NL7905172A - Protease-produkt met verminderde allergene eigen- schappen. - Google Patents

Description

y ^ * y * _ « _ N.O. 27.806 NOVO INDUSTBI A/S, te Bagsvaerd, Denemarken.

Protease-produkt met verminderde allerg ene . eigenschappen.

Be onderhavige uitvinding heeft betrekking op een pro-tease-preparaat afkomstig van een Bacillus licheniformig met aanzienlijk verminderde allerg-ene eigenschappen en geschikt als een handelsprotease-produkt, bijvoorbeeld voor het mengen in was-middelpreparaten, zoals waspoederpreparaten voor huishoudelijk ge- 5 bruik.

Wasmiddel-protease-preparaten uit de handel worden gewoonlijk verkregen door het kweken van geselecteerde stammen van Bacillus licheniformis. De protease wordt extracellulair voortgebracht door het microorganisme en een protease-concentraat wordt 10 vervolgens uit de cultuurvloeistof gewonnen, bijvoorbeeld door precipitatie met zouten en/of oplosmiddelen. De opwerkmethoden kunnen op een zodanige wijze worden uitgevoerd, dat nagenoeg geen protease-activiteit achterblijft in de cultuurvloeistof. Echter is de winningsmethode niet bijzonder specifiek met betrekking tot het 15 protease en dientengevolge zal het protease-concentraat gewoonlijk cultuurvloeistofbestanddelen bevatten anders dan het enzym*

Ter bereiding van een wasmiddel-protease-produkt uit de handel, zoals ALCAIiASE geleverd door NOVO INDUSTBI A/S, Denemarken (ALCA-LASE is een geregistreerd handelsmerk) wordt het protease-concen- 20 traat vervolgens gemengd met een inert vulmateriaal en de hulpmiddelen, die dienen ter bereiding van een protease-produkt met een vooraf bepaalde proteolytische activiteit met een laag stof-gehalte.

Verreweg de meest overheersende proteolytische compo- 25 nent van protease-produkten uit de handel afkomstig van Bacillus licheniformis, zoals ALCALASE, is geïdentificeerd als subtilopep-tidase A (EC 5·^.21.1Α·), hierna subtilisine genoemd. Dit enzym, dat gewonnen kan worden uit het handelsprodukt in gezuiverde en 790 5 1 72 • 2 - ft' ·* , gekristalliseerde vorm is zeer gedetailleerd gekarakteriseerd en bleek te behoren tot dezelfde groep van zogenaamde serine-prote-asen zoals trypsine en chymotrypsine. De enzymnomenclatuur zinspeelt op het feit, dat oorspronkelijk de microbiële bron van AICALASE is geklassificeerd als B. subtilis. Echter moet nu alge- 5 meen aanvaard worden, dat het AICALASE voortbrengende micro-organisme B. lioheniformis. is.

Nagenoeg alle proteïnen, met inbegrip van industriële enzymen, vertonen allergene eigenschappen van variërende potentie, afhankelijk van het individuele proteïne. Een aanzienlijk aller- 10 geen effekt van protease-preparaten afkomstig van Bacillus lichë-niformis werd ervaren vroeg na hun commerciële introduktie en sindsdien is een der gelijk effekt door de techniek beschouwd als een inherent nadeel verbonden met het gebruik van de protease-produkten. 15

Tot dusverre zijn pogingen voor het minimaliseren van het voortvloeisel van hypergevoelige reacties onder werknemers en gebruikers alleen gericht op het verschaffen van deeltjesvormige, bijvoorbeeld granulaire of ingekapselde, prptease-produkten met gering stofgehalte om het risico van blootstelling aan het pro te- 20 ase, zowel bij werknemers in de wasmiddel-enzym- en waspoe der-fabrieken en gebruikers van huishoudwaspoeders te verminderen.

Het succes van deze pogingen is gedeeltelijk bewezen door het voortgezette, ruime huishoudelijke gebruik van wasmiddel-enzym— bevattende waspoe ders. 25

Het is echter eveneens bekend, dat de ontwikkeling van allergêne*ky reacties zeer onvoorspelbaar en grillig kan zijn.

Derhalve blijft er nog een behoefte aan een commercieel protease— i preparaat met allergene eigenschappen, die aanzienlijk zijn af-gezwakt in vergelijking met de tot dusverre bekende preparaten. 30

Het is een oogmerk van de onderhavige uitvinding een B.lioheniformis protease-produkt te verschaffen, dat in allergene reacties is afgezwakt.

Het is een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding een industrieel uitvoerbare werkwijze te verschaffen ter berei- 35 ding van een produkt met een verminderd aller ge en vermogen.

7905172 s * ti 3 -

Het bereiken van deze oogmerken is gebaseerd op bepaalde waarnemingen met betrekking tot de bestanddelen van prote-ase-handelspreparaten en op hun eigenschappen.

Recent gepubliceerde onderzoekingen met behulp van kwalitatieve (evenwel sterk gevoelige) immunoelektroforese (bijvoor- 5 beeld volgens Grabar-Williams, zie R. Verbruggen c.s.» Biochim.»

Biophys, Acta, 365 (197*0, 108-114) wezen erop» dat in de handel verkrijgbare protease-produkten, in het bijzonder ALCALASE, antigeenachtig heterogeen zijn.

In daarop volgende onderzoekingen gepubliceerd door 10

Verbruggen (Biochem. Journal» 151 (1973)» 1*0-155)» onder toepassing van de techniek van kwantitatieve» gekruiste agarose gel immunoelektroforese» werd gevonden» dat de voornaamste protease-component van ALCALASE, bestaande uit een groep subtilisine-iso-enzymen» vergezeld gaat van een ondergeschikte proteïne-compo- 15 nent» die antigeenachtig verschilt van de hoofdprotease-component.

Eén henadering in de richting van een verdere opheldering van de samenstelling van protease-handelspreparaten» die eveneens toepasbaar is op een preparatieve laboratoriumschaal voor het fraktioneren van dergelijke preparaten, is.het onderwer- 20 pen van het protease-concentraat, gewonnen uit de cultuurvloei-stof, aan ionenuitwisselingschromatografie. Zo werden bijvoorbeeld 30 g B. licheniformis protease-concentraat aan een chroma-tografische behandeling onderworpen over een kolom (5 x 35 cm) carboxymethylcellulose (CMC, 500 g), op 4°C gehouden en in even- 25 wicht gebracht met een buffer met een pH van 6,5, bestaande uit 0,005 nol tris(hydroxymethyl)aminomethaan (THIS) maleaat en 0,002 mol calciumacetaat. De eluering werd uitgevoerd met dezelfde buffer, onder toepassing van een lineaire natriumchloride-gradient na de verschijning van de frontpiek. De optische dicht- 30 heid van frakties van 20 ml, verzameld bij een stroomsnelheid van 210 ml/uur, werd geregistreerd bij 280 nm. Het chromatogram is opgenomen in fig. 1 van de bijgevoegde figuren.

De voornaamste protease-component gewonnen uit verenigde frakties overeenkomend met piek B van het chromatogram 35 (piek A is de frontpiek), werd geïdentificeerd als subtilisine.

7905172 - k --.

Verondersteld wordt, dat de ondergeschikte protease-component, ' voorgesteld door piek G, identiek is met de ondergeschikte prote-ine-component vastgesteld bij gekruiste immunoëlektroforese (zie hiervoor) en beschreven als antigeenachtig verschillend van de hoofdcomponent, maar niet op andere wijze gekarakteriseerd. Hier- 5 na zal de ondergeschikte protease-component, geïdentificeerd zoals hiervoor, aangeduid worden als "component C". Component C is gebleken ongeveer 5 tot ongeveer 15¾ van het totale proteasege-halte van ALCALASE te vormen.

Als een middel voor verdere karakterisering werden de 10 subtilisine-eomponent en component C, zoals verkregen uit verenigde frakties overeenkomend met de pieken B en C respectievelijk, onderworpen aan agarose gel elektroforese, De elektroforese werd uitgevoerd in een 0,075 molaire natriumbarbitalbuffer met een pH van 8,0 bij 10°C gedurende 60 minuten, onder toepassing van een 15 spanningsgradiênt van 15 V/cm. De monsters werden toegepast als 1 gew./vol.# oplossingen. De elektroferogrammen aangegeven in fig. 2 laten zien dat, onder de proefomstandigheden, subtilisine , (positie I) en component C (positie II) duidelijk verschillende kathodische migratiesnelheden vertonen, - 20

Voorts geven de elektroferogrammen aan, dat, aangezien beide proteasen migreren als bandpatronen, die elk zijn samengesteld uit een hoofdband vergezeld van langzamer migrerende neven-banden, zowel de subtilisine-eomponent als component C veelsoortige isoënzym-systemen zijn (zie Verbruggen). 25

Onderzoekingen over de remming,zoals hierna toegelicht, hebben aangetoond dat, in tegenstelling tot subtilisine, component C een non-serineprotease is,

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de ontdekking, dat het allergsen vermogen van de subtilisine-eomponent 30 aanzienlijk lager is dan het allergëen ·vermogen van component C.

Volgens één aspekt van de onderhavige uitvinding wordt een protease-preparaat verschaft, dat geschikt is voor toevoeging aan waspreparaten, met daarin opgenomen een proteaseconcen-traat afkomstig van licheniformis, met het kenmerk, dat dit 35 protease-concentraat, gestabiliseerd door daarin aanwezige pepti- 790 5 1 72 * ί / 5 - den afkomstig Tan een non-proteolytische cultuurvloeistof, in hoofdzaak vrij is ran non-serineprotease en aanzienlijk afgezwakte allerg.ene eigenschappen vertoont in vergelijking met een non-serine-protease bevattend -protease-concentraat.

Het protease-concentraat zal in het algemeen ten mins- 5 te 99% van zijn proteolytische activiteit ontlenen aan het sub-tilisine-isoënzymsysteem en zal ten minste ongeveer 2% non-pro-teolytisch actieve peptiden daarin bevatten·

Volgens een verder aspekt van de onderhavige uitvinding wordt een werkwijze verschaft ter bereiding van een prote- 10 ase-concentraat, geschikt voor het opnemen in de protease-prepa-raten, die zijn aangepast voor menging met waspreparaten, welk protease-concentraat in hoofdzaak vrij is van non-serineprotease en aanzienlijk afgezwakte allergene eigenschappen vertoont in vergelijking met een non-serineprotease bevattend protease-con- 15 centraat, met het kenmerk, dat een stam van licheniformis, gemuteerd om in hoofdzaak het vermogen ervan tot synthetiseren van andere proteasen dan subtilisine te blokkeren, wordt gekweekt in een voedingsmillieu, dat assimileerbare bronnen van koolstof, stikstof en fosfor bevat, gevolgd door het winnen van het prote- 20 ase-concentraat bevattende subtilisine en van de cultuurvloeistof afkomstige peptiden.

Dergelijke winningsmethoden zijn in de techniek goed tot stand gebracht. Gewoonlijk wordt de cultuurvloeistof gefiltreerd, gecentrifugeerd of op andere wijze geklaard, gevolgd door 25 precipitatie van het protease-concentraat, bijvoorbeeld door toevoeging van'een in water oplosbaar anorganisch zout,zoals natrium-of ammoniumsulfaat of door toevoeging van een met water mengbaar organisch oplosmiddel, zoals ethanol of aceton. Het precipitaat kan volgens gebruikelijke methoden gewonnen worden, zoals filtre- 50 ren of centrifugeren.

Het vochtige protease-precipitaat kan volgens gebruikelijke methoden gedroogd worden, bijvoorbeeld onder een verminderde druk. Een bijzonder doelmatig droogproces op grote schaal, dat sproeidroging combineert met een daarop volgende droogtrap 35 onder de omstandigheden van een gefluïdiseerd bed, is in het Brit- 7905172 , -6 - + e. ♦ .

se octrooischrift 1.360.969 beschreven.

De omzetting van het gedroogde enzym-concentraat tot een deeltjesvormig handelspreparaat van protease met laag stof-gehalte met een vooraf bepaalde activiteit kan volgens verschillende in de techniek bekende methoden worden uitgevoerd. Eén van 5 deze methoden is beschreven in het Britse octrooischrift 1.338.2^9, waarbij in hoofdzaak bolvormige parels worden voortgebracht uit een mengsel van het protease-concentraat en een in water dispergeerbaar, vast* wasachtig bindmiddelprodukt, zoals een niet-ionogeen wasmiddel. Ook wordt verwezen naar het Britse 10 octrooischrift 1.362.365» waarin een werkwijze beschreven wordt» waarbij een bevochtigd voormengsel van het enzymeoncentraat en een vast verdunningsmiddel« zoals natriumchloride* eventueel bij aanwezigheid van een bindmiddel» bijvoorbeeld dextrine en/of poly-ethyleenglycol, wordt geëxtrudeerd en vervolgens tot bolletjes 15 wordt verwerkt, bijvoorbeeld door middel van een inrichting in de handel gebracht onder de handelsnaam MABUMEBIZER en tenslotte gedroogd onder omstandigheden van een gefluïdiseerd bed.

Ook kan een granulair enzymprodukt bereid; worden volgens de werkwijze beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 20 ^.106.991· Een daarop volgend bekledingsproces kan eventueel worden toegepast om verder de stuifeigensch&ppen van het eindprodukt te verminderen. Een bekleding van het deeltjesvormige pro-dukt wordt gewoonlijk uitgevoerd met behulp van een gesmolten was, bij voorkeur polyethyleenglycol, eventueel gevormd door verpoe- 25 dering van het verkregen, beklede produkt met een fijnverdeeld kléurmiddel, bijvoorbeeld TiO^ gemengd met hulpverpoederingsmid-delen.

De onderhavige uitvinding verschaft eveneens mutant-stammen van B^ licheniformis, geblokkeerd met betrekking tot de 30 synthese van component C, terwijl het vermogen om subtilisine te synthetiseren behouden blijft.

Voorts verschaft de onderhavige uitvinding een waspreparaat, dat een werkzame hoeveelheid protease-produkt afkomstig van licheniformis bevat, dat in hoofdzaak vrij is van pro- 35 tease-component C, 7905172 - 7 t *

Kaast het enzym zal het commerciële waspoederpreparaat van de onderhavige uitvinding in het algemeen de volgende bestanddelen bevatten: (a) ten minste één oppervlakactief middel, dat anionogeen, niet- ionogeen of amfoteer kan zijn, of een in water oplosbare zeep. 5

Gewoonlijk wordt een anionogeen oppervlak-actief middel (bijvoorbeeld een lineair alkylarylsulfonaat) gebruikt gemengd met een niet-ionogeen oppervlak-actief middel (bijvoorbeeld een alkylfenylpolyglycolether) in hoeveelheden van respectievelijk 5-30 en 1 - 5 gew.$, betrokken op het waspreparaat. 10 (b) Eén of meer builders, bij voorkeur met een begeleidende, se- questrerende funktie. Natriumtripolyfosfaat, natriumcitraat, natriumsilicaat en zeolieten zijn voorbeelden van dergelijke verbindingen, die gewoonlijk 10 - 70 gew.$ van het wasmiddel-preparaat uitmaken. 15 (c) Een bleekmiddel, bij voorkeur een peroxyverbinding zoals na-triumperboraat, gewoonlijk opgenomen in een hoeveelheid tot 30 gew.$ van het preparaat.

(d) Hulpmiddelen, zoals carboxymethylcellulose, optische bleekmiddelen en parfums. Desgewenst wordt een pH regelend middel 20 toegevoegd om een pH van het wasmilieu te geven binnen het trajekt van 8,0 - 10,5.

Het deeltjesvormige protease-preparaat van de uitvinding wordt toegevoegd in een berekende hoeveelheid om een prote-ase-activiteit te geven van ten minste 0,1 Anson-eenheden (AU, 25 zie hierna), bij voorkeur 0,5 - 2,5 AU per 100 g waspreparaat.

Desgewenst kan de rest tot 100$ bestaan uit een anorganische vulstof, bij voorkeur natriumsulfaat.

Vloeibare wasmiddelpreparaten kunnen bereid worden uit enzymsuspensies, bij voorkeur in niet-waterbevattende milieu’s. 30

Gewoonlijk kunnen dergelijke suspensies bestaan uit een suspensie van een fijngemalen protease-concentraat in een vloeibaar, niet-ionogeen oppervlak-actief middel, bijvoorbeeld Tergitol 15 S 9 of een mengsel van dergelijke oppervlak-actieve middelen. Gewoonlijk zal de suspensie tevens één of meer anorganische vulstoffen 35 bevatten, zoals fijngemalen natriumchloride, eventueel gemengd 790 5 1 72 - 8- met een stabilisator voor de suspensie, bijvoorbeeld gerookt si-liciumdioxide (Aerosil 200). Tergitol en Aerosil zijn handels» merken.

De proteasesuspensie van de uitvinding wordt in een berekende hoeveelheid toegevoegd om een protease-activiteit te ge- 5 ven van ten minste 0,1 AU, bij voorkeur 0,5 - 2,5 AU, per 100 g vloeibaar wasmiddelpreparaat.

De waspreparaten kunnen op de gebruikelijke wijze bereid worden, bijvoorbeeld door de bestanddelen met elkaar te mengen. Ook kan een voormengsel worden bereid, dat vervolgens wordt 10 gemengd met de resterende bestanddelen.

Een gezuiverde kwaliteit subtilisine, bijvoorbeeld een kwaliteit, die gewonnen kan worden uit verenigde frakties, overeenkomend met piek B van het CMC-ionenuitwisselingschromatogram van fig. 1 en met een proteolytische activiteit in een ordegroot- 15 te die 3-5 maal die van het protease-concentraat is, wordt niet beoogd in verband met de praktijk van de onderhavige uitvinding.

De hantering van een dergelijk krachtig protease-concentraat, zal onvermijdelijk het risico van voorkomen, van..lokale irritaties vergroten, in het bijzonder van het ademhalingskanaal en andere 20 slijmvliesachtige membranen, tot een niveau, dat onaanvaardbaar zou kunnen zijn voor werknemers in enzymbereidingsfabrieken.

Voorts is de enzymatische instabiliteit van een derge— lijk gezuiverde, subtilisine-component te hoog om een dergelijk , protease-concentraat met enige geschiktheid als een wasmiddel- 25 enzym te bereiden. Het aanzienlijke verschil in stabiliteit, dat ondervonden wordt tussen gezuiverd enzym en protease-handelspre-paraten is blijkbaar toe te schrijven aan de aanwezigheid in laatstgenoemde van non-enzymatisch actieve cultuurvloeistofbe-standdelen, die het protease stabiliseren. Dergelijke stabilise- 30 rende bestanddelen zijn ten minste ten dele identificeerbaar als kleinere peptiden en aminozuren, in hoofdzaak afkomstig van de autodigestie van het protease tijdens de fermentatieve bereiding ervan. Echter kunnen additioneel stabiliserende cultuurvloeistof-bestanddelen van een niet gespecificeerd karakter eveneens aanwe- 35 zig zijn. Gemakshalve zal hierna de uitdrukking "peptidefraktie" 7905172 -9 - gebruikt worden voor deze non-proteolytische cultuurvloeistofbe-standdelen. Be peptidefraktie wordt geëlueerd tezamen met front-piek At wanneer het protease-concentraat gefraktioneerd wordt op een CMC-ionenuitwisselingskolomt zoals beschreven in verband met fig. 1. 5

Het peptidefraktiegehalte wordt berekend uit de formu- percentage peptidefraktie = ü —j.

waarin proteïne N bet stikstofgehalte is van een trichloorazijn- 10 zuurprecipitaat bereid onder genormaliseerde omstandigheden.

Volgens een voorkeurs-uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding ligt de proteolytische activiteit van het protease-concentraat in het trajekt van 2 - 20$ bij voorkeur 5-15$ Anson-eenheden (AU) per gram, terwijl het peptidefraktiegehalte 15 afkomstig van de cultuurvloeistof daarin in het trajekt van 2 -15 gew.# ligt.

In principe zou het oogmerk van het verschaffen van een werkwijze ter bereiding van een protease-produkt$ dat in . hoofdzaak vrij is van component C$ bereikt kunnen worden door al- 20 leen component C uit het protease-concentraat te verwijderen, bijvoorbeeld door middel van gefraktioneerde precipitatie- en/of selectieve extraktiemethoden. Afgezien echter van het feit, dat geen werkwijze van dit type tot dusverre bedacht is, zou een eventuele dergelijke methode vrijwel onvermijdelijk begeleidende ver- 25 liezen insluiten in opbrengst van subtilisine.

Bovendien zouden de kosten, opgelopen bij de uitvoering van de verwijdering van component C, aanzienlijk bijdragen tot de produktiekosten van het uiteindelijke protease-produkt.

De scheidingsbenadering is als een praktische zaak onaanvaardbaar. 50 Eveneens verhindert een onvermijdelijke toename in produktiekosten tot onaanvaardbare niveau's elke methode, die de verwijdering van component C omvat, bijvoorbeeld door chromato-grafie op een CMC-ionenuitwisselingskolom, zoals toegelicht in fig. 1, volgens welke methode de verwijdering van component C 55 eenvoudig zou kunnen worden uitgevoerd door de elutie stil te la- 7905172 - IQ- ten houden kort voor het verschijnen, van piek C van het chromatogram.

De hiervoor beschreven hindernissen ter bereiding van een minder allerg.ëen .. protease-concentraat zijn nu overwonnen, doordat een werkwijze is gevonden, die in hoofdzaak component C 5 bij het microbiologische niveau elimineert door toepassing van een stam van licheniformis, die gemuteerd is om in hoofdzaak de synthese van component C te blokkeren, terwijl volledig het vermogen tot synthetiseren van de subtilisine-component behouden blijft. Cultures van drie dergelijke mutantstammen van B. licheni- 10 formis zijn gedeponeerd bij het Northern Regional Research Center,

Peoria, Illinois, U.S.A. en hebben de volgende nummers toegewezen gekregen: NRRL B-11301, NRRL B-11302 en 15 NRRL B-11303.

Mutatiemethode.

Mutatie van licheniformis voor het blokkeren van de synthese van component C, terwijl het vermogen tot synthetiseren van subtilisine behouden blijft, werd op de volgende wijze uitge- 20 \ voerd. Logaritmisch groeiende cellen op een medium, dat TRTPTICASE (2#); gistextrakt (0,590? FeCl2, éHgO (0,0007¾); MnCl2, kE20 (0,0001¾) en MgSO^, 7H20 (0,0015¾) bij een pH van 7»3 bevat en dat op een temperatuur van 30°C werd gehouden, werd na 5 uren gewonnen en gesuspendeerd in TRXS-maleaatbuffer met een pH van 5»7. 25 N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine werd toegevoegd tot een concentratie van 100 yug/ml en de suspensie werd 30 minuten geincubeerd in een waterbad bij 30°C. Na deze behandeling bedroeg de overlevingsgraad 0,1¾.

De cellen werden enkele malen met de buffer gewassen 30 en vervolgens uitgespreid op agarplaten, die bereid waren met het hiervoor vermelde cultuurmilieu.

Selectie van mutanten.

Na incubatie bij 37°C gedurende 2 dagen werden weggenomen agarschijven, die elk een mutantkolonie droegen, op een 35 glasplaat opgesteld in hexagonale patronen, waarna een 1¾ agarose- 790 5 1 72 κ * *’ 11" g«l op de plaat verd gegoten. In een opening, centraal uitgesneden in elke zeshoek, verd een monster van component C specifiek antiserum geplaatst. De plaat verd na een incubatie van 1 dag bij 30°C geïnspecteerd, Mutantkolonies, die geen precipitatielij-nen vertoonden verden geselecteerd, gezuiverd door subcultive- 5 ring en vervolgens in achudflessen voortgeplant.

Verdere karakterisering van component C.

Aminozuuranalyse.

De benaderde aminozuursamenstelling van component G vordt hierna aangegeven. De bepalingen zijn ondervorpen aan de 10 gebruikelijke fout van + 10# van de aangegeven vaarden. Ter vergelijking zijn overeenkomstige literatuurgegevens voor subtili-sine zelf tussen haakjes aangegeven.

. Lys: 10 (9); Hiss 8 (5)? Arg: 11 (*0; Aspi 22 (28);

Glui 15 (12)5 Thr: 33 (19); Seri 33 (32)5 Pro: 13.(9)5 Gly: 37 15 (35)5 Alai 17 (Vl)5 Val: 16(31); Leu: 7 06)? Ileu: 15 (10)5 Phe: 6 (4)5 Tyr: 21 (13)? Cys (1/2): 2 (0)5 Het: 3 (5)? Trp: niet bepaald (1); NH^s 27(25). Totaal aantal aminozuren: 269 (273)» exclusief Trp.

De aminozuursamenstelling van component C blijkt aan- 20 zienlijk te verschillen van die van subtilisine, vaarbij het meest in het oog vallende verschil de aanvezigheid is van de tvee cys-teïneresten (Cys 1/2) in de eerstgenoemde in vergelijking met geen in de laatstgenoemde. Er zijn bepaalde aanwijzingen, dat de cysteïneresten van component C gebonden zijn door een disulfide- 25 brug. De aanvezigheid van een S-S-brug in component C, die een lid is van de groep van Bacillus afgeleide proteasen, zou zeer ongevoon zijn.

Molecuulgewicht.

De aminozuur-samenstellingsgetallen suggeren, dat de 30 molecuulgevichten van component C en subtilisine in hetzelfde gebied liggen (het literatuurgegeven voor de laatstgenoemde is ongeveer 27.300).

Onderzoekingen over de remming.

In tegenstelling tot subtilisine, vordt component C 35 niet geremd door fosforyleringsmiddelen, zoals diisopropylfosfo- 7905172 -12-.

% >**# · -- fluoridaat (DFP) of fenylmethaanaulfonylfluoride (PMSF). Uit deze waarnemingen blijkt» dat component G niet een serineprotease is.

Voorts wijst het feit, dat component C niet geremd wordt door geleringsmiddelen, zoals ethyleendiaminetetraazijnzuur 5 (EDTA) erop, dat het geen metalloprotease is.

Effekt van de pH op de stabiliteit.

Component C vertoont een iagere stabiliteit dan sub-tilisine in het pH-trajekt van 9-10, het algemene pH-interval van wasoplossingen. Blijkbaar verklaart dit ten minste ten dele 10 i het feit, dat de wasraiddelenzymeigenschappen van component C merkbaar slechter zijn dan die van subtilisine.

Allergologische onderzoekingen.

Vorming van IgE-antilichamen in konijnen.

Oplossingen (0,5 ml) van elk van de te onderzoeken pro- 15 dukten subtilisine (15,1# proteïne N) en component C (13,7# proteïne N) tezamen met Alhydrogel (Superfos, Kopenhagen, 0,5 ml van een 1,3-procents emulsie, berekend als als toevoegsels werden subcutaan geïnjekteerd in konijnen (2b dieren per groep).

De doseringen van de twee immunogenen onder vergelijking, uitge- 20 drukt in ^,ug proteïne N, waren dezelfde. Vergelijkihgen werden uitgevoerd bij drie doseringsniveau's, respectievelijk overeenkomend met 0,015, 0,15 en 1*5 ^ug proteïne N.

Van de dieren werd bloed afgenomen op de dertiende dag na de eerste immunisering en de dieren werden de volgende dag op- 25 nieuw geïmmuniseerd. Dit schema werd elke veertiende dag tijdens de gehele proefperiode van 139 dagen herhaald.

Passieve cutane anafylaxis (PCA) proef.

De proef werd uitgevoerd volgens de methode beschreven door N.J. Zvaifler c.s», Journal of Experimentel Medicine 130 30 (1969) 907. Intradermale injekties van 0,2 ml totaal serum of serumverdunningen werden uitgevoerd in de pas geschoren ruggen van konijnen met een gewicht van ongeveer 2500 g. De proeven werden in triplo uitgevoerd. Na een sensibiliseringsperiode van 72 uren werden de dieren intraveneus uitgedaagd met antigeen + 50 mg 35

Ewans Blue (Merck) opgelost in 5 ml zoutoplossing. De uitdagings- 7905172 % fc ff s - 13 dosering kwam orereen met 750 yug proteïne N per dier.

De dieren verden na 30 - 60 minuten opgeofferd met een overdosering Nembutal en de verkregen letsels verden gemeten en geregistreerd.

Bij een doseringsniveau van immunogeen overeenkomend 5 met 0,15 yUg proteïne N subcutaan verschenen de positieve titers voor component C aanzienlijk vroeger en in een aanzienlijk grotere hoeveelheid van de dieren dan dit deed voor subtilisine.

Bij hetzelfde doseringsniveau was de som van titerni-veau's opgewekt door component C bij tien aderlatingen aanzien- 10 lijk groter dan die van subtilisine (P < 0,02). Eveneens bereikte component C aanzienlijk hogere maximum-titers (P < 0,02).

Gemodificeerde Anson-hemoglobine-methode voor de bepaling van proteolytische activiteit.

Bij de Anson-hemoglobine-methode voor de bepaling van 15 proteolytische activiteit wordt gedenatureerd hemoglobine onder genormaliseerde omstandigheden verwerkt. Het niet verwerkte hemoglobine wordt neergeslagen met trichloorazijnzuur (TCA) en de hoeveelheid in TCA oplosbaar produkt wordt bepaald met het Foline-Ciocalteu fenolreagens. 20 Eén Anson-eenheid (AU) is de hoeveelheid enzym, die onder genormaliseerde reactie-omstandigheden hemoglobine verwerkt bij een zodanige beginsnelheid, dat er per minuut een hoeveelheid in TCA oplosbaar produkt wordt vrijgemaakt, die dezelfde kleur met fenolreagens geeft als 1 milliequivalent tyrosine. 25

De standaard reactie-omstandigheden zijn als volgt: temperatuur 25°C; reactietijd 10 minuten; pH 7«5.

Voor verdere verwijzing zie: M.L. Anson, Journal of General Physiology 22 (1939)« 79-89? O.Folin en V. Ciocalteu,

The Journal of Biological Chemistry 73 (1927)« 627-636·.· 30

Voorbeeld I.

Elk van de B^ licheniformis-stammen NRHL B-11301, B-11302 en B-11303 werden onder de volgende omstandigheden gekweekt:

Van schotten voorziene Erlenmeyer-kolven van 500 ml 35 werden samengesteld met in elk daarvan 100 ml substraat; De vol- 7905172 % - legende substraatsamenstellingen werden gebruikt:

Substraat 1 Substraat 2 Substraat 3 gew./vol.# gew./vol.# gew.^vol,# aardappelzetmeel 10 12»5 10 sojameel ,5 7 »5 2 5 Νη2ΗΡ0^.12 H20 1 0,5 1

Pluronic L-61 0,01 0,01 0,01

Tween 80 1 gerstzetmeel 5 natriumcaseïnaat 1 1® BAN 120 L 0,01 0,01 0,01.

Pluronic L-61 is een niet-ionogeen oppervlak-actief middel in de handel gebracht door Wyandotte Corporation, Michigan, U.S.A. '

Tween 80 is een polyoxyethyleen-sorbitanmonooleaat in 15 de handel gebracht door Atlas Chemical Industries, Delaware, U.S.A.

BAN 120 L is een α-amylase handelsprodukt, verkregen door fermentatie van Bj_ subtilis en geleverd door NOVO INDUSTfil A/S, Denemarken. 20

De media .werden in 50 minuten van 50tqt90°C verwarmd, vervolgens nogeens 80 minuten tot 121°C verhit en daarna gekoeld.

De kolven werden geinoculeerd met de B^ licheniformis-stam en vervolgens op een roterende schudtafel bij 2^0 omwentelingen per minuut 5 dagen bij 30°C geschud. De protease-activi- 25 teit werd daarna bepaald volgens de Anson-methode. De volgende resultaten werden verkregen (Aïï/kg):

Stam Substraat 1 Substraat 2 Substraat 3 NREL B-11301 160 219 155 NHEL B-11302 158 200 155 30 NRBL B-11303 161 192 150.

Monsters van de cultuurvloeistoffen, zoals hiervoor verkregen onder toepassing van substraat 2 werden 30 minuten bij 15*000 6 gecentrifugeerd. De bovenstaande laag werd afgescheiden en evenmatige hoeveelheden van 50 ml werden tot 37°C verwarmd. 35 7905172 •V ·*:= ·9 - 15 - 15 g Watervrij natriumsulfaat werden aan elke portie toegevoegd en het mengsel werd 30 minuten geroerd. Het neerslag werd vervol· gens gefiltreerd en onder een verminderde druk gedroogd.

De verkregen protease-concentraten bezaten de volgende eigenschappen: 5

Stam Proteolytische % proteïne- % peptide- activiteit gehalte fraktie Aïï/g B-11301 11 3½ 8 B-11302 10 35 10 10 B-11303 10 31 6.

Een monster van 5 S van het produkt verkregen uit B. licheniformis NHBL B-11301 werd aan een chromatografische behandeling onderworpen over een kolom van 25 x 23»5 cm van 130 g CMC onder omstandigheden, die analoog zijn aan de hiervoor beschreven 15 omstandigheden. Het chromatogram werd verkregen door registratie van OD^gQ van frakties van 20 ml verzameld bij een stroomsnelheid van k5 ml/uur.

Bovendien werd een 3-gew.procents oplossing van hetzelfde concentraat onderworpen aan een agarose-gelelektroforese 20 volgens de hiervoor beschreven methode, 1-Gew./vol.-procents oplossingen van subtilisine en component C werden als referenties toegepast. Het chromatogram en de elektroferogrammen, aangegeven in de fig. 3 en laten zien* dat het enige protease* dat aantoonbaar is in het protease-concentraat (fig. b* positie III) 25 subtilisine (positie II) is, terwijl component C (positie I) afwezig is.

Voorbeeld II.

B. licheniformis-stam HBBL B-11301 werd gekweekt op voedingsagar gedurende 1-2 dagen bij 37°C in een kolf volgens 30

Fernbach. De cultuur werd vervolgens voortgeplant in een roestvrij stalen fermentatiereservoir, dat het hierna beschreven fer-mentatiesubstraat bevatte. Na 2b uren bij 3^°C onder beluchting en roeren werd een dichte cultuur verkregen. Deze cultuur werd vervolgens gehruikt om het enzymproduktiereservoir van kweekmate- 35 riaal te voorzien. De kweekcultuur (35 1) werd overgebracht naar 7905172 - 16- een roestvrij stalen fermentatiereservoir, dat het hierna beschreven fermentatiesubstraat bevatte» De fermentatie-o'mstandigheden voor zowel het kweekreservoir als het hoofdreservoir waren als volgt: totaal reservoirvolnmei.550 1 5 substraatvolume : 350 1 beluchtingssnelheid : 300 1/min.

roerbehandeling : ^00 omwentelingen per minuut met een tur- bineroerder, die uit zes bladen bestaat met een diameter van 28 cm 10 temperatuur : 3^°C.

Substraatsamenstelling: aardappelzetmeel i 100 g/1 sojameel 50 g/1

Na2HP0^.12H20 10 g/1 15 ' BAN 120 L 0,1 ml/1

Pluronic L-61 1 g/1.

Substraatbereiding:

Het substraat werd in 50 minuten van 5995°C verwarmd en vervolgens 60 minuten bij 121°C gesteriliseerd. 20

Na een fermentatieduur van 50 uren bedroeg de prote-ase-activiteit 160 Aü/kg, zoals bepaald volgens de gemodificeerde Anson-methode. De fermentatievloeistof werd vervolgens tot ongeveer 5°C gekoeld.

ajj, 25

Een monster van de cultuurvloeistof van de hiervoor beschreven fermentatie werd 30 minuten bij 15.000 G gecentrifugeerd. De bovenstaande laag werd afgescheiden en vervolgens tot 37°C verwarmd. 320 g/1 Watervrij natriumsulfaat werden toegevoegd en het mengsel werd 30 minuten geroerd, terwijl de temperatuur op 30 37°C werd gehouden. Daarna wérd het precipitaat gefiltreerd en onder een verminderde druk gedroogd.

Het verkregen protease-concentraat‘bevat de volgende eigenschappen: proteolytische activiteit 8 Aü/g 35 proteïnegehalte 20% 790 5 1 72 - 17" peptidefraktie k%.

Chromatografie over CMC an agarosegel-elektroforese, uitgevoerd op dezelfde wijze zoals beschreven in voorbeeld I» toonde aan* dat het protease-produkt vrij was van component C* terwijl het enige waarneembare protease subtilisine was. 5 b^

Een tweede evenmatige hoeveelheid van de hiervoor vermelde cultuurvloeistof werd 30 minuten bij 15.000 Q gecentrifu-geeid De bovenstaande laag werd vervolgens afgescheiden. 3 Vol.dln aceton werden langzaam en onder krachtig roeren aan de bovenstaan- 10 de laag toegevoegd. Het verkregen neerslag werd vervolgens gefiltreerd en onder een verminderde druk gedroogd.

Het verkregen protease-concentraat bezat de volgende eigenschappens proteolytische activiteit 6 AtF/g 15 proteïnegehalte 15¾ peptidefraktie 3 %·

Chromatografie over CMC en agarosegel-elektroforese* uitgevoerd op dezelfde wijze zoals in voorbeeld I beschreven, toonde aan, dat het protease-produkt vrij was van component C, 20 terwijl het enige bepaalbare protease -subtilisine was.

Voorbeeld III.

Een deeltjesvormig protease-handelsprodukt werd op de volgende wijze bereid:

Een voormengsel bestaande uit enzymeoncentraat 25 (8 AIT/g, 25 gew.#), bereid zoals beschreven in voorbeeld Ila, polyvinylpyrrolidon (2#), polyethyleenglycol 6000 (6¾) en natrium-chloride (67¾) werd met 8¾ water bevochtigd» geëxtrudeerd door een zeef met openingen van 0,9 mm en vervolgens tot bolletjes verwerkt zoals beschreven in het Britse octrooischrift 1.362.365. 30

Het deeltjesvormige produkt werd op een gefluïdiseerd bed gedroogd tot een vochtgehalte van ongeveer 0,5^ gevolgd door bekleding met 4 polyethyleenglycol en tenslotte gepoederd met een mengsel (11¾) van titaandioxide en magnesiumsilicaat. Het uiteindelijke enzympreparaat bezat een activiteit van 1,7 AU/g. 35 7905172 -¾ . V --.

- 18-

Voorbeeld IV.

Een granulair protease-produkt werd in hoofdzaak bereid zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.106.991.

Fijngemalen protease-concentraat (9 AU/g, 25-gew.#, bereid volgens voorbeeld Ha, titaandioxide {2.%), cellulosepoe- 5 der (10#), CEPO S20 (The Swedish -Cellulose Powder en. Wood Flour Mills, Ltd.) en fijngemalen natriumchloride (62$) werden gemengd in een menginrichting volgens LÖdige, zoals beschrevenin voorbeeld 1 van het hiervoor vermelde Amerikaanse octrooischrift.

Het droge mengsel werd besproeid met een 4,5-procents 10 oplossing van polyvinylpyrrolidön K 30 in water (1 gew.# van het totale mengsel) dat dienst doet als bindmiddel. De granulering van het produkt werd uitgevoerd in de menger volgens Lodige, gevolgd . door drogen van het granulaire produkt tot een' vochtgehalte beneden 3%. Tenslotte werden de granules gezeefd en daarna be- 15 kleed met polyethyleenglycol en verpoederd volgens de in voorbeeld III beschreven methode. Het aldus verkregen protease-prepa-raat bezat een activiteit van 2 AU/g.

Voorbeeld V,

De deeltjesvormige protease-produkten bereid volgens 20 de voorbeelden III en IV werden gebruikt voor de bereiding van waspoederpreparaten met de volgende samenstellingen: a» Bestanddeel Hoeveelheid in gew.# NANSA S 40 S 10

Berol WASC 4 25 zeep 3 natriumtripolyfosfaat 30 natriujöperboraat 25 natriumsiliffc’aat 6 natrium CMC .1 30 optische bleekmiddelen, parfums 0,5 pH regelende middelen indien noodzakelijk protease-produkt (1,5 - 2,0 AU/g) 0,8 natriumsulfaat, rest tot 100 35 790 5 1 72 *r * * * 19 b. Bestanddeel Hoeveelheid in geir.cg NANSA SlOS 10

Berol NASC 4 zeep ' 3 natriumtripolyfosfaat 15 5 SASIL 15 natriumperboraat 25 natriumsilicaat 6 natrium CMC 1 optische bleekmiddelen, parfums 0,5 10 pH regelende middelen indien noodzakelijk protease-produkt (1,5 - 2,0 AU/g) 0,8 natriumsulfaat, rest tot 100» NANSA S kO S is een natriumalkylbenzeensulfonaat, op basis van “zacht” volledig biologisch afbreekbaar alkylaat in 15 poedervorm (Marchon Ltd).

Berol WASC is een niet-ionogene alkylfenylpolyglycol-ether (Berol A/B).

SASIL is een natriumaluminiumsilicaatzeoliet type A met de formule Na12(Al02')12(Si02)12.27H20 (Degussa). 20 790 5 1 72

Claims (8)

1. Protease-preparaat, geschikt voor het mengen met waspreparaten met daarin opgenomen een protease-concentraat afkomstig van licheniformis, met het kenmerk, dat het protease-concentraat, gestabiliseerd door daarin aanwezige 5 peptiden afkomstig van een non-proteolytische cultuurvloeistof, in hoofdzaak vrij is van non-serineprotease en aanzienlijk afge-zwakte allergsne eigenschappen vertoont in vergelijkihg jnet een non-serineprotease bevattend protease-concentraat.

2. Preparaat volgens conclusie 1, m e t h e t 10 kenmerk, dat ten minste 99# van de proteolytische activi- téit van het daarin opgenomen protease-concentraat afkomstig is van het subtilisine isoënzymsysteem.

3. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het protease-concentraat, daarin opgenomen 15 ten minste 0,5, bij voorkeur 2-15 gew.# peptiden afkomstig van een non-proteolytische cultuurvloeistof bevat. k* Preparaat volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat de proteolytische activiteit van het daarin opgenomen protease-concentraat in het trajekt van 2 - 20, bij 20 voorkeur 5 - 15» Anson-eenheden per gram ligt.

5. Werkwijze ter bereiding van een protease-concen traat, dat geschikt is voor opname in de protease-preparaten, aangepast voor het mengen in waspreparaten, waarbij het protease-preparaat in hoofdzaak vrij is van non-serine-protease en aan- 25 zienlijk afgezwakte allerg.ene. - eigenschappen vertoont in vergelijking met een non-serine-protease bevattend protease-concentraat, met het kenmerk, dat men een stam van B. licheniformis, gemuteerd tot het in hoofdzaak blokkeren van het vermogen ervan andere proteasen dan subtilisine te synthetiseren, 30 kweekt in een voedingsmiddelmilieu, dat assimileerbare bronnen van koolstof, stikstof en fosfor bevat, en vervolgens het protease-concentraat, dat subtilisine en peptiden afkomstig van de cultuurvloeistof bevat, wint.

6. Werkwijze volgens conclusie 5» net het 35 kenmerk, dat men de gemuteerde B^ licheniformis-stam se- 790 5 1 72 « ·ί· ? lecteert uit stammen, die aangeduid zijn met de deponeringsnum-mers NBBL B-11301, B-11302 en B-11303.

7. Een B^ licheniformis-stam, gemuteerd om in hoofdzaak het -vermogen ervan tot synthetiseren van non-serine-protease te blokkeren, terwijl het vermogen ervan subtilisine te syntheti- 5 seren behouden blijft.

8. Stam volgens conclusie 7* met het kenmerk, dat de stam gekozen is uit gedeponeerde stammen met de nummers NBBL B-11301, B-11302, en B-11303*

9. Waspreparaat, gekenmerkt door de aanwe- 10 zigheid van een werkzame hoeveelheid van het protease-preparaat volgens conclusie 1. ****** < 7905172