DE68902212T2

DE68902212T2 - Immunotoxine zur behandlung bzw. prophylaxe von autoimmunkrankheiten.

Info

Publication number: DE68902212T2
Application number: DE8989202588T
Authority: DE
Inventors: Hermanus Antonius Mari Verheul
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1988-10-21
Filing date: 1989-10-13
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2009-10-14
Also published as: JP2807506B2; KR0151851B1; PT92071A; KR900005996A; FI100305B; ATE78407T1; AU625802B2; AU4359589A; DK523589A; EP0365087A1; FI895005A0; NZ231095A; IE893324L; CA2000999A1; EP0365087B1; ES2051989T3; DK523589D0; GR3006048T3; DE68902212D1; JPH02169523A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Immunotoxine für die Behandlung oder Prophylaxe einer autoimmunen Erkrankung, auf pharmazeutische Präparate, welche ein oder mehrere Immunotoxine enthalten, und auf ein Verfahren für die Herstellung dieser Immunotoxine.
Das Immunsystem weist eine Komplezität auf, welche eine Erfordernis für Selbsterkennung umfasst. Die Regulierung des Immunsystems erfolgt über diese Selbstberkenntnis und kann Zellen, Antikörper, Verstärkungssysteme (z.B. ein Komplement) und Kombinationen dieser Elemente einschliessen. In gesunden Individuen antwortet das Immunsystem auf den Einfluss einer fremden Substanz durch Aktivierung der zellularen Immunantwort und/oder durch Erzeugung spezifischer Antikörper gegen diese Substanz. Andererseits ist das Immunsystem im allgemeinen tolerant gegenüber Bestandteilen des eigenen Körpers, was als Eigentoleranz bezeichnet wird. Autoimmunität kann als eine Umgehung dieser Eigentoleranz definiert werden.
Autoimmune Erkrankungen können sein: Multiple Sklerose, bei welcher das Gewebe durch Myelin angegriffen wird; Myasthenia Gravis, bei welcher das Angriffsziel ein Rezeptormolekül für den wichtigen Neurotransmittor Acetylcholin ist; rheumatoide Arthritis, bei welcher unter anderem die peripheralen Gelenke angegriffen werden, Diabetes Mellitus vom Typus I, dadurch gekennzeichnet, dass die insulinerzeugenden Zellen zerstört sind, und systemischer Lupes Erythematosus, bei welchem Blutgefässe, Haut und Nieren angegriffen werden.
Autoimmune Erkrankungen können hervorgerufen werden, ohne dass ein spezifisches äusseres Mittel erforderlich ist. Der Verlust der Toleranz gegenüber den Eigenantigenen kann durch das Eigenantigen, durch eine abnormale Immunantwort auf das Eigenantigen oder durch eine Kombination von beiden hervorgerufen werden. Manchmal bewirken exogene Mittel eine Immunantwort, welche Empfänglichkeit gegenüber gewissen Eigenantigenen einschliesst (Epitop-Nachahmung). Eine Immunantwort, welche durch den Wirt gegenüber einem spezifischen Determinanten eines Infektionsmittels aufgebaut wurde, kann mit der nachgeahmten Wirtesequenz eine Crossreaktion hervorrufen, welche zu Autoimmunität und möglicher Gewebeschädigung und Erkrankung führt. Zahlreiche virale und bakterielle Proteine teilen Epitope mit Wirtzellenproteinen, welche ähnlich genug sind um eine Crossreaktion einzugehen, aber verschieden genug, um die immunologische Toleranz zu brechen.
Die Erkennung der Eigenantigene und/oder exogenen Antigene und die anschliessend auftretende Schädigung des das Eigenantigen enthaltenden Gewebes durch das Immunsystem wird durch die T-Lymphozyten und B-Lymphozyten vermittelt.
In der US-Patentschrift 4,634,590 ist die Züchtung von spezifischen T-Lymphozyten, welche verantwortlich sind für das Hervorrufen autoimmuner Erkrankungen bei Labortieren, als Langzeit-Zelllinien beschrieben. Es wurde gefunden, dass nach Abschwächung dieser spezifischen T-Lymphozyten die Zellen oder das Membranmaterial davon als wirksame Mittel für die Impfung gegen eine spezifische autoimmune Erkrankung verwendet werden können.
WO 85/05034 beschreibt die Verwendung eines Mykobakteriums oder einer Fraktion davon in einer Zusammensetzung oder einem Impfstoff für die Linderung der Symptome oder für die Behandlung oder Diagnose von arthritischen Erkrankungen. Spezifische Fraktionen von Mykobakterium, welche immunologische Crossreaktionsfähigkeit mit Proteoglykanen von normalen Gelenkknorpeln aufweisen, werden identifiziert. Schutz gegen adjuvante Arthritis (AA) und die Unterdrückung der autoimmunen Erkrankung kann verbunden werden mit einer spezifischen Fraktion von Mykobakterium, während die andere Fraktion die schädliche Autoimmunantwort induziert.
Ferner wurden zwei T-Lymphozytenklone als ansprechend auf jeweils eine der beiden Mykobakteriumfraktionen identifiziert, so dass sie mit der Arthritogenizität oder mit der Unterdrükkung von Arthritis assoziiert werden können.
Adjuvante Arthritis-T-Lymphozytenclone wurden auch verwendet, um das Antigen zu identifizieren, welches auf Mykobakterium vorhanden sind und durch diese T-Zellclone erkannt werden. Ein 65 kD-Protein wurde als das Mykobakteriumantigen identifiziert, welches proliferative Antwort der T-Zellclone in vitro entlockt. Das durch die T-Zellclone erkannte Epitop befindet sich in der 180-188-Aminosäuresequenz des 65 kD-Antigens. Diese Sequenz zeigt eine Aehnlichkeit mit einem Teil des Bindeproteins von Ratten-Proteoglykan (siehe van Eden et al., Nature 331, 171, 1988).
Die allgemein übliche Behandlung von autoimmunen Erkrankungen umfasst die Verabreichung von nichtspezifischen Arzneimitteln, welche die Autoimmunantwort unterdrücken, aber auch verschiedene unerwünschte Komplikationen hervorrufen, welche mit der vollständigen Unterdrückung des Immunsystems verbunden sind oder andere unerwünschte toxische Nebenwirkungen auf die Nichtlymphoiden Gewebe ausüben. Beispiele von Arzneimitteln, welche üblicherweise zur Bekämpfung autoimmuner Erkrankungen verwendet werden, sind Naproxen, Auranofin, Penicillamin, Chlorochin und Corticosteroid. So müssen in einer bevorzugten Annäherung für die Behandlung oder die Prophylaxe einer autoimmunen Erkrankung Arzneimittel in solcher Weise angestrebt werden, dass die immunologische Reaktionsfähigkeit, welche zu den Erkrankungssymptomen führt, spezifisch beeinträchtigt werden.
Es ist aus der Literatur bekannt, dass der Acetylcholin-Rezeptor, welcher das bei der Autoimmunerkrankung Myasthenia Gravis angegriffene Eigenantigen ist, für die Unterdrückung der spezifischen Immunantwort gegen das Antigen verwendet werden kann. Der Acetylcholin-Rezeptor, gebunden an die Toxine Rizin oder Gelonin, ist befähigt, eine Fraktion der Antigenrekationsfähigen Lymphozyten zu eliminieren (Killen, J.A. and Lindstrom, J.M., Journal of Immunology 133 (1984), 2549-2553; Olsberg, C.A. et al., Journal of Immunology 135 (1985), 3062- 3067; Brust, S. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368 (1987), 991-999).
Es ist ferner bekannt, dass ein Antigen in den meisten Fällen nur durch T-Lymphozyten erkannt werden kann, nachdem dieses Antigen durch Antigen präsentierende Zellen (APC) in Kombination mit Molekülen des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (MHC) verarbeitet wurde. Demzufolge weist der obgenannte, bekannte Antigen-Toxin-Versuch den Nachteil auf, dass während der APC-Verarbeitung des Antigen-Toxin-Koniugates die APC durch Wirkung des Toxins inaktiviert werden, wodurch das Immunsystem wertvoller Zellen beraubt wird.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Tatsache, dass spezifische Eigen-Epitope oder exogene Epitope mit einer zytotoxischen Substanz koniugiert werden anstelle des ganzen Eigenantigens oder exogenen Antigens, wodurch die Notwendigkeit der Verarbeitung durch APC umgangen wird.
Ferner ist in der gegenwärtigen Situation die zytotoxische Substanz an das Fragment des Antigens gebunden, welches direkt durch das T-Lymphozyt erkannt wird: das Epitop. Dies führt zu einer wirksameren toxischen Wirkung des Epitop-cytotoxische Substanz-Koniugates für die T-Lymphozyten, wodurch die Verwendung von verminderten Konzentrationen dieses Epitop-cytotoxische Substanz-Koniugates erlaubt wird, um eine vollständige Eliminierung der autoimmunogenen T-Lymphozyten zu erzielen.
Ferner werden im Falle von exogenen Antigenen in der vorliegenden Erfindung nur jene T-Lymophzyten, welche für die Autoimmunantwort verantwortlich sind, eliminiert, wodurch dem Immunsystem ermöglicht wird, eine Immunantwort gegen das exogene Antigen hervorzurufen.
Das Immunotoxin gemäss der vorliegenden Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass das Immunotoxin ein Epitop, welches durch T-Lymphozyten als charakteristisch für die spezifische Autoimmunerkrankung erkannt wurde, oder ein CR (Crossreactive)-Analoges davon umfasst, wobei dieses Epitop oder CR- Analoge davon an eine zytotoxische Substanz gekuppelt ist.
Viele Proteine und/oder Epitope, welche durch T-Lymphozyten als charakteristisch für die spezifische Autoimmunerkrankung erkannt werden, sind bekannt und in der Literatur beschrieben.
Adjuvante Arthritis (AA) ist eine chronische autoimmune Erkrankung, welche die Degenerierung des Knorpels in den Gelenken verursacht. Adjuvante Arthritis kann bei Ratten durch Immunisierung mit einem Antigen von Mykobakterium Tuberkolosis (Mt) induziert werden. Die bei AA beobachtete Gewebeschädigung ist charakteristisch für T-Lymphozyten. Die T-Lymphozyten werden durch ein Antigen stimuliert, welches zu Mykobakterium Tuberkolosis gehört und welches die Eigenantigene nachgeahmt, welche in den arthritischen Ratten angegriffen werden.
Spezifische T-Lymphozytenclone wurden gefunden, welche fähig sind, sowohl das fremde Mykobakterium Tuberkolosis-Antigen wie das eigene Antigen zu erkennen. Das eigene Antigen befindet sich wahrscheinlich innerhalb eines Teils eines Knorpel- Proteoglykanmoleküls, genannt das Bindemolekül. Diese spezifischen T-Lymphozytenklone reagieren spezifisch mit einem 65 kD-Protein, einem Mt-Protein, das durch E. coli, das mit Mt-DNA transfektiert ist, exprimiert wird. Dieses 65 kD-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf Mykobakteriumstämme.
Ein Peptid bestehend aus 21 Aminosäuren, welches sich in der 65-85-Aminosäuresequenz des 65 kD-Proteins befindet, wie auch ein Peptid bestehend aus 9 Aminosäuren, Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu- Glu-Leu-Thr, welches sich in der 180-188-Aminosäuresequenz des 65 kD-Proteins befindet, werden als die Epitope identifiziert, welche durch die T-Lymphozyten erkannt werden. Dieses Nonapeptid weist eine Aehnlichkeit auf mit einem Teil des Bindeproteins des Proteoglykanmoleküls, welches das Kernprotein an das Zuckerrückgrat dieses Moleküls bindet und die Aminosäuresequenz Thr- Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln besitzt. Das 65 kD-Protein von Mykobakterium Bovis, welches eine identische Codierungsregion aufweist wie das Mt-65 kD-Protein, enthält ebenfalls mehrere Epitope, welche durch Lymphozyten erkannt werden.
Diese T-Lymphozytenepitope stimmen überein mit oder befinden sich in den Aminosäuresequenzen 1-16, 17-61, 85-108, 112-132, 235-279 und 437-459 (für Aminosäuresequenzen des Mykobakterium- 65 kD-Proteins siehe Thole et al., Infect. Immun. 55, 1466-1475, 1987; Husson et al., PNAS 84, 1679-1683, 1987; Shinnick et al., J. Bact. 169, 1080-1088, 1987).
Myelin-Basisprotein (BP) ist ein Autoantigen in verschiedenen Spezies. Die Immunisierung mit BP oder der passive Transfer von Lymphozyten von Tieren, welche BP-immunisiert sind, induziert die Autoimmunerkrankung experimentelle Autoimmun-Enzephalomelitis (EAE) in verschiedenen Spezies. EAE erzeugt entzündliche Lähmung und Demyelierung, Symptome, welche auch bei Multipler Sklerose auftreten. EAE wird durch eine spezifische Klasse von T-Lymphozyten vermittelt. Die Immunisierung mit BP oder einigen Fragmenten davon induziert EAE in empfänglichen Spezies, jedoch ist nicht jedes Fragment enzephalogen. T-Lymphozyten werden nur durch das intakte Protein oder Fragmente, welche ein spezifisches Epitop enthalten, aktiviert. Verschiedene Epitope innerhalb BP sind bereits in Fachkreisen bekannt. Die Aminosäuresequenz 1-16, 1-37, 59-74, 68-88, 89- 169 und 114-122 von BP wurden bereits als Epitope oder Epitope enthaltende Sequenzen identifiziert, welche Affinität für enzephalogene T-Lymphozyten aufweisen und daher für T-Lymphozyten, welche charakteristisch sind für Multiple Sklerose (für Aminosäuresequenzen des Myelin-Basisproteins siehe Eylar et al., J.Biol.Chem. 259, 5028, 1984; Stoner, G.L. J.Neurochem. 43, 433-447, 1984; Scoble et al., J.Neurochem. 47, 614-616, 1986).
Myasthenia Gravis (MG), eine andere autoimmune Erkrankung, wird durch das Vorliegen eines immunogenen Faktors des Azetylcholin-Rezeptors hervorgerufen, was zu einer Stimulierung von autoimmunen Lymphozyten führt. MG ist gekennzeichnet durch Auto-Antikörper und T-Lymphozyten, welche gegen den Azetylcholin-Rezeptor gerichtet sind, was zu erhöhter Zersetzung des Rezeptors führt und sich klinisch durch Schwäche und Ermüdung von willkürlich arbeiteten Muskeln äussert. Der Azetylcholin-Rezeptor besteht aus 5 Untereinheiten (α2βcd).
Ein Hauptanteil der zellularen Autoimmunantwort von Patienten, welche an MG leiden, richtet sich auf eine Gegend der α-Untereinheit des Rezeptors: die hauptsächliche immunogene Region. In dieser Region wurden verschiedene Epitope oder epitophaltige Aminosäuresequenzen identifiziert, wie die Aminosäuresequenzen 1-30, 73-90, 100-116, 111-126, 146-162, 169-181, 182-198, 257- 271, 351-368 (für Aminosäuresequenzen des Azetylcholin-Re zeptors siehe Noda et al., Nature 299, 793-797, 1982 und Nature 302, 528-532, 1983 und Nature 305, 818-823, 1983; Sumikawa et al., Nucleic Acid Res. 10, 5809-5822, 1982; Devillers-Thiery et al., PNAS 80, 2067-2071, 1983; Hohlfeld et al., J.Clin.Invest. 81, 657-660, 1988).
Der Ausdruck Epitop, wie er hier verwendet wird, bezeichnet einen immunogenen Determinanten eines immunogenen Moleküls, wobei der immunogene Determinant durch eine Komponente des Immunsystems erkannt wird.
Die obgenannten Epitope sind Kandidaten für die Kupplung an eine zytotoxische Substanz, was zu einem Epitop-Zytotoxische Substanz-Koniugat gemäss der vorliegenden Erfindung führt.
Es liegt für den Fachmann auf der Hand, dass ein Peptid, welches nur einen Teil eines Epitops enthält, ebenfalls eine Bindungsaffinität für die T-Lymphozyten aufweist, wie dies der Fall sein wird für ein Peptid, welches zusätzlich zu dem Epitop seitliche Aminosäuren oder andere Gruppierungen enthält. Die Länge dieser seitlichen Gruppierungen ist durch das Erfordernis beschränkt, dass das Peptid nicht unbedingt durch APC verarbeitet wird. Es ist klar, dass ein Immunotoxin, welches solche Peptide enthält, ebenfalls innerhalb des Geltungsbereiches dieser Erfindung liegt.
Ferner ist es möglich, das Polypeptide mit einer ähnlichen aber nicht identischen Aminosäuresequenz entsprechende immunologische Kennzeichen aufweisen. Polypeptide, welche mit einem Epitop in der oben erwähnten Weise verwandt sind, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Zytotoxische Substanzen, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, werden ausgewählt aus einer Gruppe von Substanzen, welche fähig sind, die Zellproliferation zu beenden und gegebenenfalls den Tod der Zelle zu bewirken.
Vorzugsweise werden die zytotoxischen Substanzen aus einer Gruppe von Proteinen von pflanzlichem, pilzlichem oder bakteriellem Ursprung ausgewählt, welche die Eigenschaft aufweisen, die Proteinsynthese in eukaryotischen Zellen zu hemmen. Diese Toxine wirken spezifisch auf den Prozess der Translation durch katalytische Inaktivierung der Ribosomen. Die Pflanzentoxine werden in zwei Gruppen klassifizert, das heisst, Toxine, bestehend aus entweder zwei oder vier proteinhaltigen Untereinheiten, und Toxine bestehend aus einem einkettigen Proteinmolekül, an welches üblicherweise eine Kohlehydratgruppierung gebunden ist.
Die Toxine mit zwei Untereinheiten weisen eine Molekularmasse von 60-65 kD auf, wobei die Untereinheit A etwas kleiner ist als die Untereinheit B (30 kD vs. 32 kD). Die Untereinheiten sind kovalent durch eine einfache Disulphidbindung miteinander verbunden, doch sind auch hydrophobe Wechselwirkungen ebenfalls wichtig, um A und B zusammenzuhalten. Die Untereinheit B besteht aus einer Polypeptidkette und einer Kohlenwasserstoffkette, welche Mannose und N-Ac-Glukosamin enthält. Diese Untereinheit scheint in der Wechselwirkung des Toxins mit den galaktosehaltigen Glykoproteinen und -lipiden der Ziel-Zellmembran beteiligt zu sein. Diese Untereinheit ermöglicht der Untereinheit A in die Zelle einzudringen. Untereinheit A inaktiviert eukaryotische Ribosomen in katalytischer Weise unter nachfolgender Hemmung der Proteinsynthese und dem Tod der Zelle. Eingeschlossen in diese Gruppe von Toxinen sind Rizin, Abrin, Modeccin, Volkensin und Viscumin.
Die einkettigen Pflanzentoxine weisen ähnliche Eigenschaften auf wie jene der oben beschriebenen Untereinheit A. Sie sind inaktiv gegenüber intakten Zellen, obwohl sie sehr starke Inhibitoren in zellfreien Systemen darstellen. Infolge der Abwesenheit einer Untereinheit B treten diese Toxine mit Schwierigkeiten in die Zielzellen ein, so dass sie viel weniger toxisch für die Zellen sind als die toxinhaltige Untereinheit B. Sie können jedoch toxisch werden, wenn sie an Träger gebunden werden, welche fähig sind, sich an Zellen zu binden oder in Zellen einzudringen, wie Lectine und Antikörper. Die folgenden Proteine gehören zu dieser Klasse von Toxinen, z.B. Gelonin, antivirale Proteine aus Phytolacca (pokeweed), Dodecandrin, Dianthine, Luffin, Saporine, Momardica charantia-Inhibitor, Getreideinhibitoren.
Die pilzlichen Proteintoxine, z.B.: α-Sarcin, Restrictocin und Mitogillin, sind nahe verwandte Basisproteine. Diese Toxine enthalten eine einzelne Polypeptidkette und enthalten, im Gegensatz zu den meisten Pflanzentoxinen, keine Kohlehydratgruppierung.
Diphtherietoxin und Pseudamonas-Exotoxin sind zwei Beispiele von bakteriellen Toxinen, welche funktionelle Aehnlichkeiten mit den oben beschriebenen Pflanzentoxinen mit zwei Untereinheiten aufweisen.
Andere bevorzugte zytotoxische Substanzen sind ausgewählt aus der Gruppen von Radioisotopen. Diese Radioisotope können auf spezifische Zellen gerichtet sein. Die Zielzellen werden beschädigt oder getötet durch Verwendung von Isotopen, welche energetische α-Partikel oder β-Partikel ausstrahlen. Geeignete Isotope sind 90Y, 153Sm, 43Sc, 67Cu, 186Rh, 188Rh, 212Bi, 211At, 103Pd.
Es gibt eine Anzahl gutbekannter Wege, um ein Epitop an ein Proteintoxin zu konjugieren.
Eine zufällige Kupplung zwischen dem Epitop und einem Proteintoxin kann z.B. erzielt werden unter Verwendung einer Karbodiimidverbindung (z.B. EDC), welche die Karboxylgruppe eines Proteintoxins aktivert, so dass sie an die Aminogruppe des Epitops gekuppelt werden kann.
Abgesehen von dieser direkten Kupplung können Linker verwendet werden, um eine Brücke zwischen dem Epitop und einem Proteintoxin zu bilden. Ein gutbekannter, homobifunktionelles Vernetzungsmittel ist Glutar(di)aldehyd. Er reagiert vorzugsweise mit Aminen.
Andere homobifunktionelle Linker können ausgewählt werden aus der Gruppe der Imidoester (z.B. Dimethyl-adipimidat, Dimehylsuberimidat) oder N-Hydroxysuccinimid-ester (z.B. Disuccinimidyl-suberat, Dithiobis(succinimidyl-propionate), welche beide spezifisch für Aminogruppen sind.
Heterobifunktionelle Reagentien werden bevorzugt, da sie zwei unähnliche funktionelle Gruppen enthalten, welche die Regulierung der Konjugierungsreaktion sowohl selektiv wie sequentiell erlauben. Ein Beispiel eines heterobifunktionellen Linkers ist N-Succinimidyl-3 (pyridyldithio)-propionat (SPDP). Zuerst wird eine 2-Pyridyl-disulphidgruppe in das Epitop eingeführt durch Umsetzung eines primären Amins mit SPDP. Das derivatisierte Epitop kann nun mit einem Proteintoxin konjugiert werden, welches eine Thiolgruppe enthält, wobei eine Disulphidbindung zwischen dem Epitop und dein Proteintoxin gebildet wird. Falls sie nicht bereits vorhanden ist, kann diese Thiolgruppe in das Proteintoxin eingeführt werden mit Hilfe von Thiolierungsmitteln, wie 2-Iminothiolan, SPDP oder N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat.
Maleimidgruppen wie auch Brom- oder Iodacetylgruppen reagieren unter milden Bedingungen ziemlich rasch mit Thiolgruppen, um eine thioätherartige Bindung zu ergeben. Die Maleimidgruppe kann z.B. in das Epitop eingeführt werden durch Umsetzung der Aminogruppe des Epitops mit Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl)cyclo-hexan-1-carboxylat. In der zweiten Stufe wird ein, eine Sulphydrylgruppe enthaltendes Proteintoxin an das mit Maleimid aktivierte Epitop gebunden.
Die Kohlehydratgruppierung eines Proteintoxins kann auch zur Bindung an das Epitop verwendet werden. Periodat wird verwendet, um Aldehydegruppen in der Kohlehydratgruppierung zu erzeugen. Anschliessend lässt man die Aldehydgruppen mit Aminogruppen des Epitops reagieren, um eine Schiff'sche Base zu bilden, welche durch Reduktion stabilisiert werden kann um ein sekundäres Ainin zu bilden.
Die Kupplung von Radioisotopen an das Epitop wird durch Verwendung eines Chelators erzielt. Chelatoren sind derart aufgebaut, dass eine gute in vivo-Stabilität des Chelator-Isotop-Komplexes sichergestellt ist.
Ein anderer Weg für den Aufbau eines Immunotoxins gemäss der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung mittels rekombinanter DNA-Techniken. Wichtige Nukleinsäuresequenzen, abgeleitet von genomischer DNA oder mRNA, die für Toxinpolypeptide oder toxische Bereiche davon codieren, werden mit Nukleotidsequenzen verbunden, welche die genetische Information für die Aminosäuresequenz des Epitops tragen. Gegebenenfalls kann eine verbindende Sequenz einverleibt werden, welche eine Aminosäuresequenz codiert, die geeignet ist als ein Spacer zwischen dem Toxin und dem Epitop. Die Erzeugung dieser Immunotoxins kann entweder in prokaryotischen oder in eukaryotischen Expressionssystemen durchgeführt werden.
Die Immunotoxine der vorliegenden Erfindung können enteral oder vorzugsweise parenteral verabreicht werden. Zu diesem Zweck werden sie mit einem oder mehreren der üblichen pharmazeutisch annehmbaren, nichttoxischen Träger und/oder üblichen Excipienten vermischt, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung erhalten wird.
Diese pharmazeutische Zusammensetzung umfasst Tabletten, Pillen und überzogene Tabletten für enterale Verabreichung und Lösungen, Suspensionen und Emulsionen für orale oder parenterale Verabreichung.
Die Dosierung der Verbindungen in dem Präparat gemäss der Erfindung hängt weitgehend von den individuellen Erfordernissen des Patienten ab. Für intravenöse Injektion werden die Verbindungen jedoch vorzugsweise in einer Anfangsdosierung zwischen 0,1 ug und 1 mg pro kg Körpergewicht verabreicht, gefolgt, falls notwendig, von einer oder mehreren zusätzlichen Dosierungen pro Tag. Zur Infusion werden die Verbindungen während einer längeren Zeit in einer Dosierung verabreicht, welche auf der oben erwähnten intravenösen Verabreichung basiert.
Die vorliegende Erfindung wird weiter illustriert mit Hilfe der folgenden Beispiele.

Beispiel 1

Synthese des Nonapeptids Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln- OH (I).

Die Synthese des Nonapeptids der Formel I wird nach der Methode der Festphasenpeptidssynthese durchgeführt, wie sie ursprünglich durch Merrifield (J.Amer.Chem.Soc. 85, 2149, 1963) beschrieben wurde.
Die Synthese wird in einem Vega-Kupplungsapparat 250ºC durchgeführt unter Verwendung eines p-Benzyloxybenzyl-alkoholharzes (06-07 mmol/g, Bachem AG, Schweiz).
Aminosäuren werden als ihre Nα-Fmoc-(Fmoc = 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-) Derivate an das Harz gekuppelt, während die Seitenkettenfunktionen von Glu und Thr als t-Butylester bzw. ein t-Butyläther geschützt werden.
Die Synthese beginnt mit der Kupplung von Fmoc-Gln-OH an das Harz unter Verwendung von DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) und DMAP (N,N-Dimethylaminopyridin) bei niederen Temperaturen und in Gegenwart von HOBt (N-Hydroxybenzotriazol), wie von Van Nispen et al. beschrieben (Recl.Trav.Chim. Pays-Bas 104, 99-100, 1985). Restliche freie Alkoholgruppen am resultierenden Fmoc-Gln-Harz (0,3-0,4 mmol/g) werden durch eine Acetylierung blockiert.
Die Fomc-Schutzgruppe wird entfernt durch Behandlung des Harzes mit 25% Piperidin in DMF (Dimethylformamid) während 10 Min., gefolgt von 3 Waschungen (je 1 Min.) mit DMF und CH&sub2;Cl&sub2;.
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc- Val-OH (2 mal), Fmoc-Ala-OH und Fmoc-Thr(tBu)-OH werden nacheinander gekuppelt unter Verwendung von 3 Aequivalenten von jeder geschützten Aminosäure, DCC und HOBt in 6-7 ml DMF pro Gramm Harz während 2 Stunden. Dann werden 3 Waschungen (jede 1 Min.) mit Ethanol, DMF und CH Cl durchgeführt. Die Vollständigkeit jeder Acylierung wird durch den Ninhydrin-Test von Kaiser et al. (Anal.Biochem. 34, 595-598, 1970) überwacht. Im Falle eines positiven Tests wird die entsprechende Kupplungsstufe mit je einem Aequivalent von Fmoc-Aminosäure, DCC und HOBt während einer Stunde wiederholt. Wenn der Kaiser- Test dann immer noch positiv ist, werden die verbliebenen freien Aminogruppen acetyliert durch eine Behandlung des Harzes mit Essigsäureanhydride-Pyridin (2:1; v/v; 6-7 ml/g) während 10 Minuten, gefolgt von 3 Waschungen mit DMF und CH&sub2;Cl&sub2; von je 1 Minute. Anschliessend an die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe durch Behandlung mit 25% Piperidin in DMF, wie oben beschrieben, wird die nächste Aminosäure gekuppelt.
Die Synthese führt nach Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe zum Nonapeptid-Harz II
Das freie Peptide I wird aus dem Nonapeptideharz II im Anschluss an eine Behandlung in Trifluoressigsäure-Dichlormethan (1:1; v/v) während 3 Stunden erhalten.
Diese Säurebehandlung bewirkt gleichzeitig die Entfernung der auf t-Butyl basierenden Schutzgruppen und die Abspaltung des Peptids vom Harz. Das Harz wird durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird anschliessend im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in t-Butanol-Wasser (1:1, v/v) gelöst. Restliche TFA wird sodann durch Zusatz von Dowex 2 x 8 (OAc)-Ionenaustauscherharz gegen Essigsäure umgetauscht.
Die Lyophilisierung der erhaltenen Lösung ergibt Nonapeptid I (als das Azetatsalz).

Beispiel 2

Synthese von Nonapeptid Derivaten

A. S-acetylthioacetyl derivate

Peptide I wird in DMF-H&sub2;O (2:1, v/v) aufgelöst. Der pH der Lösung wird durch Zusatz von N-Aethyl, N,N-diisopropylamin auf 7,5-8,0 eingestellt. Eine Lösung von 1,2 Aequivalenten N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) in DMF wird sodann zugesetzt. Der pH des Reaktionsgemisches wird durch Zusatz der genannten tertiären Base auf 7,5-8,0 gehalten. Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur wird der pH der Lösung durch Zusatz von Essigsäure auf 5,0 gebracht. Nach Entfernung der Lösungsmittel durch Verdampfen im Vakuum wird der Rückstand mit Aethylacetatäther verrieben. Das Peptidderivat III wird anschliessend in t-Butanol-Wasser (1:1; v/v) aufgelöst und durch Lyophilisieren isoliert.

B. Maleimid-derivat

Die Acylierung der Nα-Aminogruppe in I mit N-Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC, "Piercel") unter Verwendung des in Beispiel 2A beschriebenen Verfahrens ergibt das Maleimid-derivat IV.

C. Bromacetyl-derivat

Die Acylierung der Nα-Aminogruppe in I mit N-Succinimidylbromacetat unter Verwendung des in Beispiel 2A beschriebenen Verfahrens ergibt das Bromacetyl-derivat V.

D. Pyridyldisulfid-derivat

Die Acylierung der Nα-Aminogruppe in I mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP, "Pierce") ergibt das Pydidyldisulfid-derivat VI.

Beispiel 3

Synthese von Gelonin-derivaten

A. Iminothiolan-derivat

Die freien SH-Gruppen werden in Gelonin eingeführt durch Derivatisierung des Toxins mit 2-Iminothiolan (Trauts-Reagens).
Ein 50-facher molar Ueberschuss an 2-Iminothiolan (0.4 M 2- Iminothiolan in 0,1 M Phosphatpuffer vom pH 8,0, welcher 1 mM EDTA enthält; Endkonzentration an 2-Iminothiolan beträgt 5 mmol/l) wird zu 4 ml Geloninlösung (3 mg/ml; 100 umol/l) im obgenannten Puffer zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird während 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Anschliessend wird das Gemisch auf eine Säule aus Sephadex G25 verbracht, welche mit 0,1 M Phosphatepuffer pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, equilibriert wurde, um den Ueberschuss an Reagens und an Reaktionsprodukten von niederem Molekulargewicht zu entfernen. Die Ausbeute dieser Derivatisierungsstufe betrug 92%, und das Toxin enthielt einen Durchschnitt von 1-2 SH-Gruppen pro Geloninmolekül.

B. Pyridyldisulfid-derivat

Pyridyldisulfid (PDP)-Gruppen werden in Gelonin eingeführt durch Auflösen von Gelonin in einem 0,1 M Phosphatepuffer vom pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA (3 g Gelonin/l). Ein 5-facher molarer Ueberschuss an Succinimidyl-pyridyldithio-propionat (40 mM SPDP in Aethanol; Endkonzentration SPDP beträgt 500 mol/l) wird zu 4 ml Geloninlösung (3 g Gelonin/l) in 0,1 M Phosphatpuffer vom pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA zugesetzt und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschliessend wird das Gemisch auf eine Säule aus Sephadex G25 verbracht, die in dem obgenannten Puffer equilibriert wird, um den Ueberschuss an Reagens und die Reaktionsprodukte von niederem Molekulargewicht zu entfernen. Die Rückgewinnung des Toxins betrug 95%, und die Toxinmoleküle enthielten einen Durchschnitt von 1-2 Pyridyldisulfidgruppen pro Geloninmolekül.

Beispiel 4

Bindung des Nonapeptid-derivates an das Gelonin-derivat

A. Bindung von Nonapeptid IV an das Gelonin-iminothiolanderivat

8 ml Geloninderivat-Lösung (1,4 mg/ml) wird bei Zimmmertemperatur mit einem 2,5-fachen molaren Ueberschuss an Nonapeptid IV (Endkonzentration 115 umol/l) während 2 Stunden inkubiert. Der Inkubationspuffer ist ein Phospatpuffer von pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch auf eine Kolonne aus Sephadex G50 verbracht, die mit Inkubationspuffer equilibriert wird, um überschüssiges Reagens und Reaktionsprodukte von niederem Molekulargewicht zu entfernen. 72% Geloninderivat wird in das Konjugat umgewandelt, wie durch SDS-PAGE getestet, wobei die Hauptkomponente ein Geloninmolekül pro Peptid enthält.
Freies Gelonin wird durch Ionenaustauscherchromatographie an Mono Q (0,05 M Tris-puffer, pH 8,0) entfernt. Das Konjugat wird mit 0,5 M NaCl eluiert.

B. Bindung von Nonapeptid VI an das Gelonin-iminothiolan- Derivat.

Die Herstellung des obigen Konjugats wird ausgeführt unter Verwendung des unter A beschriebenen Verfahrens.

C. Bindung des Nonapeptids V an das Gelonin-pyridyldisulphid- Derivat.

Die Herstellung des obigen Konjugats wird durchgeführt unter Verwendung des unter A beschriebenen Verfahrens.

Beispiel 5

Bindung des Nonapeptids III an das Gelonin-Pyridyldisulfid- Derivats.

0,5 ml Geloninderivat (1,4 mg/ml) wird über Nacht bei Zimmertemperatur mit einem 2,5-fachen molaren Ueberschuss an Nonapeptid III (Endkonzentration 115 umol/l) im obgenannten Phosphatpuffer, zu welchem Hydroxylamin zugesetzt wird (10 mM), inkubiert.
Nach Beendigung der Reaktion wird das Gemisch auf eine Sephadex G50-Säule verbracht, die mit Inkubationspuffer equilibriert wird, um überschüssiges Reagens und Reaktionsprodukte von niederem Molekulargewicht zu entfernen. 67% Geloninderivat werden in das Konjugat umgewandelt, wie durch SDS-PAGE nachgewiesen wurde. Freies Gelonin wird durch Ionenaustauscherchromatgraphie an Mono Q (0,05 M TRis-puffer, pH 8,0) entfernt. Das Konjugat wird mit 0,5 M NaCl eluiert.

Beispiel 6

Bindung eines Epitops (RdV&sub1;) bestehend aus 20 Aminosäuren der 65-85 Aminosäuresequenz des 65 kD-Proteins von Mykobakterium Tuberculosis (MT) an Ricin-A.

Das Peptid mit der Sequenz Lys-Thr-Ile-Ala-Tyr-Asp-Glu-Glu- Ala-Arg-Arg-Gly-Leu-Glu-Arg-Gly-Ala-Val-Arg-Asn-Ala-Lys wird in DMF/H&sub2;O (1:2) verdünnt. 0,4 M SPDP in DMF wird zugesetzt (Molares Verhältnis 1:1) und das Gemisch wird während 30 Min. bei Zimmertemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation werden 2 Volumina Aethylacetat zugesetzt, und das Gemisch wird während 5 Minuten in einer Eppendorf- Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit Aether gewaschen und wiederum während 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Niederschlag wird sodann unter Stickstoffgas getrocknet.
Der getrocknete Niederschlag wird in 0,1 M NaP (pH = 7,3) in einem möglichst kleinen Volumen gelöst.
Ricin-A (in 0,1 M NaP pH = 7,3) wird durch Zusatz von 1 M DTT auf eine Konzentration von 10 mM reduziert und das Gemisch während 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Lösung wird sodann über PD 10 in 0,1 M NaP (pH = 7,3) entsalzt.
Das reduzierte Ricin-A wird zu dem SPDP-behandelten Peptid in einem molaren Verhältnis von 1:5 zugesetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur während einer Stunde inkubiert.
Die resultierende Konjugatlösung kann bei 4ºC gelagert werden. Falls notwendig können Verunreinigungen mit einem hohem Molekulargewicht chromatographisch (Fractogel HW 55 (s) in PBS) entfernt werden.

Beispiel 6B

Ein menschliches T-Zellenklon eines RA-Patienten wird mit dem 65 kD-Protein, das antigen spezifisch ist, in Gegenwart von Antigen darbietenden Zellen (APC) stimuliert. Mehrere Konzentrationen an Ricin-A, 65 kD-Ricin-A oder RdV&sub1;-Ricin-A werden zugesetzt. Nach 3 Tagen wird die Proliferation der Zellen gemessen durch Einverleibung von 3H-Thymidin. Die Resultate sind unten dargestellt als Prozentsätze der Einverleibung in stimulierte Kulturen ohne Zusatz von Toxin (Konjugaten).
a und b stellen ein erstes bzw. ein zweites Experiment dar. ug/ml Toxin Ricin-A % Einverleibung Ricin-A-65 kD % Einverleibung Ricin-A RdV&sub1; % Einverleibung
Die LD&sub5;&sub0;-Werte für die oben dargestellten Experimente sind Ricin-A 65 kD-Ricin-A RdV&sub1;-Ricin-A
Wir können daher schliessen, dass das Epitop-Ricin-A-Konjugat stärker toxisch für diese Zellen ist als das Toxin allein oder das Toxin-65 kD-Konjugat.

Beispiel 6C

Die selben Experimente wie in Beispiel 6B werden wiederholt unter der Bedingung, dass keine Antigen darbietenden Zellen zugegen sind und dass die T-Zellen mit IL-2 (Antigen nicht spezifisch) stimuliert werden. Die Resultate sind unten dargestellt. ug/ml Toxin Ricin-A Ricin-A-65 kD Ricin-A-RdV&sub1;
Die durchschnittlichen LD&sub5;&sub0;-Werte sind: Toxin Toxin-65 kD Toxin-RdV&sub1; durchschnittl.
Es kann geschlossen werden, dass die RdV&sub1;-Ricin-A-Konjugate wirksamer sind für die Hemmung der Proliferation von diesem T-Zellenclon.

Beispiel 7

In männlichen Lewis-Ratten wird adjuvante Arthritis induziert durch Mykobakterium Butyricum (100 mg/ml in Paraffinöl).
6 Gruppen von je 5 Ratten werden am Tag 0-5 und am Tag 8-12 mit Injektionen des folgenden behandelt:
Gruppe 1 Placebo
Gruppe 2 65 kD-Ricin-A-Konjugat (siehe Beispiel 6) (1 mg/kg)
Gruppe 3 Peptid I-Ricin-A-Konjugat (siehe Beispiel 5) (0.25 mg/kg)
Gruppe 4 Ricin-A (0.25 mg/kg)
Gruppe 5 65 kD-Protein (0.5 mg/kg)
Gruppe 6 Peptid I (0.01 mg/kg).
Am Tag 22 werden 10 ug 65 kD-Protein in das Ohr injziert. Am Tag 24 wird die Schwellung des Ohrs bestimmt. Von den Resultaten pro Gruppe wird der Durchschnitt berechnet und als Prozentsatz der Schwellung dargestellt. Gruppe % Schwellung
Es kann daraus geschlossen werden, dass das Nichtpeptid- Ricin-Konjugat die DTH (verzögerte Ueberempfindlichkeit - Delayed Type Hypersensitivity) gegen 65 kD-Protein in Ratten hemmt.

Claims

1. Immunotoxin für die Behandlung oder die Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunotoxin ein Epitop enthält, welches durch T-Lymphocyten als charakteristisch für die spezifische Autoimmunerkrankung erkannt wird, oder ein CR-(Cross reactive) Analoges davon enthält, wobei das Epitop oder das CR-Analoge davon an eine cytotoxische Substanz gekoppelt ist.

2. Immunotoxin für die Behandlung oder die Prophylaxe von rheumatoider Arthritis nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop in Gelenkknorpelprotein vorhanden ist.

3. Immunotoxin nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop die Aminosäuresequenz Thr-Ala-Val-Val- Ala-Leu-Glu-Leu-Gln aufweist.

4. Immunotoxin für die Behandlung oder die Prophylaxe von rheumatoider Arthritis nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop im 65 kD-Protein von Mycobakterium enthalten ist.

5. Immunotoxin nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop die Aminosäuresequenz Thr-Phe-Gly-Leu- Gln-Leu-Glu-Leu-Thr aufweist.

6. Immunotoxin für die Behandlung oder die Prophylaxe von Multiple Sclerose nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop in Myelin-Basisprotein vorhanden ist.

7. Immunotoxin für die Behandlung oder die Prophylaxe von Myasthenia Gravis nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop im Acetylcholinerezeptor vorhanden ist.

8. Immunotoxin nach den Patentansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die cytotoxische Substanz ein Ribosomen inaktivierendes Protein ist.

9. Immunotoxin nach den Patentansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die cytotoxische Substanz ein Radio-Isotop ist.

10. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend ein oder mehrere Immunotoxine nach den Patentansprüchen 1 bis 9 als biologisch aktive Komponente.

11. Verfahren zur Herstellung von Immunotoxinen nach den Patentansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop oder ein CR (Cross reactive)-Analoges davon an die cytotoxische Substanz entweder direkt oder über einen Linker gekuppelt wird.