CH642395A5 - Proteasen enthaltende zubereitungen zum einsatz in waschmitteln. - Google Patents

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CH642395A5
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protease
subtilisin
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licheniformis
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CH620479A
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Peter Tang
Grethe Nielsen-Christophersen
Keith Gibson
Knud Aunstrup
Hans Erik Schiff
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Novo Industri As
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Description

Diese Erfindung betrifft eine Protease-Zubereitung, die von Bacillus licheniformis herstammt. Diese Zubereitung zeigt wesentlich reduzierte allergenische Eigenschaften und ist daher sehr gut geeignet als kommerziell verwertbares Pro-teaseprodukt. Beispielsweise ist die Zumischung der genannten Zubereitung in Wasch- und Detergensmittel für Hauswäsche sehr gut möglich.
Kommerzielle Protease-Zubereitungen zum Gebrauch in Waschmitteln werden heute normalerweise mittels Kultivierung von ausgewählten Stämmen des Bacillus licheniforms erhalten. Die Protease wird dabei extrazellulär durch die Mikroorganismen synthetisiert. Das Protease-Konzentrat wird anschliessend aus dem Zuchtmedium gewonnen. Dies geschieht beispielsweise mittels Aussalzung und/oder durch Lösungsmittel. Die Reingewinnung des Produktes kann so ausgeführt werden, dass im Kulturmedium praktisch keine Proteaseaktivität verbleibt. Hingegen sind die genannten Gewinnungsmethoden nicht sehr spezifisch, was die eigentlichen Proteasen des erhaltenen Produktes betrifft. Daher enthalten solche Proteasekonzentrate normalerweise neben den gesuchten Enzymen auch andere Bestandteile der gezüchteten Produkte. Um von den genannten Proteasekon-zentraten dann ein kommerziell verwertbares Proteasepro-duktzum Einsatz in Waschmitteln herzustellen, muss dieses noch mit inerten Fülimaterialien und sonstigen Hilfsstoffen gemischt werden. Erst so wird dann ein Proteaseprodukt mit geringer Staubbildung und gewünschter proteolytischer Aktivität erhalten. Ein Beispiel eines solchen kommerziell verwertbaren Produktes ist Alcalase® der Novo Industri A/S, Dänemark.
Die bei weitem wichtigste proteolytische Komponente von Protease-Zubereitungen von Bacillus licheniformis, die kommerziell wie Alcalase verwendet werden, ist die Subtilopepti-dase A (EC 3.4.21.14). Diese Komponente wird im folgenden Subtilisin genannt. Dieses Enzym, welches aus den oben angegebenen Produkten mittels Reinigungs- und Kristallisationsverfahren rein erhalten werden kann, ist in grossem Umfang und detailliert untersucht worden. Es wurde gefunden, dass das Enzym zur gleichen Gruppe gehört wie die sogenannten Serin-Proteasen, wie Trypsin und Chymo-trypsin. Die Enzym-Nomenklatur deutet daraufhin, dass ursprünglich als mikrobielle Quelle für Alcalase der Bacillus subtilis angegeben worden war. Heute wird jedoch allgemein angenommen, dass der Alcalase produzierende Mikroorganismus der B. licheniformis ist.
Praktisch alle Proteine, inklusive die industriell eingesetzten Enzyme, zeigen allergenische Eigenschaften von verschiedenen Stärken, die vom einzelnen Protein abhängen. Ein signifikanter allergenischer Effekt der von Bacillus licheniformis herstammenden Protease-Zubereitungen wurde kurz nach der kommerziellen Einführung der genannten Präparate festgestellt. Seither wurde dieser allergenische Effekt allgemein als eine dem Produkt und dessen Einsatz inhärente Unannehmlichkeit betrachtet.
Um nun Allergien aufgrund der obigen Tatsache zu mini-malisieren, waren die Bestrebungen der Herstellerund Verwender der obigen Produkte praktisch ausschliesslich darum bemüht, das Produkt in einer Form zu haben, welche praktisch keinen Staub abgab. Gesucht waren also Granulate oder Produkte in eingekapselter Form. Dadurch wurde die Berührung vor allem der Benutzer der Produkte mit den eigentlichen Enzymen reduziert. Der Erfolg der genannten Bemühungen wird mindestens zum Teil dadurch demonstriert, das Waschmittel mit Enzymen auch in Haushaltungen immer mehr und in immer mehr Ländern verwendet werden.
Trotzdem ist bekannt, dass allergische Reaktionen immer wieder auftreten und sehr unangenehme Formen annehmen können. Die Entwicklung von kommerziell einzusetzenden Protease-Zubereitungen, welche gegenüber bekannten Präparaten wesentlich abgeschwächte allergenische Eigenschaften aufweisen, bleibt also als wichtige Aufgabe bestehen.
Es ist ein Zweck der vorliegend beschriebenen Erfindung, ein Proteaseprodukt auf der Basis von B. licheniformis zu schaffen, welches abgeschwächte Allergenizität zeigt.
Es ist ein weiterer Zweck der vorliegend beschriebenen Erfindung, einen industriell tragbaren Prozess zu schaffen zur Herstellung der oben genannten Produkte mit einer reduzierten Allergenizität. Die genannten Zwecke werden aufgrund von bestimmten Beobachtungen betreffend die Konstituenten der kommerziellen Protease-Zubereitungen und deren Eigenschaften erreicht.
In neuester Zeit wurden Untersuchungen veröffentlicht, die zeigen, dass kommerziell erhältliche Proteaseprodukte, speziell Alcalase, antigenisch heterogen sind. Die genannten Untersuchungen basieren auf qualitativen, aber hoch empfindlichen Immunoelektrophorese-Untersuchungen [beispielsweise gemäss Grabar-Williams, siehe R. Verbruggen et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 365 (1974), Seiten 108-114].
In folgenden Veröffentlichungen von Verbruggen [Biochem. Journal, Vol. 151 (1975), Seiten 149-155] wurde festgestellt, dass die wichtigste Proteasekomponente von Alcalase, die aus einer Familie von Subtilisin-Isoenzymen besteht, einen kleinerem Proteinanteil aufweist, welches letztere antigenisch sich von der Haupt-Proteasekomponente s
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Ein Schritt weiter zur Feststellung der Zusammensetzung von kommerziell verwerteten Protease-Zubereitungen besteht darin, das genannte Proteasekonzentrat aus dem Zuchtmedium der Ionenaustauschchromatographie zu unterziehen. Das gleiche Verfahren ist übrigens auch für die labo-ratoriumsmässige Aufteilung der Komponenten der genannten Zusammensetzungen verwendbar. Beispielsweise wurde ein Proteasekonzentrat (30 g) auf Basis von B. licheniformis chromatographiert. Die Kolonne (5x35 cm) war mit Carboxymethylcellulose (CMC, 500 g) beschickt. Die Temperatur wurde auf 4°C gehalten und die Chromatographie wurde bei einem pH von 6,5 ausgeführt. Der genannte pH wurde mittels 0,005 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) Maleat und 0,002 M Calciumacetat äquilibriert und gepuffert. Die Eluation wurde mit der gleichen Pufferlösung ausgeführt, wobei ein linearer Natriumchloridgradient entsprechend dem Erscheinen des ersten Peaks angewendet wurde. Die optische Dichte der einzelnen Fraktionen (20 ml), die bei einer Durchsatzgeschwindigkeit von 210 ml/Std. gewonnen wurde, wurde bei 280 nm verfolgt. Das entsprechende Chromatogramm ist in Fig. 1 der eigentlichen Zeichnungen dargestellt.
Die hauptsächliche Proteasekomponente aus den vereinigten Fraktionen entspricht dem Peak B auf dem Chromatogramm (der Peak A ist der Austrittspeak). Das dazugehörige Enzym wurde als Subtilisin identifiziert. Es wird angenommen, dass die kleinere Proteasekomponente, die durch den Peak C dargestellt wird, identisch ist mit der kleineren Proteinkomponente, die mittels der «Cross» Immunoelektrophorese (siehe oben) gefunden wurde. Die genannte kleinere Proteinkomponente wird als antigenisch verschieden von der Hauptkomponente bezeichnet. Weiter wird die Komponente jedoch nicht charakterisiert. Im folgenden wird die genannte kleinerer Proteasekomponente mit Komponente C bezeichnet werden. Die Komponente C macht, wie gefunden worden ist, ungefähr 5 bis 15% des gesamten Proteaseanteils von Alcalase aus.
Als Mittel zur weiteren Charakterisierung wurde eine Mischung aus der Subtilisin-Komponente und aus der Komponente C, wie sie aus den vereinigten Fraktionen, enthaltend die Peaks B und C, erhalten wurden, der Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die Elektrophorese wurde in einem Medium mit 0,075 M Natriumbarbitalpufferbei pH 8,0 ausgeführt. Die Temperatur betrug 10°C und die Elektrophorese dauerte 60 Minuten lang. Angelegt wurde ein Spannungsgradient von 15 V/cm. Die Beispiele wurden als Lösungen mit 1% Gew./Vol. eingegeben. Die entsprechenden Elektropherogramme der Fig. 2 in den beigelegten Zeichnungen zeigen, dass unter den genannten Untersuchungsmethoden Subtilisin (Position I) und Komponente C (Position II) klar getrennte kathodische Migrationsgeschwindigkeiten aufweisen.
Weiter zeigen die genannten Elektropherogramme, dass, da beide Proteasen bandförmige Flecken zeigen, wobei jede Komponente einen Hauptstreifen, begleitet von einem Seitenstreifen mit kleinerer Migrationsgeschwindigkeit, aufweist, beide, sowohl die Subtilisinkomponente wie auch die Komponmente C, aus einem Mehrfach-Isoenzymsystem bestehen (Verbruggen, siehe oben).
Inhibitionsstudien, die weiter unten in der Spezifikation beschrieben werden, haben dann gezeigt, dass, im Gegensatz zu Subtilisin, die Komponente C eine Nicht-Serin-Protease ist.
Die vorliegend beschriebene Erfindung basiert nun auf der Entdeckung, dass die allergenische Potenz der Subtilisin-
Komponente wesentlich kleiner ist als die allergenische Potenz der Komponente C.
Gemäss einem Aspekt dieser Erfindung wird eine Pro-tease-Zusammensetzung geschaffen, die in Waschmitteln eingesetzt werden kann und die ein von B. licheniformis abgeleitetes Proteasenkonzentrat enthält, wobei die genannte Zubereitung dadurch charakterisiert ist, dass das genannte Proteasenkonzentrat, das mittels von nicht-proteolytischen Kulturzüchtungen herstammenden Peptiden stabilisiert ist, im wesentlichen frei ist von Nicht-Serin-Proteasen und, im Vergleich zu einem Nicht-Serin-Proteasen enthaltenden Proteasenkonzentrat, wesentlich verringerte allergenische Eigenschaften aufweist.
Das genannte Proteasenkonzentrat wird im allgemeinen mindestens 99% seiner proteolytischen Aktivität vom Subti-lisin-Isoenzymsystem herleiten. Es wird im allgemeinen mindestens ungefähr 2% nicht-proteolytisch aktiver Peptide enthalten.
Gemäss einem weiteren Aspekt der vorliegend beschriebenen Erfindung wird ein Verfahren geschaffen zur Herstellung eines Proteasenkonzentrates, das geeignet ist zur Verwendung in Proteasen enthaltenden Zubereitungen, die in Waschmitteln eingesetzt werden können, wobei das genannte Proteasenkonzentrat im wesentlichen frei ist von Nicht-Serin-Proteasen und, im Vergleich zu einem Nicht-Serin-Pro-teasen enthaltenden Proteasenkonzentrat, wesentlich verringerte allergenische Eigenschaften aufweist, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Stamm von B. licheniformis, der derart mutiert ist, dass seine Fähigkeit, andere Proteasen ausser Subtilisin zu synthetisieren, im wesentlichen blockiert worden ist, in einem Nährmedium kultiviert wird, welches Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, assimilierbarem Stickstoff und assimilierbarem Phosphor enthält, wonach das derart gebildete Subtilisin und aus der Kulturzucht stammende Peptide enthaltende Proteasenkonzentrat gewonnen wird.
Solche Gewinnungsmethoden sind bekannt. Normalerweise wird das Nährmedium nach Abschluss der Kultivierung abfiltriert, zentrifugiert oder sonstwie in eine klare Lösung übergeführt. Anschliessend wird das Proteasekonzentrat ausgefällt, beispielsweise mittels Zugabe von wasserlöslichen, anorganischen Salzen, wie Natrium- oder Ammoniumsulfat, oder durch Zugabe von mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Äthanol oder Aceton. Das Präzipitat kann dann mittels konventioneller Verfahren, wie Filtration oder Zentrifugierung, gewonnen werden.
Das feuchte Proteasepräzipitat kann mittels konventioneller Methoden getrocknet werden, beisielsweise unter Vakuum. Ein speziell vorteilhafter Trocknungsprozess, der auch in grosstechnischen Anlagen eingesetzt werden kann, ist die Kombination von Sprühtrocknen mit einem anschliessenden Trocknungsschritt unter Fliessbettverfahren. Ein solches Trocknungsverfahren ist beispielsweise im britischen Patent Nr. 1 360 969 dargelegt.
Die Umsetzung des getrockneten Enzymkonzentrates in eine kommerziell verwertbare Proteasezubereitung aus festen Teilchen mit tiefer Staubproduktion und einer gesuchten Enzymaktivität kann dann mittels verschiedener bekannter Methoden ausgeführt werden. Eine derartige Methode ist beispielsweise im GB-Patent Nr. 1 338 249 dargestellt. Bei Anwendung der genannten Methode werden im wesentlichen runde Teilchen erhalten, wobei aus einer "Mischung des Pro-teasekonzentrates und einem im Wasser dispergierbaren, festen Wachs-Bindematerial ausgegangen wird. Ein solches, letzteres Material ist z.B. ein nicht-ionisches Detergens. Hingewiesen wird hier auch auf das GB-Patent Nr. 1 362 365, in dem ein Verfahren beschrieben wird, mittels dessen eine s
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angefeuchtete Vor-Mischung aus dem Enzymkonzentrat und einem festen Verdünnungsmittel, wie Natriumchlorid, und, bei Bedarf, in Anwesenheit eines Bindemittels, beispielsweise Dextrin und/oder Polyäthylenglykol, extrudiert und dann spheroidisiert wird. Dazu kann beispielsweise eine Vorrichtung eingesetzt werden, die unter der Marke Marumerizer vertrieben wird. Das Produkt wird anschliessend in einem Fliessbettapparat getrocknet.
Ein anderer Weg, um granulatförmige Enzymprodukte zu erhalten, stellt das Verfahren gemäss US-Patent Nr. 4 106 991 dar. Ein anschliessender Schritt zur Oberflächenbeschich-tung der Teilchen kann bei Bedarf angeschlossen werden. Dadurch werden die Staubbildungseigenschaften des erhaltenen Produktes weiter reduziert. Die Teilchen des Produktes werden normalerweise mittels eines geschmolzenen Wachses, vorteilhafterweise mit Polyäthylenglykol, beschichtet. Das beschichtete Produkt kann anschliessend, falls dies erwünscht wird, unter Einsatz eines fein zerkleinerten Farbstoffes, beispielsweise TÌO2, und anderen, pulverförmigen Hilfsstoffen, bepudert werden.
Die vorliegend beschriebene Erfindung schafft auch Mutanten des Stammes von B. licheniformis, die in bezug auf die Synthese der Komponente C blockiert sind. Die Stämme behalten jedoch ihre Fähigkeit, Subtilisin zu synthetisieren, bei.
Zusätzlich schafft die vorliegend beschriebene Erfindung Waschmittel, die einen wirksamen Anteil von Proteasenzube-reitung auf Basis von B. licheniformis enthalten, die im wesentlichen frei sind von Proteasekomponente C.
Neben der genannten Proteasezubereitung enthält das Waschmittel gemäss der vorliegenden Erfindung allgemein noch:
a) Mindestens einen oberflächenaktiven Stoff, der anionischer, nicht-ionischer oder amphoterischer Art sein kann, oder eine wasserlösliche Seife. In einem typischen Fall wird ein anionischer oberflächenaktiver Stoff (beispielsweise ein lineares Alkylarylsulfonat), zusammen mit einem nicht-ioni-scher oberflächenaktiven Stoff (beispielsweise ein Alkylphe-nylpolyglykoläther) in Anteilen von 5 bis 30, resp. 1 bis 5 Gew.-%, im Waschmittel eingesetzt.
b) Einen oder mehrere Gerüstbildner, die vorteilhafterweise zugleich als Sequestratoren funktionieren. Beispiele solcher Verbindungen sind Natriumtripolyphosphat, Natri-umcitrat, Natriumsilicat und Zeolite. Sie werden normalerweise in Anteilen von 10 bis 70 Gew.-% des Waschmittels eingesetzt.
c) Ein Bleich- und Entfärbungsmittel, vorteilhafterweise eine Peroxyverbindung wie Natriumperborat. Dieses Mittel wird typischerweise in einem Anteil von bis zu 30 Gew.-% in das Waschmittel eingebaut.
d) Hilfsmittel, wie Carboxymethylcellulose, optische Aufheller und Parfums. Falls nötig, werden auch Mittel zum Einstellen des pH's zugegeben. Der pH einer Waschlauge sollte im allgemeinen im Bereich zwischen 8 und 10,5 liegen.
Die aus Teilchen bestehende Proteasezubereitung gemäss dieser Erfindung wird einem Waschmittel in einer derartigen Menge zugegeben, die es erlaubt, eine entsprechende Protea-seaktivität von mindestens 0,1 Anson-Einheiten, vorteilhafterweise 0,5 bis 2,5 Anson-Einheiten pro 100 g Waschmittel zu berechnen. Betreffend die Definition von Anson-Einheiten siehe weiter unten. Falls bei der Aufstellung der Komponenten des Waschmittels es sich als nötig erweist, kann mit anorganischen Füllstoffen, vorteilhafterweise mit Natriumsulfat, auf 100% aufgefüllt werden.
Flüssige Waschmittel können von Enzymaufschläm-mungen, vorteilhafterweise nicht-wässrigen Medien, erhalten werden. In einem typischen Fall können solche Aufschläm-mungen aus Suspensionen von fein gemahlenem Proteasekonzentrat in einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff, beispielsweise Tergitol 15 S 9, oder aus einer Mischung solcher oberflächenaktiver Stoffe bestehen. Normalerweise wird die Aufschlämmung auch einen oder mehrere anorganische Füllstoffe, wie beispielsweise fein gemahlenes Natriumchlorid, falls gewünscht, zusammen mit Suspensionsstabilisatoren, wie beispielsweise Hochtemperatur-Kieselerde (Aerosil 200), enthalten. Sowohl Tergitol wie auch Aerosil sind Handelsmarken.
Die Proteaseaufschlämmung gemäss der Erfindung wird in einer derart berechneten Menge einem flüssigen Waschmittel zugegeben, dass im genannten Mittel daraus Anson-Ein-heiten von mindestens 0,1, vorteilhafterweise jedoch von 0,5 bis 2,5 pro 100 g flüssigem Waschmittel folgen.
Die genannten Waschmittel können im übrigen gemäss bekannter Methoden fertiggestellt werden. Beispiele für solche Methoden sind das gemeinsame Mischen aller Komponenten oder die Herstellung einer Vormischung und Zugabe, unter weiterem Rühren, der restlichen Ingredienzien.
Ein Subtilisin von höherem Reinheitsgrad, beispielsweise ein solches, welches durch die vereinigten Fraktionen mit dem Peak B über CMC Ionenaustauschchromatogramm der Fig. 1 erhalten wird und als solches eine proteolytische Aktivität von 3 bis 5mal mehr als das Proteasekonzentrat gemäss der Erfindung aufweist, wird in Zusammenhang mit der Ausführung dieser Erfindung nicht in Betracht gezogen. Der Umgang mit einem derart starken Proteasekonzentrat würde unweigerlich das Risiko des Auftretens von lokaler Irritation, speziell im Respirationstrakt und an anderen Mucosen,
derart stark erhöhen, dass dieses bei der Herstellung durch die Arbeiter in der Enzymfabrikation nicht mehr akzeptiert werden kann.
Zudem ist die enzymatische Instabilität eines derart gereinigten Subtilisins zu hoch, um es als Waschmittelenzym einzusetzen. Die substantielle Differenz in bezug auf die Stabilität zwischen gereinigtem Enzym und kommerziellen Protea-sezubereitungen ist anscheinend zurückzuführen auf die in den letzteren anwesenden, nicht enzymatisch aktiven Kulturmediumkonstituenten, die die Proteasen stabilisieren. Solche stabilisierenden Konstituenten sind mindestens zum Teil als kleinere Peptide und Aminosäuren identifizierbar. Die genannten Peptide und Aminosäuren stammen hauptsächlich aus der Autodigestion von Proteasen während des fermentativen Vorgangs. Daneben können natürlich noch zusätzlich stabilisierende Konstituenten aus dem Fermentationsmedium vorliegen, die hier nicht spezifiziert sind. Daher wird im folgenden der Ausdruck «Peptidfraktion» für diese genannten, nicht proteolytischen Konstituenten aus dem Kultivierungsmedium verwendet.
Die Peptidfraktion wird zusammen mit dem ersten Peak A eluiert, wenn das Proteasekonzentrat über einer CMC-Ionenaustauscherkolonne fraktioniert wird. Die Fraktionierung ist weiter oben in Zusammenhang mit Fig. 1 beschrieben worden.
Der Gehalt an Peptidfraktion wird gemäss der folgenden Formel berechnet:
„ „ . , . Prozent Total N - Prozent Protein-N Prozent Peptidfraktion= Q~[4
Darin bedeutet Protein-N den Stickstoffgehalt eines Tri-chloracetatsäurepräzipitates, welches unter standardisierten Bedingungen erhalten wird.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegend beschriebenen Erfindung beträgt die proteolytische s
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Aktivität des Proteasekonzentrates 2 bis 20, vorteilhafterweise 5 bis 15 Anson-Einheiten pro Gramm. Der Gehalt an Peptidfraktion darin liegt dabei im Bereich von 2 bis 15 Gew.-%.
Im Prinzip könnte ein Proteaseprodukt, das im wesentlichen frei ist von Komponente C, dadurch erhalten werden, dass nur die Komponente C vom Proteasekonzentrat entfernt wird. Dies könnte beispielsweise mittels fraktionierter Ausfällung und/oder selektiver Extraktion geschehen. Neben der Tatsache, dass noch keine derartige Methode ausgeabeitet worden ist, ist jedoch in jedem Fall zu beachten, dass eine derartige Methode beinahe unweigerlich Verluste in der Ausbeute von Subtilisin zur Folge hätte. Zudem würden die zusätzlichen Kosten für die Entfernung der Komponente C im wesentlichen sich auf die Produktionskosten des Protease-konzentrats schlagen. Daher ist eine Trennung des Produktes in praktischen und kommerziellen Hinsichten unannehmbar.
Analog verhält es sich mit der Auftrennung des Produktes in ein solches ohne Komponente C, z.B. mittels Chromatographie. Eine derartige Chromatographie auf einer CMC-lonenaustauschkolonne ist wie gesagt in Fig. 1 illustriert. Danach könnte man also die Komponente C sehr einfach dadurch ausscheiden, dass die Eluation vor dem Erscheinen des Peaks C auf dem Chromatogramm abgeschlossen wird.
Die oben angegebenen Schwierigkeiten zur Herstellung eines Proteasekonzentrats mit verringerter allergenischer Aktivität wurden nun so überwunden, dass ein Verfahren entwickelt wurde, mittels dem die Komponente C im wesentlichen schon auf dem mikrobiologischen Niveau eliminiert wird. Dabei wird ein Stamm von B. licheniformis verwendet, welcher so mutiert worden ist, dass seine Fähigkeit, die Komponente C zu synthetisieren, im wesentlichen blockiert ist. Der Stamm behält aber seine Fähigkeit, Subtilisinkompo-nenten zu produzieren, voll bei. Kulturen dreier solcher Mutanten des Stammes von B. licheniformis wurden bei Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, deponiert und erhielten die folgenden amtlichen Deposi-tionsnummern:
NRRL B-l 1301 ami. Mai 1978
NRRL B-l 1302 am 1. Mai 1978
NRRL B-l 1303 ami. Mai 1978
Mutationsmethode
Die Mutation von B. licheniformis und seine Fähigkeit, die Komponente C zu synthetisieren, zu blockieren unter Beibehaltung seiner Fähigkeit, Subtilisin zu synthetisieren, wurde folgendennassen ausgeführt: Zellen unter logarithmischem Wachstum in einem Medium, enthaltend 2% Tripticase, 0,5% Hefeextrakt, 0,0007% FeC'h.óHiO, 0,0001% MnCk.4H20 und 0,0015% MgS04.7H20 wurden bei 30°C und bei einem pH von 7,3 gezüchtet. Fünf Stunden nach Inkubationsbeginn wurden die Zellen gewonnen und in einem Tris-Maleatpuffer bei pH 5,7 suspendiert. Nun wurde N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin zugegeben, um in der Suspension eine Konzentration der genannten Verbindung von 100 (xg pro ml zu erhalten. Die Suspension wurde wiederum 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 30°C inkubiert. Nach dieser Behandlung betrug die Überlebensrate der Zellen 0,1 %.
Die Zellen wurden nun verschiedene Male mit der Pufferlösung gewaschen und dann auf Agarplatten ausgebreitet. Diese Agarplatten enthielten das oben genannte Kultivierungsmedium.
Auswahl der Mutanten
Nach zweitägiger Inkubation bei 37°C wurden ausgeschnittene Agar-Grundflächen mit den verschiedenen Mutanten auf einer Glasplatte in einem Sechseck angeordnet.
Über diese Anordnung wurde ein l%iges Agarosegel gegossen. In der Mitte des Sechseckes wurde eine Öffnung in die Agarschicht geschnitten. In diese Öffnung wurde eine gewisse Menge eines zur Komponente C spezifischen Antise-rums gegeben. Nun wurde die Platte wiederum einen Tag lang bei 30°C inkubiert. Die Platte wurde nun genau untersucht und nur diejenigen Mutanten weiter gereinigt und kultiviert, die keine Fällungslinien zum Antiserum hin aufzeigten. Die ausgewählten Mutanten wurden in Schüttelflaschen gegeben und dort weiter gezüchtet.
Weitere Charakterisierung der Komponente C
Analysen der Aminosäuren
Die ungefähre Zusammensetzung der Komponente C in bezug auf Aminosäuren ist weiter unten angegeben. Die Bestimmungen sind mit dem üblichen Fehler von ± 10% der angegebenen Werte behaftet. Zum Vergleich werden die entsprechenden Daten aus der Literatur für Subtilisin selbst in Klammern angegeben.
Lys.: 10 (9); His.: 8(5); Arg.: 11 (4); Asp.: 22 (28); Glu.: 15(12); Thr.: 33 (19); Ser.: 33 (32); Pro.: 13 (9); Gly.: 37 (35); Ala.: 17 (41); Val.: 16(31); Leu.: 7 (16); lieu.: 15 (10); Phe.: 6 (4); Tyr.: 21 (13); Cys. (1/2): 2 (o); Met.: 3 (5); Trp.: nicht bestimmt (1); NH3:27 (25). Totale Anzahl der vorliegenden Aminosäuren: 269 (273), exkl. Trp.
Die Aminosäurezusammensetzung der Komponente C weicht signifikant von derjenigen von Subtilisin ab. Die auffallende Differenz ist dabei die Anwesenheit von 2-Cystein-Resten (Cys 1/2) in der Komponente C, verglichen zu keinen solchen Resten im Subitlisin. Es liegen Hinweise vor, dass die Cystein-Reste der Komponente C mittels einer Disulfid-brücke miteinander verbunden sind. Die Anwesenheit einer S-S-Brücke in der Verbindung C erscheint höchst unüblich, wenn man bedenkt, dass die Komponente C eine Komponente der von Bacillus abgeleiteten Proteasen ist.
Molekularmasse
Die Aminosäurekomposition von oben lässt darauf schliessen, dass die Molekularmasse der Komponente C und diejenige von Subtilisin im gleichen Bereich liegen (der Literaturwert für die Molekularmasse und Subtilisin ist ungefähr 27 300).
Inhibitionsuntersuchungen
Im Gegensatz zu Subtilisin wird die Komponente C durch phosphorylierende Mittel, wie Diisopropylphosphorfluo-ridat (DFP) oder Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF),
nicht inhibiert. Es scheint also, dass die Komponente C eine Nicht-Serin-Protease darstellt.
Weiter lässt die Tatsache, dass die Komponente C durch Chelierungsmittel, wie beispielsweise Äthylendiamintetraes-sigsäure (EDTA), nicht inhibiert wird, darauf schliessen, dass es nicht eine Metalloprotease ist.
Einfluss des pH-Wertes auf Stabilität
Die Komponente C zeigt eine verringerte Stabilität verglichen mit Subtilisin im pH-Bereich zwischen 9 und 10. Dies ist aber genau der wichtigste pH-Intervall für Waschlaugen. Scheinbar ist also diese Tatsache mindestens teilweise der Grund dafür, dass die Eigenschaften der Komponente C für den Einsatz in Waschmitteln weniger geeignet ist als solche, die Subtilisin enthalten.
Allergologische Untersuchungen
Bildung von IgE-Antikörpern in Kaninchen
Es wurden die folgenden Injektionslösungen hergestellt:
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0,5 ml Subtilisin (15,1% Protein N) oder Komponente C (13,7% Protein N) als Testsubstanzen, zusammen mit Alhy-drogel (Superfos, Kopenhagen, 0,5 ml einer l,3%igen Emulsion, berechnet als AI2O3) als Zusatz. Diese Lösungen wurden subkutan je 24 Tieren injiziert. Die injizierten Dosierungen wurden so berechnet, dass die verabreichten Mengen zu gleichen Gewichten (ug) Protein-N führten. Verglichen wurde auf 3 Dosierungsebenen, denen die Mengen 0,015, 0,15 und 1,5 j-Lg Protein-N entsprachen.
13 Tage nach der ersten Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen, und am Tag darauf wurden die gleichen Tiere noch einmal immunisiert. Dieses Vorgehen wurde wiederholt mit Abständen von 14 Tagen über die ganze Experimentierperiode von 139 Tagen.
Untersuchungen betreffend passive Cutananaphylaxis (PCA)
Die Untersuchung wurde gemäss dem Vorgehen nach N.J. Zvaifler et al., Journal of Expérimental Medicine, Vol. 130 (1969), S. 907, ausgeführt. Intradermale Injektionen von 0,2 ml Serum oder Serumlösungen wurden in die frisch rasierte Haut von Kaninchen injiziert. Die Tiere wogen dabei ungefähr 2500 g. Die Untersuchungen wurden dreifach ausgeführt. Nach einer Sensitisierungsperiode von 72 Stunden wurden die Tiere intravenös mit Antigen und 50 mg Ewans Blue von Merck in 5 ml Salzlösung behandelt. Die Dosis der Behandlung entsprach 750 ug Protein-N pro Tier.
30 bis 60 Minuten nach der Gegenbehandlung wurden die Tiere mit einer Überdosis Nembutal umgebracht und die Verletzungen ausgemessen und notiert.
Bei einer Dosis von 0,15 (ig zeigte sich bei der Komponente C der positive Titer signifikant früher und in einer signifikant grösseren Proportion der Tiere verglichen mit den gleichen Daten für Subtilisin. Beim gleichen Niveau der Dosis war die Summe der induzierten Titerbeträge in 10 Blutproben signifikant höher als diejenigen bei Subtilisin (P < 0,02). Ebenso erreichte die Komponente C signifikant höhere maximale Titer (P< 0,02).
Modifizierte Anson-Hämoglobin-Methode für die Feststellung der proteolytischen Aktivität
In der Anson-Hämoglobin-Methode für die Feststellung der proteolytischen Aktivität wird denaturiertes Hämoglobin unter Standardbedingungen abgebaut. Das nicht abgebaute Hämoglobin wird mit Trichloressigsäure ausgefällt und die Menge des Produktes, welches in Trichloressigsäure löslich ist, wird mit Folin-Ciocalteu Phenolreagens bestimmt.
Eine Anson-Einheit (AU) ist diejenige Menge des Enzyms, welche unter Standardreaktionsbedingungen Hämoglobin in einer solchen Anfangsgeschwindigkeit abbaut, dass pro Minute eine derartige Menge von in Trichloressigsäure löslichen Produkt entsteht, die mit Phenol als Reagens die gleiche Verfärbung gibt wie ein Milliaquivalent Tyrosin.
Die Standard-Reaktionsbedingungen sind die folgenden: Temperatur 25°C, Reaktionszeit 10 Minuten, pH 7,5.
Für weitere Angaben siehe M.L. Anson, Journal of General Physiology, Vol. 22 (1939), Seiten 79-89; O. Folin und V. Ciocalteu, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 73, (1927), Seiten 627-636.
Die Erfindung wird nun in Details anhand der folgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Je ein Stamm von B. licheniformis der Depositions-nummerNRRL B-l 1301, B-l 1302 und B-l 1303 wurden unter folgenden Bedingungen kultiviert:
In geschlossenen, 500-ml-Erlenmeyer-Flaschen wurden verschiedene Substrate (je 100 ml) mit folgender Zusammensetzung vorbereitet:
Substrat 1
Substrat 2
Substrat 3
Prozente
Prozente
Prozente
Gew./Vol.
Gew./Vol.
Gew./Vol.
Kartoffelstärke
10
12,5
10
Sojabohnenmehl
5
7,5
2
Na2HP04-12 H2O
1
0,5
1
Pluronic L-61
0,01
0,01
0,01
Tween 80
1
Gerstestärke
5
Natriumcaseinat
1
BAN 120 L
0,01
0,01
0,01
Pluronic L-61 ist ein nicht-ionisches, oberflächenaktives Mittel der Firma Wyandotte Corporation, Michigan, USA.
Tween 80 ist ein Polyoxyäthylensorbitanmonooleat der Firma Atlas Chemical Industries, Delaware, USA.
BAN 120 L ist ein kommerziell erhältliches Alpha-Amy-lase-Produkt, das durch Fermentation von B. subtilis erhalten wird. Das Produkt wird durch Novo Industri A/S, Dänemark, geliefert.
Die Komponenten wurden auf 50 bis 90°C erwärmt, wobei die Erwärmung 50 Minuten dauerte. Dann wurde in einer Zeit von 80 Minuten die Temperatur der Mischung auf 121 °C angehoben. Die Mischung wurde anschliessend wieder abgekühlt.
Nun wurden die Flascheninhalte mit den verschiedenen Stämmen von B. licheniformis inokuliert. Auf einem Schüttelgerät wurden sie nun 5 Tage lang bei 30°C und einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 240 Umdrehungen pro Minute belassen. Die Proteaseaktivität wurde dann mittels der Anson-Methode festgestellt. Erhalten wurden die folgenden Resultate in Anson-Einheiten pro kg:
Stämme Substrat 1 Substrat 2 Substrat 3
NRRL B-l 1301 160 219 153
NRRL B-l 1302 158 200 155
NRRL B-l 1303 161 192 150
Muster der oben erhaltenen Kultivierungsmedien mit dem Substrat 2 wurden dann 30 Minuten lang bei 15 000 g zentri-fugiert. Die überstehende, klare Flüssigkeit wurde abgetrennt und davon je 50 ml genommen und auf37°C erwärmt. Zu jeder Probe wurden dann 15 g wasserfreies Natriumsulfat gegeben und die Lösung 30 Minuten lang gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde abfiltriert und unter Vakuum getrocknet. Die derart erhaltenen Proteasekonzentrate wiesen die folgenden Charakteristiken auf:
Stämme
Proteolytische
Proteingehalt
Peptidfraktion
Aktivität AU/g
Prozente
Prozente
B-l 1301
11
34
8
B-l1302
10
35
10
B-l 1303
10
31
8
5 g des Produktes des Stammes B. licheniformis NNRL B-l 1301 wurden über eine Kolonne (25x23,5 cm) CMC (130 g) chromatographiert. Die Bedingungen waren die5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
642395
selben, wie sie weiter oben beschrieben worden sind. Das Chromatogramm wurde erhalten mittels Messung von OD280 der Fraktionen (20 ml), die bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 45 ml/Std. gewonnen wurden.
Zusätzlich wurde eine Lösung (3 Gew.-%) des gleichen Konzentrats einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen. Die entsprechende Methode ist ebenfalls weiter oben beschrieben. Lösungen (1% Gew./Vol.) von Subtilisin und von Komponente C wurden als Referenzlösungen ebenfalls untersucht. Das Chromatogramm und die Elektropherogramme sind in Fig. 3 und 4 der beigelegten Zeichnungen wiedergegeben. Sie zeigen, dass die einzige nachweisbare Protease im Proteasekonzentrat (Fig. 4, Position III) Subtilisin ist (Position II). Die Komponente C (Position I) ist nicht vorhanden.
Beispiel 2
Der Stamm B. licheniformis NRRL B-l 1301 wurde auf einem Nährmedium aus Agar 1 bis 2 Tage bei 37°C in einer Fernbach-Flasche kultiviert. Das Produkt wurde nun in einem rostfreien Stahlfermentationstank verteilt. Der Tank enthielt das Fermentationssubstrat, das weiter oben beschrieben worden ist. Nach 24 Stunden bei 34°C mit Lüftung und Rühren erhielt man eine dichte Kultur. Diese wurde nun dazu verwendet, um den Enzymproduktionstank zu impfen. Die Impfkultur (351) wurde in einen rostfreien Stahlfermentationstank gegeben, der die weiter unten beschriebene Fermentationsbrühe enthielt. Die Fermentationsbedingungen für beide, d.h. für den Impftank und für den Haupttank waren die folgenden:
Totales Tankvolumen: 5501 Substratvolumen: 3501
Belüftungsgeschwindigkeit: 3001/Min.
Rührwerk: 400 Umdrehungen pro Minute mit einem
Sechsblatturbinenrührwerk von 28 cm Durchmesser Temperatur: 34°C
Substratzusammensetzung: Kartoffelstärke Sojabohnenmehl Na:HP04- 12HîO BAN 120 L Pluronic L-61
Substratzubereitung:
Das Substrat wurde in einer Zeit von 50 Minuten von 50 auf 95°C erwärmt und dann während 60 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Nach einer Fermentationsdauer von 50 Stunden betrug die Proteaseaktivität 160 Anson-Einheiten pro kg. Dieser Wert wurde erhalten mittels einer Bestimmung gemäss der modifizierten Anson-Methode. Die Fermentationsbrühe wurde anschliessend auf ungefähr 5°C abgekühlt.
a) Ein Muster des Kultivierungsmediums aus der obigen Fermentation wurde 30 Minuten lang bei 15 000 g zentrifu-giert. Die überliegende, klare Flüssigkeit wurde abgetrennt und auf 37°C erwärmt. Dazu wurden 320 g/1 wasserfreies Natriumsulfat gegeben und die Mischung dann 30 Minuten lang gerührt. Dabei wurde immer die Temperatur auf37°C gehalten. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und unter Vakuum getrocknet. Das erhaltene Proteasekonzentrat wies die folgenden Charakteristiken auf:
Untersuchungen mittels Chromatographie auf CMC und mittels Agarose-Gel-Elektrophorese, ausgeführt gemäss den Angaben in Beispiel 1, zeigten, dass das Proteaseprodukt frei war von Komponente C; die einzige nachweisbare Protease 5 war Subtilisin.
b) Eine zweite aliquote Menge der oben genannten Kulturbrühe wurde bei 15 000 g 30 Minuten lang zentrifugiert. Die überliegende, klare Flüssigkeit wurde abgetrennt. Zu ihr wurden nun 3 Volumen pro Volumen Flüssigkeit Aceton 10 gegeben. Die Zugabe geschah langsam und unter kräftigem Rühren. Der dabei ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und unter Vakuum getrocknet.
Das erhaltene Proteasekonzentrat wies die folgenden Charakteristiken auf:
Proteolytische Aktivität
Proteingehalt
Peptidfraktion
6 AU/g 15%
3%
25
100 g/1 50 g/1 10 g/1 0,1 ml/1
lg/1
Proteolytische Aktivität
Proteingehalt
Peptidfraktion
8 AU/g 20% 4%
1 Durch Untersuchungen mittels Chromatographie auf CMC und mittels Agarose-Gel-Elektrophorese, ausgeführt gemäss den Angaben in Beispiel 1, konnte gezeigt werden, dass das Proteaseprodukt frei war von Komponente C; die einzige nachweisbare Protease war Subtilisin.
Beispiel 3
Ein kommerzielles, in Teilchen vorliegendes Proteaseprodukt wurde folgendermassen hergestellt:
30 Eine Vormischung aus 25 Gew.-% Enzymkonzentrat (8 AU/g), hergestellt nach dem Verfahren von Schritt a, Beispiel 2,2% Polyvinylpyrrolidon, 6% Polyäthylenglykol 6000 und 67% Natriumchlorid wurde mit 8% Wasser angefeuchtet. Die Mischung wurde durch ein Sieb mit 0,9 mm Sieböff-35 nungen extrudiert und anschliessend spheroidisiert, wie dies im GB-Patent Nr. 1 362 365 beschrieben ist. Das Produkt aus Teilchen wurde nun auf einem Fliessbett getrocknet, bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von ungefähr 0,5%. Anschliessend wurde es mit Polyäthylenglykol beschichtet, wobei es nach 40 der Beschichtung 4 Gew.-% des Beschichtungsmittels aufwies. Schliesslich wurde es mit einer Mischung aus 11% Titandioxyd und Magnesiumsilicat gepudert. Das so erhaltene Enzympräparat wies eine Aktivität von 1,7 AU/g auf.
45
Beispiel 4
Ein Proteaseprodukt in Teilchenform wurde hergestellt, im wesentlichen gemäss den Angaben, wie sie im US-Patent Nr. 4 106 991 beschrieben sind.
so Eine Mischung aus 25 Gew.-% fein gemahlenem Proteasekonzentrat (9 AU/g), hergestellt gemäss dem Verfahren im Schritt a des Beispiels 2,2% Titandioxyd, 1% Cellulosepulver CEPO S20 (The Swedish Cellulose Powder and Wood Flour Mills, Ltd.), und 72% fein gemahlenes Natriumchlorid 55 wurden in einem Lödige-Mischapparat gemischt, wie dies im Beispiel der oben genannten US-Patentschrift beschrieben ist.
Die trockene Mischung wurde nun mit 4,5% wässriger Lösung von Polyvinylpyrrolidon K 30 (entsprechend 1 60 Gew.-% der Gesamtmischung) besprüht. Die Sprühlösung dient dabei als Bindemittel. Die Granulierung des Produktes wurde im gleichen Lödige-Mischer ausgeführt. Das granulat-förmige Produkt wurde nun auf einen Feuchtigkeitsgehalt unter 3% getrocknet. Die Granulate wurden gesiebt, 65 anschliessend mit Polyäthylenglykol beschichtet und dann gepudert, alles gemäss dem Verfahren, wie es im Beispiel 3 angegeben ist. Die Proteasezubereitung, die so erhalten wurde, wies eine Aktivität von 2 AU/g auf.
642 395
8
Beispiel5 b) Bestandteil Anteil (Gew.-%)
Die Proteasezubereitungen in Form von Teilchen, die in
den obigen Beispielen 3 und 4 erhalten wurden, wurden für NANSA S 40 S 10
die Herstellung von zwei Waschmitteln der folgenden For- Berol WASC 4
mulierungen verwendet: 5 Seife 3
Natriumtripolyphosphat 15
SASIL 15
Natriumperborat 25
Natriumsilicat 6
a) Bestandteil Anteil (Gew.-%) Natrium CMC 1
Optische Aufheller, Parfums 0,5
NANSA S 40 S 10 Mittel zur Einstellung des pH-Wertes nach Bedarf
Berol WASC 4 Proteaseprodukt (1,5 bis 2,0 AU/g) 0,8 Seife 3 Natriumsulfat zu 100 Natriumtripolyphosphat 30 is ~~
Natriumperborat 25 NANSA S 40 S ist ein Natriumalkylbenzolsulfonat, basie-
Natriumsilicat 6 rend auf «soft», d.h. voll biologisch abbaubaren Alkylaten in
Natrium CMC 1 Pulverform der Firma Marchon Ltd.
Optische Aufheller, Parfums 0,5 Berol WASC ist ein nicht-ionischer Alkylphenylpolygly-
Mittel zur Einstelung des pH-Wertes nach Bedarf 20 koläther der Firma Berol A/B.
Proteasezubereitung (1,5 bis 2,0 AU/g) 0,8 SASIL ist ein Natriumaluminiumsilicatzeolith des Typs A Natriumsulfat zu 100 mit der Formel Nai2(A102)i2(Si02)i2.27H20 der Firma Degussa.
B
2 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

  1. 642395
    2
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Proteasen enthaltende Zubereitung, die in Waschmitteln eingesetzt werden kann und die ein von B. licheniformis abgeleitetes Proteasenkonzentrat enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Proteasenkonzentrat, das mittels von nicht-proteolytischen Kulturzüchtungen herstammenden Peptiden stabilisiert ist, im wesentlichen frei ist von Nicht-Serin-Proteasen und im Vergleich zu einem Nicht-Serin-Proteasen enthaltenden Proteasenkonzentrat verringerte allergenische Eigenschaften aufweist.
  2. 2. Zubereitung gemäss Patentanspruch 1, in der mindstens 99% der proteolytischen Aktivität des Proteasenkonzentrats aus dem Subtilisin-Isoenzym-System herstammt.
  3. 3. Zubereitung gemäss Patentanspruch 1, in der das darin enthaltene Proteasenkonzentrat mindestens 0,5 Gew.-%, vorteilhafterweise 2 bis 15 Gew.-%, von nicht-proteolytischen Kulturzüchtungen herstammende Peptide enthält.
  4. 4. Zubereitung gemäss Patentanspruch 1, in der die proteolytische Aktivität des darin enthaltenen Proteasenkonzentrats im Bereich von 2 bis 20, vorteilhafterweise in demjenigen von 5 bis 15 Anson-Einheiten pro Gramm liegt.
  5. 5. Verfahren zur Herstellung der Zubereitung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von B. licheniformis, der derart mutiert ist, dass seine Fähigkeit, andere Proteasen ausser Subtilisin zu synthetisieren, im wesentlichen blockiert worden ist, in einem Nährmedium kultiviert wird, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, assimilierbarem Stickstoff und assimilierbarem Phosphor aufweist, wonach das dabei gebildete, Subtilisin und aus der Kulturzucht stammende Peptide enthaltende Proteasenkonzentrat gewonnen wird.
  6. 6. Verfahren gemäss Patentansprach 5, in dem der mutierte B. licheniformis-Stamm aus der Gruppe der deponierten und folgendermassen bezeichneten Stämme ausgewählt ist: NRRL B-l 1301, B-l 1302 und B-l 1303.
  7. 7. Waschmittel, einen wirksamen Anteil der Proteasen-Zubereitung gemäss Patentanspruch 1 enthaltend.
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