MX2014012889A - Anticuerpos e inmunoconjugados anti-pmel17. - Google Patents

Anticuerpos e inmunoconjugados anti-pmel17.

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MX2014012889A
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hvr
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acid sequence
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MX2014012889A
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Paul Polakis
William Mallet
Jyoti Asundi
Suzanna Clark
Youjun Chen
Christine Tan
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Genentech Inc
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Abstract

La invención proporciona anticuerpos e inmunoconjugados anti-PMEL17 y métodos para usarlos.

Description

ANTICUERPOS E I MU OCONJUGADOS A TI-PMEL17 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos e inmunoconjugados anti-PMEL17 y métodos para usarlos.
ANTECEDENTES La proteína melanocita PMEL17 es una proteína integral de membrana que se exporta del retículo endoplasmático al aparato de Golgi donde es glicosilado y finalmente traficado al melanosoma. La vía específica por la cual las PMEL17 maduras se desplazan al melanosoma ha sido tema de debate, sin embargo, es evidente que alguna parte de la proteína se presenta temporalmente en la superficie celular antes de su entrada a melanosomas de etapa I. Los melanosomas son unos orgánulos especializados relacionados con los lisosomas que producen pigmentos de melanina, que se depositan en fibrilos compuestos de fragmentos proteolíticos derivados de la proteína PMEL17. La síntesis de pigmentos de melanina se encuentra restringida en gran medida a melanocitos y el epitelio pigmentario post-mitótico del ojo. Los melanocitos solo expresan genes especializados requeridos para la formación pigmentaria, algunos de los cuales se mantienen luego de su transformación en melanoma.
La PMEL17 humana es una proteína de 661 aminoácidos (que incluye la secuencia de señal amino-terminal) , con una región transmembranal localizada en los aminoácidos 596 y 616. La PMEL17 es sometida a un proceso complejo, pero al menos una parte del ciclo de vida de la proteina se lleva a cabo en la superficie celular.
En la técnica se necesitan agentes que utilicen la PMEL17 para el diagnóstico y tratamiento de afecciones asociadas al P EL17, tal como el cáncer. La invención cumple esa necesidad y proporciona otros beneficios.
BREVE DESCRIPCIÓN La invención proporciona anticuerpos e inmunoconjugados anti-PMEL17 y métodos para usarlos.
En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo aislado que une la PMEL17. En algunas modalidades, el anticuerpo une un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N° : 26. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 45 de la SEC ID N° : 26. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que une al PMEL17. En algunas modalidades, la PMEL17 es PMEL17 humana. En algunas modalidades, la PMEL17 humana tiene la secuencia de la SEC ID N° : 26 o la SEC ID N° : 27. En determinadas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl, IgG2a o IgG2b.
En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: a) (i) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5, (ii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y (iii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4; o b) (i) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 15, (ii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y (iii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14; o c) HVR-H3, HVR-L3, y HVR-H2 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: a) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5; o b) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; o c) HVR-Hl , HVR-H2 y HVR-H3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: a) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o b) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o c) HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3, HVR-Ll, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: a) (i) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o b) (i) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o c) HVR-Ll, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: a) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : l o 50; o b) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 2; o c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) ; o d) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 9 o 49; o e) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 10; o f) una secuencia VH como en (d) y una secuencia VL como en (e) ; o g) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro ATCC N° PTA-12862; o h) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro ATCC N° PTA-12862; o i) una secuencia VH como en (g) y una secuencia VL como en (h) .
En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : l o 50; una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 9 o 49; o una secuencia VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°:2, una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 10, o una secuencia VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7 ) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 1 o 50 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 2; o (b) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 9 o 49 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 10; o (c) una secuencia VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA- 12862 y una secuencia VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo aislado que aisla el PMEL17 , donde el anticuerpo comprende: a) (i) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22, (ii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25, y (iii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21; o b) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22; o c) (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25; o d) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22, (iv) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25; o e) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N"; 11 o 51; o f) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 12; o g) una secuencia VH como en (e) y una secuencia VL como en (f) ; o h) una secuencia VH que tiene una secuencia de aminoácido de la SEC ID N°: 11 o 51; o i) una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 12; o j) una secuencia VH como en (h) y una secuencia VL como en (i) . En determinadas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl, IgG2a o lgG2b.
En algunas modalidades, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunas modalidades, se proporciona una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula hospedadora para que se produzca el anticuerpo.
En algunas modalidades, se proporciona un inmunoconjugado . En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende cualquiera de los anticuerpos precedentes y un agente citotóxico. En algunas modalidades, el inmunoconjugado tiene la fórmula Ab-(L-D)p, donde: (a) Ab es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; (b) L es un enlace; (c) D es una droga seleccionada de un maitansinoide , una auristatina, una caliqueamicina, una pirrolobenzodiazepina, y un derivado de nemorrubicina; y (d) p varía de 1-8.
En algunas modalidades, D es una auristatina. En algunas modalidades, D tiene la fórmula DE y donde R2 y R6 son cada uno metilo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada R8 se selecciona independientemente de CH3 , 0-CH3, OH y H; R9 es H; y R18 es -C(R8)2-C(R8)2-arilo.
En algunas modalidades, el fármaco (D) es MMAE.
En algunas modalidades, D es una pirrolobenzodiazepina la Fórmula A: donde las líneas punteadas indican la presencia opcional de un enlace doble entre Cl y C2 o C2 y C3 ,- R2 se selecciona independientemente de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se selecciona además de halógeno o dihalógeno, donde RD se selecciona independientemente de R, C02R, COR, CHO, C02H y halógeno; R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02 , Me3Sn y halógeno; R7 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halógeno; Q se selecciona independientemente de O, S y NH; R11 es ya sea H, o R o, donde Q es O, S03M, donde M es un catión metálico; R y R' se seleccionan cada uno independientemente de alquilo Ci-8, heterociclilo C3-8 y grupos arilo C5-2o, opcionalmente sustituido, y opcionalmente en relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo hetercíclico opcionalmente sustituido de 4-, 5-, 6- o 7- miembros; R12, R16, R19 y R17 son como se definen para R2, R6, R9 y R7 respectivamente; R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede ser interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos que están opcionalmente sustituidos; y X y X' se seleccionan independientemente de O, S y N(H) .
En algunas de tales modalidades, D tiene la estructura: donde n es 0 o 1 , En algunas modalidades, D tiene una estructura seleccionada donde RE y RE" se seleccionan independientemente de H o RD, donde RD se selecciona independientemente de R, C02R, COR, CHO, C02H, y halógeno; donde Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido; y donde n es 0 o 1, En algunas modalidades, D es un derivado de nemorrubicin . En algunas de tales modalidades, D tiene una estructura seleccionada de: comprende un aipepciao vai-cic o un c pepcicto ne-.bys. ün algunas modalidades, el enlace es lábil frente al ácido. En algunas de tales modalidades, el enlace comprende hidrazona.
En algunas modalidades, un inmunoconjugado tiene la fórmula donde S es un átomo de sulfuro.
En algunas modalidades, un inmunoconjugado tiene una fórmula seleccionada de: En algunas modalidades de los inmunoconjugados precedentes, p varía de 2-5.
En algunas modalidades, se proporciona un inmunoconjugado, donde el inmunoconj gado comprende un anticuerpo que comprende: a) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4 ; (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o b) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o c) HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En algunas modalidades, se proporciona un inmunoconjugado, donde el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que comprende (a) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 1 o 50 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:2; o (b) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 9 o 49 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 10; o (c) una secuencia VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862 y una secuencia VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En algunas modalidades, se proporcionan formulaciones farmacéuticas. En algunas de tales modalidades, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo descrito en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, una formulación farmacéutica comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional.
En algunas modalidades, se proporcionan los métodos para tratar a un individuo que tiene cáncer PMEL17 positivo. En algunas de tales modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une al PMEL17. En algunas de tales modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une al dominio extracelular de PMEL17. En algunas de tales modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo descrito en la presente. En algunas modalidades, el cáncer PMEL17 positivo es melanoma. En algunas modalidades, un método para tratar a un individuo que tiene cáncer PMEL17 positivo comprende además administrar un agente terapéutico adicional al individuo.
En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar a un individuo que tiene cáncer PMEL17 positivo, donde el cáncer PMEL17 positivo es resistente a un primer terapéutico. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une al PMEL17. En algunas modalidades, el cáncer PMEL17 positivo es melanoma. En algunas modalidades, el primer terapéutico comprende un primer anticuerpo que une a un antígeno que no sea PMEL17. En algunas modalidades, el primer terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que une un antígeno que no sea PMEL17 y un primer agente citotóxico. En algunas modalidades, el primer anticuerpo une un antígeno seleccionado de receptor de la endotelina B (ETBR) , proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TYRP1) , antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4) y glicoproteína NMB (GP MB) . En algunas modalidades, el primer anticuerpo une ETBR. En algunas modalidades, el primer anticuerpo es hu5E9.vl. En algunas modalidades, el primer inmunoconjugado es hu5E9.vl-MC-val-cit-PAB-MMAE . En algunas modalidades, el primer agente citotóxico y el agente citotóxico del inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une al PMEL17 son diferentes. En algunas de tales modalidades, el primer agente citotóxico es MMAE y el agente citotóxico del inmunoconjugado comprende un anticuerpo que se une a PMEL17 se selecciona de una caliqueamicina, una pirrolobenzodiazepina, y un derivado de nemorrubicina . En algunas de tales modalidades, el primer agente citotóxico del inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a PMEL17 se selecciona de una pirrolobenzodiazepina y de un derivado de nemorrubicina.
En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar un individuo con cáncer PMEL17 positivo, donde el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un primer inmunoconjugado descrito en la presente en combinación con un segundo inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que une el ETBR. En algunas modalidades, el anticuerpo que une el ETBR comprende una HVR Hl que comprende una secuencia de la SEC ID N° : 33, una HVR H2 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 34, una HVR H3 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 35, una HVR Ll que comprende una secuencia de SEC ID N° : 36, una HVR L2 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 37, y una HVR L3 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 38. En algunas modalidades, el anticuerpo que une el ETBR comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID N° : 40 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID N° : 39. En algunas modalidades, el primer inmunoconjugado comprende un agente citotóxico seleccionado de una auristatina, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina, y el segundo inmunoconjugado comprende un agente citotóxico seleccionado de una auristatina, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina. En algunas modalidades, el primer inmunocon ugado comprende un agente citotóxico seleccionado de una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina, y el segundo inmunoconjugado comprende una auristatina. En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende MMAE. En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende una parte de enlace-fármaco que comprende MC-val-cit-PAB-MMAE . En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado es hu5E9. l-MC-val-cit-PAB-MMAE . En cualquiera de las modalidades anteriores, el cáncer PMEL17 positivo puede ser melanoma. En algunas modalidades, el cáncer PMEL17 positivo también es ETBR positivo.
En algunas modalidades, se proporciona un método para inhibir la proliferación de células PMEL17 positivas. En algunas de tales modalidades, el método comprende exponer la célula a un inmunoconjugado descrito en la presente bajo condiciones permisivas para unir el inmunoconjugado al PMEL17 en la superficie de la célula, inhibiendo de esta forma la proliferación de la célula. En algunas modalidades, la célula es una célula de melanoma.
En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a PMEL17 conjugado a una etiqueta. En algunas modalidades, la etiqueta es un emisor de positrón. En algunas de tales modalidades, el emisor de positrón es 89Zr.
En algunas modalidades, se proporciona un método para detectar PMEL17 humano en una muestra biológica. En algunas modalidades, el método comprende contactar la muestra biológica con un anticuerpo anti-PMEL17 descrito en la presente bajo condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-PMEL17 a un PMEL17 humano de origen natural. En algunas modalidades, el método comprende además detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-PMEL17 y un PMEL17 humano de origen natural en la muestra biológica. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PMEL17 es el anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° . PTA-12862. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende a) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4; (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 5, (iv) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o b) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15, (iv) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8; o c) HVR-H1, HVR-H2 , HVR-H3 , HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de melanoma.
En algunas modalidades, se proporciona un método para detectar un cáncer PMEL17 positivo. En algunas de tales modalidades, el método comprende (i) administrar un anticuerpo anti-PMEL17 marcado a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene cáncer PMEL17 positivo, donde el anticuerpo anti-PMEL17 marcado comprende un anticuerpo anti-PMEL17 descrito en la presente, y (ii) detectar el anticuerpo anti-PMEL17 marcado en el sujeto, donde la detección del anticuerpo anti-PMEL17 marcado indica un cáncer PMEL17 positivo en el sujeto. En algunas de tales modalidades, el anticuerpo anti-PMEL17 marcado comprende un anticuerpo anti-PMEL17 conjugado a un emisor de positrón. En algunas modalidades, el emisor de positrón es 89Zr.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A-1B muestra (Fig.lA) una representación gráfica de los niveles de expresión génica de PMEL17 humano en varios tejidos, y (fig.lBB) una representación gráfica de los niveles de PMEL17 humano en varias líneas celulares humanas, tal como se describe en el Ejemplo A.
Las Figuras 2A y 2B muestran alineamientos de las secuencias de regiones variables de (Fig.2A) cadena ligera y (Fig.2B) cadena pesada para los anticuerpos 8G3, 17A9 y 15F2.
Las Figuras 3A a 3D muestran un mapeo de epítopo de 77E6 (Fig.3A y Fig.3B), 17A9 (Fig.3C y fig.3D) y 31D1 (fig.3D), tal como se describe en el Ejemplo D.
La Figura 4 muestra la internalización de 17A9 en células de melanoma, tal como se describe en el Ejemplo G.
La Figura 5 muestra la destrucción de varias líneas celulares PMEL17+ melanoma al aumentar las concentraciones de 17A9 ADC, tal como se describe en el Ejemplo I.
La Figura 6A- A 6C muestra (Fig.6A) la distribución de tinción con 31D1 en piel normal, (fig.6B) tinción con 17A9 de melanocitos normales y línea celular de melanoma SK-MEL-5 por FACS, y (fig.6C) el IC50 de 17A9 en melanocitos normales es casi 100 veces mayor que el IC50 de 17A9 en líneas celulares de melanoma, tal como se describe en el Ejemplo J.
La Figura 7A y 7B muestra (FIG.7A) una tinción de ejemplo para cada nivel de tinción con PMEL17 y (FIG.7B) resultados de la IHQ para un panel de muestras de melanoma humano, tal como se describe en el Ejemplo K.
La Figura 8 muestra la eficacia de 17A9 ADC en un xenoinjerto de una línea celular SK-MEL-23, tal como se describe en el Ejemplo L.
Las Figuras 9A y 9B muestran un alineamiento de PMEL17 humano, de ratón, de rata y de mono cynomolgus, tal como se describe en el Ejemplo F.
La Figura 10A-10B muestra (Fig.lOA) el volumen del tumor sobre el tiempo en ratones inoculados con células de melanoma UACC-257X2.2 y células de melanoma y a quienes se administraron varias dosis de anti-ETBR-ve-MMAE ("5E9vl-vcE"), y (Fig.lOB) células UACC-257X2.2 parentales y resistentes cultivadas in vitro en la presencia de concentraciones en aumento de anti-ETBR-ve-MMAE ADC, tal como se describe en el Ejemplo M.
La Figura 11A—11D muestra la expresión de ETBR (Fig,llA y 11B; también referidos como "EDNRB" ) y PMEL17 (Fig.llC y 11D) en células UACC-257X2.2 parentales y resistentes derivadas in vivo (Fig.llA y C) e in vitro (Fig.llB y 11D) , tal como se describe en el Ejemplo M.
La Figura 12A-12C muestra la sensibilidad de (Fig.l2A) células UACC-257X2.2 parentales, (Fig.l2B) células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo, y (Fig.l2C) células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro para concentraciones en aumento de anti-ETBR-vc-MMAE, anti-PMEL17-vc-MMAE, y anti-gD-vc-MMAE, tal como se describe en el Ejemplo M.
La Figura 13A-13C muestra la sensibilidad de (Fig.l3A) células UACC-257X2.2 parentales, (Fig.l3B) células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo, y (Fig.l3C) células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro para concentraciones en aumento de anti-ETBR-PNU, anti-PMEL17-P U, y anti-gD-PNU, tal como se describe en el Ejemplo M.
La Figura 14A-14C muestra la sensibilidad de (Fig.l4A) células UACC-257X2.2 parentales, (Fig.l4B) células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo, y (Fig.l4C) células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro para concentraciones en aumento de anti-ETBR-vc-PNU, anti-PMEL17-vc-PNU, y anti-gD-vc-P U, tal como se describe en el Ejemplo M.
La Figura 15A-15E muestra las estructuras de varios conjugados anticuerpo- fármaco, que incluyen (Fig.l4A) Ab-MC-val-cit-PAB-MMAE; (Fig.l4B) Ab-MC-acetal-PNU-159682 ; (Fig.l4C) Ab-MC-val-cit-PAB-PNU- 159682; (Fig.l4D) Ab-MC-val-Cit-PAB-PBD; y (FÍg.l4E) Ab-PNU-159682.
DESCRIPCIÓN DETALADA DE DETERMINADAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN I. DEFINICIONES Un "marco humano aceptor" para los fines de la presente es un marco que comprende la secuencia de aminoácido de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o de un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano, tal como se define a continuación. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de este, o puede contener cambios de la secuencia de aminoácidos. En algunas modalidades, el número de cambios de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas modalidades, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia VL de marco de inmunoglobulina humana o secuencia de marco de consenso humano .
"Afinidad" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno) . A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de un molécula X para su compañera Y puede estar representada generalmente por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse usando métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en la presente. Se describen a continuación modalidades específicas ilustrativas y de ejemplo para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo de "afinidad madura" hace referencia a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR) , en comparación con un anticuerpo principal que no posee tales alteraciones, las cuales tienen como resultado una mejoría en la afinidad del anticuerpo para antígeno .
Los términos "anticuerpo anti-PMEL17" y "un anticuerpo que se une a PMEL17" hace referencia a un anticuerpo que es capaz de unir PMEL17 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como un diagnóstico y/o agente terapéutico al dirigirse al PMEL17. En una modalidad, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-PMEL17 a una proteína no-PMEL17 no relacionada es menor que alrededor de 10% de la unión del anticuerpo a PMEL17 tal como se midió, por ejemplo, por un radioinmunoensayo (RIA) . En determinadas modalidades, un anticuerpo que se une al PMEL17 tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, = 100 nM, = 10 nM, , < 5 Nm, , < 4 nM, , < 3 nM, , < 2 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, = 0,01 nM, o = 0,001 nM (por ejemplo, 10"8 M o menor, por ejemplo, de 10~8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10~9 M a 10~13 M) . En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 se une a un epxtopo de PMEL17 que se conserva entre PMEL17 de diferentes especies.
El término "anticuerpo" se utiliza en la presente en su sentido más amplio y cubre varias estructuras de anticuerpo, que incluyen de modo no taxativo, anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad deseada de unión al antígeno.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula que no sea un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto y que une el antígeno al cual el anticuerpo intacto se une. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, de modo no taxativo, Fv, Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab')2 ; diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena simple (por ejemplo, scFv) ; y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo que se une al mismo epitopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o más, y en cambio, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o más. Se proporciona un ensayo de competición de ejemplo en la presente .
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen las condiciones fisiológicas en mamíferos que se caracterizan típicamente por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, de modo no taxativo, melanoma, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfornas Hodgkin y no Hodgkin) , blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (por ej . , cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón, incluyendo cáncer microcítico de pulmón, cáncer no microcítico de pulmón ( "NSCLC" ) , adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroide, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos , y varios tipos de cáncer de cabeza/cerebro y cuello.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una parte de la cadena pesada o ligera se deriva de una fuente de especies específica, mientras que el resto de la cadena pesada o ligera se deriva de una fuente o especie diferentes.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases importantes de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente.
El término "agente citotóxico" , como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca destrucción o muerte celular. Los agentes citotóxicos incluyen, de modo no taxativo, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu) ; agentes quimioterapéuticos o fármacos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorrubicina, malfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes) ; agentes inhibidores del crecimiento; sus enzimas y fragmentos, por ejemplo enzimas nucleolíticas ; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, animal vegetal, incluso sus fragmentos y/o variantes; y los diversos agentes antitumorales o anticáncer divulgados a continuación.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como ® tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN ) ; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL*) ; beta-lapacona; lapacol; colchicinas ; ácido betulínico; una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR ) , acetilcamptotecina, scopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (que incluye sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (que incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamidea mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, que incluyen dinemicina A; una esperamicina; así como también cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteínas relacionadas) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (que incluyen morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina) , epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopu ina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina. enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostana, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutatimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno,- edatraxato,- defofamina; demecolcina,- diazicuona,-elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilono; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina,-maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2 , 2 ' , 2" -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE , FILDESIN ) ; dacarbazma; manomustma; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ej . , TAXOL* paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ libre de Cremofor, formulación de paclitaxel de nanopartículas modificadas con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR") ; 6-tioguanina,-mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico,- capecitabina (XELODA®) ,- sales, ácidos farmacéuticamente aceptables o derivados de cualquiera de los anteriores; así como también combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, CVP, abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovovina.
"Funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: Unión a Clq y citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) ; unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) ; fagocitosis; subregulación de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de las células B) ; y activación de las células B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante períodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "epítopo" se refiere el sitio específico en una molécula de antígeno a la cual un anticuerpo se une .
El término "región Fe" en la presente se utiliza para definir una región terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. En una modalidad, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hacia el extremo carboxilo terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina en el terminal C (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fe o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat et ál . , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Marco" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR) . El FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.
Los términos "anticuerpo de longitud completa" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se utilizan en la presente de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de un anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define en la presente .
El término "formas glicosiladas de PMEL17" se refiere a formas de PMEL17 de origen natural que están modificadas postraduccionalmente por la adición de residuos de carbohidratos .
Los términos "célula hospedadora" , "línea de células hospedadora" y "cultivo de células hospedadora" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluso la progenie de dichas células. Las células hospedadora incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula primaria transformada y progenie derivada de la misma sin importar la cantidad de pasajes. Es posible que la progenie no sea completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula madre, pero puede contener mutaciones. Se incluye en la presente la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica examinada o seleccionada en la célula originalmente transformada.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponden a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivada de un origen no humano que utiliza repertorios de anticuerpo humano u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente al anticuerpo humanizado que comprende residuos no humanos de unión a antígeno.
Un "marco de consenso humano" es un marco que representa el residuo de aminoácidos de origen más común en una selección de secuencias de inmunoglobulina humana de marco VL o VH. Generalmente, la selección de secuencias de inmunoglobulina humana de marco VL o VH se realiza a partir de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et ál, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En una modalidad, para la VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et al, mencionado anteriormente. En una modalidad, para el VH, el subgrupo es un subgrupo III según Kabat et al, mencionado anteriormente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de aminoácidos de FR humanos. En determinadas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en el cual todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todos o sustancialmente todos los FR corresponden a los de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización .
El término "región hipervariable" o "HVR" , tal como se usa en la presente, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2 , L3) . Las HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) , siendo la última de más alta variabilidad de secuencia y/o que participa en el reconocimiento de antlgeno. Bucles hipervariables ejemplares se producen en residuos de aminoácidos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) , 91-96 (L3) , 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDR de ejemplo (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en residuos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3 , 31-35B de Hl, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et ál, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). A excepción de CDR1 en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables . Las CDR también comprenden "residuos determinantes de especificidad" o "SDR" , que son residuos que se ponen en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas o a-CDR. Las CDR Ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en residuos de aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2 , 89-96 de L3, 31-35B de Hl, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front . Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se enumeran aquí de acuerdo con Kabat et ál, mencionado anteriormente.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluso, de modo no taxativo, con un agente citotóxico.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, de modo no taxativo, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovej s, gatos, perros y caballos) , primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, por ejemplo monos) , conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano .
Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su entorno natural . En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta más del 95 % o el 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, centrado isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa) . Para una revisión de los métodos de evaluación de pureza de un anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et ál, J. Chromatogr . B 848:79-87 (2007) .
Un "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que comúnmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico se encuentra presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-PMEL17" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o sus fragmentos) , incluso las moléculas de ácido nucleico en un único vector o vectores separados y las moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.
El término "PMEL17" , tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier PMEL17 nativo. El término "PMEL17" de cualquier ser vertebrado, incluso mamíferos tales como primates (por ejemplo humanos y monos cynomolgus) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , a menos que se indique lo contrario. El término comprende PMEL17 "de longitud completa", no procesada, así como cualquier forma de PMEL17 que resulte del procesamiento en la célula. El término también incluye las variantes de PMEL17 de origen natural, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una preproteína PMEL17 humana de ejemplo, con secuencia de señal (aminoácidos 1-24) se muestra en la SEC ID N° : 26. La secuencia de aminoácidos de una proproteína PMEL17 humana de ejemplo se muestra en la SEC ID N°: 27. La secuencia prevista de un mono cynomolgus de ejemplo PMEL17 (sin secuencia de señal) se muestra en la SEC ID N° : 28. Las secuencias de aminoácidos para ratas PMEL17 de ejemplo con secuencia de señal (aminoácidos 1-25) y sin secuencia de señalización se muestran en la SEC ID N°: 29 y 30, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos para ratones PMEL17 de ejemplo con secuencia de señal (aminoácidos 1-25) y sin secuencia de señalización se muestran en la SEC ID N° : 31 y 32, respectivamente.
El término "cáncer PMEL17 positivo" se refiere a un cáncer que comprende células que expresan (incluso expresan temporalmente) PMEL17 en su superficie.
El término "célula PMEL17 positiva" se refiere a una célula que expresa PMEL17 en su superficie.
El término "anticuerpo monoclonal" , tal como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos o se unen al mismo epítopo, excepto por los anticuerpos variantes posibles, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades mínimas. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales , que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo a través de ningún método específico. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención se pueden hacer a través de diversas técnicas incluso, de modo no taxativo, el método de hibridoma, métodos de ADN recombinantes, métodos de visualización de fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte del loci de la inmunoglobulina humana, dichos métodos y otros métodos ejemplares para realizar anticuerpos monoclonales se describen en la presente.
Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogos (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltones, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlace disulfuro. Del extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también denominada un dominio variable pesado o un dominio variable de cadena pesada, seguido por los tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) . De forma similar, del extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también denominada un dominio variable ligero o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?) , en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término "prospecto de envase" se utiliza para referirse a las instrucciones que se suelen incluir en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones o advertencias referente al uso de dichos productos terapéuticos .
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácido puede lograrse de varias maneras conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible al público, tales como los software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para alinear las secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando. A los fines de la presente, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente se presentó con documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde se encuentra registrada con el Registro de Derechos de Autor N° TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público por Genentech, Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como se indica a continuación: 100 veces la fracción X/Y en donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos marcados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B, en donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A para B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B para A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que es de forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido allí sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se le administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que es no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, de modo no taxativo, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante .
Tal como se usa en la presente, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales como "tratar" o "se trata") se refiere a una intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que se está tratando y se puede realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseados del tratamiento incluyen, de modo no taxativo, evitar la aparición o la recurrencia de una enfermedad, aliviar los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, evitar la metástasis, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejora en el pronóstico. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan para retardar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar el avance de una enfermedad.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural generalmente tienen estructuras similares, cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) . (Véase, por ejemplo, Kindt et ál . Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para lograr especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno específico se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominio VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et ál . , J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et ál . , Nature 352:624-628 (1991) .
El término "vector", tal como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al cual está unida. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la cual se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos de forma operativa. Dichos vectores se denominan en la presente como "vectores de expresión" .
"Alquilo" es hidrocarburo Ci-Cis que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Los ejemplos son metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3) , 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2) 1-butilo (n-Bu, n-butilo, CH2CH2CH2CH3) , 2-metil-l-propilo (i-Bu, i-butilo, CH2CH(CH3)2) , 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH (CH3 ) CH2CH3 ) , 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n- pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-pentilo ( -CH (CH3) CH2CH2CH3) , 3-pentilo (-CH(CH2CH3) 2) 2-metil-2-butilo ( -C (CH3 ) 2CH2CH3) , 3-metil-2-builo ( -CH (CH3 ) CH (CH3 ) 2 ) , 3-metil-l-butilo (- H2CH2 H(CH3) 2) , 2-metil-l-butilo ( -CH2CH (CH3 ) H2CH3 ) , 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-hexilo (- CH(CH3)CH2CH2CH2CH3) , 3-hexilo ( -CH (CH2CH3 ) ( CH2CH2CH3 ) ) , 2-metil-2-pentilo ( -C (CH3 ) 2CH2CH2CH3 ) , 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3) , 4 -metil-2-pentilo (- CH(CH3)CH2CH(CH3)2) , 3 -metil-3 -pentiilo ( -C (CH3 ) (CH2CH3 ) 2) , 2-metil-3-pentilo ( -CH (CH2CH3 ) CH (CH3 ) 2 ) , 2 , 3 -dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2) , 3 , 3 -dimetil-2 -butilo ( -CH (CH3 ) C (CH3 ) 3.
El término "alquilo Ci_C8" , según se emplea aquí, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los grupos "alquilo Cx-C8" representativos incluyen, de modo no taxativo, -metilo, -etilo, -n propilo, -n butilo, -n pentilo, -n hexilo, -n-heptilo, -n-octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquilos Ci-C8 ramificados incluyen, de modo no taxativo, -isopropilo, -sec butilo, -isobutilo, -tere butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, alquilos Ci-C8 insaturados incluyen, de modo no taxativo, -vinilo, -alilo, -1 butenilo, -2 butenilo, -isobutilenilo, -1 pentenilo, -2 pentenilo, -3 metil 1 butenilo, -2 metil 2 butenilo, -2,3 dimetil 2 butenil, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1 butinilo, -2 butinilo, -1 pentinilo, -2 pentinilo, -3 metil 1 butinilo. Un grupo alquilo Cx-C8 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluso, de modo no taxativo, alquilo -Ci-C8 , -O- (alquilo Ci-Cs ) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S03R' , -S (O) 2R' , -S(0)R', -OH, halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
El término "alquilo C1-Ci2," tal como se utiliza en la presente hace referencia a hidrocarburo saturado o no saturado de cadena recta o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Un grupo alquilo Ci-CX2 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo, pero de modo no taxativo, -alquilo Ci-C8, -0- (alquilo C!-C8) , arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R'}2 Y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo-Cx-Ca y arilo.
El término "alquilo Ci-C6", tal como se usa en la presente, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los grupos "alquilo Ci-Cg " representativos incluyen, de modo no taxativo, -metilo, -etilo, -n propilo, -n butilo, -n pentilo, y -n hexilo,- mientras que los alquilos Ci-C6 ramificados incluyen, de modo no taxativo, -isopropilo, -sec butilo, -isobutilo, -tere butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, alquilos Ci-C3 insaturados incluyen, de modo no taxativo, -vinilo, -alilo, -1 butenilo, -2 butenilo, -isobutilenilo, -1 pentenilo, -2 pentenilo, -3 metil 1 butenilo, -2 metil 2 butenilo, -2,3 dimetil 2 butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo y 3-hexilo. Un grupo alquilo Ci-C6 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos, como se describió anteriormente para el grupo alquilo Ci-C8.
El término "alquilo Ci-C4", tal como se usa en la presente, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Los grupos "alquilo QL-C ' representativos incluyen, de modo no taxativo, -metilo, -etilo, -n propilo, -n butilo; mientras que los alquilos Ci-C4 ramificados incluyen, de modo no taxativo, -isopropilo, -sec butilo, -isobutilo, -tere butilo; los alquilos Ci~C4 insaturados incluyen, de modo no taxativo, -vinil, -alilo, -1 butenilo, -2 butenilo e isobutilenilo. Un grupo alquilo Ci-C4 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos, como se describió anteriormente para el grupo alquilo Cx - Cg .
"Alcoxi" es un grupo alquilo unido individualmente a un oxígeno. Grupos alcoxi de ejemplo incluyen, de modo no taxativo, metoxi (-OCH3) y etoxi (-OCH2CH3) . Un "alcoxi C1-C5" es un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono. Los grupos alcoxi pueden ser no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos, como se describió anteriormente para los grupos alquilo .
"Alquenilo" es hidrocarburo C2 - C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2 carbono-carbono . Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo ( -CH2CH=CH2) , ciclopentilo (-C5H7), y 5-hexenilo (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2) . Un "alquenilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2 carbono-carbono .
"Alquinilo" es hidrocarburo C2 - C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono . Los ejemplos incluyen, pero de modo no taxativo: acetileno (-C=CH) y propargilo (-CH2C=CH) . Un "alquinilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono .
"Alquileno" se refiere a una cadena ramificada o lineal saturada, o un radical hidrocarbonado cíclico de 1 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alcano principal . Los radicales alquileno típicos incluyen, de modo no taxativo: metileno (-CH2-) 1,2-etilo ( - CH2CH2 - ) , 1,3 -propilo (-CH2CH2CH2-) , 1,4 -butilo (-CH2CH2CH2CH2-) , y similares.
Un "alquileno C1 - C10" es un grupo hidrocarbonado de cadena lineal saturado de fórmula - (CH2) ?- ?0 - . Ejemplos de un alquileno C1 - C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
"Alquenileno" se refiere a una cadena ramificada o lineal insaturada, o a un radical hidrocarbonado cíclico de 2 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alqueno base. Los radicales alquenileno típicos incluyen, de modo no taxativo: 1,2-etileno (-CH=CH-) .
"Alquinileno" se refiere a una cadena ramificada o lineal insaturada, o a un radical hidrocarbonado cíclico de 2 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alquino principal . Los radicales típicos de alquinileno comprenden, de modo no taxativo: acetileno (-C=C-), propargil (-CH2C=C-) , and 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C=C-) .
"Arilo" se refiere a un grupo aromático carbocíclico .
Los ejemplos de grupos arilo incluyen, de modo no taxativo, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo aromático carbocíclico o un grupo aromático heterocíclico puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos que incluye, de modo no taxativo, alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo -C1-Ce) , -arilo, -C(0)R' , -0C(0)R' , -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')a -NHC(O)R' , -s(o)2R' , -S(o)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, - NH(R'), -N(R' )2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Cx-Cs y arilo.
Un "arilo C5-C2o" es un grupo arilo de 5 a 20 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos . Los ejemplos de grupos arilo C5-C2o incluyen, de modo no taxativo, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-C2o puede ser sustituido o no sustituido como se describió anteriormente para los grupos arilo. Un "arilo C5-Ci4" es un grupo arilo de 5 a 14 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos. Los ejemplos de grupos arilo C5-Ci incluyen, de modo no taxativo, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-C14 puede ser sustituido o no sustituido como se describió anteriormente para los grupos arilo.
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en las configuraciones orto, meta o para como se muestra en las siguientes estructuras: en las cuales el grupo fenilo puede ser no sustituido o sustituido con más de cuatro grupos que incluye, de modo no taxativo, alquilo -Cx-Ca, -O- (alquilo -C!-C8) , -arilo, C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0) ', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2 , -NH(R'), -N(R' )2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Cx-Ca y arilo.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono del extremo o sp3, es reemplazado con un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen, de modo no taxativo, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-l-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-l-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluso los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y el resto arilo es de 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal sp3, es reemplazado por un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, de modo no taxativo, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo y similares. Los grupos heteroarilalquilo comprenden de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluso los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y el resto heteroarilo es de 5 a 14 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, 0, P y S. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5] , [5,6] o [6,6] .
"Alquilo sustituido" , "arilo sustituido" y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo y arilalquilo respectivamente, en los cuales uno o más átomos de hidrógeno son reemplazados independientemente por un sustituyente . Los sustituyentes típicos incluyen, de modo no taxativo, -X, -R, -O", -OR, -SR, -S~, -NR2 , -NR3 , =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=0, -NCS, -NO, -N02, =N2 , -N3, NC(=0)R, -C(=0)R, -C(=0)NR2, -S03\ -S03H, -S(=0)2R, -OS(=0)2OR, -S(=0)2NR, -S(=0)R, -OP(=0) (OR)2, -P(=0) (OR)2, -PO" 3, -P03H2, -C(=0)R, -C(=0)X, -C(=S)R, -C02R, -CCV , -C(=S)0R, -C(=0)SR, -C(=S)SR, -C(=0)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)N R2, en donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br o í; y cada R es independientemente -H, alquilo C2-Ci8, arilo C6-C20, heterociclo C3-Ci4, grupo protector o resto profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno como se describió anteriormente también se pueden sustituir de manera similar.
"Heteroarilo" y "heterociclo" se refiere a un sistema de anillos en los cuales uno o m s átomos de los anillos son un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclo comprende de 3 a 20 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] .
Heterociclos ejemplares se describen, por ejemplo, en Paquette, Leo A. , "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamín, Nueva York, 1968) , particularmente en los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente) , en particular volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. A . Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Los ejemplos de heterociclos incluyen a modo de ejemplo y de modo no taxativo, piridilo, dihidroipiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo) , tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo azufre oxidado, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tet ahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H, 6H- 1 , 5 , 2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H- indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naf iridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, ß-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo.
A modo de ejemplo y de forma no taxativa, los heterociclos unidos por carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, la posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, la posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, la posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, la posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol , la posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, la posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, la posición 2 o 3 de una aziridina, la posición 2, 3 o 4 de una azetidina, la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina o la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aún más típicamente, los heterociclos unidos por carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4 -piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4 -pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3 -pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo .
A modo de ejemplo y no taxativamente, los heterociclos unidos por nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3 -pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, lH-indazol, la posición 2 de un isoindol o isoindolina, la posición 4 de una morfolina y la posición 9 de un carbazol o ß-carbolina. Aún más típicamente, los heterociclos unidos por nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo y 1-piperidinilo .
Un "heterociclo C3-C8 " se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el cual de uno a cuatro átomos de carbono del anillo son reemplazados independientemente por un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, de modo no taxativo, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, coumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con hasta siete grupos incluso, de modo no taxativo, alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo -Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 -C(0)NHR', -C(0)N(R')2-NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2 , -NH(R')/ -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
"Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo es reemplazado por un enlace. Un heterociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con hasta seis grupos incluso, de modo no taxativo, alquilo Ci-C8, -O- (alquilo Ci-Cs) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C (O) N (R' ) 2-NHC (O) R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R' )2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
Un "heterociclo C3-C20" hace referencia a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromatic en el cual de uno a cuatro de los átomos de carbón del anillo se sustituyen independientemente con un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Un heterociclo C3-C2o puede ser no sustituido o sustituido por hasta siete grupos incluyendo, de modo no taxativo, alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR' , -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C9 y arilo .
"Heterociclo C3-C2o" hace referencia a un grupo heterociclo C3-C20 definido anteriormente donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo se sustituye con un enlace .
"Carbociclo" significa un anillo saturado o insaturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o de 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 6 átomos del anillo, aún más típicamente 5 o 6 átomos del anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos del anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] o 9 o 10 átomos del anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6] . Ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3 -enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2 -enilo, 1-ciclohex-3-enilo cicloheptilo y ciclooctilo.
Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carbocxclico no aromático saturado o insaturado de 3-, 4-, 5-, 6-, 7- u 8- miembros. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, de modo no taxativo, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, -ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1 , 4-ciclohexadienilo, -cicloheptilo, -1,3-cicloheptadienilo, -1 , 3 , 5-cicloheptatrienilo, -ciclooctilo y -ciclooctadienilo . Un heterociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con hasta seis grupos incluso, de modo no taxativo, alquilo C -Ca, -O- (alquilo Cx-C3) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C (O) N (R' ) 2~ NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo es reemplazado por un enlace.
"Enlazador" se refiere a un resto químico que comprende un enlace covalente o a una cadena de átomos que une por un enlace covalente un anticuerpo a un resto fármaco. En diversas modalidades, los enlazadores incluyen un radical divalente tal como un alquildiilo, un arildiilo, un heteroarildiilo, restos tales como: - (CR2) nO (CR2) n-, unidades de repetición de alquiloxi (por ejemplo polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (por ejemplo, polietilenamino, Jeffamine™) ; y éster diácido y amidas incluso succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida. En diversas modalidades, los enlazadores pueden comprender uno o más residuos de aminoácidos, tales como valina, fenilalanina, lisina y homolisina.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponerse al compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" hace referencia a moléculas que son superponibles a su compañero de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero difieren en cuanto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros se pueden separar en procedimientos analíticos de alta resolución como electroforesis y cromatografía .
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles una de la otr .
Las convenciones y definiciones estereoquímicas utilizadas en la presente siguen en general a S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar el plano de la luz polarizada plana. Para describir un compuesto ópticamente activo, se utilizan los prefijos D y L, o R y S, para indicar la configuración absoluta de la molécula sobre su centro o centros quirales . Los prefijos d y l o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de luz polarizada plana por el compuesto, y (-) o 1 significa que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dexógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos, con la excepción de que son imágenes especulares entre sí. También se puede hacer referencia a un estereoisómero específico como un enantiómero y una mezcla de tales isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o un racemato, que puede ocurrir donde no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" hacen referencia a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas , sin actividad óptica.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede ser sustituido por otro grupo funcional . Determinados grupos salientes se conocen en la técnica, y ejemplos incluyen, de modo no taxativo, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro) , metansulfonilo (mesilo) , p-toluensulfonilo (tosilo) , trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato .
El término "grupo protector" se refiere a un sustituyente que comúnmente se emplea para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras hace reaccionar otros grupos funcionales en el compuesto. Por ejemplo, un "grupo amino protector" es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad del amino en el compuesto. Los grupos amino protectores adecuados incluyen, de modo no taxativo, acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC) , benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc) . Para ver una descripción general de grupos protectores y su uso, véase T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John iley & Sons, Nueva York, 1991, o una edición posterior.
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos que se unen a PMEL17 e inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos. Los anticuerpos y los inmunoconjugados de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de cánceres PMEL17 positivos.
A. Anticuerpos anti-PMEL17 de ejemplo En algunas modalidades, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a PMEL17. PMEL17 es una proteína integral de membrana que se encuentra temporalmente en la superficie celular de los melanocitos. Como se demuestra en la presente, PMEL17 se expresa en la mayoría de los especímenes de melanoma humano examinados .
Una secuencia de una preproteína PMEL17 humana de origen natural de ejemplo, con secuencia de señal (aminoácidos 1-24) se proporciona en la SEC ID N° : 26, y la secuencia de proproteína PMEL17 correspondiente se muestra en la SEC ID N° : 27 (correspondiente a los aminoácidos 25-661 de la SEC ID N° : 26) .
En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-PMEL17 une un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N° : 26, o une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 45 de la SEC ID N° : 26. Tales anticuerpos de ejemplo no taxativos incluyen 17A9, 8G3 y 31D1. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-P EL17 une anti-PMEL17 humano. En algunas modalidades, un anticuerpo anti- MEL17 une PMEL seleccionado de PMEL17 humano, de mono cynomolgus, de ratón y de rata.
En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N° : 26. En algunas de tales modalidades, el anticuerpo anti-PMEL17 une el PMEL17 con una afinidad de = 5 nM, o = 4 nM, o = 3 nM, o = 2 nM o = 1 nM y, opcionalmente = 0,0001 nM, o = 0,001 nM o = 0,01 nM. Tales anticuerpos de ejemplo no taxativos incluyen 17A9 y 8G3 , descritos en la presente. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N°: 26 se une al PMEL17 humano. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N° : 26 se une a un PMEL17 humano y/o PMEL17 de mono cynomolgus.
En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 45 de la SEC ID N° : 26. En algunas de tales modalidades, el anticuerpo anti-PMEL17 une el PMEL17 con una afinidad de = 5 nM, o < 4 nM, o = 3 nM, o = 2 nM o = 1 nM y, opcionalmente = 0,0001 nM, o = 0,001 nM o = 0,01 nM. Un anticuerpo de ejemplo no taxativo es 31D1, descrito en la presente. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 45 de la SEC ID N° : 26 se une al PMEL17 humano. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N° : 26 se une a un PMEL17 humano y/o PMEL17 de mono cynomolgus.
Se proporcionan anticuerpos adicionales que se unen a PMEL17. Un anticuerpo anti-PMEL17 de ejemplo no taxativo es 15F2, descrito en la presente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PMEL17 une el PMEL17 con una afinidad de = 5 nM, o = 4 nM, o = 3 nM, o = 2 nM o = 1 nM y, opcionalmente = 0,0001 nM, o = 0,001 nM o = 0,01 nM. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 se une al anti-PMEL17 humano. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PMEL17 se une al anti-PMEL17 humano y/o al PMEL17 de mono cynomolgus.
Ensayos .
Para determinar si un anticuerpo anti-PMEL17 se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N° : 26, o si se "une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 45 de la SEC ID N° : 26", los polipéptidos PMEL17 con eliminaciones en el extremo terminal N y C se expresan en células 293 y se prueba la unión del anticuerpo a los polipéptidos truncados mediante FACS tal como se describe en el Ejemplo D, donde una reducción considerable (reducción = 70% ) o eliminación de la unión del anticuerpo a un polipéptido trucado relativo a la unión del PMEL17 de longitud completa expresado en células 293 indica que el anticuerpo no se une a ese polipéptido truncado.
Si un anticuerpo anti-PMEL17 "se une con una afinidad de < 5 nM, o < 4 nM, o < 3 nM, o < 2 nM, o < 1 nM," se determina con un ensayo BIAcore*. Por ejemplo, la Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmones superficiales ® utilizando un BIACORE -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . Se activan chips de CM5 de grado de investigación BIAcore™ con reactivos de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se acoplan IgG de cabra anti-Fc humana a los chips para obtener aproximadamente 10.000 unidades de respuesta (RU) en cada célula de flujo. Se bloquean los grupos de acoplamiento sin reaccionar con etanolamina 1 M. Para las mediciones cinéticas, se pueden capturar los anticuerpos anti-PMEL17 para obtener aproximadamente 300 RU. Se pueden inyectar diluciones seriadas en dos etapas de ECD de PMEL17 humana (por ejemplo, aminoácidos 25 a 291 fusionados a un Fe de extremo terminal C expresado en un sistema de baculovirus, o aminoácidos 22-558 fusionados con Fe; se inyectan 125 nM a 0,49 nM) en tampón HBS-P (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,005% tensioactivo P20) a 25° C con una velocidad de flujo de 30 µ?/min. Se pueden calcular las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1 (BIAcore™ Evaluation Software versión 3,2). Se calcula la constante de equilibrio de disociación (Kd) como la proporción k0ff/kon. Si la velocidad de asociación supera 106 M"1 s"1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de desactivación fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno de 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según lo medido en un espectrómetro, tales como un espectrofotómetro con método para la parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco"9 de 8000 series (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Anticuerpo 17A9 y otras modalidades En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3 ,-(b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o al menos las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5. En una modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5. En otra modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5; y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N": 5.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o al menos las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID N° : 5; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o al menos las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 5; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N" : 8.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o al menos las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID N° : 5; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8.
En algunas modalidades, ?? en la SEC ID N° : 17 se selecciona de Arg, Lys, Gln, Asn, Gly y Ala. En algunas modalidades, Xx en la SEC ID N° : 17 se selecciona de Arg, Lys, Gly y Ala. En algunas modalidades, Xx en la SEC ID N° : 17 se selecciona de Arg y Gly. En algunas modalidades, X2 en la SEC ID N° : 18 se selecciona de Tyr, Trp, Phe, Thr, Ser, lie, Leu, Val, Met, Ala y Norleucina. En algunas modalidades, X2 en la SEC ID N° : 18 se selecciona de Tyr, Phe, lie, Leu, y Val. En algunas modalidades, X2 en la SEC ID N° : 18 se selecciona de Tyr e lie. En algunas modalidades, X3 en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser, T r y Val. En algunas modalidades, X3 en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser y Thr. En algunas modalidades, X en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser, Thr y Val. En algunas modalidades, X4 en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser y Thr.
En cualquiera de las modalidades que anteceden, se humanizó un anticuerpo anti-PMEL17. En una modalidad, un anticuerpo anti-PMEL17 comprende HVR en cualquiera de las formas que se mencionaron en modalidades anteriores, y comprende adicionalmente una estructura aceptora humana, por ejemplo una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana. En determinadas modalidades, el marco aceptor humano es el marco VL kappa 1 humano (VLKI) y/o el marco VH de VHi. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado anti-PMEL17 comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado anti-PMEL17 comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-P EL17 comprende una secuencia de cadena pesada de dominio variable (VH) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 1 o 50. En ciertas modalidades, una secuencia de VH que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 1 o 50 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones, o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-P EL17 que comprende esa secuencia conserva la habilidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID N° : 1 o 50. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEC ID N° : 1 o 50. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o elminaciones suceden en regiones que se encuentran fuera de las HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VH de la SEC ID N° : l o 50, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5. En algunas modalidades, la VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 17, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5.
En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo anti-PMELl7, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 2. En ciertas modalidades, una secuencia VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 2 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende esa secuencia conserva la habilidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID N° : 2. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEC ID N": 2. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en las regiones fuera de la HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VL de la SEC ID N° : 2, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N": 8. En algunas modalidades, la VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PMEL17, donde el anticuerpo comprende una VH tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden, y una VL tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en la SEC ID N°: 1 y en la SEC ID N° : 2, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID N° : 50 y en la SEC ID N°: 2, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de estas secuencias.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-PMEL17 que se proporciona en la presente. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende una secuencia de VH de la SEC ID N": l o 50 y una secuencia de VL de la SEC ID N° : 2. En ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de la SEC ID N° : 26 de los aminoácidos 105 a 125 o dentro de estos o superponiéndose a estos.
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, un anticuerpo anti-PMEL17 es un fragmento de anticuerpo, por e emplo, un fragmento de Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o F(ab' )2- En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud considerablemente completa, por ejemplo, un anticuerpo IgGl u otra clase anticuerpo o isótopo tal como se define en la presente.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden puede incorporar cualquiera de las características, solas o combinadas, que se describen en las Secciones 1-7 más adelante .
Anticuerpo 8G3 y otras modalidades En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15. En una modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15. En otra modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N" : 15, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 13; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (ii) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID N° : 15; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o al menos las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16, (ii) HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 14; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID N° : 15; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En algunas modalidades, Xi en la SEC ID N° : 17 se selecciona de Arg, Lys, Gln, Asn, Gly y Ala. En algunas modalidades, Xi en la SEC ID N° : 17 se selecciona de Arg, Lys, Gly y Ala. En algunas modalidades, Xi en la SEC ID N°: 17 se selecciona de Arg y Gly. En algunas modalidades, X2 en la SEC ID N° : 18 se selecciona de Tyr, Trp, Phe, Thr, Ser, lie, Leu, Val, et, Ala y Norleucina. En algunas modalidades, X2 en la SEC ID N° : 18 se selecciona de Tyr, Phe, lie, Leu, y Val. En algunas modalidades, X2 en la SEC ID N° : 18 se selecciona de Tyr e lie. En algunas modalidades, X3 en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser, Thr y Val. En algunas modalidades, X3 en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser y Thr. En algunas modalidades, X4 en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser, Thr y Val. En algunas modalidades, X4 en la SEC ID N° : 19 se selecciona de Ser y Thr.
En cualquiera de las modalidades que anteceden, se humanizó un anticuerpo anti-PMEL17. En una modalidad, un anticuerpo anti-PMEL17 comprende HVR en cualquiera de las formas que se mencionaron en modalidades anteriores, y comprende adicionalmente una estructura aceptora humana, por ejemplo una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado anti-PMEL17 comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado anti-PMEL17 comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-PMEL17 comprende una secuencia de cadena pesada de dominio variable (VH) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 9 o 49. En ciertas modalidades, una secuencia de VH que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 9 o 49 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-P EL17 que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID N° : 9 o 49. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEC ID N° : 9 o 49. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en regiones que se encuentran fuera de las HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente , el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VH de la SEC ID N° : 9 o 49, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15. En algunas modalidades, la VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 17, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 18, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15.
En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo anti-PMEL17, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 10. En ciertas modalidades, una secuencia VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 10 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID N° : 10. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEC ID N° : 10. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en las regiones fuera de la HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VL de la SEC ID N° : 10, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esta secuencia. En una modalidad particular, la VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8. En algunas modalidades, la VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 19; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti- PMEL17, donde el anticuerpo comprende una VH tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden, y una VL tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en la SEC ID N" : 9 y SEC ID N° : 10, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de estas secuencia. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID N° : 49 y SEC ID N° : 10, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de estas secuencia.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-PMEL17 que se proporciona en la presente. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende una secuencia de VH de la SEC ID N° : 9 o 49 y una secuencia de VL de la SEC ID N° : 10. En ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de la SEC ID N° : 26 de los aminoácidos 105 a 125 o dentro de estos o superponiéndose a estos .
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, un anticuerpo anti-PMEL17 es un fragmento de anticuerpo, por e emplo, un fragmento de Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o fragF(ab')2. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud considerablemente completa, por ejemplo, un anticuerpo IgGl u otra clase anticuerpo o isotipo tal como se define en la presente.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden puede incorporar cualquiera de las características, solas o combinadas, que se describen en las Secciones 1-7 más adelante .
Anticuerpo 15F2 y otras modalidades En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o al menos las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22. En una modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22. En otra modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22; y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N" : 22.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o al menos las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID N° : 22; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25.
En cualquiera de las modalidades que anteceden, se humaniza un anticuerpo anti-PMEL17. En una modalidad, un anticuerpo anti-PMEL17 comprende HVR como en cualquiera de las formas que se mencionaron en modalidades anteriores, y comprende adicionalmente una estructura aceptora humana, por ejemplo, una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado anti-PMEL17 comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-PMEL17 comprende una secuencia de cadena pesada de dominio variable (VH) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 11 o 51. En ciertas modalidades, una secuencia de VH que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 11 o 51 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones, o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID N° : 11 o 51. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEC ID N° : 11 o 51. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en regiones que se encuentran fuera de las HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VH de la SEC ID N° : 11 o 51, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22.
En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo anti-PMEL17, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 12. En ciertas modalidades, una secuencia VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 12 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID N° : 12.
En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEC ID N° : 12. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en las regiones fuera de la HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente , el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VL de la SEC ID N° : 12, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PMEL17, donde el anticuerpo comprende una VH tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden, y una VL tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en la SEC ID N° : 11 y la SEC ID N° : 12, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEC ID N° : 51 y la SEC ID N° : 12, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de estas secuencias.
En un aspeq,to adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-PMEL17 que se proporciona en la presente. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende una secuencia de VH de la SEC ID N° : 11 o 51 y una secuencia de VL de la SEC ID N° : 12.
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, un anticuerpo anti-P EL17 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o fragF(ab')2. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud considerablemente completa, por ejemplo, un anticuerpo IgGl u otra clase anticuerpo o isótopo tal como se define en la presente.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden puede incorporar cualquiera de las características, solas o combinadas, que se describen en las Secciones 1-7 más adelante .
Anticuerpo 31D1 y otras modalidades En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR del anticuerpo producido por el hibridoma llamado "7509 (31D1.6.7) " y almacenado en la ATCC el 24 de abril de 2012, que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. A los efectos de esta sección, se trazan las HVR mediante los intervalos de aminoácidos correspondientes a las CDR, es decir, CDR que se dan en los residuos de aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la región variable de cadena ligera, y los residuos de aminoácidos 31-35B, 50-65 y 95-102 de la región variable de cadena pesada (CDR-L1, CDR-L2 , CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, respectivamente). Véase Kabat et ál . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH producidas por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tienen el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En una modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En otra modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3, HVR-L3 y HVR-H2 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL del anticuerpo producidas por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En una modalidad, el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA- 12862; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA- 12862.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende HVR-H1, HVR-H2 , HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En cualquiera de las modalidades que anteceden, se humaniza un anticuerpo anti-PMEL17. En una de tales modalidades, el anticuerpo es una forma humanizada del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC PTA-12862. En una modalidad adicional, un anticuerpo anti-P EL17 comprende HVR tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden, y comprende adicionalmente una estructura aceptora humana, por ejemplo, una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-PMEL17 comprende una secuencia de cadena pesada de dominio variable (VH) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En ciertas modalidades, una secuencia de VH contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PMEL17 que comprenda esta secuencia conserva la capacidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC PTA-12862. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en regiones que se encuentran fuera de las HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esta secuencia. En una modalidad particular, la VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PMEL17, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En ciertas modalidades, una secuencia de VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) , inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencias de referencia, pero un anticuerpo anti-PMEL17 que comprenda esta secuencia conserva la capacidad de unirse a PMEL17. En ciertas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en las regiones fuera de la HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-PMEL17 comprende la secuencia de VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7 ) que tiene el número de registro de ATCC PTA-12862, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti- PMEL17, donde el anticuerpo comprende una VH tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden, y una VL tal como se describe en cualquiera de las modalidades que anteceden. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-PMEL17 que proporciona la presente. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC N° PTA-12862.
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, un anticuerpo anti-P EL17 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o fragF(ab')2. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud considerablemente completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG2b u otra clase anticuerpo o isotipo tal como se define en la presente.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-PMEL17 de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden puede incorporar cualquiera de las características, solas o combinadas, que se describen en las Secciones 1-7 más adelante . 2. Afinidad de anticuerpos En ciertas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente tiene una constante de disociación (Kd) de < ?µ , = 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, = 0,01 nM, o = 0,001 nM, y opcionalmente es = 10~13 M (por ejemplo, 10"8 M o menos, por ejemplo, de 10"8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10~13 M) .
En una modalidad, Kd se mide mediante un ensayo de unión de antígenos radiomarcados (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión en una solución de Fab con un antígeno se mide mediante el balance de Fab con una concentración mínima de un antígeno radiomarcado (125I) en presencia de una serie de titulación de un antígeno radiomarcado, capturando luego al antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpos anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et ál . , J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren durante la noche las placas de múltiples pocilios MICROTITER (Thermo Scientific) con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y luego se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , 100 pM o 26 pM de antígeno [1 5I] se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistentes con la evaluación de un anticuerpo an i-VEGF, Fab- 12, en Presta et ál . , Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo de tiempo mayor (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego se retira la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20a>) al 0,1% en PBS . Cuando se hayan secado las placas, se añaden 150 µ?/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20 ™; Packard, y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOU T ™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que producen menos o el equivalente al 20% de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva.
Según otra modalidad, se mide Kd utilizando ensayos de resonancia de plasmon superficial utilizando un BIACORE®-2000 o un BIACORE ¾-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 ug/ml (-0,2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con polisorbato 20 (TWEEN-20™) al 0,05% (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIACORE s Evaluation Software versión 3,2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación del equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen et ál . , J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación supera 106 M"1 s"1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de desactivación fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm,-emisión = 340 nm, pasabanda de 16 nm ) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20nM (forma Fab) en PBS, pH 7 , 2 , en presencia de concentraciones en aumento de antígeno como se midió en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 2. Fragmentos de anticuemos En ciertas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, de modo no taxativo, fragmentos de Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab' )2, Fv, y scFv, y otros fragmentos que se describen más adelante. Para un resumen de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et ál. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para un resumen del scFv, véase Pluckthün en The Pharmacology of Monoclonal ñntibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore ediciones., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); véase también WO 93/16185; y las patentes estadounidenses N° . 5,571,894 y 5,587,458. Para proposiciones sobre fragmentos de Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor de salvamento y tienen una semivida aumentada in vivo, véase la patente estadounidense N° . 5,869,046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígenos que pueden ser bivalentes o biespecíficos . Véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et ál., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos se describen también en Hudson et ál., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un único dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena pesada completo o una parte de este o un dominio variable de cadena ligera completo o una parte de este. En ciertas modalidades, un anticuerpo de un único dominio es un anticuerpo con un único dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° . 6,248,516 Bl) .
Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias técnicas, incluyendo, pero de modo no taxativo, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como también producción mediante células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago) , tal como se describe en la presente. 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados En ciertas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos en, por ejemplo, la patente estadounidense N° . 4,816,567; y en Morrison et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:6851-6855 (1984)) . En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, una rata, un hámster, un conejo o un primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con conmutación de clase" en el que la clase o subclase se ha conmutado de aquella del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígenos de estos.
En ciertas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en humanos, mientras que mantiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o partes de estas) derivan de un anticuerpo no humano, y las FR (o partes de estas) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, al menos una parte de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual derivan los residuos de las HVR) , por ejemplo, para reparar o mejorar la especificidad o afinidad de un anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos para elaborarlos se resumen en, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen más detalladamente en, por ejemplo, Riechmann et ál . , Nature 332:323-329 (1988); Queen et ál . , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); las patentes estadounidenses N° . 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, y 7,087,409; Kashmiri et ál., Methods 36:25-34 (2005) (descripción de transplante de SDR (a-CDR) ) ; Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (descripción de "resurfacing" ) ; Dall'Acqua et ál . , Methods 36:43-60 (2005) (descripción de "mezcla de FR" ) ; y Osbourn et ál., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et ál . , Br . J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (descripción de enfoque de "selección orientada" para mezclar FR) .
Las regiones marco humanas que pueden utilizarse para la humanización incluyen, pero de modo no taxativo: regiones marco seleccionadas utilizando el método de "ajuste óptimo" (véase, por ejemplo, Sims et ál . J. Immunol. 151:2296 (1993)) ; las regiones marco derivadas de una secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena pesada o de cadena ligera (véase, por ejemplo, Cárter et ál. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:4285 (1992); y Presta et ál . J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco humanas maduras (mutadas de forma somática) o regiones marco de línea germinal humanas (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas del cribado de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et ál . , J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et ál . , J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpos humanos En ciertas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo humano. Pueden producirse anticuerpos humanos utilizando varias técnicas conocidas en la técnica. En términos generales, se describen los anticuerpos humanos en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Los anticuerpos humanos pueden prepararse administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos intactos humanos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una prueba de antígenos. Tales animales contienen, normalmente, sitios de inmunoglobulina completos o partes de estos, los cuales reemplazan los sitios de inmunoglobulina endógenos o los cuales se encuentran presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente a los cromosomas del animal . En tales ratones transgénicos , en general, se han desactivado los sitios de inmunoglobulina endógenos. Por resúmenes de métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) . Véase también, por ejemplo, las patentes estadounidenses N° . 6,075,181 y 6,150,584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente estadounidense N° . 5,770,429 que describe la tecnología HUMAB® ; la patente estadounidense N° . 7,041,870 que describe la tecnología -M MOUSE® y la solicitud de patente estadounidense N° . US 2007/0061900, que describe la teconología VELOCIMOUSE®) . Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales pueden modificarse de forma adicional mediante, por ejemplo, una comparación con diferentes regiones constantes humanas.
Los anticuerpos humanos pueden obtenerse también mediante métodos basados en hibridomas . Se describieron las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano/ratón para la producción de anticuerpos monoclonales . (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Inmuno1., 133: 3001 (1984); Brodeur et ál . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et ál . , J. Immunol., 147: 86 (1991). También se describen anticuerpos humanos generados mediante tecnologías de hibridoma de células B en Li et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, la patente estadounidense N° . 7,189,826 (descripción de anticuerpos monoclonales humanos IgM de las líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4 ): 265 -268 (2006) (descripción de hibridomas humano/humano) . También se describe la tecnología de hibridoma humano (tecnología de triomas) en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
Los anticuerpos humanos pueden generarse también mediante el aislamiento de las secuencias de dominio variable de Fv clonado seleccionadas de bibliotecas de exhibición de fagos derivados de humanos. Tales secuencias de dominios variables pueden combinarse con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación. 5. Anticuerpos derivados de bibliotecas Se puede aislar los anticuerpos de la invención mediante cribados de bibliotecas combinatorias con la actividad o actividades deseada/s. Por ejemplo, se conoce en la técnica una variedad de métodos para generar bibliotecas de exhibición de fagos y cribar tales bibliotecas en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Tales métodos se resumen en, por ejemplo, Hoogenboom et ál . en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et ál . , ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen más detalladamente en, por ejemplo, McCafferty et ál . , Nature 348:552-554; Clackson et ál . , Nature 352: 624:-628 (1991); Marks et ál . , J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et ál . , J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et ál . , J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et ál . , J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004).
En ciertos métodos de exhibición de fagos, se clonan los repertorios de genes de VH y VL por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos que pueden cribarse luego en busca de fagos de unión a antígenos tal como se describe en Winter et ál . , Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) . Los fagos exhiben, normalmente, fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos de cadena simple de Fv (scFv) o como fragmentos de Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan al inmunógeno anticuerpos de alta afinidad sin necesitar la construcción de hibridomas . De manera alternativa, el repertorio sin inmunización puede clonarse (por ejemplo, de un humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a una amplia gama de antígenos ajenos y propios sin inmunización tal como se describe en Griffiths et ál . , EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas sin inmunización pueden elaborarse de forma sintética clonando segmentos génicos V sin reorganización de células madre, y utilizando cebadores PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr una reorganización in vitro, tal como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente estadounidense N° . 5,750,373, y las publicaciones de patentes N° . 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos de la presente. 6. Anticuerpos multiespecíficos En ciertas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de unión es para PMEL17 y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, una de las especificidades de unión es para PMEL17 y la otra es para CD3. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° . 5,821,337. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de PMEL17. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos para células que expresan PMEL17. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos .
Las técnicas para generar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero de modo no taxativo, la coexpresión recombinante de dos pares de cadenas pesadas/ligeras de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et ál . , EMBO J. 10: 3655 (1991)), y ensamblaje "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° . 5,731,168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden generar mediante el ensamblaje de efectos de direccionamiento electroestático para crear moléculas heterodiméricas de Fe de anticuerpos (WO 2009/089004A1) ; reticular dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° . 4,676,980, y Brennan et ál., Science, 229: 81 (1985)); utilizando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et ál . , J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992)); utilizando tecnología de "diacuerpo" para generar fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci . EUñ, 90:6444-6448 (1993)); y utilizando dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et ál . , J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos tal como se describe en, por ejemplo, Tutt et ál . J. Immunol. 147: 60 (1991).
Se incluye también en la presente a los anticuerpos modificados genéticamente con tres o más sitios de unión a antígenos funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo," (véase, por ejemplo, US 2006/0025576A1) .
El anticuerpo o fragmento descrito en la presente incluye también un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a PMEL17 así como también a otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, US 2008/0069820) . 7. Variantes de anticuerpos En ciertas modalidades, se contemplan las variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, se puede desear mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse introduciendo las modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica al anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de residuos y/o inserciones en estos y/o sustituciones de estos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución puede realizarse para llegar a la estructura final, siempre que la estructura final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígenos. a) Sustitución, Inserción y eliminación de variantes En ciertas modalidades, se proporcionan las variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitucional incluye las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 con el título "sustituciones preferidas" . Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 1 titulada "ejemplos de sustituciones," y tal como se describe más adelante con respecto a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Pueden introducirse modificaciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y cribar sus productos para una actividad deseada, por ejemplo, mantenimiento/mejora de unión a antígenos, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC me orados .
TABLA 1 Pueden agruparse los aminoácidos de acuerdo con propiedades comunes de cadena lateral : (1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácida: Asp, Glu (4) básica: His, Lys, Arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante sustitucional involucra la sustitución de uno o más de los residuos de las regiones hipervariables de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para estudios más detallados tendrán modificaciones (es decir, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad disminuida) en comparación con el antígeno original y/o mantendrán sustancialmente ciertas propiedades biológicas del anticuerpo original. Un ejemplo de variante sustitucional es un anticuerpo madurado por afinidad, el cual puede generarse de manera conveniente, por ejemplo, utilizando una técnica de maduración por afinidad basada en la exhibición de fagos tales como aquellas que se describen en la presente. Brevemente, se mutan uno o más de los residuos de HVR y se exhiben las variantes de anticuerpos en fagos y se realiza un cribado en busca de una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión) .
Pueden generarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Tales alteraciones pueden realizarse en "puntos calientes" de HVR es decir, residuos codificados por codones que sufren una mutación en una alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR) , con la prueba de la variante de VH o VL resultante para la afinidad de unión. Se describe la maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias en, por ejemplo, Hoogenboom et ál . en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et ál . , ed. , Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas modalidades de la maduración por afinidad, se introduce la diversidad en genes variables elegidos para maduración mediante cualquiera de numerosos métodos (por ejemplo, PCR susceptible a errores, mezcla de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos) . Se crea entonces una segunda biblioteca. Se criba entonces la biblioteca para identificar las variantes con la afinidad deseada. Otro método que introduce diversidad involucra enfoques dirigidos por HVR, en los que se distribuyen de forma aleatoria varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) . Los residuos HVR involucrados en la unión a antígenos pueden identificarse específicamente, por ejemplo, utilizando mutagénesis por barrido de alanina o modelado. En particular, se seleccionan CDR-H3 y CDR-L3.
En ciertas modalidades, pueden ocurrir sustituciones, inserciones o eliminaciones dentro de una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno. Por ejemplo, las alteraciones conservativas (por ejemplo, las sustituciones conservativas que se proporcionan en la presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión pueden generarse en HVR. Tales alteraciones pueden encontrarse fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En ciertas modalidades de las variantes de secuencias de VH y VL que se proporcionaron anteriormente, cada HVR o bien se encuentra sin alteraciones o contiene no más de dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un método útil para identificar residuos o regiones de un anticuerpo que pueden haber sido seleccionados para la mutagénesis es llamado "mutagénesis de barrido de alanina" tal como se describe en Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifica un residuo o grupo de residuos seleccionados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) mediante aminoácidos neutrales o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos demostrando la sensibilidad funcional a sustituciones iniciales. De manera alternativa, o adicionalmente , se utiliza una estructura de cristal de un complejo de antígeno/anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos limitantes pueden seleccionarse o eliminarse como candidatos para sustitución. Las variantes pueden ser cribadas para determinar si contienen las propiedades deseadas .
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo que oscilan en cuanto a longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones entre las secuencias de un único residuo de aminoácidos o de múltiples de ellos. Los ejemplos de inserciones de extremos incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo de extremo N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de los extremos N- o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida del anticuerpo en suero. b) Variantes de glicosilación En ciertas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente se altera para aumentar o disminuir el punto hasta el cual se puede glicosilar un anticuerpo. Puede lograrse de forma exitosa la adición o eliminación de sitios de glicosilación a un anticuerpo alterando la secuencia de aminoácidos de modo tal que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación.
En los casos en que el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido a este puede alterarse. Los anticuerpos naturales producidos por células mamíferas comprenden, normalmente, un oligosacárido ramificado de dos antenas que normalmente se encuentra unido mediante un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Véase, por ejemplo, right et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) . El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc) , galactosa y ácido siálico, así como también una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido de dos antenas. En algunas modalidades, las modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención pueden generarse para crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.
En una modalidad, las variantes de anticuerpos se proporcionan teniendo una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en comparación con la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras en complejo, híbridas o de alta cantidad de mañosa) tal como se mide mediante espectrómetro de masas MALDI-TOF, tal como se describe en, por ejemplo, WO 2008/077546. Asn297 hace referencia al residuo de asparagina ubicado en alrededor de la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de los residuos de la región Fe) sin embargo, Asn297 puede ubicarse también alrededor de + 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo en la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores en anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden haber mejorado la función ADCC. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patentes estadounidenses N° . US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Los ejemplos de publicaciones relacionado con variantes de anticuerpos "defucosiladas" o "deficiente en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140 ; Okazaki et ál . J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et ál . Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células Lecl3 CHO con deficiencia en fucosilación proteica (Ripka et ál . Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986) ; Solicitud de patente estadounidense N° US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et ál., especialmente en el Ejemplo 11) y líneas celulares desactivadas, tales como el gen alfa-1, 6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO desactivadas (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et ál. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et ál., Biotechnol. Bioeng., 94 (4) : 680-688 (2006); y WO2003/085107) .
Además se proporcionan variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en los cuales un oligosacárido con dos antenas unido a la región Fe del anticuerpo se bisecta por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpos se describen en, por ejemplo, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et ál . ) ; patente estadounidense N.° 6.602.684 (Umana et ál) ; y US 2005/0123546 (Umana et ál) . También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos se describen en, por ejemplo, O 1997/30087 (Patel et ál) ; WO 1998/58964 (Raju, S . ) ; y WO 1999/22764 (Raju, S. ) . c) Variantes de la región Fe En determinadas modalidades, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en el presente, generado así una variante de la región Fe . La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana [por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En determinadas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que la convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la semivida del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo para confirmar la reducción/pérdida de las de actividades CDC o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fe (FcR) se pueden realizar para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC) , pero mantiene la capacidad de unión a FcRn. Las células principales para mediar células ADCC, NK, solamente expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991). Se describen los ejemplos no taxativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente estadounidense N° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et ál. Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et ál . , Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (véase Bruggemann, M. et ál., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad ACTI™ no radioactivo de citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad CytoTox 96 radioactivo (Promega, Madison, WI) . Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células destructoras naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal, por ejemplo el descrito en Clynes et ál . Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a Clq para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a Clq y, por lo tanto, carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación de complementos, se puede realizar un ensayo con CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et ál, J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, .S. et ál . , Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se puede realizar la unión a FcRn y las determinaciones in vivo de eliminación/semivida utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et ál., Int'l. Immunol. 18 ( 12 ): 1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen los que tienen sustitución de uno o más residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense N° 6.737.056). Dichos mutantes Fe incluyen los mutantes Fe con sustituciones en dos o más posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante Fe también denominado "DANA" con sustitución de residuos 265 y 297 de alanina (patente estadounidense N. ° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpos con unión a FcR mejorada o disminuida. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 6,737,056; WO 2004/056312, y Shields et ál., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de residuos) .
En algunas modalidades, se realizan alteraciones en la región Fe que producen unión a Clq alterada (es decir, ya sea mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) , por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense N.° 6.194.551, WO 99/51642, y Idusogie et ál. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas mayores y unión mejorada al receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable de la transferencia de IgG materna al feto (Guyer et ál . , J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et ál . , J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et ál . ) .
Esos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en ellas que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Dichas variantes de Fe incluyen las que tienen sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo de la región Fe 434 (patente estadounidense N° . 7,371,826).
Véase también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente estadounidense N° . 5,648,260; patente estadounidense N° . 5,624,821; y O 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fe. d) Variantes de anticuerpos modificados genéticamente con cis eína En determinadas modalidades, puede ser deseable crear anticuerpos modificados genéticamente con cisterna, por ejemplo, "thioMAbs" , en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modalidades particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, se ubican grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo a otros restos, por ejemplo restos de fármacos o restos fármaco-enlazadores, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en el presente. En determinadas modalidades, se puede sustituir cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína : V205 (numeración Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada,- y S400 (numeración EU) de la región Fe de cadena pesada. Los anticuerpos modificados genéticamente con cisteina pueden generarse como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense N° 7.521.541. e) Derivados de anticuerpos En determinadas modalidades, un anticuerpo proporcionado en la presente puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteináceas adicionales que se conocen en la técnica y se encuentran fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivación del anticuerpo incluyen, pero de modo no taxativo, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no taxativos de polímeros solubles en agua incluyen, pero de modo no taxativo, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilalcohol , polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolimeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros propropilenglicol , copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado (por ejemplo, glicerol) , polivinilalcohol y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si hay más de un polímero unido, pueden ser las mismas moléculas o moléculas diferentes. En general, la cantidad o tipo de polímeros utilizados para la derivación se pueden determinar en base a consideraciones que incluyen, de modo no taxativo, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se mejorará, ya sea que el derivado de anticuerpo se utilice en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otra modalidad, se proporcionan los conjugados de un anticuerpo y el resto no proteináceo que se puede calentar de forma selectiva mediante la exposición a la radiación. En una modalidad, el resto no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, de modo no taxativo, longitudes de onda que no dañan las células comunes, pero que calientan el resto no proteináceo a una temperatura en la cual las células próximas al resto no proteináceo del anticuerpo mueren.
B. Composiciones y métodos recombinantes Los anticuerpos se pueden producir utilizando composiciones y métodos recombinantes, por ejemplo, tales como se describen en la patente estadounidense N° . 4,816,567. En una modalidad, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-PMEL17 descrito en el presente. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo) . En otra modalidad, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otra modalidad, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En una de taless modalidades, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH el anticuerpo. En una modalidad, la célula hospedadora es eucariota, por ejemplo, una célula ovárica de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20) . En una modalidad, se proporciona un método para realizar un anticuerpo anti-PMEL17, en donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se describió anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o medio de cultivo de células hospedadoras) .
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-PMEL17, se aisla un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describió anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Tal ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo) .
Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando la glicosilación y la función efectora de Fe no se necesitan. Para la expresión de fragmentos y polipéptidos de anticuerpos en bacterias, véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses N. ° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli) . Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de células bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente .
Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o la levadura son hospedadoras de clonación o de expresión adecuados para los vectores codificantes de anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levadura cuyas vías de glicosilacion se han "humanizado" , dando lugar a la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilacion parcialmente o completamente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et ál., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden utilizar junto con células de insectos, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda .
También se pueden utilizar como hospedadoras los cultivos celulares vegetales. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLA TIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .
También se pueden utilizar como hospedadoras las células de los vertebrados. Por ejemplo, pueden ser útiles las líneas celulares mamíferas que se adaptan para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares hospedadoras mamíferas útiles son las líneas de células CV1 de riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7) ; líneas embrionarias humanas de riñon (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et ál . , J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK) ; células de sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VERO- 76) ; células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA) ; células de riñon canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) ; células de pulmón humano ( 138) ; células de hígado humano (Hep G2) ; tumor de mama de ratón (MMT 060562) ; células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et ál . , Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares hospedadoras mamíferas útiles incluyen células ováricas de hámster chino (CHO) , incluso células DHFR" CHO (Urlaub et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para un resumen de determinadas líneas celulares hospedadoras mamíferas adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003).
C . Ensayos .
Los anticuerpos anti-PMEL17 proporcionados en la presente se pueden identificar, evaluar o caracterizar para conocer sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas a través de diversos ensayos conocidos en la técnica.
En un aspecto, se evalúa un anticuerpo de la invención para conocer su actividad de unión al antígeno, por ejemplo, a través de métodos conocidos, tales como ELISA, BIACore®, FACS o análisis de transferencia Western.
En otro aspecto, se pueden utilizar ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente para la unión a PMEL17. En determinadas modalidades, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o un epítopo conformacional) que está unido por un anticuerpo descrito en la presente. Los ejemplos de métodos detallados para mapear un epítopo al cual se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" , en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) .
En un ejemplo de ensayo de competición, se incuba la PMEL17 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a PMEL17 (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente) y un segundo anticuerpo sin marcar que se está evaluando para conocer su capacidad de competir con el primer anticuerpo para la unión a PMEL17. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas . Como control, se incuba la PMEL17 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo sin marcar. Después de la incubación en condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo a PMEL17, se elimina el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con la PMEL17 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con la PMEL17 inmovilizada es sustancialmente reducida en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, esto indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo para la unión a PMEL17. Véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies : A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) .
D . Inmunocon ugados La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-PMEL17 conjugado en el presente a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de estas) , o isótopos radioactivos (es decir, un radioconjugado) .
Los inmunoconjugados permiten la administración dirigida de un resto de fármaco a un tumor y, en algunas modalidades, la acumulación intracelular allí, en donde la administración sistemática de fármacos no conjugados puede producir niveles inaceptables de toxicidad a las células normales (Polakis P. (2005) Current Opinión in Pharmacology 5 : 382-387) .
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) son moléculas quimioterapéuticas dirigidas que combinan propiedades los anticuerpos y los fármacos citotóxicos teniendo como diana fármacos citotóxicos potentes para células tumorales que expresan antigeno (Teicher, B.A. (2009) Current Cáncer Drug Targets 9:982-1004), potenciando así el índice terapéutico maximizandó la eficacia y minimizando la toxicidad específica (Cárter, P.J. y Senter P.D. (2008) The Cáncer Jour. 14 (3) : 154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107 .
Los compuestos ADC de la invención incluyen los que tienen actividad contra el cáncer. En algunas realizaciones, los compuestos ADC incluyen un anticuerpo conjugado, es decir, unido por enlace covalente, al resto del fármaco. En algunas modalidades, el anticuerpo está unido por enlace covalente al resto de fármaco a través de un enlazador. Los conjugados de anticuerpo- fármaco (ADC) de la invención administran selectivamente una dosis eficaz de un fármaco a un tejido de tumor, por lo tanto se puede lograr mayor selectividad, es decir, una menor dosis eficaz, mientras aumenta el índice terapéutico ("ventana terapéutica") .
El resto de fármaco (D) de los conjugados de anticuerpo- fármaco (ADC) puede incluir cualquier compuesto, resto o grupo que tenga un efecto citotóxico o citostático. Los restos de fármaco pueden ejercer sus efectos citotóxicos o citostáticos a través de mecanismos que incluyen, de modo no taxativo, unión a la tubulina, interacción o unión al ADN e inhibición de polimerasa AR , síntesis proteica y/o topoisomerasa. Los ejemplos de restos de fármaco incluyen, de modo no taxativo, un maitansinoide , dolastatina, auristatina, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepina (PBD) , nemorrubicina y sus derivados, PNU-159682, antraciclina, duocarmicina, alcaloides de la vinca, taxano, tricoteceno, CC1065, camptotecina, elinafida y estereoisómeros , isóseteres, análogos y sus derivados que tienen actividad citotóxica. Los ejemplos no taxativos de dichos inmunoconj gados se discuten más detalladamente a continuación.
J. Ejemplos de conjugados de anticuerpo-fármaco Un ejemplo de modalidad de un compuesto de conjugado de anticuerpo- fármaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) que tiene como diana una célula tumoral, un resto de fármaco (D) y un resto enlazador (L) que une el Ab a D. En algunas modalidades, el anticuerpo se une al resto enlazador (L) a través de uno o más residuos de aminoácidos, como lisina o cisteína.
Un ejemplo de ADC tiene la Fórmula I: Ab-(L-D)p I donde p es 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, la cantidad de restos de fármaco que se pueden conjugar con un anticuerpo se encuentra limitada por la cantidad de residuos de cisteína libres. En algunas modalidades, se introducen los residuos de cisteína libres en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo a través de los métodos descritos en la presente. Los ejemplos de ADC de la Fórmula I incluyen, de modo no taxativo, anticuerpos que tienen 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de cisteína modificados (Lyon, R. et ál . (2012) Methods in Enzym. 502:123-138) . En algunas modalidades, uno o más residuos de cisteína libres ya están presentes en un anticuerpo, sin la utilización de modificación genética, en cuyo caso se pueden utilizar los residuos de cisterna libres existentes para conjugar el anticuerpo con un fármaco. En algunas modalidades, se expone un anticuerpo a condiciones reductoras antes de la conjugación del anticuerpo para generar uno o más residuos de cisteína libres. a) Ejemplos de enlazadores Un "enlazador" (L) es un resto bifuncional o multifuncional que se puede utilizar para unir uno o más restos de fármaco (D) a un anticuerpo (Ab) para formar un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula I. En algunas modalidades, se pueden preparar conjugados de anticuerpo- fármaco (ADC) utilizando un enlazador que tenga grupos funcionales reactivos para unirse por enlace covalente al fármaco y al anticuerpo. Por ejemplo, en algunas modalidades, un tiol de cisteína de un anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional reactivo de un enlazador o un intermedio de fármaco-enlazador para producir un ADC.
En un aspecto, un enlazador tiene un grupo funcional capaz de reaccionar con una cisteína libre presente en un anticuerpo para formar un enlace covalente. Los ejemplos no taxativos de dichos grupos funcionales reactivos incluyen maleimida, haloacetamidas , oc-haloacetilo, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos . Véase, por ejemplo, el método de conjugación de la página 766 de Klussman, et ál (2004) , Bioconjugate Chemistry 15 (4) : 765-773 , y los ejemplos de la presente.
En algunas modalidades, un enlazador tiene un número de grupos funcionales capaz de reaccionar con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los ejemplos de dichos grupos electrófilos incluyen, de modo no taxativo, grupos carbonilo de aldehidos y cetonas . En algunas modalidades, un heteroátomo del número de grupos funcionales reactivos del enlazador puede reaccionar con un grupo electrófilo de un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad del anticuerpo. Los ejemplos no taxativos de dichos números de grupos funcionales reactivos incluyen, de modo no taxativo, hidracida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
Un enlazador puede comprender uno o más componentes enlazadores. Los ejemplos de componentes enlazadores incluyen 6-maleimidocaproil ( "MC" ) , maleimidopropanoil ( "MP" ) , valina-citrulina ("val-cit" o "ve"), alanina-fenilalanina ("ala-phe" ) , p-aminobenciloxicarbonilo (un "PAB"), N-succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP") y 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ( "MCC" ) . Se conocen varios componentes enlazadores en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación.
Un enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco. Los ejemplos no taxativos de enlazadores escindibles incluyen enlazadores lábiles al ácido (por ejemplo, que comprenden hidrazona) , enlazadores sensibles a proteasa (por ejemplo, sensibles a peptidasa) , enlazadores fotolábiles o enlazadores que contienen disulfuro (Chari et ál . , Cáncer Research 52:127-131 (1992) ; US 5208020) .
En algunas modalidades, un enlazador tiene la siguiente Fórmula II: -Aa—WW—Yy~ T1 en donde A es una "unidad extensora" y a es un entero de 0 a 1; W es una "unidad de aminoácido" y w es un entero de 0 a 12; Y es una "unidad espadadora" e y es 0, 1 o 2; y Ab, D, y p se encuentran definidos por la Fórmula I que se mencionó anteriormente. Los ejemplos de modalidades de tales enlazadores se describen en la patente estadounidense N° . 7,498,298, la cual se incorpora a la presente expresamente mediante esta referencia.
En algunas modalidades, un componente enlazador comprende una "unidad extensora" que une un anticuerpo con otro componente enlazador o con un resto de fármaco. A continuación se presentan ejemplos no taxativos de unidades extensoras (en donde la línea ondeada indica los sitios de unión covalente con un anticuerpo, fármaco u otros componentes enlazadores) : En algunas modalidades, un componente enlazador comprende una "unidad de aminoácido" . En algunas de tales modalidades, la unidad de aminoácido permite la escisión del enlazador a través de una proteasa, facilitando así la liberación del fármaco del xnmunoconjugado tras la exposición a las proteasas intracelulares , tales como las enzimas lisosómicas (Doronina et ál . (2003) Nat. Biotechnol . 21:778-784) . Los ejemplos de unidades de aminoácido incluyen, de modo no taxativo, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos . Los ejemplos de dipéptidos incluyen, de modo no taxativo, valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) ; fenilalanina-lisina (fk o phe-lys) ; fenilalanina-homolisina (phe-homolys) ; y N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit) . Los ejemplos de tripéptidos incluyen, de modo no taxativo, glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Una unidad de aminoácido puede comprender residuos de aminoácidos de origen natural y/o aminoácidos menores y/o análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como la citrulina.
Las unidades de aminoácidos pueden diseñarse y optimizarse por escisión enzimática mediante una enzima en particular, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor, catesina B, C y D, o una proteasa plasmina.
En algunas modalidades, un componente enlazador comprende una unidad "espadadora" que une el anticuerpo con un resto de fármaco, ya sea directamente o a través de una unidad extensora y/o una unidad de aminoácido. Una unidad espaciadora puede ser "autodestructiva" o "no autodestructiva" . Una unidad espaciadora "no autodestructiva" es una unidad en la cual parte o toda la unidad espaciadora permanece unida al resto de fármaco tras la escisión del ADC. Los ejemplos de unidades espadadoras no autodestructivas incluyen, de modo no taxativo, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. En algunas modalidades, la escisión enzimática de un ADC que contiene una unidad espaciadora glicina-glicina por una proteasa asociada a una célula tumoral provoca la liberación de un resto glicina-glicina- fármaco del resto del ADC. En algunas de tales modalidades, se somete el resto glicina-glicina-fármaco a una etapa de hidrólisis en la célula tumoral, escindiendo así la unidad espaciadora glicina-glicina del resto de fármaco.
Una unidad espaciadora "autodestructiva" permite la liberación del resto de fármaco. En determinadas modalidades, una unidad espaciadora de un enlazador comprende una unidad de p-aminobencilo . En algunas de dichas modalidades, un alcohol p-aminobencílico se une a una unidad de aminoácido a través de un enlace amida y se forma un carbamato, metilcarbamato o carbonato entre el alcohol bencílico y el fármaco (Hamann et ál . (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). En algunas modalidades, la unidad espaciadora comprende p-aminobenciloxicarbonilo (PAB) . En algunas modalidades, un ADC que comprende un enlazador autodestructivo tiene la estructura: donde Q es alquilo-Ci-C8 , -O- (alquiloCi-Cg) , -halógeno, -nitro, o -ciano; m es un entero de 0 a 4 ; y p oscila de 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, p oscila de 1 a 10, l a 7, l a 5 o l a 4.
Otros ejemplos de espaciadores autodestructivos incluyen, de modo no taxativo, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB, como derivados de 2- aminoimidazol-5-metanol (patente estadounidense N° 7.375.078; Hay et ál . (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett . 9:2237) y orto- o para-aminobencilacetales . En algunas modalidades, se pueden utilizar espaciadores que sufren ciclización luego de la hidrólisis del enlace amida, como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues y et ál. (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillos biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] adecuadamente sustituidos (Storm et ál (1972) J. ñmer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et ál (1990) J. Org. Chem. 55:5867) . El enlace de un fármaco al carbono de un residuo de glicina es otro ejemplo de un espaciador autodestructivo que puede ser útil en ADC (Kingsbury et ál . (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
En algunas modalidades, el enlazador L puede ser un enlazador de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un resto de fármaco a un anticuerpo a través de un resto enlazador multifuncional ramificado (Sun et ál . (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et ál. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la proporción molar de fármaco a anticuerpo, es decir, la carga, que está relacionada con la potencia del ADC. Por lo tanto, cuando un anticuerpo tiene solo un grupo tiol de cisteina reactivo, se pueden unir muchos restos de fármaco a través de un enlazador dendrítico .
A continuación, se muestran ejemplos no taxativos de enlazadores en el contexto de un ADC de Fórmula I: cit-PAB Otros ejemplos no taxativos de ADC incluyen las estructuras : cada R es independientemente H o alquilo Ci-C6; y n es 1 a 12.
Normalmente, los enlazadores de tipo peptídicos pueden prepararse mediante la formación de una unión peptídica entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Tales enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de síntesis en fase líquida (por ejemplo, E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides" , tomo 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) .
En algunas modalidades, se sustituye un enlazador por grupos que modulan la solubilidad y/o reactividad. Como ejemplo no taxativo, un sustituyente cargado como sulfonato (-S(-V) o amonio puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo del enlazador y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo del enlazador con el anticuerpo y/o el resto de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L (intermedio de anticuerpo-enlazador) con D o D-L (intermedio de fármaco-enlazador) con Ab, dependiendo de la vía de síntesis utilizada para preparar el ADC. En algunas modalidades, una parte enlazadora se acopla al anticuerpo y una parte enlazadora se acopla al fármaco, y después el Ab- (parte enlazadora) a se acopla al fármaco- (parte enlazadora) b para formar el ADC de Fórmula I . En algunas de tales modalidades, el anticuerpo comprende más de un sustituyente (parte enlazadora) a, de modo tal que un fármaco se acople a un anticuerpo en el ADC de la Fórmula I.
Los compuestos de la invención contemplan expresamente, de modo no taxativo, el ADC preparado con los siguientes reactivos de enlazadores: bis-maleimido-trioxietilenglicol (BMPEO) , éster de N- ( ß-maleimidopropiloxi) -N-hidroxi succinimida (BMPS) , éster de N- ( e -maleimidocaproiloxi) succinimida (EMCS) , éster de N- [?-maleimidobutiriloxi] succinimida (GMBS) , 1 , 6 -hexan-bis-vinilsulfona (HBVS) , succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxi- (6-amidocaproato) (LC-SMCC) , éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), hidrazida de ácido 4 - ( -N-Maleimidofenil) butírico (MPBH) , succinimidil 3- (bromoacetamido) ropionato (SBAP) , succinimidil yodoacetato (SIA) , succinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato (SIAB) , N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) propionato (SPDP) , N-succinimidil-4- (2-piridiltio) entanoato (SPP) , succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC) , succinimidil 4 - (p-maleimidofenil) butirato (SMPB) , succinimidil 6-[(beta-maleimidopropionamido) hexanoato] (SMPH) , iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y succinimidil- (4 -vinilsulfon) benzoato (SVSB) e incluido los reactivos bis-maleimida: ditiobismaleimidoetano (DTME) , 1,4- Bismaleimidobutano (BMB) , 1,4 Bismaleimidil-2 , 3-dihidroxibutano (BMDB) , bismaleimidohexano (BMH) , bismaleimidoetano (BMOE) , BM(PEG)2 (se muestra a continuación) y BM(PEG)3 (se muestra a continuación) ; derivados bifuncionales de imidoésteres (como clorhidrato de dimetil adipimidato HCL) , ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (como 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (como 1,5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) . En algunas modalidades, los reactivos bis-maleimida permiten la unión del grupo tiol de una cisteína en el anticuerpo a un resto de fármaco, enlazador o intermedio de enlazador-fármaco que contiene tiol. Otros grupos funcionales que son reactivos a grupos tiol incluyen, de modo no taxativo, yodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato .
BM(PEG)2 BM(PEG)3 Determinados reactivos de enlazadores útiles se pueden obtener de varias fuentes comerciales, tales como Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL) , Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) o se pueden sintetizar de acuerdo con los procedimientos descritos en la técnica; por ejemplo, en Toki et ál. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et ál . (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et ál (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743 ; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminpentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de un agente quelante para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase, por ejemplo, WO94/11026. b) Ejemplos de restos de fármaco (1) Maitansina y maitansinoides En algunas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de maitansina. Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan por medio de la inhibición de polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África Oriental Maytenus serrata (patente estadounidense N° 3896111) . Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producían maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (Patente estadounidense N° 4,151,042). Los maitansinoides sintéticos se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses N. ° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663 y 4.371.533.
Los restos de fármacos maitansinoides son restos de fármacos atractivos en los conjugados de anticuerpo-fármaco porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química o derivación de productos de fermentación, (ii) favorecen la derivación con grupos funcionales adecuados para la conjugación mediante enlazadores no disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) eficaces contra diversas líneas celulares tumorales .
Algunos maitansinoides adecuados para utilizar como restos de fármacos maitansinoides son conocidos en la técnica y se pueden aislar de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos o se pueden producir utilizando técnicas de modificación genética (véase, por ejemplo, Yu et ál . (2002) PNAS 99:7968-7973). Los maitansinoides también se pueden preparar sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos.
Los ejemplos de restos de fármacos maitansinoides incluyen, de modo no taxativo, aquellos que tienen un anillo aromático modificado, por ejemplo: C-19-decloro (Patente estadounidense No. 4256746) (preparado, por ejemplo, mediante reducción de hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2) ; C-20-hidroxi (o C-20-demetilo) +/-C-19-decloro (Patentes estadounidenses Nos. 4361650 y 4307016) (preparado, por ejemplo, mediante demetilación usando Streptomyces o Actinomyces o declorinación usando LAH) ; y C-20-demetoxi , C-20-aciloxi (-OCOR) , +/-decloro (Patente estadounidense No. 4294757) (preparado, por ejemplo, mediante acilación usando cloruros de acilo) y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones del anillo aromático.
Los ejemplos de restos de fármaco maitansinoide también incluyen los que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (Patente estadounidense N. ° 4424219) (preparado, por ejemplo, por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5) ; C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2 OR) (US 4331598),- C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (Patente estadounidense N.° 4450254) (preparado, por ejemplo, a partir de Nocardia) ; C-15-hidroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado, por ejemplo, por . la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (patente estadounidense Nos. 4313946 y 4315929) (por ejemplo, aislado de Trewia nudlflora) ; C-18-N-demetilo (Patente estadounidense N" . 4362663 y 4322348) (preparado, por ejemplo, por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y 4,5-desoxi (US 4371533) (preparado, por ejemplo, por la reducción con tricloruro de titanio/LAH de maitansinol) .
Muchas posiciones en los compuestos de maitansinoides son útiles como la posición de enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede formarse por la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. En algunas modalidades, la reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En algunas modalidades, se forma el enlace en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
Los restos de fármacos maitansinoides incluyen aquellas que tienen la estructura: en donde la línea ondeada indica la unión covalente del átomo de azufre del resto de fármaco maitansinoide con un enlazador de un ADC. Cada R puede ser independientemente H o un grupo Ci-C6. La cadena de alquileno que une el grupo amida al átomo de azufre puede ser metanilo, etanilo o propilo, es decir, m es 1, 2 o 3 (US 633410; US 5208020; Chari et ál . (1992) Cáncer Res. 52:127-131; Liu et ál (1996) Proc . Nati. Acad. Sci EUA 93:8618-8623).
Se contemplan todos los estereoisómeros del restode fármaco maitansinoide para el ADC de la invención, es decir, cualquier combinación de las configuraciones R y 5 en los carbonos quirales (US 7276497; US 6913748; US 6441163; US 633410 (RE39151) ; US 5208020; Widdison et ál . (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408, que se incorporan en su totalidad a la presente mediante esta referencia) . En algunas modalidades, el resto de fármaco maitansinoide tiene la siguiente estereoquímica : Las modalidades de ejemplo de los restos de fármacos maitansinoides incluyen, entre otros, DM1; DM3 y DM4, que tienen las estructuras: en donde la línea ondeada indica la unión covalente del átomo de azufre del fármaco con un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco.
Otros ejemplos de conjugados de anticuerpo de maitansinoide-fármaco tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en donde Ab es anticuerpo y p es entre 1 y alrededor de 20. En algunas modalidades, p es de 1 a 10, p es de 1 a 7, p es de 1 a 5 o p es de 1 a 4) : DM1 Los ejemplos de conjugados de anticuerpo-fármaco en donde DM1 está unido a través de un enlazador B PEO a un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y la abreviatura : en donde Ab es anticuerpo; n es 0, 1 o 2 ; y p es de 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, p es de 1 a 10, p es de 1 a 7, p es de 1 a 5 o p es de 1 a 4.
Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos para prepararlos y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidense N. ° 5.208.020 y 5.416.064; US 2005/0276812 Al; y en la patente europea EP 0 425 235 Bl, cuyas descripciones se incorporan expresamente la presente mediante esta referencia. Véase también Liu et ál.
Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA 93:8618-8623 (1996); y Chari et ál. Cáncer Research 52:127-131 (1992).
En algunas modalidades, se pueden preparar los conjugados de anticuerpo-maitansinoide a través del enlace químico de un anticuerpo con una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 5.208.020 (cuya descripción se incorpora expresamente a la presente mediante esta referencia) . En algunas modalidades, ADC con un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha presentado una eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente la función o la solubilidad del anticuerpo. En algunas instancias, incluso se espera que una molécula de toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad con respecto al uso del anticuerpo sin inmunización.
Los ejemplos de grupos de unión para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoide incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en la presente y aquellos descritos en la patente estadounidense N.° 5208020; patente EP 0 425 235 Bl; Chari et ál . Cáncer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 Al; y US 2005/016993 Al, cuyas descripciones se expresan expresamente a la presente mediante esta referencia. (2) Auristatinas y Dolastatinas Los restos de fármaco incluyen las dolastatinas, auristatinas y sus análogos y derivados (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431) . Las auristatinas son derivados del compuesto de molusco marino dolastatina-10. Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular, se ha observado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con las dinámicas microtubulares , la hidrólisis GTP y la división nuclear y celular (Woyke et ál (2001) Antimicrob . Agents and Chemother. 45 (12) : 3580-3584 ) y presentan actividad contra el cáncer (US 5,663,149) y actividad antifúngica (Pettit et ál (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965) . El resto de fármaco de dolastatina/auristatina se puede unir al anticuerpo a través del extremo N (amino) o del extremo C (carboxilo) del resto de fármaco peptídico (WO 02/088172; Doronina et ál . (2003) Nature Biotechnology 21(7) :778-784; Francisco et ál . (2003) Blood 102(4) :1458-1465) .
Los ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen los restos DE y DF de fármaco de monometilauristatina unidas al extremo N , descritas en US 7498298 y US 7659241, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente mediante referencia: en donde la linea ondeada de DE y DF indica el sitio de unión covalente a un anticuerpo o anticuerpo-componente enlazador e independientemente en cada ubicación: R2 se selecciona de H y alquilo (Ci-C8) ; R3 se selecciona de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 y alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 se selecciona de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 y alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R5 se selecciona de H y metilo; o R4 y R5 forman en conjunto un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n en donde Ra y Rb se seleccionan de manera independiente de H, alquilo Cx-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona de H y alquilo (Cx-C8) ; R7 se selecciona de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Cx-C8, alquilo Cx-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 y alquilo Cx-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 se selecciona de manera independiente de H, OH, alquilo Cx-C8, carbociclo C3-C8 y 0- (alquilo Cx-C8) ; R9 se selecciona de H y alquilo Cx-C8; R10 se selecciona de arilo o heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH o NR12, en donde R12 es alquilo Cx-C8; R11 se selecciona de H, alquilo Cx-C2o arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14 , o - (R130) m-CH (R15) 2 ; m es un número entero que oscila de 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo Cx-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-S03H, o - (CH2) n-S03-alquilo d-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo d-Cg, o -(CH2)n-COOH; R18 se selecciona de — C (R8) 2-C (R8) 2— rilo, -C(R8)2-C(R8) 2- (heterociclo C3-CB) y -C (R8) 2-C (R8) 2- (carbociclo C3-C8) ; y n es un número entero que oscila de 0 a 6.
En una modalidad, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H o metilo. En un ejemplo de modalidad, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo .
En aun otra modalidad, R2 y R6 son cada uno metilo y R9 es -H.
En aún otra modalidad, cada aparición de R8 es -OCH3. En un ejemplo de modalidad, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y Rs son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
En una modalidad, Z es -O- o -NH- .
En una modalidad, R10 es arilo.
En un ejemplo de modalidad, R10 es fenilo.
En un ejemplo de modalidad, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En una modalidad, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, donde R15 es - (CH2) n-N (R16) 2 , y R1S es -alquilo Ci-C8 o -(CH2)n-COOH.
En otra modalidad, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, donde R15 es - (CH2) n-S03H.
Un ejemplo de modalidad de auristatina de la fórmula DE es MMAE, en donde la línea ondeada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo- f rmaco : Un ejemplo de modalidad de auristatina de la fórmula DF i MMAF, en donde la línea ondeada indica la unión covalente un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo- fármaco: Otros ejemplos de modalidades incluyen compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones carboxi de fenilalanina en el extremo C del resto de fármaco de auristatina pentapeptídica (WO 2007/008848) y compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de cadena lateral de fenilalanina en el extremo C del resto de fármaco de auristatina pentapeptídica (WO 2007/008603) .
Los ejemplos no taxativos de ADC de Fórmula I que comprenden MMAE o MMAF y diversos componentes enlazadores tienen la siguientes estructuras y abreviaturas (en donde "Ab" es un anticuerpo; p es de 1 a aproximadamente 8, "Val-Cit" es un dipéptido de valina-citrulina,- y "S" es un átomo de azufre: Ab-MC-MMAF Los ejemplos de modalidades no taxativas de ADC de Fórmula I que comprenden MMAF y diversos componentes enlazadores incluyen además Ab-MC-PAB-MMAF y Ab-PAB-MMAF. Se ha observado que los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un enlazador que no es escindible proteolíticamente presentan actividad similar a la de los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un enlazador escindible proteolíticamente (Doronina et ál . (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124). En algunas de dichas modalidades, se cree que la liberación del fármaco es efectuada por la degradación del anticuerpo en la célula.
Típicamente, los restos de fármaco basadas en péptido se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Tales enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de síntesis en fase líquida (véase, por ejemplo, E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides" , tomo 1, pp 76-136, 1965, Academic Press). Los restos de fármaco de auristatina/dolastatina, en algunas modalidades, se pueden preparar según los métodos: US 7498298; US 5635483; US 5780588; Pettit et ál (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et ál (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et ál . Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et ál (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; y Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21 (7) : 778-784.
En algunas modalidades, se pueden preparar los restos de fármaco de auristatina/dolastatina de fórmulas DE, como MMAE y DF, como MMAF e intermedios de fármaco-enlazador y sus derivados, como MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF y MC-vc-PAB-MMAE utilizando los métodos descritos en US 7498298; Doronina y et l (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; y Doronina et ál. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784 y después se pueden conjugar con un anticuerpo de interés. (3) Caliqueamicina En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina y análogos de esta, son capaces de producir rupturas en el ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares (Hinman et ál., (1993) Cáncer Research 53:3336-3342; Lode et al., (1998) Cáncer Research 58:2925-2928). La calqueamicina tiene sitios intracelulares de acción pero, en determinados casos, no cruza fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos, en algunas modalidades, potencia en gran medida sus efectos citotóxicos. Los ejemplos de métodos no limitativos para preparar conjugados de anticuerpo- fármaco con un resto de fármaco calqueamicina se describen, por ejemplo, en US 5712374; US 5714586; US 5739116; y US 5767285. (4) Pirrolobenzodiazepinas En algunas modalidades, un ADC comprende una pirrolobenzodiazepina (PBD) . En algunas modalidades, los dímeros de PDB reconocen y se unen a secuencias de ADN específicas. El producto natural, antramicina, un PBD, se reportó por primera vez en 1965 (Leimgruber, et ál . , (1965) J. Am. Chem. Soc, 87:5793-5795; Leimgruber, et ál . , (1965) J. Am. Chem. Soc, 87:5791-5793). Desde entonces, se han reportado una cantidad de PBD, tanto de origen natural como análogos (Thurston, et ál., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465 incluyendo dímeros de la estructura de PBD tricíclica (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099) . Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que la estructura de dímero imparte la forma tridimensional apropiada para la isohelicidad con el surco menor del ADN forma B, lo cual lleva a un ajuste apretado en el sitio de unión (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Nueva York, páginas 3-11 (1975); Hurley y Needham-VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230-237). Se ha demostrado que los compuestos diméricos PBD que portan sustituyentes arilo C2 son útiles como agentes citotóxicos (Hartley et ál . (2010) Cáncer Res. 70 (17) :6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53 (7) :2927-2941; Howard et ál. (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22) :6463-6466) .
Los dímeros de PBD se han conjugado con anticuerpos y se demostró que el ADC resultante tiene propiedades anticancerosas. Los ejemplos no limitativos de sitios de unión del dímero de PBD incluyen el anillo pirrólo de cinco miembros, el enlace entre las unidades PBD y el grupo imina N10-C11 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598) .
Los ejemplos no limitativos de componentes de dímero de PBD de ADC son de la Fórmula A: y sales y solvatos de estos, donde: la línea ondulada indica el sitio de enlace covalente al enlazador; las líneas punteadas indican la presencia opcional de un enlace doble entre Cl y C2 o C2 y C3 ; R2 se selecciona independientemente de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se selecciona además de halo o dihalo, donde RD se selecciona independientemente de R, C02R, COR, CHO, C02H y halo ; R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02 , Me3Sn y halógeno; R7 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2 , NHR, NRR', N02 , Me3Sn y halógeno; Q se selecciona independientemente de O, S y NH; R11 es ya sea H, o R o, donde Q es O, S03M, donde M es un catión metálico; R y R' se seleccionan cada uno independientemente de alquilo Ci-8 opcionalmente sustituido, alquilo Ci-i2, heterociclilo C3-8 y grupos arilo C5-20, y opcionalmente en relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo hetercíclico opcionalmente sustituido de 4-, 5-, 6- o 7- miembros; R12, R16, R19 y R17 son como se definen para R2, R6 , R9 y R7 respectivamente; R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede ser interrumpida por uno o más heteroátomos , por ejemplo, 0, S, N(H) , NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno y piridina, donde dichos anillos están opcionalmente sustituidos; y X y X' se seleccionan independientemente de O, S y N(H) .
En algunas modalidades, R9 y R19 son H.
En algunas modalidades, R6 y R16 son H.
En algunas modalidades, R7 y R17 son ambas 0R7A, donde R7A es alquilo Ci-4 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R7A es Me. En algunas modalidades, R7A es Ch2Ph, donde Ph es un grupo fenilo.
En algunas modalidades, X es O.
En algunas modalidades, R11 es H.
En algunas modalidades, hay un enlace doble entre C2 y C3 en cada unidad de monómero .
En algunas modalidades, R2 y R12 se seleccionan independientemente de H y R. En algunas modalidades, R2 y R12 son, independientemente, R. En algunas modalidades, R2 and R12 se sustituyen opcional e independientemente por arilo C5-2o o arilo C5-7 o arilo C8-i0. En algunas modalidades, R2 y R12 son independientemente fenilo, tienilo, naftilo, piridilo, quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R2 y R12 se seleccionan independientemente de =0, =CH2, =CH-RD y =C(RD)2. En algunas modalidades, R2 y R12 son cada uno =CH2. En algunas modalidades, R2 y R12 son cada uno H. En algunas modalidades, R2 y R12 son cada uno =0. En algunas modalidades, R2 y R12 don cada uno =CF2. En algunas modalidades, R2 y/o R12 son independientemente =C(RD)2. En algunas modalidades, R2 y R12 son independientemente =CH-RD.
En algunas modalidades, cuando R2 y/o R12 es =CH-RD, cada grupo puede tener independientemente cualquier configuración mostrada más adelante: (i) (ll) En algunas modalidades, a =CH-R está en la configuración (I) .
En algunas modalidades, R" es un grupo alquileno C3 o un grupo alquileno C5.
En algunas modalidades, un ejemplo de componente de dimero PBD de un ADC tiene la estructura de la Fórmula A(I) : A(I) ; donde n es 0 o 1, En algunas modalidades, un ejemplo de componente de ro PBD de un ADC tiene la estructura de la Fórmula A (II) : A (II) ; donde n es 0 o 1, En algunas modalidades, un ejemplo de componente de dimero PBD de un ADC tiene la estructura de la Fórmula A(III) : A(III) ; donde RE y RE" son cada uno seleccionado independientemente de H o RD, donde RD se describió anteriormente; y donde n es 0 o 1.
En algunas modalidades, n es 0. En algunas modalidades, n es 1. En algunas modalidades, RE y/o RE" es H. En algunas modalidades, RE y RE" son H. En algunas modalidades, RE y/o RE" es RD, donde RD es alquilo Ci-i2 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RE y/o RE" es RD, donde RD es metilo.
En algunas modalidades, un ejemplo de componente de dimero PBD de un ADC tiene la estructura de la Fórmula A(IV) : A(IV) ; donde Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido; donde Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes; y donde n es 0 o 1.
En algunas modalidades, un ejemplo de componente de dimero PBD de un ADC tiene la estructura de la Fórmula A(V) : A(V) ; donde Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido; donde Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes; y donde n es 0 o 1.
En algunas modalidades, Ar1 y Ar2 se seleccionan cada uno independientemente de fenilo, furanilo, tiofenilo y piridilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente fenilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente tien-2-ilo o tien-3-ilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido. El grupo quinolinilo o isoquinolinilo puede estar unido al núcleo de PBD a través de cualquier posición disponible del anillo. Por ejemplo, el quinolinilo puede ser quinolin-2-ilo, quinolin-3-ilo, quinolin-4ilo, quinolin-5-ilo, quinolin-6-ilo, quinolin-7-ilo y quinolin-8-ilo . En algunas modalidades, el quinolinilo se selecciona a partir de quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo. El isoquinolinilo puede ser isoquinolin-l-ilo, isoquinolin-3-ilo, isoquinolin-4ilo, isoquinolin-5-ilo, isoquinolin-6-ilo, isoquinolin-7-ilo y isoquinolin-8-ilo . En algunas modalidades, el isoquinolinilo se selecciona a partir de isoquinolin-3-ilo y isoquinolin-6- ilo.
Los ejemplos adicionales no limitativos de componentes de dxmero de PBD de ADC son de la Fórmula B : B y sales y solvatos de estos, donde: la línea ondulada indica el sitio de enlace covalente al enlazador; la línea ondulada conectada al OH indica la configuración S o R; Rvl y Rv2 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo y fenilo (donde dicho fenilo puede estar opcionalmente sustituido por fluoro, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5_6; donde RV1 y RV2 pueden ser iguales o diferentes; y n es 0 o 1.
En algunas modalidades, RV1 y RV2 se seleccionan independientemente de H, fenilo y 4-fluorofenilo .
En algunas modalidades, un enlazador puede acoplarse a una o varios sitios del resto de fármaco de dímero PBD, incluyendo la imina NIO del anillo B, la posición endo/exo C- 2 del anillo C, o la unidad de enlace que se une a los anillos A (véanse las estructuras C(I) y C(II) más adelante).
Los ejemplos no limitativos de componentes de dímero PBD de ADC incluyen Fórmulas C(I) y C(II): Las Fórmulas C(I) y C(II) se muestran en su forma imina N10-C11. Los ejemplos restos de profármaco PBD también incluyen las formas de carbinolamina y carbinolamina protegida, como se muestra en la tabla a continuación: donde : X es CH2 (n = 1 a 5) , N u O; Z y Z' se seleccionan independientemente de OR y NR2, donde R es una cadena de alquilo primario, secundario o terciario que contiene 1 a 5 átomos de carbono; Rl7 R'i, 2 y R'2 cada uno se seleccionan independientemente de H, alquilo Ci-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, arilo C5-2o (incluyendo arilos sustituidos) , grupos heteroarilo C5-20, ~NH2, -NHMe, -OH y -SH, donde, en algunas modalidades, las cadenas de alquilo, alquenilo y alquinilo comprenden hasta 5 átomos de carbono,- R3 y R'3 se seleccionan independientemente de H, OR, NHR y NR2, donde R es una cadena de alquilo primario, secundario o terciario que contiene 1 a 5 átomos de carbono; R4 y R'4 se seleccionan independientemente de H, Me y OMe; R5 se selecciona de alquilo Ci-C8í alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, arilo C5-20 (incluyendo arilos sustituidos por halo, nitro, ciano, alcoxi, alquilo, heterociclilo) y grupos heteroarilo C5-20, donde, en algunas modalidades, las cadenas alquilo, alquenilo y alquinilo comprenden hasta 5 átomos de carbono ; Rn es H, alquilo Ci-C8 o un grupo protector (tal como acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC) , benciloxicarbonilo (CBZ) , 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc) o un resto que comprende una unidad autodestructiva, tal como valina-citrulina-PAB) ; R12 es H, alquilo Cx-Cs o grupo protector ,- donde un hidrógeno de uno de Ri , R' i , R2 R' 2, 5 o R12 o un hidrógeno del espaciador -OCH2CH2 (X) nCH2CH20- entre los anillos A se reemplaza con un enlace conectado al enlazador del ADC.
Los ejemplos de porciones de dímero PDB de ADC incluyen, de modo no taxativo (la línea ondulada indica el sitio de enlace covalente del enlazador) : dímero de PBD; Los ejemplos no limitativos de ADC comprenden dímeros de PBD que tienen las siguientes estructuras: dímero de PBD-val-cit-PAB-Ab; dímero de PBD-Phe-Lys-PAB-Ab, donde: n es 0 a 12. En algunas modalidades, n es 2 a algunas modalidades, n es 4 a 8. En algunas modalidades selecciona de 4 , 5, 6, 7 y 8.
Los enlazadores del dímero de PBD-val-cit-PAB-Ab y el dímero de PBD-Phe-Lys-PAB-Ab son escindibles por proteasa, mientras que el enlazador de dímero de PBD-maleimida-acetal es lábil al ácido.
Los dímeros de PBD y ADC que comprenden el dímero de PBD pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598. (5) Antraciclinas En algunas modalidades, un ADC comprende una antraciclina . Las antraciclinas son compuesto antibióticos que exhiben actividad citotóxica. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, los estudios han indicado que las antraciclinas pueden funcionar para destruir células mediante una cantidad de mecanismos diferentes, incluyendo: 1) intercalación de las moléculas de fármaco en el ADN de la célula inhibiendo de esta manera la síntesis de ácido nucleico dependiente de ADN; 2) producción mediante el fármaco de radicales libres que luego reaccionan con macromoléculas celulares para causar daño a las células, y/o 3) interacciones de las moléculas de fármaco con la membrana celular (véase, por ejemplo, C. Peterson et ál . , "Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" en Anthracycline Antibiotics In Cáncer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. en las páginas 97-102) . Debido a su pontencial citotóxico, las antraciclinas se han usado en el tratamiento de varios cánceres, tal como leucemia, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de ovario y sarcomas (véase, por ejemplo, P.H- Wiernik, in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11) .
Los ejemplos no limitativos de antraciclinas incluyen doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, nemorrubicina y derivados de estas. Los inmunoconjugados y profármacos de daunorrubicina y doxorrubicina se han preparado y estudiado (Kratz et ál. (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey et ál . (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et ál . (2005) Bioconj . Chem. 16:717-721; Nagy et ál . (2000) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 97:829-834; Dubowchik et ál . (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et ál . (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; US 6630579). El conjugado de anticuerpo-fármaco BR96 -doxorrubicina reacciona específicamente con el antígeno asociado a tumores Lewis-Y y se ha evaluado en estudios de fase I y fase II (Salen et ál . (2000) J. Clin. Oncology 18 :2282-2292 ; Ajani et ál . (2000) Cáncer Jour. 6:78-81; Tolcher et ál . (1999) J. Clin. Oncology 17 :478-484) .
PNU-159682 es un metabolito potente (o derivado) de nemorrubicina (Quintieri, et ál . (2005) Clinical Cáncer Research 11 (4 ) : 1608 - 1617) . La nemorrubicina es un análogo semisintético de doxorrubicina con un grupo 2-metoximorfolino en el amino glicósido de doxorrubicina y ha sido sometido a evaluación clínica (Grandi et ál. (1990) Cáncer Treat. Rev. 17:133; Ripamonti et ál (1992) Brit. J. Cáncer 65:703; ), incluyendo ensayos en fase II/III para el carcinoma hepatocelular (Sun et ál . (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Absl448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cáncer Research, 44:1a Ed, Resumen 4649; Pacciarini et ál. (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116) .
Un ejemplo no limitativo de ADC comprende nemorrubicina derivados de nemorrubicina, como se muestra en la Fórmula donde Rx es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi Ci-C5, o una sal farmacéuticamente aceptable de estos; Li y Z juntos son un enlazador (L) como se describe en la presente; T es un anticuerpo (Ab) como se describe en la presente; y m es 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, m es de l a 10, l a 7, l a 5 o l a 4.
En algunas modalidades, Rx y R2 son ambos metoxi (-OMe) .
Un ejemplo no limitativo adicional de ADC comprende nemorrubicina o derivados de nemorrubicina, como se muestra en la Fórmula Ib: donde Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi Ci-C5, o una sal farmacéuticamente aceptable de estos; L2 y Z juntos son un enlazador (L) como se describe en la presente; T es un anticuerpo (Ab) como se describe en la presente; y m es 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, m es de l a 10, l a 7, l a 5 o l a 4.
En algunas modalidades, cada Rx y R2 son ambos metoxi (- OMe) .
En algunas modalidades, el componente de nemorrubicina del ADC que contiene nemorrubicina es PNU-159682. En algunas modalidades, la parte de fármaco del ADC puede tener una de las siguientes estructuras: donde la línea ondulada indica la unión al enlazador (L) .
Las antraciclinas , incluyendo PNU-159682, se pueden conjugar con anticuerpos a través de varios sitios de unión y de una variedad de enlazadores (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; O 2010/009124), incluyendo los enlazadores descritos en la presente.
Los ejemplos de ADC que comprenden una nemorrubicina y 20 PNU- 159682 -val -cit-PAB-espaciador (R1-^2) -Ab, donde: Ri y R2 se seleccionan independientemente de H y lquilo(Ci-C6) ; y PNU-159682-maleimida-Ab El enlazador de PNU-159682 maleimida acetal-Ab es lábil al ácido, mientras que los enlazadores de PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador-Ab y PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador (R1^) -Ab son escindibles por proteasa. (6) Otros restos de fármaco Los restos de fármaco también incluyen geldanamicina (Mandler et ál . (2000) J. Nat. Cáncer Inst. 92 (19) : 1573-1581; Mandler et ál . (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et ál . (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791); y toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de estas, incluyendo, de modo no taxativo, cadena A de la difteria, fragmentos activos de la toxina de difteria que no son de unión, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidores de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos . Véase, por ejemplo, WO 93/21232.
Los restos de fármaco también incluyen compuestos con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN) .
En determinadas modalidades, un inmunoconjugado puede comprender un átomo altamente radiactivo. Una variedad de isótopos radioactivos se encuentran disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. En algunas modalidades, cuando un inmunoconjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios centellográficos , por ejemplo Te" o I123, o un marcador de salto para imagenología por resonancia magnética nuclear (NMR) (también denominado imagenología por resonancia magnética, MRI) , tal como circonio-89, yodo-123, yodo-131, indio-111, fluoro-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El circonio-89 puede complejarse con varios agente quelantes metálicos y conjugarse con anticuerpos, por ejemplo, para imagenología PET (WO 2011/056983) .
Las radioetíquetas u otras etiquetas pueden incorporarse en el inmunoconjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, un péptido puede biosintetizarse o sintetizarse químicamente usando precursores de aminoácido adecuados que comprenden, por ejemplo, uno o más átomos de flúor- 19 en lugar de uno o más hidrógenos. En algunas modalidades, las etiquetas, tales como Te", I123, Re186, Re188 e In111 pueden acoplarse por medio del residuo cisterna en el anticuerpo. En algunas modalidades, itrio- 90 puede acoplarse por medio del residuo lisina del anticuerpo. En algunas modalidades, el método IODOGEN (Fraker et ál . (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80: 49-57 puede usarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros determinados métodos.
En determinadas modalidades, un inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo conjugado con una enzima activadora de profármaco. En algunas de dichas modalidades, una enzima activadora de profármaco convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, véase WO 81/01145) en un fármaco activo, tal como un fármaco anticanceroso. Dichos inmunoconjugados son útiles, en algunas modalidades, en la terapia de profármacos mediados por enzimas dependientes de anticuerpos ("ADEPT"). Las enzimas que pueden conjugarse con un anticuerpo incluyen, de modo no taxativo, fosfatasas alcalinas, que son útiles para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasas , que son útiles para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosinas deaminasa, que son útiles para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tal como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, que son útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de ácido D-amino; enzimas que escinden carbohidratos, tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa, que es útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tal como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, que son útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. En algunas modalidades, las enzimas pueden unirse covalentemente a anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Neuberger et l . , Nature 312 : 604-608 (1984) . c) Carga de fármaco La carga de profármaco está representada por p, la cantidad promedio de restos de fármaco por anticuerpo en una molécula de la Fórmula I . La carga de profármaco puede estar en el intervalo de 1 a 20 restos de fármaco (D) por anticuerpo. Los ADC de la Fórmula I incluyen grupos de anticuerpos con una gama de restos de fármacos, de 1 a 20. La cantidad promedio de restos de fármacos por anticuerpo en las preparaciones de ADC a partir de reacciones de conjugación puede caracterizarse mediante medios convencionales tales como espectroscopia de masas, ensayo de ELISA y HPLC. También puede determinarse la distribución cuantitativa de ADC en función de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de ADC homogéneos donde p es un valor cierto de ADC con otras cargas de fármaco puede lograrse a través de medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis .
Para algunos conjugados anticuerpo-fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, donde la unión es un tiol de cisteína, tal como en determinadas modalidades de ejemplo mencionadas anteriormente, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cisteína o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales puede estar unido el enlazador. En determinadas modalidades, una carga mayor de fármaco, por ejemplo, p>5, puede causar la agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de ciertos conjugados anticuerpo-fármaco . En determinadas modalidades, la carga promedio de fármaco para un ADC está en el intervalo de 1 a alrededor de 8; de 2 a alrededor de 6; o de 3 a alrededor de 5. De hecho, se ha demostrado que para ciertos ADC, la relación óptima de restos de fármacos por anticuerpo puede ser menor que 8 y puede ser de alrededor de 2 a alrededor de 5 (US 7498298) .
En determinadas modalidades, menos del máximo teórico de restos de fármacos se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionan con el intermedio fármaco-enlace o un reactivo de enlace, como se indica a continuación. Por lo general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que puedan estar enlazados a un resto de fármaco, de hecho, la mayoría de los residuos tiol de cisteína en anticuerpos existen como puentes disulfuros. En determinadas modalidades, un anticuerpo puede reducirse con un agente de reducción tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP) en condiciones de reducción parciales o totales, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas modalidades, un anticuerpo está sujeto a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleofílicos reactivos tales como lisina o cisteína.
La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante: (i) limitar el exceso molar del intermedio de fármaco-enlazador o del reactivo de enlazador en relación con el anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de reacción de conjugación, y (iii) parcializar o limitar las condiciones reductivas para la modificación de tiol cisteína.
Se deberá comprender que donde más de un grupo nucleofílico reaccione con un intermedio fármaco-enlazador o enlazador, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de uno o más restos de fármacos ligados a un anticuerpo. La cantidad promedio de fármacos por anticuerpo puede calcularse a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA dual, el cual es específico para anticuerpos y específico para el fármaco. Las moléculas ADC individuales se puede identificar en la mezcla mediante espectroscopia de masas y separar mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrofóbica (véase, por ejemplo, McDonagh et ál . (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19 (7) : 299-307 ; Hamblett et ál . (2004) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et ál . "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics , and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjúgate," Resumen No. 624, American Association for Cáncer Research, encuentro anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, actas de la AACR, Volumen 45, marzo 2004; Alley, S.C., et ál . "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Resumen No. 627, American Association for Cáncer Research, encuentro anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, actas de la AACR, Volumen 45, marzo 2004) . En determinadas modalidades, un ADC homogéneo con un valor de carga único puede aislarse de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía. d) Determinados métodos para preparar inmunoconjugados Un ADC de la Fórmula I puede prepararse por varias vías, empleando reacciones, condiciones y reactivos de la química orgánica conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo: (1) la reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo de unión bivalente para formar Ab-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con un resto de fármaco D; y (2) la reacción de un grupo nucleofílico de una resto de fármaco con un reactivo de unión bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con un grupo nucleofílico de un anticuerpo. Los ejemplos de métodos para preparar un ADC de la Fórmula I por medio de la úlfima vía se describen en US 7498298, que se incorporan expresamente a la presente mediante esta referencia.
Los grupos nucleofílieos o anticuerpos incluyen, de modo no taxativo: (i) grupos amina del extremo N, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína y (iv) grupos amino o hidroxilo del azúcar donde el anticuerpo está glicosilado. Los gruposs amina, tiol e hidroxilo son neuclofílicos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos o restos de enlace y reactivos de enlace que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas ; y (iii) grupos aldehidos, cetonas, maleimido y carboxilo. Determinados anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, puentes de cisterna. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol) o tircarboniletilfosfino (TCEP) , de manera que el anticuerpo sea total o parcialmente reducido. Así cada puente de cisteína formará, en teoría, dos nucleófilos de tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleofílicos adicionales en anticuerpos a través de la modificación de los residuos lisina, por ejemplo, mediante la reacción de los residuos lisina con 2 -iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Pueden introducirse también grupos tiol reactivos en un anticuerpo, mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, mediante la preparación de anticuerpos variantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no naturales) .
Los conjugados de anticuerpo- fármaco de la invención también pueden producirse mediante la reacción entre un grupo electrofílico en un anticuerpo, tal como un grupo aldehido carbonil cetona, con un grupo nucleofílico en un reactivo enlazador o fármaco. Los grupos nucleofllicos útiles en un reactivo enlazador incluyen, de modo no taxativo, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida . En una modalidad, se modifica un anticuerpo para introducir restos electrofílicos que son capaces de reaccionar con sustituyentes nucleofílicos en el reactivo enlazador o fármaco. En otra modalidad, los azúcares de anticuerpos glicolisados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de periodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de restos de fármaco o reactivos enlazadores. Los grupos de base Schiff de imina resultantes pueden formar una unión normal o pueden reducirse, por ejemplo, mediante reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con una oxidasa de galactosa o meta-periodato de sodio puede proporcionar grupos carbonilo (aldehido o cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, los anticuerpos que contienen residuos de treonina o serina del extremo N terminal pueden reaccionar con meta-periodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Dicho aldehido puede hacerse reaccionar con un resto de fármaco o nucleófilo enlazador.
Los ejemplos de grupos nucleofílieos en un resto fármaco incluyen, de modo no taxativo: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida que son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos o restos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ásteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehidos, cetonas, maleimido y carboxilo.
Los ejemplos no limitativos de reactivos entrecruzados que pueden usarse para preparar ADC se describen en la presente en la sección titulada "Ejemplos de enlazadores". Los métodos para usar dichos reactivos entrecruzados para unir dos restos, incluyendo un resto proteináceo y un resto químico, son conocidos en la técnica. En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende un anticuerpo y un agente citotóxico puede realizarse, por ej . , mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos . Una molécula de ADN recombinante puede comprender regiones que codifican el anticuerpo y porciones citotóxicas del conjugado, ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas de1 conjugado .
En aun otra modalidad, un anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para el uso en la pre-selección del objetivo tumoral donde el conjugado receptor-anticuerpo se administra al paciente, seguido por la eliminación de un conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarador y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ej . , un fármaco o radionucleótido) .
E . Métodos y composiciones para el diagnóstico y la detección En determinadas modalidades, cualquier anticuerpo anti-PMEL17 provisto en la presente es útil para detectar la presencia de PMEL17 en una muestra biológica. El término "detectar", tal como se usa en la presente, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. Una "muestra biológica" comprende, por ejemplo, una célula o tejido (por ejemplo, material de biopsia, incluyendo tejido de piel canceroso o potencialmente canceroso, incluyendo melanoma posible o confirmado; material de biopsia de linfotna, tal como linfoma cutáneo de linfocitos T; y material de biopsia de tumores renales) .
En una modalidad, se proporciona un anticuerpo anti-PMEL17 para su uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de PMEL17 en una muestra biológica. En determinadas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-PMEL17 como se describe en la presente en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-PMEL17 con PMEL17, y detectar si se formó un complejo entre el anticuerpo anti-PMEL17 y PMEL17 en la muestra biológica. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una modalidad, se usa un anticuerpo anti-PMEL17 para seleccionar sujetos que son susceptibles a la terapia con anticuerpo anti-PMEL17, por ejemplo, donde el PMEL17 es un biomarcador para la selección de pacientes. En una modalidad adicional, la muestra biológica es una célula o tejido (tejido de piel canceroso o potencialmente canceroso, incluyendo melanoma posible o confirmado; material de biopsia de linfoma, tal como, linfoma cutáneo de linfocitos T; y material de biopsia de tumores renales) .
En una modalidad adicional, se usa un anticuerpo anti-PMEL17 in vivo para detectar, por ejemplo, mediante imagenología in vivo, un cáncer positivo para PMEL17 en un sujeto, por ejemplo, para fines de diagnóstico, pronóstico y estadificación del cáncer, determinar el curso de terapia apropiado o monitorear la respuesta de un cáncer a la terapia. Un método conocido en la técnica para la detección in vivo es la inmuno-tomografía por emisión de positrones (inmuno-PET) , como se describe en, por ejemplo, van Dongen et ál., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) y Verel et l . , J. Nucí. Med. 44:1271-1281 (2003). En dichas modalidades, se proporciona un método para detectar un cáncer positivo para PMEL17 en un sujeto, el método comprende administrar un anticuerpo anti-PMEL17 marcado al sujeto que tiene o se sospecha que tiene un cáncer positivo para PMEL17, y detectar el anticuerpo anti-PMEL17 marcado en el sujeto, donde la detección del anticuerpo anti-PMEL17 marcado indica un cáncer positivo para PMEL17 en el sujeto. En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-PMEL17 comprende un anticuerpo anti-PMEL17 conjugado con un emisor de positrones, tal como 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr y 12I. En una modalidad particular, el emisor de positrones es 89Zr.
En modalidades adicionales, un método de diagnóstico o detección comprende poner en contacto un primer anticuerpo anti-PMEL17 inmovilizado en un sustrato con una muestra biológica para analizar la presencia de PMEL17, exponer el sustrato a un segundo anticuerpo anti-PMEL17 y detectar si el segundo anti-PMEL17 está unido a un complejo entre el primer anticuerpo anti-PMELl7 y el PMEL17 de la muestra biológica. Un sustrato puede ser cualquier medio de soporte, por ejemplo, vidrio, metal, cerámica, perlas poliméricas, láminas, lascas y otros sustratos. En determinadas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido (tejido de piel canceroso o potencialmente canceroso, incluyendo melanoma posible o confirmado; material de biopsia de un linfoma, tal como linfoma cutáneo de linfocitos T; y material de biopsia de un tumor renal) . En determinadas modalidades, el primer o segundo anticuerpo anti-PMEL17 es cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente.
Los ejemplos de trastornos que pueden diagnosticarse o detectarse de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores incluyen cánceres positivos para PMEL17, tal como cáncer de piel positivo para PMEL17 (tal como melanoma) ; linfornas positivos para PMEL17 (tal como linfoma cutáneo de linfocitos T) ; y tumores renales positivos para PMEL17. En algunas modalidades, un cáncer positivo para PMEL17 es un cáncer que recibe un puntaje de inmunohistoquímica (IHC) anti-PMEL17 mayor que "0", el cual corresponde a una tinción muy baja o nula en >90% de las células tumorales, bajo las condiciones descritas en la presente en el Ejemplo K. En algunas modalidades, un cáncer positivo para PMEL17 expresa PMEL17 en un nivel de 1+, 2+ o 3+ , como se define bajo las condiciones descritas en la presente en el Ejemplo K, usando el anticuerpo 31D1 (el hibridoma que expresa 31D1 se depositó en la ATCC como 7509 (31D1.6.7) el 24 de abril de 2012). En algunas modalidades, un cáncer positivo para PMEL17 es un cáncer que expresa PMEL17 de acuerdo con un ensayo de hibridación in situ (ISH) . En algunas de dichas modalidades, se usa un sistema de puntaje similar al usado para la IHC. En algunas modalidades, un cáncer positivo para PMEL17 es un cáncer que expresa PMEL17 de acuerdo con un ensayo de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) que detecta el ARNm de PMEL17. En algunas modalidades, el RT-PCR es RT-PCR cuantitativa.
En determinadas modalidades, se proporcionan anticuerpos anti-PMEL17 marcados. Las etiquetas incluyen, de modo no taxativo, etiquetas o restos que se detectan directamente (tal como etiquetas fluorescentes, cromofóricas , electrodensas, quimioluminiscentes y radiactivas) , así como restos, tal como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de reacción enzimática o de interacción molecular. Los ejemplos de etiquetas incluyen, de modo no taxativo, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tal como quelatos térreos poco comunes o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense N° 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacaridas, por ejemplo, oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa y glucosa-6-fosf to deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tal como uricasa y oxidasa xantina, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de salto, etiquetas bacteriófagas , radicales libres estables y similares. En otra modalidad, la etiqueta es un emisor de positrones. Los emisores de positrones incluyen, de modo no taxativo, 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr y 124I. En una modalidad particular, un emisor de positrones es 89Zr.
F . Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 como se describe en la presente se preparan mediante la mezcla de dicho anticuerpo o inmunoconjugado que tiene el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, de modo no taxativo: amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol de butilo o bencilo; alquilparabenos , tales como metil o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ej . , complejos de proteína Zn) y/o tensioactivos no-iónicos tal como polietilenglicol (PEG) . Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables de la presente incluyen adicionalmente agentes de dispersión de fármacos intersticiales tal como glicoproteínas hialouronidasa activa neutral soluble (sHASEGP) , por ejemplo, glicoproteínas hialouronidasa PH-20 humanas solubles, tal como rHuPH20 (HYLENEX , Baxter International, Inc.). Determinados ejemplos de sHASEGP y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las patentes estadounidenses N° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con una o más glicoaminoglicanasas adicionales tal como condroitinasas .
Los ejemplos de formulaciones de anticuerpo o inmunoconjugado liofilizado se describen en la patente estadounidense N° 6,267,958. Las formulaciones de anticuerpo o inmunoconjugado acuoso incluyen aquellas descritas en la patente estadounidense N° 6,171,586 y-- O2006/044908 , las formulaciones de esta última incluyen un amortiguador histidina-acetato .
La formulación en la presente también puede contener más de un ingrediente activo, según sea necesario para la afección particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí.
Los ingredientes activos pueden estar contenido en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas coloidales de liberación de fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington 's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .
Se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo o inmunoconjugado, cuyas matrices se encuentran en forma de elementos moldeados, por ej . , películas o microcápsulas .
Las formulaciones que es usan para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilización se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. 6. Composiciones y métodos terapéuticos Cualquiera de los anticuerpos o inmunoconjugados anti-PMEL17 provistos en la presente pueden usarse en los métodos, por ejemplo, métodos terapéuticos.
En un aspecto, un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 provisto en la presente se usa en un método para inhibir la proliferación de una célula PMEL17 positiva, dicho método comprende exponer la célula al anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 en condiciones que permitan la unión del anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 a PMEL17 en la superficie de la célula, inhibiendo de esta manera la proliferación de la célula. En determinadas modalidades, el método es un método in vitro o in vivo. En algunas modalidades, la célula es una célula de melanoma. En algunas modalidades, la célula es una célula de linfoma, tal como una célula de linfoma cutáneo de linfocitos T. En algunas modalidades, la célula es una célula de tumor renal.
La inhibición de la proliferación celular in vitro se puede analizar usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™, que se encuentra disponible comercialmente de Promega (Madison, WI) . Ese esayo determina el número de células viables en un cultivo basado en la cuantidicación del ATP presente, lo cual indica la actividad metabólica de las células. Véase Crouch et ál . (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, patente estadounidense N° 6,602,677. El ensayo puede llevarse a cabo en un formato de 96 o 384 pocilios, lo cual lo hace adecuado para un ensayo automático de alto rendimiento (HTS) . Véase Cree et ál . (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento de ensayo involucra agregar un único reactivo (reactivo CellTiter-Gloe) directamente a las células cultivadas. Esto da como resultado la lisis celular y la generación de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantida de ATP presente, la cual es directamente proporcional al número de células viables presentes en el cultivo. Los datos pueden registrarse por medio de un luminómetro o dispositivo de imagenologia por cámara CCD. La salida de luminiscencia está expresada como unidades relativas de luz (RLU) .
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 para su uso como un medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 para su uso en un método de tratamiento. En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 para su uso en el tratamiento de un cáncer positivo para PMEL17. En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 para su uso en un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer positivo para PMEL17, el método comprende administra al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17. En una modalidad, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante.
En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17 en la fabricación o preparación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento de un cáncer positivo para PMEL17. En una modalidad adicional, el medicamento es para su uso en un método para tratar un cáncer positivo para P EL17, dicho método comprende administrarle a un individuo que tiene un cáncer positivo para PMEL17 una cantidad eficaz del medicamento. En una modalidad, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar un cáncer positivo para PMEL17. En una modalidad, el método comprende administrarle a un individuo que tiene un cáncer positivo para PMEL17 una cantidad eficaz de un anticuerpo o inmunoconjugado anti-PMEL17. En una modalidad, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe más adelante.
Un cáncer positivo para PMEL17, de acuerdo con cualquiera de las modalidades antemencionadas puede ser, por ejemplo, un cáncer de piel positivo para PMEL17 (incluyendo melanoma) ; linfomas positivos para PMEL17 (nincluyendo linfoma cutáneo de linfocitos T) ; y tumores renales positivos para PMEL17. En algunas modalidades, un cáncer positivo para PMEL17 es un cáncer que recibe un puntaje de inmunohistoquímica (IHC) o de hibridación in situ (ISH) anti-PMEL17 mayor que "0", el cual corresponde a una tinción muy baja o nula en >90% de las células tumorales, bajo las condiciones descritas en la presente en el Ejemplo K. En otra modalidad, un cáncer positivo para PMEL17 expresa PMEL17 en un nivel de 1+, 2+ o 3+ , como se define bajo las condiciones descritas en la presente en el Ejemplo K, usando el anticuerpo 31D1 (el hibridoma que expresa 31D1 se depositó en la ATCC como 7509 (31D1.6.7) el 24 de abril de 2012). En algunas modalidades, un cáncer positivo para PMEL17 es un cáncer que expresa PMEL17 de acuerdo con un ensayo de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) que detecta el ARNm de PMEL17. En algunas modalidades, el RT-PCR es RT-PCR cuantitativa.
En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar a un individuo que tiene cáncer positivo para PMEL17, donde el cáncer positivo para PMEL17 es resistente a un primer agente terapéutico. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une al PMEL17. En algunas modalidades, el cáncer positivo para PMEL17 es melanoma. En algunas modalidades, el primer agente terapéutico comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no sea PMEL17. En algunas modalidades, el primer agente terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no sea PMEL17 y un primer agente citotóxico. En algunas modalidades, el primer anticuerpo se une a un antígeno seleccionado de receptor de la endotelina B (ETBR) , proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TYRP1) , antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4) y glicoproteína B (GPNMB) . En algunas modalidades, el primer anticuerpo se une a ETBR. En algunas de dichas modalidades, el primer inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-ETBR hu5E9.vl, tal como el inmunoconjugado hu5E9. l-MC-val-cit-PAB-MMAE . Véase, por ej . , publicación estadounidense N° US 2011/0206702. Las regiones hipervariables (HVR) de hu5E9.vl se muestran en la presente, por ejemplo, en las SEC ID N° : 33 a 38. Las regiones hipervariables de cadenas pesada y ligera de hu5E9.vl se muestran en la presente, por ejemplo, en las SEC ID N° : 40 y 39, respectivamente. En algunas modalidades, el primer agente citotóxico y el agente citotóxico del inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une al PMEL17 son diferentes. En algunas de tales modalidades, el primer agente citotóxico es MMAE (tal como, por ejemplo, cuando el primer inmunoconjugado es hu5E9. vl-MC-val-cit-PAB-MMAE) y el agente citotóxico del inmunoconjugado comprende un anticuerpo que se une a PMEL17 se selecciona de una caliqueamicina, una pirrolobenzodiazepina, y un derivado de nemorrubicina . En algunas modalidades, el primer agente citotóxico del inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a PMEL17 se selecciona de una pirrolobenzodiazepina y de un derivado de nemorrubicina.
En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar a un individuo con cáncer, donde el cáncer es resistente a un primer agente terapéutico. En algunas modalidades, el primer terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo unido a un primer agente citotóxico a través de un primer enlazador. En algunas modalidades, un método para tratar a un individuo con un cáncer que es resistente a un primer agente terapéutico (tal como un primer inmunoconjugado) comprende administrarle un segundo inmunoconjugado que comprende un segundo anticuerpo unido a un segundo agente citotóxico a través de un segundo enlazador. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos y el primer agente citotóxico y el segundo agente citotóxico son iguales o diferentes. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos que están presentes en al menos algunas de las mismas células. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos y el primer agente citotóxico y el segundo agente citotóxico son diferentes. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a los mismos antígenos y el primer agente citotóxico y el segundo agente citotóxico son diferentes. En cualquiera de las modalidades antemencionadas, el primer enlazador y el segundo enlazador pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos, el primer y el segundo enlazador son diferentes, y el primer y el segundo agente citotóxico son diferentes .
Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades antemencionadas puede ser un humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones f rmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos o inmunoconjugados anti-PMEL17 provistos en la presente, por ejemplo, para su uso en los métodos terapéuticos antemencionados. En una modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos o inmunoconjugados anti-PMEL17 provistos en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos o inmunoconjugados anti-PMEL17 provistos en la presente y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden usarse ya sean solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede administrarse conjuntamente con al menos un agente terapéutico adicional.
En algunas modalidades, los métodos de tratamiento del cáncer comprenden administrar un inmunoconjugado descrito en la presente en combinación con un segundo inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a un antígeno seleccionado del receptor de endotelina B (ETBR) , proteína relacionada con tirosina 1 (TYRP1) , antígeno linfocito T citotóxico 4 (CTLA-4) y glicoproteína MB (GPNMB) . En algunas de dichas modalidades, el agente citotóxico del segundo inmunocon ugado se selecciona de MMAE, una caliqueamicina, un derivado de nemorrubicina y una pirrolobenzodiazepina . El agente citotóxico del inmunoconjugado descrito en la presente y el agente citotóxico del segundo inmunoconjugado pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades, los agentes citotóxicos son diferentes. En algunas modalidades, el agente citotóxico se selecciona de MMAE, un derivado de nemorrubicina y una pirrolobenzodiazepina.
En algunas modalidades, los métodos de tratamiento del cáncer comprenden administrar un inmunoconjugado descrito en la presente en combinación con un segundo xnmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a ETBR. En algunas de dichas modalidades, el cáncer es un cáncer positivo para PMEL17 y también un cáncer positivo para ETBR. La determinación de si el cáncer es también positivo para ETBR puede llevarse a cabo mediante cualquier método, incluyendo, de modo no taxativo, los métodos descritos en la presente para determinar si un cáncer es positivo para PMEL17, y los métodos descritos en la publicación estadounidense N° US 2011/0206702. En algunas modalidades, el anticuerpo que se une a ETBR es hu5E9.vl, que se describe en, por ejemplo, la publicación estadounidense N° US 2011/0206702. En algunas modalidades, el anticuerpo que une el ETBR comprende un HVR Hl que comprende una secuencia de la SEC ID N° : 33, una HVR H2 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 34, una HVR H3 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 35, una HVR Ll que comprende una secuencia de SEC ID N° : 36, una HVR L2 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 37, y una HVR L3 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 38. En algunas modalidades, el anticuerpo que une el ETBR comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID N°: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID N° : 39.
En algunas modalidades, los métodos para tratar el cáncer comprenden administrar un inmunoconjugado anti-ETBR-MC-val-cit-PAB-MMAE, tal como hu5E9. l-MC-val-cit-PAB-MMAE (véase, por ejemplo, la publicación estadounidense N° US 2011/0206702), en combinación con un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-PMEL17, tal como aquellos descritos en la presente. El inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-PMEL17 puede comprender el mismo o un agente citotóxico diferente como el inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-ETBR. En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-PMEL17 que comprende un agente citotóxico diferente, tal como un derivado de nemorrubicina o una pirroloebenzodiazepina, por ejemplo, cuando el inmunoconjugado anti-ETBR comprende MMAE.
La administración "en combinación" comprende la administración combinada (donde dos agentes terapéuticos se incluyen en la misma o en formulaciones separadas) , y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede ocurrir antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional (tal como el inmunoconjugado anti-ETBR) y/o adyuvante. En algunas modalidades, la administración del inmunoconjugado anti-PMEL17 y la administración del inmunoconjugado anti-ETBR ocurren dentro de alrededor de un mes, o dentro de alrededor una, dos o tres semanas, o dentro de alrededor de uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días entre una y otra. Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden usarse también en combinación con terapia de radiación.
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea el tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. La administración puede ser mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tal como intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se contemplan en la presente varios cronogramas de dosificación, incluyendo, de modo no taxativo, administraciones simples o múltiples durante varios momentos, administración por bolo e infusión por pulso.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se formulan, dosifican y administran de una manera coherente con la buena práctica médica. Los factores que deberán considerarse en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, el mamífero particular que se esté tratando, la afección médica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación del agente, el método de administración, el cronograma de administración y otros factores conocidos para los médicos. El anticuerpo o inmunoconjugado se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión, aunque no es necesario. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o inmunoconjugado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores mencionados anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las mismas vías de administración como se describe en la presente, o alrededor de 1 a 99% de las dosificaciones descritas en la presente, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente apropiada.
Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosis adecuada de un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo de anticuerpo o inmunoconjugado, la gravedad y ciclo de la enfermedad, si el anticuerpo o inmunoconjugado se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo o inmunoconjugado y el criterio del médico tratante. El anticuerpo o inmunoconjugado se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una posible dosis inicial puede ser de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo o inmunoconjugado para la administración al paciente ya sea, por ejemplo, en una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de alrededor de 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antemencionados. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento generalmente se mantiene hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosis del anticuerpo o inmunoconjugado estará generalmente en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, una o más dosis de alrededor de 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de estas) pueden administrarse al paciente. Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de manera que el paciente reciba desde alrededor de dos a alrededor de veinte, por ejemplo, alrededor de seis dosis del anticuerpo) . Se puede administrar una dosis de carga inicial mayor seguida por una o más dosis menores. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. La evolución de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales .
Debe entenderse que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos antemencionados pueden llevarse a cabo usando tanto un inmunoconjugado de la invención como un anticuerpo anti-PMEL17.
H . Artículos de fabricación En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el contenedor. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los contenedores pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición por sí misma o cominada con otra composición que es efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar el trastorno y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tenga un tapón que pueda perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo o inmunocon ugado de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza en el tratamiento de la afección elegida. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una comprende contenida en este, donde la composición comprende un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en este, donde la composición comprende un agente citotóxico u otro tipo de agente terapéutico adicional. El artículo de fabricación en esta modalidad de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto indicando que las composiciones pueden usarse para tratar una afección particular. De manera alternativa o adicional, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer o solución 5 de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
I . Depósito de material biológico 10 El siguiente material biológico se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC) : 15 Designación del N° ATCC Fecha del depósito hibridoma 7509 Í31D1.6.7) PTA-12862 24 de abril de 2012 El hibridoma depositado antemencionado produce el anticuerpo 31D1 referido en la presente. 20 El depósito se hizo según lo establecido en el Tratado de Budapest sobre del Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en materia de Patentes y las Regulaciones de este (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito y por al menos cinco (5) años después de la solicitud más reciente para obtener una muestra del depósito. El depósito estará disponible en la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y sujeto al acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, el cual asegura que las restricciones impuestas por el depositante respecto a la disponibilidad al público del material depositado serán eliminadas de manera irrevocable cuando se otorgue la patente estadounidense pertinente, asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público una vez se haya emitido la patente estadounidense correspondiente o ante la puesta a la disposición del público de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie para quien nombre el Comisionado de Patentes y Marcas que tenga el derecho a esto, de acuerdo con 35 U.S.C. § 122 y los reglamentos del Comisionado de acuerdo con este (incluyendo 37 C.F.R. § 1.14 con referencia particular a 886 OG 638).
III . EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Debe entenderse que pueden llevarse a la práctica otras modalidades diferentes, dada la descripción general provista anteriormente .
Expresión génica de PMEL17 humano Para el análisis de la expresión de ARNm de P EL17 en múltiples tumores humanos, se analizaron muestras normales de biopsia usando datos de Affymetrix obtenidos de Gene Logic, Inc. (Gaithersburg, MD) . El análisis mostrado es para el set de sonda identificado como 209848_s_at, llevado a cabo usando el GeneChip HGU133 Plus v2 en 3879 muestras de tejido humano normal, 1605 muestras de tejido canceroso humano (1291 primarios y 314 metastásicos) y 3872 muestras de tejido humano con enfermedad no cancerosa. Los datos del microensayo se normalizaron usando el software MAS (Microassay Analysis Suite) de Affymetrics, versión 5.0, con valores de expresión de muestra escalados a un promedio acotado de 500. El análisis de las líneas celulares cultivadas se llevó a cabo de una manera similar.
Los resultados se muestran en la Figura 1A y IB. La escala del eje "y" indica los niveles de expresión génica basados en la intensidad de la señal de hibridación. En la Figura 1A, aparecen puntos tanto encima como debajo de la línea que se extiende a partir del nombre de cada tejido enumerado. Los puntos que aparecen sobre la línea representan la expresión génica en tejido normal, y los puntos que aparecen debajo de la línea representan la expresión génica en tejido tumoral o enfermo. Como se muestra en la Figura 1A, el alto nivel de expresión de ARNm de PMEL17 fue ampliamente restringido a neoplasmas derivados de la piel, y todos estos se clasificaron como melanoma. Un pequeño número de tumores renales benignos que también fueron positivos se clasificaron como angiomiolipomas epitelioides , y una cantidad de linfornas positivos se identificaron como linfomas cutáneos de linfocitos T. La Figura IB muestra que PMEL17 se sobreexpresa en muchas líneas celulares de melanoma, mientras que hay poca o ninguna expresión en líneas celulares de otros cánceres humanos. BC, cáncer de mama; CRC, cáncer colorrectal ; GB, glioblastoma; NSCLC, cáncer de pulmón no microcítico; SC, cáncer de pulmón microcítico; NHL, linfoma no Hodgkin; MEL, melanoma; MM, mieloma múltiple; OVCA, cáncer de ovarios ; PANC, cáncer pancreático; PROS, cáncer de próstata. Solo el 5% de las 487 líneas celulares diferentes analizadas fue identificado en la figura.
B . Generación de anticuerpos monoclonales de ratón Los anticuerpos monoclonales contra PMEL17 humano se generaron usando los siguientes procedimientos. Se hiperinmunizaron dos grupos de ratones Balb/C (Charles River Laboratories, Hollister, CA) con EDC de PMEL17 humano purificado (aminoácidos 25 a 591 con una Fe de extremo C terminal expresado en células CHO) en adyuvante Ribi (Grupo 1) o con ADN plásmido que codifica P EL17 de longitud completa (Grupo 2) por medio de inyección hidrodinámica de la vena de la cola (HTV) usando una versión modificada de un protocolo descrito previamente (véase, por ejemplo, Her eijer, H., y olff, J. A. (2003) Gene Ther 10 (6), 453-458; Liu, F., Song, Y., y Liu, D. (1999) Gene Ther 6(7), 1258-1266; y Zhang, et ál . (1999) Hum Gene Ther 10(10), 1735-1737) . Después de un estímulo final con proteína (Grupol) o células PC3 que sobreexpresan PMEL17 (Grupo 2) 3 días antes de la infusión, los linfocitos B que mostraban una unión específica fuerte a células PC3 por medio de FACS de ambos grupos fueron electrofusionados (BTX ECM 2001, aparato Harvard) a una relaciónde 1:1 con células de mieloma de ratón X63-Ag8.653 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockwille, MD) , puestas en placas a 100,000 células/pocilio en medio de cultivo que contenía lx azaserina e hipoxantina (HA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se incubaron a 37°C, 7% C02.
Después de 10-14 días, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron mediante ELISA y FACS . Para el análisis de FACS, líneas celulares de melanoma SK-MEL-23 (provistas por Paul Robbins, Center for Cáncer Research, Sección Inmunología Tumoral) , 1300mel (provistas por Paul Robbins, Center for Cáncer Research, Sección Inmunología Tumoral) , SKMEL5 (ATCC HTB-70) y UACC257 (National Cáncer Institute) , melanocitos normales (nvitrogen, Carlsbad, CA) y la línea celular de cáncer de próstata PC3 que expresan de manera estable P EL17 humano se pusieron en contacto con el anticuerpo. Un anticuerpo de los ratones inmunizados por PMEL17, designado 17A9, reaccionó fuertemente mediante el análisis de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) con células vivas de melanoma, melanocitos humanos normales y la línea celular PC3 que expresan de manera estable ADNc de PMEL17, pero no la línea celular PC3 parental . Otro anticuerpo, 77E6, obtenido de ratones inmunizados por ADN, también era positivo por FACS, aunque 77E6 reaccionó con líneas celulares vivas que expresaban el tumor PMEL17 de una manera un tanto inconsistente y más débil que 17A9.
Los clones positivos que mostraban una unión específica a PMEL17 fuerte mediante FACS luego se expandieron y subclonaron limitando la dilución. Después de dos rondas de subclonación y análisis, los clones finales se cultivaron en biorreactores (Integra Biosciences, Chur, Suiza) y los sobrenadantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad de Proteína A como se describió previamente (Hongo et ál. (2000) Hybridoma 19(4), 303-315). Se seleccionaron tres clones de anticuerpo, 8G3, 15F2, 17A9, y 31D1 de los ratones inmunizados por ECD de PMEL17, y un clon de anticuerpo, 77E6, de los ratones inmunizados por ADN, para su análisis adicional.
C . Clonación de anticuerpos monoclonales de ratón Se extrajo el ARN total de las células de hibridoma que producen 8G3, 15F2 y 17A9 murinos utilizando métodos estándares. Los dominios variable ligero (VL) y variable pesado (VH) fueron amplificados usando RT-PCR con cebadores redundantes a las cadena pesada y ligera. Los cebadores directos fueron específicos para la secuencia de aminoácidos N-terminal de las regiones VL y VH. Respectivamente, se diseñaron los cebadores inversos de LC y HC para que se hibridaran con una región en el dominio 1 pesado constante (CH1) y ligero constante (CL) , que se conservan en gran medida entre las especies. Se determinó la secuencia de polinucleótidos de las inserciones utilizando métodos de secuenciación de rutina. Las secuencias de aminoácidos 17A9 VH y VL se muestran en las SEC ID N°s: 50 y 2, respectivamente. Las regiones hipervariables de cadena pesada (HVR) Hl, H2, y H3 se muestran en las SEC ID N°s: 3, 4 y 5, respectivamente. Las regiones hipervariables de cadena ligera (HVR) Ll, L2, y L3 se muestran en las SEC ID N°s: 6, 7 y 8, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos 8G3 VH y VL se muestran en las SEC ID N°s: 49 y 10, respectivamente. Las regiones hipervariables de cadena pesada (HVR) Hl, H2, y H3 se muestran en las SEC ID N°s: 13, 14 y 15, respectivamente. Las regiones hipervariables de cadena ligera (HVR) Ll, L2 , y L3 se muestran en las SEC ID N°s: 16, 7 y 8, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos 15F2 VH y VL se muestran en las SEC ID N°s: 51 y 12, respectivamente. Las regiones hipervariables de cadena pesada (HVR) Hl, H2 , y H3 se muestran en las SEC ID N°s: 20, 21 y 22, respectivamente. Las regiones hipervariables de cadena ligera (HVR) Ll, L2, y L3 se muestran en las SEC ID N°s: 23, 24 y 25, respectivamente.
En las Figuras 2A y 2B se muestra una alineación de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente, de los anticuerpos 8G3 , 17A9 y 15F2.
D . Mapeo de epxtopos de los anticuerpos monoclonales Todas las construcciones para el mapeo de epítopos se hicieron por amplificación de PCR de cada fragmento y subclonación en el vector pRKtkneo con una etiqueta gD N-terminal o un vector pRKtkneo con una etiqueta gD N-terminal y un ancla GPI C-terminal. Se llevaron a cabo transfecciones usando FuGene 6 (Roche Applied Science) y se utilizó un vector vacío como control. PMEL17 humano de longitud completa se subclonó en un vector pRKtkneo con una etiqueta gD N-terminal.
Se fusionaron una secuencia de señalización y una etiqueta de epítopo gD a la secuencia N-terminal de una serie de eliminaciones mutantes, que luego se expresaron en células de mamífero y los lisados se analizaron por inmunotransferencia para determinar la reactividad con 17A9 o 77E6. Las eliminaciones N-terminales analizadas incluyeron ?100, ?255, ?292, ?315, ?444, ?515 y ?567.
Además, las eliminaciones C-terminales con una N-terminales etiqueta gD y un ancla GPI C-terminal se transfectaron de forma transitoria en células 293 y se analizaron para determinar la unión a anticuerpos mediante FACS . Las eliminaciones del extremo C-terminal analizadas incluyeron PMEL1725-i25 , PMEL1725-105 , PMEL1725-85, PMEL1725-65 y PMEL1725-4S- Finalmente, un fragmento PMEL17 que comprende la región del aminoácido 515 a través del dominio transmembrana pero que carece de la región citoplasmática ("A515-C") y un fragmento PMEL17 que comprende solo el dominio citoplasmático con una etiqueta gD N-terminal y un GPI C-terminal se analizaron mediante inmunotransferencia para determinar la reactividad con 77E6.
Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 3A-3D. La Figura 3A muestra un diagrama de los mutantes de eliminación de PMEL17 N-terminal y las inmunotransferencias qie muestran la reactividad con un anticuerpo anti-gD y 77E6. 77E6 reaccionó con todas las eliminaciones del extremo N-terminal analizadas. La Figura 3B muestra un diagrama del fragmento A515-C y del fragmento de dominio citoplásmido, y las inmunotransferencias que muestran la reactividad con un anticuerpo anti-gD y 77E6. 77E6 se unió a todas las mutaciones de eliminación que contenían el dominio citoplasmático, pero no a la mutación A515-C, que carece de dominio citoplasmático. Estos resultados confirman que 77E6 se une a un epítopo dentro del dominio citoplasmático de PMEL1 .
La Figura 3C muestra inmunotransferencias que muestran la reactividad con un anticuerpo anti-gD y 17A6. 17A6 se unió solo a un P EL17 de longitud completa y no a las mutaciones ?225 o ?100. La Figura 3D muestra un diagrama de las mutaciones de eliminación de PMEL17 c-terminal y el análisis de FACS de anticuerpo anti-gD, 17A9 y 31D1 que se une a esas mutaciones. 17A9 se unió solo a PMEL1725-i25, y no a cualquiera de las otras mutaciones, incluyendo PMEL1725-io5, sugiriendo que 17A9 se une a un epítopo dentro de la región de aminoácidos 105 a 125 de PMEL17. 31D1 se unió a todos los fragmentos analizados, incluyendo PMEL172s-45, sugiriendo que 31D1 se une a un epítopo dentro de la región de aminoácidos 25 a 45 de PMEL17.
E. Ubicación subcelular de los epitopos PMEL17 Es sabido que PMEL17 experimenta un proceso bastante complejo durante su camino hacia el melanosoma, alguno de los cuales implica escisiones proteolíticas que resultan, en última instancia, en la sedimentación de fragmentos limitados que contienen el dominio RPT en estructuras fibrilares dentro del orgánulo maduro. Este proceso implica la escisión en Arg-469 mediante una proproteína convertasa, lo que da como resultado un fragmento Ma N-terminal y uno ?ß C-terminal que permanecen enlazadas mediante un enlace disulfuro. El fragmento ß es escindido todavía más mediante una metalproteinasa en Gln-583 y mediante ?-secretasa en la región de transmembrana. Por lo tanto, las regiones de PMEL17 que contienen los epítopos cxtoplasmáticos y N- terminales se disocian durante este procesamiento.
Debido a que PMEL17 experimenta este proceso complejo, la distribución subcelular de los epítopos de anticuerpo PMEL17 en células 928mel permeabilizadas (proporcionadas por Paul Robbins, Centro para la Investigación del Cáncer, Sector de Inmunología Tumoral) se determinó usando 77E6 marcado con fluoróforo Cy3 y 14C10 marcado con Alexa 488. El anticuerpo 14C10 se une a los mismos fragmentos de eliminación que 17A9. Un conjunto grande de PMEL17 que contiene epítopos cxtoplasmáticos (detectados por 77E6) y N-terminales (detectados por 14C10) se presentó en la estructura perinuclear, posiblemente el retículo endoplasmático . Sin embargo, en su extensión hacia la periferia celular, es evidente un gradiente descendente de intensidad de tinción mediante 77E6, seguido de un gradiente ascendente de tinción de 14C10, lo que incluye la reactividad en la membrana celular. Estos resultados sugieren que el epítopo citoplasmático reconocido por 77E6 es eliminado durante el tránsito de PMEL17 hacia la membrana plasmática mientras que el epxtopo N-terminal sigue hacia la superficie celular.
De forma coherente con la liberación de estructura citoplásmica durante el proceso secretor, el PMEL17 recuperado de los medios acondicionados tampoco logró reaccionar con 77E6. Cuando se escindió de los geles SDS no reductores, este PMEL17 segregado generó secuencias peptídicas derivadas de Ma y ?ß, pero no de la región citoplasmáticas , como fue determinado por espectrometría de masas. Tras la reducción con 2-mercaptoetanol, el PMEL17 segregado exhibió una movilidad mejorada en geles SDS y a, pero no en ?ß, se generaron secuencias a partir de esta banda escindida. Estos resultados sugieren que el PMEL17 segregado contiene las regiones Ma y ?ß enlazadas mediante un disulfuro, pero carece de secuencia citoplasmática .
La predominancia del epítopo N-terminal en la superficie celular en relación con el epxtopo citoplasmático es coherente con las señales más fuertes de FACS observadas con 17A9 sobre 77E6. Sin embargo, parece que alguna parte de la región citoplasmática esté presente en la superficie celular, lo que justifica las señales de FACS observadas con 77E6. Para abordar esto, se hicieron reaccionar células vivas con anticuerpos 77E6 y 17A9 que fueron marcados directamente con los Alexa Fluors 555 y 488, respectivamente. Para demostrar que los anticuerpos no compitieron los unos con los otros por unirse con las células vivas, se incubaron células 928mel con cualquiera de los anticuerpos marcados solos o los dos juntos y se realizó un análisis FACS, cerrado para los fluoróforos individuales. La unión de los anticuerpos individuales no se vio afectada por la presencia del otro anticuerpo. La visualización de células marcadas vivas reveló una tinción de la superficie celular uniforme con 17A9, de forma coherente con epítopos N-terminales amplios accesibles en la membrana plasmática. Por contraste, la tinción con 77E6 fue más aislada e irregular y no se superpuso en gran medida con la reactividad de 17A9. Además, aunque 17A9 tiñó todas las células de manera uniforme y consistente, la tinción de 77E6 varió de célula a célula y el grado total de la tinción varió de una preparación a otra. Los experimentos posteriores demostraron que la suspensión de células mejoraba en gran medida la presencia de la tinción de 77E6 en la superficie celular, lo que sugiere que las condiciones de cultivo podrían explicar esta variación. En general, la reactividad uniforme e intensa de 17A9 en células de melanoma hace que este anticuerpo sea un buen candidato para la conjugación de f rmacos .
F. Reactividad cruzada de las especies El anticuerpo 17A9 se analizó para determinar si reaccionaba de manera cruzada con PMEL17 de otras especies que no fuera la humana. La Figura 9A-9B muestra una alineación entre el PMEL17 de ser humano (SEC ID N° : 26), mono cynomolgus (SEC ID N° : 28), rata (SEC ID N°: 29) y ratón (SEC ID N° : 31) . Todas las secuencias incluyen la secuencia de señal, excepto el PMEL17 de mono cynomolgus. Los residuos que son idénticos para las cuatro especies se indican con un asterisco (*) . En la región donde la secuencia de rata tiene una eliminación, los residuos que son idénticos para las tres especies restantes se indican con un signo de más (+) . La unión a cada especie de PMEL17 se determinó mediante análisis de FACS utilizando células 293S transfectadas de manera estable con un PMEL17 marcado con gD N-terminal (PMEL17 humano, de mono cynomolgus, rata o ratón); teñido con 10 g/ml de anticuerpo 17A9; y detectado con anticuerpo antiratón de cabra conjugado con R-Ficoeritrina . Las células 293 no transfectadas no expresan normalmente PMEL17. Se halló que 17A9 se unía a las cuatro especies de PMEL17 analizadas: humana, de mono cynomolgus, rata y ratón.
G. Internalización del anticuerpo anti-PMEL17 Un atributo deseable de una diana ADC es la capacidad de internalizar el anticuerpo en un compartimento de degradación en la célula. Se sembraron células de melanoma 1300mel en cámaras portaobjetos de cuatro pocilios tratadas con cultivo celular Lab-Tek II (Nalge Nunc International) , e incubadas con mAb PMEL17, en presencia de inhibidores de la proteasa lisosómicos, leupeptina y pepstatina A (Sigma-Aldrich) en 50 nM y 5 nM respectivamente, con 2 µg/ml para 2 horas o 20 horas en una incubadora de 37°C con C02 al 5%. Luego las células se lavaron con PBS y se fijaron en 4% de Paraformaldehído (Polysciences, Inc.) durante 5 minutos a temperatura ambiente y se impermeabilizaron con saponina al 0.05% (Sigma-Aldrich) en PBS con BSA al 0.5% durante 5 minutos a 37°C; luego las células se incubaron durante una hora con 2 ug/ml de anti-LAMPl policlonal de conejo (Sigma-Aldrich) , un anticuerpo contra un marcador lisosómico, seguido de una hora de incubación de IgG anti-ratón marcado con Cy3 (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.) e IgG anti-conejo marcado con Alexa-488 (Invitrogen Life Technology) . Los anticuerpos PMEL17 también se marcaron directamente con Alexa Fluor 555 o Alexa Fluor 488 (Invitrogen Life Technology) , y las células teñidas luego de que fueran fijadas y permeabilizadas como se menciona anteriormente. Para las imágenes se utilizó un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems) .
Como se muestra en la Figura 4, fue evidente una superposición de tinciones con 17A9 y LAMP1 considerable dentro de las células. La rápida absorción de 17A9 en líneas celulares de melanoma PMEL17+ adicionales, incluyendo 526mel, SK-MEL-5 y UACC257 se observó de manera consistente. Estos resultados predicen que un ADC 17A9 debería internalizarse de manera efectiva, experimentar una degradación y liberar el fármaco para destruir las células de melanoma.
H . Producción de Conjugados de f rmacos y anticuerpos anti- PMEL1 Para una producción de anticuerpos a mayor escala, los anticuerpos se produjeron en células CHO. Los vectores que codifican VL y VH se transíectaron en células CHO y elIgG se purificó a partir de medios de cultivo celulares mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
El conjugado fármaco-anticuerpo Anti-PMEL17 (ADC) que comprende un enlace val-cit escindible mediante proteasa y el fármaco MMAE se produjo mediante la conjugación de 17A9 o chl7A9 (véanse, por ejemplo, las SEC ID N°s: 47 y 48) con el resto de enlace- fármaco MC-vc-PAB-MMAE, que se ilustra en la presente. Los ADC Anti-ETBR que comprenden un enlace val-cit escindible mediante proteasa y el fármaco MMAE se produjeron mediante la conjugación de ch5E9 (véase, las SEC ID N°s: 43 y 44) o hu5E9.vl (véase, por ejemplo, SEC ID N°s: 45 y 46) con el resto de enlace-fármaco MC-vc-PAB-MMAE. Por razones de conveniencia, el resto fármaco-enlace MC-vc-PAB-MMAE se denomina a veces en estos Ejemplos y en las Figuras como "vcMMAE" o WVCE." Antes de la conjugación, el anticuerpo se redujo parcialmente con TCEP utilizando métodos estándares de acuerdo con la metodología descrita en WO 2004/010957 A2. El anticuerpo reducido parcialmente se conjugó con el resto fármaco-enlazador usando métodos estándares de acuerdo con la metodología descrita en, por ejemplo, Doronina et ál . (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784 y US 2005/0238649 Al. En resumen, el anticuerpo parcialmente reducido se combinó con el resto f rmaco-enlazador para permitir la conjugación del resto fármaco-enlazador a residuos de cisteína reducidos del anticuerpo. La reacción de la conjugación de inactivo mediante la adición de N-acetil-cisteína en exceso para que reaccionara con cualquier resto enlazador-fármaco libre y el ADC se purificó. La carga farmacológica (número promedio de restos farmacológicos por anticuerpo) para el ADC se determinó que era de 2.78. La estructura de los ADC que comprende enlazador-fármaco val-cit-MMAE (también denominado MC-val-cit-PAB- MAE) se muestra en la Figura 15A.
El conjugado fármaco-anticuerpo Anti-PMEL17 (ADC) que comprende un enlazador val-cit escindible mediante proteasa y el fármaco PNU-159682 se produjo mediante la conjugación de chl7A9 al resto fármaco-enlazador MC-vc-PAB-PNU-159682 , sustancialmente como se describió anteriormente. El ADC anti-ETBR que comprende un enlazador val-cit escindible mediante proteasa y el fármaco PNU-159682 se produjo mediante la conjugación de ch5E9 con el resto fármaco-enlazador MC-vc-PAB-PNU-159682, sustancialmente como se describió anteriormente. La estructura de los ADC que comprende MC-val-cit-PAB-PNU-159682 se muestra en la Figura 15C.
El conjugado fármaco-anticuerpo Anti-PMEL17 (ADC) que comprende un enlazador val-cit escindible mediante proteasa y el fármaco PNU-159682 se produjo mediante la conjugación de chl7A9 al resto fármaco-enlazador MC-acetal-PNU-159682 , sustancialmente como se describió anteriormente. El ADC anti-ETBR que comprende un enlazador val-cit escindible mediante proteasa y el fármaco PNU-159682 se produjo mediante la conjugación de ch5E9 con el resto fármaco-enlazador MC- acetal-PNU-159682, sustancialmente como se describió anteriormente . La estructura de los ADC que comprende MC-acetal-PNU-159682 se muestra en la Figura 15B.
El conjugado fármaco-anticuerpo Anti-PMEL17 (ADC) que comprende un enlazador no escindible y el fármaco PNU-159682 se produjo mediante la conjugación de chl7A9 con el resto fármaco-enlazador MC-PNU-159682 , sustancialmente como se describió anteriormente. El ADC anti-ETBR que comprende un enlazador no escindible y el fármaco PNU-159682 se produjo mediante la conjugación de ch5E9 con el resto fármaco-enlazador MC-PNU-159682 , sustancialmente como se describió anteriormente. La estructura de los ADC que comprende PNU-159682 se muestra en la Figura 15E.
Los conjugados de fármaco y anticuerpos (ADC) que comprenden un enlazador val-cit escindible mediante proteasa y un fármaco dímero PBD se produjeron mediante la conjugación de un anticuerpo con el resto fármaco-enlazador MC-val-cit-PAB-PBD, sustancialmente como se describió anteriormente. La estructura de un anticuerpo-MC-val-cit-PAB-PBD se muestra en la Figura 15D.
I . Inhibición de la proliferación celular in vitro mediante un conjugado de anticuerpo Anti-P EL17 y fármaco La proliferación en presencia de ADC 17A9 se evaluó usando PMEL17+ células de melanoma y células PC3 que expresaban de manera estable PMEL17 colocadas en placas a 2, 000 por pocilio en 50 µ!> de medio de cultivo normal en placas de fondo transparente de 96 pocilios (PerkinElmer) . Veinticuatro horas después, se agregaron 50 iL adicionales de medio de cultivo con diluciones seriadas de ADC 17A9 para triplicar los pocilios. Tres o cinco días después, los números de células se determinaron usando CellTiter-GloII (Promega Corp.) y con un Lector de múltiples etiquetas EnVision 2101 (PerkinElmer) .
Como se muestra en la Figura 5, la titulación de un panel de PMEL17+ células de melanoma con ADC 17A9 resultó en la destrucción eficaz de las células con un IC50 que varía de 10 a 100 ng/ml de ADC. La línea celular de cáncer de próstata, PC3, que expresaba de manera estable PMEL17, fue destruida de manera eficaz, pero no se notó la destrucción de la línea celular parental PC3 de control de vector en 10 µ?/??? de ADC.
Si bien no se pretende limitarse a ninguna teoría en particular, la variación en los valores de IC50 de ADC para las líneas celulares de menaloma podría reflejar la variación en los niveles de PMEL17 accesibles al ADC, aunque los factores adicionales probablemente contribuyan. Por ejemplo, la línea celular 1300mel expresa significativamente más PMEL17 en la superficie celular que la línea celular SK-MEL-5, aún así, el IC50 del ADC es apenas mayor para 1300mel. Además, la variación de las líneas celulares en respuesta al producto farmacológico MMAE liberado podría ser otro factor auxiliar. Los valores de IC50 para MMAE libre en las ocho líneas celulares varió de aproximadamente 0.1 a 0.5 nM. Si bien no hubo una correlación estricta entre la respuesta al fármaco libre y ADC 17A9, una diferencia importante en la sensibilidad del fármaco libre podría, en algunas instancias, explicar la variación en la sensibilidad hacia el ADC. De hecho, SK-MEL-5 fue más sensible al MMAE libre que 1300mel, lo que podría compensar por el hecho de tener niveles más bajos de PMEL17 que de 1300mel en la superficie celular. Otros factores, incluyendo el índice relativo de internalización de anticuerpos, podría también afectar la respuesta al ADC. Por consiguiente, se comparó la capacidad de las cuatro líneas celulares diferentes para acumular e internalizar el anticuerpo en el tiempo. Como se esperaba, las células con niveles más altos de PMEL17 en la superficie celular acumularon más anticuerpos, pero el porcentaje de esa cantidad internalizada mostró ser comparable, indicando que hay una pequeña diferencia en la eficacia relativa de la absorción.
J. Toxicidad de ADC Anti-PMEL17 en Melanocitos Normales Para evaluar la capacidad potencial de seleccionar a PMEL17 como diana en melanocitos normales, se evaluó el nivel de expresión de esta diana en piel normal humana mediante inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica (IHC) se llevó a cabo en secciones de te ido incrustadas en parafina, fijadas con formalina, de 4 µ?t? de grosor, montadas en lámina portaobjetos de vidrio. Todas las etapas de IHC se llevaron a cabo en el teñidor automático Ventana Discovery XT (Ventana Medical Systems; Tucson, AZ) . El pre-tratamiento se llevó a cabo con Acondicionador de células 1, tiempo estándar. El anticuerpo primario, el clon de PMEL17, 31D1, se utilizó en una concentración de 10 q/ml y se incubó en láminas portaobjetos durante 1 hora a 37 °C. Se utilizó Ventana Mouse OmniMap (Ventana Medical Systems; AZ) como el sistema de detección. Se utilizaron Ventana DAB y Hematoxilina II para la detección cromogénica y contratinción.
Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 6A. El teñido con anticuerpo contra PMEL17, 31D1, reveló una reactividad intermitente a lo largo de la capa basal de la dermis, consistente con la distribución de melanocitos en la piel.
Melanocitos humanos normales y células de melanoma SK-MEL-5 se hicieron reaccionar con 17A9 quimérico, o ningún anticuerpo primario, seguido de IgG anti-humano marcado con Alexa 488 y se analizaron mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 6B, los melanocitos humanos normales cultivados fueron también sometidos a FACS+ con anticuerpo 17A9 y la intensidad fue comparable a la observada con la línea celular de melanoma SK-MEL-5.
Finalmente, las células de melanoma SK-MEL-5 y SK-MEL-23 o melanocitos humanos normales, se incubaron con diluciones seriadas de ADC 17A9 y cinco días más tarde, los números celulares se determinaron usando CellTiter-GloII . Como se muestra en la Figura 6C, la titulación de los melanocitos normales con ADC 17A9 resultó en la destrucción de las células con un IC50 casi 100 veces más alto que el observado con las líneas celulares de melanoma. Estos resultados son coherentes con el mecanismo de acción del fármaco antimitótico MMAE y la capacidad proliferativa reducida de melanocitos normales en relación con las células de melanoma.
K. Expresión de PMEL17 en especímenes de -tejido de melanoma humano La expresión de PMEL17 se evaluó a través de un panel de especímenes de tejidos de melanoma humano mediante inmunohistoquímica sustancialmente como se describe anteriormente, usando 17A9 y 31D1. La tinción se midió en una escala arbitraria que iba de cero, para su ausencia, a 3+ para la mayor intensidad: 0 (negativo) : tinción muy débil o ninguna tinción en >90% de las células de melanoma 1+ (leve) : el patrón de tinción predominante es débil 2+ (moderado) : el patrón de tinción predominante es moderadamente fuerte en la mayoría (> 50%) de las células de melanoma 3+ (fuerte) : el patrón de tinción predominante es fuerte en la mayoría (> 50%) de las células de melanoma Los ejemplos de tinciones para cada uno de los niveles de la escala se muestran en la Figura 7A, paneles de la izquierda .
Se obtuvieron cincuenta y ocho especímenes de 30 melanomas primarios y 28 melanomas metastásicos . Como se muestra en la tabla en la Figura 7B, el espectro completo de la tinción se observó en los 58 especímenes de melanoma humano, en el que la mayoría dio positivo con cada anticuerpo. 83% (48/58) de los especímenes de melanoma humano fueron PMEL17+ cuando se detectaron con 31D1, y 64% (37/58) fueron PMEL17+ cuando se detectaron con 17A9. Con relación a 17A9, la tinción con 31D1 se vio más desviada hacia el extremo superior de la escala. Gránulos incrustados en parafina fijos de líneas celulares de melanoma también se dividieron y tiñeron junto con los especímenes de tejido para medir su intensidad de tinción en relación con el melanoma real. Véase Figura 7A, paneles de la derecha.
L. Eficacia de Conjugados de Fármaco y Anticuerpo Anti-P EL17 en Injerto de Linea Celular de Melanoma SK-MEL-23 Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y el Uso de Animales de Laboratorio (Ref- Institute of Laboratory Animal Resources, "Guide for the Care and Use of Laboratory Animáis" , (NIH Publication #85-23). Washington (DC) : National Academy Press; 1996.
La eficacia de los ADC anti-PMEL17 se investigó utilizando un modelo de injerto de línea celular de melanoma SK-MEL-23. Hembras de Ratones CRL Nu/Nu de los Laboratorios Charles River se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho dorsal con cinco millones de células SK-MEL-23 en HBSS con Matrigel. Las células SK-MEL-23 presentaron una intensidad de tinción de 2+ a 3+. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron -200 mm3 (día 0) , los animales se distribuyeron de forma aleatoria en grupos de 10 cada uno y se administró una única inyección intravenosa de 2 o 6 mg/kg de ADC 17A9. Como control se utilizó MMAE conjugado con anticuerpo anti-GP120. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana hasta que finalizó el estudio. Los volúmenes tumorales se determinaron utilizando calibradores digitales (Fred V. Fowler Company, Inc.) usando la Fórmula (L x W x W)/2. La inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) se calculó como el porcentaje del área bajo la curva ajustada (AUC) para el grupo de dosis respectivo por día en relación con el vehículo, de manera que %TGI = 100 x [1-(AUCtratamiento/día) / (AUCVehícuio/día) ] . El ajuste de la curva se aplicó a los datos de volumen tumoral transformados por Log2 usando un modelo de efectos mixtos lineal, utilizando el paquete "nlme" [efectos mixtos no lineales], versión 3.1-96 en R v2.10.1.
Como se muestra en la figura 8, se halló que la dosis de 6 mg/kg de ADC 17A9 retrasaba el crecimiento tumoral durante varias semanas, mientras que ninguna de las dosis de ADC de control tenía un efecto apreciable en el crecimiento tumoral. Estos resultados demuestran una eficacia específica y robusta con un ADC que se dirige a PMEL17 en un injerto de tumor de melanoma humano.
M. Eficacia de Conjugados de Fármaco y Anticuerpo Anti-PMEL17 en Células de Melanoma UACC-257X2.2 resisten-bes a anti-ETBR- vc-MMAE Para determinar la eficacia de un ADC anti-PMEL17 en un melanoma que ha desarrollado resistencia a otro agente terapéutico, se desarrollaron in vivo e in vitro células de melanoma UACC-257X2.2 que son resistentes a un inmunoconjugado de receptor de anti-endotelina B (ETBR) que comprende un enlazador val-cit y fármaco MMAE (anti-ETBR-vc-MMAE, también denominado anti -EDNRB-ve-MMAE, anti-ETBR-MC-val-cit-PAB-MMAE, etc.; véase, por ejemplo, la Publicación estadounidense N° US 2011/0206702) .
Para la resistencia desarrollada in vivo, ratones lampiños NCr (Taconic, Hudson, NY) fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco dorsal derecho con 5 millones de células UACC-257X2.2 en HBSS con Matrigel . Las células UACC- 257X2.2 se obtuvieron a partir de células UACC-257 (National Cáncer Institute) y se optimizaron para el crecimiento in vivo como sigue. Células UACC-257 se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de hembras de ratones lampiños NCr para inducir el crecimiento tumoral. Un tumor se extrajo y cultivó in vitro (denominado "línea celular UACC-257X1.2"). La línea UACC-257X1.2 se volvió a inyectar por vía subcutánea en el flanco derecho de hembras de ratones lampiños NCr para mejorar el crecimiento de la línea celular in vivo. Un tumor de la segunda inyección se recogió y se volvió a adaptar para el cultivo in vitro, con el fin de generar UACC-257X2.2. La línea celular UACC-257X2.2 y tumores derivados de esta línea expresan ETBR en niveles comparables a la línea celular parental UACC-257.
A diez ratones inoculados con células UACC-257X2.2 se les administró 3 mg/kg de hu5E9. l-MC-vc-PAB-MMAE por vía intravenosa en el día 0 (las cadenas pesada y ligera para hu5E9.vl se muestran en las SEC ID N°s: 46 y 45, respectivamente) . Para determinar cuándo se tendría que volver a administrar una dosis a los ratones, y qué dosis, se tomaron en cuenta los siguientes factores: si los tumores volvieron a crecer luego del tratamiento inicial o no (es decir, tumores que volvieron a crecer hasta quedar del tamaño que tenían el día 0) y el índice de recrecimiento. La frecuencia de las dosis administradas varió en el tiempo pero no excedió las 2 dosis/semana. Las dosis intravenosas no excedieron los 300 µ?,. El rango de dosis administradas fue 3 mg/kg, 6 mg/kg, 8 mg/kg ylO mg/kg. La dosificación se discontinuó una vez que un tumor dejó de responder (es decir, mostró resistencia) a una serie de dosis en aumento.
Como se muestra en la Figura 10A, el tumor UACC-257X2.2 #359 desarrolló resistencia a anti-ETBR-vc-MMAE luego de alrededor de 120 días, mientras que el tumor #368 desarrolló resistencia más lentamente. El tumor # 359 se cosechó y las células se disociaron para su crecimiento in vitro (denominado en la presente "células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo").
Para la resistencia desarrollado in vitro, las células UACC-257X2.2 se adaptaron a concentraciones en aumento de anti-ETBR-vc-MMAE en bandejas de cultivo durante el curso de dos meses. La Figura 10B muestra la línea celular UACC-257X2.2 resistente derivada in vitro (denominadas en la presente "células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro") que, relativamente, no se vio afectada por concentraciones de anti-ETBR-vc-MMAE de hasta al menos 10 pg/ml. La Figura 10B también muestra las células UACC-257X2.2 resistentes in vitro incubadas con un ADC de control, a-gD-vc-MMAE, y las células UACC-257X2.2 parentales se incubaron con a-ETBR-vc-MMAE .
La expresión de ETBR y PMEL17 en la superficie de las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo y las células UACC-257X2.2 parentales se determinó luego mediante FACS . Las células se tiñeron con un anticuerpo anti-ETBR (hu5E9.vl o ch5E9) o con anticuerpo anti-PMEL17 (chl7A9) , seguido de un conjugado de anticuerpo Alexa 488 anti-humano. Como se muestra en las Figura 11A y 11B, tanto las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro como las derivadas in vivo disminuyeron la expresión de ETBR en la superficie de las células en relación con la línea celular parental. La expresión de PMEL17 en la superficie permaneció inalterada en las células resistentes en comparación con las células parentales. Véase, las Figura 11C y 11D. El pico de control en cada figura muestra la tinción solo con anticuerpo secundario .
Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro y derivadas in vivo se analizaron para determinar su susceptibilidad de concentraciones en aumento de anti-ETBR-vc-MMAE , anti-PMEL17 -ve-MMAE, y un ADC de control, anti-gD-vc-MMAE. Véanse el Ejemplo H y la Figura 15A.
Se evaluó la proliferación celular in vi tro de las líneas celulares en presencia de inmunoconjugados . Células se colocaron en placas a 1,500 células por pocilio en 50 de medio de cultivo normal en placas de fondo transparente de 96 pocilios. Veinticuatro horas después, se agregaron 50 adicionales de medio de cultivo con diluciones seriadas de inmunoconjugados para triplicar los pocilios. Cinco días después, se determinó la supervivencia celular usando reactivo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (G7572, Promega Corporation, Madison, I) , utilizando un Lector de etiquetas múltiples EnVision 2101 (Perkin-Elmer, Waltham, MA) .
Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 12A-12C. La línea celular UACC-257X2.2 parental fue susceptible tanto a anti-ETBR-vc-M AE como a anti-PMEL17-vc-MMAE, con EC50 de 45 ng/mL y 33 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 12A. La línea parental también fue susceptible al enlazador-fármaco (sin anticuerpo; MC-vc-PAB-MMAE; denominado "fármaco libre" en la Figura 12A-12C) , con un EC50 de 0.28 nM. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo fueron un poco menos susceptibles a anti-PMEL1? -ve-MMAE y significativamente menos susceptibles a anti-ETBR-vc-MMAE, con EC50 de 119 ng/mL y 235 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 12B. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo también fueron menos susceptibles al enlazador- fármaco (sin anticuerpo), con un EC50 de 0.77 nM. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro fueron significativamente menos susceptibles a anti-PMEL17-vc-M AE, con un EC50 de 764 ng/mL, y no fueron susceptibles a anti-ETBR-ve-MMAE . Véase la Figura 12C. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro también fueron menos susceptibles al enlazador-fármaco (sin anticuerpo) , con un EC50 de 3.5 nM. Estos resultados sugieren que la resistencia puede ser desarrollada tanto al anticuerpo como a las partes de fármaco del ADC.
Para determinar el efecto de la porción de anticuerpo del ADC en resistencia en células UACC-257X2.2 , las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo e in vitro se analizaron para determinar su susceptibilidad de los ADC con diferentes enlazadores y diferentes fármacos que los utilizados para desarrollar las células resistentes. Los ADC analizados en este experimento fueron anti-ETBR unido a PNU-159682 a través de un enlazador no escindible (anti-ETBR-PNU) y anti-PMELl7 unido a PNU-159682 a través de un enlazador no escindible (anti-PMEL17-PNU) . Véanse el Ejemplo H y la Figura 15E. Un anticuerpo no relacionado, anti-gD, unido a PNU- 159682 a través de un enlazador no escindible anti-gD-PNU) se utilizó como control.
Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 13A-13C. La línea celular UACC-257X2.2 parental fue susceptible tanto a anti-ETBR-PNU como a an i-PMEL17-PNU, con EC50 de 4.2 ng/mL y 5.5 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 13A. La línea parental también fue susceptible al enlazador- fármaco (sin anticuerpo; MC-PNU-159682 ; denominado "fármaco libre" en la Figura 13A-13C) , con un EC50 de 0.18 nM en este experimento. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo fueron tan susceptibles como la línea parental a anti-PMEL17-PNU, y significativamente menos susceptibles a anti-ETBR-PNU, con EC50 de 4.7 ng/mL y 14.3 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 13B. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo también fueron menos susceptibles al enlazador- fármaco (sin anticuerpo) , con un EC50 de 0.133 nM. De manera similar a las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo, las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro fueron igual de susceptibles a anti-PMEL17-PNU, pero un poco menos susceptibles a anti-ETBR-PNU, con un EC50 de 4.8 ng/mL y 14.6 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 13C. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro también fueron igual de susceptibles al enlazador- fármaco (sin anticuerpo) , con un EC50 de 0.15 n . Estos resultados demostraron que el grado de resistencia en las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo se puede atribuir a la parte de anticuerpo del ADC (por ejemplo, debido a una disminución en la expresión de ETBR) , en lugar de la resistencia a la parte de fármaco MMAE del ADC. Se obtuvieron resultados similares con anti-ETBR y anti-PMEL17 unidos a P U- 159682 a través de un enlazador lábil ácido.
Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo se analizaron para determinar su susceptibilidad a anti-ETBR unido a P U-159682 a través del enlazador ve utilizado en el inmunoconjugado MMAE (anti-ETBR-vc-PNU) y anti-PMEL17 unido a PNU-159682 a través del enlazador ve (anti-PMEL17-vc-PNU) . Véanse el Ejemplo H y la Figura 15C. Un anticuerpo no relacionado, anti-gD, unido a PNU-159682 a través de un enlazador ve (anti-gD-vc-PNU) se utilizó como control.
Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 14A-14C. La linea celular UACC-257X2.2 parental fue susceptible tanto a anti-ETBR-vc-PNU como a anti-PMEL17-vc-PNU, con un EC50 de 3 ng/mL y 2.5 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 14A. La línea parental también fue susceptible al enlazador- fármaco (sin anticuerpo; MC-vc-PAB-PNU-159682) , con un EC50 de 2 nM en este experimento. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo fueron apenas menos susceptibles que la linea parental a anti-PMEL17- C-PNU, y significativamente menos susceptibles a anti-ETBR-vc-PNU, con un EC50 de 6.4 ng/mL y 23 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 14B. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo también fueron apenas menos susceptibles al enlazador- fármaco (sin anticuerpo) , con un EC50 de 4.2 nM. De manera similar, las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro fueron menos susceptibles a anti-PMEL17-PNU y anti-ETBR-PNU, con un EC50 de 111.6 ng/mL y 41 ng/mL, respectivamente. Véase la Figura 14C. Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro también fueron apenas menos susceptibles al enlazador- fármaco (sin anticuerpo), con un EC50 de 6.6 nM. Estos resultados sugieren que el componente de enlazador del ADC puede contribuir a la resistencia en células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo. Compare, por ejemplo, la susceptibilidad de la linea parental y la línea resistente derivada in vitro a anti-PMEL17-vc-PNU (EC50s 2.5 ng/ml y 11.6 ng/ml, respectivamente), que tiene un anticuerpo y fármaco diferente pero el mismo enlazador que el ADC utilizado para desarrollar las líneas resistentes, con la sensibilidad de la línea parental y la línea resistente derivada in vitro a anti-PMEL17-P U (EC50s 5.5 ng/ml and 4.8 ng/ml, respectivamente) , que tiene un anticuerpo, fármaco y enlazador diferente.
Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo se analizaron para determinar su susceptibilidad a anti-ETBR unido al dímero PBD a través del enlazador ve utilizado en el inmunoconjugado MAE (anti- ETBR-vc-PBD) . El vc-PBD tenía la estructura mostrada como "PBD dimer-val-cit-PAB-Ab" en la presente. Véanse el Ejemplo H y la Figura 15D. En ese experimento, de manera similar a los resultados con anti- ETBR-vc-PNU, las líneas celulares resistentes fueron menos susceptibles a anti-ETBR-vc-PBD que la línea parental, si bien no fueron completamente resistentes, lo que sugiere que parte de la resistencia se debe a las partes de anticuerpo y de enlazador, pero parte de la susceptibilidad puede ser restituida cambiando la parte de fármaco de inmunoconjugado .
Pese a que la invención anterior ha sido descrita en detalle a modo ilustrativo y de ejemplo con fines de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberían interpretarse como que limitan el alcance de la invención.
Las descripciones de todas las patentes y bibliografía científica citada en la presente se incorporan expresamente a modo de referencia en su totalidad.
Tabla de secuencias región EVQLQQSGPE LVKPGASMRI SCKASGYSFT variable de GYTMN VKQS HGKNLE IGV YNPYNGGTVY cadena pesada NQKFKGKATL TVDKSSSTTY MELLSLTSED de 8G3 SAVYYCARTD SGGYAMDCWG QGTSVTVSSA KT región DVQITQSPSY LDASPGETIT INCRASKTIS variable de KYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS cadena ligera RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFA YYCQQ de 8G3 HNEYPYTFGS GTKLEIK región QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT variable de KYGVHWVRQP PGKGLEWLGV IWAGGNTNYN cadena pesada SALMSRLSIN KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT de 15F2 AMYYCATFDV WGAGTTVTVS SAKT región DIVMTQAAPS VPVTPGESVS ISCRSSKSLL variable de HSNGNTFLYW FLQRPGQSPQ LLIYRMSNLV cadena ligera SGVPDRFSGS GSGTAFTLRI SRVEAEDVGF de 15F2 YYCMQHLEYP YTFGGGTKLE LK 8G3 HVR Hl GYSFTGYTMN 8G3 HVR H2 VYNPYNGGTVYNQKFKG 8G3 HVR H3 TDSGGYAMDC 8G3 HVR Ll RASKTISKYLA consenso de GYSFTXxYTMN 8G3 / 17A9 HVR Hl Preproproteína MDLVLKRCLL HLAVIGALLA VGATKVPRNQ PMEL17 Humana; D LGVSRQLR TKAW RQLYP EWTEAQRLDC NP_008859; WRGGQVSLKV SNDGPTLIGA NASFSIALNF secuencia de PGSQKVLPDG QVIWVNNTII NGSQVWGGQP señal = VYPQETDDAC IFPDGGPCPS GS SQKRSFV aminoácidos 1 YVWKTWGQYW QVLGGPVSGL SIGTGRAMLG a 24 THTMEVTVYH RRGSRSYVPL AHSSSAFTIT DQVPFSVSVS QLRALDGGNK HFLRNQPLTF ALQLHDPSGY LAEADLSYTW DFGDSSGTLI SRALWTHTY LEPGPVTAQV VLQAAIPLTS CGSSPVPGTT DGHRPTAEAP NTTAGQVPTT EVVGTTPGQA PTAEPSGTTS VQVPTTEVIS TAPVQ PTAE STGMTPEKVP VSEV GTTLA E STPEATGM TPAEVSIVVL SGTTAAQVTT TEWVETTARE LPIPEPEGPD ASSIMSTESI TGSLGPLLDG TATLRLVKRQ VPLDCVLYRY GSFSVTLDIV QGIESAEILQ AVPSGEGDAF ELTVSCQGGL PKEACMEISS PGCQPPAQRL CQPVLPSPAC QLVLHQILKG GSGTYCLNVS LADTNSLAVV STQLIMPGQE AGLGQVPLIV GILLVLMAVV LASLIYRRRL MKQDFSVPQL PHSSSHWLRL PRIFCSCPIG ENSPLLSGQQ V Proproteína KVPR Q DWLGVSRQLR TKAWNRQLY EWTEAQRLDC PMEL17 Humana; WRGGQVSLKV SNDGPTLIGA NASFSIALNF sin secuencia PGSQKVLPDG QVIWVNNTII NGSQVWGGQP de señal; VYPQETDDAC IFPDGGPCPS GSWSQKRSFV aminoácidos25a YVWKTWGQYW QVLGGPVSGL SIGTGRAMLG 661 THTMEVTVYH RRGSRSYVPL AHSSSAFTIT DQVPFSVSVS QLRALDGGNK HFLRNQPLTF ALQLHDPSGY LAEADLSYTW DFGDSSGTLI SRALWTHTY LEPGPVTAQV VLQAAIPLTS CGSSPVPGTT DGHRPTAEAP NTTAGQVPTT EVVGTTPGQA PTAEPSGTTS VQVPTTEVIS TAPVQMPTAE STG TPEKVP VSEV GTTLA EMSTPEATGM TPAEVSIVVL SGTTAAQVTT TEWVETTARE LPIPEPEGPD ASSIMSTESI TGSLGPLLDG TATLRLVKRQ VPLDCVLYRY GSFSVTLDIV QGIESAEILQ AVPSGEGDAF ELTVSCQGGL PKEACMEISS PGCQPPAQRL CQPVLPSPAC QLVLHQILKG GSGTYCLNVS LADTNSLAVV STQLIMPGQE AGLGQVPLIV GILLVLMAVV LASLIYRRRL MKQDFSVPQL PHSSSHWLRL PRIFCSCPIG ENSPLLSGQQ V PMEL17 de mono KGPRNQDWLG VSRQLRTKAW NRQLYPE TE cynomolgus , AQRLDC RGG QVSLKVSNDG PTLIGANASF sin secuencia SIALNFPGSQ KVLPDGQVIW VNNTIINGSQ de señal VWGGQPVYPQ ETDDACIFPD GGPCPSGPWS QKRSFVYVWK TWGQYWQVLG GPVSGLSIGT GRAMLGTHTM EVTVYHRRGS RSYVPLAHSS SAFTITDQVP FSVSVSQLRA LDGGNKHFLR NQPLTFALQL HDPSGYLAEA DLSYTWDFGD SSGTLISRAL WTHTYLEPG PVTAQVVLQA AIPLTSCGSS PVPGTTDGHR PTAEAPDTTA GRGPTTEVVG TTPGQVPTTQ PSGTTSVQVP TTEVISTTPV QMPTAESTGT TPEKVPVSEV MGTTLAEMST PEAIGMTPAE VSI VPSGTT AAQVTTTEWV ETTAGELPTP EPEGPDTSSI MSTESITGSL GPLLDGTATL RLEKRQVPLD CVLYRYGSFS VTLDIVQGIE SAEILQVVPS SEGDAFELTV SCQGGLPTEA CMEISSPGCQ PPAQQLCQPV PPSPACQLVL YQILKGGLGT YCLNVSLADA NSLAVVSTQL IVPGQEAGLG QAPLFVGILL VL AVVLASL IYRRRL KQA FSIPQLPHGS SHWLRLPRIF RSCPIGENSP LLSGQEV Precursor MGVQRRCFLP VLVLGALLAL GSIEGSRNQN PMEL17 de WHGVSRQLVT KVWNKQLYPE WTEVQGSNCW rata; RGGQVSLKVR NDGPTLVGAN TSFSIALHFP NP_068682; GSQKVLPDGQ VIWVNNTIIN GSQVWGGQPV secuencia de YPREPDDACI FPDGGPCPSG PKPPRRSFVY señal = VWKTWGQYWQ VLGGPESKLS IPTGHARLGT aminoácidos 1 HTMEVTVYHR RGSQSYVPLA HSSSTFTITG a 25 SVSRLLDDTD TIMLVKRQVP LDCVLYRYGS FSLTLDIVQG IESAEILQAV PSSEGDAFEL TVSCRGGLPK EACMDISSPG CQPPAQRLCQ PVPPSPDCQL VLHQILKGGL GTYCLNVSLA DANSLAVAST QLVVPGQEGS LGQAPLLVGV LLVLVAVVLA SLIYRHRLKK QDSVSQTPHG STHWLRLPPV FCARRLGESS PLLSGQQV PMEL17 de SRNQN WHGVSRQLVT KVWNKQLYPE WTEVQGSNCW rata, sin RGGQVSLKVR NDGPTLVGAN TSFSIALHFP secuencia de GSQKVLPDGQ VIWVNNTIIN GSQVWGGQPV señal ; YPREPDDACI FPDGGPCPSG PKPPRRSFVY aminoácidos 26 VWKTWGQYWQ VLGGPESKLS IPTGHARLGT a 418 HTMEVTVYHR RGSQSYVPLA HSSSTFTITG SVSRLLDDTD TIMLVKRQVP LDCVLYRYGS FSLTLDIVQG IESAEILQAV PSSEGDAFEL TVSCRGGLPK EACMDISSPG CQPPAQRLCQ PVPPSPDCQL VLHQILKGGL GTYCLNVSLA DANSLAVAST QLVVPGQEGS LGQAPLLVGV LLVLVAVVLA SLIYRHRLKK QDSVSQTPHG STHWLRLPPV FCARRLGESS PLLSGQQV Precursor MGVQRRSFLP VLVLSALLAV GALEGSRNQD PMEL17 de WLGVPRQLVT KTWNRQLYPE WTEVQGSNCW ratón; RGGQVSLRVI NDGPTLVGAN ASFSIALHFP NP_068682; GSQKVLPDGQ VI ANNTIIN GSQVWGGQPV secuencia de YPQEPDDACV FPDGGPCPSG PKPPKRSFVY señal = V KTWGKYWQ VLGGPVSRLS IATGHAKLGT aminoácidos 1 HTMEVTVYHR RGSQSYVPLA HASSTFTITD a 25 QVPFSVSVSQ LQALDGETKH FLRNHPLIFA LQLHDPSGYL AEADLSYTWD FGDGTGTLIS RALDVTHTYL ESGSVTAQVV LQAAIPLVSC GSSPVPGTTD GYMPTAEAPG TTSRQGTTTK VVGTTPGQMP TTQPSGTTVV QMPTTEVTAT TSEQ LTSAV IDTTLAEVST TEGTGTTPTR PSGTTVAQAT TTEGPDASPL LPTQSSTGSI SPLLDDTDTI MLVKRQVPLD CVLYRYGSFS LALDIVQGIE SAEILQAVPF SEGDAFELTV SCQGGLPKEA CMDISSPGCQ PPAQRLCQSV PPSPDCQLVL HQVLKGGSGT YCLNVSLADA NSLAVASTQL VVPGQDGGLG QAPLLVGILL VLVAVVLASL IHRHRLKKQG SVSQMPHGST HWLRLPPVFR ARGLGENSPL LSGQQV PMEL17 de SR QD WLGVPRQLVT KTWNRQLYPE WTEVQGSNCW ratón, sin RGGQVSLRVI NDGPTLVGAN ASFSIALHFP secuencia de GSQKVLPDGQ VIWANNTIIN GSQVWGGQPV señal ,- YPQEPDDACV FPDGGPCPSG PKPPKRSFVY aminoácidos 26 VWKTWGKYWQ VLGGPVSRLS IATGHAKLGT a 626 HTMEVTVYHR RGSQSYVPLA HASSTFTITD QVPFSVSVSQ LQALDGETKH FLRNHPLIFA LQLHDPSGYL AEADLSYTWD FGDGTGTLIS RALDVTHTYL ESGSVTAQVV LQAAIPLVSC GSSPVPGTTD GYMPTAEAPG TTSRQGTTTK VVGTTPGQMP TTQPSGTTVV QMPTTEVTAT TSEQMLTSAV IDTTLAEVST TEGTGTTPTR PSGTTVAQAT TTEGPDASPL LPTQSSTGSI SPLLDDTDTI MLVKRQVPLD CVLYRYGSFS LALDIVQGIE SAEILQAVPF SEGDAFELTV SCQGGLP EA CMDISSPGCQ PPAQRLCQSV PPSPDCQLVL HQVLKGGSGT YCLNVSLADA NSLAVASTQL VVPGQDGGLG QAPLLVGILL VLVAVVLASL IHRHRLKKQG SVSQMPHGST HWLRLPPVFR ARGLGENSPL LSGQQV 5E9 HVR Hl GYTFTSYWMQ 5E9 HVR H2 TIYPGDGDTSYAQKFKG 5E9 HVR H3 WGYAYDIDN 5E9 HVR Ll KSSQSLLDSDGKTYLN 5E9 HVR L2 LVSKLDS 5E9 HVR L3 WQGTHFPYT región DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKSSQSLL variable de DSDGKTYLNW LQQKPGKAPK RLIYLVSKLD cadena ligera SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT de hu5E9.vl YYCWQGTHFP YTFGQGTKVE IK región EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT variable de SYWMQWVRQA PGKGLEWIGT IYPGDGDTSY cadena pesada AQKFKGRATL STDKSKNTAY LQMNSLRAED de hu5E9.vl TAVYYCARWG YAYDIDNWG región DVVMTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL variable de DSDGKTYLNW LLQRPGQSPK RLIYLVSKLD cadena ligera SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI TRVEAEDLGV de mu5E9 YYCWQGTHFP YTFGGGTKLE IK región QVQLLQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT variable de SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT IYPGDGDTSY cadena pesada AQKFKGKATL TTDKYSSTAY QLSSLASED de mu5E9 SAVYYCARWG YAYDIDNWG cadena ligera DWMTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL de ch5E9 DSDGKTYLNW LLQRPGQSPK RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI TRVEAEDLGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC Cadena pesada QVQLLQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT de ch5E9 SYWMQWVKQR PGQGLE IGT IYPGDGDTSY AQKFKGKATL TTDKYSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARWG YAYDIDNWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSR QQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK Cadena ligera DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKSSQSLL de hu5E9.vl DSDGKTYLNW LQQKPGKAPK RLIYLVSKLD SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYC QGTHFP YTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC Cadena pesada EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT de hu5E9.vl SYWMQ VRQA PGKGLE IGT IYPGDGDTSY AQKFKGRATL STDKSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCAR G YAYDIDNWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK Cadena ligera DVQITQSPSY LAASPGETIT INCRATKSIS de chl7A9 KYLAWYQEQP GKTNNLLIYS GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAMYYCQQ HNEYPYTFGS GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC cadena pesada EVQLQQSGPE LVKPGASMKI SCKSSGYSFT de chl7A9 RYTMN VKQS HGKNLEWIGV INPYNGGTVY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY ELLSLTSED SAVYYCARTD YDGYAMDYWG QGTSVTVSSA KTKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTL ISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK región EVQLQQSGPE LVKPGASMRI SCKASGYSFT variable de GYTMN VKQS HGKNLEWIGV YNPYNGGTVY cadena pesada NQKFKGKATL TVDKSSSTTY MELLSLTSED de 8G3 SAVYYCARTD SGGYAMDCWG QGTSVTVSS región EVQLQQSGPE LVKPGASMKI SCKSSGYSFT variable de RYTMN VKQS HGKNLEWIGV INPYNGGTVY cadena pesada NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELLSLTSED 17A9 SAVYYCARTD YDGYAMDYWG QGTSVTVSS región QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT variable de KYGVHWVRQP PGKGLEWLGV IWAGGNTNYN cadena pesada SALMSRLSIN KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT de 15F2 AMYYCATFDV WGAGTTVTVS S

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que se une a PMEL17, donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 105 a 125 de la SEC ID N° : 26, o une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 45 de la SEC ID N° : 26. 2. El anticuerpo de la reivindicación anticuerpo monoclonal. 3. El anticuerpo de la reivindicación anticuerpo humano, humanizado o quimérico. 4. El anticuerpo de la reivindicación fragmento de anticuerpo que une al PMEL17. 5. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde P EL17 es una PMEL17 humana. 6. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde PMEL17 humana comprende la secuencia de la SEC ID N° : 26 o SEC ID N° : 27. 7. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende : a) (i) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 5, (ii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y (iii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4 o b) (i) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15, (ii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8, y (iii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14 o c) HVR-H3, HVR-L3, y HVR-H2 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862. 8. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende: a) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 5 o b) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 14, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15 o c) HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862. 9. El anticuerpo de la reivindicación 8, donde el anticuerpo comprende: a) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 4, (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 5, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8 o fc>) (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 13, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N": 14, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 15, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8 o C) HVR-H1, HVR-H2 , HVR-H3, HVR-Ll, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862. 10. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende : a) (i) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 6, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8 o b) (i) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 16, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 7; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 8 o c) HVR-Ll, HVR-L2 y HVR-L3 del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862. 11. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende : a) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : l o b) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 2 o c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) ; o d) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID F: 9 O e) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 10 o f) una secuencia VH como en (d) y una secuencia VL como en (e) ; o g) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia a la secuencia VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro ATCC N° PTA-12862; o h) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia a la secuencia VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro ATCC N° PTA-12862; o i) una secuencia VH como en (g) y una secuencia VL como en (h) . 12. El anticuerpo de la reivindicación 11, que comprende una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 1, una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 9, o una secuencia VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862. 13. El anticuerpo de la reivindicación 11, que comprende una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 2, una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 10, o una secuencia VL del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862. 14. Un anticuerpo aislado que comprende (a) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 1 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 2; o (b) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 9 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 10; o (c) una secuencia VH del anticuerpo producido por el hibridoma 7509 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862 y una secuencia VL del anticuerpo producido por el hibridoma 750 (31D1.6.7) que tiene el número de registro de ATCC No. PTA-12862. 15. Un anticuerpo aislado que se une a la PMEL17, donde el anticuerpo comprende : a) (i) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22, (ii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25, y (iii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21 o b) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22 o c) (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 25 o d) (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 20, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 21, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 22, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 23, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 24, (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 25 o e) una secuencia VH que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 11 o f) una secuencia VL que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEC ID N° : 12 o g) una secuencia VH como en (e) y una secuencia VL como en (f) ; o h) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : li o i) una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 12; o j) una secuencia VH como en (h) y una secuencia VL como en (i) . 16. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que es un anticuerpo IgGl, IgG2a o IgG2b. 17. El ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 18. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 17. 19. Un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 18 para que se produzca el anticuerpo. 20. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un agente citotóxico . 21. El inmunoconjugado de la reivindicación 20 que tiene la fórmula Ab-(L-D)p, donde: (a) Ab es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; (b) L es un enlazador; (c) D es un fármaco seleccionado de un maitansinoide , una auristatina, una caliqueamicina, una pirrolobenzodiazepina, y un derivado de nemorrubicina; y (d) p varía entre 1-8. 22. El inmunoconjugado de la reivindicación 21, donde D es una auristatina. 23. El inmunoconj gado de la reivindicación 22, donde tiene la fórmula DE y donde R2 y Rs son cada uno metilo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada R8 se selecciona independientemente de CH3, 0-CH3, OH y H; R9 es H; y R18 es -C(R8)2-C(R8)2-arilo. 24. El inmunoconjugado de la reivindicación 21, donde fármaco es MMAE. 25. El inmunocon ugado de la reivindicación 22, donde D es una pirrolobenzodiazepina de la Fórmula A: donde las líneas punteadas indican la presencia opcional de un enlace doble entre Cl y C2 o C2 y C3 ,- R2 se selecciona independientemente de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se selecciona además de halo o dihalo, donde RD se selecciona independientemente de R, C02R, COR, CHO, C02H y halógeno; R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02 , Me3Sn y halógeno; R7 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halógeno; Q se selecciona independientemente de O, S y NH; R11 es ya sea H, o R o, donde Q es O, S03M, donde M es un catión metálico; R y R' se seleccionan cada uno independientemente de alquilo Ci-a opcionalmente sustituido, heterociclilo C3_8 y grupos arilo C5-2o, y opcionalmente en relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido de 4-, 5-, 6- o 7- miembros; R12, R16, R19 y R17 son como se definen para R2, R6, R9 y R7 respectivamente; R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede ser interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos que están opcionalmente sustituidos; y X y X' se seleccionan independientemente de O, S y N(H) . 26. El inmunoconjugado de la reivindicación 25, donde D tiene la estructura: donde n es 0 o 1, 27. El inmunoconjugado de la reivindicación 25, donde D tiene la estructura seleccionada de: donde RE y RE" se seleccionan cada uno independientemente de H o RD, donde RD se selecciona independientemente de R, C02R, COR, CHO, C02H, y halógeno; donde Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5_2o opcionalmente sustituido; y donde n es 0 o 1. 28. El inmunoconjugado de la reivindicación 21, donde D es una pirrolobenzodiazepina de la Fórmula B: donde la línea ondulada indica el sitio de enlace covalente al enlazador; RV1 y RV2 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo, fenilo, fenilo sustituido con fluoro y eterociclilo C5-6; y n es 0 o 1. 29. El inmunoconjugado de la reivindicación 21, donde D es un derivado de nemorrubicina. 30. El inmunoconjugado de la reivindicación 29, donde D tiene la estructura seleccionada de: 31. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, donde el enlazador es escindible por una proteasa. 32. El inmunoconjugado de la reivindicación 31, donde el enlazador comprende un dipéptido val-cit o un dipéptido Phe-Lys . 33. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, donde el enlazador es lábil al ácido . 34. El inmunoconjugado de la reivindicación 33, donde el enlazador comprende hidrazona. 35. El inmunoconjugado de la reivindicación 23, que presenta la fórmula: donde S es un átomo de sulfuro. 36. El conjugado inmunogénico de la reivindicación 26, que presenta la fórmula: 315 38. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 37, donde p varía de 2-5. 39. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 38, que comprende el anticuerpo de la reivindicación 9. 40. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 38, que comprende el anticuerpo de la reivindicación 14. 41. Una formulación farmacéutica que comprende el inmunoconj gado de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 40 y un portador farmacéuticamente aceptable. 42. La formulación farmacéutica de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional . 43. Un método para tratar un individuo que tiene cáncer PMEL17 positivo, el método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40. 44. El método de la reivindicación 43, donde el cáncer PMEL17 positivo es melanoma. 45. El método de la reivindicación 44, que comprende adicionalmente administrar un agente terapéutico adicional al individuo . 46. Un método para inhibir la proliferación de una célula PMEL17 positiva; el método comprende exponer la célula al inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40 bajo condiciones que permitan la unión del inmunoconjugado al PMEL17 en la superficie de la célula, inhibiendo de esta manera la proliferación de la célula. 47. El método de la reivindicación 46 donde la célula es una célula de melanoma. 48. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 conjugado con una etiqueta. 49. El anticuerpo de la reivindicación 48, donde la etiqueta es un emisor positrón. 50. El anticuerpo de la reivindicación 49, donde el emisor positrón es 89Zr. 51. Un método para detectar PMEL17 humano en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo anti-PMEL17 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-PMEL17 a un PMEL17 humano de origen natural, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-PMEL17 y un PMEL17 humano de origen natural en la muestra biológica. 52. El método de la reivindicación 51, donde el anticuerpo anti-PMEL17 es un anticuerpo como en la reivindicación 9 o de la reivindicación 15. 53. El método de la reivindicación 51, donde la muestra biológica es una célula de melanoma. 54. Un método para detectar un cáncer PMEL17 positivo que comprende (i) administrar un anticuerpo anti-PMEL17 marcado a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene cáncer PMEL17 positivo, donde el anticuerpo anti-PMEL17 marcado comprende un anticuerpo anti-PMELl7 de cualquiera de las reivindicaciones la 16, y (ii) detectar el anticuerpo anti-PMEL17 marcado en el sujeto, donde la detección del anticuerpo anti-PMEL17 marcado indica un cáncer PMEL17 positivo en el sujeto. 55. El método de la reivindicación 54, donde el anticuerpo anti-PMEL17 marcado es un anticuerpo como en la reivindicación 9 o de la reivindicación 15 que está marcado. 56. El método de la reivindicación 54 o de la reivindicación 55, donde el anticuerpo anti-PMEL17 marcado comprende un anticuerpo anti-P EL17 conjugado con un emisor positrón. 57. El método de la reivindicación 56, donde el emisor positrón es 89Zr. 58. Un método para tratar un individuo que tiene un cáncer PMEL17 positivo, donde el cáncer PMEL17 positivo es resistente a un primer agente terapéutico, el método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del inmunocon gado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40. 59. El método de la reivindicación 58, donde el cáncer PMEL17 positivo es melanoma. 60. El método de la reivindicación 58 o de la reivindicación 59, donde el primer agente terapéutico comprende un primer anticuerpo que une un antígeno que no sea el PMEL17. 61. El método de la reivindicación 60, donde el primer agente terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que une un antígeno que no sea PMEL17 y un primer agente citotóxico. 62. El método de la reivindicación 60 o de la reivindicación 61, donde el primer anticuerpo une un antígeno seleccionado de receptor de la endotelina B (ETBR) , proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TYRP1) , antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4) y glicoproteína B (GPNMB) . 63. El método de la reivindicación 62, donde el primer anticuerpo une el ETBR. 64. El método de la reivindicación 63, donde el primer anticuerpo es hu5E9.vl. 65. El método de la reivindicación 64, donde el primer inmunoconjugado es hu5E9. vl-MC-val-cit-PAB-MMAE . 66. El método de cualquiera de las reivindicaciones 61 a 65, donde el primer agente citotóxico y el agente citotóxico del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40 son diferentes. 67. El método de la reivindicación 66, donde el primer agente citotóxico es MMAE y el agente citotóxico del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40 se selecciona de una caliqueamicina, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina . 68. El método de la reivindicación 67, donde el agente citotóxico del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40 se selecciona de una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina. 69. Un método para tratar a un individuo con cáncer PMEL17 positivo, que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz de un primer inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40 en combinación con un segundo inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que une el ETBR. 70. El método de la reivindicación 69, donde el anticuerpo que une el ETBR comprende una HVR Hl que comprende una secuencia de la SEC ID N° : 33, una HVR H2 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 34, una HVR H3 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 35, una HVR Ll que comprende una secuencia de SEC ID N° : 36, una HVR L2 que comprende una secuencia de SEC ID N": 37, y una HVR L3 que comprende una secuencia de SEC ID N° : 38. 71. El método de la reivindicación 69, donde el anticuerpo que une el ETBR comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de la SEC ID N°: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID N° : 39. 72. El método de cualquiera de las reivindicaciones 69 a 71, donde el primer inmunoconjugado comprende un agente citotóxico seleccionado de una auristatina, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina, y el segundo inmunoconjugado comprende un agente citotóxico seleccionado de una auristatina, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina . 73. El método de cualquiera de las reivindicaciones 69 a 72, donde el primer inmunoconjugado comprende un agente citotóxico seleccionado de una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina, y el segundo inmunoconjugado comprende una auristatina. 74. El método de la reivindicación 73, donde el segundo inmunoconjugado comprende MMAE . 75. El método de cualquiera de las reivindicaciones 69 a 74, donde el segundo inmunoconjugado comprende una parte enlazador-fármaco que comprende MC-val-cit-PAB-MMAE. 76. El método de cualquiera de las reivindicaciones 69 a 75, donde el segundo inmunoconjugado es hu5E9.vl-MC-val-cit-PAB-MMAE. 77. El método de cualquiera de las reivindicaciones 69 a 76, donde el cáncer PMEL17 positivo es melanoma. do de cualquiera de las reivindicaciones 69 a 77, donde el cáncer PMEL17 positivo también es ETBR positivo.
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