CN114127125A - 多特异性甲状腺素转运蛋白免疫球蛋白融合物 - Google Patents

多特异性甲状腺素转运蛋白免疫球蛋白融合物 Download PDF

Info

Publication number
CN114127125A
CN114127125A CN202080049750.1A CN202080049750A CN114127125A CN 114127125 A CN114127125 A CN 114127125A CN 202080049750 A CN202080049750 A CN 202080049750A CN 114127125 A CN114127125 A CN 114127125A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ttr
ser
protein complex
leu
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080049750.1A
Other languages
English (en)
Inventor
K·W·沃克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of CN114127125A publication Critical patent/CN114127125A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用作多特异性结合蛋白的多特异性甲状腺素转运蛋白(TTR)复合物。本文所述的多特异性TTR复合物在结合至可能存在于一个或多个蛋白上的一个、两个或更多个表位方面特别有用。本文描述了使用本发明的TTR复合物治疗疾病的方法。

Description

多特异性甲状腺素转运蛋白免疫球蛋白融合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年7月8日提交的美国临时申请号62/871,247的优先权和利益；将其通过引用以其整体并入本文。
参考序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。序列表以标题为A--2414-WO-PCT_SeqList_ST25.txt的文本文件提供，该文件创建于2020年7月1日，大小为101,660字节。电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及用作多特异性结合蛋白的多特异性甲状腺素转运蛋白(TTR)复合物。本文所述的多特异性TTR复合物在结合至可能存在于一个或多个蛋白上的一个、两个或更多个表位方面特别有用。本文描述了使用本发明的TTR复合物治疗疾病的方法。
背景技术
单特异性抗体，即结合单一抗原的抗体，是一类良好确立的已在各种治疗领域获得批准的化合物。事实上，在过去十年中，许多基于单特异性抗体的药物已在多个国家获得批准。
多特异性蛋白质，例如多特异性抗体，已成为越来越多研究的主题。多特异性蛋白质能够结合相同或不同蛋白质上的两种或更多种不同抗原。这允许同时影响两种不同的生物途径的可能性。
甲状腺素转运蛋白(TTR)是非共价四聚体人血清和脑脊髓液蛋白，在携带一部分循环甲状腺素方面和在视黄醇结合蛋白的血清半衰期方面起作用。TTR通常以四聚体(约56kDa)血清蛋白的形式存在，每个单体单元的分子量约为14kDa。
先前使蛋白质多聚化的努力包括使用链霉亲和素(Kipriyanov等人,ProteinEngineering[蛋白工程],9(2):203-211(1996))、螺旋-转角-螺旋构建体(Kriangkum等人,Biomolecular Engineering[生物分子工程],18:31–40(2001))、亮氨酸拉链(Kruif等人,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],271(13):7630–7634,1996(1996))、芽胞杆菌RNA酶/芽胞杆菌RNA酶抑制剂复合体(Deyev等人,NatureBiotechnology[自然生物技术],21(12):1486-1492(2003))、和对接N锁(Dock N Lock)技术(蛋白激酶和A激酶锚定蛋白锚定结构域相互作用)(Goldenberg等人,Journal ofNuclear Medicine[核医学杂志],49(1):158-163(2008))。
然而，仍然需要一种有效的方法来产生可以结合相同或不同蛋白质上的多个表位的多特异性蛋白质(例如，完整抗体和抗体片段)。
发明内容
本发明涉及TTR蛋白复合物，其中
该TTR蛋白复合物包含TTR亚基A、B、C和D；
TTR亚基A和B二聚化形成TTR二聚体AB；
TTR亚基C和D二聚化形成TTR二聚体CD；
TTR二聚体AB和CD进一步二聚化形成TTR四聚体ABCD；和
A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以下除外：TTR二聚体AB和TTR二聚体CD之间的界面中的至少一个氨基酸被突变从而相比于形成任何其他四聚体(例如，ABAB四聚体或CDCD四聚体)偏好形成ABCD四聚体。
TTR蛋白复合物的A、B、C和D亚基中的每一个都可以包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：C10A、K15A，或C10A和K15A。
因此，在一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的6、7、8、9、10、13、15、17、19、20、21、22、23、24、26、50、51、52、53、54、56、57、60、61、62、63、78、82、83、84、85、100、101、102、103、104、106、108、110、112、113、114、115、117、119、121、123、124、125、126和127。
在另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123。
在另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸或谷氨酸。
在又另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中C和D在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
在特定实施例中，A和B在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸或谷氨酸；并且C和D在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
在一些实施例中，A和B包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：K15D、L17D、V20D、R21D、G22D、S23D、P24D、S52D、I84D、T106D、A108D、S112D、Y114D、S115D、T119D、V121D、S123D、K15E、L17E、V20E、R21E、G22E、S23E、P24E、D51E、S52E、I84E、T106E、A108E、S112E、Y114E、S115E、T119E、V121E和S123E。本发明还涉及TTR蛋白复合物，其中A和B包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中该突变选自包括以下的列表：L17D、L17E、V20D、V20E、G22D、G22E、S112D、S112E、T119D、T119E、V121D和V121E。
在一些实施例中，C和D包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：K15R、L17R、V20R、G22R、S23R、P24R、D51R、S52R、I84R、T106R、A108R、S112R、Y114R、S115R、T119R、V121R、S123R、L17K、V20K、R21K、G22K、S23K、P24K、D51K、S52K、I84K、T106K、A108K、S112K、Y114K、S115K、T119K、V121K、S123K、K15H、L17H、V20H、R21H、G22H、S23H、P24H、D51H、S52H、I84H、T106H、A108H、S112H、Y114H、S115H、T119H、V121H和S123H。本发明还涉及TTR蛋白复合物，其中C和D包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中该突变选自包括以下的列表：L17R、L17K、L17H、V20R、V20K、V20H、G22R、G22K、G22H、S112R、S112K、S112H、T119R、T119K、T119H、V121R、V121K和V121H。
在其他实施例中，A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个独立地包含上述一个突变。在又其他实施例中，A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个独立地包含上述两个所述突变。
在具体实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/G22R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/G22K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/S112R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/S112K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/T119R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/T119K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22D，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/G22E，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112D，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/S112E，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119E，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V121D，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；或者
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)。
在其他具体实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D，并且C和D包含C10A/K15A/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E，并且C和D包含C10A/K15A/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E，并且C和D包含C10A/K15A/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/L17R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/T119D，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)；或者
A和B包含C10A/K15A/V121E，并且C和D包含C10A/K15A/L17K(或反之亦然)。
在一些实施例中，A和B在SEQ ID NO:1中包含两个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：L17D/V20D、L17D/V20E、L17E/V20D、L17E/V20E、L17D/T119D、L17D/V121E、L17E/T119D、L17E/V121E、V20D/T119D、V20D/V121E、V20E/T119D和V20E/V121E。
在一些实施例中，C和D在SEQ ID NO:1中包含两个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：L17K/V20K、L17K/V20R、L17R/V20K、L17R/V20R、L17K/V121K、L17K/V121R、L17R/V121K、L17R/V121R、V20K/V121K、V20K/V121R、V20R/V121K和V20R/V121R。
本发明还包括实施例，其中TTR蛋白复合物中的A、B、C和D中的每一个都包含SEQID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：
A和B包含C10A/K15A/L17D/V20D并且C和D包含C10A/K15A/L17K/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D/V20E并且C和D包含C10A/K15A/L17K/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E/V20D并且C和D包含C10A/K15A/L17R/V20K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E/V20E并且C和D包含C10A/K15A/L17R/V20R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D/T119D并且C和D包含C10A/K15A/L17K/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17D/V121E并且C和D包含C10A/K15A/L17K/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E/T119D并且C和D包含C10A/K15A/L17R/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/L17E/V121E并且C和D包含C10A/K15A/L17R/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D/T119D并且C和D包含C10A/K15A/V20K/V121K(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20D/V121E并且C和D包含C10A/K15A/V20K/V121R(或反之亦然)；
A和B包含C10A/K15A/V20E/T119D并且C和D包含C10A/K15A/V20R/V121K(或反之亦然)；或者
A和B包含C10A/K15A/V20E/V121E并且C和D包含C10A/K15A/V20R/V121R(或反之亦然)
在一些实施例中，TTR蛋白复合物附接至1、2、3、4、5、6、7或8种生物活性蛋白、肽或小分子。在一些实施例中，TTR蛋白复合物附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白或肽。在其他实施例中，TTR蛋白复合物附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白或肽。抗原结合蛋白或肽可以在TTR亚基的C末端或TTR亚基的N末端与TTR蛋白复合物附接。此外，TTR蛋白复合物可以直接附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白或肽；或者可以通过接头附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白或肽。在特定实施例中，TTR蛋白复合物直接附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白或肽；或通过接头附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白或肽。
接头可以是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的基于氨基酸的接头。在其他实施例中，接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的基于氨基酸的接头。在其他实施例中，接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的基于氨基酸的接头。在其他实施例中，接头是包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的基于氨基酸的接头。在特定实施例中，接头是G、GG、GGG、GGGG、GGGGG、GGGGGG、GGGGGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGG或GGGGGGGGGG。在其他特定实施例中，接头选自包括以下的列表：GG、GGGG、GGGSGG、GGGSGGGG和GGAGGGAGGG。
其他合适的接头包括G(GxBy)rGz接头，其中G＝甘氨酸；B＝任何氨基酸；x＝1-15；y＝1-5；z＝1-15；并且r＝1-20。在另一个实施例中，接头是G(GxBy)rGz接头，其中B＝Q、S、A、E、P、T、K、R、D或N；x＝4；y＝1；z＝4；并且r＝1。
在本发明的一些实施例中，TTR蛋白复合物附接至两个抗原结合蛋白，其中每个抗原结合蛋白结合不同的抗原。在本发明的其他实施例中，TTR蛋白复合物附接至四个抗原结合蛋白，其中这些抗原结合蛋白结合至少两个不同的抗原(例如，一个抗原结合蛋白结合第一抗原并且三个抗原结合蛋白结合第二抗原；或两个抗原结合蛋白结合第一抗原，两个抗原结合蛋白结合第二抗原)。
抗原结合蛋白可以是抗体。在其他实施例中，抗原结合蛋白是Fab或scFv。在特定实施例中，抗原结合蛋白是Fab。在其他实施例中，抗原结合蛋白是抗体和Fab的混合物。
本发明还包括包含本文讨论的任何TTR蛋白复合物的药物组合物。
此外，本发明包括使用本文讨论的任何TTR蛋白复合物治疗癌症的方法。本发明的TTR蛋白复合物可用于治疗癌症。本发明还包括本文讨论的用于治疗癌症的任何TTR蛋白复合物。
在另一个实施例中，本发明包括编码本文讨论的任何TTR蛋白复合物的分离的一种或多种核酸。此外，本发明包括包含编码本文讨论的任何TTR蛋白复合物的核酸的一种或多种表达载体。本发明进一步包括包含此一种或多种核酸或一种或多种载体的重组宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、E5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、人肝细胞癌细胞或人胚肾293(HEK293)细胞。
在一些实施例中，本发明涉及一种制备本文所述的TTR蛋白复合物的方法，其中该方法包括：a)培养重组宿主细胞；b)从培养物中分离该TTR蛋白复合物。
附图说明
图1.图1是本发明的TTR蛋白复合物(构建体或融合蛋白)的示意图。图1a描绘了构成本发明的TTR复合物的四个TTR亚基。图1b是示例性TTR抗体异二聚体融合蛋白，其中两条抗体重链的C末端均与每个TTR亚基的N末端相连。在这个示例中，两种抗体结合相同或不同蛋白质上的不同表位。图1c是示例性TTR抗体/Fab异三聚体融合蛋白。在这个示例中，抗体结合第一表位，而Fab结合相同或不同蛋白质上的第二表位。图1d是示例性TTR Fab异四聚体融合蛋白，其中每个Fab的C末端与每个TTR亚基的N末端连接。在这个示例中，两个Fab结合第一表位，并且两个Fab结合相同或不同蛋白质上的第二表位。图1b-1d中的每一个都显示了重链和TTR之间的任选的接头。
图2.图2a-e代表示例性异聚TTR Ab、TTR Fab和TTR Ab/Fab蛋白复合物。任何抗原结合蛋白(例如，Fab、抗体、scFv、scFab)或诸如酶的蛋白都可用于本发明的TTR蛋白复合物中。图2e中的“+”和“-”符号表示Fc电荷对，其允许每个完整抗体始终连接一个TTR亚基。图2a-e还列举了每个蛋白质复合物的简写描述(例如，[[Fab“A”]-[负TTR]]2：[[正TTR]-[Fab“B”]]2)其中“A”是指第一靶标，而“B”是指第二靶标。“-”表示两个部分之间的单个附接点(例如，[正TTR]和[Fab“B”])，而“＝”表示两个部分之间的两个附接点(例如，[655-341Ab]和[负TTR])。值得注意的是，简写并不意味着N→C或C→N方向，而是从“左到右”对分子的简写描述。还描述了简写的第二种形式。例如，图2a构建体可以标记为“4X-Fab-TTR”，表明4个Fab附接至TTR复合物。类似地，构建的图2b和图2e可以分别标注为“2X-Ab-TTR”和“4X-Ab-TTR”。
图3.图3描绘了形成两组TTR二聚体的TTR单体之间的界面(左侧)和形成TTR四聚体的TTR二聚体之间的界面(右侧)。可以看出，TTR单体之间的界面不同于TTR二聚体之间的界面。
图4.图4描绘了TTR(SEQ ID NO:1)的18个TTR电荷变体(C10A/K15A/XX)，它们被用来评估电荷突变是否会导致TTR二聚体/二聚体界面的实质性排斥。
图5.图5描绘了各种TTR二聚体/二聚体界面(带有突变)如何在加热和不加热的情况下响应SDS(离液剂)的存在。
图6.图6描绘了非变性条件对TTR变体的影响。记录了TTR变体、产率、TTR是作为四聚体还是二聚体(根据SEC和SDS-PAGE分析)存在以及TTR解链温度。
图7.图7描绘了通过SEC(上部)和SDS-PAGE(下部)对TTR异四聚体形成的评估。SEC(上部)分析表明许多变体配对都有形成异多聚体的倾向，如非零值((保留时间与TTR四聚体一致的分子％)所示。此外，如SDS-PAGE结果所示，许多TTR异四聚体对被离液SDS的分解具有抗性。
图8.图8描绘了对正/负配对的进一步SDS-PAGE评估，显示出形成稳定TTR四聚体的高度倾向。TTR异四聚体对SDS诱导的变性具有抗性，这是良好稳定性的指标。对于每个配对，评估了[1]负(即碱性)变体；[2]正(即酸性)变体；[3]负和正变体的组合(应形成四聚体)；和[4]暴露于半胱天冬酶的负和正变体的组合。
图9.图9描绘了当暴露于pH 5.0条件时对包含L17R/T119D、L17K/T119D、L17K/V121E、V20R/V20D、V20R/V20E、V20K/V20D、V20K/V20E、V121R/L17D、V121R/L17E和V121K/L17D配对的TTR异四聚体的评估以确定它们是否可以在与药物配制品中发现的那些条件相似的条件下保持四聚体状态(通过SEC)。
图10.图10描绘了TTR异四聚体解链温度的评估。在每种情况下(图中注明的突变体)，TTR异四聚体在至少92℃都是稳定的，这表明异四聚体是热稳定的。
图11.图11描绘了双特异性TTR异四聚体Ab构建体的构建。显示了示例性双特异性TTR异四聚体Ab构建体，其中655-341Ab的每条重链(线填充)附接至负TTR单体的N末端(一起形成负TTR二聚体)并且DNP-3B1 Ab的每条重链(实心填充)附接至正TTR单体的N末端(一起形成正TTR二聚体)。四个负TTR变体与655-341Ab融合，并且四个正TTR变体与DNP-3B1 Ab融合。所有Ab-TTR融合物均在Ab和TTR单体之间没有接头的情况下产生。
图12.图12描绘了当[655-341Ab]＝[负TTR]2和[正TTR]2＝[DNP-3B1 Ab]四聚体部分在单独的哺乳动物细胞(293-6E HEK细胞)中表达时，不能有效地产生TTR异四聚体Ab构建体。
图13.图13描绘了双特异性TTR异二聚体Ab构建体的构建，用于评估在Ab重链和TTR单体之间添加接头对两个不同哺乳动物细胞中两个四聚体部分的表达的影响。
图14.图14描绘了在Ab重链和TTR单体之间具有接头的双特异性TTR异四聚体Ab构建体的两个不同哺乳动物细胞中两个Ab-TTR异二聚体部分的表达结果(按接头排序)。
图15.图15描绘了在Ab重链和TTR单体之间具有接头的双特异性TTR异四聚体Ab构建体的两个不同哺乳动物细胞中两个Ab-TTR异二聚体部分的表达的另外结果(按接头排序)。
图16.图16描绘了图14和15的平均结果。
图17.图17描绘了用于评估哺乳动物细胞系(CHO K1)中Fab TTR融合物的双特异性TTR异四聚体Fab构建体的构建。
图18.图18描绘了图17中双特异性TTR异四聚体Fab构建体的评估结果。
图19.图19描绘了异多聚体分子15524([655-341Fab]-[GG]-[TTR(C10A/K15A/L17D)]和[TTR(C10A/K15A/V121R)]-[GG]-[DNP-3B1 Fab])与同多聚体Ab-和Fab-TTR融合物以及未融合的Ab(均作为标准)相比较的保留(SEC)。
图20.图20描绘了通过SEC偶联MS确认洗脱种类(来自图19)的分子量与对分子15524(作为异多聚体)的预期一致。
图21.图21描绘了含Ab的TTR融合物的构建以确定含Ab的TTR融合物的共表达是否会导致产生所期望的TTR异四聚体[655-341Ab]＝[[LX]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[LX]]2＝[DNP-3B1 Ab]。
图22.图22描绘了对于图21中的许多组合而言，形成了大量所期望的TTR异四聚体。
图23.图23描绘了异多聚体分子15539([655-341Ab]＝[[GGAGGGAGGG]-[TTR(C10A/K15A/L17D]]2:[[TTR(C10A/K15A/V121K)]-[GGAGGGAGGG]]2＝[DNP-3B1 Ab])与同多聚体Ab-和Fab-TTR融合物以及未融合的Ab(均作为标准)相比较的保留(SEC)。
图24.图24描绘了通过SEC偶联MS确认洗脱种类(来自图23)的分子量与对分子15539(作为异多聚体)的预期一致。
图25.图25描绘了图22的平均结果。
图26.图26描绘了评估在同一细胞系中与Ab和Fab融合的负和正TTR变体(每个突变的4个)的共表达是否会导致产生Ab-Fab-TTR构建体(即，[Ab“A”]＝[负TTR]2:[[正TTR]＝[Fab“B”]]2构建体)。
图27.图27描绘了图26的Ab-Fab-TTR构建体的表达、纯化和分析的结果。
图28.图28描绘了异多聚体分子15545([655-341Ab]＝[[GGGG]-[TTR(C10A/K15A/V20D)]]2:[[TTR(C10A/K15A/V20R)]-[GG]-[DNP-3B1-Fab]]2)与同多聚体Ab-和Fab-TTR融合物以及未融合的Ab(均作为标准)相比较的保留(用SEC)。
图29.图29描绘了通过SEC偶联MS确认洗脱种类(来自图28)的分子量与对分子15545(作为异多聚体)的预期一致。
图30.图30描绘了图27的平均结果。
图31.图31描绘了TTR(SEQ ID NO:1)的TTR双电荷变体(C10A/K15A/XX/YY)，其被制备用于评估双电荷突变是否能够实现异多聚体相对于同多聚体的选择性增加。
图32.图32描绘了单独表达的单界面和双界面突变体的表达产率、纯化产率和SEC特性。
图33.图33描绘了示例性单界面和双界面突变体的SEC谱。
图34.图34描绘了TTR(SEQ ID NO:1)的TTR双电荷变体(C10A/K15A/XX/YY)，其被制备用于评估双电荷突变是否能够实现异多聚体相对于同多聚体的选择性增加。
图35.图35描绘了按负突变分类的单界面和双界面突变体的纯化后混合的SEC特性。
图36.图36描绘了按正突变分类的单界面和双界面突变体的单独纯化后混合的SEC特性。
图37.图37描绘了单独地以及纯化后混合之后的示例性单界面和双界面突变体的SEC谱。
图38.图38描绘了通过细胞系的共培养产生的单界面和双界面突变体的纯化产率和SEC谱。
图39.图39描绘了图38中呈现的数据的延续。
图40.图40描绘了通过共培养双界面突变体产生的示例性分子的SEC谱。
具体实施方式
本文中所使用的部分标题仅出于组织目的，而不应被视为限制所描述的主题内容。
除非本文中另外定义，否则结合本申请所使用的科学及技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。
通常，结合本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交而使用的命名法及其技术是本领域中众所周知且通常使用的那些命名法及技术。除非另外指示，否则本申请的方法及技术可根据本领域中众所周知的常规方法且如贯穿本说明书所引用及论述的各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)[分子克隆:实验室手册,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约洲(2001)]；Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)[分子生物学现代方法,格林出版联合公司(1992)]；以及Harlow和Lane Antibodies:A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)[抗体:实验室手册,冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州(1990)]，将这些文献通过引用并入本文中。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书、如本领域中通常所实现或如本文中所描述来进行。结合本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医学及药物化学而使用的术语及其实验程序和技术是本领域中众所周知且通常使用的那些术语以及实验程序和技术。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送、以及患者的治疗。
应理解，本发明不限于本文中所描述的特定方法、方案及试剂等且因而可能变化。本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不意欲限制本披露的范畴，本披露的范畴将仅由权利要求书来限定。
除了操作实例中或另外指示的情况，表述本文中所使用的成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”当结合百分比使用时可意指±1％。
以任何方式都比由本文特定段落所定义的变型范围更窄的所有实施例应被认为包括在本披露中。例如，某些方面被描述为一类，并且应当理解，属于一类的每个成员可以分别是实施例。同样，被描述为一类的方面或选择属于一类的成员应被理解为包括该类中两个或更多个成员的组合。还应理解，虽然说明书中的多个实施例是使用“包含”语言呈现的，但在多种情况下，也可以使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来描述相关的实施例。
在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另外说明。此外，术语“包括(including)”、以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。同样，术语如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分两者，除非另外明确说明。
定义
“氨基酸”包括其在本领域中的标准含义。二十种天然氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见，Immunology-A Synthesis[免疫学-A合成],第2版,(E.S.Golub和D.R.Green,编辑),斯那路联合出版社(Sinauer Associates):桑德兰(Sunderland),马萨诸塞州.(1991)，其出于任何目的通过引用并入本文。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸(例如[α]-,[α]-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、和其他非常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)也可以是多肽的合适组分，并被包括在术语“氨基酸”中。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、[γ]-羧基谷氨酸、[ε]-N,N,N-三甲基赖氨酸、[ε]-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、[σ]-N-甲基精氨酸、和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。本文使用的多肽表示法中，按照标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
本文所用的“拮抗剂”通常是指可以结合抗原并抑制、减少或消除与抗原相关的生物信号传导的分子，例如本文所提供的抗原结合蛋白。
如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式、包含重链及轻链且包含可变区及恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常为约100-110或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。恒定区允许抗体募集免疫***的细胞和分子。可变区由每条轻链和重链的N末端区域构成，而恒定区由每条重链和轻链的C末端部分构成。(Janeway等人,“Structure of theAntibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology:The Immune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫***],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(Garland Publishing),(1999))。
抗体可以包含本领域已知的任何恒定区。人类轻链分类为κ轻链及λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本披露的实施例包括所有这种抗体类别或同种型。轻链恒定区可为例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人类κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如人类α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，该抗体为同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。
术语“抗原”是指能够由例如抗原结合蛋白(包括例如抗体)的结合剂结合且另外能够用于动物中以产生能够结合该抗原的抗体的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。
如本文所用的“抗原结合蛋白”意指任何特异性结合特定靶抗原的蛋白质。所述术语包括包含至少一个抗原结合区的多肽。所述术语还涵盖包含至少两个全长重链及两个全长轻链的完整抗体，以及其衍生物、变体、片段及突变。抗原结合蛋白还包括Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、结构域抗体(例如
Figure BDA0003444809760000251
)和scFv，如下文更详细描述。
“抗原结合区”或“抗原结合结构域”意指蛋白质(例如抗体或其片段、衍生物或变体)的部分，所述部分特异性结合于分子(例如，抗原)上给定的表位或位点、与其相互作用、或识别其。例如，抗原结合蛋白中含有与抗原相互作用且赋予抗原结合蛋白以其对该抗原的特异性及亲和力的氨基酸残基的部分称为“抗原结合区”。抗原结合区可包括一个或多个“互补决定区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“构架”区。“框架”区可以直接有助于抗原结合蛋白的特异性结合，但是通常有助于保持CDR的适当构象，以促进抗原结合区与抗原之间的结合。
术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性的”和“恶性的”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于上皮癌，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括黑素瘤、肺癌、头颈癌、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、***、卵巢癌、肝癌(例如肝上皮癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(例如肾细胞上皮癌和肾母细胞瘤)、基底细胞癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌和食道癌。
术语“CDR”及其复数“多个CDR”(也称为“高变区”)是指蛋白质例如抗体或其片段、衍生物或变体的互补决定区。轻链可变区和重链可变区各自包含三个CDR。例如，轻链可变区包含以下CDR：CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；并且重链可变区包含以下CDR：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。CDR含有大部分负责抗体与抗原特异性相互作用的残基，并且因此有助于抗体分子的功能活性。CDR是抗原特异性的主要决定簇。
准确定义的CDR边界和长度受制于不同的分类和编号***。因此，CDR可以通过Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号***)来引用。Kabat编号方案(***)是以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛使用的标准，并且是本发明应用的优选方案，也如本文其他地方所提及。另外的结构考虑因素也可以用于确定抗体的规范结构。例如，Kabat编号未完全反映的那些差异可以通过Chothia等人的编号***来描述，并且/或者通过其他技术(例如结晶学和二维或三维计算建模)来揭示。尽管有不同的边界，但这些***中的每一者在构成可变序列内的“CDR”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些***的CDR定义可以相对于相邻框架区在长度和边界区域方面不同。参见，例如Kabat(一种基于跨物种序列变异性的方法)、Chothia(一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人,上述引文；Chothia等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1987,196:901-917；和MacCallum等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,262:732)。表征抗原结合位点的还另一标准是由牛津大学分子公司(Oxfbrd Molecular)的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见例如，Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析]在：Antibody Engineering Lab Manual[抗体工程实验室手册](编辑：Duebel,S.和Kontermann,R.，施普林格出版社(Springer-Verlag)，海德尔堡)。关于抗体结构的综述，参见Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold SpringHarbor Laboratory[冷泉港实验室],Harlow等人编辑,1988。
典型地，CDR形成可以分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指由抗原结合(CDR)环所使用的主链构象。从比较结构研究中，已经发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象组库。每个规范结构可以通过多肽骨架的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可能具有非常相似的三维结构，但环的大多数部分具有高的氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志],1987,196:901；Chothia等人,Nature[自然],1989,342:877；Martin和Thornton,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,263:800)。此外，所使用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类别的构象由环的长度和位于环内关键位置以及保守框架内(即，环外)的氨基酸残基决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在来进行对特定规范类别的分配。
当在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)的上下文中使用时，术语“竞争”意指抗原结合蛋白之间的竞争，并且通过测定进行确定，其中待测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)防止或抑制参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。可使用许多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹层竞争测定(参见例如Stahli等人,1983,Methods in Enzymology[酶学方法]9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等人,1986,J.Immunol.[免疫学杂志]137:3614-3619)；固相直接标记测定、固相直接标记夹层测定(参见例如Harlow及Lane,1988,Antibodies[抗体],A Laboratory Manual[实验室手册],冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人,1988,Molec.Immunol.[分子免疫学]25:7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung等人,1990,Virology[病毒学]176:546-552)；及直接标记RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.[斯堪的纳维亚免疫学杂志]32:77-82)。典型地，这种测定涉及使用结合到固体表面的纯化的抗原或表达抗原的细胞、未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白。通过测定在测试抗原结合蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定法鉴定的抗原结合蛋白包括：与参考抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白和与参考抗原结合蛋白结合的表位足够近的邻近表位结合(以发生空间位阻)的抗原结合蛋白。关于测定竞争性结合的方法的其他详情提供于本文中。例如，在一个实施例中，根据BiaCore测定确定竞争。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，其将使参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、或97％或更多。
术语“控制序列”是指可以影响与其连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可能取决于宿主生物体。在特定实施例中，原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点及转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可以包括包含一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列及转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合配偶体序列。
多肽的“衍生物”是已用不同于***、缺失或取代变体的某种方式，例如经由与另一化学部分结合来进行修饰(例如，化学修饰)的多肽。
“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能免疫球蛋白片段。结构域抗体的实例包括
Figure BDA0003444809760000281
在一些情况下，用肽接头共价连接两个或更多个VH区以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
“有效量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率，消除症状和/或潜在病因，预防症状和/或其潜在病因的发生，和/或改善或治愈由癌症引起或与之相关的损伤的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态(例如癌症)或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。“预防有效量”是当向受试者施用时将具有预定预防效应，例如预防或延迟癌症的发作(或复发)，或者降低癌症或癌症症状的发作(或复发)可能性的药物组合物的量。施用一次剂量未必会出现完全治疗或预防作用，且可能仅在施用一系列剂量之后才发生。因此，治疗或预防有效量可以一次或多次施用进行施用。
术语“表位”是指能够被抗原结合蛋白(例如抗体)识别并特异性结合的抗原部分。在多肽的情况下，表位可以从连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性后丢失。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，更通常至少5或8-10个氨基酸。“线性表位”或“顺序表位”是抗原结合蛋白(例如抗体)通过其氨基酸的线性序列或一级结构识别的表位。“构象表位”或“非顺序表位”是抗原结合蛋白(例如抗体)通过其三级结构识别的表位。构成这些表位的残基在一级氨基酸序列中可能不连续，但在分子的三级结构中彼此靠近。当蛋白质变性、断裂或还原时，线性和构象表位通常表现不同。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指适合转化宿主细胞的载体，并含有指导和/或控制(与宿主细胞结合)一个或多个与其可操作地连接的异源编码区表达的核酸序列。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。
“Fab片段”或“Fab”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab'片段”或“Fab”含有一条轻链及一条重链的含有VH结构域及CH1结构域以及介于CH1与CH2结构域之间的区域的部分，使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，从而形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”或“F(ab’)2”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有CH1与CH2结构域之间的一部分恒定区，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段因而由介于两个重链之间的二硫键维持在一起的两个Fab'片段构成。
“Fc”区含有两个包含抗体的CH2及CH3结构域的重链片段。这两个重链片段由两个或更多个二硫键及CH3结构域的疏水性相互作用维持在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。
术语“重链”在关于抗原结合蛋白、抗体或其片段使用时包括全长重链。全长重链包括可变区结构域(VH)和三个恒定区结构域(CH1、CH2、和CH3)。VH结构域位于多肽的氨基末端，并且CH结构域位于羧基末端，其中CH3最接近多肽的羧基末端。重链可属于任何同种型，例如IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1及IgA2亚型)、IgM及IgE。重链片段具有足够的可变区序列以赋予结合特异性。
“血液学癌症”是始于形成血液的组织(如骨髓)或免疫***细胞中的癌症。血液癌症的实例是白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
术语“异二聚体融合蛋白”或“异二聚体蛋白复合物”是指包含两个不同蛋白(例如，抗原结合蛋白；肽，如激动剂肽；和激动剂蛋白结构域)的融合蛋白。在特定实例中，异二聚体可以是TTR异二聚体融合蛋白，其包含通过如本文所述的TTR蛋白连接的两个不同抗原结合蛋白(例如，两个不同抗体)。在另一个实例中，异二聚体可以是TTR异二聚体融合蛋白，其包含通过如本文所述的TTR蛋白连接的一个抗体和一个Fab。图1b和2b中描绘了示例性异二聚体融合蛋白。
术语“异三聚体融合蛋白”或“异三聚体蛋白复合物”是指包含三个不同蛋白(例如，抗原结合蛋白；肽，如激动剂肽；和激动剂蛋白结构域)的融合蛋白。在特定实例中，异三聚体可以是TTR异三聚体融合蛋白，其包含通过如本文所述的TTR蛋白连接的抗体和两个Fab(参见，例如，图2c)。
术语“异四聚体融合蛋白”或“异四聚体蛋白复合物”是指包含四个不同蛋白(例如，抗原结合蛋白；肽，如激动剂肽；和激动剂蛋白结构域)的融合蛋白。在特定实例中，异四聚体融合蛋白是TTR异四聚体融合蛋白，其中例如抗体、Fab或其混合物通过如本文所述的TTR蛋白连接。实例包括其中抗原结合蛋白是抗体(参见，例如，图2e)或Fab(参见，例如，图1d和2a)。在特定实例中，异四聚体融合蛋白是TTR异四聚体融合蛋白，其中例如抗体、Fab或其混合物通过如本文所述的TTR蛋白连接。
术语“宿主细胞”意指已用核酸序列进行转化且从而表达感兴趣的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本细胞在形态或遗传构成方面是否相同，只要存在目的基因即可。
术语“同一性”意指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的通过比对和比较序列来确定的关系。“百分比同一性”意指比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且是基于比较的最小分子的大小来计算的。对于这些计算，须利用特定数学模型或计算器程序(即，“算法”)解决比对中的空位(若存在的话)。可以用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括以下中所描述的方法：ComputationalMolecular Biology[计算分子生物学],(Lesk,A.M.编辑),1988,New York:OxfordUniversity Press[纽约：牛津大学出版社]；Biocomputing Informatics and GenomeProjects[生物计算信息学和基因组计划],(Smith,D.W.编辑),1993,New York:AcademicPress[纽约：学术出版社]；Computer Analysis of Sequence Data[序列数据的计算机分析],Part I[第I部分],(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,New Jersey:HumanaPress；von Heinje[新泽西：胡玛纳出版社],von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis inMolecular Biology[分子生物学中的序列分析],New York:Academic Press[纽约：学术出版社]；Sequence Analysis Primer[序列分析入门],(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,New York:M.Stockton Press[纽约：M.Stockton出版社]；以及Carillo等人,1988,SIAM J.Applied Math.[工业与应用数学学会]48:1073。
在计算一致性百分比时，以实现各序列间最大匹配的方式比对所比较的序列。用于确定同一性百分比的计算机程序是GCG软件包，其包括GAP(Devereux等人,1984Nucl.Acid Res.[核酸研究]12:387；遗传学计算机公司(Genetics Computer Group),威斯康星大学,麦迪逊市,威斯康星州)。计算机算法GAP是用来比对其百分比序列同一性待确定的两个多肽或多核苷酸。比对序列以使它们各自的氨基酸或核苷酸达到最佳匹配(提供算法确定的“匹配范围”)。将空位开放罚分(其计算为3x对角线平均值，其中“对角线平均值”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的得分或数值)和空位延伸罚分(其通常是1/10×空位开放罚分)以及比较矩阵(诸如PAM 250或BLOSUM 62)与该算法联合使用。在某些实施例中，该算法还使用标准比较矩阵(有关PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence andStructure[蛋白质序列和结构图集]5:345-352；有关BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]89:10915-10919)。
用于使用GAP程序来测定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数如下：
算法：Needleman等人,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453；
比较矩阵：来自Henikoff等人,1992,同上的BLOSUM 62；
空位罚分：12(但是末端空位无罚分)
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可以使这两个序列的仅较短区域匹配，并且此较小比对区可以具有极高序列同一性，即使这两个全长序列之间并无明显关系。因此，如果需要，可以调整所选择的比对方法(GAP程序)以在靶多肽的至少50个连续氨基酸范围内进行比对。
短语“免疫调节剂”是指诱导、增强或抑制免疫应答的分子。免疫激活剂是诱导或放大免疫应答的分子。免疫抑制剂是降低或抑制免疫应答的分子。因此，激活免疫疗法是涉及施用一种或多种分子以诱导或增强受试者免疫***的疗法。抑制免疫疗法是用一种或多种分子治疗受试者以降低或抑制受试者免疫***的疗法。
如本文中所使用的术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)的“片段”是一种抗原结合蛋白，其包含抗体中缺乏全长链中所存在的至少一些氨基酸但能够特异性结合抗原的部分(不考虑如何获得或合成该部分)。此类片段具有生物学活性，因为其特异性结合靶抗原并且可与其他抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定表位。在一个方面，此类片段将保留存在于全长轻链或重链中的至少一个CDR，并且在一些实施例中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物学活性片段可通过重组DNA技术来产生，或可通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促或化学裂解来产生。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和scFv，并且可以衍生自任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔。进一步设想本文中所披露的抗原结合蛋白的功能部分，例如一个或多个CDR，可与第二蛋白质或小分子共价结合，以产生针对体内特定标靶或具有延长血清半衰期的治疗剂。
“分离的核酸分子”意指具有基因组、mRNA、cDNA或合成来源或其某一组合的DNA或RNA，其不与全部或部分多核苷酸缔合(其中该分离的多核苷酸发现于自然界中)或与在自然界中不与其连接的多核苷酸连接。出于本披露的目的，应理解，“包含”特定核苷酸序列的“核酸分子”不涵盖完整染色体。“包含”规定核酸序列的分离的核酸分子除这些规定序列以外还可以包括针对多达十种或甚至多达二十种其他蛋白质或其部分的编码序列，或可以包括控制所叙述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调节序列，和/或可以包括载体序列。
如本文所用，术语“分离的多肽”、“纯化的多肽”、“分离的蛋白质”或“纯化的蛋白质”旨在指从其他组分分离的组合物，其中多肽相对于其天然可获取状态被纯化至任何程度。因此，纯化的多肽还指没有在其天然存在的环境中的多肽。通常，“纯化的”将指已经过分部分离以去除各种其他组分并且基本上保留了其表达的生物学活性的多肽组合物。当使用术语“基本上纯化的”时，该名称将指这样的肽或多肽组合物，其中所述多肽或肽形成所述组合物的主要组分，例如构成所述组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、或更多。
术语“轻链”在关于抗原结合蛋白、抗体或其片段使用时包括全长轻链。全长轻链包括可变区结构域(VL)和恒定区结构域(CL)。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。轻链片段具有足够的可变区序列以赋予结合特异性。
如贯穿本说明书结合例如多肽、核酸、宿主细胞及其类似物的生物学物质所使用的术语“天然存在”是指在自然界中发现的物质。
术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸的长度是10至60个碱基。在其他实施例中，寡核苷酸的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链，例如，以用于构建突变基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
如本文所用，“可操作地连接”意指应用该术语的组分处于允许它们在合适条件下实现其固有功能的关系中。例如，载体中“可操作地连接”至蛋白质编码序列的控制序列是与该编码序列连接以使得在与控制序列的转录活性相适应的条件下实现该蛋白质编码序列的表达。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链及双链核苷酸聚合物两者。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。修饰包括碱基修饰，例如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修饰，例如2',3'-二脱氧核糖；及核苷酸间键修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯、苯氨基磷酸酯及氨基磷酸酯。
除非另外说明，否则本文所论述的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’。新生RNA转录物的5'至3'添加方向称为转录方向；在序列与RNA转录物相同的DNA链上作为RNA转录物5'端的5'端的序列区称为“上游序列”；在序列与RNA转录物相同的DNA链上作为RNA转录物3'端的3'端的序列区称为“下游序列”。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换用于指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。这些术语还可涵盖已例如通过添加碳水化合物残基(以形成糖蛋白)或通过磷酸化而经修饰的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可以由天然存在的和非重组的细胞或由基因工程化的或重组的细胞产生，并且可以包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽片段”是指与全长蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与全长蛋白质相比，此类片段还可含有经修饰的氨基酸。在某些实施例中，片段的长度约为5到500个氨基酸。例如，片段可以是至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。
“重组蛋白”，包括重组TTR蛋白，是使用重组技术，即，通过表达如本文中所描述的重组核酸而制造的蛋白质。用于产生重组蛋白的方法和技术是本领域中熟知的。
“单链Fv”(scFv)是Fv分子，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接形成单个多肽链，其形成抗原结合区。在国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了scFv。
“实体瘤”是指通常不包含囊肿或液体区域的异常生长或组织块。实体瘤可以是良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名。实体瘤的实例是肉瘤、上皮癌和淋巴瘤。白血病(血液癌)通常不形成实体瘤。
当抗原结合蛋白表现出与抗原以外的分子很少结合至没有结合时，所述抗原结合蛋白“特异性结合”所述抗原。然而，特异性结合抗原的抗原结合蛋白可能与来自不同的物种的抗原交叉反应。典型地，如经由表面等离子共振技术(例如BIACore，GE医疗集团(GE-Healthcare)，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)测量的解离常数(KD)≤10-7M时，抗原结合蛋白特异性结合抗原。当抗原结合蛋白以KD≤5x10-8M结合抗原时，所述抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性结合所述抗原，并且当抗原结合蛋白以KD是≤5x10-9M结合抗原时，所述抗原结合蛋白以“非常高亲和力”特异性结合所述抗原(如使用例如BIACore的方法测量)。
如本文中所使用的“受试者”或“患者”可以是任何哺乳动物。在一典型实施例中，该受试者或患者是人类。
如本文中所使用，“基本上纯的”意指所描述种类的分子是所存在的主要种类，即，在摩尔基础上，其比同一混合物中的任何其他个别种类更丰富。在某些实施例中，基本上纯的分子是组合物，其中目标种类包括所存在的所有大分子种类的至少50％(在摩尔基础上)。在其他实施例中，基本上纯的组合物将构成存在于组合物中的所有大分子种类的至少80％、85％、90％、95％、或99％。在其他实施例中，将目标种类纯化至基本均质，其中通过常规检测方法在该组合物中无法检测到污染种类且因而该组合物由单一可检测大分子种类组成。
术语“治疗”是指损伤、病变或病症的成功治疗或改善的任何征候，包括任何客观或主观参数，例如减轻；缓解；削弱症状或使损伤、病变或病症对患者更可耐受；减缓退化或衰弱速率；使退化终点不那么令人虚弱；改良患者的身体或精神健康。症状的治疗或缓解的依据可以是客观或主观参数；包括身体检查、神经精神病学检查和/或精神病学评估的结果。例如，本文提出的某些方法通过例如减少癌症的进展或扩散、抑制肿瘤生长、引起肿瘤的缓解和/或减轻与癌症或肿瘤有关的症状来成功治疗癌症和肿瘤。同样，本文提供的其他方法通过减少感染的进展或传播、降低感染的程度和/或减轻与感染有关的症状来治疗传染病。
如本文所用，术语“TTR”是指“甲状腺素视黄质运载蛋白”。人TTR描述在Mita等人,Biochem.Biophys.Res.Commun[生物化学与生物物理学研究通讯].,124(2):558-564(1984)(其通过引用并入本文)中。人TTR的氨基酸序列也描述在UniProt知识库(www.uniprot.org/uniprot/P02766#sequences)中，并在本文中以SEQ ID NO:1引述。人TTR的核酸序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7276)中描述。另参见GenBank保藏号K02091.1。人TTR的核酸序列在本文中作为SEQ ID NO:44引用。鼠TTR的氨基酸和核酸序列分别在SEQ ID NO:2和3中列出。在一些实施例中，人TTR核酸是编码SEQ ID NO:1的人TTR蛋白的核酸。在其他实施例中，鼠TTR核酸是编码SEQ ID NO:2的鼠TTR蛋白的核酸。
术语“TTR变体”是指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与具有SEQ IDNO:1的TTR至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。本发明还包括编码此类TTR变体的核酸。特定的变体包括例如在C末端或N末端截短的TTR蛋白。
“肿瘤”是指随着癌细胞的生长和繁殖而形成的组织块，其可以侵入并破坏正常的相邻组织。癌细胞可以脱离恶性肿瘤而进入血液或淋巴***，从而使癌细胞从原发性肿瘤扩散而在其他器官中形成新的肿瘤。
多肽的“变体”包含如下氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基***至所述氨基酸序列中、从所述氨基酸序列缺失和/或被取代至所述氨基酸序列中。变体包括融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，在所述环中可以连接另外的DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。可以将其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明旨在包括具有等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
TTR变体
如前所述，人TTR是非共价四聚体蛋白。TTR四聚体蛋白由二聚体的二聚体构成(图3)。有趣的是，形成TTR二聚体的TTR单体之间的界面(图3，左侧)和形成TTR四聚体的TTR二聚体之间的界面(图3，右侧)不同。两个界面之间的差异允许设计TTR变体，从而调节TTR二聚体之间的相互作用，而不会破坏TTR单体之间的界面。
在本发明的一个方面，构成四聚体蛋白质的四个TTR单体中的每一个可以描述为TTR亚基A、B、C或D-其中TTR亚基A和B形成第一AB二聚体并且TTR亚基C和D形成第二CD二聚体(图3)。TTR二聚体AB和TTR二聚体CD结合形成TTR四聚体ABCD。本发明的TTR单体在TTR二聚体AB和TTR二聚体CD之间的界面中包含至少一个氨基酸突变(相对于SEQ ID NO:1)从而相比于形成任何其他四聚体(例如，ABAB四聚体或CDCD四聚体)偏好形成ABCD四聚体。
因此，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中
该TTR蛋白复合物包含TTR亚基A、B、C和D；
TTR亚基A和B二聚化形成TTR二聚体AB；
TTR亚基C和D二聚化形成TTR二聚体CD；
TTR二聚体AB和CD进一步二聚化形成TTR四聚体ABCD；和
A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以下除外：TTR二聚体AB和TTR二聚体CD之间的界面中的至少一个氨基酸被突变从而相比于形成任何其他四聚体(例如，ABAB四聚体或CDCD四聚体)偏好形成ABCD四聚体。
TTR蛋白复合物的A、B、C和D中的每一个都可以包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：C10A、K15A，或C10A和K15A。
因此，在一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的6、7、8、9、10、13、15、17、19、20、21、22、23、24、26、50、51、52、53、54、56、57、60、61、62、63、78、82、83、84、85、100、101、102、103、104、106、108、110、112、113、114、115、117、119、121、123、124、125、126和127。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中A和B在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在又另一个实施例中，本发明涉及TTR蛋白复合物，其中C和D在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在特定实施例中，A和B在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸或谷氨酸；并且C和D在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在一些实施例中，A和B包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：K15D、L17D、V20D、R21D、G22D、S23D、P24D、S52D、I84D、T106D、A108D、S112D、Y114D、S115D、T119D、V121D、S123D、K15E、L17E、V20E、R21E、G22E、S23E、P24E、D51E、S52E、I84E、T106E、A108E、S112E、Y114E、S115E、T119E、V121E和S123E。本发明还涉及TTR蛋白复合物，其中A和B包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中该突变选自包括以下的列表：L17D、L17E、V20D、V20E、G22D、G22E、S112D、S112E、T119D、T119E、V121D和V121E。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在一些实施例中，C和D包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：K15R、L17R、V20R、G22R、S23R、P24R、D51R、S52R、I84R、T106R、A108R、S112R、Y114R、S115R、T119R、V121R、S123R、L17K、V20K、R21K、G22K、S23K、P24K、D51K、S52K、I84K、T106K、A108K、S112K、Y114K、S115K、T119K、V121K、S123K、K15H、L17H、V20H、R21H、G22H、S23H、P24H、D51H、S52H、I84H、T106H、A108H、S112H、Y114H、S115H、T119H、V121H和S123H。本发明还涉及TTR蛋白复合物，其中C和D包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中该突变选自包括以下的列表：L17R、L17K、L17H、V20R、V20K、V20H、G22R、G22K、G22H、S112R、S112K、S112H、T119R、T119K、T119H、V121R、V121K和V121H。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
本发明的TTR蛋白复合物可包含TTR亚基，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个独立地包含本文讨论的一个或两个突变。在一些实施例中，本发明的TTR蛋白复合物可包含TTR亚基，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个独立地包含本文讨论的一个突变。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在具体实施例中，本发明的TTR蛋白复合物包含TTR亚基，其中A、B、C和D中的每一个都包含具有表1中的以下突变(反之亦然)的SEQ ID NO:1的氨基酸序列：
表1
Figure BDA0003444809760000391
Figure BDA0003444809760000401
Figure BDA0003444809760000411
表1中的任何TTR变体和变体配对都适用于本发明。表2指出了针对某些变体和配对观察到的TTR四聚体形成量(参见实例2和图7)。
表2：TTR四聚体形成
Figure BDA0003444809760000412
Figure BDA0003444809760000421
*等级1＝根据SEC并且SDS抗性的强四聚体
等级2＝根据SEC>60％的强四聚体，轻微抗或不抗SDS
等级3＝根据SEC>10％并且<＝60％的显著四聚体
本发明的TTR蛋白复合物可包含TTR亚基，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个独立地包含本文讨论的两个突变。在一些实施例中，A和B在SEQ ID NO:1中包含两个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：L17D/V20D、L17D/V20E、L17E/V20D、L17E/V20E、L17D/T119D、L17D/V121E、L17E/T119D、L17E/V121E、V20D/T119D、V20D/V121E、V20E/T119D和V20E/V121E。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在一些实施例中，C和D在SEQ ID NO:1中包含两个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：L17K/V20K、L17K/V20R、L17R/V20K、L17R/V20R、L17K/V121K、L17K/V121R、L17R/V121K、L17R/V121R、V20K/V121K、V20K/V121R、V20R/V121K和V20R/V121R。在一些实施例中，突变是C10A和K15A的补充。
在具体实施例中，本发明的TTR蛋白复合物包含TTR亚基，其中A、B、C和D中的每一个都包含具有表3中的以下突变(反之亦然)的SEQ ID NO:1的氨基酸序列：
表3
Figure BDA0003444809760000431
在一些实施例中，本发明的TTR蛋白复合物包含TTR亚基，其中A和B或C和D包含具有以下突变的SEQ ID NO:1的的氨基酸序列：C10A/K15A/V20E/T119D、C10A/K15A/L17D/T119D、C10A/K15A/L17E/T119D、C10A/K15A/L17R/V20K、C10A/K15A/L17K/V20K、C10A/K15A/L17R/V121R或C10A/K15A/L17R/V121K。
如上所述，TTR变体也可以用于本发明。本文讨论的任何TTR变体可以彼此组合使用。TTR变体包括具有以下氨基酸序列的蛋白质，该氨基酸序列与相对于SEQ ID NO:1具有突变的TTR蛋白至少80％、81％、82％、83％、86％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
存在于人TTR(SEQ ID NO:1)中的半胱氨酸可用作与生物活性蛋白质、肽或小分子缀合的位点。在一些实施例中，人TTR(SEQ ID NO:1)中存在的半胱氨酸可用作与抗原结合蛋白(例如抗体和Fab)缀合的位点。另外，能够进行位点特异性缀合的TTR变体，例如具有工程化的半胱氨酸的TTR变体，可以用于本发明。参见，例如，USP 8,633,153，其通过引用并入本文。例如，TTR变体可以包含以下半胱氨酸突变中的一个或多个：A37C、D38C、A81C或G83C。
可用于本发明的其他变体包括例如在C末端或N末端具有截短的TTR蛋白。这样的TTR蛋白包括其中从C末端或N末端TTR蛋白去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的那些。在一些实施例中，本发明的融合蛋白包含TTR蛋白，其中从TTR蛋白的C末端或N末端去除1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。在其他实施例中，本发明的融合蛋白包含TTR蛋白，其中从TTR蛋白的N末端去除1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。
可用于本发明的其他TTR变体包括降低或阻断TTR与甲状腺素结合的那些。每个TTR四聚体包含位于TTR四聚体的中央通道中的两个甲状腺素结合位点。例如，这样的变体可以避免干扰患者的甲状腺素生物学，并且可以避免甲状腺素代谢途径对TTR融合起作用。可用于本发明的其他TTR变体包括降低或消除TTR蛋白水解活性的那些。
另外，TTR-His标签融合物可用于本发明。例如，TTR-His标签融合物可用于纯化TTR Fab构建体(其中Fab缺乏Fc)，或用于纯化TTR Ab构建体(其中有利于避免蛋白A亲和柱的低pH纯化环境)。在一些实施例中，在纯化后去除His标签。His标签也可以存在于最终的治疗分子中(即，标签可以在纯化后保留)。在一些实施例中，His标签是His、(His)2、(His)3、(His)4、(His)5、(His)6、(His)7、(His)8、(His)9或(His)10标签。在特定实施例中，His标签是(His)6或(His)7标签。在具体的实施例中，His标签是(His)6标签。在一些实施例中，His标签包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸氨基酸作为接头。在特定的实施例中，His标签包含两个甘氨酸(例如，GGHHHHHH)。
在一些实施例中，可以在TTR变体和重链或轻链之间***两个甘氨酸氨基酸接头。
此外，本发明的TTR变体可以包括掺入糖基化位点的变体，这可以有助于调节TTR融合物的PK或溶解性。另外，本发明的TTR变体或TTR融合蛋白可以被修饰以包括赋予有益PK特性的部分，例如含三嗪的部分(包含在构建体中，所述构建体具有能够与蛋白质反应的末端基团；参见，例如PCT公开号WO/2017/083604，其通过引用整体并入本文)。
在一些实施例中，TTR蛋白复合物附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白或肽。在其他实施例中，TTR蛋白复合物附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白或肽。抗原结合蛋白或肽可以在TTR亚基的C末端或TTR亚基的N末端与TTR蛋白复合物附接。此外，TTR蛋白复合物可以直接附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白或肽；或者可以通过接头附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白或肽。在特定实施例中，TTR蛋白复合物直接附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白或肽；或通过接头或肽附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白。
异二聚体融合蛋白(复合物)
如本文所述，本发明部分涉及TTR在抗原结合蛋白例如抗体的多聚化中的用途。因为TTR是人血清中发现的人细胞外蛋白，所以它在人体中的含量相对较高，使得它当存在于本发明的多聚构建体中时不太可能引发免疫应答(与例如非人、细胞内和稀有蛋白质相比)。因此，其在本发明的多聚技术中的使用是有利的。
例如，TTR可用于结合不同表位的抗体的二聚化，其中这些表位存在于例如相同或不同的蛋白质上。在这样的异二聚体融合蛋白中，TTR(SEQ ID NO:1)或其变体以四聚体形式存在，其中TTR亚基与抗体重链的C末端连接以形成TTR抗体异二聚体。例如，每个抗体重链的C末端(每个抗体包含两个这样的C末端)可以连接到每个TTR亚基的N末端(见图1和2)。因此，每个抗体与TTR四聚体中的两个TTR亚基连接，产生TTR抗体异二聚体。
因此，本发明涉及包含两个抗原结合蛋白的异二聚体融合蛋白，其中每个抗原结合蛋白结合不同的表位，其中表位存在于例如相同或不同的蛋白质上。在一些实施例中，异二聚体融合蛋白包含与蛋白复合体连接的抗原结合蛋白。在一些实施例中，蛋白复合体是TTR蛋白复合体，其中TTR蛋白复合体是TTR四聚体。在一些实施例中，抗原结合蛋白是抗体。
在特定实施例中，本发明涉及包含与TTR四聚体连接的两个抗体的异二聚体融合蛋白，其中每个抗原结合蛋白结合不同的表位，其中表位存在于例如相同或不同的蛋白质上。抗体可以在没有接头的情况下与TTR四聚体相连(即，抗体直接与TTR相连)。
在其他实施例中，抗体经由接头连接至TTR四聚体。例如，氨基酸接头可用于将抗体重链的C末端连接至TTR亚基N末端。在一些实施例中，接头的长度是1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35或1-40个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。在其他实施例中，接头的长度是0、1、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。在其他实施例中，接头的长度多达5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度多达5、10、15或20个氨基酸。在特定的实施例中，接头的长度是0、5、10、15或20个氨基酸。
在一些实施例中，接头是GGGGS、GGGGSGGGGS(即(GGGGS)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)3)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)4)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)5)、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)6)。在其他实施例中，是GGGGS、GGGGSGGGGS(即(GGGGS)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)3)、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)4)。
其他合适的氨基酸接头包括，例如二硫键、(Gly)n(n＝1-10)、(EAAAK)n(n＝1-5)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A、PAPAP、AEAAAKEAAAKA、(Ala-Pro)n(n＝1-20)、VSQTSKLTRAETVFPDV、PLGLWA、RVLAEA、EDVVCCSMSY、GGIEGRGS、TRHRQPRGWE、AGNRVRRSVG、RRRRRRRRR、GFLG和LE。合适的非氨基酸接头包括聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，将抗体在有或没有接头的情况下连接至截短的TTR亚基。例如，可以从一个或多个TTR亚基的N末端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，并且抗体可以附接至截短的TTR亚基N末端。
本发明还涉及编码本文所述的异二聚体融合蛋白的核酸分子。关于产生异二聚体融合蛋白的示例性方法的细节可以在实例中找到。
异三聚体和异四聚体融合蛋白(复合物)
本发明还部分涉及TTR在抗原结合蛋白例如抗体的三聚化或四聚化中的用途。
在异四聚体融合蛋白中，TTR(SEQ ID NO：1)或其变体再次以四聚体形式存在。但是，在TTR抗体异四聚体的情况下，将单个抗体重链(即，在单个抗体中仅存在两条重链中的一条)连接到每个TTR亚基，从而允许将四个抗体连接到TTR四聚体(参见图2e)。抗体C末端的两条重链之一可与每个TTR亚基的N末端连接(见图2e)。因此，每个抗体与TTR四聚体中的一个TTR亚基连接，产生TTR抗体异四聚体。
在这种异四聚体融合蛋白中，通过Fc中的突变不利于Fc异二聚体(如上所述)的形成。此类修饰包括Fc突变，诸如杵-臼、DuoBodies、Azymetric、电荷对、HA-TF、SEEDbody和具有差别蛋白A亲和力的修饰。参见例如Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学],67(2,部分A),2015,第95-106页。杵-臼突变包括第一重链中的T366W，和第二重链中的T366S、L368A和/或Y407V。参见例如Ridgway等人,Protein Eng.[蛋白质工程化],9(1996),第617-621页；和Atwell等人,J.Mol.Biol.[分子生物杂志],270(1997),第26-35页。DuoBody突变包括第一重链中的F405L和第二重链中的K409R。参见例如Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],110(2013),第5145-5150页。Azymetric突变包括第一重链中的T350V、L351Y、F405A和/或Y407V和第二重链中的T350V、T366L、K392L和/或T394W。参见例如Von Kreudenstein等人,mAbs,5(2013),第646-654页。HA-TF突变包括第一重链中的S364H和/或F405A，和第二重链中的Y349T和/或T394F。参见例如Moore等人,mAbs,3(2011),第546-557页。SEEDbody突变包括第一重链中的IgG/A嵌合体突变和第二重链中的IgG/A嵌合体突变。参见例如Davis等人,Protein Eng.Des.Sel.[蛋白质工程化设计与选择],23(2010),第195-202页。差别蛋白A亲和力突变在一个重链中包括H435R且另一重链中无突变。参见例如美国专利第8,586,713号。这些文件中的每一个均通过引用整体并入。
在特定的实施例中，有可能通过使用Fc电荷对来驱动抗体的异四聚化，所述Fc电荷对不利于抗体重链的二聚化，因此有利于连接至TTR亚基的一条抗体重链与未连接至TTR的一条抗体重链之间的重链二聚化(参见图1c)。例如，可以将一组带电荷的突变并入重链的CH3结构域中，其中一条重链上带负电荷并且相应重链上带正电荷，或者一条重链上的负电荷和正电荷的混合物(与其在相应的重链上相应的正电荷和负电荷配对)。示例性的负电荷包括K392D和K409D，示例性的正电荷包括E356K和D399K。由于在CH3界面上的类似电荷相斥而异种电荷吸引，因此同二聚作用不利，而异二聚作用则有利。TTR仅与一种电荷类型(正电荷或负电荷，但不是两者)的重链融合；因此产生一个TTR亚基/完整抗体，由4条链(两条轻链、一条未融合的重链和一条TTR融合的重链)构成。另外的电荷对突变在例如USP 9,546,203中讨论。电荷对突变(包括第一重链中的D221E、P228E、和/或L368E和第二重链中的D221R、P228R、和/或K409R)还描述于例如，Strop等人,J.Mol.Biol[分子生物学杂志].,420(2012),第204-219页。这些文件中的每一个均通过引用整体并入。
在异三聚体融合蛋白中，TTR(SEQ ID NO：1)或其变体再次以四聚体形式存在。异三聚体融合蛋白的示例包括包含一个抗体和两个Fab的那些。在TTR抗体异三聚体的情况下，每条抗体重链的C末端可以连接至两个TTR亚基中每一个的N末端，而两个Fab中每一个的C末端连接至两个TTR亚基中的每一个的N末端以形成TTR Ab/Fab异三聚体(见图2c和2d)。因此，抗体与TTR四聚体中的两个TTR亚基连接，并且每个Fab与TTR亚基连接，产生包含TTR四聚体、一个抗体和两个Fab的TTR Ab/Fab异三聚体。
本发明还部分地涉及TTR在Fab的四聚化中的用途。在此类异四聚体融合蛋白中，TTR(SEQ ID NO:1)、或其变体再次以四聚体形式存在，其中每个TTR亚基连接至每个Fab的C末端以形成TTR Fab异四聚体(参见图2a)。因此，每个Fab与TTR四聚体中的单个TTR亚基连接，从而产生TTR Fab异四聚体。
因此，本发明涉及包含三个或四个抗原结合蛋白(例如，Ab/Fab三聚体、Fab四聚体或Ab四聚体)的异三聚体和异四聚体融合蛋白。在一些实施例中，异三聚体和异四聚体融合蛋白包含与蛋白复合物连接的抗原结合蛋白。在一些实施例中，蛋白复合体是TTR蛋白复合体，其中TTR蛋白复合体是TTR四聚体。在一些实施例中，抗原结合蛋白是抗体。在其他实施例中，抗原结合蛋白是Fab。在一些实施例中，异四聚体融合蛋白包含抗体和Fab的混合物。
在特定的实施例中，本发明涉及异四聚体融合蛋白，其包含四个与TTR四聚体连接的抗体。在其他实施例中，本发明涉及异四聚体融合蛋白，其包含通过接头连接至TTR四聚体的四个Fab。在其他实施例中，本发明涉及异三聚体融合蛋白，其包含通过接头连接至TTR四聚体的一个Ab和两个Fab。在一些实施例中，抗体或Fab在没有接头的情况下与TTR四聚体相连(即，抗体或Fab直接与TTR相连)。
接头可以是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的基于氨基酸的接头。在其他实施例中，接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的基于氨基酸的接头。在其他实施例中，接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的基于氨基酸的接头。在其他实施例中，接头是包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的基于氨基酸的接头。在特定实施例中，接头是G、GG、GGG、GGGG、GGGGG、GGGGGG、GGGGGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGG或GGGGGGGGGG。在其他特定实施例中，接头选自包括以下的列表：GG、GGGG、GGGSGG、GGGSGGGG和GGAGGGAGGG。
在一些实施例中，接头是GGGGS、GGGGSGGGGS(即(GGGGS)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)3)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)4)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)5)、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)6)。在其他实施例中，是GGGGS、GGGGSGGGGS(即(GGGGS)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)3)、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)4)。
其他合适的接头包括G(GxBy)rGz接头，其中G＝甘氨酸；B＝任何氨基酸；x＝1-15；y＝1-5；z＝1-15；并且r＝1-20。在另一个实施例中，接头是G(GxBy)rGz接头，其中B＝Q、S、A、E、P、T、K、R、D或N；x＝4；y＝1；z＝4；并且r＝1。
另外的合适的氨基酸接头包括，例如二硫键、(Gly)n(n＝1-10)、(EAAAK)n(n＝1-5)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A、PAPAP、AEAAAKEAAAKA、(Ala-Pro)n(n＝1-20)、VSQTSKLTRAETVFPDV、PLGLWA、RVLAEA、EDVVCCSMSY、GGIEGRGS、TRHRQPRGWE、AGNRVRRSVG、RRRRRRRRR、GFLG和LE。合适的非氨基酸接头包括聚乙二醇(PEG)和含三嗪的部分(包含在具有能够与蛋白质反应的末端基团的构建体中；参见，例如PCT公开号WO/2017/083604，其通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施例中，将抗体或Fab在有或没有接头的情况下连接至截短的TTR亚基。例如，可以从一个或多个TTR亚基的N末端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，并且抗体或Fab可以附接至截短的TTR亚基N末端。
本发明还涉及编码本文所述的异三聚体和异四聚体融合蛋白的核酸分子。可以在实例中找到关于用于产生异三聚体和异四聚体融合蛋白的示例性方法的细节。
抗原结合蛋白
任何抗原结合蛋白(例如Fab、抗体、scFv、scFab)均可用于本发明的TTR融合蛋白。此外，在本发明的TTR融合蛋白中可以与抗原结合蛋白组合地使用蛋白质(例如酶)。
因为本发明的融合蛋白允许结合不同的表位(例如，在相同或不同的蛋白质上)，所以融合蛋白在将不同靶标靠近有益的情况下是有用的。成功实施此类技术的示例包括依米赛珠单抗，其作用是将活化的因子IX和因子X结合在一起，从而使凝血过程能够继续进行而无需更换因子VIII来治疗血友病。
本发明的融合蛋白还可用于肿瘤学领域。例如，取决于与肿瘤学靶标相关的作用机制，靶细胞(例如，癌细胞)与效应细胞(例如，T细胞)的交联可能是期望的。在
Figure BDA0003444809760000501
(双特异性T细胞接合物)抗体构建体的背景下，此类方法已被证明是成功的。其他示例包括可以结合两个不同肿瘤标志物(例如，通过本发明的TTR融合蛋白的Ab和/或Fab)以及CD3(例如，通过抗CD3 scFv、Ab或Fab)的三特异性物。
本发明的融合蛋白还可以解决与联合治疗的监管评估/批准相关的复杂性。联合治疗的临床试验可能需要更复杂的临床试验策略来评估安全性和有效性，尤其是在之前没有评估过单个成分的情况下。本发明的融合蛋白通过将多个成分组合成单一构建体来解决这种复杂性。
制备TTR异二聚体、异三聚体和异四聚体融合蛋白的方法
实例中讨论了制备本发明的TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合物的方法。
通常，本发明的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合物可以使用重组方法产生。因此，本发明包括编码TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合物的多核苷酸。在另一方面，本发明包括包含编码TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合物的多核苷酸的表达载体。在某些实施例中，表达载体包含控制序列(例如，启动子、增强子)，其与编码TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合物的多核苷酸可操作地连接以支持在合适宿主细胞中的表达。在某些实施例中，表达载体还包含允许在宿主细胞中染色体非依赖性复制的多核苷酸序列。示例性载体包括但不限于质粒、粘粒和YACS。在特定的实施例中，载体是pTT5。
通常，在生成TTR异二聚体、异三聚体或异四聚体融合构建体时，会使用哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主细胞也适用于产生Fab TTR融合构建体，尽管也可以使用非哺乳动物细胞，例如原核(细菌)和非哺乳动物(例如酵母)宿主细胞。
在另一方面，本发明包括包含本发明表达载体的宿主细胞。用表达载体转染宿主细胞并在适合于表达TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合物的条件下培养转染的宿主细胞的方法是本领域已知的。使用的转染程序可能取决于要转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的某些方法是本领域已知的，并且包括但不限于：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、一个或多个多核苷酸封装于脂质体中、以及DNA到核中的直接显微注射。可用作用于表达的宿主的某些哺乳动物细胞系是本领域中众所周知的且包括但不限于可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO，例如CHO-K1)细胞、E5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、人胚胎肾细胞293(HEK 293)和多种其他细胞系。在某些实施例中，可以通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生TTR异二聚体、异三聚体和异四聚体融合物来选择细胞系。
因此，本发明还涉及制备本文所述的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合蛋白的方法。例如，TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合蛋白可以通过以下方式制备：
a)培养包含编码TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合物的多核苷酸的重组宿主细胞；和
b)从所述培养物中分离该TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合蛋白。
药物组合物
在一些实施例中，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本发明的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合蛋白以及药学上有效的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
优选地，可接受的配制品物质在所采用的剂量及浓度下对接受者无毒。在具体的实施例中，提供了包含治疗有效量的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合蛋白的药物组合物。
在某些实施例中，药物组合物可含有配制品物质以调节、维持或保留例如组合物的pH值、渗透性、粘度、澄明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透。在此类实施例中，合适的配制品材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸、或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；疏松剂(诸如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)；助悬剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨聚糖、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、氚核、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙星(tyloxapal))；稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物、优选地氯化钠或氯化钾，甘露糖醇，山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药用辅助剂。参见，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书]",第18版(A.R.Genrmo编),1990,马克出版公司(Mack Publishing Company)。
在某些实施例中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期施用途径、递送形式和所希望剂量来确定。参见，例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书]，同上。在某些实施例中，此类组合物可影响本发明的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放率及体内清除率。在某些实施例中，药物组合物中的主要媒介物或载剂在性质上可以是水性的或非水性的。例如，适合的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在具体的实施例中，药物组合物包含pH约7.0-8.5的Tris缓冲液、或pH约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且可以进一步包括山梨醇或其适合的替代物。在本发明的某些实施例中，TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)组合物可以通过将具有所希望纯度的所选组成成分与任选配制剂(REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书]，同上)混合以冻干饼或水性溶液的形式制备用于储存。此外，在某些实施例中，可使用适当赋形剂(例如蔗糖)将TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制为冻干物。
可以选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。可替代地，可以选择组合物用于吸入或通过消化道递送，例如口服。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的技术范围内。配制品组分优选地以给药部位可接受的浓度存在。在某些实施例中，使用缓冲液将组合物维持在生理pH值或稍低的pH值，通常pH值范围为从约5至约8。
当考虑肠胃外施用时，用于本发明的治疗组合物能以无热原的肠胃外可接受的水性溶液的形式提供，该水性溶液在药学上可接受的媒介物中包含期望的TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)。用于肠胃外注射的特别适合的媒介物是无菌蒸馏水，其中将TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中，该制备可以涉及用可以提供产物(该产物可以经由储库注射来递送)的受控或持续释放的药剂(如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)配制所希望分子。在某些实施例中，也可以使用透明质酸，该透明质酸具有促进循环持续时间的作用。在某些实施例中，可使用可植入药物递送装置来引入所要抗原结合蛋白。
可以配制本发明的药物组合物用于吸入。在这些实施例中，TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)有利地配制成干燥的、可吸入的粉末。在具体实施例中，还可用推进剂配制TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)吸入溶液以用于气雾剂递送。在某些实施例中，可以使溶液雾化。因此，国际专利申请号PCT/US94/001875进一步描述经肺施用及配制方法，其通过引用并入且描述经化学修饰的蛋白质的经肺递送。
还预期配制品可以口服施用。以此方式施用的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)可以在存在或不存在载剂的情况下配制，这些载剂常用于混配固体剂型(例如片剂和胶囊)。在某些实施例中，可设计胶囊以便在胃肠道中在生物可用性最大化且***前降解最小化时释放配制品的活性部分。可以包括另外的药剂以促进TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、助悬剂、片剂崩解剂及粘合剂。
其他药物组合物对于本领域技术人员将显而易见，包括呈持续或控制递送配制品形式的涉及TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)的配制品。用于配制各种其他持续或控制递送方式的技术(如脂质体载剂、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储库注射)也是本领域技术人员已知的。参见，例如国际专利申请号PCT/US93/00829，其通过引用结合在此并描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包括呈成型制品(例如膜或微胶囊)形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号EP 058481中所披露，其每个通过引用结合在此)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers[生物聚合物]2:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志]15:167-277和Langer,1982,Chem.Tech.[化学技术]12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号EP 133,988)。持续释放组合物还可以包括可以通过本领域中已知的若干种方法中的任一种制备的脂质体。参见，例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]82:3688-3692；欧洲专利申请公开号EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949，这些参考文献通过引用并入。
用于体内施用的药物组合物典型地作为无菌制剂提供。灭菌可以通过无菌滤膜过滤完成。当组合物冻干时，可以在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物能以冻干形式或于溶液中储存。通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器(例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。
本发明的方面包括自缓冲的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制品，其可以用作药物组合物，如国际专利申请WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述，将其通过引用以其全文并入本文。
如上所述，某些实施例提供了TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)组合物，特别是药物TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)组合物，其除了异多聚体之外还包含一种或多种赋形剂，例如在本节和本文其他地方说明性描述的那些。在这方面，赋形剂在本发明中可用于多种目的，如调整配制品的物理、化学或生物特性，如调整粘度和/或本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类配制品和方法，以对抗由于例如在制造、运输、储存、使用前准备、施用和之后过程中发生的压力而导致的降解和腐坏。
有多种关于蛋白质稳定和制剂材料以及在这方面有用的方法的论述，例如Arakawa等人,“Solvent interactions in pharmaceutical formulations[药物配制品中的溶剂相互作用],”Pharm Res.[药物研究]8(3):285-91(1991)；Kendrick等人,“Physicalstabilization of proteins in aqueous solution[蛋白质在水溶液中的物理稳定],”在RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS:THEORY AND PRACTICE[稳定蛋白配制品的合理设计：理论与实践],Carpenter和Manning编辑.PharmaceuticalBiotechnology[药物生物技术].13:61-84(2002)，和Randolph等人,“Surfactant-proteininteractions[表面活性剂-蛋白质相互作用],”Pharm Biotechnol[药物生物技术].13:159-75(2002)，其每一个均通过引用以其全文并入本文，特别是涉及与根据本发明的自缓冲蛋白配制品的赋形剂及其制备方法有关的部分，尤其是用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法。
根据本发明的某些实施例，可以使用盐以例如调整配制品的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。
众所周知，离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷基团和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别地与蛋白质的变性肽键(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，并且从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。
离子种类对蛋白质的作用显著不同。已经开发了多种对可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类评级。一个实例是Hofmeister系列，该系列通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行评级。稳定溶质称为“亲液的。”不稳定溶质称为“离液的”。通常使用高浓度的亲液剂(例如，>1摩尔硫酸铵)以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。通常使用离液剂来使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根据本发明的各种实施例，游离氨基酸可在TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制品中作为膨胀剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定配制品中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和特性。在液体配制品和冻干配制品两者中，精氨酸均可用于抑制蛋白质聚集。蛋氨酸可用作抗氧化剂。
多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨醇以及多元醇，如例如甘油和丙二醇，并且出于本文论述的目的，包括聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是亲液的。它们在液体配制品和冻干配制品两者中是有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调整配制品的张力。
在本发明的选择实施例中有用的多元醇是甘露醇，甘露醇通常用于确保在冻干配制品中饼的结构稳定性。它确保了饼的结构稳定性。它通常与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。山梨醇和蔗糖是用于调整张力且作为稳定剂以防止在运输过程中的冷冻-解冻应力或防止在制造过程中制备团块的优选药剂。还原糖(含有游离醛或酮基团)，如葡萄糖和乳糖，可以使表面赖氨酸和精氨酸残基糖基化。因此，它们通常不是根据本发明使用的优选多元醇。此外，在这方面，形成此类反应性物质的糖也不是本发明优选的多元醇，该糖如蔗糖，蔗糖在酸性条件下水解为果糖和葡萄糖并因此产生糖基化。PEG可用于稳定蛋白质并用作冷冻保护剂，并且在这方面可以用于本发明。
TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制品的实施例进一步包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附在表面上，并且变性以及随后在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且典型地因物理振荡(如在产品运输和处理过程中产生的物理振荡)而加剧。
常规使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。在这方面，本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯、以及泊洛沙姆188。
表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面使用表面活性剂是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂典型地会稳定一些蛋白质并使其他蛋白质不稳定。
聚山梨醇酯易于氧化降解，并且通常在供应时含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链，尤其是甲硫氨酸的氧化。因此，应谨慎使用聚山梨醇酯，并且在使用时应以其最低有效浓度使用。在这方面，聚山梨醇酯例示了赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。
TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制品的实施例进一步包含一种或多种抗氧化剂。通过保持适当水平的环境氧气和温度并避免暴露于光下，可以在某种程度上防止药物配制品中蛋白质的有害氧化。也可以使用抗氧化赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这方面，有用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质配制品中的抗氧化剂优选是水溶性的并且在整个产品的储存寿命内保持其活性。在这方面，EDTA是根据本发明的优选的抗氧化剂。
抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂，如特别是谷胱甘肽，可以破坏分子内二硫键。因此，选择用于本发明的抗氧化剂尤其用于消除或足够降低其本身破坏配制品中的蛋白质的可能性。
根据本发明的配制品可以包含金属离子，这些金属离子是蛋白质辅助因子并且是形成蛋白质配位复合物所必需的，如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子也可以抑制降解蛋白质的一些过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。
镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。Ca+2离子(高达100mM)可以增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg+2、Mn+2和Zn+2可以使rhDNase去稳定。类似地，Ca+2和Sr+2可以稳定因子VIII，它可以因Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2去稳定，并且其聚集可以通过Al+3离子增加。
TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制品的实施例进一步包含一种或多种防腐剂。当开发涉及从同一容器提取超过一次的多剂量肠胃外配制品时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个保质期或使用期限内的产品无菌性。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂在小分子肠胃外使用方面有着悠久的历史，但包含防腐剂的蛋白质配制品的开发可能具有挑战性。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定效应(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质配制品中使用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白质药物仅配制用于一次性使用。然而，当多剂量配制品是可能时，它们具有使患者方便的附加优势和增加的可销售性。良好的示例是人生长激素(hGH)，其中防腐配制品的开发已经促成更方便、多次使用的注射笔展示的商业化。至少四种含有hGH的防腐配制品的此类笔装置目前可在市场上获得。Norditropin(液体，诺和诺德公司(Novo Nordisk))、Nutropin AQ(液体，基因泰克公司(Genentech))和Genotropin(冻干的--双室药筒，法玛西亚普强公司(Pharmacia&Upjohn))含有苯酚，而Somatrope(礼来公司(Eli Lilly))用间-甲酚进行配制。
在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑若干个方面。必须优化药物产品中有效的防腐剂浓度。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围测试剂型中给定的防腐剂。
正如可以预期的那样，含有防腐剂的液体配制品的开发比冻干配制品更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，从而显著最小化相关的稳定性风险。在液体配制品的情况下，应在整个产品保质期(例如，约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。要指出的重要点是，防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终配制品中得到证实。
TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)配制品通常将被设计用于特定的施用途径和方法、特定的施用剂量和频率、特定疾病的特定治疗、具有生物利用度和持久性的范围等。因此，可以根据本发明设计配制品，以通过任何适合的途径(包括但不限于口服、耳内、眼科、直肠、和***)以及通过肠胃外途径(包括静脉内和动脉内注射、肌内注射、和皮下注射)递送。
一旦配制了药物组合物，可以将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类配制品能以即用形式或以在施用前重构的形式(例如，冻干形式)储存。本发明还提供了用于产生单剂量给予单元的药剂盒。本发明的药剂盒可各自含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性配制品的第二容器。在本发明的某些实施例中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干注射器)的药剂盒。
待采用的含有TTR异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体和异四聚体)的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗情形及目标。本领域技术人员将理解，治疗的适当剂量水平将部分地取决于递送的分子、使用TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)的适应症、施用途径、以及患者的大小(体重、体表面积或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)。在某些实施例中，临床医师可滴定剂量且修改施用途径以获得最佳治疗效果。取决于上述因素，典型的剂量范围可以为从约0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高。在具体的实施例中，剂量范围可以为从1.0μg/kg至约20mg/kg，任选地为从10μg/kg至高达约10mg/kg或从100μg/kg至高达约5mg/kg。
治疗有效量的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)优选导致疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病痛苦引起的损伤或残疾。
药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于药物组合物施用的医疗装置的示例描述在美国专利号4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163，均通过引用并入本文。
TTR异二聚体、异三聚体和异四聚体融合蛋白的治疗用途
如实例中所示，已经发现本发明的多特异性TTR融合蛋白能够结合一个或多个蛋白质上的两个或更多个表位。这种多特异性TTR融合特别有用，因为与传统的治疗模式相比，它们可以参与多种生物途径，从而更有效地治疗疾病状态(例如癌症)。
本发明的多特异性TTR融合蛋白优于许多已知的双特异性/多特异性方法。例如，本发明提供了抗原结合结构域的二价双特异性呈递，与例如异-IgG构建体相比，这减少或消除了亲合力损失。与异-IgG构建体相比的其他益处包括，无需Fc电荷对突变(CPM)(Fc电荷对突变(CPM)是驱动异-IgG构建体中重链异二聚化所需的)即可生成本发明的多特异性TTR融合蛋白，以及减少或消除不需要的副产物，例如半抗体和轻链错配(存在于异-IgG和IgG-Fab构建体中)。实际上，本发明的TTR融合蛋白减少了其他构建体中所需的许多(并且在某些情况下，全部)Ab或Fab工程化。
与IgG-Fab和IgG-scFv构建体相比，本发明的TTR融合蛋白的抗原结合结构域被最佳定向，使得N末端抗原结合区暴露并且空间诱导的亲和力损失减少或消除。
本发明的TTR融合蛋白的另一个益处源于使用天然IgG形式，这有助于减少在将mAb转化为scFv构建体时观察到的亲和力损失和聚集倾向增加。Gil和Schrum,Advances inBioscience and Biotechnology[生物科学和生物技术进展],4:73-84(2013)。
此外，因为本发明的TTR融合蛋白允许多种抗原结合结构域的有效掺入，所以能够快速扫描双特异性(或多特异性)组合。
与单个抗体和/或Fab相比，TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合蛋白也表现出改善的抗原聚簇。当抗体(例如IgG抗体)与靶细胞(例如肿瘤细胞)上的抗原结合时，形成的聚簇化Fc结构域就会与免疫效应细胞(例如NK细胞和巨噬细胞)上的FcγR接合。这种聚簇有助于通过FcγR进行信号传导，从而启动细胞介导的效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。因此，TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)融合蛋白在靶向配体中特别有用，其中高抗体或Fab亲和力/亲合力导致增强的生物学效应。本发明的TTR异多聚体(例如异二聚体、异三聚体和异四聚体)构建体增强细胞介导的效应子功能导致杀死细胞的能力增强，这可用于例如癌症的治疗。
因此，本发明还涉及使用本文所述的异二聚体融合蛋白和异四聚体融合蛋白治疗癌症的方法。
在其他实施例中，本发明涉及本文所述的异二聚体融合蛋白和异四聚体融合蛋白在癌症治疗中的用途。
在其他实施例中，本发明涉及本文所述的用于治疗癌症的异二聚体融合蛋白和异四聚体融合蛋白。
实例
提供以下实例是为了说明本发明的具体实施例或特征，而不是为了限制其范围。
实例1：一般技术
实例1描述了用于制造和表征其余实例中讨论的TTR负和正构建体的一般技术。
以下技术用于生成包含每个TTR亚基具有一个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体(“C10A/K15A/XX”)的TTR负和正构建体
大肠杆菌中TTR负和正变体的克隆
美商安进公司大分子注册构建体C37979(pAMG21:huTTR(opt-C10A，K15A))用作所有TTR负和正变体(包含C10A/K15A/XX)的模板。TTR负和正变体是使用标准分子生物学技术产生的，所述分子生物学技术包括聚合酶链式反应(PCR)、定点PCR诱变、限制性核酸内切酶消化和酶促连接到细菌表达质粒中。还产生了在TTR N末端含有MKH6GG的TTR负和正变体。
通常根据可在Molecular Cloning:A Laboratory Manuel[分子克隆：实验室手册],第3版，Sambrook等人,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],cold Spring Harbor,N.Y.[冷泉港，纽约州]中参考的方法进行所述技术。
大肠杆菌中TTR负和正变体的表达
将含有编码TTR负和正变体的pAMG21载体的BL21细胞在250ml带挡板摇瓶中在含有20μg/ml卡那霉素的50ml体积的Terrific Broth(天惠华公司(Teknova)T7060)中在30-37℃培养过夜。第二天，将35ml过夜培养物加入含有20μg/ml卡那霉素和50μl Sigma Y-30消泡剂的1L Terrific Broth中，并在33℃孵育直至600nm处的OD达到0.4。将1ml Sigma K-3255N-(β-酮己酰基)-DL-高丝氨酸内酯自诱导剂(溶解在乙醇中的储备溶液)加入培养物，使其在30至33℃表达四小时。
从大肠杆菌纯化TTR负和正变体
使用Omni TH(欧尼国际公司(Omni International),肯尼索(Kennesaw),乔治亚州,美国)手持匀浆器，将冷冻的大肠杆菌细胞糊在重量比体积为1:10的50mM磷酸钠、300mMNaCl、pH 8.0溶液中匀浆。然后将所得悬浮液通过M-110S微流化器(微流体公司(Microfluidics Corporation),尔湾市(Irvine),加利福尼亚州,美国)以13,800PSI处理两次。然后将裂解物在4℃以22,000RCF离心1小时。通过0.45μm醋酸纤维素过滤器(康宁生命科学公司(Corning Life Sciences),图克斯伯里(Tewksbury),马萨诸塞州,美国)过滤可溶级分，并保留作为FPLC纯化的起始材料；不溶级分作为废物处理。
连接到
Figure BDA0003444809760000621
(通用健康生物科学公司(GE Healthcare Bio-Sciences),马尔堡(Marlborough),马萨诸塞州,美国)FPLC的5mL Ni-NTA SuperFlow柱(凯杰公司(Qiagen),希尔登(Hilden),德国)在上样前用5个柱体积(CV)的50mM磷酸钠、300mM NaCl、10mM咪唑、pH 8.0平衡。将过滤后的可溶性裂解液注入柱上，用15CV的50mM磷酸钠、300mMNaCl、10mM咪唑、pH 8.0洗涤，并用10CV的50mM磷酸钠、300mM NaCl、250mM咪唑、pH 8.0逐步洗脱。
将纯化池使用VivaSpin 10kDA MWCO(赛多利斯股份公司(Sartorius AG),哥廷根(Gottingen),德国)离心过滤器进行浓缩，以3,000RCF离心直至达到所需体积。
使用Slide-a-lyzer 10kDa MWCO(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific),沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)透析盒用10mM tris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl透析浓缩样品，直到计算得出起始缓冲液低于1％。
TTR负和正变体(大肠杆菌)的PC分析
通过使用Nanodrop 2000c(赛默飞世尔科技公司)在280nm处测量UV吸光度来进行蛋白质定量。
在加热和不加热样品的情况下进行非还原SDS-PAGE分析。在这两种情况下，样品都用SDS-PAGE样品缓冲液处理，并在4-20％Tris-Gly SDS-PAGE(赛默飞世尔科技公司)上运行，按照制造商的方案。在加热实验中，样品和样品缓冲液在85℃加热5分钟，然后加载到凝胶上；添加样品缓冲液后，将未加热的样品直接加载到凝胶上。根据制造商的微波方案，使用SimplyBlue SafeStain(赛默飞世尔科技公司)对凝胶进行染色。
HPLC SEC分析如下进行：在连接到安捷伦1290Infinity HPLC***(安捷伦科技公司(Agilent Technologies),圣克拉拉(Santa Clara),加利福尼亚州,美国)的SEC-3000、7.8x 300mm柱(菲罗门公司(Phenomenex),托兰斯(Torrance),加利福尼亚州,美国)上，运行等度50mM NaH2PO4、250mM NaCl、pH 6.9流动相，流速为1mL/min，并在280nm处观察UV吸光度。
TTR负和正变体二聚化
通过用10mM tris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl稀释，将纯化的TTR样品标准化为实验队列的最低共同摩尔浓度。将样品以等体积合并，并在4℃孵育过夜。
将混合样品的部分如下通过半胱天冬酶裂解进行处理。通过使用10mM tris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl稀释，将纯化的蛋白质样品浓度调节至2.5mg/mL。制备由250mM NaCl、15mM 2-巯基乙醇、pH 8.0组成的5x消化缓冲液，并在水浴中加热至25℃，以及通过用水稀释5x缓冲液制备1x消化缓冲液。使用1x消化缓冲液将半胱天冬酶-3(美商安进公司(AmgenInc.),千橡市,加利福尼亚州,美国)的储液等分试样稀释至0.1mg/mL。将4份蛋白质、4份稀释的半胱天冬酶-3、8份5x消化缓冲液和20份水混合，并且在25℃水浴中孵育2小时。去除消化溶液并添加20份SDS-PAGE样品缓冲液(与之前指定用于SDS-PAGE分析的试剂相同)。使用先前指定的相同方案在SDS-PAGE上进行裂解反应。
通过非还原、未加热的SDS-PAGE和HPLC SEC分析所得分子混合物、半胱天冬酶过程和非半胱天冬酶过程。
(1)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”](2X Ab-TTR)；(2)[[Ab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Ab“B”]]2(4X Ab-TTR)；和(3)[[Fab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2(4X Fab-TTR)分子(无接头)的克隆
使用标准分子生物学技术(包括聚合酶链反应(PCR)、定点PCR诱变、限制性内切酶消化和酶促连接到哺乳动物表达质粒中)，将TTR与杂交瘤衍生的抗CB1、抗GITR和抗TR2抗体重链(HC)的几种工程化变体融合。还产生了带His标签的Fab-TTR分子。将这些克隆的TTR融合变体重链和Fab DNA与它们各自的克隆的抗CB1、抗GITR和抗TR2抗体轻链(LC)DNA组合，用于转染哺乳动物细胞以表达2X Ab-TTR，4X Ab-TTR和4X Fab-TTR。通常根据可在Molecular Cloning:A Laboratory Manuel[分子克隆：实验室手册],第3版，Sambrook等人,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],cold SpringHarbor,N.Y.[冷泉港，纽约州]中参考的方法进行所述技术。
TTR抗体和Fab融合序列由
Figure BDA0003444809760000641
无缝克隆(GSC)或金门组装(Golden GateAssembly，GGA)生成。组合的DNA片段通过拼接重叠延伸PCR(SOE-PCR)产生或从外部供应商合成订购。在GSC克隆中使用的SOE-PCR产物是使用与诱变回文引物配对的侧翼引物产生的，这些引物产生了两个PCR产物，它们共享围绕针对所期望氨基酸变化位点的密码子的15bp重叠区域。GGA中使用的SOE-PCR产物设计为包括由BsmBI消化产生的定向独特4碱基对突出端。
简而言之，GGA依赖II型限制酶和T4 DNA连接酶切割并将多个DNA片段无缝连接在一起。(Engler等人,PLOS One[公共科学图书馆期刊],第3卷(11):e3647,2008)。在该实例中，多个DNA片段由以下组成：(i)编码科扎克共有序列、信号肽序列、完整抗体基因、接头和TTR序列的合成核酸序列(GeneByte,Gen9,剑桥,马萨诸塞州)组成，以及(ii)表达载体骨架。GGA反应由以下构成：50ng GeneByte、20ng表达载体、1μl 10x快速消化反应缓冲液+0.5mM ATP(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher),沃尔瑟姆,马萨诸塞州)、0.5μl快速消化Esp3I(赛默飞世尔公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)、1μl T4 DNA连接酶(5U/μl,赛默飞世尔公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)和水(至10μl)。这些反应会进行15个循环，每个循环由以下组成：37℃的2分钟消化步骤和16℃的3分钟连接步骤。15个循环后，进行最终的5分钟的37℃消化步骤和80℃5分钟的酶失活步骤。
[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]分子(无接头)的表达
HEK 293-6E细胞在25mm振动直径的振动器上的培养箱(5％CO2，80％-90％湿度和120rpm搅拌)中的摇瓶中在36℃在FreeStyle F17培养基(赛默飞世尔科技公司)(补充有0.1％(w/v)泊洛沙姆188(西格玛奥德里奇公司)、6mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司)、25μg/ml G418(赛默飞世尔科技公司))中培养。293-6E细胞在转染前2天以0.4x106个细胞/ml接种。在转染当天，细胞处于指数生长期(约1.5x106个细胞/ml，>95％存活率)。通过添加0.5mg/L DNA(0.1mg/L目的基因构建体DNA+0.4mg/L载体DNA)和2mg/L PEI Max(聚乙烯亚胺Max，聚合科学公司(Polysciences)，Cat#24765-2)的混合物至细胞培养物来以20％基因剂量进行瞬时转染。转染后4小时添加专有进料{酵母酸盐(0.5％w/v)和葡萄糖(3g/L)}。转染后6天，通过将细胞以4000rpm(3485x g)离心40分钟来收获产物。用0.45μM PES(聚醚砜)过滤器过滤上清液。
[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]分子(无接头)的纯化
连接到
Figure BDA0003444809760000652
(通用健康生物科学公司)FPLC的rProtein A Fast Flow柱(通用健康生物科学公司,马尔堡,马萨诸塞州,美国)在上样前用Dulbecco’s PBS(DPBS)平衡。将过滤的细胞培养基注射到柱上，用5个柱体积(CV)的DPBS洗涤，并用8个CV的50mMHOAc，pH 3.2逐步洗脱。使用1M tris将洗脱液滴定至pH 5.0，然后通过0.45μm醋酸纤维素真空过滤器(康宁公司(Corning Inc.),康宁,纽约州,美国)过滤。滴定和过滤的rProteinA池被分成两个单独的池以进行另外的纯化。
rProtein A池的一半用20mM MES，pH 5.0按体积1:5稀释，然后注射到连接至
Figure BDA0003444809760000651
(通用健康生物科学公司)FPLC的SP Sepharose高性能柱(通用健康生物科学公司)上，该高性能柱预先用20mM NaOAc，pH5.0平衡。该柱用5CV的20mM NaOAc，pH 5.0洗涤，并用20CV梯度从20mM NaOAc，pH 5.0到20mM NaOAc，500mM NaCl，pH 5.0洗脱。
SP Sepharose级分在Caliper LabChip GXII微毛细管电泳***上使用ProteinExpress Assay LabChip(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer),沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)按照制造商方案进行分析。针对在单体Ab-TTR相比于不合格MW种类的近似分子量处的富集条带选择级分，然后合并。
使用Slide-a-lyzer 10kDa MWCO(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific),沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)透析盒用10mM MES、150mM NaCl、pH 6.5对SPSepharose池进行透析，直到计算得出起始缓冲液低于1％。
将rProtein A池的另一半注射到连接至
Figure BDA0003444809760000661
(通用健康生物科学公司)FPLC的Sephadex G-25(通用健康生物科学公司)柱上，该柱预先用20mM MES，pH 6.5平衡。该柱在10mM MES、150mM NaCl、pH 6.5中进行等度洗脱。
[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]分子(无接头)的PC分析
通过使用Nanodrop 2000c(赛默飞世尔科技公司)在280nm处测量UV吸光度来进行蛋白质定量。
通过以下来进行非还原SDS-PAGE分析：用含有100mM碘乙酰胺(西格玛奥德里奇公司,圣路易斯,密苏里州,美国)的SDS-PAGE样品缓冲液(赛默飞世尔科技公司)处理样品，然后直接加载到10％Tris-Gly凝胶并按照制造商方案运行。通过用SDS-PAGE样品缓冲液和样品还原剂(赛默飞世尔科技公司)处理样品来进行还原SDS-PAGE分析。样品在85℃孵育5分钟，然后加载到10％Tris-Gly凝胶上并按照制造商方案运行。根据制造商的微波方案，使用SimplyBlue SafeStain(赛默飞世尔科技公司)对凝胶进行染色。
HPLC SEC分析如下进行：在连接到安捷伦1290Infinity HPLC***(安捷伦科技公司,圣克拉拉,加利福尼亚州,美国)的Zenix-C SEC-300、7.8x 300mm柱(Sepax技术公司(Sepax Technologies Inc.),纽瓦克(Newark),德克萨斯州,美国)上，运行等度50mMNaH2PO4、250mM NaCl、pH 6.9流动相，流速为1mL/min，并在280nm处观察UV吸光度。
[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]分子(无接头)的DAS分析
变性LC-MS：所有LC-MS数据均在配备1290Infinity Lc***的安捷伦6230TOF LC/MS***上采集。色谱分离是使用在75℃操作的Zorbax SB300-C8 3.5μm 2.1x50mm柱实现的。所用溶剂如下：流动相A是含有0.1％v/v TFA的水。流动相B是含有0.1％v/v TFA的90％正丙醇。初始梯度条件是20％流动相B，从0.0到1.0分钟；1.0到9.0分钟，20-70％流动相B；9.0-10.0分钟，70-100％流动相B，在那里它在100％再保持1分钟。流速为0.2mL/min。每次分析都将大约5μg的IgG1-生物素缀合物加载到LC-MS***上。在m/z范围1000-7000内采集数据。源碎裂器、分离器和八极杆1RF值分别为：460V、95V和800V(峰-到-峰)。ESI毛细管电压为5.9kV。气体温度为340℃。干燥气体为13L/min。雾化器为25psig。校准使用安捷伦TuneMix，使用通过MassHunter Data Acquisition B.06.01版本6.01.6157实施的自动校准程序执行Oa-ToF。
[655-341Ab]＝[[LX]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[LX]]2＝[655-341Ab]分子的表达如对[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]分子所述进行表达。
[655-341Ab]＝[[LX]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[LX]]2＝[655-341Ab]分子的纯化
将过滤后的细胞培养基注射在连接至
Figure BDA0003444809760000671
(通用健康生物科学公司)的rProtein A Fast Flow HiTrap柱(通用健康生物科学公司)和脱盐HiTrap柱(通用健康生物科学公司)串联纯化***(分别用DPBS和10mM MES 150mM NaCl，pH 6.5平衡)上。rProtein A柱用DPBS洗涤，并用100mM HOAc，pH 3.6逐步洗脱。rProtein A洗脱液在脱盐HiTrap柱上用10mM MES、150mM NaCl、pH 6.5进行缓冲液交换。
[655-341Ab]＝[[LX]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[LX]]2＝[655-341Ab]分子的DAS分析
如对[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]分子所述进行变性LC-MS。
(1)[[Fab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2,(2)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]和(3)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2分子的表达(共表达)
CHO-K1生长培养基由50％CS9培养基(非选择，美商安进公司专有)+50％ExCell302(SAFC生物科学公司(SAFC Biosciences)#14324C)+2mM L-谷氨酰胺(吉博公司(Gibco)#25030-081)组成。选择培养基由生长培养基+10ug/ml嘌呤霉素(吉博公司#A11138-03)+500μg/ml潮霉素(英杰公司#10687-010)组成。生产培养基由CHO-K1 6DCD(ATO培养基实验室(ATO Media Lab)，美商安进公司专有)组成。
转染试剂由Lipofectamine LTX(吉博公司#15338-100(p/n 94756))和Opti-MEMI减少血清培养基(吉博公司#31985-070)组成。生长条件是在36℃+5％CO2下在加湿培养箱中悬浮生长，该加湿培养箱使用通风摇瓶以120RPM振荡。转染程序如下。转染前一天，将宿主培养物分成7-10e5VCD/ml。DNA/Lipofectamine LTX复合物如下制备。4μg非线性DNA以24DWB(2.0μg GOI(目的基因)和2.0μg PB200(超活性转座酶))中的0.5ml Opti-MEM培养基中稀释。对于四个链转染，使用0.5ug的每条链和2.0μg PB200(高活性转座酶)，总共4.0μg/转染。对于三个链转染，使用0.66μg的每条链和2.0μg PB200(高活性转座酶)，总共4.0μg/转染。10μl Lipofectamine LTX在15ml聚丙烯管中的0.5ml Opti-MEM培养基中稀释，并且静置5分钟。然后将稀释的DNA与Lipofectamine LTX组合，并通过移液彻底混合。混合物在室温孵育15-20分钟，不时混合。然后将2e6个活细胞/转染转移到15-50ml聚丙烯管中，以1200rpm转速旋转5分钟，吸出培养基。然后通过完全重悬用1x PBS洗涤细胞并且以1200rpm旋转5分钟。然后吸出1x PBS，并且将细胞重悬在1ml Opti-MEM中(每个转染)。然后将1ml细胞添加到每个孔中，然后将DNA/LTX复合物逐滴添加到每个孔中。将细胞在235rpm、36℃+5％CO2振荡孵育5-6小时。然后将2.0ml非选择生长培养基(CHO-K1培养基)添加到细胞中。转染后72小时的选择是通过将细胞置于4ml选择培养基中并完全重悬来完成的。通过将来自DWB培养物的1.6ml直接添加到50ml通风离心管中的12ml中，进行第6天的扩增规模放大。第10天的生产是通过将约13ml N-1培养物重新悬浮在生产培养基中来接种40ml批量生产来完成的。第17天的收获是通过细胞的离心分离然后对条件培养基的无菌过滤来进行的。
[[Fab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2分子的纯化(共表达)
Fab-TTR融合蛋白包括C末端6x his-标签，并通过IMAC亲和色谱(1ml HisTrapExcel,通用健康医疗公司(GE Healthcare)；17-3712-05)以2ml/分钟的流速从CM捕获。然后用5CV的20mM磷酸钠、250mM氯化钠、pH 7.4以4ml/分钟的流速洗涤IMAC柱，通过用20mM磷酸钠、250mM氯化钠、0.5M咪唑，pH 7.4以2ml/分钟进行逐步蛋白质洗脱。在下一次上样之前，IMAC柱用6M盐酸胍、50mM Tris，pH 8进行解吸，并用20mM磷酸钠、250mM氯化钠，pH 7.4进行平衡。
经由以2ml/分钟的流速通过5ml HiTrap脱盐柱(通用健康医疗公司；17-1408-01)，将所有纯化的蛋白质最终缓冲液交换为10mM MES、150mM氯化钠，pH 6。所有制备型色谱操作均使用
Figure BDA0003444809760000694
Purifiers(通用健康医疗公司)进行。然后使用分析方法的组合来表征产生的蛋白质的数量和质量，包括A280蛋白质定量、尺寸排阻色谱(SEC)、微毛细管电泳(MCE)和SDS-PAGE。
[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]和[Ab“A”]＝[负TTR]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2分子的纯化(共表达)
通过蛋白A亲和色谱(1ml MabSelect SuRe HiTrap,通用健康医疗公司,生物科学部(Bio-Sciences),马尔堡,马萨诸塞州,美国；11-0034-93)以2ml/分钟的流速从CM捕获抗体-TTR融合蛋白。然后用5CV的25mM Tris、100mM氯化钠，pH 7.4以4ml/分钟的流速洗涤蛋白A柱，通过用100mM乙酸，pH 3.6以2ml/分钟进行逐步蛋白质洗脱。在下一次上样之前，柱用6M盐酸胍、50mM Tris，pH 8进行解吸，并用25mM Tris、100mM氯化钠，pH 7.4进行平衡。
经由以2ml/分钟的流速通过5ml HiTrap脱盐柱(通用健康医疗公司；17-1408-01)，将所有纯化的蛋白质最终缓冲液交换为10mM MES、150mM氯化钠，pH 6。所有制备型色谱操作均使用
Figure BDA0003444809760000695
Purifiers(通用健康医疗公司)进行。
(1)[[Fab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2,(2)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]和(3)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2分子的PC分析(共表达)
A280定量-通过使用Multiskan Go(赛默飞世尔科技公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)在280nm处测量UV吸光度来进行蛋白质定量。
SEC-TTR融合蛋白样品在100mM磷酸钠、50mM氯化钠、7.5％乙醇、pH 6.9的流动相中以0.4ml/分钟的流速施加到ACQUITY UPLC BEH
Figure BDA0003444809760000693
1.7μm、4.6x 300mm SEC柱(沃特斯公司(Waters),米尔福德(Milford),马萨诸塞州,美国；186005226)并且观察280nm处的UV吸光度。使用1290Infinity HPLC(安捷伦科技公司,圣克拉拉,加利福尼亚州,美国)进行分析型SEC。由于这些TTR融合分子的大MW(249-347kDa)和产物相关杂质，利用MW基准分子来衡量特定融合分子的预期MW的近似SEC保留时间。这些基准分子是美商安进公司生产的分子，并且包括2种不同的抗体(每个145kDa；蛋白质批次BR4214-1和PL41591)、抗体-TTR异四聚体(635kDa；蛋白质批次PL38002)、抗体-TTR异二聚体(265kDa；蛋白质批次PL46796)和Fab-TTR异四聚体(248kDa；蛋白质批次PL38000)。
使用LabChip GXII(卡尺生命科学公司(Caliper LifeSciences),山景城,加利福尼亚州,美国)通过微毛细管电泳对TTR融合蛋白样品进行MCE表征。根据制造商的指导方针，制备还原和非还原样品。微流控芯片技术可自动对蛋白质样品进行染色、脱色、电泳分离和分析。
SDS-PAGE-TTR融合蛋白样品在各种Tris-甘氨酸、一维凝胶上运行，包括8％、10％和4-20％(英杰公司,卡尔斯巴德(Carlsbad),加利福尼亚州,美国；Wedge Well：分别为XP00080、XP00100、XP04200)。制备未还原(未加热或在85℃加热10分钟)的样品。使用SimpyBlue SafeStain(英杰公司；LC6060)对凝胶进行染色，并与MW参考标准进行比较，以鉴定所期望的产物条带。
(1)[[Fab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2,(2)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]和(3)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2分子的DAS分析(共表达)
如对[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”]分子所述进行变性LC-MS。
SEC-原初-MS：所有QToF实验均在以正ESI模式运行的Synapt G1 HDMS仪器上进行。该仪器已转换为RF限制漂移管仪器，类似于Bush等人,Anal Chem[分析化学]2010,82:9557-9565中描述的那样。所有临界仪器电压和压力如下：毛细管电压3.1kV；样品锥孔200V，提取锥孔1V；源块温度25℃；阱碰撞能量50V；传输碰撞能量20V；阱入口2.0V；阱偏置5V；阱出口0.0V；IMS入口-20V；IMS出口21V；传输入口1.0V；传输出口1.0V；传输速度248m/sec；传输波幅3.0V；源RF幅(峰-到-峰)450V；三波RF幅(峰-到-峰)阱380V，IMS 250V，传输380V；源背压6.0mbar；阱/传输压力cC4F8，2.00e-2mbar(指示的皮拉尼规；流速4.0mL/min)。通过MassLynx 4.1SCN 872进行仪器控制和数据采集。
SEC使用Agilent 1200泵***和2.1x50mm、
Figure BDA0003444809760000711
Waters BEH在环境温度下以75μL/min的流速运行。流动相为200mM醋酸铵。SEC分离是通过等度6分钟的方法进行的。注射25-50μg材料进行分析。使用了200mM醋酸铵，因为它是挥发性缓冲液，因此与质谱仪兼容。仪器控制通过ChemStation进行。
以下技术用于生成包含每个TTR亚基具有两个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体(“C10A/K15A/XX/YY”)的TTR负和正构建体具有包含两个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体的Fab TTR二聚体的克隆
使用与描述(1)[Ab“A”]＝[负TTR]2:[正TTR]2＝[Ab“B”](2X Ab-TTR)；(2)[[Ab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Ab“B”]]2(4X Ab-TTR)；和(3)[[Fab“A”]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[Fab“B”]]2(4X Fab-TTR)分子(无接头)的克隆的部分中描述的方法类似的方法，完成具有包含两个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体的Fab TTR二聚体的克隆。
具有包含两个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体的Fab TTR二聚体的表达
以50ml规模进行转染。HEK 293-6E细胞在25mm振动直径的振动器上的培养箱(5％CO2，80％-90％湿度和120rpm搅拌)中的摇瓶中在36℃在FreeStyle F17培养基(赛默飞世尔科技公司)(补充有0.1％(w/v)泊洛沙姆188(西格玛奥德里奇公司)、6mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司)、25μg/ml G418(赛默飞世尔科技公司))中培养。293-6E细胞在转染前2天以0.4x106个细胞/ml接种。在转染当天，细胞处于指数生长期(约1.5x106个细胞/ml，>95％存活率)。通过添加0.5mg/L DNA和2mg/L PEI Max(聚乙烯亚胺Max，聚合科学公司(Polysciences)，Cat#24765-2)的混合物至细胞培养物来进行瞬时转染。转染后4小时添加专有进料{酵母酸盐(0.5％w/v)和葡萄糖(3g/L)}。转染后6天，通过将细胞以4000rpm(3485x g)离心40分钟来收获产物。用0.45μM PES(聚醚砜)过滤器过滤上清液。
具有包含两个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体的Fab TTR二聚体的纯化
将过滤后的细胞培养基注射在连接至
Figure BDA0003444809760000712
(通用健康生物科学公司)的HisTrap excel柱(通用健康生物科学公司)和脱盐HiTrap柱(通用健康生物科学公司)串联纯化***(分别用20mM磷酸钠、500mM NaCl、pH 7.4和10mM MES 150mM NaCl、pH 6.0平衡)上。HisTrap excel柱用20mM磷酸钠、500mM NaCl、pH 7.4洗涤，然后用20mM磷酸钠、500mMNaCl、500mM咪唑、pH 7.4逐步洗脱。HisTrap xcel洗脱液在脱盐HiTrap柱上用10mM MES、150mM NaCl、pH 6.0进行缓冲液交换。
具有包含两个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体的Fab TTR二聚体的PC
通过使用MultiSkan FC微孔板光度计(赛默飞世尔科技公司)在280nm处测量UV吸光度来进行蛋白质定量。
根据制造商的方案，使用Protein Express Assay LabChip(珀金埃尔默公司)在Caliper LabChip GXII***上进行非还原和还原微毛细管电泳分析。
HPLC SEC分析如下进行：在连接到安捷伦1290Infinity HPLC***(安捷伦科技公司)的ACQUITY UPLC BEH450 SEC 2.5μm 7.8x 300mm柱(沃特斯公司(Waters Corp.),米尔福德,马萨诸塞州,美国)上，运行等度100mM NaH2PO4、50mM NaCl、7.5％EtOH、pH 6.9流动相，流速为0.4mL/min，并在280nm处观察UV吸光度。
[[Fab“A”]-[双负TTR]]和[[双正TTR]-[Fab“B”]]的异二聚化：单独产生的构建体的混合和分析
通过用10mM MES、150mM NaCl、pH 6.0稀释，将纯化的TTR-Fab样品归一化为0.2mg/mL。将样品以等体积合并，并在4℃孵育过夜。通过HPLC-SEC分析所得分子混合物。
[[Fab“A”]-[双负TTR]]和[[双正TTR]-[Fab“B”]]的共表达
转染单独进行，完成后(1-4小时后)，将[[Fab“A”]-[双负TTR]]和[[双正TTR]-[Fab“B”]]构建体以4ml规模一起合并和生产。HEK 293-6E细胞在25mm振动直径的振动器上的培养箱(5％CO2，80％-90％湿度和120rpm搅拌)中的摇瓶中在36℃在FreeStyle F17培养基(赛默飞世尔科技公司)(补充有0.1％(w/v)泊洛沙姆188(西格玛奥德里奇公司)、6mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司)、25μg/ml G418(赛默飞世尔科技公司))中培养。293-6E细胞在转染前2天以0.4x106个细胞/ml接种。在转染当天，细胞处于指数生长期(约1.5x106个细胞/ml，>95％存活率)。通过添加0.5mg/L DNA和2mg/L PEI Max(聚乙烯亚胺Max，聚合科学公司(Polysciences)，Cat#24765-2)的混合物至细胞培养物来进行瞬时转染。转染后4小时添加专有进料{酵母酸盐(0.5％w/v)和葡萄糖(3g/L)}。转染后6天，通过将细胞以4000rpm(3485x g)离心40分钟来收获产物。用0.45μM PES(聚醚砜)过滤器过滤上清液。
共表达的[[Fab“A”]-[双负TTR]]和[[双正TTR]-[Fab“B”]]的纯化
将过滤后的细胞培养基注射在连接至
Figure BDA0003444809760000731
(通用健康生物科学公司)的HisTrap excel柱(通用健康生物科学公司)和脱盐HiTrap柱(通用健康生物科学公司)串联纯化***(分别用20mM磷酸钠、500mM NaCl、pH 7.4和10mM MES 150mM NaCl、pH 6.0平衡)上。HisTrap excel柱用20mM磷酸钠、500mM NaCl、pH 7.4洗涤，然后用20mM磷酸钠、500mMNaCl、500mM咪唑、pH 7.4逐步洗脱。HisTrap xcel洗脱液在脱盐HiTrap柱上用10mM MES、150mM NaCl、pH 6.0进行缓冲液交换。
共表达的[[Fab“A”]-[双负TTR]]和[[双正TTR]-[Fab“B”]]的PC分析
通过使用MultiSkan FC微孔板光度计(赛默飞世尔科技公司)在280nm处测量UV吸光度来进行蛋白质定量。根据制造商的方案，使用Protein Express Assay LabChip(珀金埃尔默公司)在Caliper LabChip GXII***上进行非还原和还原微毛细管电泳分析。HPLCSEC分析如下进行：在连接到安捷伦1290Infinity HPLC***(安捷伦科技公司)的ACQUITYUPLC BEH450 SEC 2.5μm 7.8x 150mm柱(沃特斯公司(Waters Corp.),米尔福德,马萨诸塞州,美国)上，运行等度100mM NaH2PO4、50mM NaCl、7.5％EtOH、pH 6.9流动相，流速为0.4mL/min，并在280nm处观察UV吸光度。
实例2：评估包含每个TTR亚基具有一个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体(“C10A/K15A/XX”)的TTR异四聚体-在大肠杆菌中产生
制备了TTR(SEQ ID NO:1)的18个TTR电荷变体(C10A/K15A/XX)以确定哪些电荷突变会导致TTR二聚体/二聚体界面的实质性排斥(参见图4)。每个TTR变体都包含C10A和K15A突变以及表示为“XX”的第三突变。在这些实验中，XX是K15R、L17R、V20R、R21E、G22R、S23R、P24R、D51R、S52R、I84R、T106R、A108R、S112R、Y114R、S115R、T119R、V121R或S123R。
TTR变体中的九个(P24R、I84R、L17R、V121R、V20R、G22R、S112R、T119R、Y114R和S115R)显示出TTR二聚体/二聚体界面的显著减弱，如通过以下事实所示：在SDS(离液剂)存在下，TTR四聚体在不加热的情况下分解为相应的TTR二聚体(参见图5，“非加热”凝胶)。如通过SEC评估，变体中的六个(V20R、G22R、S112R、T119R、Y114R和S115R)也在非变性(天然)条件下干扰二聚体/二聚体相互作用(参见图6)。此外，观察到四个变体(P24R、I84R、L17R和V121R)在非变性SEC条件下主要形成TTR四聚体，并显示出较低的解链温度，再次表明这些变体中的二聚体/二聚体界面减弱。
选择最有利的六个二聚体/二聚体界面突变位点(图6，红色)来生成另外的TTR变体，以评估包含两个不同TTR单体序列的TTR异四聚体的形成。在这些实验中，所期望的TTR异四聚体包含[1]一个TTR二聚体，其本身由两个TTR单体组成，每个单体都是“负”TTR变体；和[2]一个TTR二聚体，它本身由两个TTR单体组成，每个单体都是“正”TTR变体。根据它们在SEC和SDS-PAGE条件下形成异四聚体的能力，选择有利的六个二聚体/二聚体界面突变位点。选择在SDS-PAGE条件下主要导致二聚体形成的突变位点作为初始截止值(即L17R、V121R、V20R、G22R、S112R、T119R、Y114R和S115R)。由于蛋白质产量明显较低，Y114R和S115R不再考虑。
负TTR变体包含C10A/K15A/XX突变，其中每个XX是L17D、L17E、V20D、V20E、G22D、G22E、S112D、S112E、T119D、T119E、V121D或V121E。类似地，正TTR变体包含C10A/K15A/XX突变，其中每个XX是L17R、L17K、V20R、V20K、G22R、G22K、S112R、S112K、T119R、T119K、V121R或V121K。因此，总共产生了24个电荷界面变体(12个负和12个正)(图7)。
正变体与负变体(以配对方式)混合，并通过SDS-PAGE和SEC评估TTR异四聚体的形成。变体配对中的许多显示出一些形成所期望异四聚体的倾向，如图7中的非零SEC值所示(该值代表异四聚体形成的％)。事实上，一些配对显示出非常高的形成异四聚体的倾向，其中具有40-100％四聚体形成。
如SDS-PAGE结果所示，这些TTR异四聚体中的许多都能抵抗离液SDS的分解，也如图7所示。表现出形成稳定异四聚体的高倾向的正/负配对(交叉参考SEC和SDS-PAGE数据)包括：L17R/T119D、L17K/T119D、L17K/V121E、V20R/V20D、V20R/V20E、V20K/V20D、V20K/V20E、V121R/L17D、V121R/L17E和V121K/L17D。
显示出形成稳定TTR四聚体的高倾向的正/负配对通过SDS-PAGE进一步评估。在这个实验中，对于每个配对，评估了[1]负(即碱性)变体；[2]正(即酸性)变体；[3]负和正变体的组合(应形成四聚体)；和[4]暴露于半胱天冬酶的负和正变体的组合(图8)。如图8所示，分开的负和正变体迁移到凝胶底部，而负和正变体的组合仅在凝胶中向下迁移了一部分。这进一步表明，负和正变体在组合后形成高分子量种类(HMW)-可能是所期望的异四聚体。用半胱天冬酶(由于包含DEVD序列，它只从正变体上切割多组氨酸标签)处理负和碱性变体的组合产生了一条基本均匀的带，其运行比未切割的四聚体略低，表明存在正组分并显示四聚体大多是均匀的并且可能是异四聚体。
然后将包含L17R/T119D、L17K/T119D、L17K/V121E、V20R/V20D、V20R/V20E、V20K/V20D、V20K/V20E、V121R/L17D、V121R/L17E和V121K/L17D配对的异四聚体暴露于pH 5.0的条件，以确定它们是否可以在与药物配制品中发现的那些条件相似的条件下保持四聚体状态(通过SEC)(图9)。实际上，图9中的单峰表明异四聚体能够保持其四聚体状态。
评估了三个异四聚体的解链温度。在每种情况下，异四聚体在至少92℃都是稳定的，这表明异四聚体是非常热稳定的(图10)。
实例3：评估包含每个TTR亚基具有一个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体(“C10A/K15A/XX”)的TTR异四聚体Fab、Ab和混合Fab/Ab构建体-在哺乳动物细胞中产生
评估了形成TTR异四聚体Fab、Ab和混合Fab/Ab构建体的能力。在这些构建体中，包含两个正TTR变体和两个负TTR变体(如上所述)的TTR四聚体可用于产生附接到四个Fab、2个Ab或1个Ab和2个Fab的TTR异四聚体。分别参见图2a、2b和2c。Fab构建体中的电荷对突变可用于驱动正确的HC/LC Fab配对。这种TTR异四聚体构建体的一个益处是它们允许通过将TTR单体单元融合到Ab和/或Fab的C末端来组装多个抗原靶向部分(例如，Ab和/或Fab)。这将Ab和/或Fab定向，使得它们的抗原结合结构域不太可能遭受在其他二价双特异性平台(例如，IgG-Fab和IgG scFv构建体)中看到的空间干扰，这通常是由于Fab或scFv N末端与IgG的C末端的融合。
TTR异四聚体Ab构建体
产生了双特异性TTR异四聚体Ab构建体。在这些构建体中，一种Ab(655-341Ab)特异于人TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)受体2(TR-2，死亡受体5)的细胞外结构域，而另一种Ab(DNP-3B1)特异于DNP。示例性双特异性TTR异四聚体Ab构建体显示在图11中，其中655-341Ab的每条重链(线填充)附接至负TTR单体的N末端(一起形成负TTR二聚体)并且DNP-3B1 Ab的每条重链(实心填充)附接至正TTR单体的N末端(一起形成正TTR二聚体)。
四个负TTR变体与655-341Ab融合，并且四个正TTR变体与DNP-3B1 Ab融合(图11)。所有Ab-TTR融合物均在Ab和TTR单体之间没有接头的情况下产生。这些变体是在哺乳动物细胞(293-6E HEK细胞)中产生的，用于分泌到培养基中。生成了两组转化细胞：一组产生655-341Ab/负TTR融合物([655-341Ab]＝[负TTR]2)，一组产生DNP-3B1 Ab/正TTR融合物([正TTR]2＝[DNP-3B1 Ab])。
有趣的是，与大肠杆菌(实例2)中产生的TTR四聚体相反，大量的分泌构建体是：自缔合的655-341Ab/负TTR融合物(即[655-341Ab]＝[负TTR]2:[负TTR]2＝[655-341Ab])，自缔合的DNP-3B1 Ab/正TTR融合物(即，[DNP-3B1 Ab]＝[正TTR]2:[正TTR]2＝[DNP-3B1Ab])，或其他HMW种类。游离655-341Ab/负TTR融合物([655-341Ab]＝[负TTR]2)和DNP-3B1Ab/正TTR融合物([正TTR]2＝[DNP-3B1Ab])占分泌的构建体的11-32％(图12)。快速缓冲液交换减少了HMW种类的数量，尽管这主要导致自缔合种类的增加。
使用相同的八个电荷变体研究了在Ab重链和TTR单体之间添加接头的影响。评估了大小为2-10个氨基酸的五个接头(图13)。主要分泌的含有接头的Ab/TTR融合物种类再次是自缔合的(例如，[655-341Ab]＝[[LX]:[负TTR]]2:[[负TTR]:[LX]]2＝[655-341Ab])和HMW种类。游离655-341Ab/负TTR融合物和DNP-3B1 Ab/正TTR融合物([655-341Ab]＝[[LX]:[负TTR]]2和[[正TTR]:[LX]]2＝[DNP-3B1 Ab])占分泌的构建体的高达31％(图14和15)。值得注意的是，较短的接头通常会导致更高的效价和产率(即更多的蛋白质产生)和更低水平的HMW种类(图16)。此外，负TTR融合物产生适度更高的产率和更低的HMW种类水平。含有接头的Ab-TTR融合物均未形成游离655-341Ab/负TTR融合物或DNP-3B1 Ab/正TTR融合物作为主要产物。其他观察结果包括较短的接头产生了更高水平的抗SDS的自缔合Ab/TTR融合物；V20K、V20R和V121K产生更高水平的易受SDS影响的自缔合Ab/TTR融合物；T119D、V20D、V121E和L17D产生的融合物具有更高的效价/产率和减少量的游离Ab/TTR融合物；以及负变体似乎产生更低数量的HMW种类。
根据这些观察结果，假设哺乳动物细胞可能无法有效地产生“未四聚化”的TTR。也就是说，哺乳动物细胞可能难以产生[655-341Ab]＝[负TTR]2或[正TTR]2＝[DNP-3B1 Ab](有或没有接头)，因为此类构建体仅包含两个TTR单体(与具有四个TRR单体的天然TTR相比)。为了对此进行研究，在哺乳动物细胞系(CHO K1)中共同生产了655-341Fab/负TTR融合物和DNP-3B1 Fab/正TTR融合物的五种组合。在这些构建体中，Fab HC通过GG接头附接到TTR(图17)。
[655-341Fab]-[GG]-[负TTR]和[正TTR]-[GG]-[DNP-3B1 Fab]在CHO K1中的共同生产导致所期望的[[655-341Fab]-[GG]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[GG]-[DNP-3B1Fab]]2的显著形成(78-88％)和减少量的HMW种类(在每种情况下都低于5％)(图18)。对所有突变配对，发现Fab形成都非常有效，尽管L17D/V121R显示稍微的益处。此外，似乎V20R/V20D配对可能形成较弱的异四聚体，其可以被SDS破坏。
使用Ab-和Fab-TTR融合物以及未融合的Ab作为SEC标准，可以看出分子15524([655-341Fab]-[GG]-[TTR(C10A/K15A/L17D)]和[TTR(C10A/K15A/V121R)]-[GG]-[DNP-3B1 Fab])具有与4X-Fab同源多聚体相似的保留时间，并且比针对2X-Fab-TTR融合物(应在对照Ab之后洗脱)所预期的明显更短(图19)。此外，当15524通过SEC耦合MS评估时，洗脱种类的分子量与预期一致(图20)。
采取相同的方法来确定含Ab的TTR融合物的共表达是否会导致产生所期望的TTR异四聚体[655-341Ab]＝[[LX]-[负TTR]]2:[[正TTR]-[LX]]2＝[DNP-3B1 Ab]。测试了总共五个TTR电荷变体和三个接头长度(X＝0、4和10个氨基酸)，总共15种组合(图21)。对于组成组合中的许多，形成了大量所期望的TTR异四聚体，高达70％(图22)。此外，与0个氨基酸的接头相比，4个氨基酸的接头产生更高的效价和产率。使用Ab-和Fab-TTR融合物以及未融合的Ab作为SEC标准，可以看出观察到分子15539([655-341Ab]＝[[GGAGGGAGGG]-[TTR(C10A/K15A/L17D]]2:[[TTR(C10A/K15A/V121K)]-[GGAGGGAGGG]]2＝[DNP-3B1 Ab])的主峰保留时间几乎与2X-Ab-TTR同多聚体的主峰保留时间相同(图23)。此外，当通过SEC耦合MS评估构建体时，洗脱种类的分子质量与所期望的TTR异四聚体的分子质量一致(图24)。据观察，平均而言，L4接头似乎导致良好的产率以及所期望产物的良好优先生产。此外，L17K/T119D、V20K/V20D和V20R/V20D突变组合似乎导致高表达和产率。最后，L17K/V121E、V121K/L17D和V20K/V20D突变组合似乎最能驱动所期望的TTR异四聚体组装。参见图25。
我们接下来试图确定在同一细胞系中与Ab和Fab融合的负和正TTR变体(每个突变的4个)的共表达是否会导致产生Ab-Fab-TTR构建体(即，[Ab“A”]＝[负TTR]2:[[正TTR]＝[Fab“B”]]2构建体)。测试了总共五个TTR变体与三个接头长度(X＝0、4和10个氨基酸)和两个Ab/Fab的组合-总共30种组合(图26)。对于这些组合中的许多，基于SEC形成所期望的Ab-Fab-TTR构建体的Ab融合物的数量高达45.6％(图27)。此外，与0个氨基酸的接头相比，4个氨基酸和10个氨基酸的接头似乎产生更多的所期望的Ab-Fab-TTR构建体(基于效价和纯化产率)。使用Ab-和Fab-TTR融合物以及未融合的Ab作为SEC标准，可以观察到分子15545([655-341Ab]＝[[GGGG]-[TTR(C10A/K15A/V20D)]]2:[[TTR(C10A/K15A/V20R)]-[GG]-[DNP-3B1-Fab]]2)正如预期的那样产生了一个在2X-Ab-TTR同多聚体和4X-Fab-TTR同多聚体之间具有保留的峰(图28)。此外，当通过SEC耦合MS评估该分子时，洗脱种类的分子量与所期望的构建体一致(图29)。据观察，平均而言，L10接头在Ab-Fab-TTR构建体中是优选的。此外，L17K/T119D TTR突变似乎在Ab-Fab-TTR构建体中是优选的。参见图30。
实例4：评估包含每个TTR亚基具有两个TTR二聚体/二聚体界面突变的TTR变体(“C10A/K15A/XX/YY”)的TTR异四聚体Fab、Ab和混合Fab/Ab构建体-哺乳动物细胞中
具有两个带电界面突变的Ab-和Fab-TTR融合物是在哺乳动物细胞中分别产生的，如先前针对单电荷界面突变所述。效价、亲和后色谱产率和SEC性能如先前针对单电荷界面突变所述进行评估。然后将纯化的单电荷和双电荷界面变体以基质方式混合，并通过SEC评估混合物，如先前针对单电荷变体所述。
具有单电荷和双电荷界面突变的Ab-和Fab-TTR融合物是通过将哺乳动物细胞与带相反电荷的TTR变体共同培养而产生的，如先前针对单电荷界面突变所述。亲和后色谱产率和SEC性能如先前针对单电荷界面突变所述进行评估。
这些实验的结果可以在图31-40中找到。从图35和36中可以看出，与混合前单独产生的分子的单一混合物所产生的相比，某些变体组合产生了4X-Fab形成的显著增加(通过取混合前4X-Fab水平的平均值并从观察到的4X-Fab中减去该值来确定)。图37通过显示混合物的4X-Fab SEC峰远大于混合前4X-Fab峰来说明这一点。此外，某些共培养条件导致形成更高数量的4X-Fab(图38和39)。图40显示共培养的4X-Fab峰显著大于单独培养的分子的4X-Fab峰，表明在电荷对立变体存在的情况下4X-Fab形成可能增加。
Figure BDA0003444809760000791
Figure BDA0003444809760000801
Figure BDA0003444809760000811
Figure BDA0003444809760000821
Figure BDA0003444809760000831
Figure BDA0003444809760000841
Figure BDA0003444809760000851
Figure BDA0003444809760000861
Figure BDA0003444809760000871
Figure BDA0003444809760000881
下划线＝信号肽(信号肽可以从本文披露的任何氨基酸或核酸序列中去除。因此，对于本文所述的每个氨基酸和核酸序列，特别考虑了具有和不具有信号肽的序列)。
粗体＝CDR
粗体+下划线＝接头
斜体＝融合蛋白的TTR部分
序列表
<110> 安进公司
<120> 多特异性甲状腺素转运蛋白免疫球蛋白融合物
<130> A-2414-WO-PCT
<150> 62/871,247
<151> 2019-07-08
<160> 44
<170> PatentIn3.5版
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TTR AA
<400> 1
Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val
1 5 10 15
Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val
20 25 30
Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe
50 55 60
Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr
85 90 95
Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser
100 105 110
Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu
115 120 125
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠TTR AA
<400> 2
Gly Pro Ala Gly Ala Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val
1 5 10 15
Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Val Asp Val Ala Val Lys Val
20 25 30
Phe Lys Lys Thr Ser Glu Gly Ser Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys
35 40 45
Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Val Glu Gly Val Tyr Arg Val Glu Leu Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys
65 70 75 80
Thr Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu Phe Ala Asp Val Val Phe Thr
85 90 95
Ala Asn Asp Ser Gly His Arg His Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser
100 105 110
Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Asn Pro Gln Asn
115 120 125
<210> 3
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠TTR NA
<400> 3
acagaagtcc actcattctt ggcaggatgg cttctcatcg tctgctcctc ctctgccttg 60
ctggactggt atttgtgtct gaggctggcc ctacgggcac cggtgaatcc aagtgtcctc 120
tgatggtcaa agttctagat gctgtccgag gcagtcctgc catcaatgtg gccgtgcatg 180
tgttcagaaa ggctgctgat gacacctggg agccatttgc ctctgggaaa accagtgagt 240
ctggagagct gcatgggctc acaactgagg aggaatttgt agaagggata tacaaagtgg 300
aaatagacac caaatcttac tggaaggcac ttggcatctc cccattccat gagcatgcag 360
aggtggtatt cacagccaac gactccggcc cccgccgcta caccattgcc gccctgctga 420
gcccctactc ctattccacc acggctgtcg tcaccaatcc caaggaatga gggacttctc 480
ctccagtgga cctgaaggac gagggatggg atttcatgta accaagagta ttccattttt 540
actaaagcac tgttttcacc tcatatgcta tgttagaagt ccaggcagag acaataaaac 600
attcctgtga aaggc 615
<210> 4
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP 3B1 Ab LC AA
<400> 4
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Glu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 5
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Ab LC NA
<400> 5
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctga aggagacaga 120
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagcccctaa gcgcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240
ccattaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300
cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagtata atagttaccc gtggacgttc 360
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
<210> 6
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP 3B1 Ab LC AA w/CPM S230E (EU S176E)
<400> 6
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Glu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Glu Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 7
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP 3B1 Ab LC NA w/CPM S230E (EU S176E)
<400> 7
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctga aggagacaga 120
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagcccctaa gcgcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240
ccattaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300
cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagtata atagttaccc gtggacgttc 360
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cgaaagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
<210> 8
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP 3B1 Ab HC AA
<400> 8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn
65 70 75 80
Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 9
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP 3B1 Ab HC NA
<400> 9
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg ttaagccttc ggagaccctg 120
tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc atcagtagtt actactggag ctggatccgg 180
cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gaacaccaac 240
tccaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 300
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaacc 360
tactatgata gtagtggtta ctactaccgt gcttttgata tctggggcca agggacaatg 420
gtcaccgtct ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720
aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 780
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1320
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gt 1422
<210> 10
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Ab HC AA
w/CPM S230K (EU S183K)
<400> 10
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn
65 70 75 80
Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Lys Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 11
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Ab HC NA w/CPM S230K (EU S183K)
<400> 11
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg ttaagccttc ggagaccctg 120
tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc atcagtagtt actactggag ctggatccgg 180
cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gaacaccaac 240
tccaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 300
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaacc 360
tactatgata gtagtggtta ctactaccgt gcttttgata tctggggcca agggacaatg 420
gtcaccgtct ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc aagagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720
aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 780
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1320
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gt 1422
<210> 12
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab HC AA
<400> 12
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn
65 70 75 80
Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
245
<210> 13
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab HC AA
<400> 13
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg ttaagccttc ggagaccctg 120
tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc atcagtagtt actactggag ctggatccgg 180
cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gaacaccaac 240
tccaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 300
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaacc 360
tactatgata gtagtggtta ctactaccgt gcttttgata tctggggcca agggacaatg 420
gtcaccgtct ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720
aagaaagttg agcccaaatc ttgt 744
<210> 14
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab HC AA w/CPM S230K (EU S183K)
<400> 14
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn
65 70 75 80
Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Lys Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
245
<210> 15
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab HC NA w/CPM S230K (EU S183K)
<400> 15
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg ttaagccttc ggagaccctg 120
tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc atcagtagtt actactggag ctggatccgg 180
cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gaacaccaac 240
tccaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 300
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaacc 360
tactatgata gtagtggtta ctactaccgt gcttttgata tctggggcca agggacaatg 420
gtcaccgtct ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc aagagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720
aagaaagttg agcccaaatc ttgt 744
<210> 16
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab LC AA
<400> 16
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
100 105 110
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 17
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab LC NA
<400> 17
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gggtattagt agaagcgaat tagcctggta ccagcagaaa 180
cctggccagg ctcccagcct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcaa caatttggta gttcaccgtg gacgttcggc 360
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gctagcgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705
<210> 18
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab LC AA w/CPM S230K (EU S176K)
<400> 18
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
100 105 110
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 19
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab LC NA w/CPM S230K (EU S176K)
<400> 19
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gggtattagt agaagcgaat tagcctggta ccagcagaaa 180
cctggccagg ctcccagcct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcaa caatttggta gttcaccgtg gacgttcggc 360
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gctagcgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcaa gagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705
<210> 20
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab HC AA
<400> 20
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 21
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab HC NA
<400> 21
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtgattact tctggagctg gatccgccag 180
ctcccaggga agggcctgga gtggattggg cacatccata acagtgggac cacctactac 240
aatccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa gcagttctcc 300
ctgaggctga gttctgtgac tgccgcggac acggccgtat attactgtgc gagagatcga 360
gggggtgact acgcttatgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagcctcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1410
<210> 22
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab HC AA w/CPM S230E (EU S183E)
<400> 22
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Glu Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 23
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab HC NA w/CPM S230E (EU S183E)
<400> 23
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtgattact tctggagctg gatccgccag 180
ctcccaggga agggcctgga gtggattggg cacatccata acagtgggac cacctactac 240
aatccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa gcagttctcc 300
ctgaggctga gttctgtgac tgccgcggac acggccgtat attactgtgc gagagatcga 360
gggggtgact acgcttatgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagcctcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcga gagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1410
<210> 24
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab HC AA
<400> 24
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys
<210> 25
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab HC NA
<400> 25
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtgattact tctggagctg gatccgccag 180
ctcccaggga agggcctgga gtggattggg cacatccata acagtgggac cacctactac 240
aatccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa gcagttctcc 300
ctgaggctga gttctgtgac tgccgcggac acggccgtat attactgtgc gagagatcga 360
gggggtgact acgcttatgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagcctcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gt 732
<210> 26
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab HC AA w/CPM S230E (EU S183E)
<400> 26
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Glu Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys
<210> 27
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab HC NA w/CPM S230E (EU S183E)
<400> 27
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtgattact tctggagctg gatccgccag 180
ctcccaggga agggcctgga gtggattggg cacatccata acagtgggac cacctactac 240
aatccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa gcagttctcc 300
ctgaggctga gttctgtgac tgccgcggac acggccgtat attactgtgc gagagatcga 360
gggggtgact acgcttatgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagcctcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcga gagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gt 732
<210> 28
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Ab LC NA (TTR 构建体)
<400> 28
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctga aggagacaga 120
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagcccctaa gcgcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240
ccattaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300
cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagtata atagttaccc gtggacgttc 360
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
<210> 29
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Ab LC AA (TTR 构建体)
<400> 29
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Glu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 30
<211> 1809
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Ab HC NA (TTR 构建体)
<400> 30
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg ttaagccttc ggagaccctg 120
tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc atcagtagtt actactggag ctggatccgg 180
cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gaacaccaac 240
tccaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 300
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaacc 360
tactatgata gtagtggtta ctactaccgt gcttttgata tctggggcca agggacaatg 420
gtcaccgtct ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720
aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 780
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1320
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtggaggcgg tccaactggt 1440
actggtgaat ctaaagctcc tcttatggtt gcagtcaaag atgctgttcg tggttccccg 1500
gcaattaatg ttgctgtaca tgttttccgt aaagctgctg acgacacctg ggaaccgttc 1560
gctagcggta aaacctccga atccggtgaa ctgcacggtc tgaccaccga agaagaattc 1620
gttgaaggta tctacaaagt tgaaatcgac accaaatcct actggaaagc tttgggtatc 1680
tccccgttcc acgaacacgc tgaagttgtt ttcaccgcta acgactccgg tccgcgtcgt 1740
tacacgatcg ctgctctgct gtccccgtac tcctactcca ccaccgctgt tgttaccaac 1800
ccgaaagaa 1809
<210> 31
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Ab LC AA (TTR 构建体)
<400> 31
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn
65 70 75 80
Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Pro Thr Gly
465 470 475 480
Thr Gly Glu Ser Lys Ala Pro Leu Met Val Ala Val Lys Asp Ala Val
485 490 495
Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala
500 505 510
Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser
515 520 525
Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile
530 535 540
Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile
545 550 555 560
Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser
565 570 575
Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr
580 585 590
Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu
595 600
<210> 32
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab LC NA (TTR 构建体)
<400> 32
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gggtattagt agaagcgaat tagcctggta ccagcagaaa 180
cctggccagg ctcccagcct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcaa caatttggta gttcaccgtg gacgttcggc 360
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gctagcgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705
<210> 33
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab LC AA (TTR 构建体)
<400> 33
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
100 105 110
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 34
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab HC NA (TTR 构建体)
<400> 34
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtgattact tctggagctg gatccgccag 180
ctcccaggga agggcctgga gtggattggg cacatccata acagtgggac cacctactac 240
aatccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa gcagttctcc 300
ctgaggctga gttctgtgac tgccgcggac acggccgtat attactgtgc gagagatcga 360
gggggtgact acgcttatgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagcctcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggaggcggtc caactggtac tggtgaatct 1440
aaagctcctc ttatggttgc agtcgatgat gctgttcgtg gttccccggc aattaatgtt 1500
gctgtacatg ttttccgtaa agctgctgac gacacctggg aaccgttcgc tagcggtaaa 1560
acctccgaat ccggtgaact gcacggtctg accaccgaag aagaattcgt tgaaggtatc 1620
tacaaagttg aaatcgacac caaatcctac tggaaagctt tgggtatctc cccgttccac 1680
gaacacgctg aagttgtttt caccgctaac gactccggtc cgcgtcgtta cacgatcgct 1740
gctctgctgt ccccgtactc ctactccacc accgctgttg ttaccaaccc gaaagaa 1797
<210> 35
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Ab LC AA (TTR 构建体)
<400> 35
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser
465 470 475 480
Lys Ala Pro Leu Met Val Ala Val Asp Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro
485 490 495
Ala Ile Asn Val Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr
500 505 510
Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His
515 520 525
Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu
530 535 540
Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His
545 550 555 560
Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg
565 570 575
Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala
580 585 590
Val Val Thr Asn Pro Lys Glu
595
<210> 36
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab LC NA (TTR 构建体)
<400> 36
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gggtattagt agaagcgaat tagcctggta ccagcagaaa 180
cctggccagg ctcccagcct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcaa caatttggta gttcaccgtg gacgttcggc 360
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gctagcgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705
<210> 37
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab LC AA (TTR 构建体)
<400> 37
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
100 105 110
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 38
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab HC NA (TTR 构建体)
<400> 38
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtgattact tctggagctg gatccgccag 180
ctcccaggga agggcctgga gtggattggg cacatccata acagtgggac cacctactac 240
aatccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa gcagttctcc 300
ctgaggctga gttctgtgac tgccgcggac acggccgtat attactgtgc gagagatcga 360
gggggtgact acgcttatgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagcctcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtggaggagg tccaactggt actggtgaat ctaaagctcc tcttatggtt 780
gcagtcgatg atgctgttcg tggttccccg gcaattaatg ttgctgtaca tgttttccgt 840
aaagctgctg acgacacctg ggaaccgttc gctagcggta aaacctccga atccggtgaa 900
ctgcacggtc tgaccaccga agaagaattc gttgaaggta tctacaaagt tgaaatcgac 960
accaaatcct actggaaagc tttgggtatc tccccgttcc acgaacacgc tgaagttgtt 1020
ttcaccgcta acgactccgg tccgcgtcgt tacacgatcg ctgctctgct gtccccgtac 1080
tcctactcca ccaccgctgt tgttaccaac ccgaaagaag gcggtcacca tcaccatcac 1140
cac 1143
<210> 39
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 655-341 Fab HC AA (TTR 构建体)
<400> 39
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Ala
245 250 255
Pro Leu Met Val Ala Val Asp Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile
260 265 270
Asn Val Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu
275 280 285
Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu
290 295 300
Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp
305 310 315 320
Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His
325 330 335
Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr
340 345 350
Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val
355 360 365
Thr Asn Pro Lys Glu Gly Gly His His His His His His
370 375 380
<210> 40
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab LC NA (TTR 构建体)
<400> 40
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60
cgctgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctga aggagacaga 120
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagcccctaa gcgcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240
ccattaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300
cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagtata atagttaccc gtggacgttc 360
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
<210> 41
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab LC AA (TTR 构建体)
<400> 41
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Glu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 42
<211> 1155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab HC NA (TTR 构建体)
<400> 42
Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Gly Thr Gly Cys
1 5 10 15
Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Gly
35 40 45
Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Gly Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala
85 90 95
Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly
100 105 110
Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys
115 120 125
Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr
130 135 140
Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr Thr
145 150 155 160
Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr
165 170 175
Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Gly
180 185 190
Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala
195 200 205
Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Thr Ala Thr Cys Thr Ala Thr Thr Ala
210 215 220
Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys
225 230 235 240
Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Ala
245 250 255
Ala Gly Ala Gly Thr Cys Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr
260 265 270
Ala Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Ala Cys Ala Cys Gly Thr Cys Cys
275 280 285
Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Cys
290 295 300
Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys Thr Gly Thr
305 310 315 320
Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Ala Cys Ala Cys Gly
325 330 335
Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly
340 345 350
Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala
355 360 365
Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys
370 375 380
Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala
385 390 395 400
Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys
405 410 415
Ala Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr
420 425 430
Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly
435 440 445
Gly Cys Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys
450 455 460
Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys
465 470 475 480
Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly
500 505 510
Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys
515 520 525
Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly
530 535 540
Thr Gly Ala Cys Gly Gly Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala
545 550 555 560
Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys
565 570 575
Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr
580 585 590
Thr Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala
595 600 605
Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Cys
610 615 620
Thr Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly
625 630 635 640
Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly
645 650 655
Cys Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly
660 665 670
Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly
675 680 685
Thr Gly Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly
690 695 700
Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys
705 710 715 720
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala
725 730 735
Ala Ala Thr Cys Thr Thr Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly
740 745 750
Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Thr
755 760 765
Gly Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys
770 775 780
Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Ala
785 790 795 800
Ala Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr
805 810 815
Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly
820 825 830
Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr
835 840 845
Cys Cys Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys
850 855 860
Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Thr
865 870 875 880
Thr Cys Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys
885 890 895
Cys Thr Cys Cys Gly Ala Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Ala Ala
900 905 910
Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala
915 920 925
Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Thr
930 935 940
Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala
945 950 955 960
Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala
965 970 975
Ala Ala Thr Cys Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys
980 985 990
Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Cys Gly
995 1000 1005
Thr Thr Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr
1010 1015 1020
Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Cys
1025 1030 1035
Gly Cys Thr Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr
1040 1045 1050
Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Thr Thr Ala Cys Ala Cys Gly
1055 1060 1065
Ala Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly
1070 1075 1080
Thr Cys Cys Cys Cys Gly Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys
1085 1090 1095
Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr
1100 1105 1110
Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala
1115 1120 1125
Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr
1130 1135 1140
Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys
1145 1150 1155
<210> 43
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP Fab HC AA (TTR 构建体)
<400> 43
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn
65 70 75 80
Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Pro Thr Gly Thr Gly
245 250 255
Glu Ser Lys Ala Pro Leu Met Val Ala Val Lys Asp Ala Val Arg Gly
260 265 270
Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp
275 280 285
Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu
290 295 300
Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys
305 310 315 320
Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro
325 330 335
Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro
340 345 350
Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr
355 360 365
Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu Gly Gly His His His His His
370 375 380
His
385
<210> 44
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TTR NA
<400> 44
ggtccaactg gtaccggtga atccaagtgt cctctgatgg tcaaagttct agatgctgtc 60
cgaggcagtc ctgccatcaa tgtggccgtg catgtgttca gaaaggctgc tgatgacacc 120
tgggagccat ttgcctctgg gaaaaccagt gagtctggag agctgcatgg gctcacaact 180
gaggaggaat ttgtagaagg gatatacaaa gtggaaatag acaccaaatc ttactggaag 240
gcacttggca tctccccatt ccatgagcat gcagaggtgg tattcacagc caacgactcc 300
ggcccccgcc gctacaccat tgccgccctg ctgagcccct actcctattc caccacggct 360
gtcgtcacca atcccaagga a 381

Claims (48)

1.一种甲状腺素转运蛋白(TTR)蛋白复合物，其中所述TTR蛋白复合物包含TTR亚基A、B、C和D；
其中TTR亚基A和B二聚化形成TTR二聚体AB；
其中TTR亚基C和D二聚化形成TTR二聚体CD；
其中TTR二聚体AB和CD进一步二聚化形成TTR四聚体ABCD；并且
其中A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以下除外：TTR二聚体AB和TTR二聚体CD之间的界面中的至少一个氨基酸被突变从而相比于形成ABAB四聚体或CDCD四聚体偏好形成ABCD四聚体。
2.根据权利要求1所述的TTR蛋白复合物，其中A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：C10A、K15A、或C10A和K15A突变。
3.根据权利要求1或2所述的TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的6、7、8、9、10、13、15、17、19、20、21、22、23、24、26、50、51、52、53、54、56、57、60、61、62、63、78、82、83、84、85、100、101、102、103、104、106、108、110、112、113、114、115、117、119、121、123、124、125、126和127。
4.根据权利要求3所述的TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，
其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸或谷氨酸。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，
其中所述氨基酸被突变为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A和B在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，
其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸或谷氨酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中C和D在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，
其中所述氨基酸被突变为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中：
A和B在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为天冬氨酸或谷氨酸；并且
C和D在选自以下列表的一个或多个氨基酸位置包含突变，该列表包括：SEQ ID NO:1的15、17、20、21、22、23、24、51、52、84、106、108、112、114、115、119、121和123，其中所述氨基酸被突变为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
10.根据权利要求1-7和9中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A和B包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：K15D、L17D、V20D、R21D、G22D、S23D、P24D、S52D、I84D、T106D、A108D、S112D、Y114D、S115D、T119D、V121D、S123D、K15E、L17E、V20E、R21E、G22E、S23E、P24E、D51E、S52E、I84E、T106E、A108E、S112E、Y114E、S115E、T119E、V121E和S123E。
11.根据权利要求10所述的TTR蛋白复合物，其中A和B包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：L17D、L17E、V20D、V20E、G22D、G22E、S112D、S112E、T119D、T119E、V121D和V121E。
12.根据权利要求1-6、8和9中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中C和D包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：K15R、L17R、V20R、G22R、S23R、P24R、D51R、S52R、I84R、T106R、A108R、S112R、Y114R、S115R、T119R、V121R、S123R、L17K、V20K、R21K、G22K、S23K、P24K、D51K、S52K、I84K、T106K、A108K、S112K、Y114K、S115K、T119K、V121K、S123K、K15H、L17H、V20H、R21H、G22H、S23H、P24H、D51H、S52H、I84H、T106H、A108H、S112H、Y114H、S115H、T119H、V121H和S123H。
13.根据权利要求12所述的TTR蛋白复合物，其中C和D包含SEQ ID NO:1中的至少一个突变，其中所述突变选自包括以下的列表：L17R、L17K、L17H、V20R、V20K、V20H、G22R、G22K、G22H、S112R、S112K、S112H、T119R、T119K、T119H、V121R、V121K和V121H。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个独立地包含一个所述突变。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A和B两者，C和D两者，或A、B、C和D中的所有四个独立地包含两个所述突变。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/G22K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/S112K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/T119K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/G22E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/S112E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/V121D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；或者
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中：
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R；
A和B两者包含C10A/K15A/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K；或者
A和B两者包含C10A/K15A/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：
A和B两者包含C10A/K15A/L17D/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E/V20E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R/V20R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/V20D/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20K/V121R；
A和B两者包含C10A/K15A/V20E/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R/V121K；或者
A和B两者包含C10A/K15A/V20E/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R/V121R。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中A、B、C和D中的每一个都包含SEQ ID NO:1的具有以下突变的氨基酸序列：
A和B两者包含C10A/K15A/V20E/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/V20R/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E/T119D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R/V121K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17E/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R/V20K；
A和B两者包含C10A/K15A/L17D/V20D，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17K/V20K；或者
A和B两者包含C10A/K15A/L17E/V121E，并且C和D两者包含C10A/K15A/L17R/V121R。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中所述TTR蛋白复合物附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白或肽。
21.根据权利要求20所述的TTR蛋白复合物，其中所述TTR蛋白复合物附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白或肽。
22.根据权利要求20或21所述的TTR蛋白复合物，其中所述抗原结合蛋白或肽在TTR亚基的C末端附接至该TTR蛋白复合物。
23.根据权利要求20或21所述的TTR蛋白复合物，其中所述抗原结合蛋白或肽在TTR亚基的N末端附接至该TTR蛋白复合物。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中所述TTR蛋白复合物：
直接附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白；或者
通过接头附接至1、2、3、4、5、6、7或8个抗原结合蛋白。
25.根据权利要求20-23中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中所述TTR蛋白复合物：
直接附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白；或者
通过接头附接至1、2、3或4个抗原结合蛋白。
26.根据权利要求25所述的TTR蛋白复合物，其中所述接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的基于氨基酸的接头。
27.根据权利要求26所述的TTR蛋白复合物，其中所述接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的基于氨基酸的接头。
28.根据权利要求27所述的TTR蛋白复合物，其中所述接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的基于氨基酸的接头。
29.根据权利要求28所述的TTR蛋白复合物，其中所述接头是包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的基于氨基酸的接头。
30.根据权利要求26所述的TTR蛋白复合物，其中所述接头是G、GG、GGG、GGGG、GGGGG、GGGGGG、GGGGGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGG或GGGGGGGGGG。
31.根据权利要求26所述的TTR蛋白复合物，其中所述接头是G(GxBy)rGz并且其中：
G＝甘氨酸；
B＝任何氨基酸；
x＝1-15；
y＝1-5；
z＝1-15；并且
r＝1-20。
32.根据权利要求30所述的TTR蛋白复合物，其中：
B＝Q、S、A、E、P、T、K、R、D或N；
x＝4；
y＝1；
z＝4；并且
r＝1。
33.根据权利要求26所述的TTR蛋白复合物，其中所述接头选自包括以下的列表：GG、GGGG、GGGSGG、GGGSGGGG和GGAGGGAGGG。
34.根据权利要求20-33中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中所述TTR蛋白复合物附接至两个抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合不同的抗原。
35.根据权利要求20-33中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中所述TTR蛋白复合物附接至四个抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合至少两个不同的抗原。
36.根据权利要求20-35中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中该抗原结合蛋白是抗体。
37.根据权利要求20-35中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中该抗原结合蛋白是Fab或scFv。
38.根据权利要求37所述的TTR蛋白复合物，其中该抗原结合蛋白是Fab。
39.根据权利要求20-35中任一项所述的TTR蛋白复合物，其中该抗原结合蛋白是抗体和Fab的混合物。
40.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1-39中任一项所述的TTR蛋白复合物。
41.一种治疗癌症的方法，该方法使用根据权利要求1-39中任一项所述的TTR蛋白复合物。
42.根据权利要求1-39中任一项所述的TTR蛋白复合物在治疗癌症中的用途。
43.根据权利要求1-39中任一项所述的TTR蛋白复合物，用于治疗癌症。
44.一种或多种分离的核酸，其编码根据权利要求1-39中任一项所述的TTR亚基、与抗原结合蛋白或肽(例如抗体或Fab)融合或连接的TTR亚基、或TTR蛋白复合物。
45.一种表达载体，该表达载体包含根据权利要求44所述的核酸。
46.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据权利要求44所述的核酸或根据权利要求45所述的载体。
47.根据权利要求45所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、E5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、人肝细胞癌细胞或人胚肾293(HEK 293)细胞。
48.一种制备根据权利要求1-39中任一项所述的TTR蛋白复合物的方法，所述方法包括：
a)培养根据权利要求46或47所述的重组宿主细胞；和
b)从所述培养物中分离该TTR蛋白复合物。
CN202080049750.1A 2019-07-08 2020-07-06 多特异性甲状腺素转运蛋白免疫球蛋白融合物 Pending CN114127125A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962871247P 2019-07-08 2019-07-08
US62/871,247 2019-07-08
PCT/US2020/040873 WO2021007150A1 (en) 2019-07-08 2020-07-06 Multispecific transthyretin immunoglobulin fusions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114127125A true CN114127125A (zh) 2022-03-01

Family

ID=71784719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080049750.1A Pending CN114127125A (zh) 2019-07-08 2020-07-06 多特异性甲状腺素转运蛋白免疫球蛋白融合物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220324924A1 (zh)
EP (1) EP3997112A1 (zh)
JP (1) JP2022540089A (zh)
KR (1) KR20220032065A (zh)
CN (1) CN114127125A (zh)
AU (1) AU2020310851A1 (zh)
CA (1) CA3140208A1 (zh)
MX (1) MX2021015976A (zh)
SG (1) SG11202112762TA (zh)
WO (1) WO2021007150A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4234695A1 (en) * 2022-02-24 2023-08-30 Sartorius BIA Separations d.o.o. Methods for the selective removal of contaminants during a process of purifying biologic agents

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255702A (zh) * 2013-12-20 2016-12-21 生物控股有限公司 基于抗体的对转甲状腺素蛋白(ttr)淀粉样变性的疗法及其人源抗体
CN107406500A (zh) * 2015-01-28 2017-11-28 普罗塞纳生物科学有限公司 抗甲状腺素运载蛋白抗体
WO2019070901A1 (en) * 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. IMMUNOGLOBULIN FUSIONS OF TRANSTHYRETIN

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US233A (en) 1837-06-14 Improvement in plows
US4447A (en) 1846-04-04 Car- wheel
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
EA012801B1 (ru) 2005-06-14 2009-12-30 Эмджен Инк. Самобуферирующиеся композиции белков
KR102010827B1 (ko) 2009-06-26 2019-08-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
WO2013180295A1 (ja) 2012-06-01 2013-12-05 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
WO2017083604A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Amgen Inc. Triazine mediated pharmacokinetic enhancement of therapeutics

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255702A (zh) * 2013-12-20 2016-12-21 生物控股有限公司 基于抗体的对转甲状腺素蛋白(ttr)淀粉样变性的疗法及其人源抗体
CN107406500A (zh) * 2015-01-28 2017-11-28 普罗塞纳生物科学有限公司 抗甲状腺素运载蛋白抗体
WO2019070901A1 (en) * 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. IMMUNOGLOBULIN FUSIONS OF TRANSTHYRETIN

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RICARDO SANT’ANNA等: "Cavity filling mutations at the thyroxine-binding site dramatically increase transthyretin stability and prevent its aggregation", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 7, pages 44709 *
邹丽云: "光甘草定与转甲状腺素蛋白野生型及V30A突变体相互作用的多种分子动力学模拟研究", 中国硕士学位论文全文数据库, no. 9 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220032065A (ko) 2022-03-15
MX2021015976A (es) 2022-02-10
CA3140208A1 (en) 2021-01-14
US20220324924A1 (en) 2022-10-13
SG11202112762TA (en) 2021-12-30
AU2020310851A1 (en) 2021-12-09
EP3997112A1 (en) 2022-05-18
WO2021007150A1 (en) 2021-01-14
JP2022540089A (ja) 2022-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102648966B1 (ko) Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
KR102665542B1 (ko) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 CD3 ABD 엽산 수용체 1(FolR1) 및 PD-1 축 결합 길항물질의 조합 요법
KR102282761B1 (ko) 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
KR101963923B1 (ko) 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
WO2010071208A1 (ja) 抗体の精製方法
CN108137698A (zh) 具有高亲和力的抗人cd19抗体
CN110845618A (zh) 双特异性t细胞活化抗原结合分子
KR20120125611A (ko) 이종이량체 결합 단백질 및 이의 용도
JP2015501291A (ja) ハイブリッド定常領域
TW201041594A (en) Compositions and methods for increasing muscle growth
CN115551894A (zh) 新型抗lilrb4抗体和衍生产物
CN112300280B (zh) 一种抗pd-1抗体及其医药用途
CN109415435B (zh) 新型抗体形式
CN115836088A (zh) 结合nkg2d、cd16和clec12a的蛋白质
CN114502595A (zh) 针对脊髓灰质炎病毒受体(pvr)的抗体及其用途
CN114127125A (zh) 多特异性甲状腺素转运蛋白免疫球蛋白融合物
JP2024012336A (ja) トランスサイレチン免疫グロブリン融合物
CA2943242A1 (en) Bi-specific antigen-binding polypeptides
WO2023025309A1 (zh) 一种cdc平台抗体
KR20230117379A (ko) 이종이량체 psma 및 cd3-결합 이중특이적 항체
EA046854B1 (ru) Продукты слияния транстиретина и иммуноглобулина
KR20210149796A (ko) Hiv 감염의 치료를 위한 교차 이중 가변 도메인(codv) 형태를 이용한 삼중특이적 및/또는 3가 결합 단백질
CN117136073A (zh) 使用识别tau的抗体的方法
CN115397854A (zh) 抗NKp30抗体及使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination