CZ298203B6 - Fúzní OB protein, sekvence nukleové kyseliny, vektor, hostitelská bunka, zpusob produkce proteinu ajeho pouzití pro výrobu léciva, farmaceutická kompozice - Google Patents

Abstract

Protein obecného vzorce R.sub.1.n.-R.sub.2.n. nebo R.sub.1.n.-L-R.sub.2.n., kde R.sub.1.n. predstavuje Fc cást imunoglobulinu; L predstavuje linker; a R.sub.2.n. predstavuje OB protein. Sekvence nukleové kyseliny kódující tento protein. Vektor pAMG21 ulozený pod císlem ATCC 98113. Hostitelská bunkaobsahující tento vektor. Zpusob produkce tohoto proteinu zahrnující kultivaci hostitelské bunky a izolaci vyrobeného proteinu. Farmaceutická kompozice s obsahem tohoto proteinu a její pouzití pro výrobu léciva pro lécení nadmerné telesné hmotnosti, diabetes, vysoké hladiny lipidu v krvi, arteriosklerózy a arteriálního plátu, pro redukci nebo prevenci vzniku zlucových kamenu a pro lécení nedostatecnosti tkáne tvorené v podstate svalovinou neobsahující tuk, nedostatecné citlivosti k inzulinu a mrtvice.

Description

Fúzní OB protein, sekvence nukleové kyseliny, vektor, hostitelská buňka, způsob produkce proteinu a jeho použití pro výrobu léčiva, farmaceutická kompozice

Oblast techniky

Vynález se týká Fc-ΌΒ fúzního proteinu, sekvence nukleové kyseliny, vektoru, hostitelské buňky, způsobu produkce proteinu a jeho použití pro výrobu léčiva a farmaceutické kompozice na bázi tohoto proteinu.

Dosavadni stav techniky

Ačkoliv jc molekulární základ obezity z velké části neznámý, identifikace „OB genu a kódovaného proteinu („OB proteinu“ neboli „leplinu“) do určité míry osvětlila mechanismus, který' organismus používá pro regulaci ukládání tělesného tuku - viz PCT publikace WO 96/05309 (12/22/96), Fricdman ct al., Zhang et al.. Nátuře 372. str. 425 až 432 (1994) a také Correction at Nátuře 374. str. 479 (1995). OB protein je aktivní in vivo jak u mutantních myší ob/ob (myši, u nichž je příčinou obezity defekt v produkci produktu OB genu), tak u normálních myší divokého typu. Biologická aktivita se manifestuje mj. ztrátou hmotnosti. Obecně viz Barrinaga, „Obesc“ Protein Slims Mice, Science 269, str. 456 až 475 (1995). OB protein, jeho deriváty a jejich použiti jako modulátorů kontroly hmotnosti a adiposity u živočichů, jako u savců a lidí, jsou velmi podrobně popsány v PCT publikaci WO 96/05309 (12/22/96), která zde je citována náhradou za přenesení celého jejího obsahu, včetně obrázků, do tohoto textu.

Ostatní biologické účinky OB proteinu nejsou dobře charakterizovány. Je například známo, že u ob/ob mutantních myší podávání OB proteinu vede ke zvýšení hladiny inzulínu v séru a hladiny glukózy' v séru. Je rovněž známo, žc podávání OB proteinu vede ke snížení hladiny sérového inzulínu a sérové glukózy. Je také známo, že podávání OB proteinu má za následek snížení tělesného tuku. To bylo zjištěno jak u ob/ob mutantních myší, tak u neobézních normálních myší. (Viz Pelleymounter et al, Science 269, str. 540 až 543, 1995; Halaas et al., Science 269, str. 543 až 546, 1995 a dále Campfield et al.. Science 269, str. 546 až 549, 1995, Pcriphcral and centrál administration of microgram doses of OB protein reduced food intake and body weight of ob/ob and diet-indueed obese mice but not in db/db obesc mice.) Podle žádné z těchto zpráv byla pozorována toxicita, a to ani při nej vyšších dávkách.

Přes příslib klinického využití OB proteinu není mechanismus jeho působení in vivo zcela objasněn. Informace o OB rcceptoru ukazují vysokou vazebnou afinitu k OB proteinu zjištěném v hypotalamu potkana, což dokazuje umístění OB receptoru - ví Stcphens et al. Nátuře 377, str. 530 až 532. Myš db/db vykazuje stejný fenotyp jako myš ob/ob, tj. extrémní obezitu a diabetes typu II. Má se za to. že k tomuto fenotypu vede detektivní OB receptor, zejména proto, že myši db/db neodpovídají na podávání OB proteinu (viz Stephens, výše uvedená citace).

Pokrok dosažený v technologiích s rekombinantní DNA, který zvýšil dostupnost rekombinantních proteinů pro terapeutická použití, se odrazil v rozvoji formulace a chemické modifikace proteinů. Jedním z cílů takové modifikace je ochrana proteinu a snížení jeho degradace. Fůzní proteiny a chemické připojení mohou účinně blokovat fyzický kontakt proteolytického enzymu s hlavním řetězcem proteinu, a tak bránit degradaci. Jako další výhody je za určitých okolností možno uvést zvýšení stability, doby cirkulace a biologické aktivity terapeutického proteinu. Přehledný popis modifikace proteinů a fúzních proteinů lze nalézt ve Francis, Focus on Growth Factors 3, str. 4 až 10 (květen 1992), vyd. Mediscript, Moutview Court, Friern Barnct Lané, Londýn N30, OLD, Velká Británie.

Jednou / takových modifikací jc použití FC regionu imunoglobulinů. Protilátky obsahující dvě funkční nezávislé části, variabilní doménu, známou jako „Fab“, která váže antigen, a konstantní

- 1 CZ 298203 B6 doménu, známou jako „Fc, která poskytuje spojení na efektorové funkce, jako komplementu nebo tágocytů. Fc část imunoglobulinu má dlouhý poločas v plazme, zatímco Fab část má poločas krátký (Capon et al„ Nátuře 337, 525 až 531, 1989).

Terapeutické proteinové produkty byly zkonstruovány za použití FC domény, aby se dosáhlo delšího poločasu nebo začlenění funkcí, jako je vazba Fc receptoru, vazba proteinu A, fixace komplementu a prostup placentou, které vždy náleží Fc proteinům imunoglobulinu. Tak například byla fúzována Fc oblast protilátky IgGl s N-terminálním koncem CD30-L. molekuly, která váže receptory CD30 exprimované na nádorových buňkách Hodgkinova nádoru, buňkách ana10 plastického lymfomu, leukemických T-buňkách a maligních buňkách jiných typů (viz patent US 5 480 981). IL 10, protizánětlivé činidlo a látka snižující odmítavou reakci, byl za účelem zvýšení poločasu cirkulace cytokinu fúzován s myší Fcy2a (Zheng. X. et al., Thc Journal of Immunology, 154: 5590 až 5600. 1995). Byly také zpracovány studie hodnotící použití receptoru faktoru nekrózy nádorů vázaného s Fc proteinem lidského IgGl při léčení pacientu postiže15 ných scptickým šokem (Fisher, C, et al.. N. Engl. J. Med., 334, 1697 až 1702, 1996; Van Zcc, K. et al., The Journal of Immunology, 156, 2221, až 2230, 1996). Fc byl také fúzován s receptorem CD4 za vzniku terapeutického proteinu pro léčení AIDS (viz Capon et al., Nátuře, 337, 525 až 531, 1989). Kromě toho byl za účelem překonání krátkého poločasu interleukinu 2 a jeho systémické toxicity fúzován N-konec interleukinu 2 s Fc částí IgGl nebo lgG3 (viz Harvill et al, 20 Immunotechnology, 1.95 až 105, 1995).

Vzhledem ktomu, že OB protein byl identifikován jako slibný terapeutický protein, vznikla potřeba vyvinout kompozice na bázi OB analogu pro klinické použití, které by se podávaly spolu sOB proteinem nebo namísto něho. Tento vývoj by mohl být zaměřen na kompozice na bázi 25 OB analogu, při němž by se formulacemi a chemickými modifikacemi proteinů dosáhlo snížení degradace proteinu, zvýšení stability a doby cirkulace. Takové kompozice jsou předmětem tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je protein obecného vzorce R_t-R₂ nebo R]-E~R_?, kde R] představuje Fc část imunoglobulinu; L představuje linker; a R₂ představuje OB protein. Protein podle vynálezu je podrobněji definován dále. Předmětem vynálezu jc dále sekvence nukleove kyseliny kódující 35 tento protein, vektor pAMG21 uložený pod číslem ATCC 98113 a hostitelská buňka obsahující tento vektor. Předmětem vynálezu jc i způsob produkce tohoto proteinu zahrnující kultivaci hostitelské buňky a izolaci vyrobeného proteinu, farmaceutická kompozice s obsahem tohoto proteinu a použití tohoto proteinu pro výrobu léčiva pro léčení dále specifikovaných poruch.

Předmětem vynálezu je zejména genetický fúzní protein, který’ obsahuje Fc část imunoglobulinu fúzovanou sN-terminální oblastí OB proteinu. Fc- OB fúzní protein jc schopen dimerizace na cystěinových zbytcích Fc oblasti. Neočekávaně se ukázalo, že genetická fúzní modifikace s Fc na N-konci OB proteinu je výhodná z hlediska stability, rychlosti clearance a snížení degradace. Těchto výhod se u OB proteinu nebo u fúze Fc s C-koncem OB proteinu nedosáhne. Překvapivé 45 a důležité je zjištění, že ve srovnání s OB proteinem nebo Fc modifikací na C-konci OB proteinu, modifikace na N-konci OB proteinu poskytuje neočekávanou ochranu proteinu před degradací, prodlouženou dobu cirkulace a zvýšenou stabilitu. Tyto neočekávané výhody vyplývající z Fc modifikace OB proteinu by pro konzumenty OB proteinu byly prospěšné, jelikož tyto změny přispívají požadovanému snížení dávek nebo nižší frekvenci podávání. Tento vynález, jak je pod50 robněji popsáno dále, má tedy řadu aspektů spojených s genetickou modifikací proteinů prostřednictvím fúze Fc oblasti s OB proteinem (nebo jeho analogem), jakož i se specifickými modifikacemi, způsoby výroby a použití.

Podle jednoho aspektu je předmětem vynálezu Fc-OB fúzní protein, v němž je Fc oblast genetic55 ky fúzována s N-konccm OB protein (nebo jeho analogu). Kromě toho, jak jc známo odborní- 2 .

kům v tomto oboru, může být Fc oblast připojen kN-konci OB protein (nebo jeho analogu) prostřednictvím peptídového nebo chemického linkeru. Jak již bylo poznamenáno výše a je podrobněji popsáno dále, Fc-OB fúzní protein vykazuje neočekávanou ochranu proti degradaci, prodlouženou dobu cirkulace a zvýšenou stabilitu ve srovnání s OB proteinem nebo C-terminál5 nimi OB-Fc fúzními proteiny. Podle dalších aspektů jsou tedy předmětem vynálezu nejen kombinace na bázi Fc-OB fúzního proteinu, ale také DNA sekvence kódující takové proteiny, příslušné vektory a hostitelské buňky obsahující takové vektory, ktcrc jsou užitečné pro produkci fúzních proteinů podle vynálezu.

ίο Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou způsoby přípravy Fc-OB fuzního proteinu. Tyto postupy zahrnují postupy s rekombinantní DNA pro přípravu rekombinantních proteinů a dále způsoby fcrmcntacc a purifikace.

Fc-OB fuzního proteinu podle vynálezu je možno použít pro léčení nadváhy li osob nebo živoči15 chů, při němž se podáváním snižuje ukládání tuku. Vzhledem k vlastnostem Fc-OB fúzního proteinu se při tomto způsobu může snížit množství a/nebo frekvence podávání OB proteinu.

Fc-OB fúzního proteinu podle vynálezu je také možno použít pro léčení chorobných stavu spojených s nadbytkem tukové tkáně, jako je diabetes, dys- nebo hyperlipidemie. arteriální skleróza 20 a arteriální plát, způsob redukce nebo prevence tvorby žlučových kamenů, léčení mrtvice a rovněž způsob zvyšování citlivosti na inzulín a/nebo zvyšování hmoty tkání tvořených převážně svalovinou bez tuku.

Podle dalšího aspektu jsou předmětem vynálezu farmaceutické kompozice na bázi Fc-OB pro25 teinii a analogů a jejich derivátů pro použití při léčení výše uvedených stavů.

Popis obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna rekombinantní myší metOB (dvouřetězcová) DNA (SEQ ID NO: 1 a 2) a sekvence aminokyselin (SEQ ID: NO: 3).

Na obr. 2 je znázorněn rekombinantní lidský metOB analog DNA (dvouřetězcové) (SEQ ID NO: 4 a 5) a sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 6).

Na obr. 3 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská metFc-OB (dvouřetězcová) DNA (SEQ ID NO: 7 a 8) a sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 9).

Na obr. 4 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská metFc-OB varianta (dvouřetězcová) DNA 40 (SEQ ID NO: 10 a 11) a sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 12).

Na obr. 5 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská mctFc-OB varianta (dvouřetězcová) DNA (SEQ ID. No: 13 a 14) a sekvence aminokyseliny (SEQ ID: NO: 15).

Na obr. 6 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská mctFc-OB varianta (dvouřetězcová) DNA (SEQ ID NO: 16a 17) a sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 18).

Následuje podrobnější popis vynálezu

Předmětem vynálezu jsou kombinace na bázi Fc-OB fúzního proteinu, způsoby přípravy takových kompozic a jejich použití. Konkrétně se vynález týká genetické nebo chemické fúze Fc oblasti imunoglobulinu s N-tcrminální oblastí OB proteinu. Neočekávané se zjistilo, že fúze Fc na N-konce OB proteinu vykazuje výhody, které OB protein nebo fúze Fc na C-koncc OB 55 proteinu nemá. N-tcrminální Fc modifikace OB proteinu mu překvapivě poskytuje neočekávanou ochranu před degradací, prodlouženou dobu cirkulace a zvýšenou stabilitu. Fc OB fúzní protein, jeho analogy a jejich deriváty, jakož i způsoby použití a přípravy jsou podrobněji popsán dále.

Látky

Fc sekvence rekombinantní humánní Fc-OB sekvence uvedená v SEQ. ID. NO: 9 (viz obr. 3) může být zvolena ze souboru sestávajícího z těžkého řetězce lidského imunoglobulinu IgG-1 (viz Ellison. J. W. et al.. Nucleic Acids Res. 10. 4071 až 4079. 1982) nebo jakékoliv jiné Fc sekvence známé v tomto oboru (například IgG jiných tříd, jejichž neomezujícími příklady jsou IgG—2, IgG3 a IgG—4 nebo jiné imunoglobuliny). Varianty, analogy nebo deriváty Fc části mohou být zkonstruovány například různými záměnami zbytků nebo sekvencí.

Cysteinové zbytky lze odstranit nebo nahradit jinými aminokyselinami, aby se zabránilo vytvoření d i sul Edových příčných vazeb v Fc sekvenci. Konkrétně, aminokyselinou v poloze 5 SEQ ID. NO: 9 je cystainový zbytek. Rekombinantní Fc-OB sekvencí (SEQ ID: NO: 9) je 378-aminokyselinový Ec-OB protein (nepočítaje v to methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence rckombinantního Fc-OB proteinu z obr. 3 je označována jako +1 s methioninem v poloze -L

Cystein v poloze 5 je možno odstranit nebo nahradit jednou aminokyselinou nebo větším počtem aminokyselin. Cysteinový zbytek v poloze 6 je možno nahradit alaninem, čímž se získá variantní aminokyselinová sekvence znázorněná na obr. 4 (SEQ ID NO. 12). Rekombinantní Fc-OB proteinem z obr. 4 je 378-aminokyselinový Fc-OB (nepočítaje methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence jc rekombinantní Fc-OB protein z br. 4 jc označována jako + 1 s methioninem v poloze -1.

Podobně by cystein v poloze 5 SEQ ID. NO: 9 mohl být nahrazen serinem nebo zbytkem jiné aminokyseliny nebo vypuštěn. Variantu nebo analog je také možno připravit delecí aminokyselin v polohách 1,2, 3, 4 a 5, jak jc tomu například u varianty v SEQ. ID. NO. 15 (viz obr. 5). Zbytky v těchto polohách je také možno nahradit, a takové substituce spadají do rozsahu tohoto vynálezu, Rekombinantní Fc-ΌΒ protein z obr. 5 je Fc-OB proteinem se 373 aminokyselinami (nepočítaje methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence jc rekombinantní Fc-OB protein z obr. 5 je označována jako +1 s methioninem v poloze -1.

Modifikace je také možno provádět za účelem zavedení čtyř aminokyselinových substitucí pro odstranění vazebného místa Fc receptoru a vazebného místa komplementu (Clq). Tyto variantní modifikace ze SEQ. ID. NO: 15 by zahrnovaly nahrazení leucinu v poloze 15 kyselinou glutamovou, nahrazení kyseliny glutamové v poloze 98 alaninem a nahrazení lysinu v polohách 100 a 102 alaninem (viz obr. 6 a SEQ ID. NO. 18). Rekombinantní Fc-OB protein z obr. 6 je Fc-OB proteinem se 373 aminokyselinami (nepočítaje methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence pro rekombinantní Fc OB protein z obr. 6 je označena jako +1 s methioninem v poloze -1.

Podobně je jedna nebo více tyrosinových zbytků možno nahradit fenylalaninovými zbytky. Kromě toho je možno provést jiné variantní inzerce, delece a/nebo substituce aminokyselin, které rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Dále přecházejí v úvahu a Iterace ve formě a Iterovaných aminokyselin, jako jsou peptidomimetika nebo D-aminokyscliny. Fc protein je také možno navázat na OB proteiny Fc-OB proteinu pomocí „linkerových“ zbytků, kterými jsou buď zbytky chemických sloučenin nebo zbytky aminokyselin o různé délce. Takové chemické linkery jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy. Jak neomezující příklady sekvencí aminokyselinových linkerú je možno uvést:

(a) ala, ala, ala;

(b) ala, ala, ala. ala;

(c) ala, ala, ala, ala. ala;

-4CZ 298203 B6 (d) gly, gly:

(e) gly, gly, gly;

(0 gly, gly, gly. gly. gly;

(g) gly, gly. gly, gly, gly. gly. gly;

s (h) gly-pro-gly;

(i) gly, gly. pro, gly, gly: a (j) kteroukoliv kombinaci (a) až (i).

OB část Fc-OB fúzního proteinu může být zvolena ze souboru sestávajícího z rekombínantního iíj myšího proteinu popsaného v SEQ, ID, NO: 3 (viz obr. 1) a rekombínantního lidského proteinu uvedeného v Zhang et al.. Nátuře, viz výše a proteinu shodného s tímto proteinem, který však v poloze 28 postrádá glutaminylový zbytek (viz Zhang et al., Nátuře, víz výše, str. 428). Rovněž je možno použít analogu rekombínantního lidského OB proteinu, který je uveden v SE ID. NO: 6 (viz obr. 2), jenž obsahuje (1) arginin namísto lysinu v poloze 35: a (2) leucin namísto izoleucinu 15 v poloze 74 (zkratka tohoto analogu je „rekombinantní lidský R->L'\ I—>L⁷⁴). Aminokyselinová sekvence pro rekombinantní lidský a rekombinantní myší protein nebo jejich analogy s fúzovanou Fc částí na N-konci OB proteinu nebo bez léto části jsou uvedeny dále s methionylovým zbytkem v poloze -1, ačkoliv v kterémkoliv z těchto OB proteinů a analogů může mcthionylovy zbytek chybět.

Myší protein je v podstatě homologní s lidským proteinem, zejména ve formě maturovaného proteinu, zvláště na N-konci. Analog rckombinantního lidského proteinu je možno připravit alterací (jako substitucí aminokyselinových zbytků) aminokyselin v rekombinantní lidské sekvenci aminokyselinami, které sc liší od myší sekvence. Jelikož rekombinantní lidský protein vykazuje 25 biologickou aktivitu u myši, byl by takový analog pravděpodobně aktivní u lidí. Tak je například možno za použití lidského proteinu s lysinem v poloze 35 a izoleucinem v poloze 74, číslováno podle SEQ. Id NO: 6, kde první aminokyselinou je valin a aminokyselinou v poloze 146 je cystein, jednu nebo více aminokyselin v polohách 32. 35, 50, 64, 68. 71. 74, 77. 89. 97. 100, 105,

106, 107, 108, 111, 118, 136, 138. 142 a 145 nahradit jinými aminokyselinami. Aminokyselinu je 30 možno zvolit ze souboru sestávajícího z aminokyselin v odpovídajících polohách myšího proteinu (SEQ. ID. NO: 3) a jiných aminokyselin.

Dále je možno připravovat „konvenční” molekuly založené na sekvenci potkaního OB proteinu (viz publikace Murakami et al„ Biochem. Biophys. Res. Comm. 209, 944 až 952, 1995, která jc 35 zde citována náhradou za přenesení jejího obsahu do tohoto textu). Potkaní OB protein se od lidského OB proteinu liší v následujících polohách (za použití číslování ze SEQ. ID. NO: 6), 4, 32, 33. 35, 50, 68. 7£ 74, 77, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106. 107, 108, 111. 118, 136, 138 a£45, Jinou aminokyselinou je možno nahradit jednu nebo více aminokyselin v těchto polohách s odlišností. Podtržení označuje polohy, v nichž se od lidského OB proteinu odlišu je jak myší OB pro40 tem, tak i potkaní OB protein, tedy polohy , které jsou zvláště vhodné pro alteraci. Aminokyselinu zodpovídajícího potkaního OB proteinu nebo jinou aminokyselinu je možno nahradit v jedné nebo více polohách.

Polohy aminokyselin jak z potkaního, tak z myšího OB proteinu, které se liší od maturovaného 45 lidského OB proteinu jsou: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68. 71, 74, 77. 78. 89, 97, 100, 102, 105, 106,

107, 108, 111.118. 136, 138. 142 a 145. OB protein podle SEQ. ID. NO. 6, který má jednu nebo větší počet výše uvedených aminokyselin nahrazených jinou aminokyselinou, jako aminokyselinou. která se nachází v odpovídající potkaní nebo myší sekvenci, může být také účinný.

Kromě toho aminokyselinami, které sc nacházejí v OB proteinu makaka rhesus a jsou odlišné od maturovaného lidského OB proteinu makaka rhesus a jsou odlišné od maturovaného lidského OB proteinu, jsou : 8 ($), 35 (R), 48 (V). 53 (Q), 60 (1),66 (I), 67 (N). 68 (L), 89 (L). 100 (L).

108 (E), 112 (D) a 118 (L) (v závorkách je uvedena jednopísmenná zkratka aminokyseliny). Jelikož je rekombinantní lidský OB protein aktivní u opic Cynomolgus. lidský OB protein podle SEQ ID: NO; 6 (s lysinem v poloze 35 a izoleucinem v poloze 74). v němž je jedna nebo větší počet takových „rhesus divergentních“ aminokyselin nahrazen jinou aminokyselinou, jako aminokyselinou uvedenou v závorkách, může byl účinný. Je třeba poznamenat, že určité „rhesus divergentní aminokyseliny se také nacházejí ve výše uvedeném myším typu polohy 35, 68, 89.

100 a 112). Je ledy možné připravit myší/rhesus/lidskou konvenční molekulu (s lysinem v poloze 35 a izoleucinem v poloze 74. číslováno podle SEQ. ID NO: 6). kde je jedna nebo více aminokyselin v polohách 4, 8, 32, 33, 35. 48, 50. 53. 60, 64, 67, 68, 71. 74, 77. 78, 89, 97, 100. 102, 105, 106, 107, 108. 111. 112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazeno jinou aminokyselinou.

Další analogy je možno připravit delecí části aminokyselinové sekvence proteinu. Například maturovaný protein postrádá vedoucí sekvenci (-22 až — 1). Lze připravit následující zkrácené formy molekul lidského OB proteinu (číslováno podle SEQ ID. N O: 6):

(a) aminokyseliny 98 až 146 (b) aminokyseliny 1 až 32 (c) aminokyseliny 40 až 116 (d) aminokyseliny 1 až 99 a (současně) 112 až 146) (e) aminokyseliny 1 až 99 a (současně) 112 až 146 sjednou nebo větším počtem aminokyselin 100 až 111 umístěnými mezi aminokyseliny 99 až 112.

Kromě toho zkrácené formy mohou také obsahovat alteraci v jedné nebo větším počtu aminokyselin, které jsou v potkaním, myším nebo rhesus OB proteinu odlišné (divergentní) od lidského OB proteinu, a jakákoliv alterace mít formu alterovaných aminokyselin, jako jsou peptidomimelika nebo D-aminokyseliny.

Předmětem vynálezu jc tedy Fc-OB fúzní protein, v němž je OB protein zvolen ze souboru sestávajícího z (a) aminokyselinové sekvence 1 až 146 uvedené v SEQ ID. NO: 3 (níže) nebo SEQ. ID. NO. D6;

(b) aminokyselinové sekvence 1 až 146 uvedené v SEQ. ID, NO: 6 s lysinovým zbytkem v poloze 35 a izolcucinovým zbytkem v poloze 74:

(c) aminokyselinové sekvence podle odstavce (b) s různými aminokyselinami substituovanými v jedné nebo větším počtu následujících poloh (číslováno podle SEQ. ID. NO. 6, a to i v případě, že glutamínylový zbytek v poloze 28 chybí): 4, 32, 33, 35. 50, 64, 68, 71, 74, 77. 78, 89, 97, 100. 102, 105. 106, 107. 10. 111. 118. 136, 138, 142 a 145;

(d) aminokyselinové sekvence podle odstavec (a), (b) nebo (c). v níže popřípadě chybí glutaminylový zbytek v poloze 28;

(c) aminokyselinové sekvence podle odstavec (a), (b), (c) nebo (d) s methionylovým zbytkem na N-konci;

(f) zkráceného analogu OB proteinu zvoleného ze souboru sestávajícího z (počítáno podle SEQ. IN.NO: 6) (i) aminokyselin 98 až 146 (ii) aminokyselin 1 až 32

-6CZ 298203 B6 (iii) aminokyselin 40 až 116 (iv) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 (v) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 sjednou nebo větším počtem aminokyselin 100 až 111 umístěnými mezi aminokyseliny 99 až 1 12: a (vi) zkráceného OB analogu podle odstavce (i), v němž je jedna nebo větší počet aminokyselin 100. 102, 105? 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138. 142 a 145 nahrazena jinou aminokyselinou;

(vii) zkráceného analogu podle odstavce (ii), v němž jc jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8 a 32 nahrazen jinou aminokyselinou;

(viii) zkráceného analogu podle odstavce (iii). v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 50. 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74. 77, 78. 89. 97, 100, 102, 105, 106, 107. 10. 111 a 112 nahrazen jinou aminokyselinou;

(ix) zkráceného analogu podle odstavec (iv). v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4. 8. 32, 33, 35, 48, 50. 53, 60, 64, 66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89,97, 112, 118, 136. 138. 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

(x) zkráceného analogu podle odstavce (v), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4. 32, 33,35,50, 64, 68,71.74,77. 78, 89,97, 100, 102, 105, 106, 107. 108, 111, 118. 136, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

(xi) zkráceného analogu podle kteréhokoliv z odstavců (i) až (x) s N-tcrminálním methionylovým zbytkem;

(g) derivátu OB proteinu nebo analogu podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (f), který obsahuje chemický zbytek připojený k proteinovému zbytku (h) derivátu podle odstavce (g) v němž je chemickým zbytkem zbytek vodorozpustného polymeru;

(i) derivát podle odstavce (h). v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zby tek póly cthylenglykolu;

(j) derivát podle odstavce (h), v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyaminokyseliny;

(k) derivát podle odstavce (h) až (j), jde je uvedený zbytek připojen pouze na N-konci proteinového zbytku; a (l) OB protein, analog nebo derivát podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (k) vc farmaceuticky vhodném nosiči.

Deriváty

Fc-OB fúzní proteiny (pod pojmem „protein¹' se rozumí „peptid“, Fc, OB nebo analogy, jaké jsou například uvedeny dále, pokud není uvedeno jinak) se derivatizují tak, že se ke zbytku Fc -OB fúzního proteinu připojí jeden nebo větší počet chemických zbytků. 'Tyto chemicky modifikované deriváty je dále možno zpracovávat na formy pro intraarteriální, intraperitoneální. intramuskulámí, subkutánní, intravenózní, orální, nazální. pulmonární, topické nebo jiné podávání.

- 7 CZ 298203 B6 jako je popsáno dále. Bylo zjištěno, že chemické modifikace biologicky aktivních proteinů poskytují za určitých podmínek další výhody, jako je zvýšení stability a prodlužení doby cirkulace terapeutického proteinu a snížení imunogenity (viz patent US 4 179 337. Davis et al.. vydaný 18. prosince 1979; a přehled Abuchovvski et al.. Enzymes as Drugs. J. S. Holcerberg aj. Roberts ed„ str. 367 až 383. 1981; Francis et ak výše uvedená citace).

Jako chemické zbytky vhodné pro takovou derivatizaci je možno volit různé vodorozpustné polymery'. Zvolený polymer by mel být vodorozpustný, aby se protein, k němuž je připojen, nesrážel ve vodném prostředí, jako fyziologickém prostředí. Pro terapeutické použití konečného produktu bude polymer přednostně farmaceuticky vhodný. Odborník v tomto oboru bude schopen zvolit požadovaný polymer například na základě toho, zda sc konjugát polymer/protein bude používat k léčebným účelům, a pokud ano. na základě požadované dávky, doby cirkulace, rezistence vůči proteolýze a dalších ohledů. V případě proteinů a peptidů podle vynálezu může být efektivnost dcrivatizace zjištěna tak, že sc podávají deriváty v požadované formě (tj. například pomocí osmotické pumpy, nebo výhodněji, pomocí injekcí nebo infuzí, nebo ještě výhodněji, formulací pro orální, pulmonární nebo nazální dodávku) a pozorují se biologické účinky uvedené v tomto popisu.

Vodorozpustný polymer je možné zvolit ze souboru sestávajícího například z polyethylenglykolu. kopolymerú ethylenglykolu a propylenglykolu. karboxymcthylcclulózy. dextranu, pólyvinylalkoholu, póly viny Ipyrrolidonu, póly-1,3-dioxolanu. poly-1,3.6-trioxanu, kopolymerú ethylenu a anhydridu kyseliny maleínové, polyaminokysclin (bud¹ homopolymerů nebo statistických kopolymerú) a dextranem nebo poly(n-vinylpyrrolidonem) modifikovaného polyethylenglykolu. homopolymerů propylenglykolu, kopolymerú polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylovaných polyolů a polyvinylalkolu. Při výrobě může být výhodné použití polyethylenglykolpropionaldehydu, vzhledem k jeho stabilitě ve vodě. Rovněž je možno použít polymeru sukcinátu a sty renu.

OB nebo Fc proteiny, jichž se používá pro přípravu Fc-OB fůzního proteinu, lze vyrábět tak, že se ke zbytku Fc nebo OB proteinu (nebo analogu) naváže polyaminokyselina nebo „branch point“ aminokyselina. lak například polyaminokyselina může představovat přídavný nosičový protein, který podobně jako Fc fúzovaný k OB proteinu nebo OB analogu podle vynálezu, slouží k tomu, že se kromě výše popsaných výhod Fc-OB fůzního proteinu také dosáhne prodloužení poločasu cirkulace proteinu. Při použití pro terapeutické nebo kosmetické účely by se měly volit polyaminokyscliny. které nemají nebo nevy volávají neutralizační antigenní odpověď, nebo jiné nežádoucí odezvy. lakové polyaminokyseliny lze volit zc souboru sestávajícího ze sérového albuminu (jako lidského sérového albuminu), dalších protilátek nebo jejich částí (například Fc oblasti) a jiných polyaminokyselin, například lysinu. Jak je uvedeno dále, místo připojení aminokyseliny sc může nacházet na N konci Fc-OB proteinového zbytku, na jeho C-konci nebo na jiném místě mezi nimi. Polyaminokyselina může být k Fc-OB fúznímu proteinu také připojena pomocí chemického linkeru.

Polymer může mít jakou molekulovou hmotnost a muže být rozvětven nebo nerozvětvený. U polyethylenglykolu se s ohledem na snadnost zpracování a výroby dává přednost molekulové hmotnosti od asi 2 kDa do asi 100 kDa (pod pojmem „asi“ se rozumí, že v polyethylenových produktem budou mít některé molekuly hmotnost vyšší a některé hmotnost nižší, než je uvedená molekulová hmotnost). Je možno použít i jiných velikostí, a to v závislosti na požadovaném terapeutickém profilu, jako je například požadovaná doba trvalého uvolňování, účinky na biologickou aktivitu (pokud k nějakým dochází), snadnost zpracování, stupeň nebo absence antigenicity a jiných známých účinků, které má polyethylenglykol na terapeutický protein nebo analog.

Počet takto připojených polymerních molekul může být různý a odborník v tomto oboru bude schopen stanovit jeho účinky na funkci. Lze provádět monoderivatizaci, nebo je možno uskutečnit di-, tri-, tetraderívatizaci nebo určité kombinace derivatizace, přičemž se používá stejných nebo různých chemických zbytků (například polymerů, jako polyethylenglykolu o různé moleku

- 8 CZ 298203 B6 lové hmotnosti). Poměr polymemích molekul k molekulám proteinu (nebo peptidu) bude kolísat s jejich koncentrací v reakční směsi. Optimální poměr (z hlediska efektivnosti reakce, tj. aby nebyl přítomen žádný přebytek nezreagovaného proteinu nebo polymeru) bude dán takovými faktory; jako jc požadovaný stupeň derivatizace (například mono-, di-, tri- atd.), molekulová hmotnost zvoleného polymeru, okolnost zdaje polymer rozvětvený nebo nerozvětvený a reakční podmínky).

Chemické zbytky by k proteinu měly být připojeny se zřetelem na účinky na funkční a antigenní doménu proteinu. Existuje řada způsobů takových připojení, které jsou dostupné odborníkům v tomto oboru (viz například EP 0 401 384, který je zde citován náhradou za přenesení jeho obsahu do tohoto textu (kopulace PEG kG CSF)), a dále Malík et al.. Exp. Hematol. 20. 1028 až 1035. 1992 (popisující pegvlaci GM-CSF za použití tresylchloridu). Tak jc například polyethylenglykol možno kovalentně vázat prostřednictvím aminokyselinového zbytku přes reaktivní skupinu, jako je volná aminoskupina nebo karboxyskupina. Reaktivní skupina jsou skupiny, k nimž sc může vázat molekula aktivovaného polyethylenglykolu. Jako příklady aminokyselinových zbytků s volnou aminoskupinou je možno uvést zbytky lysinu a N-terminální aminokyselinové zbytky. Jako příklady aminokyselinových zbytků s volnou karboxyskupinou lze uvést zbytky kyseliny asparagovc, zbytky kyseliny glutamovc a C-tcrminální aminokyselinové zbytky. Jako reaktivních skupin pro připojení molekuly nebo molekul polyethylenglykolu je rovněž možno využít sulfhydrylových skupin. Z hlediska použití pro terapeutické účely se dává přednost připojení na aminoskupině, jako je N-tcrminální připojení nebo na zbytku lysinu. Připojení na zbytcích, které jsou důležité pro vazbu receptorů žádoucí.

V určitých případech muže být potřebné Fc-OB fúzní protein N-terminálně chemicky modifikovat. V případě polyethylenglykolu, který je zde uveden jako ilustrativní příklad, je možno volit z různých molekul polyethylenglykolu (co do molekulové hmotnosti, rozvětvení atd.). poměrů polycthylcnglykolových molekul k molekulám proteinu (nebo peptidu) v reakční směsi, typů pegylační reakce, která se má provádět, a způsobu přípravy zvoleného N-terminálně pegylovaného proteinu. Způsobem přípravy N-terminálně pegylovaného přípravu (tj. oddělení tohoto zbytku od jiných monopcgylovaných zbytků, pokud je to nezbytné) může být purifikace N-terminálně pegylované látky ze souboru molekul pegylovaného proteinu. Selektivní N-tcrminální chemickou modifikaci je možno provádět reduktivní alky lácí, která využívá různou reaktivitu různých typů primárních aminokyselin (lysin versus N-konec), jež jsou v konkrétním proteinu dostupné pro derivatizaci. Za vhodných reakčních podmínek se za použití polymeru obsahujícího karbonylovou skupinu dosáhne v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci. Tak je například možno selektivně N-terminálně pegylovat protein tak, žc sc reakce provádí při pH, které umožní využít výhody rozdílů v pK_;! mezi ε-aminoskupinou lys i nových zbytků a a-aininoskupinou Ntcnninálního zbytku proteinu. Takovou selektivní derivatizaci je řízené připojení vodorozpustného polymeru k proteinu: ke konjugaci s polymerem dochází převážně n N-konci proteinu a nedochází k žádné významné modifikaci jiných reaktivních skupin, jako je aminokyselina lysinového postranního řetězce. Za použití postupu reduktivní alky láce může být vodorozpu siným polymerem polymer výše popsaného typu, který by měl mít jedinou reaktivní aldehydovou skupinu pro kopulaci s proteinem. Může se použít polycthylcnglykolpropionaldehydu, který' obsahuje jedinou reaktivní aldehydovou skupinu.

N-terminálně monopegylovaným derivátům sc dává přednost z hlediska usnadnění přípravy léčiv. N- terminální pegylace zajišťuje homogenní produkt, jelikož charakterizace produktu je vzhledem k di-, tri- nebo jiným multi-pegylovaným produktům zjednodušena. Použití výše popsaného postupu reduktivní alky láce pro přípravu N-terminálního produktu se dává přednost z hlediska usnadnění výroby v průmyslovém měřítku.

Komplexy

Fc-PB fúzní protein, jeho analog nebo jejich derivát je možno podávat ve formě komplexu s vazebnou látkou. Taková vazebná látka může mít vliv na prodloužení doby cirkulace, která

- 9_

CZ 298203 Β6 může být dokonce delší než za použití Fc-OB fúzního proteinu, jeho analogu nebo derivátu. Takovými vazebnými látkami mohou být proteiny (neboli peptidy). Jako příklad vazebného proteinu lze uvést receptor OB proteinu nebo jeho část, jako je jeho vodorozpustná část. Jiné vazebné proteiny je možno zjistit zkouškou OB proteinu nebo Fc-OB proteinu v séru nebo empirickým sereeningem na přítomnost vazby. Použití vazebné proteiny obvykle nebudou interferovat se schopností OB proteinu, Fc-OB fúzních proteinu nebo analog nebo jejich derivátů vázat se k endogennímu receptorú OB proteinu a/nebo vyvolávat transdukci signálu.

Farmaceutické kompozice

Před metem vynálezu jsou také způsoby použití farmaceutických kompozic na bázi Fc-OF fúzních proteinů a derivátů. Takové farmaceutické kompozice mohou být vc formě pro injekční, orální, pulmonární. nazální. transdermální nebo jiné podávání. Předmětem vynálezu jsou farmaceutické kompozice, které obsahují účinné množství proteinového produktu nebo derivátu podle vynálezu spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, konzervačním činidlem, sol ubil izátorem, emulgátorem. adjuvantem a/nebo nosičem. Jako příklady takových látek je možno uvést ředidla s obsahem různých pufru (jako je např. Tris-HCl, acctátový pufr a fosfátový pufr), různých pH a iontovou silou: aditiva, jako detergenty a solubilizaČni činidla (například Twccn 80, Polysorbate 80), antioxidační činidla (například askorbovou kyselinu, disiřičitan sodný), konzervační činidla (například Thimersol, benzylalkohol) a látky dodávající objem (například laktózu. mannitol). V úvahu také přichází začlenění látky do částicového přípravku na bázi polynicmí sloučeniny, jako kyseliny polymléčné, polyglykolovc atd. nebo do liposomů. Také je možno použít kyseliny hyaluronové, která může mít podpůrný účinek na prodloužení coby cirkulace. Takové látky mohou ovlivnit fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost clearance in vivo proteinů a derivátů podle vynálezu (viz například publikace Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, str. 1435 až 1712, která je zde citována náhradou za přenesení jejího obsahu do tohoto textu). Kompozice je možno připravovat v kapalné formě nebo ve formě suchého prášku, jako v lyofilizované formě. V úvahu rovněž přicházejí implantovatelné prostředky s přetrvávajícím uvolňováním, a dále také transdermální prostředky.

Pro použití přicházejí v úvahu orální pevné dávkovači formy, které jsou obecně popsány v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání. 1990. Mack Publishing Co., Easton PA 18042 v kapitole 89, která jc zde uvedena náhradou za přenesení jejího obsahu do tohoto textu. Jako příklady pevných dávkovačích forem jc možno uvést tablety, tobolky, pilule, pastilky nebo zdravotní bonbony, oplatky nebo pelety. Při formulaci kompozic podle vynálezu také lze využít zapouzdření v liposomech nebo protcinoidcch (například proteinoidové mikrokuličky popsané v patentu US 4 925 673). Je možno použít liposomálního zapouzdření a liposomy je možno derivatizovat různými polymery (například patent US 5 013 556). Popis možných pevných dávkovačích forem pro léčivé látky je uveden v publikaci Marshall, K., Modem Pharmaceutics, Ed.. G. S. Bankéř a ('. T. Rhodes, kapitola 10, 1979, která je zde citována náhradou na přenesení jejího obsahu do tohoto textu. Kompozice bude obvykle obsahovat Fc-OB fúzní protein (nebo analog nebo derivát) a inertní přísady, které biologicky účinné látce poskytnou ochranu proti prostředí žaludku a umožní její uvolňování ve střevě.

Zvláště pozoruhodné jsou také orální dávkování formy výše popsaných derivatizovaných proteinů. Fc-OB fúzní protein jc možno chemicky modifikovat tak. aby orální dodávka tohoto derivátu byla účinná. Obvykle je takovou chemickou modifikací připojení alespoň jednoho zbytku k samotné molekule proteinu (nebo peplidu), pokud takový zbytek umožní (a) inhibovat proteolýzu: a (b) vstřebávání do krevního řečiště / žaludku nebo střeva. Žádoucí je také zvýšení celkové stability proteinu a prodloužení doby cirkulace v organismu. Jako příklady takových zbytků lze uvést polyethylenglykol, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulózu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon a polyprolin (Abuchowski a Davis, Soluble Polymer—Enzyme Adducts, „Enzyme as Drugs, eds. Floccnbcrg a Robcrts, Wiley Interscience, New York, NY, 1981. str. 367 až 383: Newmark et al., J. AppL Biochem. 4, 185 až 189, 1982). Jako

- 10CZ 298203 B6 jiné polymery, kterých by se mohlo použít, je možno uvést poly-l ,3-dioxolan a póly-1.3.6tioxokan. Jak bylo uvedeno výše, pro farmaceutické použití se dává přednost zbytkům polyethylenglykolu.

Místem uvolňování Fc-OB fůzní protein, analogu nebo derivátu může být žaludek nebo tenké střevo (například duodenum. jejunum nebo ileum) nebo tlusté střevo. Pro odborníka v tomto oboru jsou dostupné prostředky, které se nebudou rozpouštěl v žaludku, avšak budou látku uvolňovat v duodenu nebo kdekoliv jinde ve střevě. Uvolňování sc bude přednostně vyhýbat škodlivým účinkům prostředí žaludku, a to bud' pomocí ochrany Fc-OB fúzního proteinu, analogu nebo derivátu nebo prostřednictvím uvolňování biologicky účinné látky mimo prostředí žaludku, jako ve střevě.

Pro zajištění plné rezistence vůči prostředí v žaludku jsou podstatné obaly, kterc jsou nepropustné při pH alespoň 5,0. Jako příklady nejobvyklejších inertních přísad, kterých se používá jako enterických povlaků, je možno uvést acetát trimelitát celulózy (CAT), ftalát hydroxypropylmethylcelulózy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinyíacelátftalát (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, acetát ftalát celulózy (CAP), Eudragit L, Eudragit S a šelak. Těchto povlaků se může používat jako směsných filmů.

Obalů nebo směsí obalů se také může používat na tabletách, které nemají být chráněny před prostředím žaludku. Jako příklady takových obalů jc možno uvést cukerné obaly nebo obaly, které usnadňují polykání tablety. Tobolky mohou být tvořeny tvrdými tobolkami (jako želat lnovými) pro dodávku suchého léčiva (tj. prášku); pro kapalné formy jc možno použít měkkých želatinových tobolek. Stěny oplatek může tvořit ztužený škrob nebo jiný jedlý papír. Pro pilule, pastilky, lité tablety a tabletové trituráty je možno použít postupů kompaktování. hnětení nebo zpracování za vlhka.

Léčivo může byt v prostředku obsaženo jako jemné multičástice vc formě granulí nebo pelet o velikosti částic asi 1 mm. Látka pro podávání ve formě tobolek může také mít formu prášku, lehce slisovaných válečků nebo pelet či dokonce formu tablet. Léčivo je možno připravovat lisováním.

Jc možno použít všech barvicích a aromatizačních činidel. Tak jc například možno připravit formulaci na bázi proteinu nebo derivátu (jako zapouzdřením v liposomech nebo mikroperlách) a poté ji dále začlenit do jedlého produktu, jako chlazených nápojů obsahujících barvicí a aromatizační činidla.

Za použití inertní látky jc možno terapeuti ku in ředit nebo zvyšovat jeho objem. Jako příklady takových ředidel je možno uvést sacharidy, zejména mannitol. α-laktózu, bezvodou laktózu, celulózu, sacharózu, modifikované dextrany a škrob. Jako plniv je možno také použít některých anorganických solí, jako fosforečnanu vápenatého, uhličitanu horečnatého a chloridu sodného. Ředidly dostupnými na trhu jsou například Fast Flo, Emdex, STA-RX 1500, Encomprcss a Avicell.

Při formulacích terapeut i ka na pevnou dávkovači formu jc možno začlenit rozvolňovadla. Jako neomezující příklady látek, které jsou používány jako rozvolňovadla. je možno uvést škroby, jako obchodně dostupné rozvolňovadlo na bázi škrobu. Explotab. Také lze použít sodnou sůl škrobového glykolátu, Amberlite, sodnou sůl karboxymethylcclulózy, ultramylopcktin, alginát sodný, želatinu, pomerančovou slupku, karboxymclhylcelulózu ve volné formě, přírodní houbu a bentonit. Další formu rozvolňovadcl představují nerozpustné katexové pryskyřice. Jako rozvolňovadel a poj i v je možno po užít práškovaných pryskyřic, jako je agar, karaya nebo tragant. Užitečné jako rozvolňovadla jsou také kyselina alginová a její sodná sůl.

Při výrobě tvrdých tablet je možno použít poj i v. aby se dosáhlo soudržnosti terapeutického činidla. Jako příklady poj iv je možno uvést látky z přírodních produktů, jako je klovatina, tragant,

- 11 CZ 298203 B6 škrob a želatina, a dále rnethylccluiózu (MC), ethylcelulózu (EC) a karboxymethylcclulózu (CMC). Pro granulaci léčiva je možno použít polyvinylpyrrolidonu (PVP) i hydroxypropylmcthylcelulózu (HPMC) v alkoholických roztocích.

Aby se snížila lepivost směsi během formulačního procesu, mohou terapeutické prostředky obsahovat příslušná činidla snižující tření. Lze použít lubrikantú, které budou tvořit vrstvu mezi léčivem a stěnou formy. Jako neomezující příklady takových látek je možno uvést kyselinu stearovou. včetně jejích horečnatých a vápenatých solí, polytetrafluorcthylen (PTFE), kapalný parafín, rostlinné oleje a vosky. Také lze použít rozpustných lubrikantú, jako laury Isu I fátu sodného.

laury·(sulfátu horečnatého, polyethylenglvkolu o různých molekulových hmotnostech, Carbowax 4000 a 6000.

Je možno přidat kluzné látky, které mohou zlepšovat tokové vlastnosti léčiva během formulace a napomáhat přeskupování během lisování. Jako příklady kluzných látek je možno uvést škrob.

mastek, koloidní oxid křemičitý a hydrátovány hlinitokřemičitan.

Pro usnadnění rozpouštění léčiva ve vodném prostředí je možno přidat povrchově aktivní látku, jako smáčedlo. Jako příklady povrchově aktivních látek lze uvést aniontové detergenty, jako laurylsulťát sodný, dioktylsulfojantaran sodný a dioktylsulfonan sodný. Je možno použít také 20 kationtových delergentů, jako benzalkoniumchloridu nebo bcnzcthomiumchloridu. Jako povrchově aktivní látky ve formulacích mohou být obsaženy následující potenciální ne iontové detergenty; lauromakrogol 400. polyoxyl 40 stcarál, polyoxyethylenovaný hydrogenovaný ricinový olej.

10, 50 a 60. glycerolmonostearát. polysorbate 40. 60, 65 a 80, ester mastné kyseliny a sacharózy, methyl celulóza a karboxymethylcclulóza. Tylo povrchově aktivní látky mohou být v přípravku 25 na bázi proteinu nebo derivátu přítomny samotné nebo ve formě směsí v různých poměrech.

Dalšími přídavnými látkami, které mohou podporovat absorpci proteinu (nebo derivátu), jako například mastné kyseliny, jako je kyselina olejová, kyselina I inolová a ky selina linolenová.

Může být žádoucí připravit formulace s řízeným uvolňováním. Léčivo lze začlenit do inertní matrice. která umožní uvolňování difúzí nebo prostřednictvím, mechanismu vyluhování (např. pryskyřice). Do formulace také mohou být začleněny pomalu degenerující matrice, například algináty a polysacharidy. Další formou řízeného uvolňování tohoto léčiva je způsob založený na terapeutickém systému Oros (Alza Corp.), kdy se léčivo uzavře v semipermcabilní membráně, která 35 vodě dovoluje vstoupit a osmoticky vytlačit léčivo jediným malým otvorem. Účinek odloženého uvolňování také mají některé enterické povlaky.

Pro formulaci je možno použít dalších obalů, jako jsou různé cukry, které je možno nanášet vdražovacím bubnu. Terapeutické činidlo lze také podávat v tabletách opatřených filmovým 40 povlakem. Látky, které se používají pro tento účel se dělí do dvou skupin. První skupinu představují neentcrické látky, jako jsou methylcelulóza, cthylcelulóza, hydroxycthylcelulóza, methylhydroxyethylcelulóza, hydroxypropylccluióza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymcthylcelulózy, providonc a polyethylenglykoly. Druhou skupinu tvoří enterické látky, kterými obvykle jsou estery kyseliny fialové.

Aby se získal optimální filmový povlak, je možno použít směsi látek. Filmové povlaky je možno nanášet v zařízení s bubnem nebo fluidním ložem nebo nalisováním.

Protein podle vynálezu (nebo jako deriváty) také lze podávat pulmonárně. Protein (nebo derivát) 50 se dodává do plic savce při inhalaci a epítelíální výstelkou plic prochází do krevního řečiště (další zprávy viz Adjci et al.. Pharmaceutical Research 7. 565 až 569, 1990; Adjei et aL; International Journal of Pharmaccutics 63, 135 až 144, 1990 (leuprolid acetát); Braquet et al., Journal ofCardiovascuiar Pharmacology 13 (suppl. 5). 143 až 146, 1989 (endothelin-l); Hubbard et al., Annals of lnternal Medicine 3, 206 až 212, 1989 (αΐ-antitrypsin); Smith et al.. J. CTm. lnvest. 84, 1145 55 až 1146, 1989 (a-1 proteasa); Oswcin cl al.. „Aerosolization of Protcins”. Proceedings ofSym

- 12 CZ 298203 B6 posium on Respirátory Drug Delivery 11. Keystone, Colorado, březen, 1990 (rekombinantní lidský růstový hormon); Debs et al., The Journal of Immunology i40, 3482 až 3488. 1988 (interferon-γ a faktor nekrózy nádorů a) Platz et al., patent US 5 284 656 (faktor stimulující kolonie granulocytú).

V praxi přichází v úvaha řada mechanických zařízení zkonstruovaných pro pulmonární dodávku léčiv, které jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy. Jako neomezující příklady takových zařízení je možno uvést rozmlžovače, inhalátory pro odměřenou dávku a inhalátory pro prášková léčiva.

Jako příklady konkrétních zařízení, která jsou v praxi dostupná, je možno uvést rozmlžovač Ultravent. výrobek firmy Mallinckrodt, lne., St. Louis, Missouri, USA; rozmlžovač Acorn II, výrobek firmy Marguest Mecidal Products, Englewood. Colorado. USA; inhalátor odměřené dávky Vcntolin. výrobek firmy Glaxo lne., Research Triangle Park, North Ca rol i na. USA; a inhalátor pro prášková léčiva Spinhaler, výrobek firmy Fisons Corp., Bedford, Massachusetts. USA.

Všechna tato zařízení vyžaduji použiti formulací vhodných pro dávkování proteinu (nebo jeho analogu nebo derivátu). Obvykle je každá formulace specifická vzhledem k typu použitého zařízení a může kromě použití ředidel, adjuvantů a/nebo nosičů užitečných při léčení zahrnovat použití vhodné hnací látky.

Protein (nebo derivát) by se pro nejůčinnější dodávku do distální části plic měl nejvýhodněji připravoval ve formě částic o průměrné velikosti menč než 10 μηι, nejvýhodněji v rozmezí od 0,5 do 5 pm.

Jako příklady nosičů lze uvést sacharidy, jako jc trchalóza, mannitol, xylitol, sacharóza, laktóza a sorbitol. Ve formulacích jc možno použít dalších přísad, jako DPPC. DOPE, DSPC a DOPC. Lze také použít přírodních nebo syntetických povrchově aktivních látek. Může se použít polyethylenglykolu (i kromě jeho použití při derivatizaci proteinu nebo analogu). Dále jsou použitelné dextrany. jako cyklodcxtran; soli žlučových kyselin a další příbuzné podpůrné látky a také celulóza a deriváty' celulózy. Je možno použít aminokyselin, jako je použití v pufrových formulacích.

Předpokládá se rovněž použití liposomů. mikrotobolek nebo mikrokuliček. inkluzních komplexů a dalších typů nosičů.

Formulace vhodné pro použití s rožnilžovačeni, proudovým nebo ultrazvukovým, budou obvykle obsahovat Fc-OB protein nebo jeho analogy nebo deriváty rozpouštěné ve vodě v koncentraci asi 0,1 až 25 mg biologicky aktivního proteinu na 1 ml roztoku. Formulace také mohou obsahovat pufr a jednoduchý cukr (například pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku). Rozmlžovací formulace rovněž mohou obsahovat povrchově aktivní látku, aby se snížila nebo vyloučila agregaci proteinu vyvolaná rozprašováním roztoku při tvorbě aerosolu.

Formulace podávané pomocí zařízení pro inhalaci odměřené dávky budou obvykle obsahovat jemně rozdělený prášek s obsahem proteinu (nebo derivátu), který jc pomocí povrchově aktivní látky suspendován v propelentu. Propelcntcm může být jakákoliv látka, které se obvykle používá pro tento účel, jako je například plně chlorfluorovaný uhlovodík, částečně chlorftuorovaný uhlovodík. částečně fluorovaný uhlovodík nebo uhlovodík jako trichlorfluormcthan, dichlordifluormethan, dichlortetrafluorethanol a 1,1,1,2-tctraíluorethan a jejich kombinace. Vhodnými povrchově aktivními látkami jsou například sorbitantrioleát a sójový lecitin. Jako povrchově aktivní látka může být užitečná také kyselina olejová.

Formulace pro dodávku za zařízení pro inhalaci prášků budou obsahovat jemně rozdělený prášek s obsahem proteinu (nebo derivátu) a popřípadě také činidlo zvyšující objem, jako laktózu, sorbi

- 13 CZ 298203 B6 tol, sacharózu, mannítol, trehalózu nebo xylitol. a to v množství, které usnadní dispergování prášku ze zařízení, například v množství 50 až 90 %. vztaženo na hmotnost formulace.

Protein (nebo analog nebo derivát) je také možno dodávat nazálně. Nazální dodávka umožňuje 5 proteinu přejít do krevního řečiště přímo poté, co léčivo bylo podáno do nosu, bez nezbytného ukládání produktu v plicích. Jako příklady formulací pro nazální dodávku je možno uvést formulace s dextranem nebo cyklodextranem. V úvahu také přichází dodávka přes jiné slizniční membrány.

Dávkování

Odborník v tomto oboru bude schopen zjistit účinné dávky z pozorování požadovaného terapeutického účinku po podání léčiva. N-terminální modifikace OB proteinu podle vynálezu ve srovnání s OB proteinem nebo jeho C terminální modifikací poskytuje proteinu neočekávanou ochra15 nu před degradací, prodlouženou dobu cirkulace a stabilitu. Odborníku v tomto oboru bude na základě těchto změn zřejmé, že účinná dávka muže být nižší nebo že lze snížit frekvenci podávání.

V přednostním provedení bude formulace taková, žc se při denní dávce asi 0,10 (ig/kg až asi

10 mg/kg dosáhne požadovaného terapeutického účinku. Účinné dávky lze stanovit v průběhu doby za použití diagnostických nástrojů. Tak se například nejprve stanoví endogenní hladina proteinu za použití diagnostiky pro měření množství OB proteinu nebo Fc-OB fúzního proteinu v krvi (nebo plazmě nebo síru). Takové diagnostické nástroje mohou mít podobu stanovení protilátky, například sendvičové stanovení protilátky. Nejprve se kvantifikuje množství endogen25 ní ho OB proteinu a stanoví se základní linie. Terapeutické dávky sc určí na základě toho, jak se vyvíjí množství endogenního a exogcnního OB proteinu nebo Fc-OB fúzního proteinu (tj. proteinu, analogu nebo derivátu zjištěného v organismu, který si organismus vyprodukoval nebo který by byl dodán) během léčení. Dávky se tedy během léčení mohou měnit tak. Že se nejprve používá relativně vysoké dávky, a to až do doby, kdy jc pozorován pozitivní terapeutický účinek, a pro 30 udržení pozitivních terapeutických účinků se používá nižších dávek.

V čistě teoretické situací, kdy je požadováno poulíc snížené hladiny lipidů v krvi, kdy je žádoucí udržení snížené hladiny lipidů v krvi nebo zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svaiovinou bez tuku bude dávka nedostatečná pro snížení hmotnosti. Během počátečního období léčení obézní osoby je tedy možno podávat dávky, při nich sc dosáhne snížení hmotnosti a současného snížení hladiny lipidů v krvi nebo současně snížení tukové tkáně/zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku. Jakmile se dosáhne dostatečného snížení hmotnosti, jc možno podávat dávku, která je dostatečná pro udržení požadované hladiny lipidů v krvi nebo zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku (nebo prevenci ztráty této tkáně). Tyto 40 dávky je možno stanovit empiricky, jelikož účinky OB nebo Fc-OB proteinu jsou reverzibilní (např. Campfield et al.. Science 269: 546 až 549, 1995, na straně 547). Jestliže je ledy pozorováno. že dávka vede ke snížení hmotnosti, které není žádoucí, lze podávat dávku nižší, při níž se dosáhne požadované hladiny lipidů v krvi nebo zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku, ale požadovaná hmotnost zůstane zachována.

Při zvyšování citlivosti jedince na inzulín je možno brát v úvahu podobné faktory ovlivňující dávkování. Bez úbytku hmotnosti lze dosáhnout takového zvýšení podílu tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku, které umožní snížit množství inzulínu (nebo potenciálně amylinu, thiazolidindionů nebo jiných možných léčiv pro léčení diabetes), jaké by sc jedinci podávalo pro 50 léčení diabetes.

Při zvyšování celkové síly lze brát opčt v úvahu podobné faktory' ovlivňující dávkování. Zvýšení podílu tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku spolu se současným zvýšením celkové síly jc možno dosáhnout s dávkami, které nejsou dostatečné pro ztrátu hmotnosti. Bez ztráty hmot- 14CZ 298203 B6 nosti lze rovněž dosáhnout dalších pozitivních výsledku, jako je zvýšení červených krvinek (a okysličování krve) a snížení resorpce kostí nebo osteoporózy.

Kombinace

Výše uvedených postupuje možno použít spolu s jinými léčivy, jako jsou léčiva užitečná pro léčení diabetes (například inzulín, potenciálně thioazolidindiony, amylin nebo jejich antagonisty). léky snižující cholesterol a krevní tlak (jako jsou léky snižující hladinu lipidů v krvi nebo jiná kardiovaskulární léčiva) a léky zvyšující aktivitu (například amfetaminy). Rovněž lze použít činilo del potlačujících chuť k jídlu (jako jsou látky ovlivňující hladinu serotoninu nebo neuropeptidu Y). Takové podávání může být simultánní nebo pošlou pne.

Kromě toho je těchto způsobů možno použít spolu s chirurgickými postupy, jako jsou kosmetické chirurgické výkony prováděné za účelem změny celkového vzhledu těla (například liposukce 15 nebo laserová chirurgie za účelem snížení tělesné hmotnosti). Současným použitím kompozic a způsobu podle vynálezu jc možno posílit pozitivní výsledky srdečních operací, jako jsou operace bypass, nebo jiných zákroků, které mají zmírnit stavy vyvolané blokádou cév tukovými úsadami, jakojc arteriální plál. Před léčením za použití kompozic nebo způsobů podle vynálezu, v průběhu takového léčení či po něm, je možno použít postupu eliminujících žlučové kameny, jako 20 jsou postupy využívající ultrazvuk nebo laser. Způsobů léčení podle vynálezu je dále možno použít jako podpůrné léčby při operacích nebo léčení zlomených kostí, poškozených svalů nebo jiných terapiích, u nichž by vlivem zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku došlo ke zlepšení.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Aplikace myšího Fe-OB proteinu ve formě subkutánních injekcí

Tento příklad demonstruje, že subkutánní injekce myšího Fc-OB proteinu vedou u normálních myší ke snížení hmotnosti. Normálním (neobézním) myším CD1 se subkutánními injekcemi po dobu 22 dní podává myší Fc-OB protein. Při denní dávce proteinu 10 mg/kg tělesné hmotnosti se 22. den podávání injekcí dosáhlo 14% (+/· 1.1 %) úbytku hmotnosti vzhledem k základní linii. 40 Podávání PBS vedlo 22. den injekčního podávání k 3.9% (+/- 3,3 %) úbytku hmotnosti vzhledem k základní linii. Podáváním Fc-OB proteinu obézním myším CD1 v denní dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti se 22. den dosáhlo 10% (+/- 4,3%) snížení hmotnosti vzhledem k základní linii a podávání PBS vedlo 22. den k 8,7 % (+/- 1,3 %) snížení hmotnosti vzhledem k základní linii.

Dále jsou uvedeny procentní odchylky od základní linie hmotnosti u myší CD1 (o stáří 8 týdnů):

Tabulka I

Úbytek hmotnosti při subkutánním injekčním podávání

1	—	Normální myši/	Obézní myši/
Čas	Vehikulum	rekombinantní	rekombinantní
(dny)	(PBS)	Fc-OB fúzní	Fc-OB fúzní
		protein 1	protein
1 až 2	-0,44 ± 1,1	-3,6 ± 0,41	-1,03 ± 1,36
2 až 4	-1,07 ± 0,13	-6,8 + 1,5	-2,7 x 1,1
5 až 6	-0,13 ± 1,1	-9,5 ± 1,2	-4,9 ± 0,95
7 až 8	-0,92 ± 0,29	-12,5 ± 1,6	-7,7 ± 2,9
9 až 1D	1,5 ± 1,3 1	-12,6 ± 1,9	-8,2 + 2,9
11 až 12	-1,98 + 1	-13,6 ± 1,96	-8,6 ± 2,9
13 až 14	-5,2 ± 1,3	-14,6 X 1,7	-10,1 +3,6
1 15 až 16	-8,6 ± 0,1 í	-14,5 ± 2	: -9,4 ±2,2
17 až 18	-8,5 ± 0,64	-16,1 ± 1,8	-9,6 ±2,99
19 az 20	-4,1 + 0,99	-16 ± 1,5	-10,4 ±3,3
21 až 22	-3,9 ± 3,3	-14,1 x 1,1	-10 ± 4,3

Jak je zřejmé, na konci 22dcnního režimu subkutánního podávání u zvířat, která obdržela Fc-OB protein, sc snížila hmotnost o 14,1 % (neobézní zvířata) a 10 % (obézní zvířata), na rozdíl od zvířat, která dostávala pouze vehikulum PBS a ve srovnání se základní linií.

U zvířat, kterým byl podán Fc-OB protein celých 22 dnů, se hmotnost překvapivě snížila po dobu až 28 dnů, ještě 4 dny po poslední injekci. U normálních (neobézních) myší CD1 subkutánní injekční podávání Fc-OB myšího proteinu v denní dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti, které bylo zastaveno 22. den, vedlo k úbytku hmotnosti 21 % vzhledem k základní linii zjištěné 28. den, oproti 14% úbytku zjištěnému 22. den. Podobně u obézních myší CDI subkutánní injekční podávání Fc-OB myšího proteinu v denní dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti, které bylo zastaveno 22. den, vedlo k úbytku hmotnosti 13 % vzhledem k základní linii zjištěné 28. den. oproti 10% úbytku zjištěnému 22. den. 34. den se úbytek hmotnosti u obézních myší obdržel na 10%, přičemž u myší s nízkým podílem tukové tkáně došlo k opětovnému nabytí hmotnosti, takže úbytek činil 5 %. Kontrola v každém systému v období od 22. do 34. dne v případě obézních myší vykázala 4% a v případě myší s nízkým podílem tukové tkáně 7% přírůstek.

Příklad 2

Aplikace lidského Fc OB proteinu ve Formě subkutánního injekčního podávání myším C57

Tento příklad demonstruje, že subkutánní injekce lidského Fc-OB proteinu vedou u normálních myší ke ztrátě hmotnosti. Normálním (neobézním) myším C57 byl po dobu 7 dnů subkutánními injekcemi podáván lidský Fc-OB protein. Denní dávka proteinu 10 mg/kg tělesné hmotnosti vedla 7. den injekčního podávání k 12% (± 1,3 %) úbytku vzhledem k základní linii. Denní dávka proteinu 1 mg/kg tělesné hmotnosti vedla 7. den injekčního podávání k 8,9% (± 1,5 %) úbytku vzhledem k základní linii. U obézních myší C57 denní dávka lidského OB proteinu 10 mg/kg

- 16CZ 298203 B6 tělesné hmotnosti vedla 7. den injekčního podávání k 1,1% (± 0.99 %) úbytku vzhledem k základní linii a denní dávka proteinu I mg/kg tělesné hmotnosti vedla 7. den injekčního podávání k 2,5 (± 1,1 %) úbytku vzhledem k základní linii.

Výsledky

Dále uvedené hodnoty představují procentní rozdíly od základní hmotnosti myší C57 (o stáří 8 týdnů):

Tabulka 2

Úbytek hmotnosti při subkutánním injekčním podávání

Čas (dny)	Vehikuluni (PBS)	Rekombinantní Fc-OB fúzní protein	Rekombinantní OB protein
1 až 2	0,258 ± 1,2	-6,4 ± 1,6	-2,1 ±0,91
3 až 4	2,2 ± 1,1	-12,1 ± 1,5	-0,78 ± 0,36
5 až 6	4,5 ±2	-11,5 ± 1,5	-1,7 ± 0,6
7 až 8	7,0 ±2,1	-11,9 ± 1,6	0,1 ±1,2
9 až 10	9,0 ±1,9	-11,5 ± 1,3	7,2 ± 2,7
11 až 12	IQ ± 3,8	-9 ± 1,4	10,9 ±2,9
13 až 14	12,5 ±4,4	-9,5 ± 1,6	12,3 ± 6,4
15 až 16	11,1 ± 1,0	-3,0 ± 1,5	10,3 ± 3,3
17 až 18	17,2 ±3,6	8,0 ± 1,3	13,3 ±3,4

Lze si povšimnout, že na konci 17. den po 7 dnech režimu s subkutánní denní dávkou 10 mg/kg tělesné hmotnosti, zvířata, kterým byl podáván Fc-OB protein, opětovně získala 8 % své tělesné hmotnosti. Zvířata, která dostávala denní dávku I mg/kg při sedmidenním režimu subkutánního podáváni, po 12 dnech znovu získala 6,4 % tělesné hmotnosti.

Tyto zkoušky také ukazují, že během období regenerace od 7. do 22. dne po poslední injekci, která byl podána 7. den, je návrat tělesné hmotnosti u myší C57 ošetřených Fc-OB pomalejší než u myší ošetřených OB proteinem. Z toho se dá usoudit, že Fc-OB protein není eliminován tak rychle jako OB protein, což prodlužuje účinek spočívající vc snižování hmotnosti.

Příklad 3

Závislost odpovědi na dávce u myší CF7 ošetřených Fc-OB fúzním proteinem

Další zkouška dokládá existenci závislosti odpovědi na dávce při nepřetržitém podávání Fc-OB fúzního proteinu. Při této zkoušce se obecním myším CF7 o hmotnosti 35 až 40 g podává rekombinantní lidský Fc-OB protein za použití metodologie popsané v předchozím příkladu. Výsledky zkoušky jsou uvedeny následující tabulce 3, kde úbytek tělesné hmotnosti (%) vzhledem k základní linii jc stanoven výše popsaným postupem:

- 17CZ 2982U3 B6

Tabulka 3

Dávka (mg/kg/den)	Čas	Úbytek tělesné hmotnosti (%)
0,25	den 5	4
0/5	den 5	12
1 i	den 5	16

Jc zřejmé, že zvýšení dávky z 0,25 mg/kg/den na I mg/kg/den vede ke zvýšení úbytku ze 4 % na 16 %. 16% snížení tělesné hmotnosti v den 5 při dávce 1 mg/kg/den jc rovněž pozoruhodné. Tyto zkoušky také svědčí o pomalém návratu hmotnosti na 0%. a je tedy možno usoudit, že Fc-OB protein není eliminován rychle, což je příčinou prodlouženého účinku spočívajícího ve snižováni hmotnosti.

Příklad 4

Farmakokinetické vlastnosti rekombinantního Fc-OB proteinu při zkoušce na myších CD-1 a psech

Tato zkouška demonstruje farmakokinetické vlastnosti rekombinantního lidského met Fc-OB proteinu u myší Cl) l a psů. Po intravenózním nebo subkulánním podávání v dávce 1 mg/kg/den se enzymově spřaženým imunochemickým stanovením na pevném povrchu (EL1SA) zjistí sérové koncentrace rekombinantního lidského met Fc-OB proteinu a lidského met OB proteinu.

U obou druhů byla pozorována zvýšená expozice, kvantifikovaná vyšším pikem sérových koncentrací a větší plochou pod křivkou koncentrace v séru (AUC), oproti rekombinantním mct-lidskému OB proteinu. Fc-OB má nižší systematickou clcaranci než rekombinantní met-lidský OB protein. To je patrné z nižší cl ca rance a delšího poločasu Fc-OB proteinu oproti OB proteinu. Větší velikost proteinu nevyvolává pouze zvýšení jeho stability, ale také snížení účinnosti renální clearance. Výsledkem je. že Fc-OB protein je ze systematického oběhu eliminován pomaleji. Zvýšení časového maxima, maxima sérové koncentrace a AUC pro Fc-OB protein jsou v souladu s nižší clcaranci. Fc OB protein poskytuje podstatně vyšší systematickou expozici než OB protein. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.

- 18CZ 298203 B6

Tabulka 4

Farmakokinetické vlastnosti.

Druh	Myši CD-1	MyŠi CD-1	Psi beagle
Způsob podávání	Intravenózní	Subkutánní	Subkutánní
	OB protein	Fc-OB protein	OB protein	Fc-OB protein	OB protein	Fc-OB protein
Dávkování (mg/kg) 1	1	1	1	1	0,5	0,5
1 Časové maximum (h)			0, 14	6	2,8	8
Maximum sérové koncentrace (ng/ml·)			1520	7550	300	1120
AUC (ng.h/ml)	1470	366 000	1230	132 000	2200	52 500
Poločas (h)	0,491	21,4	0,398		2,13	22,9
Clearance (ml/h/kg)	681	2,73

Příklad 5

Tento příklad demonstruje, žc u normálních myší, které nejsou obézní a nemají zvýšenou hladinu lipidů v krvi, podávání lidského rekombinantního Fc-OB proteinu vede ke snížení hladiny ίο cholesterolu, glukózy a triglyccridů. Tento příklad kromě toho demonstruje, že hladiny těchto látek zůstávají během třídenního regeneračního období nízké.

Normálním myším CD1 se subkutánními injekcemi podává rekombinantní lidský Fc-OB protein. 24 hodin po dni 23, což je den podání poslední injekce, se odeberou krevní vzorky, Jak je d i skulí továno výše, zvířata při podávaných dávkách ztratila na hmotnosti. Z tabulky 5 vyplývá, že u myší ve srovnání s kontrolou došlo k významném snížení sérového cholesterolu, glukózy' a triglyccridů, které je závislé na dávce.

- 19CZ 298203 B6

Tabulka 5

Dávka	Glukí	>za		i Chole 1	st	erol	Trig:	Lyceridy
PBS	232,6		15,1	67,8	+	3,6	52,6	+	3,7
1 mg/kg/den	225,8	±	29,1	54	-v	5,6	43	+	8,7
|~~ϊθ r.g/kg/den	193,2	+	21,4	53,4	i	5,7	38	+	11
1 mg/kg/každé 2	dny	242,0	+	9,3	52,6	±	4,4	40,8	+	7,2
10 mg/kg/každé	2 dny	197,4	i	27,9	51,4	4-	5,9	29,8	±	6,3
1 mg/kg/každé 3	dny	244,8	+	19,5	60,8	±	7,3	54	+	7,1
10 mg/kg/každé	3 dny	188	+	31,2	52,2	+	6,9	26,2	+	10,7

Tyto údaje dokládají. žc Fc-OB protein nebo jeho analogy nebo deriváty jsou činidly, která účinně snižují krevní lipidy.

Příklad 6

Obéznímu pacientu (člověku) se za účelem snížení hmotnosti podává lidský Fc-OB protein nebo analog nebo derivát. T ento obézní pacient má také zvýšenou hladinu lipidů v kiwi, jako je zvýšená hladina cholesterolu, nad 200 mg/100 ml. Pacient v průběhu léčení Fc-OB proteinem dosáhne uspokojivého snížení hmotnosti. Tomuto neobéznímu pacientu sc podává udržovací dávka FcOB proteinu nebo analogu nebo derivátu, aby sc udržela snížená hladina krevních lipidů, včetně snížené hladiny cholesterolu, pod 200 mg/100 ml. l ato podávaná dávka není natolik vysoká, aby vedla k dalšímu snižování hmotnosti. Podávání je dlouhodobé. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu. jak jc stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity. je-li použitelný).

Příklad 7

Pacientem jc ncobčzní člověk, který prodělal koronární operaci bypass nebo jiné invazivní ošetření za účelem zmírnění rozvinuté tvorby arteriálního plátu. Po operaci se pacientu podává udržovací dávka Fc OB proteinu nebo analogu nebo derivátu, aby se zabránilo opětovné tvorbě arteriál ní ho plátu. Podávaná dávka není tak vysoká, aby vedla ke ztrátě hmotnosti. Podávání je dlouhodobé. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu. jako je stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity; je-li použitelný).

Příklad 8

Pacientem je neobézní člověk, který trpí hypertenzí vyvolanou omezením krevního toku z ucpaných arterií. Tomuto pacientu sc podává 1’c OB protein nebo jeho analog nebo derivát v dávce, která je dostatečná pro redukci arteriálního plátu vedoucího k ucpání tepen. Poté sc u pacienta monitoruje další tvorba arteriálního plátu a hypertenze. Pokud opět dojde k tomuto stavu, pacientu se znovu podává Fc-OB protein, analog nebo derivát v množství dostatečném pro obnovení krevního toku, přičemž toto množství není natolik vysoké, aby vedlo ke snížení hmotnosti. I lladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti Fc-OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity , je-li použitelný).

-20CZ 298203 B6

Příklad 9

Pacientem je člověk se Žlučovými kameny. Žlučové kameny buď nebyly odstraněny, a je snaha vyhnout se tvorbě dalších kamenu, nebo odstraněny byly, avšak žlučník byl ponechán (jako v případě použití laserové nebo ultrazvukové chirurgie), a je snaha vyhnout se tvorbě dalších kamenu. Pacientu se podává Fc-OB protein nebo jeho analog nebo derivát v množství, které je účinné pro zabránění akumulaci dalších žlučových kamenů nebo opětovné akumulaci žlučových kamenů. Hladiny cirkulujícího Fe-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jak je stanovení protilátek proti Fc-OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity. je-li použitelný).

Příklad 10

Pacientem je diabetik, u něhož je snaha snížit dávky inzulínu při léčení diabetes. Pacientu sc podává Fc-OB protein nebo jeho analog nebo derivát v množství, které je účinné pro zvýšení hmoty tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující luk. Citlivost pacienta na inzulín se zvýší a dávka inzulínu nezbytná pro alevaci od symptomů diabetes se sníží. Toto snížení sc projeví buď jako snížení potřebných jednotek inzulínu nebo ve formě snížení potřebného počtu inzulínových injekcí za den. Hladiny cirkulujícího Fc-OB protein nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity, je-li použitelný).

Příklad 11

Pacientem je ncobézní člověk, který pro léčebné účely potřebuje zvýšit hmotu tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující tuk. jako je například rekonvalescence po prodělaném onemocnění, které tyto tkáně vyčerpává. Pacientu se podává Fc-OB protein nebo jeho analog nebo derivát v množství, které jc účinné pro požadované zvýšení hmoty tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující tuk. Zvýšení hmoty této tkáně lze monitorovat snímáním DEXA. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity, je-li použitelný).

Materiály a metody

Zvířata

Při zkouškách podle výše uvedených příkladů bylo použito myší CD1 divokého typu a myší (+/+) C57B16. Věk myší na počátku byl 8 týdnu a zvířata měla stabilizovanou hmotnost.

Krmení a měření hmotnosti

Myším bylo podáváno mleté krmivo pro hlodavce (PMI Feeds, lne.) v krmícím zařízení pro prášková krmivá (Allentown Caging and Equipmcnt), které umožňuje přesnější a citlivější odměřování. než jaké jc u kusového krmivá. Hmotnost se měří během požadovaného období každý den ve stejnou dobu (14,00). Tělesná hmotnost den před injekcí byla definována jako základní linie hmotnosti. Myši použité při zkoušce vážily 18 až 22 g.

. Ί

Chov

Myši se chovají po jedné za humánních podmínek.

Podávání proteinu nebo vehikula

Protein (popsaný dále) nebo vehikulum (fosfátem pufrovaný solný roztok, pH 7,4) sc podávají subkutánními injekcemi nebo intravenózné.

Kontrola

Kontrolní zvířata jsou zvířata, jimž bylo injekčně podáno samotné vehikulum, k němuž nebyl přidán ani Fc-OB fúzní protein ani OB protein.

Protein

V SEQ. ID. NO. 1, 2 a 3 je popsána myší rekombinantní OB DNA a protein (obr. 1) a v SEQ. ID: No: 4. 5 a 6 je popsán analog rekombinantní lidské OB DNA a protein (obr. 2). Jak již bylo uvedeno výše, rekombinantní lidský OB protein popsaný v SEQ ID. NO:6 má lys i nový zbytek v poloze 35 a izoleucinový zbytek v poloze 74. Jako ilustrativní příklady OB proteinu, kterého lze použít při tvorbě Fc-OB fúzního proteinu pro účely způsobu léčení a způsobu výroby léčiva podle vynálezu je dále možno uvést rekombinantní lidský protein uvedený v Zhang et al„ Nátuře, viz výše a PCT publikaci WO 96/05309 (12/22/96) (citace představující náhradu za přenesení celého obsahu citovaných publikací, včetně obrázku, do tohoto textu) a myší a lidsko analogy rckombinantních proteinů uvedené na obr. I a 2. Při tvorbě Fc-OB fúzního proteinu je také možno použít jiných OB nebo Fc proteinů nebo jejich analogu nebo derivátů.

První aminokyselinou sekvence aminokyselin pro rekombinantní OB protein, která je označena jako +1, a valin. a aminokyselinou, v poloze -1 je methionin. C-tcrminální aminokyselina má číslo 146 (cytein) (viz obr. 1 a 2). První aminokyselina sekvence pro rekombinantní lidský FcOB protein uvedené na obr. 3 jc označena jako +1 a jedná se o ky selinu glutamovou a aminokyselinou v poloze -1 je methionin. C-terminální aminokyselina má číslo 378 (cystein), první aminokyselina sekvence pro variantu rekombinantního lidského Fc-OB proteinu znázorněné na obr. 4 je označená jako I 1, a je jí kyselina glutamová. Aminokyselinou v poloze 1 je methionin. C terminální aminokyselina má číslo 378 (cystein). První aminokyselina sekvence pro variantu rekombinantního lidského Fc-OB proteinu znázorněné na obr. 5 je označen jako +1, a je jí kyselina asparagová. Aminokyselinou v poloze -1 jc methionin a C-tcrminální aminokyselina má číslo 373 (cystein). První aminokyselina sekvence pro variantu rekombinantního lidského Fc-OB proteinu znázorněného na obr. 6 je označena jako -H, a jc jí kyselina asparagová. Aminokyselinou v poloze -1 je methionin a C-terminální aminokyselina má číslo 373 (cystein).

Expresní vektor a hostitelský kmen

Použitým plazmidovým expresním vektorem je pAMG21 (přírůstkové číslo TCC 98113), který je derivátem pCFM1656 (přírůstkové číslo ATCC 69576) a obsahuje vhodná restrikční místa pro inzerci genů za (ve směru exprese) lux PR promotor (popis systému lux exprese viz patent US 5 169 318). Vytvoří se Fc-OB popsaná dále a znázorněná na obr. 3 až 6 a liguje se do expresního vektoru pAMG21 lincarizovaného restrikčními endonukleázami Ndel a BamHI a transformuje do hostitelského kmene E. coli ΓΜ5. Buňky E. coli FM5 byly odvozeny firmou Amgel lne.. Thousand Oaks, C'A, USA z kmene E. coli K-I2 (Bachmann, et al., Bactcrial. Rev. 40: 116 až 167, 1976) a obsahují integrovaný represorový gen fágu lambda, cl₈>₇ (Sussman et al„ C.R. Acad, Scio. 254: 1517 až 1579, 1962). Produkce vektoru, buněčná transformace a selekce kolonií se provádí za použití standardní metodologie (např. Sambrook et al..m Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Hostitelské buňky se pěstují v LB mediu.

- 22 CZ 298203 B6

Konstrukce Fc-OB DNA

Jako zdroj sekvence pro těžký řetězec lidského imunoglobulinu IgG-1 od aminokyseliny číslo 99 (Glu) do přirozeného karboxylového konce slouží plazmid pFC-A3 (popsaný dále). Sekvenci lidského IgG-1 jc možno získat z genové banky Gcncbank (PO 1857).

Lidská OB sekvence je popsána výše a také v publikaci Zhang et al.. Nátuře, viz výše a PCT WO 96/05309. které jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu, včetně obrázků, do tohoto textu. OB DNA se liguje do expresního vektoru pCFM1656 linearizovaného restrikčními endonuklcázami Xbal a BamHI za použití standardních postupů klonování (viz například Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Sping Harbor. NY, USA). Plazmid pCFM1656. který' nese OB DNA sekvenci slouží jako zdroj sekvence pro rekombinantní lidský OB gen.

Genetická fúze těchto dvou sekvencí se provádí prodloužením pře kry v u pomocí polymerázové řetězové reakce (Ho. S.N.. et al.. Sítě Directed Mutagenesis by Overlap Extension Using Thc Polymerase Chain Reaction, Gene 77: 51 až 59, 1989). Product PCR se štěpí restrikční endonukleázou Ndel, aby vznikl 5'—lepivý konec a restrikční endonukleázou BamHI, aby vznikl 3'lepivý konec. Podobné sc štěpí vektor pAMG21. Ligace se provádí za použití fúzního fragmentu a linearizovaného vektoru. Ligo váná DNA sc clcktroporujc do hostitelského kmene E. coli. Klony přežívající na kanamycinových (50 pg/ml) selekčních agarových miskách se prověří na expresi proteinu velikosti Fc OB. Izolují se plazmidy jednotlivých klonů a ověří se sekvence oblasti kódující gen.

V případě, že je žádoucí Fc-OB gen dále modifikovat, pro provedení změn sc použije opět PCR postupů. Za účelem získání variant SEQ. ID. NO: 12 a 15 byly Na N-konci Fc části fúzního proteinu (SEQ. ID. NO: 9) provedeny dvě sady změn, Další varianta byla zkonstruována zavedením čtyř aminokyselinových substitucí, aby se odstranilo vazebné místo Fc-receptor (leucin v poloze 15 sc nahradí kyselinou glutamovou) a vazebné místo komplementu (Clq) (kyselina glutamová v poloze 98 se nahradí alaninem, lysin v poloze 100 se nahradí alaninem a lysin v poloze 102 se nahradí alaninem) (viz Xin Xiao Zheng et aL, J. Immunol. 154: 5590 až 5600, 1995). Tcmplátem pro tento konstrukt je SEQ. ID. NO. 15 a výsledná varianta je SEQ. ID. NO: 18.

Konstrukce pFC- A3 vektoru

Plazmid pFc-A3, který obsahuje oblast kódující Fc oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu IgG-1 (viz Ellison, J. W. et al.. Nucleis Acids Res. 10: 4071 až 4079. 1982) od první aminokyseliny Glu-99 pantové domény do karboxylového konce plus fúzní místo 5'-Notl a místa 3'Sall a Xbal, se připraví PCR amplífikací knihovny cDNA lidské sleziny. PCR reakce byly provedeny v konečném objemu 100 ml a použilo se 2 jednotek Vent DNA polymerázy ve 20mM Tris-HCI (pH 8,8), lOmM chloridu draselném, lOmM síranu amonném, 2mM síranu horečnatém, 0.1% Triton X-100 a 400mM každého z dN 1 P a 1 ng cDNA knihovny, která se má amplifikovat, spolu s ΙμΜ každého primerů. Reakce se zahájí denaturací při 95 °C po dobu 2 minut, po níž následuje 30 cyklu zahřívání 30 sekund na 95 °C, 30 sekund na 55 °C a 2 minuty na 73 °C. 5'primer začlení místo Notl bezprostředně 5' k prvnímu zbytku (Glu-99) pantové domény IgG-1. 3'-primer zavede místa Sall a Xbal. 717bp PCR produkt se štěpí Notl a Sall a výsledný DNA fragment sc izoluje clektroforczou na 1% agarózovém gelu, purifikuje a klonuje do Notl vektoru pBluesript II KS štěpeného Sall (Stratagene). Inzert ve výsledním plazmidu, pFC-A3, se sekvenujc, aby se potvrdila přesnost PCR reakce.

-23 CZ 2982U3 B6

Způsoby produkce

Dále popsaných způsobů produkce se používá pro přípravu biologicky aktivního rekombinantního methionylovaného myšího nebo lidského analogu OB proteinu a Fc-OB fúzního proteinů. Podobných postupů lze použít pro přípravu biologicky aktivního methionylovaného lidského OB proteinu.

Fermentace

Použije se postupu jednorázové fermentace. Složení médií je uvedeno dále.

Dávka media, které obsahuje především zdroje dusíku se sterilizuje (zvýšením teploty na 120 až 123 °C po dobu 25 až 35 minut) ve fermentační nádobě. Po ochlazení se k médiu za aseptických podmínek přidají zdroje uhlíku, hořčíku, fosfátu a stopových kovů, Do fermentoru se přidá noční kultura (500 ml) bakterií produkujících výše uvedený rekombinantní myší protein (pěstovaná v živné půdě LB). Když sc optická hustota kultura (měřená při 600 um jako indikátor hustoty buněk) zvýší na 15 až 25 absorpčních jednotek, přidá sc autoindukční roztok (0,5 mg/ml homoscrinlaktonu) (1 ml/1), aby se indukovala exprese rekombinantního genu. Fermentační proces se nechá probíhat po dobu dalších 10 až 16 hodin a poté se půda sklidí centrifugací.

Složení média

Várka: 34 g/l kvasinkový extrakt g/l sójový pepton

0,9 g/l chlorid draselný

5,0 g/l hexaphos

1,7 g/l kyselina citrónová

120 g/l glycerol

0,5 g/l MgSO,.7H₂O

0,2 ml/1 roztok stopových kovů

0,5 ml/1 prolipěnové činidlo P2000

Roztok stopových kovů

Chlorid železitý (FeCl,. 6H₂O): 27 g/l

Chlorid zinečnatý (ZnCb.4H_;O)2 g/l

Chlorid kobaltnatý (CoCl₂.6FFO):2 g/l

Molybdenan sodný (NaMoO₄. 2ΗΌ):2 g/l

Chlorid vápenatý (CaCI₂.2H₂O):1 g/l

Síran měďnatý (CuSO₄.5H₂O) 1,9 g/l

Kyselina boritá (H-,B()Q 0,5 g/l

Chlorid manganatý (MnCI₂.4H₂O): 1.6 g/l

Dihydrát citranu sodného: 73,5 g/l

-24CZ 298203 136

Purifikace lidského Fc-OB fúzního proteinu

Purifikace lidského Fc-OB fúzního proteinu se provádí v dále uvedených stupních (pokud není 5 uvedeno jinak, provádějí se tyto stupně při teplotě 4 °C). Purifikace myšího a lidského OB proteinu je popsána v PCT publikace WO 96/05309. viz výše, kteráje zde citována náhradou za přenesení celého jejího obsahu do tohoto textu.

1. Buněčná pasta. Pasta z buněk E. coli se suspenduje v pětinásobném objemu destilované vody. Buňky vc vodě sc dále rozbíjí tak, že sc dvakrát nechají projít mikrofluidizérern. Rozbité buňky se centrífugují jednu hodinu při 4200 min'¹ v centrifuze Beckman JB-6 s rotorem J5-4.2.

2. Promytí inkluzního tělesa. Supernatant zvýše uvedeného stupně se odstraní a peleta se resuspenduje v pěti objemech destilované vody. Směs se centrifuguje za výše uvedených podmínek.

3. Solubilizacc. Peleta sc solubilizujc v 10 objemech 50mM tris, pH 8.5, 8M hvdrochloridu guanidinu, lOmM dithiothreitolu a míchá 1 hodinu při teplotě místnosti. K roztoku se přidá dihydroch lorid cystaminu (do 40mM koncentrace) a roztok se 1 hodinu míchá.

4. Roztok ze stupně 3 se přidá ke 20 až 30 objemům roztoku o následujícím složení: 50mM tris, pH 8,5. 0,8M arginin. 2M močovina a 4mM cystein. Směs se míchá 16 hodin při 8 °C\

5. Výměna pufru. Roztok ze stupně 4 se zkoncentruje a diafiItruje se 1 OmM tris, pí 1 8,5.

6. Vysrážení kyselinou. Hodnota pH roztoku ze stupně 5 se 50% ledovou kyselinou nastaví na 4,75. Výsledný roztok se inkubuje 30 minut při teplotě místnosti a poté přefiltruje.

7. Katexová chromatografie. Hodnota pil roztoku ze stupně 6 se nastaví na 7,0 a roztok se při

IO°C' umístí na sloupec CM Sepharose Fast Flow. Sloupcem se nechá projít gradient 0 až 0,1 M chlorid sodný v lOmM fosfátu o pH 7.0 (20 objemů sloupec).

8. Anexová chromatografie. Shromážděné CM frakce ze stupně 7 se pětinásobně zředí 5mM tris. pH 7,5 a při 10 °C umístí na sloupec Q Sepharose Past Flow. Gradient (20 objemů sloupce): lOmM tris. pH 7,5, 9 až 0,2M NaCl.

9. Hvdrofobní chromatografie. Ke shromážděným Q sepharosovým frakcím se přidá síran amonný do koncentrace 0,75M a roztok sc umístí na hydrofobní interakční sloupec methyl

Mecroprep při teplotě místnosti. Gradient (20 objemů sloupce): lOmM fosfát, ph 7,0, 0.75M až 0M síran amonný.

10. Výměna pufr. Shromážděné frakce ze stupně 9 se zkoncentrují, jak je to nutné a dialyzují proti pufru PBS

- 25 CZ 298203 B6

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Mann, Michael B. Hecht, Randy I.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: OB fúzní protein - kompozice a způsoby (iii) POČET SEKVENCÍ: 18 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A)	ADRESA:	Amgen lne.
ÍB)	ULICE:	1840 DeKavilland Drive
(C)	MĚSTO:	Thousand Oaks
(D)	STÁT:	Kalifornie
(E)	ZEMĚ:	Spojené státy americké
(F)	ZIP:	91320-1789

(v) POČÍTAČOVĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: pružný disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.30 (vi) ÚDAJE O PŘIHLÁŠCE:

(A) PŘIHLÁŠKA ČÍSLO: US 08/770,973 (B) DATUM PODÁNÍ: 20. prosinec 1996 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

(vii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Knight, Matthew W.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 36,846 (C) ZNAČKA SPISU: A’416 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 491 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak

-26CZ 298203 B6 (B) POZICE: 41 (D) JINÁ INFORMACE; Met je ATG (Xl) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 1:

TCTAGA7TTG	AGTTTTAACT	TTTAGAAGGA	C-GAATAACA7	ATGGTACCGA	TCCAGAAAGT	60
TCAGG ACGAC	ACCAAAACCT	TAATTAAAAC	C-ATCGTTACG	CGTATCAACG	ACATCAGTCA	12 0
CACCCAGTCG	GTCTCCGCTA	AACAGCGTGT	TACCGGTC7G	GACTTCATCC	CGGGTCTGCA	130
CCCGATCCTA	AC-CTTGTCCA	AAATGGACCA	GACCCTGGCT	G7A7ACCAGC	AGGTGTTAAC	240
CTCCCTGCCG	TCCCAGAACG	TTCTTCAGAT	CGCTAACGAC	CTCGAGAACC	TTCGCGACCT	300
GCTGCACCTG	CTGGCATTCT	CCAAA7CCTG	CTGCCTGCCG	CAGACCTCAG	gtcttcagaa	360
ACCGGAATCC	CTGGACGGGG	TCCTGGAAGG	ATCCCTGTAC	AGCACCGAAC-	TTGTTGCTCT	420
GTCCCGTCTC-	CA.GGGTTCCC	TTCAGGACAT	CCTTCAGCAG	C7GGACGT7T	CTCCGGAATG	480
TTAATGGATC						491

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA; 491 párů bází (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY; cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO:2:

AGATCTAAAC	TCAAAATTGA	AAATCTTCCT	CC7TATTGTA	TACCATGGCT	AGGTCTTTCA	60
AGTCCTGCTG	TGGTTTTGGA	ATTAATTTTG	CTAGCAATGC	GCATAGTTGC	TGTAGTCAGT	120
GTGGGTCAGC	CAGAGGCGAT	TTGTCGCACA	ATGGCCAGAC	CTGAAGTAGG	GCCCAGACGT	180
GGGCTAGGAT	7CGAACAGGT	TTTACCTGGT	CTGGGACCC-A	CATATGGTCG	TCCACAATTG	240
GAGGGACGGC	AGGGTCTTGC	AAGAAGTCTA	GCC-ATTGCTG	GAGCTCTTGG	AAGCGCTGGA	300
CGACGTGGAC	GACCGTAAGA	GGTTTAGGAC	GAGGGACGGC	gtctggagtc	CAGAAGTCTT	360
TGGCCTTAGG	GACCTGCCCC	AGGACCTTCG	TAGGGACATG	TCGTGGCTTC	AACAACGAGA	420
CAGGGCAGAC	GTCCCAAGGG	AAGTCCTGTA	GGAAGTCGTC	GACCTGCAAA	GAGGCCTTAC	480
AATTACCTAG	G					491

-27CZ 298203 B6 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 3:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) CD)	DÉLKA: 147 aminokyselin TYP: aminokyselina DRUH ŘETĚZCE: neznámý TOPOLOGIE: neznámá
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
íx)	ZNAK:
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: protein
	(B)	POZICE: 1
	(D)	JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná
		v poloze -1
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 3:

Met

Val

Pro

Zle

Glr. 5

Lys

val

Gin

Asp

Asp 10

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 1S

Lys

Thr

Ile

val

Thr

Arg

ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

20

25

30

Ala

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

35

40

45

Zle

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

ASO

Glr.

Thr

Leu

Ala

val

'T'* * v

Gin

Gin

50

55

60

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Gxn

Asn

Val

Leu

Gin

Σ 1 β

Ala

Asn

Asp

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Leu

Leu

Ala

?he

Sar

Lys

Ser

85

90

95

cys

Ser

Leu

Pro

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu

Gin

Lys

Pro

G1U

Ser

Leu

Asp

100

105

110

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

115

120

125

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Tle

Leu

Gin

Gin

Leu

Asp

Val

Ser

130

135

140

Pro Glu Cys

145

-28CZ 298203 B6

2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 4:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 454 bázových párů TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ; zvláštní znak (B) POZICE: 4 (D) JINÁ INFORMACE: Met je ATG (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 4:

CATATGGTAC	CGATCCAGAA	AG7TCAGGAC	GACACCAAAA	CCTTAATTAA	AACGATCGTT	60
ACGCGTATCA	ACGACA7CAG	TCACACCCAG	TCGGTGAGC7	C7AAACAGCG	TGTTACAGGC	120
CTGGACTTCA	TCCCGGGTCT	GCACCCGATC	CTGACCTTGT	CCAAAATGGA	CCAGACCCTG	180
GCTGTATACC	AGCAGATCTT	AACCTCCATG	CCGTCCCGTÁ	ACGT7C7TCA	GA7CTCTAAC	240
GACCTCGAGA	ACCTTCGCGA	CCTGCTGCAC	GTGCTGGCA7	TCTCCAAATC	C7GCCACCTG	300
CCATGGGCTT	CAGGTCTTGA	GACTCTGGAC	7CTC7GGGCG	GGGTCCTGGA	AGCATCCGGT	360
TACAGCACCG	AAGTTGTTGC	TCTGTCCCG7	CTGCAGGGT7	CCCTTCAGGA	CA7GCTTTGG	420
CAGCTGGACC	TGTCTCCGGG	77GT7AA7GG	ATCC			454

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO; 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 454 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 5:

GTATACCATG GCTAGGTCTT TCAAGTCCTG CTGTGGTTT? GGAATTAATT TTGCTAGCAA 60

TGCGCATAGT TGCTGTAGTC AGTGTGGGTC AGCCACTCGA GATTTGTCGC ACAATGTCCG 120

- 29 CZ 298203 B6

GACCTGAAG7		CC-TGC-GCTAG	GACTGGAACA	GGTTTTACCT	GG7CTGGGAC	180
CGACATATGG	- v- L· ; v -	T7GGAGGTAC	GGCAGGGCAT	TGCAAGAAGT	CTAGAGA7TG	240
CTGGAGCTC?	TGGP—AGCGCT	GGACGACGTG	CACGACCGTA	AGAGGTTTAG	GACGG7GGAC	300
GGTACCCGAA	GTCCAGAACT	C7C-AGACCTG	AGAC-ACCCGC	CCCAGGACCT	TCGTAGGCCA	360
ATGTCGTGGC	77CAACAAGG	AGACAGGGCA	GACG7CCCAA	GGGAÁGTCCT	GTACGAAACC	420
GTCGACCTGG	ACAGAGGCCC	AACAATTACC	TAGG			454

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO; 6:

( i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 147 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE·, neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) jmÉNO/klÍČ: protein (B) POZICE: 1 (D) JINÁ INFORMACE: Met (ATG ) začíná poloze -1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 6:

Met

Val

Pro

Ile

Gin 5

tys

Val

Gin

ASp

Asp 10

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 15

Lys

Tnr

Ile

val

Thr

Arg

Σ

Asn

Λ A nap

ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

2 0

25

30

Ser

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

35

40

45

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

50

55

60

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

ser

Arg

Asn

val

Leu

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

85

90

95

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

100

105

no

-30CZ 298203 B6

Gly Val Lee Glu Ala

115

Ar? Leu Gin Gly Ser

130

Pro Gly Cys

145

Ser Gly Tyr Ser Thr

120

Leu Gin Asp xet Leu

135

C-lu Val Val _A1 = Leu Se¹·

125

Τ'-p Gin Leu Asn Leu $ = >140

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 7: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) ÍD)	DÉLKA: 1150 bázových párů TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH	MOLEKULY: cDNA
(ix) ZNAK:
(A)	jměno/KLÍČ: zvláštní znak
(B)	POZICE: 4
(D)	JINÁ INFORMACE: Met je ATG
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 7:

CATATGG.AAC	CCAAATCTTG	TGACAAAACT	CACACATCCC	CACCGTGCCC	AGCACCTGAA	60
CTCCTGGGGG	GACCGTCAG?	CTGCCTCTTC	CCCCCAAAAC	CCAAGGACAC	CCTCATGATC	120
TCCCGGACCC	CTGAGGTCAC	ATC-CGTGGTG	GTGGACGTGA	GCCACGAAGA	CCCTGAGGTC	180
AAGTTCAACT	GGTACGTGGA	CGGCG7GC-AG	GTGCATAATG	CCAAGACAAA	GCCGCGC-GAG	24 0
GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCGTGTGGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCCTGCA	CCAGGACTGG	300
CTG.WGGCA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCCTCCCAGC	CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CC7GCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AGCTGACCAA	GAACCAGGTC	AGCCTGACCT	GCCtGGTCAA	AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCGCCGTGGA	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CGGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC	TTCTTCCÍCT	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGC-	GAACGTCTTC	TCATGCTCCG	tgatgcatga	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAAGAG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720

CAGGACGACA	CCAAAACCTT	AATTAAAACG	ATCG77ACGC	GTATCAACGř.	CA7CACTCAC	780
ACCCAG7CGG	γη .- * z* r* * * 1 <-1 zvn.	ACAGAAAG7T	A C A GG CCTGG	AC7TCATCCC	GGGTCTGCAC	84Q
CCGATCCTGA	CCCTGTCCAA	AATGGACCAG	ACCCTGGCTG	7ATACCAGCA	GATCTTAACC	900
TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGA7C	TC7AACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCCTQC	CACC7GCCAT	GGGC7TCAGG	. ., - * Unc-nt i	1020
CtGgactctc	TG3GCGGGGT	CC7GGAAGCA	TCCGGT7ACA	GCACCGAAG7	7G7TGCTC7G	1080
TCCCGTCTGC	AGGG7TCCCT	TC ACC-ACATG	C7TTGGCAGC	TGGACCTGTC	7CCGGGT7GT	1140

TAATC-G.ATCC 1150

2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 8:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 1150 bázových párů TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 8:

GTATACCT7G	GGTTTAGAAC	ACTGTTTTGA	GTljTuTACGG	C í GG<-ACGGG	TCC-TGGACTT	60
GAGGACCCCC	C7GGCAGTCA	CAA G G AG ΑΆ G	GGGGGTTTTG	GG7TCCTGTG	GGAG7.AC7AG	120
AGGGCCTGC-G	GACTCCAGTG	7ACGCACCAC	CACCTGCACT	CcG i GC.iC_	GC-GAC7CCAG	1SC
TTCAAGTTCA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC	CACGTATTAC	GGTTCTGTT7	CGGCGCCCTC	240
C7CGTCATGT	TGTCGTGCAT	GCCACACCAG	TCGCAGC-AGT	GGCAGGACGT	C-G7CCTGACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGTTC-TTTC	GGGAGGGTCG	GGGGTAGCTC	360
TTTTGGTAGA	GG7TTCGGTT	TGCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGC-GCCCTAC	TcGACTGGTT	CTTGGTCCAG	tcggactgga	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGC-TCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGT7CTGG	540
TGCGGAGGGC	ACC-ACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCG7CCC	C T TG C AG AAC	AGTACGAGGC	ACTACGTACT	CCC-AGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTCTC	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGCTA	GGTC7TTCAA	720

GTCCTGCTGT	GGTTTTGGAA	TTAATTTTGC	TAGCAATGCG	CA7AGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
TGGGTCAGCC	AC7CGAGATT	TGTCT^TCAJi	TGTCCGGACC	TGAAGTAGGG	CCCAGACGTG	840
GGCTAGGAC?	GGAACAGGTT	TTACCTGGTC	TGGGACCGAC	A7ATGGTCGT	CTAGAAT7GG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCA	ATAC-GTQTAG	AGAT7GCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960
GACGTGCACG	ACCGTAAGAC-	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGGCTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCC7GTAC	GAAACCGTCG	acctggacag	AGGCCCAACA	1140
ATTACCTAGG						1150

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 379 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) POZICE: 1 (D) JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná v poloze -1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 9:

Met 1

Glu

Pro

Lys

.Ser 5

Cys

Asp

Lys

Tnr

His 10

*' '*

Cys

Pro

Pro

Cys 15

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

20

25

30

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

50

55

60

Val

Asp

Gly

val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

65

70

75

80

Gin

Tvr

As n

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

85

90

95

Gin

Asp

Trc

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tvr

Lys

Cys

Lys

val

Ser

Asn

Lys

100

105

110

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

115

120

125

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

CT r·

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Lys

Asn

C-ln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tvr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

165

170

175

Tyr

Lys

Th ”

Thr

Pro

Pro

val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

?r e

Leu

180

185

190

Tyr

Ser

tys

Leu

TV

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

19 5

200

205

Phe

Ser

cys

Ser

Val

Mg r

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Asp

Thr

Lys

'—íL- v-

Leu

Zle

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

245

250

255

Ile

Ser

His

Thr

‘ n UJ - t.

Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

2 o j

265

270

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Ala

val

Tyr

Gin

Gin

Ile

Leu

Thr

ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

pro

Trp

Ala

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

rte:: Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys

370 375 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO; 10:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 1150 bázových páru TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
ií)	DRUH	MOLEKULY: CDNA

(ix) ZNAK:

(A) JMENO/KLÍČ: zvláštní znak (B) POZICE: 4 (D) JINÁ INFORMACE: Met je ATG (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 10:

CATATGGAAO	CAAAATCTGC	7GACAAAAC7	CACACATGTC	CACCTTGTCC	AGCTCCGGAA	60
CTCCTGGGGG	GTCCTTCAG?	CT7CCTCTTC	CCCCCAAAAC	CCAAGGACAC	CGTCATGATC	120
TCCCGGACCC	CTGaggtcac	A?GCGGGTG	GTGGACGTC-A	GCCACGAAGA	CCCTGAGGTC	180
AAG7TCAACT	1 iJUrt	CC-CCGTGC-AG	C-TGCATAATG	CCAAGACAAA	GCCGCGGGAG	240
GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCG7GTCGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCCTGCA	CCAGGACTGG	300
CTGAATGC-CA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCCTCCCAGC	CCCCA7CGAG	360
AAAACCATC?	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AGCTGACCAA	GAACCAGG7C	AGCCTGACCT	CCCTGGTCAA	AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	7CGCCGTGGÁ	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CCGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	cgacggctcc	^CTTCCTC?	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGG	GAACGTC7TC	TCATGCTCCG	TGATGCATGA	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	C G C AG.AAG AG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720
CAGGACGACA	CCAAAACCTT	aattaaaacg	ATCGTTACGC	GTATCAACGA	CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAAAGTT	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGOAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AATC-GACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	GATCTTAACC	900

- 35 CZ 298203 B6

TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGATC	TCT?ACCACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACG7GC	TGGCA7TCTC	CAAATCCTGC	CACCTGCCAT	GGGCTTCAGG	TCT7GAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTC-GAAGCA	TCCGG7TACA	GCACCGAAGl	TGTTGCGCtg	1080
TCCCGÍCTGC	AGGGTTCCCT	TCAGGACA7G	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTG	TCCGGG7TGT	1140

TAATGGATCC

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 11:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 1150 bázových párů TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 11:

GTATACCTTG	GTTTTAGACG	ACTGTT7TGA	GTGTGTACAG	GTGGAACAGG	TCGAGGCCTT	60
C-AGGACCCCC	CAGGAAGTCA	GAAGGAGAAG	C-GGGGTTTTG	GGTTCCTGTG	GGAG7ACTAG	120
AGGG<-C7<;<jG	GAC7CCAG7C-	TACGCACCAC	CACCTGCACT	CGGTGCTTCT	GGGACTCCAG	180
TTCAAGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC	CACGTATTAC	GGTTC7GTTT	CGGCGCCCTC	240
C7CG7CATGT	TGTCGILCAT	GGC.-.CACCAG	TCGCAGGAGT	GGCAGGACGT	GGTCC7GACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGT7GTTTC	GGGAGGGTCG	GGGG7AGCTC	360
TTTTGGTA.GA	GGTTTCGGT?	TCCCGTCC-GG	GCTCTTGGTG	7CCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCAG	TCGGACTGGA	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGGTCGCTC-T	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCv^G agggc	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCGTCCC	CTTGCAGAAG	AGTACGAGGC	ACTACGTAC?	CGGAGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTCTC	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGC7A	GGTCTTTCAA	720
GTCCTGCTGT	GGTTTTGC-AA	TTAATTTTGC	TAGCAATGCG	CATAGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
'iGGGTCAGCC	ACTCGAGATT	TGTCTTTCAA	TC-TCCGGACC	TGAAGTAGGG	CCCAGACGTG	840

- 36 CZ 298203 B6

C-GCTAGGACT	GC-AACAGGT7	T7ACCTGGTC	TGGGACCGAC	ATA7GG7CGT	CTAGAA7TGG	900
AGGTACGGCA	gggcattgca	ATAGGTCTAC-	AGAT7GCTGG	AC-CTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960
GACGTGCACG	accgtaagag	GT7TAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	1020
GACCTGAGAG	acccgcccca	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGGCTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	tcccaaggga	AGTCCTG7AC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	AGGCCCAACA	1140
ATTACCTAGG						1150

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO; 12:
(i)	i CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 379 aminokyselin typ i aminokyselina DRUH ŘETĚZCE; neznámý TOPOLOGIE: ne z námá
(li)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAK.
	(A)	JMÉno/klÍČ; protein
	(B)	POZICE: 1
	ÍD)	JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná v poloze -1

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 12:

Met

Glu

Pro

tys Ser Ala

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cvs

Pro

Pro Cys

Pro

1

5

10

15

Ala

Pro

Glu

Leu Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Pne

Leu

Phe

Pro Pro

Lys

20

25

30

Pro

tys

Asp

Thr Leu Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr Cys

Val

35

40

45

Val

Val

Asp

val Ser His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn Trp

Tyr

50

55

60

Val

Asp

Gly

Val Glu Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg Glu

Glu

65

70

75

Θ0

Gin

Tyr

Asn

Ser Thr Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val Lsu

His

85

90

95

Gin

Asp

Trp

Leu Asr. Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cvs

Lys

Val

Ser Asn

Lys

100 105 HO

-37CZ 2982U3 B6

Ala Leu

Pro Ala 115

Pro

Ile

Glu

uVS 120

Thr le

Ser Lys

Ala 125

Lys

Gly Gin

Pro

Arg

C-lu

Prc

Glr.

Val

Tyr

Thr

Leu Pro

Pro

Cty

Arg

Asp

Glu

Leu

130

13 5

140

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser Asn

Gly

C-ln

Pro

Glu

Asn

Asn

165

170

175

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp Ser

Asp

Gly

ser

Phe

Phe

Leu

180

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser Arg

Tro

C-ln

Gin

Gly

Asn

val

195

200

205

Phe

Ser

Cys

Ser

V a 1

Met

His

Glu

Ala Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

210

Λ - i*

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

245

250

255

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Ser Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

250

2t5

270

Asp

Phe

Ile

Pro

ciy

Leu

His

Pro

Ile Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

le Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys His

Leu

Pro

Trp

Ala

ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

C-ly

Gly Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

Met

Leu

Trp

C-lr.

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro Gly

Cys

370

375

-38CZ 298203 B6

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 13:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) ÍB) (c) ÍD)	DÉLKA: 1135 bázových párů TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
(li)	DRUH	MOLEKULY: CDNA

ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak
	(B)	POZICE: 4
	(D)	JINÁ INFORMACE; Met je ATG

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 13:

CATATGGACA	AAACTCACAC	ATGTCCACC7	TGTCCAGCTC	CGGAACTCCT	GGGGGGTCCT	60
TCAGTCTTCC	TCT7CCCCCC	AAAACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	120
GTCACATGCG	TGG7GGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	tGgaggtgca	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAA	TGGCAAGGAG	300
TACAAGTGCA	AGG7C7CCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	7CGAGAAAAC	CATCTCCAAA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGtjAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTC-	540
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCG7GATG	CATGAGGCTC	TGCACAACCA	CTACACGCAC-	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGCGTATC	AACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	780
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTGGACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGAT	CCTGACCTTG	840
TCCAAAATGG	ACCAGACCCT	C-GCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	aaccttcgcg	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	GCCATGGGCT	TCAGGTCTTG	AGACTCTGGA	CTCTCTGGGC	1020

-39CZ 298203 B6

GGGC-TCCTGG AAGCATCCGG T7ACAGCACC GAAGTTG7TG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT

TCCCTTCAGG ACATGZT7TG C-CAGCTGGAC CCGTCTCCC-G GTTGTTAATG GATCC

1080

1135 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1135 bázových párů (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE; lineární (i i) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 14:

GTATACCTGT	TTTGAGTGTG	TACAGGTGGA	ACAGGTCGAG	GCCTTGAGGA	CCCCCCAGGA	60
AGTCAGAAGG	AGAAGGGGGG	TTTTGGGTTC	CTGTGGGAGT	ACTAGAGGGC	CTGGGGACTC	120
CAGTGTACGC	ACCACCACCT	GCACTCGGTG	CTTCTGGGAC	TCCAGTTCAA	GTTGACCATG	180
CACCTGCCGC	ACCTCCACGT	ATTACGGTTC	TGTTTCGGCG	CCCTCCTCGT	CATGTTGTCG	240
TGCATGGCAC	ACCAGTCGCA	GGAGTGGCAG	GACGTGGTCC	TGACCGACTT	ACCGTTCCTC	300
ATGTTCACGT	TCCAuAGGTT	GTTTCGGGAG	GGTCGGGGGT	AGCTCT7TTG	GTAGAGGTTT	360
CGGTTTCCCG	TCGGGGCTCT	TGGTGTCCAC	ATGTGGC-ACG	GGGGTAGGGC	CCTACTCGAC	420
TGGTTCTTGG	TCCAGTCGGA	CTGGACGGAC	CAGTTTCCGA	AGATAGGGTC	GCTGTAGCGG	480
CACCTCACCC	TCTCGTJACC	CGTCGGCCTC	TTGTTGATGT	TCTGGTGCGG	AGGGCACGAC	540
CTGAGGCTGC	CGAGGAAGAA	GGAGATGTCG	TTCGAGTGGC	ACCTGTTCTC	GTCCACCGTC	600
GTCCCCTTGC	AGAAGAGTAC	GAGGCACTAC	GTACTCCGAG	ACGTGTTGGT	GATGTGCGTC	660
TTCTCGGAGA	GGGACAGAGG	CCCATTTCAT	GGCTAGGTCT	TTCAAGTCCT	GCTGTGGTTT	720
TGGaattaat	TTTGCTAGCA	atgcgcatag	TTGCTGTAGT	CAGTGTGGGT	CAGCCACTCG	780
AGATTTGTCT	TTCAATGTCC	GGACCTGAAG	TAGGGCCCAG	ACGTGGGCTA	GGACTC-GAAC	840
AGGTTTTACC	TGGTCTGGGA	CCGACATATG	GTCGTCTAGA	ATTGGAGGTA	CGGCAGGGCA	900
TTGCAATAGG	TCTÁGAGATC	GCTGGAGCTC	TTGGAAGCGC	TGGACGACGT	GCACGACCGT	960
AAGAGGTTTA	GGACGGTGGA	CGGTACCCGA	AGTCCAGAAC	TCTGAGACCT	GAGAGACCCG	1020
CCCCAGGACC	TTCGTAGGCC	AATGTCGTGG	CTTCAACAAC	GAGACAGC-GC	AGACGTCCCA	1080

-40C7. 29N20J B6

AtGGr“G”CC TGTACGAAAC CGTCGACCTG G.-.CAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG

1135

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A)	DÉLKA: 374 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: neznámý
(D)	TOPOLOGIE: neznámá

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) POZICE: 1 (D) JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná v poloze -1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 15:

Met 1

Lys

Thr

.4 i s

Τ' π r

Cys

Pro

Pro

Cys 10

Pro

A i Cl

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

LV5

Asp

Thr

Leu

20

25

30

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Va 1

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

His

Glu

Asp

Pro

Giu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

Val

His

A S Γι

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

C-lu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

7 5

80

Tyr

Are;

Val

val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

95

90

95

m T,

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Ile

Glu

Lys

Thr

ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

GlU

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

13 0

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Tle

Ala

Val

145

150

155

160

-41 CZ 298203 B6

G1U

Trp

Glu

Ser

Asn 165

Gly Gin

Pro

Glu

Asn 170

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 175

Pro

Pro

val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

80

185

190

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

225

230

235

240

Leu

Tle

Lys

Tor

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

245

250

255

Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

25 0

265

270

Leu

His

Pro

Tle

Leu

T‘nr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

275

280

285

Tyr

Gin

Gin

Ile

Len

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

T ÍJfi

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

c-iy

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

355

360

365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys

370 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1135 bázových páru (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

-42 CZ 298203 B6

ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak
	(B)	POZICE: 4
	(D)	JINÁ INFORMACE: Met je ATG

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO; 16:

CATATGGACA	AAACTCACAC	A7GCCCACCG	TGCCCAGCTC	CGGAACTCGA	AGGTGG7CCG	60
7CAGTCTTCC	TCTTCCCCCC	AAAACCCAAG	GAGACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTG-AG	120
GTCACATGCG	TGGTGGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGT7	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	Γ'-Γ'Γ* Τι 1 LjxjAkJU χ vYfía	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAA	tggcaaagct	300
TACGCATGCC-	CGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	7CGAGAAAAC	CATC7CCAAA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGGT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTG	540
GACTCCGAGG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	C7CCGTGATG	CATGAGGCTC	7GCACAACCA	CTACACGCAG	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGGGTATC	AACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	730
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTGGACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGAT	CCTGACCTTC-	840
TCCAAAATGG	ACCAGACCC.	GGCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	aaccttcgcg	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	C-CCATGGGCT	TCAGGTCTTG	AGACTCTGGA	CTCTCTGGGC	1020
ggggtcctgg	AAGCATCCGG	TTAGAGCACC	gaagttgttg	CTCTGTCCCG	TCTGCAGGGT	1080
TCCC7TCAGG	ACATGCTTTG	GCAGCTGGAG	CTGTCTCCGG	GTTGTTAATG	GATCC	1135

- 43 CZ 298203 B6 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO; 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1135 bázových párů (B) TYP; nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE; dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 17:

GTATACC7GT	T7TGAGTGTG	TACGGGTGGC	ACGGGTCGAG	GCCTTGAGCT	TCCACCAGGC	60
AGTCAGAAGG	AGAAGGGC-GG	TTTTGC-GT7C	CTGTGC-GAGT	ACTAGAGGGC	C7GGGC-ACTC	120
CAGTGTACGC	ACCACCACCT	GCACTCGGTG	CTTCTGGGAC	TCCAGTTCAA	GTTGACCATG	180
CACCTGCCGC	ACCTCCACGT	ATTACGCTTC	TGTTTCGGCG	CCCTCCTCGT	CATGTTGTCG	240
TGCATGGCAC	ACCAGTCGCA	GGAGTGGCAG	GACGTGGTCC	TGACCGACTT	ACCGTTGCGA	300
ATGCGTACGC	GCCAGAGGTT	GTTTCGGGAG	GGTCGGGGGT	AGCTCTTTTC-	GTAGAGGTTT	360
CGGTTTCCCG	TCGGGGCTCT	TGGTGTCCAC	ATGTGGGACG	GGGGTAGGGC	CCTACTCGAC	420
TGGTTCTTGG	TCCAGTCGGA	CTGGACGGAC	CAGTTTCCGA	AGATAGGGTC	GCTGTAGCGG	480
CACCTCACCC	TCTCGTTACC	CGTCGGCCTC	TTGTTGATGT	TCTGGTGCGG	AGGGCACGAC	540
CTGAGGCTGC	CGAGGAAGAA	GGAGATGTCG	TTCGAGTGGC	ACCTGTTCTC	GTCCACCGTC	600
GTCCCCTTGC	AGAAGAGTAC	GAGGCAC.AC	C-TACTCCC-AG	ACGTC-TTGGT	GATGTGCGTC	660
TTCTCGGAGA	GGGACAGAGG	CCCATTTCAT	GGCTAGGTCT	TTCAAGTCCT	GCTGTGGTTT	720
TGGAATTAAT	TTTGCTAGCA	ATGCGCATAG	TTGCTGTAGT	CAGTGTGGGT	CAGCCACTCG	780
AGATTTGTCT	TTCAATGTCC	GGACCTGAAG	TAGGGCCCAG	ACGTGGGCTA	GGACTGGAAC	840
AGGTTTTACC	TGGTCTGGGA	CCGACATATG	GTCGTCTAGA	ATTGGAGGTA	CGGCAGGGCA	900
TTGCAATAGG	TCTAGAGATT	GCTGGAGCTC	TTGGAAGCGC	TGGACGACGT	GCACGACCGT	960
AAGAGGTTTA	GGACGGTGC-A	CGGTACCCGA	AGTCCAGAAC	TCTGAGACCT	GAGAGACCCG	1020
CCCCAGGACC	TTCGTAGGCC	AATGTCGTGG	CTTCAACAAC	GAGACAGGGC	AGACGTCCCA	1080
AGGGAAGTCC	TGTACGAAAC	CGTCGACC7G	GACAGAGGCC	CAACAATTAC	CTAGG	1135

-44CZ 298203 B6 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 374 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK;

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) POZICE: 1 (D) JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná v poloze -1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 18:

Met Asp

Lys

Thr Hi s

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Glu

1

5

10

15

Gly Gly

Pro

Ser Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

20

25

30

Met Ile

Ser

Arg Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

His Glu

Asp

Pro Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

Val His

Asn

Ala Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

Tyr Arg

Val

Val Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

65

90

95

Gly Lys

Ala

Tyr Ala

Cys

Ala

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Ile Glu

Lys

Thr Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val Tyr

Thr

Leu Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Ser Leu

Thr

Cys Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

145

150

155

160

Glu Trp

Glu

Ser Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

165

170

175

-45CZ 298203 B6

Pro Val

Leu

Asp 180

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 185

Phe

Leu Tyr

Ser

Lys 190

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Glr.

Gly

Asn

Val

Phe

ser

cys

Ser

Val

195

2G0

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

A.sn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

225

230

235

240

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

Hifi

Thr

Gin

245

250

255

Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

260

265

270

Leu

His

Pro

ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

275

280

285

Tyr

Gin

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

ser

Thr

Glu

Val

Val

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

355

360

365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys

379

-46CZ 298203 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (15)

1. Protein obecného vzorce R|-R_? nebo R]-L-R₂, kde R, představuje Fc část imunoglobulinu: L představuje linkcr; a R₂ představuje OB protein zvolený ze souboru sestávajícího z (a) sekvence aminokyselin 1 až 146 uvedené v SEQ ID. NO: 3 nebo SEQ. ID. NO. 6:

(b) sekvence aminokyselin 1 až 146 uvedené v SEQ. ID. NO: 6 s lysinovým zbytkem v poloze 35 a izolcucinovým zbytkem v poloze 74:

(c) aminokyselinové sekvence podle odstavce (b) s různou aminokyselinou nahrazenou v jedné nebo větším počtu následujících poloh (číslováno podle SEQ. ID. NO: 6): 4, 8,32, 33, 35.

50. 53, 60, 64, 66, 67. 68.'71, 74, 77. 78, 89, 97, 100, 102, 105. 106, 107, 108. 111, 112, 118, 136, 138, 142 a 145;

(d) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b) nebo (c), v níže popřípadě chybí glutaminylový zbytek v poloze 28;

(e) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b), (c) nebo (d) s methionylovým zbytkem na N-konci:

(f) zkráceného analogu OB proteinu zvoleného zc souboru sestávajícího z (počítáno podle SEQ. IN. NO: 6 sc zbytkem lysinu v poloze 35 a zbytkem izoleucinu v poloze 74):

(i) aminokyselin 98 až 146 (ii) aminokyselin 1 až 32 (iii) aminokyselin 40 až i 16 (iv) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 (v) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 s jednou nebo větším počtem aminokyselin 100 až 111 umístěným mezi aminokyseliny 99 až 112: a (vi) zkráceného OB analogu podle odstavce (f) (i), v němž je jedna nebo větší počet aminokyselin 100, 102. 105J06. 107, 108, 1 1 I, 112, 118, 136. Ί 38. 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

(vii) zkráceného analogu podle odstavce (f) (ii). v němž jc jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8 a 32 nahrazen jinou aminoky selinou;

(v i i i) zkráceného analogu podle odstavce (f) (iii), v němž jc jedna nebo větší počet z aminokyselin 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71. 74. 77. 78. 89.' 97. 100. 102, 105, 106. 107, 108, 111 a 112 nahrazen jinou aminokyselinou;

(ix) zkráceného analogu podle odstavce (f) (iv). v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8, 32. 33. 35, 48, 50, 53, 60. 64, 66. 67. 68. 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 1.36, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

(x) zkráceného analogu podle odstavce (f) (v), v němž je jedna nebo větší počet / aminokyselin 4. 8. 32. 33, 35. 48. 50. 53. 60. 64. 66, 67, 68, 71. 74, 77, 78, 89. 97. 100. 102. 105. 106. 107, 108, 111,112, 118. 136, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

-47 CZ 2982U3 B6 (xi) zkráceného analogu podle kteréhokoliv /odstavců (f) (i) až (x) s N-terminálním methionylovym zbytkem:

(g) derivátu OB proteinu nebo jeho analogu podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (f), který obsahuje zbytek vodorozpustného polymeru připojený k proteinovému zbytku:

(h) derivátu podle odstavce (g), v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polycthylenglykolu;

(i) derivát podle odstavce (g), v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyaminokyseliny: a (j) derivát podle odstavce (g). kde je zbytek vodorozpustného polymeru připojen pouze na Nkonci proteinového zbytku.

2. Protein podle nároku 1. v němž je Fc část imunoglobulinu zvolena ze souboru sestávajícího z (a) Fc sekvence aminokyselin uvedených v SEQ ID NO: 9, 12, 15 a 18, od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 233, v případě SEQ ID NO: 9 a 12, a od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 228, v případe SEQ ID NO: 15a 18:

(b) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a) v níž je jinou aminokyselinou nahrazena nebo v níž jc vypuštěna aminokyselina v jedné nebo větším počtu následujících poloh, kde použité číslování odpovídá číslování SEQ ID NO: 9. a to lak. že (i) jeden nebo vetší počet cysteinových zbytků je nahrazen zbytkem alaninu nebo šeřinu;

(ii) jeden nebo větší počet tyrosinových zbytků je nahrazen zbytkem ťcnylalaninu;

(iii) aminokyselina v poloze 5 je nahrazena alaninem;

(iv) aminokyselina v poloze 20 jc nahrazena glutamátem:

(v) aminokyselina v poloze 103 je nahrazena alaninem;

(vi) aminokyselina v poloze 105 je nahrazena alaninem:

(vii) aminokyselina v poloze 107 je nahrazena alaninem:

(viii) aminokyselina v poloze 1,2, 3. 4 nebo 5 je vypuštěna: a (ix) kombinace (i) až (vidi);

(c) aminokyselinové sekvence podle odstavců (a) nebo (b) s methionylovým zbytkem na lékořici;

(d) Fc část imunoglobulinu podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (c), která obsahuje zbytek vodorozpustného polymeru připojený ke zbytku proteinu;

(e) derivát podle odstavec (d), kde zbytek vodorozpustného polymeru je polyethylenglykol;

(f) derivát podle odstavce (d), kde zbytkem vodorozpustného polymeru jc zbytek polyaminokyseliny; a

-48CZ 298203 D6 (g) derivát podle odstavce (d), kde je zbytek vodorozpustného polymeru připojen pouze na Nkonci zbytku proteinu.

3. Protein podle nároku 1. v němž je sekvence linkeru tvořena jednou nebo větším počtem 5 aminokyselin zvolených ze souboru sestávajícího z glycinu, asparaginu, šeřinu, threoninu a alani- nu.

4. Protein podle nároku 1. v němž je linker zvolen ze souboru sestávajícího z io (a) ala, ala, ala:

(b) ala, ala, ala, ala:

(c) ala, ala, ala. ala, ala:

(d) gly. gly:

(e) gly, gly, gly:

i? (D gly, gly, gly. gly, gly:

(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly. gly;

(h) gly—pro—gly:

(i) gly, gly, pro, gly, gly; a (j) zbytku vodorozpustného polymeru: a

20 (k) kterékoliv kombinace (a) až (j).

5. Sekvence nukleové kyseliny kódující protein podle nároku 1.

6. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 5 kódující protein obsahující oblast Fc části 25 imunoglobulinu zvolenou ze souboru sestávajícího z (a) Fc sekvence aminokyselin uvedených v SEQ ID NO: 9. 12. 15 a 18, od aminokyseliny l do aminokyseliny 233, v případě SEQ ID NO: 9 a 12, a od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 228, v případě SEQ ID NO: 15 a 18:

M) (b) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a) v níž je jinou aminokyselinou nahrazena nebo v níž jc vypuštěna aminokyselina v jedné nebo větším počtu následujících poloh, kde použité číslování odpovídá číslování SEQ ID NO: 9, a to tak, že

35 (i) jeden nebo větší počet cystcinových zby tků je nahrazen zbytkem alaninu nebo šeřinu:

(ii) jeden nebo větší počet tyrosinových zbytků je nahrazen zbytkem fenylalaninu:

(iii) aminokyselina v poloze 5 je nahrazena alaninem;

(iv) aminokyselina v poloze 20 je nahrazena glutamátem;

(v) aminokyselina v poloze 103 jc nahrazena alaninem;

45 (vi) aminokyselina v poloze 105 je nahrazena alaninem;

(vii) aminokyselina v poloze 107 jc nahrazena alaninem;

(viii) aminokyselina v poloze 1. 2. 3, 4 nebo 5 je vypuštěna; a

-49CZ 298203 B6 (ix) kombinace (i) až (viiii);

(c) aminokyselinové sekvence podle odstavců (a) nebo (b) s methionylovým zbytkem na Nkonci;

(d) Fc část imunoglobulinu podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (c), která obsahuje zbytek vodorozpustného polymeru připojeny ke zbytku proteinu:

(e) derivát podle odstavce (d). kde zbytek vodorozpustného polymeru je polyethylenglykol:

(f) derivát podle odstavce (d), kde zbytkem vodorozpustného polymeru je zbytek polyaminokyseliny: a (g) derivát podle odstavce (d), kde je zbytek vodorozpustného polymeru připojen pouze na Nkonci zbytku proteinu.

7. Sekvence nukleovc kyseliny podle nároku 5 kódující protein, v němž je sekvence linkeru tvořena jednou nebo větším počtem aminokyselin zvolených ze souboru sestávajícího z Gly, Asn. Ser. Thr a Ala.

8. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 5 kódující protein, v nčmŽ jc sekvence linkeru tvořena jednou nebo větším počtem aminokyselin zvolených ze souboru sestávajícího z (a) ala, ala. ala;

(b) ala, ala. ala, ala;

(c) ala. ala, ala, ala, ala;

(d) gly, gly;

(e) gly, gly, gly:

(f) gly. gly, gly. gly, gly;

(g) gly, gly; gly. gly, gly. gly. gly;

(h) gly-pro-gly;

(i) gly, gly. pro, gly, gly;

(j) zbytku vodorozpustného polymeru; a (k) kteroukoliv kombinaci (a) až (j).

9. Vektor pAMG21 uložený ve sbírce kultur Američan Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem ATCC 98113.

10. Prokaryontní nebo eukaryotní hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 9.

11. Způsob produkce proteinu podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se tím, že zahrnuje stupeň kultivace hostitelské buňky podle nároku 10 za vhodných podmínek a stupeň izolace vyrobeného proteinu.

12. Způsob podle nároku 11, v y z n a č u j í c í se t í m , že dále obsahuje stupeň purifikace vyrobeného proteinu.

13. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství proteinu podle nároku 1 ve farmaceuticky vhodném ředidlem, adjuvantu nebo nosiči.

- 50CZ 298203 B6

14. Protein podle nároku 1 pro použití pro léčení nadměrné tělesné hmotnosti, diabetes, vysoké hladiny lipidů v krvi, artenosklerózy a arteriálního plátu, pro redukci nebo prevenci vzniku žlučových kamenů a pro léčení nedostatečnosti tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující tuk. nedostatečné citlivosti k inzulínu a mrtvice.

15. Použití proteinu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení nadměrné tělesné hmotnosti, diabetes, vysoké hladiny lipidů v krvi, arteriosklerózy a arteriálního plátu, pro redukci nebo prevenci vzniku žlučových kamenů a pro léčení nedostatečnosti tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující tuk. nedostatečné citlivosti k inzulínu a mrtvice.