907994-3
25
gat härrör från antikroppar polymeriserade genom intermolekylära
disulfidbryggor bildade under isoleringen av de merkaptosuccinylerade
antikropparna. 7
Den andra tuppen (lösning b) motsvarar proteiner med en genom-
snittlig molekylvíkt av 190 000, dvs. konjugat av icke polymeriserade
antikroppar.
På analytisk väg visas att lösningen a innehåller Ä23 pg anti-
kroppar och 20 pg kedja A per ml, dvs. i genomsnitt ca 0,2 mol kedja
A per mol antikropp. Dessutom visas på analytisk väg, att lösningen
b innehåller 171 pg antikroppar och 13 pg kedja A per mol, dvs. i me-
deltal ca 0,ü mol kedja A per mol antikropp.
Ekempel Q. Framställning av ett konjugat utgående från ricinets
kedja A och anti-DNP-antikroppar substituerade med aktiverade svavel-
atomer. _ I
(a) 3-(2-pyridyldisulfanyl)propionsyra.
Denna syra framställes i två steg utgående från 2,2'-dipyridyl-
disulfid utan rening av mellanprodukten.
G12 ßfl Hs-caz-cnz-coon Q
w)- s-s--QN, ~+ 3G -rscl ----> ä' s-s-<'H2-<:H,-fi-<>H
(l
Man löser Ä g 2,2'-dipyridyldisulfid i 25 ml metylenklorid och
bubblar klorgas genom den resulterande lösningen under ca 30 min.
Härvid bildas en fällning. >Reaktionsblandningen indunstas till torr-
het under förminskat tryck, och man använder den torra återstoden
i följande reaktionssteg.
Man löser 2,H g pyridin-2-sulfinylklorid i 40 ml metylenklorid
under kylning i ett isbad. Till den resulterande lösningen sättes
långsamt under omrörning en lösning av 1,75 g 3-merkaptopropionsyra
i 10 ml metylenklorid. Efter avslutad tillsättning omröres reak-
tionsblandningen vid rumstemperatur under 15 timmar. Man tillsätter
därefter 50 ml vatten och inställer pH-värdet på H,5 genom tillsätt-
ning av 1N natriumhydroxidlösning. Man avskiljer den organiska fasen,
torkar över natriumsulfat och avdunstar lösníngsmedlet ända till torr-
het. Härvid erhålles en oljig produkt, vilken kristalliserar (1,8
g). Produkten renas genom upplösning av 16,8 ml av en O,5M vatten-
lösning av natriumbikarbonat. Man tillsätter aktivt kol och filtre-
rar lösningen, varefter man utfäller den önskade produkten genom
7907994-3
ZÄ
tillsättning av 0,5 ml koncentrerad ättiksyra för inställning av
pH~värdet mellan 3 och 3,5. Fällningen avfiltreras och torkas under
kraftigt vakuum. Man erhåller härvid 1,3 g av ett fast ämne med en
smältpunkt av 62-6190.
(b) Framställning av aktiverade anti-DNP-antikroppar.
För att alkylera varje spår av tiolgrupper som skulle kunna
förekomma i den använda produkten blandar man 13 ml av en lösning
av anti~DNP-antikroppar (23,6 mg/ml) i en fosfatbuffert (0,1M, pH
= 1,0) med 1 ml av en lösning av N-etylmaleimid (1,29 mg/ml) i
TPE-buffert. Man omrör blandningen under 5 timmar vid rumstemperatur,
varefter den resulterande lösningen dialyseras kontinuerligt mot
TPE-buffert vid 500 under 15 timmar med en hastighet av 500 ml per
timme.
I Innehållet i dialyssäcken (12 ml med en koncentration av 21,U
mg/ml) blandas med 24 ml vatten innehållande 19,9 mg 1-etyl-3~(3-
dimetylaminopropyl)karbodiimid, 55,7 mg 3-(2-pyridyldisulfanyl)pro-
pionsyra och 14 mg 1-hydroxibensotriazol. Blandningen omröres under
16 timmar vid rumstemperatur och centrifugeras därefter vid 27 000
x g under 10 min. Lösningen dialyseras därefter kontinuerligt mot
TPE-buffert vid 5OC under 23 timmar med en hastighet av 500 ml per
timme. Man erhåller härvid BH ml av en lösning innehållande 7,2 mg
protein per ml. Genom spektrofotometrisk bestämning vidšüš nm av
den genom utbyte med reducerad glutation frigjorda pyridin-2-tionen
kan man konstatera, att de resulterande antikropparna uppbär fyra
aktiverande grupper per mol antikropp.
(c) Framställning av konjugat.
16 ml av en lösning av aktiverade antikroppar (framställd på
ovan beskrivet sätt) med en koncentration av 5,9 mg/ml blandas med
20 ml av en lösning av kedja A i TPE-buffert med en koncentration
av 2,8 mg/ml. Reaktionsblandningen får stå under ZH timmar vid
rumstemperatur i frånvaro av ljus. Blandningen centrlfugeras där-
efter» vid 27 ooo x g under 10 minnvia 1:00.
Genom bestämning av den vid reaktionen frigjorda pyridin-2-
tionen kan man konstatera, att 1,123'pmol kedja A har kopplats till
0,68 pmol antikroppar, dvs. i genomsnitt 1,76 ekvivalenter kedja A
per mol antikropp. _
Lösningen-dialyseras kontinuerligt mot TPE-buffert vid 500 un-
der 21 timmar med en hastighet av 720 ml per timme. ~Innehållet_i
dialyssäcken (BH ml) behandlas med 1 ml av en lösning av N-etyl-
' maleimid (12,5 mg/ml) under 5 timmar vid rumstemperatur och förvaras
7907994-3
25
därefter vid -2o°c. i g
Denna konjugatlösning fraktioneras på en kolonn av gel av
Séphadex G 200 på samma sätt som beskrivesi exempel 5.
Man erhåller härvid tre lösningar, nämligen en lösning c inne-
hållande konjugat med en genomsnittlig molekylvíkt av 300 000, en
lösning d innehållande konjugat med en molekylvikt av 190 000 och
en lösning e innehållande konjugat med en molekylvikt av 160 000.
Sammansättningen av konjugatet i de olika lösningarna anges i
nedanstående tabell.
pg kedja A kopplad till Mol kedja A/mol
antikroppen per ml lösning antikropp
lösning c 13 0,9
lösning d Ä8 1,0
lösning e - 5 2 0,2
Exempel 7. Framställning av ett konjugat utgående från rici-
nets kedja A och anti-DNP-antikroppar substituerade med en aktiverad
disulfidgrupp.
(a) 6-/É-(2-pyridyldisulfanyl)propionylamino7hexansyra
Denna syra framställes i två steg utgående från 3-(2-pyridyl-
disulfanyl)propionsyra utan rening av mellanprodukten.
°\
fs f* /
' ' _ 0
i l 0 on N\_ \ \g ___
\__N / II X/ à O
_ __ ~ _ / \ n
S S OH Ö __è N/ S _S _C"2C"2C __0 __
O/
ß
HZN -(cn2 ) Scoou L \ O 0
\_ \ || II O
---7v . _ _ , _ _ J A _ _
S S LHZCHZC NH CHZCHZCLZCHZCIIZ C I!
0,ü30 g 3-(2-pyridyldisulfanyl)propionsyra, framställd såsom
beskrives i exempel 6(a),löses i 3 ml pyridin. Den erhållna lös-
ningen kyles i ett isbad. Till denna lösning sättes 0,230 g pul-
verformig N-hydroxisuccinimid och därefter 0,Ä53 g pulverformig di-
cyklohexylkarbodiimid. Reaktionsblandningen omröres under 20 tim-
mar vid 400. Reaktionsblandningen filtreras därefter för avlägs-
nande av den bíldade fällningen av dicyklohexylkarbamid, och den
avfiltrerade fällningen tvättas med pyridin. Tvättlösningen fö-
renas med fíltratet, varefter pyridinen avdunstas under kraftigt
7907994-5
26
vakuum. Den erhållna återstoden upptages i etylacetat. Härvid
D bildas en ny fällning av dicyklohexylkarbamid, som avlägsnas genom
filtrering. Etylacetatet avdunstas under kraftigt vakuum, varefter
tvättningen med etylacetat upprepas ytterligare två gånger. Man
erhåller slutligen 0,610 g av den önskade estern.
Den erhållna produkten löses fullständigt i 5 ml tetrahydro-
furan. Till den erhållna lösningen sättes en lösning av 0,288 g
6-aminokapronsyra i 2,5 ml vatten. Trietylamin tillsättes i stökio-
metrisk mängd (0,222 g) i förhållande till mängden 6-aminokapron-
syra för att hålla pH-värdet vid 7,0. Reaktionen genomföres under
omrörning vid UOC under 20 timmar. Reaktionsblandningen indunstas
därefter till torrhet under kraftigt vakuum. återstoden upptages i
10 ml vatten. Den erhållna vattenlösningen surgöres till pH U,5
genom tillsättning av ättiksyra. Härvid bildas en fällning, vilken
avskiljes genom dekantering och sedan löses i etylacetat. _Den här-
vid erhållna lösningen torkas över magnesiumsulfat, varefter den
filtreras och indunstas till torrhet under kraftigt vakuum.
Man erhåller 0,600 g produkt, vilken renas genom fördelninge-
'kromatografi på vn kolonn av kiseldioxíd med användning av en
blandning av aceton, kloroform och ättiksyra i volymförhållandet
15:80:5._ Man använder samma betingelser som vid analys av produk-
ten genom tunnskiktskromatografi.
0,410 g av den erhållna produkten anbringas på en kolonn,
vilken har en innerdiameter av 2 cm och innehåller 160 ml silika-
gel (Merck nr 60; 0,062-0,25 mm) som har bragts i jämvikt med klo-
roform. Man genomför en diskontinuerlig gradienteluering med an-
vändning av metanol i kloroform. Den rena produkten elueras med
en blandning innehållande 2% metanol. Eluatet indunstas till torr-
het under kraftigt vakuum.
Den erhållna produkten, som är ljusgul och har pastaliknande
konsistens, identifieras med hjälp av NMR-spektrum.
(b) Framställning av aktiverade anti-DNP-antikroppar.
Till 9 ml av en lösning av anti-DNP-antikroppar i TPE-buffert
med en koncentration av 11,Ä mg/ml sätter man 9 ml av en blandning
av vatten och L-butanol i volymförhållandet 2:1 innehållande 5,3
mg 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid och 13,7 mg 6-13-
(2-pyridyldisulfanyl)propiony1aming7hexansyra. Man arbetar därefter
på samma sätt som beskrives i exempel 6.
7907994-3
27
En analys av de aktiverade antikropparna visar, att de innehål-
ler i genomsnitt 0,6 aktiverande grupper per mol antikropp.
Den sålunda erhållna lösningen av antikroppar koncentreras ge-
nom ultrafiltrering till en koncentration av 11,1 mg/ml.
(c) Framställning av konjugat.
H8,8 mg modifierade antikroppar omsättes med 35,6 mg kedja A,
som är löst i TPE-buffert i en koncentration av 7,9 mg/ml. Fram-
ställningen genomföres under de betingelser som beskrives i exempel
6. Den erhållna genomsnittliga kopplingsgraden är 0,5 kedjor A
per mol antikropp. Konjugatet renas genom filtrering på samma sätt
som beskrives i exempel 6.
Exempel 8. Framställning av ett konjugat utgående från ricí-
nets kedja A och ett fragment F(ab)'2 av anti-DNP-antikroppar.
(a) Framställning av fragment F(ab)'2 av anti-DNP-antikroppar.
Den i exempel H framställda lösningen av antikroppar dialyseras
mot acetatbuffert (120 mM, pH H,7). Till H5 ml av denna lösning
innehållande 500 mg antikroppar sättes 3 ml av en lösning av pepsin
(koncentration 10 mg/ml) i samma buffert (pepsín E.C. 3.Ä.1 från
gris; kristalliserat två gånger; 3200 mikroenheter per mg; SIGMA).
Man inkuberar blandningen under 20 timmar vid 3700. Hydrolysens
förlopp följes genom elektrofores i närvaro av natriumdodecylsulfat
13. Biol. Chem. ZUÄ, ÄHO6-HÄ12 (1969)_7, varvid man observerar för-
svinnandet av bandet vid 150 000 dalton motsvarande ohydrolyserad
antikropp. ^
Hydrolysen avbrytes genom inställning av reaktíonsmediets pH-
värde på 7,0 med hjälp av en 1N natriumhydroxidlösning. Lösningen
centrifugeras därefter och det olösliga ämnet avlägsnas. Den över-
stående vätskan införes på toppen av en kolonn, vilken har en inner-
diameter av 50 mm och innehåller 1800 ml Sephadex G 150, som har
bragts i jämvikt med fosfatbuffert (100 mM, pH 7,0).
Man eluerar med samma buffert. Man uppsamlar de två fraktioner
som ger den första toppen. Den första fraktionen (200 ml) innehål-
ler 70 mg av antikroppfragmentet F(ab)'2, och den andra fraktionen
(100 ml) innehåller 70 mg av en blandning av fragmentet F(ab)'2 och
ett förorenande fragment med en molekylvikt av 50 000 dalton. Den
andra toppen motsvarar proteinfragment med en genomsnittlig molekyl-
vikt av 10 000 dalton; motsvarande eluatfraktioner bortkastas.
Den första toppens första eluatfraktion innehållande rent frag-
ment F(ab)'2 koncentreras genom ultrafíltrering på samma sätt som
7907994-3
28
beskrivits i exempel 1 ända till en koncentration av 16 mg/ml, var-
efter den erhållna produkten förvaras vid -2000.
Det erhållna fragmentet F(ab)'à uppvisar följande egenskaper.
Molekylvikt: 95 000 dalton (bestämd med hjälp av ett gel av
sepnadex G 150). 0
Isoelektrisk punkt: Mellan pH 7,? och 8,8 (bestämd genom iso-
elektrofokalisering på LKB-plattor).
(b) Framställning av aktiverat fragment F(ab)',.
Till 15 ml av en lösning av fragmentet F(ab)'2 (koncentration
15,6 mg/ml) sättes 15,3 ml av en blandning av vatten och t-butanol
i volymförhâllandet 2:1 innehållande 17,3 mg 1-etyl-3-(3-dimetyl-
aminopropyl)karbodiimid och 50,H mg 3-(2-pyridyldisulfanyl)propion-
syra. Den erhållna blandningen inkubcras under 90 timmar vid 30CC.
Å Lösningen dialyseras därefter kontinuerligt mot TPE-buffert vid H00
under 23 timmar med en hastighet av 500 ml per timme. Spektrofoto-
metrisk bestämning vid 343 nm av den genom utbyte med reducerat
glutation frigjorda pyridin-2-tionen visar att aktiveringen av frag-
mentet F(ab)'2 har lett till en genomsnittlig substitutionsgrad av
1,5 aktivatorgrupper per mol F(ab)'2.
Den erhållna aktiverade lösningen av fragmentet F(ab)'2 kon-
centreras genom ultrafiltrering till en koncentration av 10 mg/ml.
(c) Framställning av konjugat.
Till 13,8 ml av den ovan erhållna lösningen av aktiverat frag-
ment F(ab)'2 (koncentration 10 mg/ml) sättes 13,8 ml av en lösning
av rícinets kedja A (koncentration 8 mg/ml) i TPE-buffert.
Blandningen inkuberas vid rumstemperatur under 2U timmar i
kvävgasatmosfär och i frånvaro av ljus. Lösningen centrifugeras
därefter vid 27 000 x g vid HOC under 10 min, och den överstående
vätskan återvinnes. Bestämning av den under reaktionen frigjorda
pyridin-2-tionen visar att den genomsnittliga kopplingsgraden är
1,2 ekvivalenter kedja A per mol F(ab)'2.
Den erhållna lösningen införes på toppen av en kolonn som har
en innerdiameter av 50 mm och innehåller 1730 ml Sephadex@ä(}200.
Eluering genomföres med TPE-buffert. Man uppsamlar eluatfraktioner
7 med_volymen 8,U ml, och dessa eluatfraktioner analyseras på samma
sätt som beskrivits i exempel 5 och 6. Konjugatprodukten elueras
i form av en topp. De fraktioner som bildar denna topp förenas till
tre olika lösningar, nämligen lösning f motsvarande toppens front,
lösning g motsvarande toppens centrala del och lösning h motsvarande
toppens svans.
7907994-3
29
Lösningen g analyseras för bestämnrg av den hämmande verkan på
proteosyntesen (test 1) och för bestämning av proteinsammansättning-
en. Följande resultat erhålles.
pg kedja A kopplad till Ekvivalenter kedja A
F(ab)'2 per ml lösning per mol F(ab)'2
lösning g 148 1,4
(d) Koncentrering av konjugatet.
Konjugatet koncentreras först genom ultrafiltrering. 255 ml
av konjugatlösningen g (innehållande 1H8 pg kedja A per ml) koncent-
reras hårvid till en koncentration av 581 pg/ml. Lösningen utspädes
sedan med en tiofaldig volym destillerat vatten för sänkning av me-
diets jonstyrka. _
Den erhållna lösningen (H00 ml innehållande 38 pg kedja A per
mol) införes på toppen av en kolonn, vilken har en innerdiameter av
9 mm och innehåller 5,7 ml C.M. Sepharose , som har bragts i jäm-
vikt med en fosfatbuffert (10 mM, pH 6,5) innehållande 1 mM dinat-
riumsalt av etylendiaminotetraättiksyra.
Lösningen införes på kolonnen med en hastighet av 80 ml per
timme. Under dessa betingelser bindes hela konjugatmängden på
ikolonnen. Efter avslutat införande av konjugatlösningen införes
H,5 ml av samma buffert, varefter konjugatet elueras med PTE-buf-
fert med samma hastighet.
Konjugatet elueras i en enda topp. De eluatfraktioner, som
motsvarar toppens svans, innehåller föga proteiner och bortkastas
därför. De övriga fraktionerna förenas, och koncentrationen av
kedjan A bestämmas.
Analjuserx visar, att koncentreringen på C.M. Sepharose®har
'ökat koncentrationen av kedjan A i konjugatet till 3,6 mg/ml. De
fraktioner som bildar lösningen med koncentrationen 5,6 mg/ml inne-
håller totalt 76% av den på kolonnen avsatta konjugatmängden.
Exempel 9. Framställning av ett konjugat utgående från rioi-
nets kedja A och antikroppar IgM anti-Thy 1.2.
(a) Framställning av antikroppar IgM anti-Thy 1.2.
Rent IgM framställes utgående från'askitesvätska från Olac Ltd
(Thy-1.2 F7 D5 monoklonal IgM cytotoxisk antikropp).
Till 50 ml askitesvätska innehållande antikroppar sättas 15 g
pulverformigt ammoniumsulfat. Efter upplösning inkuberas blandning-
en under 1 timme vid 400, varefter det hela centrifugeras under 20
'(motsvarar toppens front fram till toppens
790799443
30
min vid 17 000 X g.
Den vid centrifugeringen erhållna överstående vätskan bortkastau.
Bottensatsen löses i 20 ml fosfatbuffert (100 mM, pH 7,0), varpå den
resulterande lösningen dialyseras kontinuerligt mot 10 l av samma
buffert. Den härvid erhållna lösningen införas på toppen av en ko-
lnnn, vilken har en ínnordiamctvr av 50 mm och Innehåller 1800 ml
Sepharose 6B, som har bragts i jämvikt med fosfatbuffert (100
mn, pH 7,0).
första toppen motsvarar aggregat av IgM.
Eluering genomföres med samma buffert. Den erhållna
Man uppsamlar de två
eluatfraktioner som ger den andra toppen. Den första fraktionen
spets) innehåller rent
en blandning av IgM och
av ca 660 000 dalton.
ammoniumsulfat, och den
IgM, medan den andra fraktionen innehåller
ett förorenande protein med en molekylvikt
Denna andra fraktion behandlas på nytt med
erhållna fällningen avskiljes genom centrifugering och löses i fos-
fatbuffert (100 mM, pH 7,0). Den härvid erhållna lösningen införes
på toppen av den ovan beskrivna Sepharose-kolonnen, som har tvättats
på lämpligt sätt efter den första separationsprocessen. Man eluerar
med fosfatbuffcrt (100 mM, pH 7,0) och erhåller liksom vid den
första separationsprocessen två toppar. Den andra toppen motsvarar
Vid var och en av de båda separationerna med användning
av Sepharose 6B har man sålunda erhållit en fraktion innehållande
rent IgM. Dessa båda fraktioner förenas och behandlas med ammonium-
sulfat vid H00 till en slutlig koncentration av 300 mg/ml. Bland-
ningen centrifugeras under 20 min vid 17 000 X g. Den erhållna bot-
tensatsen upptages i fosfatbuffert (100 mM, pH 7,U) innehållande H00
rent IgM.
mM natriumklorid.
Man erhåller slutligen 8 ml av en lösning innehållande 6,U mg
Elektroforetisk analys i närvaro av natriumdode-
Det erhåll-
rent IgM per mol.
cylsulfat har använts för att identifiera fraktionerna.
na rena IgM gor vid analysen två mycket närbelägna band med samma
intensitet, motsvarande en molekylvikt mycket nära 900 000 dalton.
(b) Framstållning av aktiverade antikroppar Anti-Thy 1.2.
_Till 7,6 ml av en IgM-lösning med koncentrationen 7,0 mg/ml
såttes 0,Ä6 ml av en blandning av vatten och t-butanol i volymför-
hållandet 1:5 innehållande 2,9 mg 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-
karbodiimid och 7,7 mg 3-(2-pyridyldisulfanyl)propionsyra. Reak-
tionsblandningen inkuberas vid 3000 under 20 timmar. Den resulteran-
de lösningen dialyseras kontinuerligt mot en fosfatbuffert (100 mM,
7907994-s
Bl
pH ?,H) innehållande Ä00 mM natriumklorid och 1 mM dinatriumsalt
av etylendiaminotetraättiksyra. Dialysen genomföras under 23 tim-
mar vid NCC med en hastighet av 500 ml per timme. Lösningen centri-
fugeras därefter vid 27 000 x g vid 400 under 10 min, och den över-
stâende vätskan utvinnes. En spektrofotometrisk bestämning vid BUB
nm avden genom utbyte med reducerat glutation frigjorda pyridin-2-
tionen visar att aktiveríngen av antikropparna har lett till en
genomsnittlig substitutionsgrad av 13 aktivatorgrupper per mol IgM.
(c) Framställning av konjugat.
En lösning av kedja A, erhållen på det sätt som beskrives i
exempel R, diulyuvras kontinuerligt mot un fosfathuffert (100 mM,
pH 7,H) innehållande UOO mM natriumklorid och 1 mM dínatriumsalt av
etylendiaminotetraättiksyra. Dialysen genomförs med en hastighet
av 500 ml per timme vid H00 under 20 timmar.
Till 6,8 ml av den ovan erhållna lösningen av aktiverat Igm
sättes 3,9 ml dialyserad lösning av kedja A (koncentration 7,4 mg/
ml). Blandningen inkuberas under 24 timmar vid rumstemperatur i
kvävgasatmosfär och i frånvaro av ljus. Bestämning av den under
reaktionen frigjorda pyridin-2-tionen visar att den genomsnittliga
kopplingsgraden är 9,7 ekvivalenter kedja A per mo] IgM.
Reaktionsblandningen införes på toppen av en kolonn, vilken har
en innerdiameter av 50 mm och innehåller 1727 ml Sepharose 6B,
som har bragts i jämvikt med den ovan angivna bufferten. Eluering
genomföres med samma buffert. Man uppsamlar fraktioner med en
volym av j,7 ml, och fraktionerna analyseras på samma sätt som be-
skrives i exempel 5 och 6. Konjugatprodukten ger vid elueringen
två toppar. Den första toppen motsvarar ett konjugat, som har
högre genomsnittlig molekylvikt än IgM, medan den andra toppen
motsvarar ett konjugat, vars genomsnittliga molekylvikt är ungefär
lika med molekylvikten för IgM. Man behåller de fraktioner (lös-
ning i) som ger den centrala delen av den andra toppen.
Sammansättningen av konjugatlösningen i anges nedan.
min
g kedja A kopplad Ekvivalenter kedja
till IgM per ml lösning A per mol IgM
Lösning i 23,7 3,2
Konjugaten enligt uppfinningen samt de föreningar som användes
vid framsiällning av dessa konjugat har undersökts vad beträffar
de biologiska egenskaperna, särskilt verkan mot kancer. Nedan be-
skrives de olika försöksmetoder som har använts.
'-det av
79Û799W4-B
32
Test in vitro.
(1) Hämning av proteosyntesen
Den grundläggande biologiska egenskapen hos ricinets kedja A
är att denna kedja hämmar den mikrosomala proteosyntesen genom
förändring av underenheten ribosomal 60S.
(a) celifri modell (test 1) i
Vid undersökning av proteosyntesen i cellfritt system användes
subcellulära fraktioner av råttlever, försedda med lämpliga till-
satser och i stånd att uppta 140-fenylalanin i närvaro av en konst-
gjord budbärar-RNA, nämligen polyuridylsyra.
Framställningen av de subcellulära fraktionerna och mätningen
av införandet av IÄC-fenylalanin genomföres enligt en modifikation
, -av den metod som beskrives i Biochemica Biophysica Acta 312, 608-
615, (1973), varvid man använder både en mikrosomfraktion och en
cytosolfraktion från râttleverceller. Provet innehållande kedjan
A införes i form av en på lämpligt sätt utspädd lösning i en THIS-
HCl-buffert (50 mM, pH = 7,6) innehållande 0,2% 2-merkaptoetanol
och 15 pg oxserumalbumin per ml.
Med hjälp av radioaktivitetsräkning beräknar man för varje
reaktionsmedium innehållande ricinets kedja A den procentuella
hämningen av införandet av 1ëC-fenylalanin i proteinerna, varvid
man såsom jämförelsemedium använder ett medium utan inhibitor.
Med hjälp av dessa Uörsöksrcsultat kan man beräkna den kon-
centration av kedjan A í reaktionsmediet som ger en 50%-ig hämning
av införandet av 1uC-fenylalanin i proteínerna. Denna hämmande
koncentration (CI50) gör det möjligt att karakterisera varje pre-
parat innehållande kedjan_A.
Denna mntnd gör det även möjligt att bestämma halten av kod-
jan A i ett prov. Man jämför härvid den procentuella hämning som
åstadkommas av detta prov med en kurva över den procentuella häm-
níngen som funktion av koncentrationen av kedja A, vilken kurva
har uppritats på basis av hämningsförsök genomförda under samma
betingelser med användning av lösningar av ren kedja A med kända
koncentrationer. 7 7
(b) Cellulär modell (test 2)
Detta test mäter de provade föreningarnas inverkan på införan-
1uC-leucin i odlade kancerceller. > Q
De använda cellerna är Hela-celler, vilka härrör från en biop-
si av humant cervikaladenokarcinom och är odlade i kontinuerlig
cellinjeföljd i encellsskikt.
7907994-3
35
Dessa cellcr inkuberas i närvaro av preparat av provsubstan-
ser, och efter avslutad inkubering mätes graden av införande av
1uC-leucin. Denna mätning genomföras enligt en teknik liknande den
som beskrives i Journal of Biological Chemistry êE2'(11), 5557-
3562 (197H), varvid man använder spårämnet ÃHC-leucin för bestäm-
ning av graden av proteosyntes. Bestämningen av den införda radio-
aktiviteten genomföres på hela celler isolerade genom filtrering.
På basis av dessa mätresultat kan man rita kurvor över effek-
ten som funktion av dosen. Längs abskissan anges härvid provsub-
stansens koncentration, och längs ordinatan anges införandet av
1uC-leucin i procent av införandet i jämförelseceller i frånvaro
av provsubstans.
För varje provsubstans kan man sålunda bestämma den koncentra-
tion som hämmar införandet av 1uC-leucin med 50%; denna hämmande
koncentration 50% betecknas CI50. Man har visat, att mätningen av
införandet av 1uC-leucin i hela celler ger CI50-värden¿ vilka är
identiska med de värden som erhålles med den klassiska metoden för
mätning av profeosyntes.
När man önskar studera konjugat framställda av anti-DNP-anti-
kroppar, är det nödvändigt att Hela-cellerna kan igenkännas av des-
sa antikroppar och sålunda uppbära hapteniska grupper på ytan.
Hela-cellerna omvandlas sålunda till mälceller genom märkning med
ett lämpligt hapten. Man har valt att såsom hapten använda gruppen
2,H,6,-trinitrofenyl eller TNP. Fixeringen av TNF-grupperna på
Hela-cellerna ästadkommes genom inverkan av 2,H,6-trinitrobensen-
sulfonat (TNBS) enligt en modifiering av den metod som beskrives
i Biochimica Biophysica Acta êââ, 79-90 (1972) och Journal of
Immunology lll, 930-937, (1973).
Modifieringen av denna metod består huvudsakligen i ett annat
val av reaktíonsparametrar. Reaktionen genomföras sålunda vid en
temperatur av ÄOC, och reaktionen avbrytas efter 15 sek med ett
överskott av lysin.
Märkningssubstansen TNBS har valts av följande skäl. TNBS
har låg giftighet gentemot Hela-celler; korsreaktionen mellan DNP
och TNP är kraftig; de märkta cellerna och de omärkta cellerna ger
ungefär samma införande av 1uC-leucin.
Koncentrationen av TNBS i reaktionsmediet (10 mg/ml) medför
att man på varje cell fixerar 7 ' 107 haptengrupper tillgängliga
för antikropporna. Associationskonstanten för bindningen mellan
anti-DNP-antikropparna och haptengrupperna är 1,2 - 107.
7907994-5
3”
För konjugatet med anti-Thy 1.2-specifik verkan användes cel-
ler frän cellinjen WEHI-7 (lymfom från Balb/C-möss), som kan erhål-
las från Salk Institut, San Diego, Californíen, USA. Dessa celler
behöver icke märkas, ty de uppbär naturligen antigenet Thy 1.2 på
ytan. lnkuberingen med konjugatet och mätningen av proteosyntes-
- graden genomföres på samma sätt som ovan har beskrivits.
(2) Hemagglutinering
Vid hemagglutineringstestet [Üournal of Biological Chemistry
2ü9, 803 (197H)7 jämföres olika provpreparats förmåga att bindas
till membranet på humana röda blodkroppar (blodgrupp O, Rh-negativ).
Detta test kan genomföras direkt (test 3) genom att provsub-
stansen bringas i kontakt med de röda blodkropparna, varvid man
beroende på dosen av provsubstansen erhåller ett negativt eller
ett positivt gensvar.
Testet kan även genomföras indirekt (test 4). Efter det di-
rekta testet genomförs i detta fall en sensibilisering av den på
blodkropparna eventuellt fixerade provsubstansen genom att man
till blodkropparna (avskilda från reaktionsmediet genom dekantering)
sätter ett immunoserum innehållande antikroppar, vilka kan känna
igen provsubstansen och vars hemagglutinerande~verkan har elimine-
rats genom absorption på röda blodkroppar av samma blodgrupp.
Test in vivo *
(1) Akut giftighet (test 5)
Den akuta giftigheten bestämmes genom att en grupp av försöks-
djur ges intraperitoneala eller intravenösa injektioner av prov-
föreningen i isoton lösning. Försöksdjuren iakttages under 7 dygn,
och man antecknar dödligheten för varje dos av provföreningen. Man
bestämmer därefter den letala dosen 50% (DL50).
(2) Konjugatens verkan på utvecklingen av kancerceller
Man studerar provsubstansers inverkan på utbildningen av fasta
tumörer härrörande från injicerade kanceroeller.
Såsom försöksdjur användes s.k. nakna möss ("naket/naket"-
kongeniska möss från Bomholtgaard, Danmark), vilka är kända för att
ioke bortstöta allogena eller xenogena ympämnen. Dessa möss ges
injektioner av Hela-celler uppbärande haptenet TNP, och samtidigt
eller senare ges injektioner av den provade föreningen.
Olika typer av försök har genomförts.
(a) Test 6. Hela-TNP-cellerna förinkuberas med konjugatet,
varefter försöksdjuren ges en subkutan injektion. Man bestämmer
sedan storleken på de eventuellt utvecklade tumörerna genom mätning
7907994-5
35
av tvâ mot varandra vinkelräta diametrar på tumören enligt den me-
tod som beskrives i Annales d'Immunologie (Institut Pasteur), l§E_g,
567-572 (1373)-
(b) Test 7. Hela-TNP-cellerna injiceras intraperitonealt,
varefter provföreningen också injiceras íntraperitonealt. Efter
avslutat försök dödas Försöksdjuren, och tumörernas storlek bestäm-
mes genom vägning av de uttagna tumörerna.
De ovan beskrivna försöken in vitro och in vivo har använts
för undersökning av egenskaperna hos konjugaten enligt uppfinningen
samt hos ämnen som användes för framställning av dessa konjugat.
Ricín och dess kedja A.
Ricin och dess kedja A har underkastats olika test in vitro
Samma test har även
samt toxicitetstest in vivo. éšmomförts med
kedja A renad genom koncentrering på CM Sepharose 5 denna renade
kedja A kallas kedja (A)p. De erhållna resultaten är sammanställda
i nedanstående tabell I.
7907994-3
36
anno mmmë Hflfin mnficmmfl noummfl HE m.o >m wcflmmofiwcfl fimmQopflnwmmhv:H An.
.Am nflom uxfl>flwømEv mocmhm hm>flm wmfifimso Gmäm
møGmfiwnQm3.uflHmdP:m>w .hwfiflmonmflmm vuë muflfiamshm han u
.mza uwcwumms
mpfidmmn mmmon Am
Oowfl am: mN.o »=fi@\w1 .Omg An m »mms
oo: w|Ofl.m«fl m«ofl.w.m fi\fl0a I »www
.coflummpsmo
_ _ ICOM wfivqmhmßfiß
ooom m«ofi.z.w w|ofi.N.~ |=Hwwmswn mpwcflz m »mms
. . . . . . n ._ _ _ . ._ ,. . . . Jf
Omfißfi ommfi w|oH @.w@ w|Ofi¶m fifilcflflfi H\Hoe hf Ho ^« N »mms
ímflao @%-ofi.m.fi_. @fl-O«.nflfi @fl|Qfi.w_ H\H0e nmmfio fi ßmwß
Q _ _
^
wwcmflflmß mfinmflfiwz Q ,
|fi@@m»@»fi>flpz< «H@@m»@»H>fl»x< ^fl»x< pmwe
H HHwndB
= .- m. .fl-.q-w... _- .-..-..........~.. . ._ -... . ....,. -..r .........-. ...-.-.-.........
7907994-3
37
Av försöksresultaten framgår att ricin har en kraftigt häm-
mande verkan på proteosyntesen såväl i cellfria system som i cellu-
lära system. I cellfri miljö ger även kedjan A en kraftig hämning
av proteosyntesen, medan kedjan A däremot icke kan utöva sin häm-
mande verkan i cellulär miljö, när den är separerad från kedjan B.
Samma fenomen observeras i hemagglutineringsförsökon och gif-
tighetsförsöket, där ricinet är mycket mera aktivt än kedjan A.
Resultaten visar även, att koncentreringen på C.M. Sepharose Ga
gör det möjligt att ytterligare minska den icke-specifika giftig-
heten av kedjan A genom en avsevärd ökning av renheten. Den så-
lunda framställda renade kedjan A är fri från icke specifik gif-
tighet gentemot ett cellulärt system. Detta framgår tydligt av
att aktivitetaförhällandet mellan ricin och kedjan (A)p vid detta
testär större än 10 000.
Försök med kraftig absorption av kedjan A har genomförts genom
att successivt ökande överskott av Hela-celler och röda blodkrop-
par har bragts i kontakt med kedjan_A, varefter man har mätt den
cellulära giftigheten av kedjan A i den överstående absorptions-
vätskan (test 2). Härvid har följande resultat erhållits. Den
cellulära giftigheten av en lösning av kedjan A (icke koncentrerad
pä CM Sepharose ) minskas genom abzorptionen och bringa: sålunda
i nivå med giftigheten av en lösning av kedjan A, som har koncent-
rerats på CM Sepharose och icke absorberats. Giftigheten av
en lösning av kedjan A, koncentrerad på CM Sepharose QQ ndnskar
däremot icke vid absorptionsföruöken, vilket bekräftar att kedjan
(A) fullständigt saknar affinitet till cellernas plasmamembran
och följaktligen bekräftar den erhållna produktens ytterst höga
renhet.
Anti-DNP-antikroppar
När man undersöker anti-DNP-antikropparnas hämmande verkan på
proteosyntesen 1 ccllulära system, erhålles ingen verkan upp till
den högsta provade koncentrationen, dvs. 10~ M.
Vid undersökning av den akuta giftigheten kan dessutom icke
någon giftighet påvisas upp till den högsta provade dosen, dvs.
1,6 mg antikroppar per djur.
Konjugat
En första försöksserie har genomförts för bestämning av egen-
skaperna hos dels kedjan A och dels antikroppen i de framställda
konj uzjgatori .
-- - -- V . _.........-.. _ w... ...,-.-.....~...~V
7907994-s
38
Genom ett radioimmunologiskt försök (Handbook of Experimental
lmmunology, vol. 1, kap. 15, p. 1-18; D.M. Weir, 2:a uppl. 1973)
-har man kunnat konstatera, att anti-DNP-antikropparna i konjugatet
*har samma aktivitet som de fria antikropparna.
Vad beträffar kedjan A i konjugatet har man bestämt den häm-
mande verkan på proteosyntesen i cellfria system dels med använd-
ning av ett konjugatprov (exempel U, lösning a) och dels med ett
annat, identiskt konjugatprov, som först har inkuberats under 50
min med en 0,2%-ig lösning av 2-merkaptoetanol för spjälkning av
disulfidbryggan.
Man har erhållit ett CI50-värde av 59,Ä ng/ml för kedjan A
i det första fallet och ett CI50-värde av 9,2 ng/ml för kedjan A
i det andra fallet, dvs. ett aktivitetsförhållande av 1:6,6.
7 _Detta visar att huvuddelen av den hämmande verkan på proteo-
syntesen visar sig först sedan konjugatet har förbehandlats med
2-merkaptoetanol för spjälkning av disulfidbindningen.
Det faktum att en hämmande verkan kan påvisas även utan be-
handling med 2-merkaptoetanol motsäger icke denna slutsats, då
det använda analysmediet innehåller tioler, vilka delvis bidrager
till frigörande av kedjan A från antikropparna.
7 I konjugaten enligt uppfinningen bibehåller sålunda de båda
beståndsdelarna sina ursprungliga egenskaper.
En annan försöksserie har genomförts för bestämning av konju-
gatens terapeutiska verkan.
(a) Verkan i cellulärt system (test 2)
I ritningsfigurerna 1 och 2 visas kurvor över det procentuella
införandet av 140-leucin i Hela-cellerna märkta med TNP som funk-
tion av den använda konjugatdosen (uttryckt såsom koncentration
av kedjan A i nM). Det använda konjugatet är det konjugat av
anti-DNP-antikroppar och kedja A som beskrivas i exemplen 5 och 6.
De med de märkta Hela-cellerna erhållna resultaten visas med hel-
dragna linjer, under det att jämförande försöksresultat erhållna
med omärkta Hela-celler visas med streckade linjer.
I fíg. 1 anges resultat erhållna med konjugatet enligt exempel
5 (lösning b), och i fig. 2 anges resultat erhållna med konjugatet
enligt exempel 6 (lösning e). Av kurvorna framgår, att en 50%-ig
hämning av den cellulära proteosyntesen uppnås vid mycket lägre
konjugatkoncentrationer vid prov med TNP-märkta Hela-celler (CIEO
= 11 x 10-9 M för lösning b och C150 = 7,5 x 10-9 M för lösningen
79o7994fs
39
e) än vid användning av omärkta Hela-celler (CI50 = 130 x 10-9 M
för lösningen b och CI50 = 1000 x 10-9 M för lösningen e).
Om man till ínkuberingsmediet sätter DNP-serumalbumin från
nötkreatur (1 mg/ml), upphäves konjugatets hämmande verkan full-
ständigt.
I fig. 3 visas resultat erhållna med ett konjugat bildat av
ricinets kedja A och fragment F(ab)'2 av anti-DNP-IgG. Koordinater-
na är desamma som i figurerna 1 och 2. Följande resultat kan ut-
läsas i fig. 3. För ricin (kurva I) är CI50-värdet (räknat såsom
kedja A) = 5,5 x 10-11 M. För kedjan A (kurva Il) är CI50-värdet
= 9 X 10-7 M. Vid användning av omärkta Hela-celler (kurva III)
kan konjugatets CI50-värde icke bestämmas; detta värde är större
än 10-5 M. Vid användning av TNP-märkta Hela-celler (kurva IV)
är konjugatets CIBO-värde = 4,5 x 10-9 M.
Fig. Ä illustrerar hämningen av införandet av 1ÄC-leucin i
WEHI-7-celler med användning av ett konjugat bildat av kedja A och
anti-Thy 1.2.-IgM. Koordinaterna är desamma som i figurerna 1
och 2. Följande resultat kan utläsas ur fig. H. För ricin (kur-
va I) är CI5O-värdet (såsom kedja A) = 2,Ä x 10-11 M. För kedja
A (kurva II) är CISO-värdet = 8,1 x 10_7 M. För konjugatet (kurva
III) är CI50-värdet (såsom kedja A) = 5,2 x 10-11 M.
Det konjugat som har framställts utgående från ricinets kedja
A och anti-DNP-IgG med användning av 6-¿É-(2-pyridyldisulfanyl)-
propionylamin97hexansyra såsom aktivator för IgG har dessutom samma
giftighet och samma specifika verkan som det i exempel 6 framställ-
da konjugatet.
Man kan draga den slutsatsen, att de enligt uppfinningen fram-
ställda konjugaten har en specifik verkan. Genom administrering
av en lämpligt vald dos av konjugatet är det möjligt att påverka
endast de celler som uppbär det antigen som motsvarar de använda
antikropparna.
Ästadkommandet av en disulfidbrygga mellan ricinets kedja A
och en antikropp specifik för ett antigen som naturligen uppbäres
av kancerceller gör det möjligt att mycket effektivt förstöra kan-
cercellerna med en mycket specifik verkan.
(b) Försök in vivo
(A) Försök har genomförts med konjugat av kedja A och anti-
DNP-antikroppar (lösningarna c och d i exempel 6).
(1) Det ovan beskrivna test 6 har genomförts med användning
av Hela-TNP-celler i en koncentration av 105 celler per ml. Geller-
i790799i4-3
H0
na har inkuberata under 90 min vid 3700 tillsammans med konjugat
(lösning c) i en koncentration av 10_8 M (uttryckt såsom kedja A).
Efter centršfugering (700 X g, 10 min) suspenderas bottensat-
sen i TBS Åbuffrad isoton lösning fri från kalcium och magnesium;
J. Exp. Med. 22, 167 (195ü)7.i en koncentration av 107 celler per
ml. Försöksdjur med en ålder av.1U veckor får subkutant mottaga
0,1 ml av den erhållna suspensionen, dvs. 106 celler.
En grupp av jämförelsedjur får mottaga celler, som icke har
inkuberats med konjugatet.
Man íakttager försöksdjuren varje dygn och mäter tumörernas
yta. Såsom utbildad betecknas varje tumör, vars yta är större
än eller lika med 10 mmg (försökets känslighetsgräns).
I fig. 5 visas den procentuella andelen tumörer med en yta
större än eller lika med 10 mm? som funktion av tiden från inji-
ceringstillfället. Den heldragna kurvan anger resultat erhållna
med Hela-celler, den streckade kurvan anger resultat erhållna med
TNF-märkta Hela-celler, och den prickstreckade kurvan anger resul-
tat erhållna med TNP-märkta Hela-celler förinkuberade med konjugat.
Av försöksresultaten framgår, att konjugatet kraftigt hämmar tu-
mörernas utveckling.
Observationer fram till det 50:de dygnet visar, att tumörer
har utbildats i 80% av fallen vid användning av Hela-celler som
icke har behandlats med konjugat och i 70% av fallen vid användning
av TNP-märkta Hela-celler som icke har behandlats med konjugat.
Motsvarande siffra är endast 20% vid användning av TNP-märkta
Hela-celler förinkuberade med konjugat.
Skillnaden är statistiskt signifikant med ett konfidensinter-
-vall av 5%.
7 (2) Man använder.test 7 och ger försöksdjur meden ålder av
10 veckor intraperitoneala injektioner av 2 X 106 Hela-TNP-celler
suspenderade i 0,1 ml av ett odlingsmedium.
Man injicerar sedan 0,1 ml konjugat innehållande 56 pg kedja
A (lösning d koncentrerad 7,5 gånger genom ultrafiltrering).
En grupp av jämförelsedjur får mottaga samma injektion av
Hela-TNP-celler men behandlas icke med konjugat.
7 25 dygn efter försökets början avlivas djuren och tumörerna
uttages och väges. I
I fig. 6 visas de erhållna resultaten, varvid resultaten-
med jämförelsegruppen visas till vänster och resultaten med för-
söksgruppen till höger. I diagrammet anges tiologaritmen för
7907994-3 r
H1
tumörvikten i mg. Detektionströskeln är 5 mg, vilket motsvarar
en tiologaritm av 0,7.
Av resultaten i fig. 6 framgår, att i jämförelsegruppen har
tumörer utbildats i lü fall av 15 (1H punkter ovanför detektions-
tröskeln och endast 1 punkt nedanför). När det gäller de med
konjugat behandlade djuren har däremot tumörer utbildats i endast
ett fall av 15 (endast en punkt ovanför detektionströskeln).
(B) Försök med konjugat av kedja A och antikroppar IgM anti-
Thy 1.2 (lösning i i exempel 9).
De använda kancercellerna härrör från cellinjen WEHI 22.1
(från Salk Institut, San Diego, Californien, USA) och har erhål-
lits från ett lymfom hos Balb/C-möss. Balb/C-möss från Bomholt-
gaard, Danmark, ges injektioner med dessa celler. Dessa försöks-
djur hålles alltifrån födelsen och under hela försöket i en zon
fri från specifika patogena organismer (SPF).
Cellerna WEHI 22.1 hâlles i kontinuerlig odling och uppsamlas
under det tredje dygnet efter omympning av kulturen. Cellerna
tvättas sedan genom centrifugering och suspenderas i en isoton
fosfatbuffert (PBS) i en koncentration av 12 x 10 celler per ml.
0,2 ml av den resulterande cellsuspensionen injiceras intra-
peritonealt till varje mus. Mössen har i förväg fördelats god-
tyckligt i burarna, och varje mus ges ett individuellt märke i
tassen.
Hos de möss som icke behandlas med konjugat följes den intra-
peritoneala injektionen av kancercellerna av en utveckling av cel-
lerna till tumörer fördelade i bukhinnan och askitesbildning.
Utvecklingen av cellerna åtföljes av en ökning av kroppsvikten.
Nämnda askites påvisas genom att man mäter ökningen av bukvolymen.
En timme efter injektionen av cellerna ges försöksdjuren en
intraperitoneal injektion av 1 ml konjugatlösning (lösning i;
23,7 hg kedja A per mol), som i förväg har dialyserats grundligt
mot PBS-buffert och därefter steriliserats genom filtrering. Dju-
ren i jämförelsegruppen ges endast 1 ml PBS-buffert fri från kon-
jugat.
Sju dygn efter injektionen av cellerna ges försöksdjuren en
andra injektion av konjugat under samma betingelser, och jämförel-
sedjuren ges en andra injektion av PBS-buffert.
De erhållna försöksresultaten visas grafiskt i figurerna 7
och 8. I fig. 7 visas tidsförloppet för uppkomsten av askites
hos de med konjugat behandlade djuren respektive de obehandlade
7907994-5
42
jämförelsedjuren, och i fig. 8 visas ökningen av kroppsvikten hos
de behandlade djuren respektive de obehandlade jämförelsedjuren.
Ökningen av kroppsvikten anges i g och beräknas på basis av samma
djurs kroppsvikt tre dygn före injektionen av cellerna.
I fig. 7 anger ordinatan den procentuella andel försöksdjur
som uppvisar askites, medan abskissan anger antalet dygn efter
injektionen av cellerna WEHI 22.1. Den beldragna kurvan betecknar
behandlade försöksdjur, och den streckade kurvan representerar
obehandlade jämförelsedjur. Resultaten visar, att askitesbildning-
en hämmas hos de djur som har behandlats med konjugat. Denna häm-
ning visar sig genom en tidsförskjutning i uppträdandet av askites.
I fig. 8 anger ordínatan försöksdjurens genomsnittliga vikt-
ökning i g, och abskissan anger antalet dygn efter injektionen av
kancercellerna. Den heldragna kurvan representerar behandlade
försöksdjur, och den streckade kurvan representerar obehandlade
jämförelsedjur. Av resultaten framgår, att ökningen av kroppsvik-
ten hämmas genom behandlingen med konjugat.
Försöksresultaten har underkastats statistisk analys. Konju-
gatets hämning av askitesbildningen är signifikant med ett konfi-
densíntervall av 1% (test x 2), och konjugatetn hämning av vikt-
ökningen är signifikant med ett konfidensíntervall av 5% (jämförel-
se mellan lutningen hos de med hjälp av kurvorna dragna räta lin-
jerna).
Ovanstående försök in vivo visar att ett konjugat bildat av
ricinets kedja A och IgM anti-Thy 1.2 är verksamt mot kancer. Den-
na verkan visar sig genom en hämning av utvecklingen av kancercel-
ler (WEHI 22,1) inympade hos möss Dalb/C.
De enligt uppfinningen framställda konjugaten uppvisar en spe-
cifik verkan, vilket gör det möjligt att använda konjugaten inom
humanterapin för behandling av kancer. Konjugaten framställes
i sådan form att de kan injiceras, och de kan användas antingen
ensamma eller i kombination med andra medel för behandling av kan-
Cíšï”.
Claims (7)
1. Cytotoxisk produkt bildad av en cytotoxisk förening och en antikropp, k ä n n e t e'c k n a d a v att den består av en förening, här benämnd konjugat, vari ricinets kedja A genom en disulfidbrygga är bunden till ett immunoglobulin eller ett immuno- globulinfragment, som selektivt kan känna igen ett givet antigen på ytan av bärarceller som man önskar förstöra.
2. Produkt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att antikroppen är ett immunoglobulinfragment F(ab')fi. L
3. Förfarande för framställning av en cytotoxisk produkt med en kovalent bindning mellan en cytotoxisk förening och en anti- kropp, k ä n n e t e c k n a t a v att man bildar en disulfid- brygga mellan ricinets kedja A och ett immunoglobulin eller ett immunoglobulinfragment specifikt för ett givet antigen som uppbäres av de celler man önskar förstöra.
4. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t a v att en förening med formeln P1-SH omsättes med en förening med formeln P2-S-S-X enligt följande reaktion: P1SH f P2 - S - S - X --9 P1 - S - S - P2 + XSH, där P2 betecknar ett immunoglobulin eller ett immunoglobulinfragment, när P1 betecknar en rest av ricinets kedja A, vilken rest uppbär denna molekyls fria tíolgrupp; under det att P1 betecknar ett immunoblobulin eller ett immunoglo- bulinfragment, när P2 betecknar nämnda rest av ricinets kedja A; och där X betecknar en organisk aktivatorgrupp.
5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t a v att P1 betecknar ett immunglobulin eller ett immunoglobulinfragment, vari man skall införa en fri tiolgrupp, varvid man först blockerar antikroppens igenkänningsställe genom behandling av antikroppen med motsvarande antigen eller ett annat antigen som ger en korsreaktion eller ett lämpligt hapten, varefter det sålunda skyddade immunglo- bulinet omsättes med S-acetylmerkaptobärnstenssyraanhydrid, varefter tiolgrupperna frigöres genom omsättning med hydroxvlamin på känt sätt, och varefter slutligen igenkänningsstället avblockeras enligt något känt förfarande förïavlägsnande av antigenet; och att PZSH betecknar ricinets kedja A, vilken omvandlas till en disulfid genom följande utbytesreaktion: Pzsrwfx-s-s-xï P2-s-s-x+xsn där X betecknar en 2- eller 4-pyrïdylgrupp, eventuellt substituerad 7997994-5 44 med en eller flera halogenatomer, alkylgrupper eller karboxylgrupper, eller en fenylgrupp, eventuellt substituerad med en eller flera nitrogrupper eller karboxylgrupper, varvid reaktionen genomföres med ett stort molärt överskott av reaktionskomponenten XSSX, vilken efter avslutad reaktion avlägsnas genom dialys eller gelfiltrering på molekylsilar; varvid samtliga de ovan angivna reaktionerna genom- 'föres vid-pH 7,0 i en fosfatbuffert och vid rumstemperatur.
6. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t a v att P1SH betecknar ricinets kedja A, och att P2 betecknar ett immuno- globulin eller ett immunoglobulinfragment, som omvandlas till en aktiverad disulfid enligt följande reaktion: _P2+Y--R-S-S-X--> Pz-R-S-S-X där Y betecknar en funktionell grupp som kan bilda en kovalent bind- ning med vilken.som helst av de funktionella grupper, särskilt amino- grupper, som uppbäres av sidokedjorna av de aminosyrarester som bildar immunoglobulinet, där R betecknar en grupp -(CH2)h-, där n är ett heltal från 2 till 10, eller en grupp R3-CH-âfl-R4, där R4 be- tecknar en väteatom eller en alkylgrupp innehållande 1-8 kolatomer och R3 betecknar en substituent som är inert gentemot de senare använda reaktionskomponenterna, såsom en amidgrupp med formeln -NH - g - 0R5{ där R5 betecknar en rak eller förgrenad alkylgrupp O innehållande 1-5 kolatomer, och där X betecknar en 2- eller 4-pyri- dylgrupp, eventuellt substituerad med en eller flera halogenatomer, alkylgrupper eller karboxylgrupper, en fenylgrupp, eventuellt sub- stituerad med en eller flera nitrogrupper eller karboxylgrupper, eller en alkoxikarbonylgrupp; varivd reaktionen genomföres i en homogen flytande fas vid rumstemperatur.
7. Förfarande enligt något av kraven 4-6, k ä n n e t e c k - n a t a v att det erhållna konjugatet P1 - S - S ~ P2 renas för avlägsnande av icke omsatt förening P2 - S - S - X på något känt sätt, såsom fraktionerad utfällning medelst organiska lösningsmedel blandbara med vatten, gelpermeationskromatografi eller affinitets- kromatografi på en kolonn av en olöslig bärare, som uppbär det anti- gen som motsvarar antikroppen. 1
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR7827838A FR2437213A1 (fr) | 1978-09-28 | 1978-09-28 | Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE7907994L SE7907994L (sv) | 1980-03-29 |
SE446303B true SE446303B (sv) | 1986-09-01 |
Family
ID=9213144
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE7907994A SE446303B (sv) | 1978-09-28 | 1979-09-26 | Cytotoxisk produkt bestaende av ricinets kedja a bunden till ett immunoglobulin eller immunoglobulinfragment genom en disulfidbrygga samt forfarande for framstellning derav |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4340535A (sv) |
JP (1) | JPS5549321A (sv) |
CA (1) | CA1188681A (sv) |
CH (1) | CH647411A5 (sv) |
DE (1) | DE2939165A1 (sv) |
ES (1) | ES484591A0 (sv) |
FR (1) | FR2437213A1 (sv) |
GB (1) | GB2034324B (sv) |
IT (1) | IT1207245B (sv) |
NL (1) | NL192088C (sv) |
SE (1) | SE446303B (sv) |
Families Citing this family (112)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4315851A (en) * | 1978-12-29 | 1982-02-16 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition having antitumor activity |
JPS5616418A (en) * | 1979-07-20 | 1981-02-17 | Teijin Ltd | Antitumor protein complex and its preparation |
EP0044167A3 (en) * | 1980-07-14 | 1982-04-21 | The Regents Of The University Of California | Antibody targeted cytotoxic agent |
US4440747A (en) * | 1980-09-30 | 1984-04-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibody-ricin hybrids as a treatment of murine graft-versus-host disease |
JPS57106626A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
JPS57106625A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
FI820020L (fi) * | 1981-01-12 | 1982-07-13 | Lilly Industries Ltd | Immunoglobulinkonjugater |
SE8102193L (sv) * | 1981-04-06 | 1982-10-07 | Pharmacia Ab | Terapeutiskt aktiv organisk forening och dess anvendning |
SE8102194L (sv) * | 1981-04-06 | 1982-10-07 | Pharmacia Ab | Terapeutiskt aktiv organisk forening och farmaceutisk beredning innehallande denna |
FR2504010B1 (fr) * | 1981-04-15 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation |
JPS5874614A (ja) * | 1981-10-30 | 1983-05-06 | Teijin Ltd | 蛋白複合体及びその製造法 |
FR2516794B1 (fr) * | 1981-11-20 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Nouveaux medicaments anticancereux pour le traitement des leucemies t constitues de la chaine a de la ricine et d'un anticorps monoclonal specifique |
US5292668A (en) * | 1981-12-21 | 1994-03-08 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
US4444878A (en) * | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
US5202252A (en) * | 1982-03-05 | 1993-04-13 | Houston Biotechnology Inc. | Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and methods for preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction |
FR2522968B1 (fr) * | 1982-03-10 | 1986-03-28 | Sanofi Sa | Medicament cytotoxique forme de l'association d'a u moins une immunotoxine et de la chloroquine |
FR2523445A1 (fr) * | 1982-03-17 | 1983-09-23 | Sanofi Sa | Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues |
WO1983004026A1 (fr) * | 1982-05-11 | 1983-11-24 | Genefusion S.A. | Agent cytotoxique |
US4468382A (en) * | 1982-07-15 | 1984-08-28 | New England Medical Center, Inc. | Polypeptide-toxin hybrid protein |
US4520226A (en) * | 1982-07-19 | 1985-05-28 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Treatment of graft versus host disease using a mixture of T-lymphocyte specific monoclonal antibody: ricin conjugates |
US4500637A (en) * | 1982-07-19 | 1985-02-19 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Prevention of graft versus host disease following bone marrow transplantation |
US4485093A (en) * | 1982-08-13 | 1984-11-27 | Runge Richard G | Immunotoxin conjugate which comprises arsanilic acid, useful for treating malignant tumors, particularly pancreatic cancer |
JPS59116232A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-07-05 | Teijin Ltd | 細胞毒性複合体及びその製造法 |
US4916213A (en) * | 1983-02-22 | 1990-04-10 | Xoma Corporation | Ribosomal inhibiting protein-immunoglobulin conjugates with specificity for tumor cell surface antigens, and mixtures thereof |
JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
US4664911A (en) * | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
GB2142428A (en) * | 1983-06-23 | 1985-01-16 | Erba Farmitalia | Adenocarcinoma related antigenic determinants and antibodies specific thereto |
GB2148299B (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-06 | Hybritech Inc | Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life |
US5169774A (en) * | 1984-02-08 | 1992-12-08 | Cetus Oncology Corporation | Monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
DE3584486D1 (de) * | 1984-02-08 | 1991-11-28 | Cetus Corp | Toxinkonjugate. |
US4753894A (en) * | 1984-02-08 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
US4894443A (en) * | 1984-02-08 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Toxin conjugates |
CA1314245C (en) * | 1984-05-23 | 1993-03-09 | Franz Jansen | Process for the preparation of conjugates in which a monovalent carboxylic ionophore is associated by means of a covalent bond with a macromolecule, which are useful as immunotoxin potentiators |
US4670563A (en) * | 1984-06-20 | 1987-06-02 | Sanofi | Imidazolides as intermediates for the synthesis of cytotoxic conjugates |
FR2566271B1 (fr) * | 1984-06-20 | 1986-11-07 | Sanofi Sa | Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention |
PT80662B (en) * | 1984-06-20 | 1986-12-09 | Sanofi Sa | Process to obtain anti-tumoral glycoprotein modified on its glycidic portions |
US6808901B1 (en) * | 1984-09-03 | 2004-10-26 | Celltech R&D Limited | Production of chimeric antibodies |
US4590071A (en) * | 1984-09-25 | 1986-05-20 | Xoma Corporation | Human melanoma specific immunotoxins |
AU585940B2 (en) * | 1984-09-25 | 1989-06-29 | Xoma Corporation | Lectin immunotoxins |
US5185434A (en) * | 1985-02-13 | 1993-02-09 | Sanofi | Prolonged-action immunotoxins containing a glycopeptide constituent which inactivates ribosomes, modified on its polysaccharide units |
FR2577135B1 (fr) * | 1985-02-13 | 1989-12-15 | Sanofi Sa | Immunotoxines a longue duree d'action comportant un constituant glycopeptidique inactivant les ribosomes modifie sur ses motifs polysaccharidiques |
US4698420A (en) * | 1985-02-25 | 1987-10-06 | Xoma Corporation | Antibody hybrid molecules and process for their preparation |
WO1986005098A1 (en) * | 1985-03-04 | 1986-09-12 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Immunotoxin and method of making |
US4888415A (en) * | 1985-03-04 | 1989-12-19 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Gelonin immunotoxin |
US4689311A (en) * | 1985-09-30 | 1987-08-25 | Rhode Island Hospital | Screening antibodies for capacity to deliver toxin to target cells |
US4731439A (en) * | 1985-11-22 | 1988-03-15 | Oncogen | Snake venom growth arresting peptide |
US4962188A (en) * | 1985-12-06 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Recombinant ricin toxin A chain conjugates |
US4911911A (en) * | 1985-12-20 | 1990-03-27 | Sanofi | Ribosome-inactivating glycoproteins, modified by oxidation of their osidic units and formation of a schiff's base and in-vivo prolonged action immunotoxins containing such a glycoprotein |
IL80973A (en) * | 1985-12-20 | 1992-08-18 | Sanofi Sa | Modified ribosome-inactivating glycoproteins,their preparation,immunotoxins containing them and pharmaceutical compositions containing such immunotoxins |
EP0252951A4 (en) * | 1986-01-06 | 1988-09-07 | Univ Melbourne | TECHNETIUM-ANTIBODY CONJUGATES. |
US4689401A (en) * | 1986-03-06 | 1987-08-25 | Cetus Corporation | Method of recovering microbially produced recombinant ricin toxin a chain |
US5242823A (en) * | 1986-03-07 | 1993-09-07 | International Genetic Engineering, Inc. | Cloning of the 38kd Mycoplasma hyorhinis regression-associated antigen |
US4748112A (en) * | 1986-03-07 | 1988-05-31 | International Genetic Engineering, Inc. | Methods and compositions relating to regression-associated antigens |
US4877868A (en) * | 1986-03-12 | 1989-10-31 | Neorx Corporation | Radionuclide antibody coupling |
WO1987005515A1 (en) * | 1986-03-20 | 1987-09-24 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Lectin complex and method and probe for making same |
US5239062A (en) * | 1986-03-20 | 1993-08-24 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Blocked lectins, methods and affinity support for making same using affinity ligands, and method of killing selected cell populations having reduced nonselective cytotoxicity |
US5395924A (en) * | 1986-03-20 | 1995-03-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Blocked lectins; methods and affinity support for making the same using affinity ligands; and method of killing selected cell populations having reduced non-selective cytotoxicity |
US4880935A (en) * | 1986-07-11 | 1989-11-14 | Icrf (Patents) Limited | Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates |
FR2601680B1 (fr) * | 1986-07-15 | 1990-06-29 | Sanofi Sa | Inhibiteur de la synthese proteique, procede d'isolement, utilisation et compositions pharmaceutiques en contenant |
US4771128A (en) * | 1986-10-10 | 1988-09-13 | Cetus Corporation | Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography |
US4871350A (en) * | 1986-11-04 | 1989-10-03 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for preventing secondary cataracts |
US5616122A (en) * | 1986-11-04 | 1997-04-01 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for preventing secondary cataracts |
US5055291A (en) * | 1986-11-04 | 1991-10-08 | Baylor College Of Medicine | Compositions for preventing secondary cataracts |
US5158893A (en) * | 1986-12-11 | 1992-10-27 | Peralta Cancer Research Institute | Methods and compositions for screening carcinomas |
US5149528A (en) * | 1987-04-10 | 1992-09-22 | Zymogenetics, Inc. | Cytotoxic protein from Trichosanthes kirilowii |
US4985541A (en) * | 1987-04-10 | 1991-01-15 | Zymogenetics, Inc. | Novel cytotoxic protein |
US5591829A (en) * | 1987-05-29 | 1997-01-07 | Matsushita; Shuzo | Antibodies modified with toxic substance |
US4865841A (en) * | 1987-10-23 | 1989-09-12 | Imre Corporation | Methods and compositions for transient elimination of humoral immune antibodies |
JPH0535249Y2 (sv) * | 1988-03-31 | 1993-09-07 | ||
WO1989012624A2 (en) * | 1988-06-14 | 1989-12-28 | Cetus Corporation | Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom |
US5241078A (en) * | 1988-06-14 | 1993-08-31 | Cetus Oncology | Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom |
US5171563A (en) * | 1988-09-30 | 1992-12-15 | Neorx Corporation | Cleavable linkers for the reduction of non-target organ retention of immunoconjugates |
US5162218A (en) * | 1988-11-18 | 1992-11-10 | The Regents Of The University Of California | Conjugated polypeptides and methods for their preparation |
WO1991010742A1 (en) * | 1990-01-16 | 1991-07-25 | Replgien Corporation | Monoclonal antibody specific for non-immunodominant epitope of hiv proteins |
US5191066A (en) * | 1990-12-07 | 1993-03-02 | Abbott Laboratories | Site-specific conjugation of immunoglobulins and detectable labels |
AU654563B2 (en) * | 1991-07-24 | 1994-11-10 | Imperial Chemical Industries Plc | Proteins |
US5578706A (en) * | 1993-11-04 | 1996-11-26 | Board Of Regents, The University Of Texas | Methods and compositions concerning homogenous immunotoxin preparations |
US5690935A (en) * | 1995-01-13 | 1997-11-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Biotherapy of cancer by targeting TP-3/P80 |
US6146628A (en) * | 1995-07-11 | 2000-11-14 | Regents Of The University Of Minnesota And Rutgers | Biotherapeutic agents comprising recombinant PAP and PAP mutants |
ZA9711548B (en) * | 1996-12-24 | 1999-06-23 | Res Dev Foundation | Ricin inhibitors and methods for use thereof |
US6673914B1 (en) | 1998-01-22 | 2004-01-06 | John Wayne Cancer Institute | Human tumor-associated gene |
ES2533255T3 (es) | 1998-07-13 | 2015-04-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Utilización de anticuerpos anti-aminofosfolípidos para el tratamiento del cáncer |
DE69934903T2 (de) * | 1998-11-10 | 2007-10-18 | Emory University | Mitogene regulatoren |
PT1210428E (pt) | 1999-08-23 | 2015-07-21 | Genetics Inst Llc | Pd-1, um recetor para b7-4 e suas utilizações |
GB9926875D0 (en) * | 1999-11-12 | 2000-01-12 | Microbiological Research Agenc | Use of lytic toxins and toxin conjugates |
AU5003001A (en) | 2000-03-06 | 2001-09-17 | Univ Kentucky Res Found | Methods to impair hematologic cancer progenitor cells and compounds related thereto |
US8163289B2 (en) * | 2001-03-09 | 2012-04-24 | Iterative Therapeutics, Inc. | Methods and compositions involving polymeric immunoglobulin fusion proteins |
CA2437958C (en) | 2001-03-09 | 2018-10-30 | University Of Chicago | Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity fc.gamma.receptors |
WO2002079499A1 (en) | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Wyeth | Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor |
US6846484B2 (en) | 2001-12-28 | 2005-01-25 | Regents Of The University Of Minnesota | DTAT fusion toxin |
US20050095627A1 (en) * | 2003-09-03 | 2005-05-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Multiple antigen detection assays and reagents |
WO2007025166A2 (en) * | 2005-08-25 | 2007-03-01 | Repair Technologies, Inc. | Devices, compositions and methods for the protection and repair of cells and tissues |
FR2900341B1 (fr) | 2006-04-27 | 2012-09-14 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation de ligands synthetiques multivalents de la nucleoline de surface pour le traitement du cancer |
US8163279B2 (en) | 2007-04-13 | 2012-04-24 | Stemline Therapeutics, Inc. | IL3Rα antibody conjugates and uses thereof |
MX2010005104A (es) | 2007-11-09 | 2010-08-04 | Peregrine Pharmaceuticals Inc | Composiciones de anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular y metodos. |
WO2009141687A1 (en) * | 2008-05-22 | 2009-11-26 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | New optically pure compounds for improved therapeutic efficiency |
GB0909904D0 (en) | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Affitech As | Product |
GB0909906D0 (en) | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Affitech As | Antibodies |
GB201002238D0 (en) | 2010-02-10 | 2010-03-31 | Affitech As | Antibodies |
CN103338782A (zh) | 2010-10-04 | 2013-10-02 | 国家科学研究中心 | 包含表面核仁素的多价合成配体和糖胺聚糖的组合物 |
GB201020738D0 (en) | 2010-12-07 | 2011-01-19 | Affitech Res As | Antibodies |
EP3613765A1 (en) | 2012-08-03 | 2020-02-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibody against repulsive guidance molecule b (rgmb) |
AU2014241442B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-11-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human antibodies to GREM 1 |
EP3293275B1 (en) | 2013-06-06 | 2021-08-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment prevention, and treatment of cancer using pd-l1 isoforms |
EP3757130A1 (en) | 2013-09-26 | 2020-12-30 | Costim Pharmaceuticals Inc. | Methods for treating hematologic cancers |
WO2016094273A1 (en) | 2014-12-08 | 2016-06-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for upregulating immune responses using combinations of anti-rgmb and anti-pd-1 agents |
WO2017066561A2 (en) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | President And Fellows Of Harvard College | Regulatory t cell pd-1 modulation for regulating t cell effector immune responses |
KR20190080825A (ko) | 2016-03-21 | 2019-07-08 | 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. | T-세포 기능소실 상태-특이적 유전자 발현 조절인자 및 그 용도 |
WO2018044640A1 (en) | 2016-08-29 | 2018-03-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-gremlin-1 (grem1) antibodies and methods of use thereof for treating pulmonary arterial hypertension |
TW202311284A (zh) | 2017-01-03 | 2023-03-16 | 美商再生元醫藥公司 | 抗金黃色葡萄球菌溶血素a毒素之人類抗體 |
WO2020251924A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human antibodies to bone morphogenetic protein 6 |
CN116964088A (zh) | 2021-01-25 | 2023-10-27 | 里珍纳龙药品有限公司 | 用于治疗肺动脉高压(pah)的抗pdgf-b抗体和使用方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2456224A1 (de) * | 1974-11-28 | 1976-08-12 | Karl Dr Med Theurer | Verwendung von nativen antikoerpern oder von antikoerper-fragmenten mit kovalent gebundenen oder konjugierten zytostatisch und/bzw. oder zytotoxisch wirkenden substanzen fuer die krebstherapie |
GB1541435A (en) * | 1975-02-04 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
GB1446536A (en) * | 1975-02-21 | 1976-08-18 | Yeda Res & Dev | Pharmaceutically active compositions |
IL47372A (en) * | 1975-05-27 | 1979-10-31 | Yeda Res & Dev | Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same |
-
1978
- 1978-09-28 FR FR7827838A patent/FR2437213A1/fr active Granted
-
1979
- 1979-09-26 SE SE7907994A patent/SE446303B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-09-26 CA CA000336385A patent/CA1188681A/en not_active Expired
- 1979-09-26 CH CH8644/79A patent/CH647411A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1979-09-27 DE DE19792939165 patent/DE2939165A1/de active Granted
- 1979-09-27 US US06/079,441 patent/US4340535A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-09-28 GB GB7933670A patent/GB2034324B/en not_active Expired
- 1979-09-28 ES ES484591A patent/ES484591A0/es active Granted
- 1979-09-28 JP JP12525779A patent/JPS5549321A/ja active Granted
- 1979-09-28 IT IT7926118A patent/IT1207245B/it active
- 1979-09-28 NL NL7907251A patent/NL192088C/nl not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2437213A1 (fr) | 1980-04-25 |
JPS5549321A (en) | 1980-04-09 |
GB2034324A (en) | 1980-06-04 |
JPS6220999B2 (sv) | 1987-05-11 |
NL7907251A (nl) | 1980-04-01 |
SE7907994L (sv) | 1980-03-29 |
IT7926118A0 (it) | 1979-09-28 |
CA1188681A (en) | 1985-06-11 |
US4340535A (en) | 1982-07-20 |
CH647411A5 (fr) | 1985-01-31 |
ES8101384A1 (es) | 1980-12-16 |
NL192088C (nl) | 1997-02-04 |
DE2939165A1 (de) | 1980-04-10 |
IT1207245B (it) | 1989-05-17 |
ES484591A0 (es) | 1980-12-16 |
FR2437213B1 (sv) | 1983-05-06 |
GB2034324B (en) | 1984-01-04 |
NL192088B (nl) | 1996-10-01 |
DE2939165C2 (sv) | 1989-08-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SE446303B (sv) | Cytotoxisk produkt bestaende av ricinets kedja a bunden till ett immunoglobulin eller immunoglobulinfragment genom en disulfidbrygga samt forfarande for framstellning derav | |
Wainer et al. | Morphine-3-succinyl—Bovine serum albumin: An immunogenic hapten-protein conjugate | |
JP4896959B2 (ja) | ドキソルビシン免疫測定法 | |
EP0359063B1 (en) | Antibody having high affinity to methamphetamine and immunogen for obtaining the same | |
Kunihiko et al. | A second class of immunoglobulin other than IgM present in the serum of a cartilaginous fish, the skate, Raja kenojei: isolation and characterization | |
JPH09157288A (ja) | 直鎖状ポリマーを用いる生体分子の単離方法 | |
US5233025A (en) | Amphetamine protein complex as immunogen for obtaining antibodies specific to methamphetamine | |
JP4521029B2 (ja) | サイトキサン抗体及びイムノアッセイ | |
Wong et al. | Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for imazaquin herbicide | |
ES2323571T3 (es) | Proceso para aislar selectivamente an ticuerpos igy de yema de huevo de un ave anseriforme. | |
Makker | Evidence that the antigen of autologous immune complex glomerulonephritis of rats is a mannose-or glucose-containing glycoprotein | |
Trieshmann Jr et al. | The characterization of human anti-IgG autoantibodies by liquid isoelectric focussing | |
Bürgisser et al. | Preparation and characterization of polyclonal and monoclonal antibodies against the insecticide DDT | |
JPS59134734A (ja) | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 | |
LIU et al. | Mouse monoclonal IgE antibodies specific for ragweed pollen antigens | |
JPH01269488A (ja) | モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 | |
JP3414856B2 (ja) | ジフェニルエーテル化合物の免疫学的測定方法 | |
JPS6236399A (ja) | ヒトcrpの回収、精製法 | |
JPH01269486A (ja) | モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 | |
Seon et al. | A Spontaneously Occurring Complex of β2-Microglobulin and a Fragment of γ-Chain of IgG: Isolation from the Urine of a Patient with Plasma Cell Leukemia and Characterization | |
JPH01269485A (ja) | モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 | |
JPH01269487A (ja) | モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 | |
JP4193477B2 (ja) | モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞、製造方法および用途 | |
Sullivan et al. | Genetic control of the immune response to human adult haemoglobin (HbA1) and sickle cell haemoglobin (HbS) | |
JPH0799992A (ja) | ジフェニルエーテル誘導体に特異的なモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、及びジフェニルエーテル誘導体の検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NAL | Patent in force |
Ref document number: 7907994-3 Format of ref document f/p: F |
|
NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 7907994-3 Format of ref document f/p: F |
|
NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 7907994-3 Format of ref document f/p: F |