MXPA04009680A - Uso de fusiones de peptido/proteina con transtiretina para incrementar la vida media en suero de peptidos/proteinas farmacologicamente activos. - Google Patents

Uso de fusiones de peptido/proteina con transtiretina para incrementar la vida media en suero de peptidos/proteinas farmacologicamente activos.

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Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para incrementar la vida media de un agente biologicamente activo, seleccionado, mediante la utilizacion de transtiretina (TTR) como un socio de fusion con un agente biologicamente activo, especificamente, la presente invencion proporciona preparaciones sustancialmente homogeneas de las fusiones de TTR (o una variante de TTR)-agente biologicamente activo y las fusiones de PEG-TTR-(PEG-variante de TTR)-agente biologicamente activo. En comparacion al agente biologicamente activo solo, la fusion TTR-agente biologicamente activo y/o la fusion de PEG-TTR-agente biologicamente activo tiene una vida media en suero sustancialmente incrementada.

Description

USO DE FUSIONES DE PEPTIDO/PROTEINA CON TRANSTIRETINA PARA INCREMENTAR LA VIDA MEDIA EN SUERO DE PEPTIDOS/PROTEINAS FARMACOLOGICAMENTE ACTIVOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas, péptidos y otras moléculas farmacológicas para el uso terapéutico son actualmente disponibles en formas adecuadas en cantidades adecuadas, ampliamente como un resultado de los avances en las tecnologías de ADN recombinante . La disponibilidad de tales péptidos y proteínas ha engendrado avances en la formulación de proteínas y la modificación química. La modificación química de péptidos, proteínas, oligonucleótidos y otros fármacos biológicamente activos, para fines de extender la vida media en suero de tales agentes bioactivos, ha sido extensamente estudiada. La habilidad para extender la vida media de suero de tales agentes permite que el potencial terapéutico del agente sea realizado sin la necesidad para altas dosificaciones y administración frecuente.
Las modificaciones químicas utilizadas para extender las vidas medias de las proteínas in vivo incluye la conjugación química de un polímero soluble en agua tal como polietilenglicol (PEG), a la proteína de interés. Han sido utilizados una variedad de procedimientos para acoplar las moléculas de polietilenglicol a la proteína (PEGilación) .
Ref . : 159242 Por e emplo, Royer (Patente de los Estados Unidos No. 4,002,531) establece que la alquilación reductiva fue utilizada para el enlace de las moléculas de polietilenglicol a una enzima. Davis et al (Patente de los Estados Unidos No. 4,179,337) describe los conjugados de PEG: roteína que involucran, por ejemplo, enzimas e insulina. Shaw (Patente de los Estados Unidos No. 4,904,584) describe la modificación del número de residuos de lisina en las proteínas para el enlace de las moléculas de polietilenglicol vía los grupos amino reactivos. Hakimi et al (Patente de los Estados Unidos No. 5,834,594) describen los conjugados de PEG rproteínas solubles en agua, sustancialmente no inmunogénicos , que involucran por ejemplo, las proteínas IL-2, el interferón alfa, e IL-lra. Los métodos de Hakimi et al involucran la utilización de ligadores únicos para conectar los diversos grupos amino libres en la proteína a PEG. Kinstler et al (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,824,784 y 5,985,265) enseñan los métodos que permiten modificar químicamente N-terminalmente de manera selectiva proteínas y análogos de las mismas, incluyendo G-CSF e interferón de consenso. Otros procedimientos diseñados para extender la vida media del suero de los agentes bioactivos incluyen: conjugación de los péptidos a una proteína estable, grande, la cual es demasiado grande para ser filtrada a través de los ríñones (por ejemplo albúmina sérica); G.D. Mao et al., Biomat., Art. Cells, Art . Org. 17:229-244 (1989); el uso de lipoproteínas de alta y baja densidad como vehículos de transporte y para incrementar la vida media en suero; P. Chris de Smidt et al., Nuc. Acids . Res., 19 (17) :4695-4700 (1991) ; el uso de la región Fe de las inmunoglobulinas para producir fusiones de Fc-proteína; PCT O 98/28427 (Mann et al, y referencias citadas en ésta); y el uso del dominio Fe para incrementar la vida media in vivo de uno o más péptidos biológicamente activos; PCT WO 00/24782 (Feige et al, y referencias citadas en éstas) . La transtiretina (TTR) (antiguamente llamada prealbúmina) es una proteína sérica tetramérca de 56 kDa que juega papeles fisiológicos importantes como un transportador de la tiroxina y la proteína de enlace al retinol; Hamilton y Benson, Cell . Mol. Life Sci . , 58:1491-1521 (2001), y referencias citadas en ésta. Blaney et al., en la Patente de los Estados Unidos No. 5,714,142, describe la explotación de TTR al dotar al fármaco que va a ser administrado, con funcionalidad que le permite enlazarse específicamente a la proteína. Específicamente, Blaney et al demuestran que el enlace covalente de un péptido, proteína, nucleótido, oligonucleótido, oligosacárido u otro fármaco a un ligando selectivo de transtiretina enlazará reversiblemente el fármaco a TTR y con esto incrementará la vida media en suero del agente, con base en la afinidad del ligando para TTR. Se establece que la actividad intrínseca del fármaco no es afectada de manera adversa y el conjugado de fármaco-ligando de TTR resultante será todavía lo suficientemente pequeño para ser oralmente absorbido. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado, sorprendentemente de manera importante, que TTR (o una variante de TTR), y en particular, un TTR o variante de TTR que ha sido químicamente modificado por medio de la conjugación a un polímero soluble en agua, por ejemplo, puede ser utilizado como un socio de fusión con un agente biológicamente activo, para incrementar la vida media en suero del agente biológicamente activo. En consecuencia, la presente invención proporciona un medio para incrementar la vida media del suero de un agente biológicamente activo, seleccionado. La presente invención se refiere de este modo a las preparaciones sustancialmente homogéneas de las fusiones de TTR (o una variante de TTR) -agente biológicamente activo y las fusiones de PEG-TTR (PEG-variante de TTR) -agente biológicamente activo. En comparación al agente biológicamente activo solo, la fusión TTR-biológicamente activo y/o la fusión de PEG-TTR-agente biológicamente activo ha incrementado sustancialmente la vida media en suero. La presente invención se refiere además a las fusiones de TTR-agente biológicamente activo y a las fusiones de PEG-TTR-agente biológicamente activo, en un portador farmacéuticamente aceptable, para proporcionar un compuesto farmacéuticamente activo. La presente invención se refiere además a la preparación de variantes de TTR. Específicamente, las proteínas TTR son modificadas tal que el o los residuos de cisteína son manipulados mediante ingeniería en la secuencia proteica de TTR. Las variantes de TTR son recuperables con un alto rendimiento y son luego químicamente modificadas por medio de la conjugación de un polímero soluble en agua en el residuo de cisteína, para proporcionar una variante de TTR químicamente modificada, la cual puede ser luego fusionada a un agente biológicamente activo, seleccionado. La presente invención se refiere además a los procesos para la preparación de los compuestos farmacológicamente activos. Por. ejemplo, la modalidad principal del método para elaborar la preparación sustancialmente homogénea de una fusión PEG-TTR-péptido comprende: (a) manipular mediante ingeniería un residuo de cisteína en una posición de aminoácido específico dentro de la secuencia de aminoácidos de TTR para proporcionar una variante de TTR; (b) conjugar un polietilenglicol a la variante de TTR en el residuo de cisteína, para proporciona un PEG-TTR; (c) fusionar el PEG-TTR a un péptido de interés para proporcionar una fusión de PEG-TTR-péptido ; y (d) aislar la fusión PEG-TTR-péptido . La presente invención también se refiere a los métodos de tratamiento de los individuos utilizando los compuestos farmacológicamente activos como se describió anteriormente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un gel de SDS que describe la purificación de una variante (C10A/G83C) de transtiretina (TTR) recombinante humana, expresada en E. coli, con un péptido de Bradicinina fusionado al extremo C de TTR. La banda 1 contiene estándares de peso molecular Novex Mark 12, y las bandas 2-7 contienen los siguientes, respectivamente: lisado celular, sobrenadante post-calentamiento, combinado proveniente del paso, de quimioterapia con Q-sepharose, combinado proveniente del paso de cromatografía en fenil-sepharose combinado proveniente del paso de cromatografía de hidroxiapatita y combinado del paso de cromatografía de fuente Q. La figura 2 demuestra mediante cromatografía de exclusión de tamaño, que la fusión de los péptidos al extremo amino o al extremo carboxilo de una variante de TTR, TTR (C10A/G83C) , no altera su estructura oligomérica. En la línea sólida es TTR (C10A/G83C) , la línea discontinua es la hormona paratiroidea (PTH) fusionada al extremo amino de TTR (C10A/G83C) , y la línea punteada es Bradicinina fusionada al extremo carboxilo de TTR (CA10A/G83C) . La figura 3 demuestra, mediante cromatografía de exclusión de tamaño, que la fusión de las proteínas al extremo amino o al extremo carboxilo de una variante de TTR, TTR(CIOA) , no altera su estructura oligomérica. La línea sólida es TTR(CIOA), la línea discontinua es IL-l-ra fusionada al extremo carboxilo de TTR(CIOA), y la línea punteada es IL-l-ra fusionada al extremo amino de TTR(CIOA). La figura 4 muestra el enlace observado utilizando BIAcore de diversas construcciones de TPO-péptico mimético (TMP) al receptor MPL humano: ¦ Fc-TMP, · TMP (m) -TTR, A TMP (m) -TTR-PEG5K, T TMP (m) -TTR-PEG20K. La figura 5 muestra que la inyección de TMP (m) -TTR-PEG5K induce la formación de plaquetas en ratones. Los siguientes símbolos corresponden a las construcciones correspondientes: ¦ portador, · Fc-TMP, ? TTR-TMP, ? TMP (m) -TTR, y ? TMP (m) -TTR-PEG5K.
La figura 6 demuestra, mediante cromatografía de exclusión de tamaño que TTR nativo y TTR(CIOA) mantienen una configuración oligomérica similar (un tetrámero aparente) . La línea sólida es TTR nativa y la línea discontinua es TTR(CIOA) .
Las figuras 7A-7D demuestran, mediante cromatografía de exclusión de tamaño, que la conjugación de PEG a TTR incrementa su tamaño molecular de una manera uniforme predecible . Las líneas sólidas no indican PEG conjugado, las líneas discontinuas indican PEG 5K fusionado, y las líneas punteadas indican PEG 20K fusionado. Se utilizaron las siguientes construcciones: 7A) TMP-TTR (C10A/A37C) , 7B) T P-TTR (C10A/D38C) , 7C) TMP- TTR (C10A/A81C) , y D) TMP-TTR (C10A/G83C) .
La figura 8 es un gel de SDS que describe el grado de pegilación de diversas construcciones de TMP-TTR que involucran variantes de TTR que tienen una cisteína no nativa manipulada mediante ingeniería genética en uno de los cuatro sitios diferentes. La banda 1 contiene los estándares de peso molecular Novex Mark 12; la banda 2 está sin pegilación de TMP-TTR (C10A/A37C) ; las bandas 3-6 son versiones pegiladas 5K de TMP-TTR (C10A/A37C) ; TMP-TTR (C10A/A37C) , TMP-TTR (C10A/D38C) , TMP-TTR (C10A/A81C) , y TMP-TTR (C10A/G83C) respectivamente; las bandas 7-10 son versiones pegiladas 20K de TMP-TTR (C10A/A37C) , TMP-TTR (C10A/D38C) , TMP- TTR (C10A/A81C) , y TMP-TTR (C10A/G83C) , respectivamente. Las figuras 9A-9C comparan el enlace competitivo de Fc-TMP y TMP-TTR a MPL humano mediante análisis de BIAcore. 9A) ¦ Fc-TMP, · TMP-TTR (C10A/A37C) , ? TMP-TTR (C10A/D38C) , ? TMP-TTR (C10A/A81C) , ? TMP-TTR (C10A/G83C) . 9B) ¦ Fc-TMP, 5K versiones pegiladas 5K de TMP-TTR (C10A/A37C) (·) , TMP-TTR (C10A/D38C) (A), TMP-TTR (C10A/A81C) (?), TMP- TTR (C10A/G83C) (?) . 9C) ¦ Fc-TMP, versiones pegiladas 20K de TMP-TTR(C10A/A37C) (·) , TMP-TTR (C10A/D38C) (?) , TMP-TTR (C10A/A81C) (?) , TMP-TTR (C10A/G83C) (?) .
Las figuras 10A-10C muestran que la inyección de TMP-TTR con PEG conjugados a las cisteínas manipuladas por ingeniería genética, inducen la formación de plaquetas en ratones. 10A) ¦ TTR(CIOA), · Fc-TMP, A TMP-TTR (C10A/A37C) , T TMP-TTR (C10A/D38C) (carboxiamidometilado) , ? TMP-TTR (C10A/A81C) , TMP-TTR (C10A/G83C) . 10B) ¦ TTR(CIOA), · Fc-TMP, versions pegiladas 5K de TMP-TTR (C10A/A37C) (A), TMP-TTR (C10A/D38C) (T), TMP-TTR (C10A/A81C) (?) , TMP-TTR (C10A/G83C) (A) . 10C) ¦ TTR (C10A) , · Fc-TMP, versiones pegiladas 20K de TMP-TTR (C10A/A37C) (A), TMP-TTR (C10A/D38C) (T) , TMP-TTR (C10A/A81C) (?), TMP-TTR (C10A/G83C) «) .
La figura 11 muestra que la inyección de PTH-TTR con PEG conjugado a las cisteínas manipuladas con ingeniería genética, induce la liberación de calcio ionizado en ratones. Los siguientes símbolos corresponden a las construcciones correspondientes: ¦ TTR(CIOA), · PTH-Fc, A PTH-TTR, T PTH-TTR (C10A/K15A/A37C) (carboxamidometilado) , ? versión pegilada 5K de PTH-TTR (C10A/K15A/A37C) , versión pegilada 20K de PTH-TTR (C10A/K15A/A37C) , ? PTH-TTR (C10A/K15A/G83C) (carboxiamidometilado) , · versión pegilada 5K de PTH-TTR (C10A/K15A/G83C) , y * versión pegilada 20K de PTH-TTR (C10A/15A/G83C) .
La figura 12 muestra que la inyección del péptido 1 similar al glucagón (GLP1) -TTR con PEG conjugado a la cisteínas manipuladas por ingeniería en los niveles de glucosa sanguínea en ratones. Los siguientes símbolos corresponden a las construcciones correspondientes: ¦ TTR(CIOA), · GLPl-Fc, ? GLPl-TTR (C10A/K15A/G83C) (PEG 5K) , y T GLPl-TTR (C10A/K15A/G83C (PEG 20K) . La figura 13 muestra que la inyección de conjugados TMP-TTR con dominios CH2 fusionados, incrementa los niveles de plaquetas en suero, en ratones. Los siguientes símbolos corresponden a las construcciones correspondientes: ¦ TTR(CIOA), · Fc-TMP, ? TMP-TTR (C10A) -CH2 , T TTR (C10A) -CH2 -TMP, y ? TMP-CH2-TTR(C10A) . La figura 14 muestra que la inyección de y las fusiones carboxilo- terminales TMP con TTR pegilado, incrementan las cuentas de plaquetas sanguíneas en ratones: Los siguientes símbolos corresponden a las construcciones correspondientes: ¦ TTR(CIOA), · Fc-TMP, A TTR (C10A/K15A/A37C) -TMP (PEG 20K) , T TTR (C10A/K15A/A81C) -TMP (PEG 20K) , ? TTR( (C10A/K15A/A83C) -TMP (PEG 20K) , - TMP-TTR (C10A/K15A/A37C) (PEG 20K), ? TMP-TTR (C10A/K15A/A81C) (PEG 20K) , · TMP-TTR (C10A/K15A/G83C) (PEG 20K) .
La figuras 15A-15C muestran que la inyección de las fusiones TMP-TTR pegiladas, que contienen una alteración K15A incrementan las cuentas de plaquetas sanguíneas en ratones. Los siguientes símbolos corresponden a las construcciones correspondientes: 15A) ¦ TTR (C10A) , · Fc-TMP, ? TMP-TTR (C10A/K15A/A37C) (carboxiamidometilado) y ? TMP-TTR (C10A/K15A/A81C) (carboxiamidometilado); 15B) ¦ TTR(CIOA), • Fc-TMP, ? TMP-TTR (C10A/K15A/A37C) (PEG 5K) , T TMP-TTR (C10A/K15A/A81C) (PEG 5K) y ? TMP-TTR (C10A/K15A/G83C) (PEG 5K) ; 15C) ¦ TTR(CIOA), · Fc-TMP, ? TMP-TTR (C10A/K15A/A37C) (PEG 20K) , T TMP-TTR (C10A/K15A/A81C) (PEG 20K) y ? TMP-TTR (C10A/K15A/G83C) (PEG 20K) . DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Para fines de describir la presente invención, se definen los siguientes términos como se establece enseguida.
El término "agente biológicamente activo" se refiere a cualquier material químico o compuesto útil para la aplicación profiláctica, terapéutica o de diagnóstico. El término "compuesto farmacológicamente activo" se refiere a un compuesto adecuado para la administración a un mamífero, preferentemente un individuo humano, que induce un efecto local o sistémico deseado. Los términos "péptido" , "polipéptido" y "proteína" describen un tipo de agentes biológicamente activos, y los términos son utilizados intercam iablemente en la presente para referirse a un polímero de aminoácidos de origen natural, recombinantemente producido o químicamente sintetizado. Se pretende que los términos incluyan las moléculas peptídicas que contengan tan pocos como 2 aminoácidos, polipéptidos químicamente modificados, moléculas de consenso, análogos, derivados o combinaciones de los mismos . Pueden ser utilizados cualquier número de péptidos en conjunto con la presente invención. De interés particular son los péptidos que imitan la actividad de la eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) , Péptido 1 similar al Glucagón (GLP-1) , hormona paratiroidea (PTH) , factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de macrofagos granulocitos (GM-CSF) , antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-lra) , leptina, antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4) , ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF (TRAIL) , factor de crecimiento tumoral alfa y beta (TGF-oc y TGF-ß, respectivamente) , y hormonas de crecimiento. Los términos "péptido mimético" y "péptido agonista" se refieren a un péptido que tienen actividad biológica comparable a una proteína (por ejemplo, GLP-1, PTH, EPO, TPO, G-CSF, etc.) que interactúa con una proteína de interés . Estos términos incluyen además los péptidos que imitan indirectamente la actividad de una proteína de interés, tales como mediante el potenciamiento de los efectos del ligando natural de la proteína de interés. De este modo, el término "péptido mimético de EPO" comprende cualesquiera péptidos que pueden ser identificados o derivados como poseedores de materia de interés mimética de EPO; ver, por ejemplo, Wrighton et al., Science, 273: 458-63 (1996) ; y Naranda et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 96: 7569-74 (1999) . Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible que alguien seleccione péptidos diferentes de los que se describen efectivamente en la presente, siguiendo los procedimientos descritos, con diferentes bibliotecas de péptidos . El término "péptido mimético de TPO" (TMP) comprende los péptidos que pueden ser identificados o derivados como poseedores de materia de interés mimética de TPO; ver, por ejemplo, Cwirla et al., Science, 276: 1696-9 (1997) ; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,869,451 y 5,932,946; y PCTWO00/24782 (Liu et al . , y referencias citadas en ésta) incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible que alguien seleccione diferentes péptidos que los que se describen efectivamente en la presente, al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos . El termino "péptido mimético de G-CSF" comprende cualesquiera péptidos que pueden ser identificados como poseedores de materia de interés mimética de G-CSF; ver, por ejemplo, Paukovits et al., ?????-Seylers Z. Physiol . Chem. 365: 303-11 (1984). Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hacen posible que alguien seleccione péptidos diferentes que los que se describen efectivamente en la presente, siguiendo los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos . El término "péptido mimético de CTLA4" comprende cualesquiera péptidos que puedan ser identificados o derivados como se describe en Fukumoto et al., Nature Biotech. 16:267-70 (1998). Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible que alguien seleccione péptidos diferentes a los que se describen efectivamente en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. Los antagonistas de péptidos son también de interés, particularmente aquellos antagonistas para la actividad de TNF, leptina, cualquiera de las interleucinas, y proteínas involucradas en la activación del complemento (por ejemplo, C3b) . El término "péptido antagonista de" o "péptido inhibidor" se refiere a un péptido que bloquea o que de alguna manera interfiere con la actividad biológica de la proteína asociada de interés, o tiene actividad biológica comparable a un antagonista o inhibidor conocido de la proteína asociada de interés. De este modo, el término "péptido antagonista de TNF" comprende los péptidos que pueden ser identificados o derivados como poseedores de materia de interés antagonista de TNF; ver, por ejemplo, Takasaki et al., Nature Biotech. , 15: 1266-70 (1997). Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible que alguien seleccione péptidos diferentes de aquellos descritos efectivamente aquí, siguiendo los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. Los términos "antagonista de IL-1" y "péptido mimético de IL-lra" comprenden los péptidos que inhiben o que subregulan la activación del receptor de IL-1 por IL-1. La activación del receptor de IL-1 resulta de la formación de un complejo entre IL-1, el receptor de IL-1, y la proteína accesoria del receptor de IL-1. El antagonista de IL-1 o los péptidos miméticos de IL-lra se enlazan a IL-1, al receptor de IL-1 o a la proteína accesoria del receptor de IL-1, y obstruyen la formación del complejo entre cualesquiera dos o tres componentes del complejo. El antagonista de IL-1 o los péptidos miméticos de IL-lra ejemplares, pueden ser identificados o derivados como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,608,035, 5,786,331, 5,880,096. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible que alguien seleccione peptidos diferentes de aquellos descritos efectivamente aquí, siguiendo los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. El término "péptido antagonista de VEGF" comprende los péptidos que pueden ser identificados o derivados como poseedores de materia de interés antagonista de VEGF; ver, por ejemplo, Fairbrother, Biochem. , 3_7: 17754-64 (1998). Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible que alguien seleccione péptidos diferentes de aquellos descritos efectivamente aquí, siguiendo los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. El término "péptido inhibidor de MMP" comprende los péptidos que pueden ser identificados o derivados como poseedores de materia de interés inhibitoria de MMP; ver, por ejemplo, Koivunen, Nature Biotech. , 17: 768-74 (1999). Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible que alguien seleccione péptidos diferentes de aquellos descritos efectivamente aquí, siguiendo los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos.
Los péptidos de dirección al objetivo son también de interés, incluyendo los péptidos de alojamiento en el tumor, péptidos de transportación de membrana, y similares.
Los péptidos ejemplares pueden ser aleatoriamente generados mediante diversas técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, son bien conocidas las técnicas de síntesis en fase sólida, e incluyen aquellas descritas en Merrifield, Chem. Polypeptid.es, pp. 335-61 (Katsoyannis y Panyotis eds . ) (1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc . , 85: 2149 (1963); Davis et al., Bioc ejn. Intl., 10: 394-414 (1985); Stewart y Young, Solid Pha.se Peptide Synthesis (1969) ; Patente de los Estados Unidos No. 3,941,763; Finn et al., The Proteins, 3a edición., 2: 105-253 (1976); y Erickson et al., The Proteins, 3a ed., 2: 257-527 (1976) . La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para la elaboración de péptidos individuales, ya que éste es el método de más bajo costo de elaboración de péptidos pequeños. La representación visual de fagos es otro método útil en la generación de péptidos para el uso en la presente invención. Se ha establecido que la selección por afinidad a partir de bibliotecas de péptidos aleatorios, puede ser utilizada para identificar los ligandos peptídicos para cualquier sitio de cualquier producto génico; Dedman et al., J. Biol . Chem., 268: 23025-30 (1993). La representación visual de fagos es particularmente muy adecuada para la identificación de péptidos que se enlazan a tales proteínas de interés como los receptores de la superficie celular o cualesquiera proteínas que tengan epitopos lineales; ilson et al., Can. J. Microbiol., 44: 313-29 (1998); Kay et al., Drug Disc. Today, 3: 370-8 (1998) . Tales proteínas son extensamente revisadas en Herz et al., J. Receptor & Signal Transduction Res., G7(5): 671-776 (1997), la cual se incorpora por referencia en la presente. Los péptidos pueden también ser elaborados en células hospederas transformadas utilizando técnicas de ADN recombinante. Para hacerlo así, una molécula de ADN recombinante que codifica para el péptido es preparada. Los métodos para la preparación de tales moléculas de ADN y/o ARN son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las secuencias que codifican para los péptidos podrían ser extirpadas del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Las secuencias relevantes pueden ser creadas utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , con la inclusión de sitios de restricción útiles para la clonación subsiguiente. Alternativamente, la molécula de ADN/ARN podría ser sintetizada utilizando técnicas de síntesis química, tales como el método de fosforamidita . También, podría ser utilizada una combinación de estas técnicas. Los agentes biológicamente activos, adicionales contemplados para el uso incluyen proteínas recombinantes o de origen natural, ya sea humanas o animales, hormonas, citocinas, factores hematopoyéticos, factores de crecimiento, factores anti -obesidad, factores tróficos, factores antiinflamatorios y enzimas. Tales proteínas podrían incluir, pero no están limitadas a interferones (ver, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471 y 4,695,623 incorporadas por referencia en la presente, incluyendo las figuras) , interleucinas (ver, Patente de los Estados Unidos No. 5,075,222, incorporada por referencia en la presente incluyendo las figuras) , eritropoyetinas (ver, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933, y 5,621,080 incorporada por referencia en la presente incluyendo las figuras) , factores de estimulación de colonias de granulocitos (ver, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823, y Publicación PCT No. 94/17185, incorporadas por referencia en la presente incluyendo las figuras) , factor de células madre (Publicaciones del PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas por referencia en la presente incluyendo las figuras), NESP (Publicación del PCT No. US94/02957, incorporada por referencia en la presente incluyendo las figuras) , osteoprotegerina (Publicación del PCT No. 97/23614, incorporada por referencia en la presente incluyendo las figuras) , antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-lra) (publicaciones del PCT Nos. 91/08285 y 92/16221) y leptina (proteína OB) (Publicaciones del PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816 incorporadas por referencia en la presente incluyendo las figuras) . Además, los agentes biológicamente activos pueden también incluir pero no están limitados a insulina, gastrina, •prolactina, hormona adrenocorticotropica (ACTH, por sus siglas en inglés) , hormona estimuladora de la tiroides (TSH, por sus siglas en inglés) , hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) , hormona estimulante del folículo (FSH, por sus siglas en inglés) , gonadotropina coriónica humana (HCG, por sus siglas en inglés) , motilina, interferones (alfa, beta, gamma) , interleucinas (IL-1 a IL-12) , factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) , proteína de enlace al factor de necrosis tumoral (TNF-bp) , factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) , factor neurotrofico derivado de la neuroglia (GDNF, por sus siglas en inglés) , factor neurotrofico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento neurotrofico (NGF, por sus siglas en inglés) , factores de crecimiento óseo tales como osteoprotegerina (OPG) , factores de crecimiento similares a insulina (IGFs, por sus siglas en inglés) , factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF) , factor de estimulación de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF) , factor de crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés) , trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF, por sus siglas en inglés) , factores de crecimiento estimuladores de colonias (CSFs, por sus siglas en inglés) , proteína morfogenética ósea (BMP, por sus siglas en inglés) , superóxido-dismutasa (SOD, por sus siglas en inglés) , activador de plasminógeno tisular (TPA, por sus siglas en inglés), urocinasa, estreptocinasa y calicreina. La transtiretina (TTR, por sus siglas en inglés) contemplada para el uso en la presente invención, tendrá las secuencias de ADN y aminoácidos de TTR como se reporta en Mita et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 124 (2 ) : 558-564 (1984) . Estas secuencias han sido depositadas en Genbank como número de acceso K02091. La secuencia TTR de 127 aminoácidos utilizada en la presente no incluye la secuencia de señal (aminoácidos 1-20) de la secuencia K02091 y se describe enseguida como SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGEL HGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSY KALGISPFHEHAEWFTANDSGPRRYTIAAL LSPYSYSTTAWTNPKE El término "variante de TTR" se refiere a una molécula o secuencia que es una forma modificada de una TTR nativa. Por ejemplo, una TTR nativa comprende sitios que pueden ser removidos debido a que éstos proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridas para las moléculas de fusión de la presente invención. De este modo, el término "variante de TTR" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios de TTR nativos o residuos, o que ha tenido uno o más sitios de TTR nativos o residuos reemplazados con un aminoácido diferente, o que ha tenido uno o más residuos agregados a la secuencia. Para fines de ejemplo, una variante de TTR en donde el residuo de alanina en la posición 37 de la secuencia de aminoácidos ha sido reemplazado con un residuo de cisterna, será designada variante de TTR (A37C) , y una variante de TTR en donde el residuo de alanina en la posición 37 de la secuencia de aminoácidos y el residuo de glicina en la posición 83 de la secuencia de aminoácidos han sido ambos reemplazados con un residuo de cisteína, será designada variante de TTR (A37C/G83C) . En una modalidad, una TTR o variante de TTR fusionada a un agente biológicamente activo, puede ser fusionada a una tercera proteína o fragmento de proteína que estabiliza adicionalmente la proteína de fusión TRR-agente biológicamente activo, e incrementa con esto la vida media de la fusión resultante en suero. Los ejemplos de tales proteínas adicionales o fragmentos de las mismas que pueden ser utilizados en tales métodos y composiciones, incluyen el dominio Fe o el dominio CH2 de una inmunoglobulina, o cualquier otro dominio de proteína que alguien de experiencia ordinaria en la técnica reconozca como poseedor de propiedades que pudieran incrementar la estabilidad de la proteína (ver, por ejemplo, el Ejemplo 29 siguiente) . Tales grupos de proteínas pueden ser fusionados al extremo carboxilo o amino de la proteína de fusión TTR-agente biológicamente activo, o pueden ser colocados entre la TTR y el agente biológicamente activo. Se contempla que pueden ser colocados ligadores y espaciadores, como sea necesario, entre cada uno de los dominios de la proteína de fusión para facilitar su actividad deseada. En otra modalidad más, la TTR o la variante de TTR de la invención puede ser químicamente reticulada al agente biológicamente activo. La reticulación de las proteínas puede ser realizada mediante el uso, por ejemplo, del 3- (2-piridilditio) -propionato de N-succinimidilo (SPDP) de acuerdo a los procedimientos publicados, establecidos. Los agentes de reticulación adicionales son fácilmente disponibles y pueden ser identificados por alguien de experiencia en la técnica. Para detalles sobre el procedimiento anterior, ver,' por ejemplo, Karpovsky et al., J. Ex . Med. 160, 1686-1701 (1984); Pérez et al., Nature, 316, 354-356 (1985) o Titus et al., Journal of Immunology, 139, 3153-3158 (1987). En otra modalidad, una molécula puede ser covalentemente enlazada a la proteína de fusión tal que la estabilidad y/o la vida media en suero son incrementadas. Por ejemplo, una TTR o variante de TTR preferida puede ser químicamente modificada utilizando polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol (PEG) . El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser de cadena lineal o ramificada. El peso molecular promedio del PEG estará preferentemente en el intervalo de aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 100 kDa, más preferentemente de aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 50 kDa, lo más preferentemente 20 kDa. Los grupos PEG serán enlazados en general a los compuestos de la invención por medio de acilación, alquilación reductiva, adición de Michael, alquilación de tiol u otros métodos de conjugación/ligadura quimioselectivos , a través de un grupo reactivo sobre la porción peg (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, éster, tiol, -haloacetilo , maleimido o hidrazino) a un grupo reactivo sobre el compuesto objetivo (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, éster, tiol, -haloacetilo, maleimido o hidrazino) . Otros polímeros solubles en agua utilizados, incluyen los copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa, alcohol polivinílico , polivinilpirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano. Una molécula de ADN que codifica para el péptido de interés, proteína de interés, TTR o variante de TTR, puede ser preparada utilizando métodos conocidos de tecnología de ADN recombinante tales como aquellos descritos en Sambrook et al. {Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
[1989]) y/o Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. y Wiley y Sons, NY (1994). Un gen o ADNc que codifica para la proteína de interés o fragmento de la misma puede ser obtenido por ejemplo mediante selección de una biblioteca genómica o de ADNc con una sonda adecuada. Las sondas adecuadas incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos , fragmentos de ADNc o fragmentos de ADN genómico, que se espera tengan alguna homología al gen que codifica para la proteína de interés, tal que la sonda se hibridará con el gen que codifica para la proteína de interés bajo condiciones de hibridación seleccionadas. Un medio alternativo de selección de una biblioteca de ADN es mediante la reacción en cadena de polimerasa "PCR", que es la amplificación del gen que codifica para la proteína de interés. La PCR es típicamente llevada a cabo utilizando "cebadores" oligonucleotídicos que tienen una secuencia que se cree tiene suficiente homología al gen que va a ser amplificado, tal que al menos una porción suficiente del cebador se hibridará con el gen. Alternativamente, un gen que codifica para el péptido de interés o la proteína de interés, puede ser preparado mediante síntesis química utilizando métodos bien conocidos para el experto en la técnica, tales como aquellos descritos por Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed. , 2_8: 716-734 (1989) . Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos de fosfotriéster, fosforamidita y H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un método preferido para tal síntesis química es la síntesis apoyada por polímero utilizando la química estándar de la fosforamidita . Típicamente, el ADN que codifica para la proteína de interés será de varios cientos de nucleótidos de longitud. Acidos nucleicos más grandes de aproximadamente 100 nucleótidos pueden ser sintetizados como varios fragmentos, utilizando estos métodos. Los fragmentos pueden ser luego ligados entre sí para formar un gen que codifica para la proteína de interés de longitud completa. Usualmente, el fragmento de ADN que codifica para el extremo amino del polipéptido tendrá un ATG, que codifica para un residuo de metionina. Esta metionina puede o no estar presente sobre la forma madura de la proteína de interés. La metionina puede ser removida dentro de la célula o durante el proceso de secreción. Los polipéptidos TTR preferidos pueden incluir TTR con la secuencia de ácido nucleico alterada para optimizar la expresión en E. coli, y para introducir sitios de restricción convenientes. Una discusión general de la optimización del codón para la expresión en E. coli, se describe en Kane, Curr. Opin . Biotechnol . , 6: 494-500 (1995). Una vez que los genes que codifican para la proteína de interés y el polipéptido TTR han sido obtenidos, éstos pueden ser modificados utilizando métodos estándares para crear sitios de endonucleasa de restricción en los extremos 5' y/o 3' . La creación de los sitios de restricción permite que los genes sean adecuadamente insertados dentro de los vectores de amplificación y/o expresión. La adición de los sitios de restricción es típicamente lograda utilizando PCR, donde un cebador de cada reacción de PCR contiene típicamente, entre otras, la secuencia de nucleótidos del sitio de restricción deseado. El gen o ADNc que codifica para el péptido de interés, o la proteína de interés, puede ser insertado en un vector de expresión apropiado para la expresión en una célula hospedera. El vector se selecciona para ser funcional en la célula hospedera particular empleada (por ejemplo, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedera, tal que puede ocurrir la amplificación y/o la expresión del gen que codifica para la proteína de interés) . Típicamente, los vectores utilizados en cualquiera de las células hospederas contendrá un promotor (también denominada como una "secuencia flanqueante 5'") y otros elementos reguladores también, tal como uno o varios aumentadores, un origen del elemento de replicación, un elemento de terminación de la transcripción, un elemento del sitio de enlace al ribosoma, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que va a ser expresado, y un elemento marcador seleccionable . Cada uno de estos elementos es discutido más adelante. Opcionalmente , el vector puede contener una secuencia de ADN de "etiqueta" por ejemplo una secuencia oligonucleotídica localizada ya sea en el extremo 5' o 3' de la construcción del ADN de fusión. El ADN de etiqueta o marcador codifica para una molécula tal como hexa-His, c-myc, FLAG (Invitrogen, San Diego, California) u otra secuencia inmunogénica pequeña. Cuando se coloca en la estructura de lectura adecuada, esta etiqueta será expresada junto con la proteína de fusión, y puede servir como una etiqueta o marcador de afinidad para la purificación de la proteína de fusión a partir de la célula hospedera. Opcionalmente, la etiqueta o marcador puede ser subsecuentemente removido de la proteína de fusión purificada por diversos medios tales como el uso de una peptidasa seleccionada, por ejemplo. El promotor puede ser homólogo (por ejemplo, de la misma especie y/o cepa como la célula hospedera) , heterólogo (por ejemplo, de una especie diferente de la especie o cepa de la célula hospedera) , híbrido (por ejemplo, una combinación de promotores provenientes de más de una fuente) , sintético, o éste puede ser una proteína nativa del promotor de interés. Además, el promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible. Como tal, la fuente del promotor puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico unicelular, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que el promotor sea funcional en, y pueda ser activado por, la maquinaria de la célula hospedera. Los promotores útiles en los vectores de esta invención pueden ser obtenidos mediante cualquiera de los diversos métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, los promotores útiles en la presente habrán sido previamente identificados mediante el trazado del mapa y/o mediante la digestión con endonucleasa de restricción, y pueden de este modo ser aislados de la fuente tisular apropiada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia nucleotídica completa del promotor puede ser conocida. Aquí, el promotor puede ser sintetizado utilizando los métodos descritos anteriormente para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos. Donde toda o solamente una porción de la secuencia promotora es conocida, el promotor completo puede ser obtenido utilizando PCR y/o mediante selección de una biblioteca genómica con el oligonucleótido adecuado y/o los fragmentos de la secuencia flanqueante 5' provenientes de la misma o de otra especie. Los promotores adecuados para practicar esta invención son promotores inducibles tales como el promotor lux, el promotor lac, el promotor de arabinosa, el promotor trp, el promotor tac, el promotor tna, los promotores lambda sintéticos (del bacteriófago lambda) , y los promotores T5 o T7. Los promotores preferidos incluyen los promotores lux y lac . El origen del elemento de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procarióticos ya sea comercialmente adquiridos o construidos por el usuario. En algunos casos, la amplificación del vector a cierto número de copias puede ser importante para la expresión óptima de la proteína o del polipéptido de interés. En otros casos, un número de copias constantes es preferido. En cualquier caso, un vector con un origen de replicación que cumple los requerimientos puede ser fácilmente seleccionado por el experto en la técnica. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, se puede sintetizar químicamente con base en una secuencia conocida, y ligado dentro del vector. El elemento de terminación de la transcripción está típicamente localizado 3' del extremo de la construcción de ADN de la proteína de fusión, y sirve para terminar la transcripción del ARN mensajero que codifica para el polipéptido de fusión. Usualmente, el elemento de terminación de la transcripción en las células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli-T. Mientras que el elemento es fácilmente clonado a partir de una biblioteca o incluso adquirido comercialmente como parte de un vector, éste puede ser también fácilmente sintetizado utilizando métodos para las síntesis de ácidos nucleicos, tales como aquellos descritos anteriormente. Los vectores de expresión contienen típicamente un gen que codifica para un marcador seleccionable . Este gen codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y el desarrollo de una célula hospedera desarrollada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección, típicos, codifican para proteínas que (a) confieren resistencia contra antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol , o kanamicina para células hospederas procarióticas, (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, el gen de resistencia al cloramfenicol , y el gen de resistencia a la tetraciclina . El elemento de enlace al ribosoma, comúnmente llamado secuencia de Shine-Dalgarsin procariotes, es necesario para el inicio de la traducción del ARNm. El elemento está típicamente localizado 3' al promotor y 5' a la secuencia de codificación de la construcción de ADN de la proteína de fusión. La secuencia Shine-Dalgarno es variada pero es típicamente una polipurina (por ejemplo, que tiene un alto contenido de A-G) . Muchas secuencias de Shine-Dalgarno han sido identificadas, cada una de las cuales puede ser fácilmente sintetizada utilizando los métodos descritos anteriormente y utilizadas en un vector procariótico. Donde uno o más de los elementos descritos anteriormente no están ya presentes en el vector que va a ser utilizado, éstos pueden ser individualmente obtenidos y ligados dentro del vector. Los métodos utilizados para obtener cada uno de los elementos son bien conocidos para el experto en la técnica, y son comparables a los métodos descritos anteriormente (por ejemplo, síntesis de ADN, selección de biblioteca y similares) . Cada elemento puede ser individualmente ligado dentro del vector mediante el corte del vector con la o las endonucleasas de restricción apropiadas tal que los extremos del elemento en el que va a ser ligado, y los extremos del vector, son compatibles para la ligadura. En algunos casos, puede ser necesario "enromar" los extremos que van a ser ligados entre sí, con el fin de obtener una ligadura satisfactoria. El enromado puede ser realizado primeramente mediante el relleno de los "extremos pegajosos" utilizando una enzima tal como la ADN-polimerasa de Klenow o la ADN-polimerasa T4 en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento es bien conocido en la técnica y es descrito por ejemplo en Sambrook et al., supra. Alternativamente, dos o más de los elementos que van a ser insertados dentro del vector pueden ser primeramente ligados entre sí (si éstos van a ser colocados adyacentes uno al otro) y luego ligados dentro del vector. Otro método más para la construcción del vector es conducir todas las ligaduras de los diversos elementos simultáneamente en una mezcla de reacción. Aquí, muchos vectores sin sentido o no funcionales pueden ser generados debido a la ligadura inadecuada o a la inserción de los elementos, no obstante el vector funcional puede ser identificado mediante la expresión del marcador seleccionable . La secuencia adecuada del producto de ligadura puede ser confirmada mediante digestión con endonucleasas de restricción o mediante el secuenciamiento de ADN. Después de que el vector ha sido construido y la construcción de ADN de la proteína de fusión ha sido insertada dentro del sitio adecuado del vector, el vector completado puede ser insertado dentro de una célula hospedera adecuada para la expresión de la proteína de fusión. Las células hospederas adecuadas para la presente invención son células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, JM109, DH5a, DH10, y MC1061) son células hospederas bien conocidas para el uso en la preparación de polipéptidos recombinantes. La elección de la cepa bacteriana es típicamente realizada de modo que la cepa y el vector de expresión que va a ser utilizado, son compatibles. Diversas cepas de B. subtilis, Pseudo onas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces spp. , y similares, pueden también ser empleadas en la práctica de esta invención, en conjunto con los vectores de expresión apropiados. La inserción (también denominada "transformación" o transíección" ) del vector dentro de la célula hospedera seleccionada, puede ser llevada a cabo utilizando métodos tales como la precipitación con fosfato de calcio o la electroporación. El método seleccionado, en parte, será función del tipo de célula hospedera que va a ser utilizada. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos para la persona experta, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., supra. Las células hospederas que contienen el vector (por ejemplo, las células hospederas transformadas o transíectadas) pueden ser cultivadas utilizando uno o más de los medios estándares bien conocidos para el experto en la técnica. El medio seleccionado contendrá típicamente todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y supervivencia de las células hospederas. Los medios adecuados para el cultivo de células de E. coli son, por ejemplo, caldo Luria ( "LB" ) , caldo YT, SOB, SOC y/o el caldo Terrific ( "TB" ) . Existen varias formas para preparar la construcción de ADN que codifica para la proteína de fusión, que comprende el gen de TTR, el gen que codifica para el péptido o proteína de interés y, opcionalmente, de una molécula de ADN que codifica para un polipéptido ligador que está localizado entre los dos genes. En un procedimiento, el gen de TTR y el gen que codifica para la proteína de interés (los "genes socios de fusión") pueden ser ligados entre sí en cualquier orientación (por ejemplo, el gen de TTR en el extremo 5' o 3' de la construcción) . Donde una molécula de ADN ligador va a ser incluida, ésta puede ser primeramente ligada a uno de los genes socios de fusión, y esta construcción puede ser luego ligada al otro gen socio de fusión. Las ligaduras son típicamente realizadas utilizando la enzima ADN-ligasa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un procedimiento separado proporciona primeramente la ligadura de un gen socio de fusión dentro del vector seleccionado, después de lo cual el otro gen socio de fusión puede ser ligado dentro del vector en una posición que es ya sea 3' o 5' al primer gen socio de fusión. Donde una molécula ligadora de ADN va a ser incluida, la molécula ligadora de ADN puede ser ligada ya sea al gen socio de fusión ya sean antes o después de que el gen haya sido ligado dentro del vector. Los TTR-TMPs de la presente invención pueden ser utilizados para tratar condiciones en general conocidas como aquellas que involucran una deficiencia existente de megacariocitos/plaquetas o una deficiencia esperada de megacariocitos/plaquetas (por ejemplo, debido a la cirugía planeada o a la donación de plaquetas) . Tales condiciones usualmente serán el resultado de una deficiencia (temporal o permanente) del ligando Mpl activo in vivo. El término genérico para la deficiencia plaquetaria es la trombocitopenia, y por lo tanto los métodos y composiciones de la presente invención son en general disponibles para tratar la trombocitopenia en pacientes en necesidad de las mismas. La trombocitopenia (deficiencias plaquetarias) puede estar presente por diversas razones, incluyendo la quimioterapia y otras terapias con una variedad de fármacos, terapia con radiación, cirugía, pérdida accidental de sangre, y otras condiciones de enfermedad específicas.
Las condiciones de enfermedad específicas, ejemplares que involucran la trombocitopenia y pueden ser tratadas de acuerdo con esta invención son: anemia aplástica, trombocitopenia idiopática, tumores metastáticos que dan como resultado trombocitopenia, lupus eritematoso sistémico, esplenomegalia, síndrome de Fanconi, deficiencia de vitamina B12 , deficiencia de ácido fólico, anomalía de May-Hegglin, síndrome de iskott-Aldrich, y hemoglobinuria nocturna paroximal . También, ciertos tratamientos para el SIDA dan como resultado la trombocitopenia (por ejemplo, AZT) . Ciertos desórdenes de sanado de heridas pueden también beneficiarse de un incremento en los números de plaquetas. Con respecto a las deficiencias plaquetarias anticipadas, por ejemplo, debido a la cirugía futura, un compuesto de la presente invención podría ser administrado varios días a varias horas antes de la necesidad para las plaquetas. Con respecto a las situaciones agudas, por ejemplo, pérdida de sangre accidental y masiva, un compuesto de esta invención podría ser administrado junto con sangre o plaquetas purificadas. Los compuestos TMP de esta invención pueden también ser útiles en la estimulación de ciertos tipos celulares diferentes de los megacariocitos , si se encuentra que tales células expresan el receptor Mpl . Las condiciones asociadas con tales células que expresan el receptor Mpl, que son responsables de la estimulación por el ligando Mpl, están también dentro del alcance de esta invención. Los compuestos TMP de esta invención pueden ser utilizados en cualquier situación en la cual se desee la producción de plaquetas o células precursoras de plaquetas, o en la cual se desee la estimulación del receptor c-MPl. De este modo, por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden ser utilizados para tratar cualquier condición en un mamífero, en donde existe una necesidad de plaquetas, megacariocitos y similares. Tales condiciones son descritas con detalle en las siguientes fuentes ejemplares: W095/26746; W095/21919; W095/18858; WO95/21920 y se incorporan por referencia en la presente . Los compuestos TMP de esta invención pueden también ser útiles en el mantenimiento de la viabilidad o vida de almacenamiento de las plaquetas y/o megacariocitos, y células relacionadas. En consecuencia, podría ser útil el incluir una cantidad efectiva de uno o más de tales compuestos en una composición que contenga tales células. Los métodos terapéuticos, composiciones y compuestos de la presente invención pueden también ser empleados, solos o en combinación con otras citocinas, receptor Mpl soluble, factores hematopoyéticos, interleucinas , factores de crecimiento o anticuerpos en el tratamiento de estados de enfermedad caracterizados por otros síntomas, así como deficiencias de plaquetas. Se anticipa que el compuesto de la invención probará ser útil en el tratamiento de algunas formas de trombocitopenia en combinación con estimuladores generales de la hematopoyesis, tales como IL-3 o GM-CSF. Otros factores estimuladores de megacariocitos, por ejemplo, meg-CSF, factor de células madre (SCF) , factor inhibitorio de la leucemia (LIF) , oncostatina M (OSM) , u otras moléculas con actividad de estimulación de megacariocitos, pueden también ser empleadas con el ligando Mpl . las citocinas ejemplares adicionales o los factores hematopoyéticos para tal coadministración, incluyen IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor de estimulación de colonias 1 (CSF-1) , SCF, GM-CSF, factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , EPO, interferón alfa (IFN-alfa) , interferón de consenso, IFN-beta, o IFN-gamma. Puede ser además útil el administrar, ya sea simultánea o secuencialmente , una cantidad efectiva de un receptor Mpl de mamífero, soluble, el cual parece tener un efecto de provocar que los megacariocitos se fragmenten en plaquetas una vez que los megacariocitos han alcanzado la forma madura. De este modo, la administración de un compuesto de la invención (para aumentar el número de megacariocitos maduros) seguido por la administración del receptor Mpl soluble (para inactivar el ligando y permitir que los megacariocitos maduros produzcan plaquetas) se espera que sea un medio particularmente efectivo de estimular la producción de plaquetas. La dosificación apropiada podría ser ajustada para compensar tales componentes adicionales en la composición terapéutica. El progreso del paciente tratado puede ser monitorizado por métodos convencionales. En la diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM, por sus siglas en inglés) , también conocida como diabetes tipo 2, la administración a los pacientes del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) tiene propiedades antidiabéticas. Sin embargo, GLP-1 es rápidamente degradado por la dipeptidil-peptidasa IV (DPPIV) después de su liberación in vivo. De este modo, es una ventaja de la presente invención que un péptido GLP-1 o una variante del mismo pueda ser fusionado a un polipéptido TTR de la invención, para estabilizar GLP-1 e incrementar su vida media i ? vivo. En consecuencia, en otra modalidad más de la invención, una proteína de fusión TTR-GLP-1 como se describe en la presente, puede ser utilizada para tratar condiciones que en general se sabe que involucran la diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) , que es también conocida como diabetes tipo II. Una persona de experiencia en la técnica reconocerá que la secuencia de un péptido GLP-1 puede ser variada, tal que ésta conserve sus efectos insulinotrópicos . Los ejemplos particulares de tales variaciones, conocidos en la técnica, incluyen por ejemplo GLP-l(7-34), (7-35), (7-36) O (7-37), Gln9-GLP-1 (7-37) , D-Gln9-GLP- 1 ( 7-37) , Thr16-Lys18-GLP-1 (7-37) , y Lys18-GLP-1 (7-37) . Ejemplos adicionales de variantes de GLP-1 se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,118,666, 5,545,618, 5,977,071 y WO02/46227 y en Adelhorst et al., J. Biol . Chem. 269: 6275 (1994), que se incorporan por referencia. En consecuencia, cualquier péptido GLP-1 puede ser utilizado para generar proteínas de fusión de la invención, siempre y cuando la proteína de fusión de GLP-1 sea capaz de enlazarse y de inducir una señal a través de su receptor cognado. El enlace al receptor y la activación pueden ser medidos mediante ensayos estándares (Patente de los Estados Unidos No. 5,120,712) . La dosis de la proteína de fusión, efectiva para normalizar la glucosa sanguínea de un paciente, dependerá de un número de factores entre los cuales se incluyen el peso del sujeto, la edad, la severidad de su incapacidad para regular la glucosa sanguínea, la ruta de administración, la biodisponibilidad, el perfil farmacocinético de la proteína de fusión y la formulación como se discute más completamente más adelante. Los métodos terapéuticos, las composiciones y los compuestos de la presente invención pueden también ser empleados, solos o en combinación con otros tratamientos para la diabetes, incluyendo pero no limitados a la insulina, inhibidores de DDPIV y similares. La dosificación de la proteína de fusión GLP-1 podría ser ajustada para compensar tales componentes adicionales en la composición terapéutica. El progreso del paciente tratado puede ser monitorizado por métodos convencionales, tales como, por ejemplo, el monitoreo de los niveles de la glucosa sanguínea. La presente invención también proporciona las composiciones farmacéuticas de los compuestos de la invención. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para la administración por inyección, o para la administración oral, nasal, transdérmica u otras formas de administración, incluyendo, por ejemplo, las administraciones intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperi oneal , intratecal, infraocular, retrobulbar, intrapulmonar (por ejemplo, fármacos aerosolízados) o inyección subcutánea (incluyendo de depósito para la liberación a largo plazo) ; mediante la implantación sublingual, anal, vaginal o quirúrgica, por ejemplo, incrustados bajo la cápsula esplénica, del cerebro o en la cornea. El tratamiento puede consistir de una dosis simple de una pluralidad de dosis en un periodo de tiempo. En general, por la presente invención están incluidas las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de un compuesto de la presente invención, junto con diluyentes, conservadores, estabilizadores, solubilizantes , emulsificantes , adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes de diversos contenidos de amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato, citrato, etc.), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizadores (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80, etc.), agentes anti -oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) , conservadores (por ejemplo, Timersol , alcohol bencílico) y sustancias de volumen (por ejemplo, lactosa, manitol) ; la incorporación del material dentro de las preparaciones particuladas de los compuestos ' poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. El ácido hialurónico puede también ser utilizado, y éste puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir opcionalmente todavía otros diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos farmacéuticamente aceptables, que sirven como vehículos, excipientes o medios farmacéuticos, incluyendo pero no limitados a, monolaurato de polioxietilensorbitan, estearato de magnesio, hidroxibenzoato de metilo y de propilo, almidones, sucrosa, dextrosa, goma de acacia, fosfato de calcio, aceite mineral, manteca de cacao y aceite de teobroma. Tales composiciones pueden influenciar el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de despejo in vivo de las presentes proteínas y derivados. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que se incorpora por referencia en la presente. Las composiciones pueden ser preparadas en forma líquida, o pueden estar en forma de polvo seco, tal como la forma liofilizada. Las formulaciones de liberación sostenida, implantables son también contempladas, como lo son las formulaciones transdérmicas . La formulación de liberación controlada puede ser deseable. El fármaco podría ser incorporado en una matriz inerte que permita la liberación ya sea mediante mecanismos de difusión o de lixiviación, por ejemplo, las gomas. Las matrices que se degeneran lentamente pueden también ser incorporadas en la formulación, por ejemplo, alginatos, polisacáridos . Otra forma más de una liberación controlada de este producto terapéutico es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), por ejemplo, el fármaco es encerrado en una membrana semipermeable la cual permite que el agua entre y empuje al fármaco hacia afuera a través de una abertura pequeña simple, debido a efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos tienen ya un efecto de liberación retardada. En la presente, también se contempla la distribución pulmonar de la presente proteína (o derivados de la misma) . La proteína (o el derivado) es administrada a los pulmones de un mamífero mientras que se inhala y atraviesa el revestimiento epitelial del pulmón hacia la corriente sanguínea. (Otros reportes de éste incluyen Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990) (acetato de leuprólido) ; Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (supl. 5); s. 143-146 (1989) (endotelina- 1 ) ; Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3: 206-212 (1989) (1-antitripsina) ; Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (1-proteinasa) ; Oswein et al., "Aerosolization of Proteins" , Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, Marzo 1990 (hormona humana del crecimiento recombinante) ; Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) ( interferón-y factor de necrosis tumoral) y Platz et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,284,656 (factor de estimulación de colonias de granulocitos) . Contemplados para el uso en la práctica de esta invención, está una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de los productos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a nebulizadores , inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para aquellos expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles, adecuados para la práctica de esta invención, son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt , Inc., St . Louis, Missouri; el nebulizador Acora II fabricado por Marquest Medial Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachussets . Todos los dispositivos tales requieren el uso de formulaciones adecuadas para surtir el compuesto de la invención. Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado, y puede involucrar el uso de un material propelente apropiado, además de los diluyentes, adyuvantes y/o portadores útiles en terapia. El compuesto de la invención debe ser, lo más ventajosamente, preparado en forma particulada con un tamaño de partícula promedio menor de 10 µp? (o mieras) , más preferentemente de 0.5 a 5 µp?, para la distribución más efectiva hacia el pulmón distal .
Los portadores incluyen carbohidratos tales como trehalosa, manitol, xilitol, sucrosa, lactosa, y sorbitol. Otros ingredientes para el uso en las formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden ser utilizados surfactantes naturales o sintéticos. Se puede utilizar polietilenglicol (incluso aparte de su uso en la derivatización de la proteína o del análogo) . Pueden ser utilizados dextranos, tales como ciclodextrano . Pueden ser utilizadas sales biliares u otros aumentadores relacionados. Pueden ser utilizados celulosa y derivados de celulosa. Pueden ser utilizados aminoácidos, tales como el uso de una formulación amortiguadora. El régimen de dosificación involucrado en un método para tratar las condiciones anteriormente descritas, será determinado por el médico que atiende, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo la edad, la condición, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. En general, la dosis debe estar en el intervalo de 0.1 µg a 100 mg del compuesto de la invención por kilogramo de peso corporal por día, preferentemente 0.1 a 1000 y más preferentemente 0.1 a 150 g/kg, dados en dosis diarias o en dosis equivalentes a intervalos más largos o más cortos, por ejemplo, cada tercer día, dos veces a la semana, semanalmente , o dos o tres veces al día. Los compuestos de la invención pueden ser administrados mediante un bolo inicial, seguido por una infusión continua para mantener los niveles terapéuticos en circulación del producto farmacológico. Como otro ejemplo, los compuestos de la invención pueden ser administrados como una dosis de un solo tiempo. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica optimizarán fácilmente las dosificaciones efectivas y los regímenes de administración como son determinados por las buenas prácticas médicas y la condición clínica del paciente individual. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes, y de la ruta de administración. La formulación farmacéutica óptima será determinada por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, dependiendo de la ruta de administración y de la dosis deseada. Ver por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co . , Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, la cual se incorpora por referencia en la presente. Dependiendo de la ruta de administración, una dosis adecuada puede ser calculada de acuerdo al peso corporal, al área superficial del cuerpo o al tamaño del órgano. Las dosis apropiadas pueden ser evaluadas a través del uso de ensayos establecidos para determinar los niveles en suero, en conjunto con los datos de dosis-respuesta apropiados. El régimen final de dosificación será determinado por el médico que atiende, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la severidad del daño y la capacidad de respuesta del paciente, la edad, la condición, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Ya que son conducidos estudios, surgirá información adicional respecto a los niveles de dosificación apropiados y a la duración del tratamiento para diversas enfermedades y condiciones. Los siguientes ejemplos están destinados para fines de ilustración únicamente, y no deben ser considerados como limitantes de la invención, de ningún modo. EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la preparación del ADN para la transtiretina humana recombinante nativa (TTR) y las siguientes variantes de TTR: TTR(CIOA), TTR (C10A/A37C) , TTR (C10A/D38C) , TTR (C10A/A81C) , TTR (C10A/G83C) , y TTR (C10A/K15A/G83C) . El plásmido de expresión pAMG21 es disponible de la ATCC bajo el número de acceso 98113, que fue depositado el 24 de julio de 1996 (ver PCT W097/23614, publicado el 3 de julio de 1997 para una descripción de pAMG21) . La secuencia de ADN que codifica para TTR, variantes de TTR o fusiones TTR-péptido, se colocó bajo el control del promotor LuxPR en pAMG21. El hospedero bacteriano GM221 está en la cepa K-12 de E. coli que ha sido modificada para contener el represor lambda cI857s7 sensible a la temperatura en la región ebg temprana y el represor lacIQ en la región ebg tardía (68 minutos) . La presencia de estos dos genes represores permite el uso de este hospedero con una variedad de sistemas de expresión, no obstante estos dos represores son irrelevantes para la expresión a partir de luxPR. El hospedero no transformado no tiene resistencias contra antibióticos. El •sitio de enlace ribosomal del gen cI857s7 ha sido modificado para incluir un RBS mejorado. Este ha sido insertado dentro del operón ebg entre las posiciones de los nucleótidos 1170 y 1411, como se numeran en el número de acceso de Genbank M64441Gb_Ba con supresión de la secuencia ebg de intervención. La construcción fue distribuida al cromosoma utilizando un fago recombinante llamado RBS #4 mejorado por MMebg-cI857s7 dentro de F'tet/393. Después de la recombinacion y resolución únicamente el inserto cromosómico descrito anteriormente permanece en la célula. Este fue renombrado F'tet/GMIOl. El F' tet/GM101 fue luego modificado mediante la distribución de una construcción lacIQ dentro del operón ebg entre las posiciones de nucleótidos 2493 y 2937, como se numeran en el número de acceso M644 1Gb_Ba de Genbank, con la supresión de la secuencia ebg de intervención. La construcción fue distribuida al cromosoma utilizando un fago recombinante llamado AGebg-lacIQ #5 dentro de F' tete/GMIOl . Después de la recombinación y la resolución únicamente el inserto cromosómico descrito anteriormente permanece en la célula. Este fue renombrado F'tet/GM221. El episoma de F'tet fue curado a partir de la cepa utilizando naranja de acridina a una concentración de 25 µ9/t?1 en LB. La cepa curada fue identificada como sensible a la tetraciclina y se almacenó como GM221. Los oligonucleótidos (1.0 nra cada uno) fueron sintetizados mediante el método de la fosforamidita . Los nucleótidos fueron, en algunos casos, alterados para la expresión optimizada en E. coli. Estos cambios de codones no dieron como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos. Cada uno de los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo son listados en la Tabla 1. Se realizó la PCR con la Polimerasa Expand Long de acuerdo al protocolo del fabricante (Boehringer Mannheim) . Los productos de PCR fueron verificados mediante electroforesis en gel de agarosa, purificados y digeridos con Ndel y Xhol (New England Biolabs) . El vector de expresión pAMG21 fue digerido de la misma manera y luego tratado con fosfatasa intestinal de ternera (Boehringer Mannheim) . El vector y el inserto fueron purificados a partir de un gel de agarosa, luego mezclados y ligados por la ADN-ligasa T4 (New England Biolabs) . La ligadura fue realizada a 4°C por 2 horas. Cada mezcla de ligadura fue transformada mediante electroporación dentro de la cepa hospedera GM221 descrita anteriormente con un Biorad GenePulser (Biorad Laboratories) utilizando 2.5 V, 25 µ?? y 200 ohmios en una cubeta con una longitud de espacio vacío de aproximadamente 2 mm. Después de la electroporación, las células se dejaron recuperar en 1 mi de caldo Luria (LB) por aproximadamente 1 hora a 37 °C con agitación suave. La mezcla de transformación completa fue sembrada en placa sobre agar LB que contenía 50 µg/ml de kanamicina. Las colonias fueron seleccionadas para la presencia del peso molecular deseado mediante PCR, utilizando los oligonucleótidos dirigidos contra la secuencia vector flanqueante. Los productos de PCR fueron evaluados mediante electroforesis en gel de agarosa. Los clones positivos fueron además seleccionados por la habilidad de producir el producto proteico recombinante y finalmente verificados mediante secuenciamiento de nucleotidos. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de TTR son conocidas (Mita, S et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 124 (2) , 558-564
[1984] ) . Estas secuencias han sido depositadas en Genbank como número de acceso K02091. El ADNc de TTR nativa excluyendo el péptido de señal, se clonó a partir de una biblioteca de ADNc derivada de hígado humano (Clontech) . Específicamente, un oligonucleótido que codifica para ocho codones del extremo 5' de TTR (oligo 2693-79) y un oligonucleótido que codifica para siete codones del extremo 3' de TTR, incluyendo un codón de terminación (oligo 2693-80) fueron sintetizados y utilizados para amplificar la TTR madura de longitud completa con la polimerasa Expand Long utilizando la biblioteca de ADNc de hígado humano, como plantilla. El fragmento de PCR resultante fue digerido con Ndel y Xhol, purificado en gel y ligado con el vector de expresión pAMG21 restringido en Ndel/Xhol. Después de 2 horas a 4°C, la mezcla de ligadura fue sometida a electroporesis dentro de células GM221. Las colonias simples fueron recogidas y el ADN plasmídico fue preparado y secuenciado. Se mostró que un plásmido resultante (cepa #5316) tenía la secuencia correcta de ADN de TTR nativa (mas una metionina en el extremo N) y se utilizó para la expresión. Esta secuencia de ADN es identificada en la SEQ ID NO: 2. El mutante TTR (C10A) se elaboró mediante el uso del oligonucleótido 2693-80 anterior y el oligonucleótido 2820-88 (abarca los primeros 11 codones de TTR nativa en la cual el codón Cys en la décima posición fue cambiado a Ala) . El procedimiento de PCR y el proceso para seleccionar la cepa de expresión fueron similares a aquel descrito anteriormente. La cepa resultante (cepa #5419) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 3. El plásmido 5619 fue modificado además mediante el reemplazo de los aminoácidos en las siguientes posiciones: A37, D38, A81 y G83, con el aminoácido cisteína. Como se describe más adelante, cada par de los oligonucleótidos complementarios que albergan las mutaciones deseadas, se utilizó en conjunto con los cebadores 5' y 3' de TTR descritos anteriormente, en un procedimiento de PCR estándar de dos pasos, diseñado para la mutagénesis específica del sitio. Cada uno de los cebadores delanteros fueron utilizados por un cebador 3' de TTR y cada uno de los cebadores inversos fue utilizado con un cebador 5' de TTR en una PCR de 20 ciclos en la cual el plásmido derivado de la cepa 5619 se utilizó como la plantilla. Los fragmentos 5' y 3' amplificados por PCR, resultantes, fueron mezclados y utilizados como la plantilla para la PCR del segundo paso, para generar los mutantes de longitud completa. Los procedimientos subsecuentes de clonación y secuenciamiento fueron similares a aquellos ya descritos. Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos : TTR(A37C) delantero (Oligo 2823-91); TTR(A37C) inverso (Oligo 2823-92); TTR(D38C) delantero (Oligo 2823-93) ; TTR(D38C) inverso (Oligo 2823-94) ; TTR(A81C) delantero (Oligo 2823-95); TTR(A81C) inverso (Oligo 2823-96), TTR(G83C) delantero (Oligo 2823-97); TTR(G83C) inverso (Oligo 2823-98). Las cepas de E. coli resultantes que contienen los plásmidos se describen como sigue: TTR (C10A/A37C) (cepa 5641) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 4. TTR/C10A/D38C) (cepa 5642) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 5. TTR (C10A/A81C) (cepa 5643) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 6. TTR (C10A/G83C) (cepa 5651) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 7. La Lys en la 15a posición en la cepa 5651 fue además mutagenizada a Ala utilizando los oligonucleótidos 2953-67 y 2953-68 mediante un procedimiento similar a aquel descrito para las cepas 5641, 5642, 5643 y 5651. La cepa •resultante TTR (C10A/K15A/G83C) (cepa 5895) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 8. TABLA 1 Oligo Secuencia SEQ ID Número 2693-79 GAGGAATAACATATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAA 18 2693-80 CCGCGGATCCTCGAGATTATTCCTTGGGATTGGTGA 19 2820-88 GAGGAATAACATATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAA TCCAAGGCTCCT 20 2823-91 AGAAAGGCTTGTGATGACACCTGG 21 2823-92 CCAGGTGTCATCACAAGCCTTTCT 22 2823-93 AGAAAGGCTGCTTGTGACACCTGG 23 2823-94 CCAGGTGTCACAAGCAGCCTTTCT 24 2823-95 TACTGGAAGTGTCTTGGCATCTCC 25 2823-96 GGAGATGCCAAGACACTTCCAGTA 26 2823-97 AAGGCACTTTGCATCTCCCCATTC 27 2823-98 GAATGGGGAGATGCAAAGTGCCTT 28 2953-67 CTGATGGTCGCAGTTCTAGAT 29 2953-68 ATCTAGAACTGCGACCATCAG 30 EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la preparación de diversas fusiones de TMP-TTR. Varias proteínas de fusión que contienen TTR y un TMP fueron preparadas. Cada uno de los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo se lista en la Tabla 2. Un fragmento que contiene el TMP fue primeramente amplificado a partir de una cepa que alberga un plásmido que codifica para una fusión TMP-Fc de longitud completa (ver Publicación del PCT No. 00/24770) utilizando los oligonucleótidos 2743-96 que codifican para los primeros 7 codones del TMP más una extensión 5' de 12 nucleótidos que incluye un sitio Ndel, y 2743-97 que codifica para los primeros 7 codones de TTR nativo y los últimos 7 codones del TMP de interés. El fragmento de PCR resultante fue mezclado con el plásmido derivado de la cepa 5619 y la mezcla se utilizó como una plantilla para los cebadores oligonucleotídicos 2743-96 y 2693-8 para amplificar TMP-TTR de longitud completa. Se utilizaron procedimientos similares a los descritos anteriormente para la clonación y expresión. La cepa resultante, TMP-TTR (cepa 5513) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 9. El TMP fue luego introducido al extremo N de la cepa 5641, 5642, 5643 y 5651, respectivamente. El plásmido 5513 fue digerido con Xbal, el inserto Xbal/Xbal resultante que contenia el TMP y los primeros 18 codones de TTR(CIOA) fue purificado en gel y ligado con el vector restringido en Xbal, tratado con fosfatasa y purificado en gel, proveniente de 5641, 5642, 5643 y 5651. El secuenciamiento de ADN fue realizado para seleccionar la orientación correcta para cada ¦fusión. Las cepas de E. coli resultantes que contienen los plásmidos se describen como sigue: TMP-TTR (C10A/A37C) (cepa 5704) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 10. TMP-TTR (C10A/D38C) (cepa 5705) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 11. TMP-TTR (C10A/A81C) (cepa 5706) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 12. TMP-TTR (C10A/G83C) (cepa 5707) tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 13. TABLA 2 Oligo Secuencia SEQ ID Número 2743-96 GAGGAATAACATATGATCGAAGGTCCGACTCTGCGT 31 2743-97 TTCACCGGTACCAGTTGGACCTGCGCGTGCTGCAAG CCATT 32 EJEMPLO 3 Este ejemplo describe la preparación de la fusión PTH (1-34) -TTR (C10A/K15A/G83C) . Cada uno de los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo se lista en la Tabla 3. Dos nuevos oligonucleótidos,. el oligonucleótido 2694-01, que codifica para los primeros 7 codones de PTH humana, y el oligonucleótido 2694-03, que codifica para los primeros 7 codones de TTR y los aminoácidos 28-34 de PTH, fueron sintetizados para realizar la fusión. Los oligonucleótidos 2694-01 y 2694-03 fueron utilizados en un procedimiento de PCR de 20 ciclos como se describe anteriormente para amplificar PTH (1-34) con el ligador de TTR. La plantilla para esta reacción fue una cepa que alberga un plásmido que codifica para una fusión PTHl-34-Fc (ver Publicación del PCT No. 01/81415) . La mezcla de PCR resultante fue combinada con la cepa 5895 y utilizada como la plantilla para amplificar la PTH de longitud completa ( 1-3 ) -TTR (C10A/ 15A/G83C) utilizando los cebadores 2694-01 y 2693-80. Después de la confirmación de la secuencia, la cepa de expresión resultante que contenia el nuevo plásmido fue designada PTH-TTR(C10A/ 15A/G83C) (cepa 5920) y tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 14. TABLA 3 Oligo Secuencia SEQ ID Número 2694-01 GAGGAATAACATATGTCTGTTTCTGAAATCCAG 33 2694-03 TTCACCGGTACCAGTTGGACCAAAGTTATGAACGTC 34 EJEMPLO 4 Este ejemplo describe la preparación de una fusión IL-lra-TTR(ClOA) y una fusión TTR (C10A) -GSGS-IL-lra . Cada uno de los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo se lista en la Tabla 4.
Para preparar la fusión IL- lra-TTR (C10A) , dos oligonucleótidos , el oligonucleótido 2823-13, el cual codifica para los primeros 7 codones de la proteína humana IL-lra, y el oligonucleótido 2823-14 que codifica para los últimos 7 aminoácidos de IL-lra y los primeros 7 aminoácidos de TTR, fueron sintetizados. El plásmido derivado de una cepa que expresa IL-lra (ver Publicación del PCT No. 91/08285) se amplificó utilizando los oligonucleótidos 2823-13 y 2823-14. El producto de PCR resultante fue mezclado con el plásmido purificado a partir de la cepa 5619, y se utilizó como una plantilla para amplificar IL-l-ra-TTR (10A) de longitud completa utilizando los cebadores oligonucleotidicos 2823-13 y 2693-80. El producto de PCR fue clonado, secuenciado y expresado como se describió anteriormente. La cepa resultante que contiene el nuevo plásmido fue designada IL-lra-TTR (C10A) (cepa 5644) y tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 15. Para elaborar TTR (C10A) -IL-lra, los siguientes dos oligonucleótidos, el oligonucleótido 2787-32, el cual codifica para los últimos 7 aminoácidos de TTR, los primeros 7 aminoácidos de IL-l-ra entre los cuales se introdujo un ligador GSGS, y el oligonucleótido 2787-33, el cual codifica para los últimos 7 codones de IL-l-ra fueron sintetizados. Estos dos cebadores oligonucleotídicos fueron utilizados para amplificar el plásmido 2693, y el producto de PCR resultante fue mezclado con el plásmido 5619, y éstos conjuntamente fueron utilizados como una plantilla para amplificar TTR(CIOA) -IL-lra de longitud completa utilizando los cebadores 2787-33 y 2693-79. El producto de PCR fue clonado, secuenciado y expresado como se describió anteriormente. La cepa resultante que contiene el nuevo plásmido fue designada TTR (C10A) -IL-lra (cepa 5645) y tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 16. TABLA 4 Oligo Secuencia SEQ ID Número 2823-13 GAGGAATAACATATGCGACCGTCCGGACGTAA 35 2823-14 TTCTACTTCCAGGAAGACGAAGGTCCAACTGGTACC 36 2787-32 GTCGTCACCAATCCCAAGGAAGGTAGTGGTAGCCGA CCGTCCGGCCGTAAGAGC 37 2787-33 CCGCGGATCCTCGAGATTATTCGTCTTCCTGGAAGT AGAA 38 EJEMPLO 5 Este ejemplo describe la preparación de TTR (C10A/G83C) -Bradicinina. Cada uno de los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo se lista en la Tabla 5. El plásmido purificado de la cepa 5651 fue utilizado para PCR con el cebador oligonucleotídico 2693-79 y el cebador oligonucleotídico 2943-47, que es un cebador 3' de TTR que contiene un sitio de restricción PstI. Este producto de PCR fue purificado en gel y digerido por restricción con Ndel y PstI. El fragmento de ADN resultante fue utilizado en una mezcla de ligadura que contenia AMG21, digerido con Ndel y Xhol, y los ligadores oligonucleotidicos recocidos 2943-48, que codifica para el ligador GSGSG, y el oligonucleótido 2943-49, que codifica para el péptido antagonista de bradicinina, , KRPPGFSPL con los extremos traslapados 5' de PstI y 3' de Xhol. GM121 fue transformado con este producto de ligadura y el ADN fue purificado a partir de las colonias resistentes a la kanamicina. La secuencia de ADN fue luego confirmada en las colonias resistentes. La cepa confirmada fue desarrollada a 30°C e inducida para la expresión en una fermentación de 10 litros descrita más' adelante. La nueva cepa fue designada TTR (C10A/G83C) -bradicinina (cepa 5914) y tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 17. TABLA 5 Oligo Secuencia SEQ ID Número 2693-79 GAGGAATAACATATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAA 39 2943-47 AATATACTGCAGTGGTGGAATAGGAG 40 2943-48 GTCGTCACCAATCCCAAGGAAGGATCAGGATCCGGA AAACGTCCGCCGGGTTTCTCCCCGCTGTAATC 41 2943-49 TCGAGATTACAGCGGGGAGAAACCCGGCGGACGTTTT CCGGATCCTGATCCTTCCTTGGGATTGGTGACGACTGCA 42 EJEMPLO 6 Este ejemplo describe la expresión recombinante de TTR y las construcciones de fusión de TTR en E. coli . Cada uno de TTR y las fusiones de TTR recién construidas, fueron primeramente examinadas para la expresión soluble a temperaturas en el intervalo de 16°C a 37°C. Para este propósito, los cultivos (25 mi) de GM221 que expresan cada uno de TTR o las fusiones de TTR, se desarrollaron en medio LB suplementado con 50 µ9/???1 de kanamicina a 37°C hasta que la densidad óptica (OD) a 600 nm alcanzó 0.5 a 1.0. Los cultivos fueron luego colocados en agitadores con ajustes de temperatura a 16°C, 20°CÍ 25°C, 30°C, 34°C y 37°C, respectivamente. La inducción de la expresión del producto génico a partir del promotor luxPR, se logró después de la adición de la autoinductor sintético N- (3-oxohexanoil) -DL-homoserina-lactona hacia el medio de cultivo, a una concentración final de 20 ng/ml. Después de 6 horas, los cultivos bacterianos fueron examinados mediante microscopía para la presencia de los cuerpos de inclusión. Frecuentemente, la expresión soluble o parcialmente soluble podría ser lograda mediante el desarrollo de los cultivos a temperaturas menores de 30°C para TTR y sus fusiones, y esta temperatura fue utilizada para la expresión a gran escala. En casos donde la expresión soluble no puede ser lograda, se utilizaron temperaturas a las cuales el nivel de expresión fue el más alto, para los agitadores o fermentadores a gran escala . La expresión a gran escala fue normalmente realizada en matraces de 4 litros. De cuatro a ocho agitadores de 4 litros que contenían 1 litro de LB fueron inoculados con cultivos de toda la noche de TTR o sus cepas de fusión. La expresión fue realizada esencialmente como se describió anteriormente. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación. La etapa de fermentación, que emplea la técnica aséptica, comienza con la inoculación a partir de un cultivo de siembra de las cepas producidas en un matraz con agitación que contiene 500 mi de caldo Luria esterilizado. Cuando este cultivo obtuvo la densidad celular apropiada (0.8-2 a 600 nm) , los contenidos fueron utilizados para inocular un fermentador de 20 litros que contenía 10 litros del medio de crecimiento basado en el complejo. El fermentador es mantenido a 30°C y pH 7 con niveles de oxígeno disuelto mantenidos a una saturación de 30%. Cuando la densidad celular alcanzó una densidad óptica de 10-12 unidad de OD a 600 nm, punto en el cual el cultivo fue inducido por la adición de N- (3 -oxo-hexanoil) -homoserina-lactona . A 6 horas de la post- inducción las células fueron cosechadas del fermentador mediante centrifugación.
EJEMPLO 7 Este ejemplo describe la purificación de TTR/C10A/G83C) -bradicinina . Aproximadamente 193 g de pasta de E. coli proveniente del clon 5914 almacenado a -80°C se descongeló en 1447 mi de Tris HC1 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0. 50 tabletas del cóctel inhibidor de proteasa Sigma 1-873-580 (Saint Louis, MO) se disolvieron en la suspensión celular, y la suspensión se hizo pasar a través de un microfluidizador modelo 110-Y (Microfluidics , Newton, MA) dos veces a 843.7 kg/cm2 (12,000 PSI). El lisado (Figura 1, Banda 2) fue centrifugado a 11,325 x g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante fue retirado como la fracción soluble. La fracción soluble fue calentada en un baño de agua a 65°C por 30 minutos en botellas de polipropileno, tiempo en el cual la temperatura de los contenidos fue de 63 °C. La fracción soluble fue centrifugada a 11,325 x g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante fue retirado como Soluble en Caliente (Figura 1, Banda 3) . La fracción soluble en caliente fue filtrada a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.45 µp? con dos prefiltros y luego se cargó sobre una columna de flujo rápido de Q-Sepharose de 240 mi (de 5 cm de diámetro interno) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 20 ml/minuto equilibrada en Q-amortiguador A (Tris-HCl 20 mM, EDTA 2.5 mM, pH 8.0) a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . La columna se lavó con aproximadamente 2300 mi de Q-amortiguador A a 20 ml/minuto. La columna Q fue eluida con un gradiente lineal de 15 volúmenes de columna a 60% de Q-amortiguador B (Tris-HCl 20 mM, cloruro de sodio 1 M, EDTA 2.5 mM, pH 8.0), seguido por un paso de dos volúmenes de columna hasta 100% de Q-amortiguador B. Las fracciones que contenían la fusión de TTR como se determinaron por SDS-PAGE, fueron combinadas en un combinado Q simple (1150 mi) (Figura 1, Banda 4) y se agregó 1.77 g de DT . El combinado Q fue suavemente agitado por 30 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . Al combinado Q, se agregaron lentamente 410 mi de sulfato de amonio 3.8 M, pH 7.0, y el pH se disminuyó desde aproximadamente 7.5 hasta 7.0 mediante la adición lenta de HCl 1 M. Aproximadamente la mitad del combinado Q fue luego cargada sobre una columna de alto rendimiento de fenil-sepharose, de 84 mi (2.6 cm de diámetro interno) (Amersham Pharmacia Biotech) en P-amortiguador A (NaH2P04 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 7.0) a 10 ml/minuto. La columna se lavó con aproximadamente 170 mi de P-amortiguador A seguido por eluciones de tres pasos utilizando 50%, 80% y 100% de P-amortiguador B (NaH2P04 50 mM, pH 7.0) . La mitad restante del combinado Q fue luego procesado utilizando el mismo protocolo que la primera mitad. Las fracciones que contenían la fusión TTR como 'se determinó por SDS-PAGE, fueron combinadas en un combinado P simple (260 mi) (Figura 1, Banda 5) ? el combinado P fue dializado contra 4 litros de HA-amortiguador A (NaH2P04 10 mM, pH 7.0) por 2 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) utilizando una tubería de diálisis de corte de 8 kDa de 20.4 mm de diámetro (Spectrum Laboratories Inc., Rancho Domínguez, California) . El amortiguador de diálisis fue cambiado con 4 litros frescos de HA- amortiguador A y la diálisis se continuó por aproximadamente 15 horas adicionales. El combinado P fue retirado de la diálisis y se agregaron 600 µ? de DTT 1 M seguido por la incubación a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) por aproximadamente 1 hora. El combinado P fue cargado sobre una columna de hidroxiapatita de cerámica tipo 1 de 105 mi (2.6 cm) (Bio-Rad Inc., Hercules, California) a 10 ml/minutos en HA-amortiguador A. La columna fue lavada con aproximadamente 210 mi de HA- amortiguador A a 10 mi /minuto, seguido por 4 pasos de 12.5%, 25%, 50% y 100% de HA- amortiguador B (NaH2P04 400 mM, pH 7.0) . El flujo de lado a lado fue combinado como 340 mi de combinado HA (Figura 1, Banda 6) y 524 mg de DTT fueron agregados, seguido por la incubación a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) por 1 hora. Aproximadamente la mitad del combinado HA se cargó sobre una columna 15Q de fuente de 47 mi (2.6 cm de diámetro interno) (Amersham Pharmacia Biotech) a 10 mi/minuto, seguido por un lavado con aproximadamente 250 mi de Q- amortiguador A. La columna se eluyó con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna desde 10% a 50% de Q-amortiguador B, seguido por un paso de 2 volúmenes de columna de 100% de Q-amortiguador B. La mitad remanente del combinado HA fue luego procesada utilizando el mismo protocolo que la primera mitad. Las fracciones que contenían la fusión TTR como se determinaron por SDS-PAGE, fueron combinadas en un combinado Q2 simple (260 mi) y se concentraron a aproximadamente 75 mi utilizando una celda agitada con una membrana de 10 kDa. El combinado Q2 (Figura 1, Banda 7) fue luego filtrado a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.22 µ?a, y la concentración de proteína fue determinada como de 16.9 mg/ml utilizando un coeficiente de extinción calculado de 18,450 M"1/cm"1. El nivel de pirógenos fue determinado como de >1 EU/mg de proteína, utilizando el ensayo de Lisado de Amebocitos Limulus (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) . Se determinó que el contenido de ácido nucleico era despreciable, ya que la proporción de la absorbancia a 260 nm sobre 280 nm fue determinada como de 0.52. EJEMPLO 8 Este ejemplo demuestra que la fusión de un péptido ya sea al extremo C o al extremo N de TTR (C10A/G83C) no tiene un impacto significativo sobre su estructura oligomérica. TTR (C10A/G83C) , PTH-TTR (C10A/K15A/G83C) y TTR (C10A/G83C) -bradicinina en Tris 20 mM pH 8.0 y cloruro de sodio aproximadamente 250 mM se redujeron con DTT 9 mM por aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . Aproximadamente 50 µ9 de la TTR reducida se inyectaron sobre una columna Biosep-Sec-S 3000 (7.8 mm de diámetro interno x 300 mm) (Phenomenex, Torrance, California) en SEC-amortiguador (NaH2P04 50 mM, NaCl 500 mM, pH 6.7) a 1 ml/minuto. Se utilizaron estándares de peso molecular Bio-Rad (151-1901) para calibrar la columna y calcular el tamaño molecular apropiado de las muestras inyectadas . Como se puede observar en la Figura 2 , TTR (C10A/G83C) eluyó aproximadamente a 8.8 minutos, correspondiente a un tamaño molecular de 49 kDa, que es comparable al peso molecular calculado del tetrámero a 55 kDa. PTH-TTR(C10/K15A/G83C) eluyó a aproximadamente 8.6 minutos correspondiente a un tamaño molecular de 67 kDa, que está cercano a los 71 kDa calculados para el tetrámero. TTR (C10A/G83C) -bradicinina eluyó aproximadamente a los 8.7 minutos correspondiente a un tamaño molecular de 57 kDa, que es también cercano a los 60 kDa calculados para el tetrámero. EJEMPLO 9 Este ejemplo demuestra que la fusión de una proteína que contiene enlaces disulfuro ya sea al extremo C o al extremo N de TTR(CIOA) no tiene un impacto significativo sobre su estructura oligomérica. Aproximadamente 50 µ9 de cada uno de TTR(CIOA), IL-l-ra-TTR (C10A) y TTR (C10A) -IL-l-ra fueron inyectados sobre una columna Bio-Sec-S 3000 (7.8 mm de diámetro interno x 300 mm) (Phenomenex) en SEC-amortiguador a 1 ml/minuto. Se utilizaron estándares de peso molecular Bio-Rad (151-1901) para calibrar la columna, y calcular el peso molecular aproximado de las muestras inyectadas. Como se ha observado en la Figura 3 TTR(CIOA) eluye aproximadamente a los 8.8 minutos, lo cual corresponde a un tamaño molecular de 49 kDa que es comparable al peso molecular calculado del tetrámero a 55 kDA. La fusión IL-l-ra-TTR (C10A) eluyó aproximadamente a 7.9 minutos, correspondiente a un tamaño molecular de 188 kDa, lo cual es notablemente mayor que aquel esperado para el tetrámero a 124 kDa. Similarmente , TTR (C10A) - IL- 1-ra eluyó aproximadamente a los 7.9 minutos, nuevamente correspondiente a un tamaño molecular de 188 kDa en comparación a los 124 kDa esperados para el tetrámero. Estas discrepancias en el tamaño son probablemente debidas a diferencias en la forma de la molécula, ya que la cromatografía de exclusión de tamaño es dependiente de la forma y los estándares son calibrados para proteínas globulares . EJEMPLO 10 Este ejemplo compara el enlace de una secuencia TMP fusionada al extremo carboxilo de Fe de la inmunoglobulina humana (Fc-TMP) y TMP (m) -TTR al receptor soluble de la leucemia mieloproliferativa humana (MPL) . Además, este ejemplo muestra el efecto de la pegilación de la cisteína TTR nativa sobre el enlace de la fusión de TMP al receptor de MPL. La preparación de las fusiones de TTR pegiladas se describe con detalle en el Ejemplo 13. Para este ejemplo, el receptor MPL humano fue covalentemente enlazado a un chip BIAcore CM5 a RL=1300 Rv utilizando la química de EDC/NHS siguiendo las instrucciones del fabricante (BIAcore, Uppsula, Suecia) . Todas las muestras fueron pasadas sobre el chip a 50 µ?/minuto en PBS de Dulbecco (Gibro BRL, Ga i hersburg , MD) con 0.1 mg/ml de albúmina sérica bovina y 0.005% de P20 (pol ioxiet i 1 ensorbi t an) . El punto final en el equilibrio fue tomado 3 minutos después de la inyección. Como se puede observar en la Figura 4, Fc-TMP muestra características de enlace superiores en comparación a TMP(m)-TTR. Además, esta figura demuestra que la pegilación de la cisterna de TTR nativa (Cys 10) interfiere con el enlace de TMP al receptor de MPL. El enlace de TMP (m) - TTR- PEG5K mostró una respuesta de enlace significativamente reprimida en comparación a su contraparte no pegilada, y TMP (m) - TTR- PEG20K mostró una inhibición aún más severa. Esto indica que la presencia de PEG sobre la cisterna 10 probablemente provoca interferencia estérica para el enlace de la TMP fusionada al receptor de MPL, y PEGs más grandes producen más interferencia.
EJEMPLO 11 Este ejemplo muestra el efecto de la inyección de TMP(m)-TTR en ratones sobre la cuenta de plaquetas en sangre. Para este ejemplo 50 ratones BDF1 (Charles River 5 Laboratories, Wilmington, Massachussets) fueron divididos en 5 grupos e inyectados (día 0) subcutáneamente ya sea con el agente de dilución (PBS de Dulbecco con 0.1% de albúmina sérica bovina) o agente de dilución con 50 µg de proteína de prueba por kg de animal . Cada grupo fue dividido a la mitad l'O y sangrado (140 µ?) en puntos de tiempo alternados (día 0, 3, 5, 7, 11, 12, 14 y 17) . Los ratones fueron anestesiados con isoflurano antes de la recolección. La sangre recolectada se analizó para una cuenta completa y diferencial utilizando un analizador de sangre 15 automatizado ADVIA 120 con software murino (Bayer Diagnostics, New York, NY) . Como se observa en la Figura 5, Fc-TMP mostró la mayor respuesta con la cuenta de plaquetas, elevándose hasta 4.3 x 1012 plaquetas por litro en el día 5, que está arriba 3.4 veces la línea base a 1.2 x 1012 plaquetas 20 por litro. TMP (m) -TTR-PEG 5K fue un respondedor moderado que se eleva a 2.3 x 1012 plaquetas por litro que está solo por debajo de dos veces el nivel de línea base. La forma no pegilada 'de TMP (m) -TTR muestra muy poca respuesta a 1.5 x 1012 plaquetas por litro que está únicamente 20% arriba del nivel 25 de línea base. La forma no pegilada de TMP (m) -TTR muestra mejor enlace in vi tro que sus contrapartes pegiladas (Figura 4), pero tiene pobre funcionamiento in vivo en comparación a TMP (m) -TTR-PEG 5K. Esto indica que PEG es requerido para mejorar la vida media biológica de la construcción de TTR( y esto más que compensa la afinidad reducida por el receptor. EJEMPLO 12 Este ejemplo demuestra que la mutación de la cisterna 10 sobre TTR a la alanina TTR(CIOA) no tiene un impacto significativo sobre su estructura oligomérica. Se inyectaron aproximadamente 50 µg de cada uno de TTR y TTR(CIOA) sobre una columna Biosep-Sec-S 3000 (7.8- mm de diámetro interno x 300 rara) (Phenomenex) en SEC - amort iguador a 1 ml/minuto. Se utilizaron estándares de peso molecular Bio-RAd (151.1901) para calibrar la columna y calcular el tamaño molecular aproximado de las muestras inyectadas. Como se puede observar en la Figura 6, TTR(CIOA) eluye aproximadamente a los 8.8 minutos, lo cual corresponde a un tamaño molecular de 57 kDa que es similar al peso molecular calculado del tetrámero a 55 kDa. Estos datos combinados con la observación de que ambas formas de TTR son resistentes a la precipitación a 65°C (datos no mostrados) indica que la mutación de la cisterna 10 a la alanina no tiene un impacto significativo sobre la estructura o la estabilidad de TTR.
EJEMPLO 13 Este ejemplo demuestra que la mutación de la alanina 37 a cisteína TMP-TTR (C10A/A37C) , aspartato 38 a cisteina TMP-TTR (C10A/D38C) , alanina 81 a cisteína TMP-TTR (C10A/A81C) , o glicina 83 a cisteína TMP-TTR (C10A/G83 C) en un antecedente de cisteína 10 a alanina, no tiene un impacto significativo sobre la estructura oligomérica de TTR. Además, este ejemplo demuestra que la pegilación de estas formas mutantes de TTR con un PEG de 5K o 20K produce dos especies distintas de TTR con tamaño molecular significativamente mayor de la forma no pegilada. La pegilación de TTR fue llevada a cabo primeramente mediante la reducción de aproximadamente 8 mi de TTR (7.28 mg/ml) con DTT 10 mM por 30 minutos a 30°C en presencia de Tris HC1 50 mM, pH 8.5. La TTR reducida fue luego desalada utilizando una columna media SEPHADEXMR G25 de 26 mi (2.6 cm de diámetro interno (Amersham Pharmacia Biotech) a 2.5 ml/minutos en Tris HCl 20 mM, pH 8.5 La concentración fue luego determinada mediante la medición de la absorbancia de la TTR reducida a 280 nm y utilizando el coeficiente de extinción calculado (29,450 M"1 para TMP-TTR (C10A/A37C) (5.14 mg/ml). La mitad (4.6 mi) de la muestra reducida fue luego inmediatamente mezclada con 810 µ? de metoxi -PEG-maleimída 5K 5 mM (Shearwater Corporation, Huntsville, AL) y la mitad restante fue mezclada con 1620 µ? de metoxi -PEG-maleimida 20 K 2.5 mM (Shearwater Corporation) . La reacción se dejo proceder a 30°C por 30 minutos y se apagó por la adición de 46 µ? de DTT 1 M. Cada muestra pegilada fue luego cargada sobre una columna de Q-sepharose HiTrap de 5 mi a 2.5 ml/minutos, y se lavó con varios volúmenes de columna de Q-amortiguador A (Tris HC1 20 mM, pH 8.0) a 5 ml/minuto. Las columnas fueron eluidas con un gradiente lineal de 40% de Q-amortiguador B (Tris HC1 20 mM, NaCl 1 M, pH 8.0) seguido por un paso de 2 volúmenes de columna hasta 100% de Q-amortiguador B. Las fracciones pico fueron combinadas y la concentración se determinó mediante la medición de la absorbancia del combinado a 280 nm. Aproximadamente 50 µg de cada muestra se inyectaron sobre una columna Biosep-Sec-S 3000 (7.8 mm de diámetro interno x 300 mm) (Phenomenex) en SEC-amortiguador a 1 ml/minuto. Se utilizaron estándares de peso molecular Bio-Rad (151-1901) para calibrar la columna, y calcular el tamaño molecular aproximado de las muestras inyectadas. Como se puede observar en la Figura 7, el tamaño molecular aparente de las 4 construcciones de TMP-TTR no pegiladas, está entre 40 y 45 kDa lo cual es notablemente menor que el tetrámero de 70 kDa esperado. Este tiempo de elución retardado es probablemente debido a una ligera interacción de la construcción TMP-TTR con la resina de exclusión de tamaño, que ha sido observada con otras diversas construcciones de TMP (datos no mostrados) . Después de la conjugación con PEG 5K, el tamaño molecular aparente se incrementa hasta entre 421 y 428 kDa (1.53-1.64 minutos más avanzó la elución, que las contrapartes no pegiladas) , lo cual es mucho mayor que los 90 kDa esperados. La observación de un peso molecular exagerado de las moléculas pegiladas sobre la cromatografía de exclusión de tamaño es un fenómeno frecuentemente observado (datos no mostrados) . Las construcciones de PEG 20K eluyen más tempranamente que el estándar de calibración más grande (670 kDa) mostrando una elución más avanzada de 1.28-1.40 minutos que sus contrapartes pegiladas 5K. Estos datos, tomados conjuntamente, demuestran que las cuatro formas mutantes manipuladas por ingeniería genética de TMP-TTR pueden ser pegiladas drásticamente, incrementando su tamaño molecular aparente. Aproximadamente 2 g de las construcciones de TMP- TTR pegiladas fueron analizados por SDS-PAGE (Figura 8) . Esta figura demuestra mediante desplazamiento en gel, que la mayoría de los monómeros de TMP-TTR fueron modificados únicamente por una metoxi-PEG-maleimida, y la reacción fue casi completa dejando muy poco monomero no modificado. EJEMPLO 14 Este ejemplo demuestra que Fc-TMP, TMP-TTR (C10/A37C) , TMP-TTR (C10A/D38C) , TMP-TTR (C10A/A81C) , y TMP-TTR (C10A/G83C) tienen afinidades similares para el enlace al receptor de MPL humano in vi tro. Para este ejemplo, Fc-TMP se enlazó a un chip de proteína G BIAcore a una alta densidad, siguiendo las instrucciones del fabricante (BIAcore, Uppsula, Suecia) . Las proteínas de prueba fueron preincubadas con el receptor MPL 5 nM en el amortiguador de enlace (PBS de Dulbecco (Gibco BRL, Gaithersburg , MD) con 0.1 mg/ml de albúmina sérica bovina y 0.005% de P20 (polioxietilensorbitan) por más de 2 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . Para las proteínas no pegiladas, se agregó 0.1 mg/ml de heparina para prevenir el enlace no específico. Todas las muestras fueron luego pasadas sobre el chip a 50 µ?/minuto en el amortiguador de enlace. El punto final del equilibrio fue tomado 3 minutos después de la inyección. Como se puede observar en la Figura 9, todas las construcciones de TTR mostraron afinidad similar por el receptor de MPL con afinidades en el intervalo de 0.881 a 2.333 nm, mientras que la construcción Fc-TMP tuvo afinidades en el intervalo de 3.276 a 5.369 nm. EJEMPLO 15 Este ejemplo muestra el efecto de inyectar las construcciones de TMP-TTR pegiladas dentro de ratones, sobre la cuenta de plaquetas en sangre. Para este ejemplo 170 ratones BDF1 fueron divididos en 17 grupos e inyectados (día 0) subcutáneamente con 50 µg de proteína de prueba por kg de animal (construcción de fusión de TMP, Fc-TMP o un control de TTR(CIOA). Cada grupo fue dividido a la mitad y sangrado (140 µ?) en puntos de tiempo alternados (día 0, 3, 5, 7, 10, 12 y 14) . Los ratones fueron anestesiados con isoflurano antes de la recolección. La sangre recolectada fue analizada para una cuenta completa y diferencial utilizando un analizador de sangre automatizado ADVIA 120 con software murino (Bayer Diagnostics, New York, NY) . Como se observa en la Figura 10A, Fc-TMP mostró la mayor respuesta con una cuenta de plaquetas que se elevó hasta arriba de 4.2 x 1012 plaquetas por litro en el día 5, que es 3 veces la línea base a 1.4 x 1012 por litro. Las 4 construcciones de TMP-TTR no pegiladas funcionaron mejor que el control, pero no así como Fc-TM con cuentas de plaquetas entre 1.8 y 2.9 x 1012 plaquetas por litro en el día 5, lo cual está entre un 29% y un 107% de mejoramiento sobre la línea base. Como se puede observar en la Figura 10B, la adición de un grupo PEG 5K a la cisteína manipulada por ingeniería genética de las 4 construcciones de TMP-TTR mejora sustancialmente la eficacia con cuentas de plaquetas entre 3.7 y 4.4 x 1012 plaquetas por litro (2.8 a 3.4 veces la línea base) . También como se puede observar en la Figura 10C, la conjugación de un PEG 20 a TMP-TTR da como resultado un mejoramiento adicional pero menos dramático en la eficacia con cuentas de plaquetas entre 4.2 y 4.6 x 1012 plaquetas por litro (3.2 a 3.5 veces la línea base). Ya que todas las construcciones de fusión de TMP tuvieron afinidades de enlace similares para MPL in vi tro, es probable que esta diferencia sea debida al efecto de la conjugación de PEG incrementando la vida biológica efectiva de la construcción. EJEMPLO 16 Este ejemplo muestra el efecto de inyectar construcciones de PTH-TTR pegiladas en ratones, sobre la liberación de calcio ionizado en sangre. Para este ejemplo 60 ratones BDF1 de 4 semanas de edad fueron divididos en 12 grupos e inyectados (día 0) subcutáneamente con 8.91 mg de proteína de prueba por kg de animal (construcción de fusión de PTH, PTH-Fc, o un control de TTR(CIOA)) . Cada grupo fue sangrado (75 µ?) a los puntos de tiempo de 0, 24, 48 y 72 horas. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano antes de la recolección. La sangre recolectada fue analizada para el calcio ionizado utilizando el analizador de Ca++/pH Ciba*Corning 634. Como se observa en la Figura 11, PTH-Fc, PTH-TTR (C10A/K15A/A37C) (PEG5K) , PTH-TTR (C10A/K15A/A37C) (PEG 20K), PTH-TTR/C10A/K15A/G83C) (PEG 5K) y PTH- TTR (C10A/K15A/G83C) (PEG 20K) mostraron la mayor respuesta con niveles de calcio ionizado que se elevan entre 2.2 y 2.7 mmol por litro a las 24 horas después de la inyección, lo cual es 1.7 veces la línea base a 1.3 mmol por litro. A las 72 horas después de la inyección los niveles de calcio ionizado de todos los grupos regresaron a la línea base, excepto los grupos tratados con PTH-TTR/C10A/K15A/A37C) (PEG 5K) , PTH-TTR(C10A/K15A/G83C) (PEG 5K) y PTH- TTR (C10A/K15A/G83C) (PEG 20K) , que mantuvieron niveles de calcio ionizado elevados, entre 1.8 y 1.9 mmol por litro. Las construcciones de PTH-TTR no pegiladas fueron equivalentes a o ligeramente menores que el control de TTR(CIOA) al elevar los niveles de calcio ionizado en suero. EJEMPLO 17 Este ejemplo describe la construcción de un plásmido que contiene PTH-TTR (C10A/K15A/A81C) . El fragmento Xbal/Xbal de 5920 fue ligado con el vector purificado derivado de la digestión del plásmido 5643 (descrito en el Ejemplo 1) con Xbal . La cepa de E. coli que contiene el plásmido resultante se describe como 5933 PTH-TTRC10A/ 15A/A81C . SEQ ID NO: 43 : ATGTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCATAACCTGGGTAAACATCTGAACTCTA TGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTTCATAACTTTGGTCC AACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAGATGCTGTC CGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTGCTGATG ACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCTGCATGG GCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATAGACACC AAATCTTACTGGAAGTGTCTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAGAGGTGG TATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCTGCTGAG CCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAATAA EJEMPLO 18 Este ejemplo describe la preparación de una fusión GLP-1-TTR (C10A/G83C) y una fusión GLP-1-TTR (C10A/K15A/G83C) . Estas construcciones fueron clonadas utilizando el plásmido pAMG21, el cual se describe en el Ejemplo 1. Cada uno de los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo son listados en la Tabla 6. El hospedero bacterial GM121 es una cepa K-12 de E. coli que ha sido modificada para contener el represor lacIQ en la región ebg tardía (68 minutos) . La presencia de este gen represor permite el uso de este gen hospedero con una variedad de sistemas de expresión, no obstante este represor es irrelevante para la expresión a partir de luxPR. El hospedero no transformado no tiene resistencias a antibióticos. Específicamente, F'tet/393 fue modificado por la distribución de la construcción lacIQ dentro del operón ebg entre la posición de nucleótidos 2493 y 2937 como son numerados en Genbank número de acceso M64441Gb_Ba con la supresión de la secuencia ebg de intervención. La construcción fue distribuida al cromosoma utilizando un fago recombinante llamado AGebg-lacIQ #5. Después de la recombinación y la resolución únicamente el inserto cromosómico descrito anteriormente permanece en la célula. Este fue renombrado F'tet/GM120. F'tet/GM120 fue luego mutado en el gen hsdR para inactivarlo. Este fue renombrado F'tet/GM121. El episoma de F'tet fue curado a partir de la cepa, verificado como sensible a la tetraciclina y fue almacenado como GM121 (ATCC #202174) . Se realizó la PCR con el Equipo Roche PCR Core (Cat. No. 1 578 553) en reacciones de 80 µ? que contenían 2-4 µ? de ADN-plantilla plasmídico mini-prep, 1 µ? de cada oligonucleótido, 0.2 mM de cada oligonucleótido, 5% de DMSO (Sigma) , y 2U de ADN-polimerasa Taq con el fin de amplificar la secuencia GLP-1 y un ligador. Los ciclos de reacción fueron de 94°C por 5 minutos seguidos por 35 ciclos de [94°C por 20 segundos, 45°C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto] . Los productos de PCR fueron purificados con el Equipo de Purificación de PCR QIAquick® de acuerdo al protocolo del fabricante (QIAGEN) . Los productos de PCR y los vectores fueron luego digeridos con Ndel y Kpnl (New England Biolabs) . El ADN digerido fue purificado a partir de un gel de agarosa, luego mezclado y ligado por la ADN-ligasa T4 (New England Biolabs) por 1.5-2 horas a temperatura ambiente. Cada mezcla de ligadura fue transformada por electroporación dentro de la cepa hospedera GM121 descrita anteriormente con un pulsador de E. coli BioRAd a 2.5 KV en una cubeta con una longitud de espacio vacío de 2 mm. Las células se dejaron recuperar en 2 mi de Caldo Terrific (TB) por aproximadamente 3 horas a 37°C a 250 rpm. 70 a 100 ul del cultivo de recuperación se sembraron en placa sobre agar LB que contenía 40 ug/ml de kanamicina. Se prepararon mini-preps de ADN y se verificaron los clones correctos mediante secuenciamiento de nucleótidos. Para preparar la fusión GLP-1-TTR(C10A/G83C) , dos oligonucleótidos , el oligonucleótido 1209-85, el cual se enlaza a la región promotora luxR, y 3131-63, el cual codifica para los últimos 12 aminoácidos del ligador de fusión y los primeros 8 aminoácidos de TTR, fueron sintetizados. Un plásmido pA G21 derivado de una cepa que expresa una secuencia de GLP-1 con un inicio Met-Lys N-terminal, seguido por una secuencia de siete histidinas para la columna de purificación con níquel, una secuencia de ácido aspártico-ácido glutámico-Valina-ácido aspártico para la escisión antes de la primera histidina de GLP-1 por la caspasa, la secuencia GLP-1 (A2G) , y un ligador de fusión de 27 aminoácidos se amplificó utilizando los oligonucleótidos 1209-85 y 3131-63. El producto de PCR fue clonado y secuenciado como se describe anteriormente. La cepa resultante que contiene el nuevo plásmido fue designada GLP-1-TTR (C10A/G83C) (cepa 6298) y tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 47. Para preparar la fusión GLP-1-TTR (C10A/K15A/G83C) , se sintetizaron dos oligonucleótidos, el oligonucleótido 3183-83, el cual contiene un sitio Ndel y codifica para la secuencia de purificación y de escisión descrita anteriormente, más los primeros seis aminoácidos de GLP-1(AG2), y 3183-84, que codifica para los últimos 6 aminoácidos del ligador de fusión y los primeros 8 aminoácidos de TTR. Un plásmido pAMG21 derivado de una cepa que expresa una secuencia de GLP-1 con un inicio Met-Lys N-terminal, seguido por una secuencia de siete histidinas para la columna de purificación con níquel, una secuencia de ácido aspártico-ácido glutámico-Valina-ácido aspártico para la escisión antes de la primera histidina de GLP-1 por la caspasa, la secuencia GLP-1 (A2G) , y un ligador de fusión de 25 aminoácidos se amplificó utilizando los oligonucleótidos 3183-83 y 3183-84. El producto de PCR fue clonado y secuenciado como se describe anteriormente. La cepa resultante que contiene el nuevo plásmido fue designada GLP-1-TTR (C10A/K15A/G83C) (cepa 6450) y tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 48. TABLA 6 Oligo Secuencia SEQ ID 1209-85 CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG 44 3131-63 GGATTCACCGGTACCAGTTGGACCACCACCACCAC CACCACCCGCACTGCCTGAACCAGAGC 45 3183-83 TGACTAAGCCATATGAAACATCATCACCATCACCAT CATGACGAAGTTGATCACGGTGAAGGTACTTTCAC 46 3183-84 GGATTCACCGGTACCAGTTGGACCACCACCACCAC CACCGCTAC 47 SEO ID NO: 48 ATGAAACATCATCACCATCACCATCATGACGAAGTTGATCACGGTGAAGGTACTT TCACTTCTGACGTTTCTTCTTATCTGGAAGGTCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGC TTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGTGGTTCTGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCC ACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTCCAACTG GTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCAAAGTTCTAGATGCTGTCCGAGG CAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTGCTGATGACACC TGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCTGCATGGGCTCA CAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATAGACACCAAATC TTACTGGAAGGCACTTTGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAGAGGTGGTATTC ACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCTGCTGAGCCCCT ACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCÁATCCCAAGGAATAA SEO ID NO: 49 ATGAAACATCATCACCATCACCATCATGACGAAGTTGATCACGGTGAAGGTACTT TCACTTCTGACGTTTCTTCTTATCTGGAAGGTCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGC TTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGT GGTGGTGGTTCTGGCGGCGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTGGTGGTCCAACTGGTA CCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAGATGCTGTCCGAGGCAG TCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTGCTGATGACACCTGG GAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCTGCATGGGCTCACAA . CTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATAGACACCAAATCTTA CTGGAAGGCACTTTGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAGAGGTGGTATTCACA GCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCTGCTGAGCCCCTACT CCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAATAA EJEMPLO 19 Este ejemplo describe la preparación de una fusión GLP- 1 (A2G) -K-Fc . Esta construcción fue clonada utilizando el plásmido pAMG33*, el cual difiere de pAMG21 en que la proteína lux y los promotores son reemplazados con los sitios de enlace lacl y un promotor inducible IPTG, y la secuencia del sitio de enlace ribosomal es más corto (la secuencia entre los sitios de reconocimiento AatlI y Clal es reemplazado con AATTGTGAGCGGATAACAATTGACAAATGCTAAAATTCTTGATTAATTGTGAGCGGATAAC AATTTATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAA y algo de la secuencia después del sitio de reconocimiento SacII fue suprimida (dej ando ATAAATAAGTAACGATCCGGTCCAGTAATGACCTCAGAAC TCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCG CAGCAACTTGTCGCGCCAATCGAGCCATGTCGTCGTCAACGACCCCCCATTCAAGAACAGC AAGCAGCATTGAGAACTTTGGAATCCAGTCCCTCTTCCACCTGCTGACCG) . Cada uno de los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo son listados en la Tabla 7. Para preparar la fusión GLP- 1 (A2G) -Fe , se sintetizaron dos oligonucleótidos, el oligonucleótido 2985-92, el cual contiene un sitio Ndel y codifica para la secuencia de purificación y escisión descrita anteriormente más los primeros ocho aminoácidos de GLP- 1 - (A2G) , y 2687-50, que codifica para los aminoácidos 18 al 23 del Fe. Un plásmido pAMG33* derivado de una cepa que expresa una secuencia de GLP-1 (A2G) con un inicio de Met N-terminal, un ligador de 27 aminoácidos, y una secuencia Fe, se amplificó utilizando los oligonucleótidos 2985-92 y 2687-50. El producto de PCR fue clonado y secuenciado como se describe anteriormente, excepto que las enzimas utilizadas fueron Ndel y EcoRI . Un paso de selección de colonias fue incluido, el cual verificó la presencia del inserto por PCR con los oligonucleótidos dirigidos contra la secuencia del vector corriente arriba (5') y la secuencia 5 His-ácido aspártico que el inserto introdujo. La cepa resultante que contiene el nuevo plásmido fue designada GLP-1 (A2G) -K-Fc (cepa 5945) y tuvo la secuencia de ADN identificada en la SEQ ID NO: 51. TABLA 7 Oligo Secuencia SEQ ID NUMERO 2985-92 AGACCTGTACATATGAAACATCATC CCATCACCAT CATGACGAAGTTGATCACGGTGAAGGTACTTTCAC TTCTG 50 2687-50 GGGGGAAGAGGAAAACTGAC 51 SEQ ID NO: 52 ATGAAACATCATCACCATCACCATCATGACGAAGTTGATCACGGTGAAGGTACTT TCACTTCTGACGTTTCTTCTTATCTGGAAGGTCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGC TTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGTGGTTCTGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCC ACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATGGTGGTGGTGGTGGTGACAAAA CTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTA CAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCG AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA EJEMPLO 20 Este ejemplo describe la clonación del dominio CH2 de una molécula de inmunoglobulina al TTR(CIOA) para generar TMP-CH2 -TTRC10A y TTRC10A-CH2 -TMP . El dominio CH2 derivado de TMP-Fe fue ligado al extremo C-terminal de TTR(CIOA), por ejemplo, cepa 5619, mediante un procedimiento de PCR de dos pasos. El dominio CH2 (que contiene de 5' a 3': los últimos 7 codones de TTR, CH2 y un ligador BamHI-Xhol) fue primero amplificado por los siguientes oligos: 2973-77 : GTC GTC ACC AAT CCC AAG GAA GGT TCT GGC TCC GGA TCA GGG GGA CCG TCA GTT TTC CTC (SEQ ID NO:53) , y 2973-78 : CCG CGG ATC CTC GAG ATT AGG ATC CAG AAC CCC CTT TGG CTT TGG AGA TGG T {SEQ ID NO:54) . Este fragmento fue luego fusionado a 5619 en una PCR subsecuente por los oligos 2973-78 y 2973-79 : GAG GAA TAA CAT ATG GGT CCA ACT GGT ACC GGT GAA TCC AAG (SEQ ID NO : 55) , Seguido por la digestión y clonación con Ndel/Xhol dentro de pAMG21 similarmente restringido. El plásmido resultante es descrito como 6017 (TTRC10A-CH2 ) : SEQ ID NO: 56: ATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCAAAGTTCTAG ATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGC TGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAG CTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAA TAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGC AGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCC CTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAAG GTTCTGGCTCCGGATCAGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGGGTTCTGGATCCTAA El fragmento Xbal/Xbal de 6017 fue reemplazado con el fragmento correspondiente de 5704 como se describe anteriormente para construir TMP-TTRC10A-CH2 (cepa 6024) : SEQ ID NO: 57; ATGATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTGGCGGTGGTG GCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCACGCGC AGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCAAAGTTCTAGAT GCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTG CTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCT GCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATA GACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAG AGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCT GCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAAGGT TCTGGCTCCGGATCAGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGGGTTCTGGATCCTAA La construcción de TTRC10A-CH2 -TMP fue realizada como sigue: el fragmento de TMP que contiene un ligador 5' BamHI y un ligador 3' Xhol fue amplificado por los oligos 2694-19 y 2974-70 : GAG GAA TAA GGA TCC ATC GAA GGT CCG ACT CTG CG (SEQ ID NO : 58 } . El fragmento amplificado fue digerido con BamHI y Xhol y fue subsecuentemente ligado con 6017 similarmente restringido. El clon resultante es descrito como cepa 6104 (TTRC10A-CH2 -TMP) . SEQ ID NO: 59: ATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCAAAGTTCTAG ATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGC TGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAG CTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAA TAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGC AGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCC CTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAAG GTTCTGGCTCCGGATCAGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGGGTTCTGGATCCATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCG TGCTGGCGGTGGTGGCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGG CTTGCAGCACGCGCATAA Otra configuración más de esta fusión fue realizada como TMP-CH2 -TTR2. El dominio CH2 derivado de TMP-Fc fue primeramente ligado al extremo N de TTRC10A por una PCR de dos pasos. El dominio CH2 (que contiene de 5' a 3' : un ligador Ndel-BamHI, CH2 y los primeros 7 codones de TTR C10A) fue primeramente amplificado por los oligos 2974-65 : TTC ACC GGT ACC ACT TGG ACC AGA ACC CCC TTT GGC TTT GGA GAT GGT (SEQ ID NO: 60), y 2974-66 : GAG GAA TAA CAT ATG GGA TCC GGT TCT GGG GGA CCG TCA GTT TTC CTC (SEQ ID NO: 61) . Este fragmento fue fusionado a 5619 en una PCR subsecuente por los oligos 2974-66 y 2693-80 (Ejemplo 1) , seguido por la restricción con Ndel/Xhol y la clonación dentro de pAMG21 similarmente restringido. El clon resultante es descrito como 6016 (CH2 -TTRC10A) ; SEQ ID NO: 62 : ATGGGATCCGGTTCTGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGGGTTCTGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCAAAG TTCTAGATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAG AAAGGCTGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCT GGAGAGCTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAG TGGAAATAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGA GCATGCAGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATT GCCGCCCTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCA AGGAATAA El fragmento de TMP que contiene un ligador de Ndel en el extremo 5' y un ligador BamHI en el extremo 3' , fue amplificado por los oligos 2974-68 : GAG GAA TAA CAT ATG ATC GAA GGT CCG ACT CTG (SEQ ID NO: 63) , y 2974-69 : TAA CAT ATG GGA TCC TGC GCG TGC TGC AAG CCA TTG (SEQ ID NO: 64) . Este fragmento fue luego digerido con Ndel/BamHI y ligado con el vector que fue similarmente restringido, purificado en gel a partir de la cepa 6016. El clon resultante es descrito como 6110 (TMP-CH2 -TTRC10A) : SEQ ID NO: 65; ATGATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTGGCGGTGGTG GCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCACGCGC AGGATCCGGTTCTGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GGGTTCTGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCAAAGTT CTAGATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAA AGGCTGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGG AGAGCTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTG GAAATAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGC ATGCAGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGC CGCCCTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAG GAATAA EJEMPLO 21 Este ejemplo describe la construcción de TTRC10A/K15A-TMP, TTRC10A/K15A/A81C-TMP y TTRC10A/K15A/G83C-TMP. TMP fue también clonado en los extremos C de TTR y variantes del mismo. TMP de longitud completa que contiene en su extremo N- terminal un ligador de 5 aminoácidos (gsgsg) más los últimos 7 aminoácidos de TTR de tipo silvestre, se amplificó mediante el siguiente grupo de oligonucleótidos en un procedimiento de PCR estándar. 2694-18 : GTC GTC ACC AAT CCC AAG GAA GGT TCT GGT TCT GGT ATC GAA (SEQ ID NO: 66) , y 2694 - 19: CCG CGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG CAA GCC ATT G (SEQ ID NO:67) . Este fragmento de PCR fue además ligado al extremo 3' de TTR de tipo silvestre por una segunda PCR utilizando los oligos 2694-19 y 2693-79 como se describe en el Ejemplo 1. El clon resultante fue confirmado en su secuencia y es descrito como cepa 5365 (TTR-TMP) : SEQ ID NO: 68 : ATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGTGTCCTCTGATGGTCAAAGTTCTAG ATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGC TGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAG CTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAA TAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGC AGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCC CTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAAG GTTCTGGTTCTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGC TGGCGGTGGTGGCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTT GCAGCACGCGCATAA El fragmento Xbal/Xbal de 5365 fue luego reemplazado por el fragmento correspondiente Xbal/Xbal de la cepa 5895 para elaborar la cepa 5921 (TTRC10A/K15A-TMP) como se describe anteriormente: SEQ ID NO: 69: ATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAG ATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGC TGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAG CTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAA TAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGC AGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCC CTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAAG GTTCTGGTTCTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGC TGGCGGTGGTGGCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTT GCAGCACGCGCATAA El plásmido 5921 fue subsecuentemente modificado mediante el reemplazo de los aminoácidos en las siguientes posiciones: A37, A81 y G83, con el aminoácido cisteína como se describe en el Ejemplo 1, excepto que el oligo TTR 3' utilizado con los oligos de mutación (2693-80) en el Ejemplo 1, fue reemplazado con 2694-19, dando como resultado la cepa 5982, que contiene TTRC10/Kl5A/A37C-TMP (SEQ ID No: 71), y la cepa 5984 que contiene TTRC10/K15A/A83 (SEQ ID No. 72) . SEQ ID NO : 7.0 : ATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAG ATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGC TTGTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAG CTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAA TAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGC AGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCC CTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGrCGTCACCAATCCCAAGGAAG GTTCTGGTTCTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGC TGGCGGTGGTGGCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTT GCAGCACGCGCATAA SEQ ID NO:71: ATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAG ATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGC TGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAG CTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAA TAGACACCAAATCTTACTGGAAGTGTCTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGC AGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCC CTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAAG GTTCTGGTTCTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGC TGGCGGTGGTGGCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTT GCAGCACGCGCATAA SEQ ID NO: 72 : ATGGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAG ATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGC TGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAG CTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAA TAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTTGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGC AGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCC CTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAAG GTTCTGGTTCTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGC TGGCGGTGGTGGCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAGTGGCTT GCAGCACGCGCATAA EJEMPLO 22 Este ejemplo describe la construcción de TMP-TTRC10A/K15A/A81C y TMP-TTRC10A/K15 /A37C . La Lys en la posición 15 de TTR fue mutagenizada a Ala en las cepas 5704, 5706 y 5707 por los siguientes métodos. El plásmido 5513 fue digerido con Ndel/Kpnl, el inserto que alberga el fragmento TMP y los primeros 6 aminoácidos de TTR fue purificado y ligado con el vector restringido con Ndel/Kpnl y purificado en gel, derivado de la cepa 5895. La cepa bacteriana que contiene el plásmido resultante es descrita como 5919 (TMP-TTRC10A/K15A/G83C) . El plásmido 5919 fue luego digerido con Xbal, el fragmento resultante Xbal/Xbal que contenía TMP y los primeros 18 codones de TTR incluyendo las mutaciones C10A y K15A fue purificado en gel y ligado con los vectores digeridos con Xbal, tratados con fosfatasa y purificados en gel, derivados de la cepa 5704 y 5706. Las nuevas cepas son descritas como 5918 (TMP-TTRC10A/K15A/A81C) y 6023 (TMP-TTRC10A/K15A/A37C) . TMP-TTRC10A/K15A/G83C (SEQ IDNO:73) : ATGATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTGGCGGTGGTG GCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCACGCGC AGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAGAT GCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTG CTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCT GCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATA GACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTTGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAG AGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCT GCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAATAA TMP-TTRC10A/K15A/A81C (SEQ ID NO:74) : ATGATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTGGCGGTGGTG GCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCACGCGC AGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAGAT GCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTG CTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCT GCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATA GACACCAAATCTTACTGGAAGTGTCTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAG AGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCT GCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAATAA TMP-TTRC10A/K15A/A37C (SEQ ID N0:75) : ATGATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTGGCGGTGGTG GCGGAGGGGGTGGCATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCACGCGC AGGTCCAACTGGTACCGGTGAATCCAAGGCTCCTCTGATGGTCGCAGTTCTAGAT GCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTT GTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCT GCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATA GACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAG AGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCT GCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAATAA EJEMPLO 23 Este ejemplo describe la expresión de las proteínas de fusión GLP-1 en E. coli. 25-100 mi de un cultivo de toda la noche, saturado, se utilizaron para inocular 50 mi de TB con 20 µ9/??1 de kanamicina en un matraz protegido de 250 mi e incubado a 37°C, a 250 rpm toda la noche. Se utilizaron 10 a 35 mi de estos cultivos de toda la noche para inocular 1 litro de TB con 20 µ9/p?1 de kanamicina en un matraz protegido de 2 litros y se incubaron a 37°C,' a 250 rpm, hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó aproximadamente 0.7. Los cultivos fueron luego inducidos para expresar la proteína recombinante , mediante la adición de: 1 mi de etanol que contenía 30 µ9/??1 de N- (B-cetocaproil) -DL-homoserina-lactona (Sigma) en el caso de pAMG21, o IPTG hasta 0.1 mM en el caso de pAMG33*. La incubación se continuó por 2-4 horas adicionales y las células se recolectaron medíante centrifugación . EJEMPLO 24 Este ejemplo describe la purificación de ?G?-TTR (C10A/K15A/A81C) . Aproximadamente 197 g de pasta de E. coli proveniente del clon 5933 almacenada a -80°C se descongeló en 1480 mi de Tris HC1 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0. 60 tabletas de cóctel inhibidor de proteasa Sigma 1-873-580 (Saint Louis, MO) se disolvieron en la suspensión celular y la suspensión se hizo pasar a través de un microfluidizador modelo 110-Y (Microfluidics , Newton, MA) dos veces a 984.31 kg/cm2 (14, 000 PSI) . El lisado se centrífugo a 11, 325 x g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante se retiró como la fracción soluble . La fracción soluble se calentó en un baño de agua a 65°C por 30 minutos en botellas de polipropileno, tiempo en el cual la temperatura de los contenidos fue de 63 °C. La fracción soluble fue centrifugada a 11,325 x g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante se retiró como soluble en caliente. La fracción soluble en caliente fue filtrada a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.45 µt? con dos prefiltros y luego se cargó sobre una columna de flujo rápido Q-sepharose de 240 mi (5 cm de DI) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 25 ml/minuto equilibrada en Q-amortiguador A (Tris HCl 20 mM, EDTA 2.5 mM, pH 8.0) a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . La columna se lavó con aproximadamente 2200 mi de Q-amortiguador A a 30 ml/minuto. La columna Q fue eluida con un gradiente lineal de 15 volúmenes de columna hasta 60% de Q-amortiguador B (Tris HCl 20 mM, NaCl 1 M, EDTA 2.5 mM, pH 8.0) seguido por un paso de 2 volúmenes de columna hasta 100% de Q-amortiguador B. Las fracciones que contenían la fusión TTR como se determinó por SDS-PAGE fueron combinadas en un combinado Q simple (1300 mi) . Al combinado Q se agregaron lentamente 464 mi de sulfato de amonio 3.8 M, pH 7.2. La solución se centrífugo a 11,325 g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante se retiró como la fracción soluble de sulfato de amonio y se desechó, y el botón se resuspendió en 450 mi de NaH2P04 10 mM, pH 7.0 mediante agitación suave a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. La solución se centrífugo a 11,325 x g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante se retiró como la fracción soluble en amortiguador de fosfato y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.45 µp?. Se agregaron 240 µ? de ditiotreitol 1 M a la fracción soluble en amortiguador de fosfato y se cargó a una columna de hidroxiapatita de cerámica tipo 1 de 105 mi (2.5 cm de DI) (Bio-Rad Inc., Hercules, California) a 10 ml/minuto en HA-amortiguador A. La columna se lavó con aproximadamente 210 mi de HA-amortiguador A a 10 ml/minuto, seguido por 3 pasos de 25%, 50% y 100% de HA-amor iguador B (fosfato diácido de sodio 400 mM, pH 7.0) . Las fracciones provenientes de la elución del 50% fueron combinadas como combinado HA (725 mi) y se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.22 Se agregó 1.16 g de ditiotreitol al combinado HA, y el pH se elevó a 8.0 utilizando base de tris, seguido por incubación a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. El combinado HA se diluyó con 750 mi de agua y se cargó sobre una columna 15Q de fuente de 50 mi (2.6 cm de DI) (Amersham Pharmacia Biotech) a 10 ml/minuto, seguido por un lavado con aproximadamente 250 mi de Q-amortiguador A. La columna se eluyó con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna desde 10% hasta 60% de Q-amortiguador B, seguido por un paso de 2 volúmenes de columna de 100% de Q-amortiguador B. Las fracciones que contenían la fusión TTR como se determinó por SDS-PAGE se combinaron en un combinado Q2 simple (170 mi) y se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.22 µp?. La concentración de proteína fue determinada como de 3.7 mg/ml utilizando un coeficiente de extinción calculado de 23,950 M"1 cm"1. El nivel de pirógeno fue determinado como menor de 1 EU/mg de proteína utilizando el ensayo de Lisado de Amebocitos Limulus (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) . Se determinó que el contenido de ácido nucleico era despreciable, ya que la proporción de la absorbancia a 260 nm sobre 280 nm fue determinada como de 0.61. EJEMPLO 25 Este ejemplo describe la purificación de TMP-TTR (C10A/D38C) . Aproximadamente 170 g de pasta de E. coli proveniente del clon 5705 almacenado a -80°C se descongelaron en 1275 mi de Tris HC1 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0. 50 tabletas de cóctel inhibidor de proteasa Sigma 1-873-580 (Saint Louis, MO) se disolvió en la suspensión celular y la suspensión se hizo pasar a través de un microfluidizador modelo 110 -Y (Microfluidics , Newton, MA) dos veces a 984.31 kg/cm2 (14,000 PSI) . El lisado se centrífugo a 11,325 x g por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante se retiró como la porción soluble y se desechó. Los botones se resuspendieron en 1200 mi de agua utilizando un triturador de tejidos y se agregaron 20 tabletas más de inhibidor de proteasa Sigma. La suspensión se centrífugo a 11,325 x g por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante se filtró a través de un filtro Whatman GF/A y se agregaron 2.1 g de ditiotreitol , seguido por la incubación a 7°C por 30 minutos. La muestra reducida fue cargada sobre una columna de flujo rápido Q-Sepharose de 240 mi (5 ctn de DI) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 30 ml/minuto equilibrada en Q-amort guador A (Tris HCl 20 mM, 0.02% de azida de sodio, pH 8.0) a 7°C. La columna se lavó con aproximadamente 1920 mi de Q-amortiguador A a 30 ml/minuto. La columna Q fue eluida con 3 pasos de 20%, 35% y 100% de Q-amortiguador B (Tris HCl 20 mM, NaCl 1 M, 0.02% de azida de sodio, pH 8.0) . Se agregaron 13 mi de EDTA 500 mM pH 8.0 al flujo de lado a lado proveniente de la columna Q, y se centrífugo por 30 minutos a 11,325 g a 4°C. El sobrenadante se desechó, y el botón se resuspendió en 700 mi de urea 4 M, Tris HCl 20 mM, pH 8.0. El botón solubilizado en urea fue luego filtrado a través de un filtro Whatman GF/A y cargado sobre una columna de flujo rápido de Q-sepharose de 240 mi (5 cm de DI) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 30 ml/minuto equilibrada en Q-amortiguador A (Tris HCl 20 mM, 0.02% de azida de sodio, pH 8.0) a 7°C. La columna se lavó con aproximadamente 1920 mi de Q-amortiguador A 30 ml/minuto. La columna Q se diluyó con 3 pasos de 20%, 35% y 100% de Q-Amortiguador B (tris HCl 20 mM, cloruro de sodio 1 M, 0.2% de azida de sodio, pH 8.0) a 15 ml/min. Las fracciones que contenían el pico de elución de 35% se combinaron, se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.22 µ?t?, y 0.5 g de ditiotreitol (concentración final 10 mM) se agregó, seguido por la incubación por 30 minutos a 7°C. El combinado Q al 35% fue luego cargado sobre una columna de hidroxiapatita de cerámica tipo 1 de 45 mi (2.6 cm) (Bio-Rad Inc., Hercules, CA) a 5 ml/min en Tris HCl 20 mM, cloruro de sodio 350 mM, pH 8.0 a 7°C. La columna se lavó con aproximadamente 70 mi de tris HCL 20 mM, cloruro de sodio 350 mM, pH 8.0 a 5 ml/min seguido por 3 pasos de 2.5%, 25% y 100% de HA-Amortiguador B (fosfato diácido de sodio 400 mM, pH 7.0) . Las fracciones de elución de 2.5% se combinaron como 80 mi de combinado HA y se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.22 µp?. Se determinó que la concentración de proteína era de 6.8 mg/ml utilizando un coeficiente de extinción calculado de 29,450 M"1 cm"1. Se determinó que el nivel de pirógeno era < 1 EU/mg de la proteína utilizando el ensayo del Lisado de Amebocitos Limulus (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) . Se determinó que el contenido de ácido nucleico era despreciable, ya que la proporción de la absorbancia a 260 nm sobre 280 nm fue determinada como de 0.54. EJEMPLO 26 Este ejemplo describe el replegamiento y purificación de TTR(CIOA) -CH2-TMP. Aproximadamente 23 g de pasta de E. coli proveniente del clon 6104 almacenado a -80°C, se descongeló en 200 mi de tris HCL 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0. Se disolvieron 10 tabletas de cóctel inhibidor de proteasa Sigma 1-873-580 (Saint Louis, MO) en la suspensión celular, y la suspensión se hizo pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics , Newton, MA) dos veces a 843.7 kg/cm2 (12,000 psi) . El lisado se centrífugo a 15,344 x g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante se retiró como la fracción soluble y se desechó. El botón se resuspendió en 200 mi de tris HCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0, utilizando un triturador de tejidos. La suspensión se centrifugo a 14,344 x g por 50 minutos a 4°C. El sobrenadante se retiró como el lavado y se desechó. El botón se resuspendió en 50 mi de tris HCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0 utilizando un triturador de tejidos. La suspensión se centrífugo a 14,000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró como el lavado y se desechó. Los concentrados se disolvieron en 50 mi de clorhidrato de guanidina 8 M, tris HCl 50 mM, pH 8.0 utilizando un sonicador por aproximadamente 1 minuto. La proteína disuelta se redujo por 30 minutos a temperatura ambiente mediante la adición de 500 µ? de DTT 1 M. La proteina reducida se centrifugó por 30 minutos a 20 °C a 27,216 g. El sobrenadante se agregó luego a 4 L de base de tris 50 mM, base de arginina 160 mM, urea 1 M, cistamina 1 mM, cisteína 4 mM, pH 9.5 a 2 ml/min y se incubó a aproximadamente 16 horas a 4°C. La proteína replegada fue luego filtrada a través de un Gellman SUPORCAP® 50 y luego se concentró a aproximadamente 500 mi utilizando un sistema de flujo tangencial de membrana YM10 de 3 pies cuadrados, Pall Filtron, seguido por diafiltración contra 2 L de tris HCl 20 mM, pH 8.0. La proteína concentrada se cargó luego sobre una columna 15Q de fuente de 45 mi (2.6 cm de ID) (Amersham Pharmacia Biotech) a 18 ml/min seguido por un lavado con aproximadamente 150 mi de Q-Amortiguador A (tris HCl 20 mM, pH 8.0) . La columna se eluyó con gradiente lineal de 20 volúmenes de columna desde 0% a 60% de Q-Amortiguador B seguido por un paso de 2 volúmenes de columna de 100% de Q-Amortiguador B. Las fracciones que contenían la fusión de TTR como se determinó por SDS-PAGE, se combinaron en un combinado Q simple (29 mi) . El combinado Q se centrífugo luego a aproximadamente 6.3 mi utilizando un Millipore CENTRIPREPMR 10 y luego se hizo pasar a través de un filtro de membrana Pall ACRODISC® MUSTANGMR E a 1 ml/min. Se determinó que la concentración de proteína era de 10.5 mg/ml utilizando un coeficiente de extinción calculado de 46,410 M"1 cm"1. Se determinó que el nivel de pirógeno era < 1 EU/mg de la proteína utilizando el ensayo del Lisado de Amebocitos Limulus (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) . Se determinó que el contenido de ácido nucleico era despreciable, ya que la proporción de la absorbancia a 260 nm sobre 280 nm fue determinada como de 0.51. EJEMPLO 27 Este ejemplo describe la purificación de GLP1-TTR (C10A/K15A/G83C) . Aproximadamente 30 g de pasta de E. coli proveniente de clon 6450 almacenado a -80 °C se descongeló en 250 mi de fosfato diácido de sodio 50 mM, H 7.0. La suspensión celular se hizo pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics , Newton, MA) dos veces a 843.7 kg/cm2 (12,000 psi) . El lisado se centrífugo a 15,344 x g por 50 min a 4°C. El sobrenadante se desechó como la fracción soluble, y el botón se resuspendió en 200 mi de desoxicolato utilizando un triturador de tejidos. La suspensión se centrífugo a 15,344 por g por 50 minutos. El sobrenadante se desechó como el lavado, y el botón se resuspendió en 200 mi de agua utilizando un triturador de tejidos. La suspensión se centrífugo a 15,344 x g por 5 min a 4°C. El sobrenadante se desechó como el lavado, y el botón se resuspendió en 100 mi de agua utilizando un triturador de tejidos. La suspensión se centrífugo a 27,216 x g por 30 minutos a temperatura ambiente . El sobrenadante se desechó como el lavado, y aproximadamente 2/3 de los botones se disolvieron en 75 mi de clorhidrato de guanidina 8 M, tris HC1 50 m , pH 8.0 mediante agitación por aproximadamente 15 minutos. La suspensión se centrifugó a 27,216 x g por 30 minutos a temperatura ambiente, y el sobrenadante se diluyó con 18 mi de agua. La muestra fue luego cargada sobre una columna de flujo rápido de sefarosa quelante de 50 mi (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , se cargó con NiCl, a 5 ml/min. Después del lavado con aproximadamente 150 mi de Ni -Amortiguador A (clorhidrato de guanidina 6 M, tris HC1 37.5 mi, pH 8.0) a 10 ml/min, eluida con dos pasos de 10% y 100% de Ni -Amortiguador B (clorhidrato de guanidina 6 M, tris HCL 37.5 mM, imidazol 400 mM, pH 8.0). Se combinó el pico que contenía la construcción de fusión como Combinado Ni (40 mi) y se determinó que el contenido de proteína era S.4 mg/ml al observar la absorbancia a 280 nm en clorhidrato de guanidina 8M utilizando un coeficiente de extinción de 25,440 NT1. Se agregaron 800 µ? de EDTA 500 mM, pH 8.0 y se retiraron 80 mg de proteína para la reacción de PEGilación. Se agregaron 230 µ? de DTT 1 M y se incubaron por 30 minutos a 30°C. Se cargó sobre una columna media SEPHADEXMR G25 de 130 mi (2.6 era de DI) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 8 ml/min en tris HCl 20 mM, urea 6 M, pH 8.5 Se combinó el pico de proteína como se determinó por absorbancia a 280 nm (22 mi) y se determinó que la concentración era de 3.2 mg/ml al observar la absorbancia a 280 nm en tris HC1 20 mM, urea 6 M, pH 8.5 utilizando un coeficiente de extinción de 25,440 M"1. Se hizo reaccionar 45% del material intercambiado en amortiguador con 950 µ? de metoxi-PEG-maleimida 5K (Shearwater Corporation, Huntsville, AL) por 140 minutos a 30°C. Se agregaron 100 µ? de 2 -mercaptoetanol 1 M a cada reacción para apagar. La reacción dializada contra 1 L de fosfato diácido de sodio 25 mM, urea 3 M, pH 7.25 utilizando un Slidealyzer Pierce de 10 kDa por 2 horas a temperatura ambiente. Se cambió el amortiguador de diálisis por fosfato diácido de sodio 25 mM, 10% de sucrosa, EDTA 2 mM, pH 7.25 y se incubó por aproximadamente 16 horas a temperatura ambiente. Se agregaron 140 µ? de CHAPS al 5% y 7.28 µ? de 2 -mercaptoetanol y 0.475 mi de caspasa 3 a 3 mg/ml , seguido por una incubación de 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se cargó sobre una columna HiTrap Q-sepharose HP de 5 mi (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 1 ml/min en tris HCl de 20 mM, pH 8.0, seguido por aproximadamente un lavado de 15 mi en el mismo amortiguador. La columna se desarrolló luego a 5 ml/min utilizando un gradiente lineal a 60% de tris HCl 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 8.0, seguido por un paso al 100% del amortiguador de elución. Las fracciones que contenían la fusión de TTR como se determinó por SDS-PAGE, se combinaron en 9.5 mi de combinado Q simple. El combinado Q se concentró hasta 3.2 mi utilizando un Millipore CENTRIPREPMR de 30 kDa y se filtró a través de una membrana Pall MUSTANGMR a aproximadamente a 1 ml/min. Se diluyó el combinado Q hasta 6.5 mi con agua y se agregaron 375 µ? de acetonitrilo . Se inyectó sobre una columna Vydac Proteína/Péptido de 10 x 250 mm C4 (Vydac, Hisperia, CA) en 95% de RP-Amortiguador A (0.1% de ácido trifluoroacético) con 5% de RP-Amortiguador (95% de acetonitrilo, 0.1% de ácido trifluoroacético) a 5 ml/min. La columna se desarrolló corriendo un gradiente lineal hasta 100% de RP-Amortiguador B. El pico de proteína se concentró hasta aproximadamente 3 mi utilizando un Millipore CENTRIPRPEMR de 30 kDA y se diluyó a 15 mi utilizando tris HCl 20 mM, pH 8.0. Se repitió el intercambio de amortiguador 3 veces más y luego se hizo pasar a través de una membrana Pall MUSTANGMR E a aproximadamente 1 ml/min. La concentración de proteína se determinó como de 7.7 mg/ml utilizando un coeficiente de extinción calculado de 25,440 M"1 cm"1. Se determinó que el nivel de pirógeno era < 1 EU/mg de la proteína utilizando el ensayo del Lisado de Amebocitos Limulus (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) . Se determinó que el contenido de ácido nucleico era despreciable, ya que la proporción de la absorbancia a 260 nm sobre 280 nm fue determinada como de 0.54.
EJEMPLO 28 Este ejemplo muestra el efecto de inyectar construcciones pegiladas de GLP1-TTR a ratones, sobre los niveles de glucosa sanguínea. Para este ejemplo, 40 ratones db/db, de 9 semanas de edad se dividieron en 4 grupos y se inyectaron (hora 0) intraperitonealmente con 7.4 - 16.6 mg de la proteína de prueba por animal (538 pmol de monómeros para todos los grupos) (10 mg de la construcción de fusión de GLP1-TTR pegilada 5K, 10 mg de la construcción de fusión GLP1-TTR pegilada 20K, 16.6 mg de GLPl-Fc, y 7.4 mg de un control TTR(CIOA) . Cada grupo se sangró a los puntos de tiempo (medición de línea base), 1, 4, 6, 12, 24 y 48 horas después de la inyección. El alimento se retiró de los ratones por las primeras 6 horas del experimento y se volvió a colocar después del sangrado al punto de tiempo de 6 horas. Cada gota de sangre recolectada por punto de tiempo fue analizada para el contenido de glucosa, utilizando un medidor de glucosa One Touch Profile y los resultados se describen en la Figura 12. EJEMPLO 29 Este ejemplo muestra el efecto de inyectar las construcciones de TMP-TTR con los dominios CH2 de anticuerpos fusionados, en ratones, sobre la cuenta de plaquetas en sangre. Para este ejemplo 50 ratonas BDF1 se diluyeron en 5 grupos y se inyectaron (día 0) subcutáneamente con 50 mg de la proteína de prueba por kg de animal (construcción de fusión TMP, Fc-TMP, o un control de TTR(CIOA). Cada grupo se dividió a la mitad y se sangró (140 mi) en puntos de tiempo alternados (día 0, 3, 5, 7 y 10) . Los ratones se anestesiaron con isoflurano antes de la recolección. La sangre recolectada se analizó para una cuenta completa y diferencial utilizando un analizador de sangre automatizado ADVIA 120 con software murino (Bayer Diagnostics, Nueva York, NY) . Como se observa en la Figura 13, Fc-TMP mostró la mayor respuesta con la cuenta de plaquetas que se eleva arriba de 4.2 x 1012 plaquetas por litro en el día 5, lo cual es 3 veces la línea base a 1.4 x 1012 plaquetas por litro. Las tres construcciones de TMP-TTR fusionadas con CH2 funcionaron mejor que el control, pero no tan bien como Fc-TMP con cuentas de plaquetas entre 2.3 x 1012 y 2.6 x 1012 plaquetas por litro en el día 5, lo cual está entre 64% y 86% de mejoramiento sobre la línea base. EJEMPLO 30 Este ejemplo muestra el efecto de inyectar construcciones de TTR pegiladas con TMP fusionado al extremo carboxilo de TTR pegilado, en ratones, sobre la cuenta de plaquetas en sangre. Para este ejemplo, 80 ratones de BDF1 se dividieron en 8 grupos y se inyectaron (día 0) subcutáneamente con 50 mg de la proteína de prueba por kg de animal (construcciones de fusión de TMP, Fc-TMP o un control de TTR(CIOA) . Cada grupo se dividió a la mitad y se sangró (140 mi) en puntos de tiempo alternados (día 0, 3, 5, 7, 10 y 12) . Los ratones fueron anestesiados con isofluorano antes de la recolección. La sangre recolectada se analizó para una cuenta completa y diferencial utilizando un analizador de sangre automatizado ADVIA 120 con software murino (Bayer Diagnostics, Nueva York, NY) . Como se observa en la figura 14, Fc-TMP y las tres fusiones amino-terminales (TMP-TTR) mostraron la mayor respuesta con cuentas de plaquetas que se elevaban entre 4.3 x 1012 y 4.6 y 1012 plaquetas por litro en el día 5, lo cual es arriba de tres veces la línea base a 1.3 x 1012 plaquetas por litro. Las tres construcciones carboxilo-terminales (TTR-TMP) funcionaron mejor que el control. EJEMPLO 31 Este ejemplo muestra el efecto de inyectar construcciones de TTR-TMP pegiladas que contienen una alteración K15A, en ratones, sobre la cuenta de plaquetas en sangre. Para este ejemplo 120 ratones de BDF1 se dividieron en 12 grupos y se inyectaron (día 0) subcutáneamente con 50 mg de la proteína de prueba por kg de animal (construcciones de fusión de TMP, Fc-TMP, o un control de TTR(CIOA) (este estudio se dividió en dos lotes (PEG 20K en uno y el PEG 5K y las muestras no pegiladas en el otro) se completó a tiempos separados con controles repetidos) . Cada grupo se dividió a la mitad y se sangró (140 mi) en puntos de tiempo alternados (día 0, 3, 5, 7, 10 y 12) . Los ratones se anestesiaron con isoflurano antes de la recolección. La sangre recolectada ae analizó para una cuenta completa y diferencial utilizando un analizador de sangre automatizado ADVIA 120 con software murino (Bayer Diagnostics, Nueva York, NY) . Como se observa en la Figura 15A, las dos construcciones no pegiladas superaron la línea base (1.3 x 1012 plaquetas L-l) con respuestas plaquetarias en el día 5 que se elevan entre 1.7 x 1012 y 2.0 x 1012 plaquetas Ll . Como se observa en la Figura 15B, Fc-TMP y las tres fusiones pegiladas 5K mostraron respuestas equivalentes en el día 5, con cuentas plaquetarias que se elevaban entre 3.5 x 1012 y 4.4 x 1012 plaquetas por litro lo cual es al menos 2.7 veces la línea base (1.3 x 1012 plaquetas por litro) . Como se observa en la figura 15C, Fc-TMP y las tres fusiones pegiladas 20K mostraron respuestas equivalentes en el día 5 con la cuenta plaquetaria que se elevaba entre 4.3 x 1012 y 4.6 x 1012 plaquetas por litro, lo cual es más de tres veces la línea base a 1.2 x 1012 plaquetas por litro. Además, las construcciones de TTR pegiladas 20K parecen tener una respuesta sostenida mejorada con las plaquetas en el día 7 que se elevan de 3.7 x 1012 a 4.9 x 1012 plaquetas por litro en comparación a Fc-TMP a 3.1 x 101¿ plaquetas por litro. Esta respuesta sostenida es mantenida en el día 10 para las tres construcciones de TTR pegiladas 20K con las plaquetas en el intervalo de 2.3 x 1012 a 3.1 x 1012 plaquetas por litro, en comparación a Fc-TMP a 2.0 x 1012 plaquetas por litro. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para incrementar la vida media en suero de un agente biológicamente activo, caracterizado el método porque comprende fusionar el agente biológicamente activo a la transtiretina (TTR) o una variante de TTR. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque TTR o la variante de TTR es químicamente modificada con un producto químico seleccionado del grupo que consiste de dextrano, poli (n-vinil-pirrolidona) , polietilenglicoles , homopolímeros de propilenglicol , co-polímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcoholes polivinílieos . 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque TTR o la variante de TTR es químicamente modificada con polietilenglicol. . El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polietilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kD y 100 kD. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polietilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 5 kD y 30 kD. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque TTR es codificada por el ácido nucleico de la SEQ ID No.: 2. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la variante de TTR es codificada por al ácido nucleico de la SEQ ID No.: 8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado .porque el agente biológicamente activo es una proteína. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente biológicamente activo es un péptido . 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido es un péptido mimético de TPO (TMP) . 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente biológicamente activo es un péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) 12. Una preparación sustancialmente homogénea de una fusión de TTR-agente biológicamente activo, caracterizada porque está opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 13. Una preparación sustancialmente homogénea de una fusión PEG-TTR-agente biológicamente activo, caracterizado porque está opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 14. La preparación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el agente biológicamente activo es una proteína. 15. La preparación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el agente biológicamente activo es un péptido. 16. La preparación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el péptido es un TMP . 17. La preparación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el péptido es un GLP-1. 18. Una preparación sustancialmente homogénea de una fusión variante de TTR-agente biológicamente activo, caracterizada porque está opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 19. Una preparación sustancialmente homogénea de una fusión PEG-variante de TTR-agente biológicamente activo, caracterizada porque está opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 20. La preparación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el agente biológicamente activo es una proteína. 21. La preparación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el agente biológicamente activo es un péptido. 22. La preparación de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el péptido es un TMP . 23. La preparación de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el péptido es GLP-1 24. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-23, caracterizada porque la fusión contiene un péptido ligador. 25. Un proceso para preparar una preparación sustancialmente homogénea de una fusión de TTR-agente biológicamente activo, caracterizado el proceso porque comprende: (a) fusionar la TTR a un agente biológicamente activo, para proporcionar una fusión de TTR-agente biológicamente activo; y (b) aislar la fusión de TTR-agente biológicamente activo. 26. Un proceso para preparar una preparación sustancialmente homogénea de una fusión de variante de TTR-agente biológicamente activo, caracterizado el proceso porque comprende: (a) manipular por ingeniería genética un residuo de cisteína dentro de una posición de aminoácido específica, dentro de la secuencia de aminoácidos de la TTR, para proporcionar una variante de TTR; (b) fusionar la variante TTR a un agente biológicamente activo para proporcionar una fusión variante de TTR-agente biológicamente activo; y (c) aislar la fusión variante de TTR-agente biológicamente activo . 27. Un proceso para preparar una preparación sustancialmente homogénea de un fusión PEG-TTR-agente biológicamente activo, caracterizado el proceso porque comprende: (a) conjugar un polietilenglicol a la TTR para proporcionar PEG-TTR; (b) fusionar PEG-TTR a un agente biológicamente activo para proporcionar la fusión PEG-TTR-agente biológicamente activo; y (c) aislar la fusión de PEG-TTR-agente biológicamente activo. 28. Un proceso para preparar una preparación sustancialmente homogénea de un fusión PEG-variante de TTR-agente biológicamente activo, caracterizado el proceso porque comprende: (a) manipular por ingeniería genética un residuo de cisteína dentro de una posición de aminoácido específica, dentro de la secuencia de aminoácidos de la TTR, para proporcionar una variante de TTR; (b) conjugar un polietilenglicol a la variante de TTR en el residuo de cisteína, para proporcionar PEG-variante de TTR; (c) fusionar PEG-variante de TTR a un agente biológicamente activo para proporcionar una fusión PEG-TTR-agente biológicamente activo; y (d) aislar la fusión de PEG-TTR-agente biológicamente activo . 29. Un método para tratar la trombocitopenia, caracterizado porque comprende administrar una dosis terapéuticamente efectiva de una preparación de conformidad con la reivindicación 16. 30. Un método para tratar la trombocitopenia, caracterizado porque comprende administrar una dosis terapéuticamente efectiva de una preparación de conformidad con la reivindicación 22. 31. Un método para tratar la diabetes no dependiente de . insulina, caracterizado porque comprende la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de una preparación de conformidad con la reivindicación 17. 32. Un método para tratar la diabetes no dependiente de insulina, caracterizado porque comprende la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de una preparación de conformidad con la reivindicación 23. 33. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende una proteína TTR fusionada a una secuencia heteróloga . 34. Una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la secuencia heteróloga es un TMP. 35. Una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la secuencia heteróloga es un GLP-1. 36. Una proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33, 34 ó 35, caracterizada porque comprende además una secuencia ligadora entre la proteína TTR y la secuencia heteróloga. 37. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para la proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33, 34 ó 35.
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