ES2339934T3 - Conjugados de agentes citotoxicos y peptidos biologicamente activos. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto conjugado representado por la fórmula siguiente: **(Ver fórmula)** en donde: X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH; n = 2; R es N(R1R2), OR1, o SR1, en donde R1 y R2 son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono; Y es una secuencia espaciadora hidrófila seleccionada de un péptido que aumenta la biodistribución de dicho compuesto conjugado o un polímero hidrófilo, o se omite; Z es un péptido enlazador que, cuando está unido a Q en el término N o en un grupo amino compatible de cadena lateral de Q, conserva al menos 50% de la actividad biológica de Q, teniendo Z la fórmula: A-B-C-E-F, en donde: A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser; o está suprimido; B es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido; C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2, 3, o 4) 3-piridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap, 4-NH2-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o está suprimido; E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln, y F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln; con la condición de que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y Q es un resto de direccionamiento.
Description
Conjugados de agentes citotóxicos y péptidos
biológicamente activos.
La invención se refiere a conjugados de agentes
citotóxicos y péptidos biológicamente activos y usos de los
mismos.
El uso de compuestos carbamato como profármacos
es bien conocido. Los compuestos carbamato son muy adecuados para
diseño de profármacos debido a que pueden utilizarse para regenerar
el fármaco parental tanto si el punto de conexión a una molécula
vectora es un grupo hidroxilo como si es una amina. Profármacos
carbamato basados en ciclaciones intramoleculares han sido
consignados desde finales de los años 1980. Por ejemplo, la Patente
U.S. No. 4812590 (que corresponde a EP 0296811) describe derivados
de 4-hidroxianisol-carbamato como
profármacos para suministro y concentración de
4-hidroxianisol en melanomas. Vigroux et al.
(J. Med. Chem. 38, 3983-3994, 1995) describen
profármacos de acetaminofeno que incorporan N-carbamatos
(2-hidroxifenil-sustituidos) y
N-carbamatos
(2-hidroxipropil-sustituidos).
Un diseño óptimo de profármacos es uno en el
cual el fármaco se conjuga a un vector biológicamente activo de tal
modo que el conjugado es completamente estable en la circulación,
pero libera el agente terapéutico limpiamente cuando se internaliza
en las células diana. Diversos tipos de tecnologías de enlazadores
intentan conseguir esta meta por medios químicos diferentes. Se
contemplan típicamente dos tipos de fenómenos de biodegradación, la
hidrólisis pasiva y la hidrólisis enzimática. La hidrólisis pasiva
ocurre cuando la molécula se degrada por simple descomposición
química; ésteres, carbonatos, amidas y uretanos son todos ellos
susceptibles en diversos grados de hidrólisis con el orden de
estabilidad siguiente a pH básico: uretanos > amidas >
carbonatos > ésteres. La hidrólisis enzimática ocurre en la
circulación plasmática así como después de internalización. Si el
resultado deseado es transportar el conjugado a la célula diana, es
deseable que el conjugado sea muy resistente a las enzimas
plasmáticas que podrían degradar el complejo durante su recorrido.
Los derivados éster utilizados comúnmente son una elección
particularmente pobre de enlazador dado que el compuesto que
circula periféricamente es atacado con rapidez por las esterasas
ubicuas.
Otra estrategia de enlazadores aprovecha las
diferencias de pH existentes entre el interior y el exterior de las
células. Los lisosomas, que son responsables de la degradación de
las moléculas en el interior de las células, tienen un pH de
4-6, mientras que el plasma y el fluido extracelular
tiene un pH de 7,4. Un enlazador que está diseñado para degradarse
a pH 5, pero es estable a pH 7, puede ser útil para suministrar el
conjugado a las células, suponiendo que el conjugado no sufre
hidrólisis pasiva o enzimática en el plasma. Sin embargo, esta
estrategia de enlazadores no es óptima para conjugados peptídicos
debido a que la mayoría de la elaboración y purificación de los
péptidos sintéticos se realiza en medios ácidos.
Otros enlazadores químicos intentan aprovechar
enzimas específicas encontradas en los lisosomas. Por ejemplo,
muchas secuencias peptídicas son estables en plasma pero son
escindidas específicamente por enzimas lisosómicas.
Los efectos tóxicos secundarios de muchas de
estas terapias, así como tratamientos estándar de la enfermedad
neoplástica, limitan en la práctica la cantidad de agente activo que
puede ser administrada a un paciente. Adicionalmente, muchos
agentes activos causan toxicidades específicas de órganos, limitando
aún más la dosis que puede ser suministrada al tejido diana. Por
ejemplo, la cardiotoxicidad de muchos miembros de la familia de las
antraciclinas reduce la dosis terapéutica máxima disponible para
este grupo de agentes quimioterapéuticos. El suministro
direccionado de fármacos de diversos agentes terapéuticos puede
reducir la toxicidad en el tejido normal y aumentar la eficacia del
tratamiento permitiendo efectos concentrados localizados en tejidos
específicos.
Somatostatina, bombesina, y otros análogos
peptídicos biológicamente activos han sido utilizados para detectar
células tumorales que sobreexpresan receptores específicos de estos
péptidos. Véase, v.g., Denzler y Reubi, Cancer 85(1):
188-198, 1999). Además, somatostatina, bombesina y
muchos otros análogos agonistas de péptidos biológicamente activos
se internalizan rápidamente después de fijarse a sus receptores
(véase, v.g., Lukinius et al., Acta Onc. 38:
383-387, 1999). Esta internalización de los análogos
peptídicos puede dar como resultado translocación al núcleo celular
(Chen et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol., 279:
F440-F448, 2000).
Los análogos de somatostatina fijan subtipos
específicos de receptores de somatostatina que están presentes en
la superficie de tejidos específicos normales o enfermos. Los
receptores de somatostatina están regulados en sentido creciente en
tejidos específicos enfermos, con inclusión de enfermedades
intestinales inflamatorias, artritis reumatoide, y una diversidad
de tipos de tumor, así como vasos sanguíneos que abastecen a muchos
tumores (Denzler y Reubi, Cancer 85: 4188-198,
1999). Análogamente, receptores específicos de otro péptido
biológicamente activo, la Sustancia P, pueden estar regulados en
sentido creciente en diversas enfermedades.
Al menos 5 subtipos de receptores de
somatostatina han sido caracterizados, y los tumores pueden expresar
diversos subtipos de receptores. (Shaer, et al., Int. J.
Cancer 70:530-537, 1997). La somatostatina existente
naturalmente y sus análogos exhiben fijación diferencial a estos
subtipos de receptor, permitiendo un direccionamiento preciso de un
análogo peptídico a tejidos enfermos específicos.
Las propiedades físicas y químicas de muchos
agentes citotóxicos hacen problemática la conjugación de los
fármacos a péptidos biológicamente activos, tales como somatostatina
y bombesina. Por ejemplo, el fármaco puede reducir la especificidad
de fijación o la actividad biológica del análogo peptídico,
limitando su eficacia como agente de direccionamiento.
Adicionalmente, agentes terapéuticos y citotóxicos pueden tener
propiedades químicas que promuevan la acumulación de análogos
fármaco-péptido en ciertos órganos, aumentando la
toxicidad y reduciendo la eficacia. Se precisan medios efectivos
para enlazar agentes citotóxicos a un agente de direccionamiento
tal como un péptido biológicamente activo o un anticuerpo, al tiempo
que retienen la actividad de cada componente para maximizar los
efectos terapéuticos, al tiempo que minimizan la toxicidad.
EP 1118336 A2 describe un sistema de suministro
de fármacos anti-cáncer, en el cual un análogo de
somatostatina está conjugado con un fármaco anticáncer, tal como
paclitaxel, de tal modo que el fármaco anticáncer puede ser
suministrado específicamente a las células diana del cáncer. WO
03/028527 se refiere a la conjugación de péptidos biológicamente
activos tales como somatostatina o bombesina con compuestos químicos
mediante enlazadores que permiten la retención de la actividad
biológica del péptido. WO 00/31122 se refiere a análogos de
somatostatina que encuentran uso, v.g. en la detección, formación
de imágenes, o direccionamiento específico de células que expresan
receptores de somatostatina, particularmente células neoplásticas y,
finalmente, Saari, W.S. et al. (1990), Journal of Medicinal
Chemistry, 33, 97-101, No. 1 concierne a la
preparación de una serie de carbamatos básicos de
4-hidroxianisol.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención caracteriza conjugados de un agente
citotóxico y un resto de direccionamiento que tienen un enlazador
químico escindible que reduce la liberación de agente citotóxico en
la circulación, permitiendo con ello que el componente del agente
activo del conjugado sea internalizado más fácilmente por una
célula, y sometido más fácilmente a control activo de la tasa de
liberación en el interior de la célula, representados por la
fórmula siguiente
en
donde:
- \quad
- X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH;
- \quad
- n = 2;
- \quad
- R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono;
- \quad
- Y es una secuencia espaciadora hidrófila seleccionada de un péptido que aumenta la biodistribución de dicho compuesto conjugado o un polímero hidrófilo, o se omite;
- \quad
- Z es un péptido enlazador que, cuando está unido a Q en el término N o en un grupo amino compatible de cadena lateral de Q, conserva al menos 50% de la actividad biológica de Q, teniendo Z la fórmula:
A-B-C-E-F,
- \quad
- en donde:
- \quad
- A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser; o está suprimido;
- \quad
- B es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido;
- \quad
- C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2, 3, o 4) 3-piridil-Ala (Pal),
- \quad
- Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o está suprimido;
- \quad
- E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln, y
- \quad
- F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln;
- \quad
- con la condición de que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y
- \quad
- Q es un resto de direccionamiento.
De acuerdo con ello, en un aspecto, la presente
invención caracteriza péptidos biológicamente activos conjugados a
compuestos químicos a través de un enlace carbamato. Los conjugados
de la presente invención proporcionan numerosas ventajas, tales
como retención de la actividad biológica del péptido, estabilidad
mejorada del conjugado en plasma, y liberación intracelular del
compuesto unido. Péptidos preferidos para uso con los conjugados de
la invención incluyen somatostatina, bombesina, péptidos KiSS,
péptidos de urotensina II, péptidos GnRH I y II, octreotido,
depreotido, vapreotido, péptido vasoactivo intestinal (VIP),
colecistoquinina (CCK), factor de crecimiento semejante a insulina
(IGF), péptidos que contienen RGD, péptido de la hormona estimulante
de los melanocitos (MSH), neurotensina, calcitonina, péptidos de
regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo
antitumoral, glutatión, YIGSR (péptidos ávidos de leucocitos, v.g.
P483H, que contienen la región de fijación de heparina del factor 4
(PF-4) de las plaquetas y una secuencia rica en
lisina), péptido natriurético atrial (ANP), péptidos
\beta-amiloideos, antagonistas
delta-opioides (v.g.,
[^{125}I]TTIPP(psi)
[H-Tyr(3'I)-Ticpsi[CH2NH]Phe-Phe-OH];
ITIPP(psi)), annexina-V, endotelina,
interleuquina (IL)-1, IL-1ra,
IL-2, e IL-8, leucotrieno B4
(LTB4), péptidos quimiotácticos (v.g.,
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina-lisina
(fMLFK)), antagonistas de los receptores GP IIb/IIIa (v.g.,
DMP444), factor de crecimiento epidérmico, inhibidor de la elastasa
de los neutrófilos humanos (v.g.,
EPI-HNE-2 y
EPI-HNE-4), inhibidor de plasmina,
péptidos antimicrobianos, apticida (v.g., P280 y P274), receptor de
trombospondina (con inclusión de análogos tales como
TP-1300), bitistatina, receptor tipo I de la
adenilil-ciclasa de la hipófisis (PAC1), cadena
\alpha de fibrina. Se incluyen también péptidos derivados de una
biblioteca de presentación de fago, y sustituciones conservadoras de
los mismos, que están direccionados a una célula o tejido en el
cuerpo de un mamífero (v.g., tejido enfermo, tal como un tumor o un
vaso sanguíneo proliferativo angiogénico; sec, v.g., Aina et
al., Biopolymers 66:184-189, 2002). Tales
péptidos son útiles para direccionamiento específico de agentes
citotóxicos a una célula, tal como una célula de cáncer, o un
tejido en el cuerpo de un mamífero (v.g., el suministro de fármacos
anti-apoptóticos a tejido cardiaco o cerebral), o
para direccionar selectivamente los glóbulos blancos de la sangre o
tubérculos infectados con tuberculosis. Por ejemplo, cuando se
utiliza somatostatina o bombesina como el péptido biológicamente
activo en un conjugado de la invención, el agente citotóxico puede
direccionarse a una célula de cáncer que expresa un receptor de
somatostatina o un receptor de bombesina. La invención caracteriza
también anticuerpos (v.g., un anticuerpo monoclonal) o un fragmento
de los mismos, que pueden estar enlazados al conjugado de la
invención. Como se expone anteriormente con respecto a los péptidos,
cuando se incorpora un anticuerpo en un conjugado de la invención,
el agente citotóxico puede direccionarse a sitios específicos de
fijación del anticuerpo.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
un conjugado que tiene la fórmula:
en
donde
- \quad
- X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato a través de un grupo alquil-OH;
- \quad
- n = 2;
- \quad
- R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono;
- \quad
- R3 es un grupo NH(CH_{2})_{m}SH (donde m = 2 a 6), una cisteína D o L, una benzofenona (v.g., p-benzoil-fenilalanina), o un grupo OH. Un compuesto conjugado que tiene esta fórmula puede utilizarse para enlazarse a un péptido, proteína, o anticuerpo a través del grupo R3 que contiene tiol, carboxilato, o benzofenona fotoactiva. Adicionalmente, un péptido o proteína puede prepararse fácilmente por síntesis del péptido o proteína directamente en los compuestos. Por ejemplo, el compuesto puede proporcionarse de tal modo que el grupo R es un grupo amino primario o secundario protegido con tBoc, y puede añadirse a la resina peptídica como se describe en los ejemplos proporcionados más adelante. Péptidos, proteínas y anticuerpos pueden unirse también al compuesto mediante el uso de reacciones de productos químicos conocidos reactivos con tiol cuando el grupo R_{3} contiene un grupo tiol, o por una reacción fotorreactiva cuando R_{3} contiene un resto benzofenona (véase, v.g., Greg T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" p. 146-152, 1996).
En realizaciones preferidas de todos los
aspectos de la invención, X es un agente citotóxico seleccionado de
camptotecina, homocamptotecina, colchicina, tiocolchicina,
combretastatina, dolistatina, doxorrubicina, metotrexato,
podofilotoxina, rizoxina, rizoxina D, un taxol, paclitaxel, CC1065,
o un maitausinoide. Por ejemplo, el agente citotóxico camptotecina
se enlaza a través de su único grupo hidroxilo libre a un enlazador
carbamato. En estas realizaciones de la invención, n es
preferiblemente 2 y R es preferiblemente NH_{2}.
Y es una secuencia espaciadora hidrófila que
puede ser, preferiblemente, un péptido que aumenta la
biodistribución del conjugado, o un polímero hidrófilo. Por
ejemplo, Y puede ser una secuencia peptídica que aumenta la
biodistribución hidrófila del conjugado del péptido biológicamente
activo. En una realización preferida, Y tiene la fórmula
U(V-V)_{n}, donde U es
D-Pro, L-Pro,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
Sarcosina, Lys, Orn, Dab, Dap,
4-NH_{2}-Phe, o
(NH_{2}-(CH_{2})_{m}-
COOH), donde m=2-10, inclusive, o está suprimido; cada V se selecciona independientemente del grupo constituido por: D-Ser, L-Ser, D-Thr, L-Thr, D-Gln, L-Gln, D-Asn, L-Asn, D-4-OH-Pro, o L-4 hidroxi-Pro; y n=1-50, inclusive. En otra realización preferida, cada V es independientemente D-Ser o L-Ser. En otra realización preferida, al menos un V es un D-aminoácido.
COOH), donde m=2-10, inclusive, o está suprimido; cada V se selecciona independientemente del grupo constituido por: D-Ser, L-Ser, D-Thr, L-Thr, D-Gln, L-Gln, D-Asn, L-Asn, D-4-OH-Pro, o L-4 hidroxi-Pro; y n=1-50, inclusive. En otra realización preferida, cada V es independientemente D-Ser o L-Ser. En otra realización preferida, al menos un V es un D-aminoácido.
Y puede ser un polímero hidrófilo. Por ejemplo,
Y puede ser polietilenglicol, poli(acetato de vinilo),
poli(alcohol vinílico), HPMA
(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) o
copolímeros de HPMA,
\alpha,\beta-poli(N-hidroxietil)-DL-aspartamida
(PHEA), o
\alpha,\beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida.
Z es a péptido enlazador que conserva al menos
el cincuenta por ciento de la actividad biológica de Q, cuando Z
está unido a Q a través del grupo amino terminal o de la cadena
lateral de Q. Generalmente, Z puede ser un péptido de 2, 3, 4, o 5
restos. Z tiene la fórmula:
A-B-C-E-F,
donde A es D-Lys, D-Tyr,
D-Ser, o L-Ser, o está suprimido; B
es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido;
C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2,3, o 4)
3-piridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap,
4-NH_{2}-Phe,
D-4-OH-Pro, o
L-4-OH-Pro, o está
suprimido; E es D-Lys, D-Tyr,
D-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diyodo-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn, D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o L-Gln; y F es
D-Lys, D-Tyr,
D-Ser, L-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diyodo-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn, D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o L-Gln; con la condición de
que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F
no es Lys; y cuando A, B, C, y E, son Lys, Tyr, Lys, y Tyr,
respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos,
y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys. En
algunos péptidos, puede ser preferible que Z esté ausente.
En otras realizaciones, Z tiene la fórmula
(cuando A, B, y C están suprimidos):
E-F
donde E es D-Lys,
D-Tyr, D-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diyodo-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn, D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o L-Gln; y F es
D-Lys, D-Tyr, D-Ser,
L-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diyodo-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn, D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o
L-Gln.
En realizaciones preferidas, Z es
D-Ser-Nle-D-Ser-D-Ser
(SEQ ID NO: 1),
D-Ser-Lys-D-Ser-D-Ser
(SEQ ID NO: 2),
D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr
(SEQ ID NO: 3),
D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 4),
D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser
(SEQ ID NO: 5),
D-Ser-Ser-D-Lys-Ser
(SEQ ID NO: 5),
D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 6),
D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 7),
D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 8),
Lys-D-Ser-D-Ser
(SEQ ID NO: 9),
Ser-D-Lys-D-Ser
(SEQ ID NO: 10),
Ser-D-Lys-Ser (SEQ
ID NO: 10),
Nle-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 11),
Lys-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 12),
Pal-D-Lys-D-Ser
(SEQ ID NO: 13),
Thr-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 14),
D-Ser-D-Lys,
D-Ser-D-Tyr,
D-Lys-D-Lys,
D-Lys-D-Tyr, o
D-Tyr-D-Lys.
Q es un resto de direccionamiento, tal como un
péptido biológicamente activo o péptidos derivados de fago. En
realizaciones preferidas, Q es un péptido, tal como somatostatina,
bombesina, o un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal. Los
restos peptídicos o de direccionamiento biológicamente activos
preferidos son internalizados por células seleccionadas por un
proceso activo de internalización, tal como en el caso de la
fijación a un receptor acoplado a proteína G o los receptores de
somatostatina tipo 2 (SSTR2).
Otro aspecto caracteriza un medicamento para el
uso en el tratamiento de una enfermedad o modificación de una
función biológica, que incluye la administración a un animal de
sangre caliente que se encuentra en necesidad de ello, v.g., un
humano, una cantidad terapéuticamente eficaz o modificadora de la
función biológica de un conjugado de la invención. Una persona con
experiencia en la técnica reconocerá que el conjugado particular
utilizado dependerá del estado de enfermedad a tratar o del sistema
biológico a modificar. En particular, un experto en la técnica
podrá seleccionar un resto de direccionamiento y agente citotóxico
particulares para preparar un conjugado de la invención que tiene
especificidad para el tratamiento de la enfermedad o es capaz de
modificar la función biológica deseada. En realizaciones preferidas,
la enfermedad es un tumor del pulmón, mama, cerebro, ojo, próstata
o colon o un tumor de origen neuroendocrino (v.g. síndrome
carcinoide). La enfermedad es también una condición que es
resultado de o causa proliferación de vasos sanguíneos
angiogénicos.
Por "administración" o "administrar"
se entiende la entrega de una dosis de una composición farmacéutica
a un mamífero, por vía, v.g., tópica, oral, intravenosa,
intraperitoneal, o intramuscular. El método de administración
preferido puede variar dependiendo de diversos factores, v.g., los
componentes de la composición farmacéutica, el sitio de la
enfermedad potencial o real y la gravedad de la enfermedad.
En las descripciones genéricas de los compuestos
de esta invención, el número de átomos de un tipo particular en un
grupo constituyente se da generalmente como intervalo. Por ejemplo,
un grupo alquilo que contiene de 1 a 8 átomos de carbono o
C_{1-8} alquilo. La referencia a dicho intervalo
tiene por objeto incluir referencias específicas a grupos que
tienen cada uno de los números enteros de átomos dentro del
intervalo especificado: por ejemplo, un grupo alquilo de 1 a 8
átomos de carbono incluye cada uno de C_{1}, C_{2}, C_{3},
C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7} y C_{8}. Un
C_{1-8} heteroalquilo, por ejemplo, incluye de 1 a
8 átomos de carbono además de uno o más heteroátomos. Otros números
de átomos y otros tipos de átomos pueden indicarse de manera
similar.
Como se utiliza en esta memoria, "alquilo"
tiene por objeto incluir grupos hidrocarbonados alifáticos de cadena
ramificada o lineal y combinaciones de los mismos. Un grupo alquilo
contiene 1 a 20 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 8 átomos de
carbono. Ejemplos incluyen metilo, etilo, n-propilo,
n-butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, pentilo, isoamilo, hexilo, octilo. Por
"alquilo inferior"\cdot se entiende un grupo alquilo de
cadena ramificada o lineal que tiene menos de 11 átomos de carbono,
preferiblemente un grupo alquilo C_{1}-C_{8}.
Por "alquilamida inferior" se entiende un grupo alquilo
inferior como se ha descrito arriba sustituido con uno o más grupos
que contienen amida.
El término "alquenilo", solo o en
combinación, significa un hidrocarburo de cadena lineal o de cadena
ramificada que tiene uno o más enlaces dobles y que contiene de 2 a
20 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 8 átomos de carbono.
El término "alquinilo", solo o en combinación, significa un
hidrocarburo de cadena lineal o cadena ramificada que tiene uno o
más enlaces triples y que contiene de 2 a 20 átomos de carbono,
preferiblemente de 2 a 8 átomos de carbono.
Por "heteroalquilo" se entiende un grupo
ramificado o no ramificado en el cual uno o más metilenos
(-CH_{2}-) están reemplazados por nitrógeno, oxígeno, azufre,
carbonilo, tiocarbonilo, fosforilo, sulfonilo, o NR, donde R es un
alquilo. Algunos ejemplos incluyen aminas terciarias, éteres,
tioéteres, amidas, tioamidas, carbamatos, tiocarbamatos,
fosforamidatos, sulfonamidas, y disulfuros. El grupo heteroalquilo
puede estar sustituido o insustituido.
Por "análogo" se entiende una molécula que
difiere de, pero es estructural, funcional, y/o químicamente afín a
la molécula de referencia. El análogo puede retener las propiedades,
funciones o estructuras esenciales de la molécula de referencia.
Muy preferiblemente, el análogo retiene al menos una función
biológica de la molécula de referencia. Generalmente, las
diferencias son limitadas, de tal modo que la estructura o secuencia
de la molécula de referencia y análogo son globalmente similares.
Un análogo peptídico y su péptido de referencia pueden diferir en
secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, y/o
deleciones, en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido
sustituido o insertado puede ser o no uno codificado por el código
genético del análogo peptídico. Un análogo de un péptido o
polipéptido puede ser existente naturalmente, tal como una variante
alélica, o puede ser una variante que no se sabe que exista
naturalmente. Análogos de péptidos no existentes naturalmente
pueden producirse por síntesis directa, por modificación, o por
técnicas de mutagénesis.
Por "péptido biológicamente activo" se
entiende cualquier péptido existente naturalmente, modificado, o
sintético que está implicado en un proceso o función biológico.
Ejemplos de péptidos biológicamente activos incluyen: hormonas,
factores de crecimiento, neurotransmisores, antígenos, anticuerpos,
o fragmentos de los mismos.
El término "péptido de bombesina" tiene por
objeto hacer referencia a bombesina, o un análogo de la misma, que
tiene al menos una actividad biológica de la bombesina nativa;
preferiblemente, esta actividad es la capacidad para fijarse
específicamente a uno o la totalidad de los 3 subtipos de receptores
de bombesina conocidos en una célula portadora de receptores de
bombesina. Análogos de bombesina incluyen péptidos seleccionados del
grupo que contiene el octapéptido
G-Trp-H-I-His-J-K-NHV
(SEQ ID NO: 15), en donde G es Gln, Asn, Nle, o Nva; H es Ava, Gly,
Leu, Val, Ile, Nle, o Nva; I es \beta-Ala, ácido
4-aminobutírico, Gly, Ala, D-Ala,
N-Me-Ala, o
N-Me-D-Ala; J es
Phe, Tyr, 4-Cloro-Phe,
4-Fluoro-Phe,
4-Bromo-Phe,
4-NO_{2}-Phe, Ala, Gly, Leu, Val,
Ile, Nle, o Nva; K es Met, Phe, Tyr,
4-Cloro-Phe,
4-Fluoro-Phe,
4-Bromo-Phe,
4-NO_{2}-Phe, Ala, Gly, Leu, Val,
Ile, Nle, o Nva; y N representa una amida o una
N-alquilamida y V es H o una alquilamida
inferior.
Por "cíclico" se entiende un grupo
hidrocarbonado que tiene de 3 a 10 carbonos y más preferiblemente de
3 a 6 carbonos.
Por "agente citotóxico" se entiende
cualquier compuesto existente naturalmente, modificado, o sintético
que es tóxico para las células tumorales. Tales agentes son útiles
en el tratamiento de los neoplasmas, así como de enfermedades
inflamatorias, trastornos autoinmunes, y en el tratamiento de otros
síntomas o enfermedades caracterizados por proliferación celular o
por una población de células hiperactivas. Los agentes citotóxicos
incluyen agentes alquilantes, antibióticos, antimetabolitos,
inhibidores de tubulina, inhibidores de topoisomerasa I y II,
agonistas o antagonistas hormonales, o inmunomoduladores. Los
agentes citotóxicos pueden ser citotóxicos cuando son activados por
la luz o radiación infrarroja (Photofrin, tintes IR; Nat.
Biotechnol. 19 (4): 327-331, 2001), pueden operar
por otros caminos mecanísticos, o ser agentes potenciadores
suplementarios.
Por "biodistribución hidrófila" se entiende
la afinidad de los agentes peptídicos de la invención para los
fluidos corporales de un individuo al que se han administrado los
agentes peptídicos (v.g., sangre, fluido cerebroespinal, orina, u
otros fluidos corporales), tal que los agentes peptídicos se
distribuyen por todo el cuerpo del individuo, pero son secretados
rápidamente en la orina por el riñón, al tiempo que evitan la
absorción por órganos periféricos tales como hígado, vesícula
biliar, y los túbulos renales proximales.
Por "polímero hidrófilo" se entiende un
polímero soluble en agua, existente naturalmente o sintético,
opcionalmente modificado, que altera la biodistribución de un
agente peptídico de la invención. Ejemplos de tales polímeros
incluyen polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico)
(PVA), poli(acetato de vinilo), dextrano,
hidroxietil-almidón, gelatina, PVP, PHPMA,
\alpha,
\beta-poli[N(2-hidroxietil)-DL-aspartamida
(PHEA), polisuccinamida (PSI), a,
\beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida,
Estos polímeros pueden modificarse, por ejemplo,
por succinilación (carga negativa), hidrólisis parcial de PSI
(grupos carboxílicos), o reacción con compuestos que añaden grupos
que contienen amino o carboxilo. Tales modificaciones opcionales
pueden aumentar o cambiar el carácter hidrófilo del polímero, o
permitir el acoplamiento al péptido o agente citotóxico de la
invención. Tales polímeros y modificaciones son conocidos en la
técnica y se describen, por ejemplo, en Yamoaka et al., J.
Pharmacol. Sci. 83: 601-606, 1994; Rypacek et
al., Pflugers Arch. 392:211-217, 1982; Yamoaka
et al., J. Pharm. Pharmacol. 47:479-486,
1995; Francesco, Bioconjugate Chemistry
9(4):418-450, 1998; Duncan y Spreafico, Clin.
Pharmacokinet. 27(4):290-306, 1994.
Por "secuencia espaciadora hidrófila" se
entiende un péptido hidrófilo o polímero hidrófilo que aumenta la
biodistribución de un compuesto de la invención, por ejemplo por
inhibición de la acumulación periférica y/o promoción del
aclaramiento renal. Ejemplos de secuencias espaciadoras hidrófilas
para uso con la presente invención se proporcionan en esta
memoria.
Por "péptido" se entiende cualquier
polipéptido, péptido (con inclusión de péptidos cíclicos o
ramificados), o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos
uno a otro por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados.
Como se utiliza en esta memoria, el término péptido se refiere a
cadenas cortas, a las que se hace referencia comúnmente como
péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y a cadenas más largas, hasta
100 residuos de longitud. Los péptidos pueden contener aminoácidos
distintos de los 20 aminoácidos del código genético, y enlaces
distintos de los enlaces peptídicos. Los péptidos incluyen
secuencias de aminoácidos modificadas sea por procesos naturales, o
por métodos químicos de modificación que son bien conocidos en la
técnica. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier punto de un
polipéptido, con inclusión de la cadena principal del péptido, las
cadenas laterales de aminoácidos, y los términos amino o
carboxilo.
Las notaciones utilizadas en esta memoria para
los residuos de aminoácidos peptídicos son las abreviaturas
utilizadas comúnmente en la técnica. Las abreviaturas menos comunes
Abu, Ava, \beta-Ala, hSer, Nle, Nva, Pal, Dab, y
Dap significan ácido 2-aminobutírico, ácido
aminovalérico, ácido beta-aminopropiónico,
homoserina, norleucina, norvalina, (2, 3, o 4)
3-piridil-Ala, ácido
1,4-diaminobutírico, y ácido
1,3-diaminopropiónico, respectivamente. En todos
los aspectos de la invención, debe tenerse en cuenta que cuando los
aminoácidos no se designan como aminoácidos D o L, el aminoácido es
o bien un aminoácido L o podría ser un aminoácido D o L, a no ser
que el contexto requiera un isómero particular.
Por "péptido de somatostatina" se entiende
una somatostatina, o un análogo de la misma, que tiene al menos una
actividad biológica de la somatostatina nativa; preferiblemente,
esta actividad es la capacidad para fijarse específicamente a un
receptor de somatostatina en una célula portadora de receptores de
somatostatina. Muchos análogos de este tipo que tienen actividad
biológica se conocen y han sido descritos, por ejemplo, en Hornik
et al., U.S.P.N. 5,770,687; Coy et al., U.S.P.N.
5,708,135; Hoeger et al., U.S.P.N. 5,750,499; McBrida et
al., U.S.P.N. 5,620,675; Coy et al., U.S.P.N. 5,633,263;
Coy et al., U.S.P.N. 5,597,894; Taylor et al.,
U.S.P.N. 5,073,541; Coy et al., U.S.P.N. 4,904,642; Dean,
U.S.P.N. 6,017,509; Hoffman et al., WO 98/47524; y A. E.
Bogden, U.S.P.N. 5,411,943.
Por "resto de direccionamiento" se entiende
cualquier molécula que se fija específicamente, se asocia
reactivamente o se compleja con un receptor u otro resto receptivo
asociado con una población de células diana dada. Esta molécula
reactiva con las células, a la que está enlazado el fármaco reactivo
por el enlazador en el conjugado, puede ser cualquier molécula que
se fije a, se compleje con o reaccione con la población de células
que se desea modificar terapéuticamente o de cualquier otro modo
biológico, y, que posee un grupo amina libre reactivo o puede
modificarse de tal manera que contenga un grupo amino de esta clase.
La molécula reactiva con la célula actúa para suministrar el
conjugado, y, con ello, el agente citotóxico a la población de
células diana particular con la cual reacciona el ligando. Tales
moléculas incluyen proteínas de peso molecular elevado (generalmente
mayor que 10.000 Daltons) tales como, por ejemplo, anticuerpos,
proteínas de menor peso molecular (generalmente, menor que 10.000
Daltons), ligandos de polipéptidos o péptidos, o ligandos no
peptídicos.
Por "agente terapéutico" se entiende
cualquier compuesto que se utilice en la detección, diagnosis o
tratamiento de enfermedades humanas. Tales compuestos pueden ser
existentes naturalmente, modificados, o sintéticos. Los agentes
terapéuticos pueden promover o inhibir cualquier proceso biológico
implicado en un camino de enfermedad humana. Dianas de enfermedad
preferidas incluyen enfermedad inflamatoria intestinal, artritis
reumatoide, apoptosis de células neoplásticas, tejidos cardiacos, o
células que proliferan de modo aberrante, síndrome carcinoideo,
acromegalia, tuberculosis, y angiogénesis que causa una
proliferación inadecuada de vasos sanguíneos (v.g., la degeneración
macular que es resultado de un exceso de angiogénesis en el ojo). Un
agente terapéutico es un agente citotóxico y puede ser por ejemplo,
antineoplástico. Los agentes antineoplásticos pueden ser agentes
alquilantes, antibióticos, antimetabolitos, agonistas o antagonistas
hormonales, inhibidores de tubulina, inhibidores de topoisomerasa I
y II, agentes anti-o
pro-apoptóticos, o inmunomoduladores. Los agentes
antineoplásticos pueden operar por otros caminos mecanísticos, o
los agentes antineoplásticos pueden ser agentes potenciadores
suplementarios.
Por "tratamiento" se entiende la
administración de una composición farmacéutica para propósitos
profilácticos y/o terapéuticos. "Prevenir la enfermedad" se
refiere a un tratamiento profiláctico de un paciente que no está
enfermo todavía, pero que es propenso a, o que se encuentra por
cualquier otra razón en riesgo de padecer una enfermedad
particular. "Tratar la enfermedad" o utilizar para
"tratamiento terapéutico" se refiere a la administración de un
tratamiento a un paciente que sufre ya una enfermedad a fin de
aliviar la enfermedad y mejorar el estado del paciente. Así, en las
reivindicaciones y realizaciones, el término "tratamiento" es
la administración a un mamífero sea para propósitos terapéuticos o
profilácticos.
La Figura 1 es un diagrama que demuestra la
síntesis sobre resina de un análogo de somatostatina que contiene
el grupo BINAR y la fijación de camptotecina por un grupo enlazador
carbamato seguida por eliminación de la resina para dar el
compuesto 2. Las condiciones básicas de ataque enzimático dan como
resultado la liberación de camptotecina libre asistida por
nucleófilos.
La Figura 2 es un gráfico que demuestra la curva
dosis-respuesta para los conjugados
1-6 y que muestra la capacidad de los conjugados
1-6 para destruir las células
IMR-32-positivas del receptor de
somatostatina subtipo 2 (SSTR2), después de incubación durante 3
días utilizando un ensayo MTT de viabilidad celular.
La presente invención se refiere a conjugados de
agentes citotóxicos y péptidos biológicamente activos como se han
especificado arriba. Estos conjugados proporcionan muchas ventajas
para la administración de tales agentes citotóxicos. Los conjugados
de la invención pueden dirigirse a sitios diana o células
específicas, dando como resultado la internalización eficaz del
agente citotóxico. Adicionalmente, los conjugados de la invención
exhiben una liberación reducida del agente citotóxico en la
circulación. Los conjugados de la invención pueden modificarse
según se desee para ajustar la liberación del agente citotóxico.
De acuerdo con la presente invención, la tasa de
liberación de agente citotóxico puede controlarse por modificación
de la estructura química del conjugado. Por ejemplo, cuando R es
NH_{2} y n = 2, puede tener lugar la reacción de desplazamiento
siguiente:
Sin pretender quedar ligados por ninguna teoría,
en el mecanismo que antecede, el grupo nucleófilo contribuye a la
liberación intracelular del agente citotóxico (como
"X-OH") de una manera ajustable dependiente de
n. La reactividad del nucleófilo puede aumentarse o reducirse de
acuerdo con la longitud de la cadena lateral hidrocarbonada, es
decir, de acuerdo con el valor de n, o por cambio de R a NCH_{3},
OH, o N(CH_{3})_{2}. En la presente invención, n
= 2 y el grupo citotóxico está unido al enlace carbamato a través de
un grupo alquil-OH, v.g., camptotecina,
homocamptotecina, colchicina, combretastatina, dolistatina,
doxorrubicina, metotrexato, podifilotoxina, rizoxina, rizoxina D,
rocaglamida, anguidina, un taxol, paclitaxel, CC1065, o un
maitansinoide.
Así, es evidente por la doctrina de esta memoria
que los conjugados de la invención pueden diseñarse de modo que
controlen la liberación del agente citotóxico.
La invención caracteriza también un compuesto
que tiene la fórmula:
en
donde
- \quad
- X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH;
- \quad
- n = 2;
- \quad
- R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo inferior de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono, y en donde R_{3} es un grupo NH(CH_{2})_{m}SH y m = 2 a 6, D-o L-cisteína, una benzofenona, o un grupo OH. Por ejemplo, un compuesto que tiene la fórmula:
- \quad
- puede utilizarse para unir el compuesto a un péptido, proteína, o anticuerpo. Adicionalmente, un péptido o proteína puede sintetizarse directamente sobre este conjugado, proporcionando con ello un medio fácil de preparación de compuestos conjugados que contienen un péptido o proteína. El compuesto puede proporcionarse de tal modo que el grupo R es como (sic) grupo amino primario o secundario protegido con tBoc, y un péptido o proteína puede añadirse al compuesto como se describe en los ejemplos que se proporcionan más adelante.
Péptidos, proteínas, y anticuerpos pueden unirse
también a un compuesto que tiene la fórmula:
Este derivado R no protegido puede utilizarse
para enlazar péptidos, proteínas, y anticuerpos utilizando
reacciones de productos químicos reactivos con tiol conocidas que
se unen al resto tiol en la posición R_{3} (véase, v.g., Greg T.
Hermanson, "Bioconjugate Techniques" p.
146-152, 1996, y el Ejemplo 21 más adelante).
En la totalidad de los conjugados de la
invención, X se selecciona preferiblemente de agentes citotóxicos
que contienen un grupo hidroxilo primario, secundario, terciario o
bencílico. Un experto de la técnica reconocerá que, para aquellos
agentes citotóxicos que carecen de un grupo hidroxilo, un derivado
que contiene un grupo hidroxilo de este tipo puede prepararse
utilizando procedimientos conocidos en la técnica.
Agentes citotóxicos preferidos son los
utilizados para terapia del cáncer, tales como, en general, agentes
alquilantes, agentes antiproliferativos, y agentes de fijación de
tubulina. Clases preferidas de agentes citotóxicos incluyen, por
ejemplo, la familia de fármacos de antraciclina, los fármacos de la
vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos
citotóxicos, la familia de fármacos de pteridina, diinenos, y las
podofilotoxinas. Miembros particularmente útiles de dichas clases
incluyen, por ejemplo, adriamicina, carminomicina, daunorrubicina,
aminopterina, metotrexato, metopterm, diclorametotrexato, mitomicina
C, porfiromicina, 5-fluorouracilo,
6-mercaptopurina, arabinósido de citosina,
podofilotoxina, o derivados de podofilotoxina tales como etoposido o
etoposido-fosfato, melfalán, vinblastina,
vincristina, leurosidina, vindesina, leurosina. Como se ha indicado
anteriormente, un experto en la técnica puede realizar
modificaciones químicas al compuesto deseado a fin de hacer las
reacciones de dicho compuesto más convenientes para los propósitos
de preparación de los conjugados de la invención. En realizaciones
preferidas, X es un agente citotóxico seleccionado de camptotecina,
homocamptotecina, colchicina, combretastatina, dolistatina,
doxorrubicina, metotrexato, podofilotoxina, rizoxina, rizoxina D, un
taxol, paclitaxel, CC1065, o un maitansinoide. Por ejemplo, el
agente citotóxico camptotecina se enlaza a través de su único grupo
hidroxilo libre a un enlazador carbamato y la tiocolchicina puede
derivatizarse de tal modo que contenga un grupo hidroxi adecuado
para uso de la estrategia de grupos enlazadores descrita. En esta
realización de la invención, n es preferiblemente 2 y R es
preferiblemente NH_{2}.
En los conjugados de la presente invención, X
puede ser cualquier resto citotóxico, v.g., agentes antineoplásticos
tales como: Acivicina; Aclarrubicina; Acodazol Hidrocloruro;
Acronina; Adozelesina; Adriamicina; Aldesleucina; Altretamina;
Ambomicina; A, metandrona acetato; Aminoglutetimida; Amsacrina;
Anastrozol; Antramicina; Asparaginasa; Asperlina; Azacitidina;
Azetepa; Azotomicina; Batimastat; Benzodepa; Bicalutamida;
Bisantreno Hidrocloruro; Bisnafida Dimesilato; Bizelesina,
Bleomicina Sulfato; Brequinar Sodio; Biopirimina; Busulfán;
Cactinomicina; Calusterona; Camptotecina; Caracemida; Carbetimer;
Carboplatino; Carmustina; Carubicin Hidrocloruro; Carzelesina;
Cedefingol; Clorambucil; Cirolemicina; Cisplatino; Cladribina;
Colchicina; Combretestatin A-4; Crisnatol Mesilato;
Ciclofosfamida; Citarabina; Dacarbazina; DACA
(N-[2-(Dimetil-amino) etil]
acridina-4-carboxamida);
Dactinomicina; Daunorrubicina Hidrocloruro; Daunomicina;
Decitabina; Dexormaplatino; Dezaguanina; Dezaguanina Mesilato;
Diaziquona; Docetaxel; Dolasatinas; Doxorrubicina; Doxorrubicina
Hidrocloruro; Droloxifeno; Droloxifeno Citrato; Dromostanolona
Propionato; Duazomicina; Edatrexato; Eflornitina Hidrocloruro;
Elipticina; Elsamitrucina; Enloplatino; Enpromato; Epipropidina;
Epirrubicina Hidrocloruro; Erbulozol; Esorrubicina Hidrocloruro;
Estramustina; Estrarnustina-Fosfato Sódico;
Etanidazol; Etiodized Aceite I 131; Etoposido; Etoposido Fosfato;
Etoprina; Fadrozol Hidrocloruro; Fazarabina; Fenretinida;
Floxuridina; Fludarabina Fosfato; Fluorouracil;
5-FdUMP; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecin
Sodio; Gemcitabina; Gemcitabina Hidrocloruro; Gold Au 198;
Homocamptotecina; Hidroxiurea; Idarrubicina Hidrocloruro;
Ifosfamida; Ilmofosina; Interferón Alfa-2a;
Interferón Alfa-2b; Interferón
Alfa-nl; Interferón Alfa-n3;
Interferón Beta-I a; Interferón
Gamma-I b; Iproplatino; Irinotecán Hidrocloruro;
Lanreotida Acetato; Letrozol; Leuprolida Acetato; Liarozol
Hidrocloruro; Lometrexol Sodio; Lomustina; Losoxantrona
Hidrocloruro; Masoprocol; Maitansina; Mecloretamina Hidrocloruro;
Megestrol Acetato; Melengestrol Acetato; Melfalán; Menogaril;
Mercaptopurina; Metotrexato; Metotrexato sódico; Metoprina;
Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcina; Mitocromina; Mitogilina;
Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Mitoxantrona
Hidrocloruro; Ácido micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina;
Ormaplatino; Oxisurán; Paclitaxel; Pegaspargasa; Peliomicina;
Pentamustina; Peploicina Sulfato; Perfosfamida; Pipobromán;
Piposulfán; Piroxantrona Hidrocloruro; Plicamicina; Plomestano;
Porfimer Sodio; Porfiromicina; Prednimustina; Procarbazina
Hidrocloruro; Puromicina; Puromicina Hidrocloruro; Pirazofurina;
Rizoxina; Rizoxina D; Riboprina; Rogletimida; Safingol; Safingol
Hidrocloruro; Semustina; Simtrazeno; Esparfosato Sódico;
Esparsomicina; Espirogermanio Hidrocloruro; Espiromustina;
Espiroplatino; Estreptonigrina; Estreptozocina; Cloruro de
Estroncio Sr 89; Sulofenur; Talisomicina; Taxano; Taxoide; Tecogalán
Sodio; Tegafur; Teloxantrona Hidrocloruro; Temoporfina; Teniposido;
Teroxirona; Testolactona; Tiocolchicina; Tiamiprina; Tioguanina;
Tiotepa; Timitaq; Tiazofurina; Tirapazamina; Tomudex; TOP53;
Topotecán Hidrocloruro; Toremifeno Citrato; Trestolona Acetato;
Triciribina Fosfato; Trimetrexato; Trimetrexato Glucuronato;
Triptorelina; Tubulozol Hidrocloruro; Uracil Mostaza; Uredepa;
Vapreotida; Verteporfina; Vinblastina; Vinblastina Sulfato;
Vincristina; Vincristina Sulfato; Vindesina; Vindesina Sulfato;
Vinepidina Sulfato; Vinglicinato Sulfato; Vinleurosina Sulfato;
Vinorrelbina Tartrato; Vinrosidina Sulfato; Vinzolidina Sulfato;
Vorozol; Zeniplatino; Zinostatina; Zorubicina Hidrocloruro;
2-Clorodesoxiadenosina; 2' Desoxiformicina;
9-aminocamptotecina; raltitrexed; ácido
N-propargil-5,8-didesazafólico;
2cloro-2'-arabino-fluoro-2'-desoxiadenosina;
2-cloro-2'-desoxiadenosina;
anisomicina; tricostatina A; hPRL-G129R;
CEP-751; linomida; mostaza de azufre; mostaza de
nitrógeno (meclor-etamina); ciclofosfamida;
melfalán; clorambucil; ifosfamida; busulfán;
N-metil-N-nitrosourea
(MNU); N, N'-Bis
(2-cloroetil)-N-nitrosourea
(BCNU);
N-(2-cloroetil)-N'-ciclohexil-N-nitrosourea
(CCNU);
N-(2-cloroetil)-N'-(trans-4-metilciclohexil-N-nitrosourea
(MeCCNU);
N-(2-cloroetil)-N'-(dietil)etilfosfonato-N-nitrosourea
(fotemustina); estreptozotocina; diacarbazina (DTIC); mitozolomida;
temozolomida; tiotepa; mitomicina C; AZQ; adozelesina; Cisplatino;
Carboplatino; Ormaplatino; Oxaliplatino;C1-973; DWA
2114R; JM216; JM335; Bis(platino); tomudex; azacitidina;
citarabina; gemcitabina; 6-Mercaptopurina;
6-Tioguanina; Hipoxantina; teniposido
9-amino camptotecina; Topotecán;
CPT-11; Doxorrubicina; Daunomicina; Epirrubicina;
darrubicina; mitoxantrona; losoxantrona; Dactinomicina
(Actinomicina D); amsacrina; pirazolacridina; aftal
all-trans;
14-hidroxi-retro-retinol;
ácido all-trans retinoico;
N-(4-Hidroxifenil) retinamida; ácido
13-cis retinoico; 3-Metil TTNEB;
ácido 9-cis retinoico; fludarabina
(2-F-ara-AMP); o
2-clorodesoxiadenosina (2-Cda).
Otros compuestos
anti-neoplásticos adecuados incluyen
20-pi-1,25 dihidroxivitamina D3;
5-etiniluracil; abiraterona; aclarrubicina;
acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas
all-tirosinaquinasa; altretamina; ambamustina;
amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina;
anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la
angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína
morfogenética-1 anti-dorsalización;
antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplastón;
oligonucleótidos antisentido; afidicolin-glicinato;
moduladores de genes de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido
apurínico;
ara-CDP-DL-PTBA;
arginina-desaminasa; asulacrina; atamestano;
atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3;
azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III;
balanol; batimastat; antagonistas BCR/ABL; benzoclorinas;
benzoilestaurosporina; derivados de beta lactamas;
beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico;
inhibidor del factor de crecimiento de los fibroblastos básicos
(bFGF); bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida;
bistrateno A; bizelesina; breflato; bleomicina A2; bleomicina B2;
bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol;
calfostina C; derivados de camptotecina (v.g.,
10-hidroxi-camptotecina); pox
IL-2 de los canarios; capecitabina;
carboxamida-amino-triazol;
carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de
cartílago; carzelesina; inhibidores de
caseína-quinasa (ICOS); castanospermina; cecropin B;
cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost;
cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno;
clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4;
análogo de combretastatina; conagenina; crambescidin 816; crisnatol;
criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacin A;
ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipernicina; citarabina
ocfosfato; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina;
deshidrodidemnin B; 2'desoxicoformicina (DCF); deslorelina;
dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnina B;
didox; dietilnorspenina;
dihidro-5-azacitidina;
9-dihidrotaxol; dioxamicina; difenilespiromustina;
discodermolida; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno;
dronabinol; duocarmicina SA; ebselén; ecomustina; edelfosina;
edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirrubicina;
epotilonas (A, R = H; B, R = Me); epitilonas; epristerida; análogo
de estramustina; agonistas de estrógenos; antagonistas de
estrógenos; etanidazol; etoposido; etoposido
4'-fosfato (etopofós); exemestano; fadrozol;
fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol;
flezelastina; fluasterona; fludarabina; fluorodaunorubicina
hidrocloruro; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina;
gadolinio-texafirina; nitrato de galio;
galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina;
inhibidores de glutatión; hepsulfam; heregulina; hexametileno
bisacetamida; homoharringtonina (HHT); hipericina; ácido
ibandrónico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina;
ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes;
inhibidor del receptor del factor-1 del crecimiento
afín a la insulina; agonistas de interferón; interferones;
interleuquinas; iobenguano; yododoxorrubicina;
4-ipomeanol; irinotecán; iroplact; irsogladina;
isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplaquinolida;
kahalalida F; lamellarin-N triacetato; lanreotida;
leinamicina; lenograstim; lentinán sulfato; leptolstatina;
letrozol; factor inhibidor de la leucemia; interferón alfa de los
leucocitos; leuprolida + estrógeno + progesterona; leuprorelina;
levamisol; liarozol; análogo lineal de poliaminas; péptido
disacárido lipófilo; compuestos lipófilos de platino; lisoclinamida
7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona;
lovastatina; loxoribina; lurtotecán;
lutecio-texafirina; lisofilina; péptidos líticos;
maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina;
inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteasas de la
matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa;
metoclopramida; inhibidor MIF; ifepristona; miltefosina;
mirimostim; RNA bicatenario desapareado; mitracina; mitoguazona;
mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina, factor
de crecimiento de los fibroblastos saporina; mitoxantrona;
mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotrofina
coriónica humana; monofosforil-lípido A + pared de
las células miobacterianas sk; mopidamol; inhibidor del gen de
resistencia a multifármacos; terapia basada en el supresor 1
múltiple de tumores; agente mostaza anticáncer; micoperóxido B;
extracto de pared de células micobacterianas; miriaporona;
N-acetildinalina; benzamidas
N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona +
pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino;
nemorrubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida;
nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de
nitróxido; nitrulina; 06-bencilguanina; octreotida;
oquicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón;
oracina; inductor oral de citoquinas; ormaplatino; osaterona;
oxaliplatino; oxaunomicina; análogos de paclitaxel; paclitaxel;
palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol;
panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina;
pentosan-polisulfato de sodio; pentostatina;
pentrozol; perflubrón; perfosfamida; alcohol perillílico;
fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasas; picibanil;
pilocarpina hidrocloruro; pirarrubicina; piritrexim; placetin A;
placetin B; inhibidor del activador del plasminógeno; complejo de
platino; compuestos de platino; complejo
platino-triamina; podofilotoxina; porfímero sódico;
porfiromicina; propil bis-acridona; prostaglandina
J2; inhibidores de proteasomas; inmunomodulador basado en proteína
A; inhibidor C de proteína-quinasas, inhibidores C
de proteína-quinasas, microalgal; inhibidores de
proteína-tirosina-fosfatasas;
inhibidores de
purina-nucleosido-fosforilasas;
purpurinas; pirazolacridina; conjugado de
polioxietileno-hemoglobina piridoxilado;
antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de la
farnesil-proteína-transferasa ras;
inhibidores de ras; inhibidor ras-GAP; reteliptina
desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; RII
retinamida; rogletimida; rohituquina; romurtida; roquinimex;
rubiginona B 1; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol
A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado
de senescencia; oligonucleótidos sentido; inhibidores de la
transducción de señales; moduladores de la transducción de señales;
proteína monocatenaria de fijación de antígeno; sizofirán;
sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol;
proteína de fijación de somatomedina; sonermina; ácido esparfósico;
espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1;
escualamina; inhibidor de células madre; inhibidores de la división
de las células madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina;
sulfinosina; antagonista del péptido superactivo vasoactivo
intestinal; suradista; suramina; swainsonina; glucosaminoglucanos
sintéticos; talimustina; tamoxifeno metioduro; tauromustina;
tazaroteno; tecogalán sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de
telomerasas; temoporfina; temozolomido; teniposido;
tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; talidomida;
tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina;
timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinán;
hormona estimulante del tiroides;
etil-etiopurpurina de estaño; tirapazamina;
titanoceno dicloruro; topotecán; topsentina; toremifeno; factor de
células madre totipotentes; inhibidores de la traducción;
tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato;
triptorelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de
tirosinaquinasas; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor
inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas
de receptores de uroquinasa; vapreotida; variolina B; sistema
vector, eritrocitoterapia génica; velaresol; veramina; verdinas;
verteporfina; vinorrelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol;
zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y zinostatina estimalamer.
X puede ser también un agente antiproliferativo
como por ejemplo piritrexim-isotionato.
Alternativamente, X puede ser un agente
anti-hipertrofia prostática tal como, por ejemplo,
sitoglusida, un agente de terapia de la hiperplasia prostática
benigna tal como, por ejemplo,
tamsulosin-hidrocloruro, o un inhibidor del
crecimiento de la próstata tal como, por ejemplo, pentomona.
X puede ser también un agente radiactivo, que
incluye: Fibrinógeno ^{125}I; Fludesoxiglucosa ^{18}F;
Fluorodopa ^{18}F; Insulina ^{125}I; Insulina ^{131}I;
Iobenguano ^{123}I; Yodipamida Sódico ^{131}I; Yodoantipirina
^{131}I; Yodocolesterol ^{131}I; Yodohipurato Sódico ^{123}I;
Yodohipurato Sódico ^{125}I; Yodohipurato Sódico ^{131}I;
Yodopiracet ^{125}I; Yodopiracet ^{131}I; Iofetamina
Hidrocloruro ^{123}I; Iometina ^{121}I; Iometina ^{131}I;
Iotalamato Sódico ^{125}I; Iotalamato Sódico ^{131}I; tirosina
^{131}I; Liotironina ^{125}I; Liotironina ^{131}I; Merisoprol
Acetato ^{197}Hg; Merisoprol Acetato ^{203}Hg; Merisoprol
^{197}Hg; Selenometionina ^{75}Se; Tecnecio ^{99m}Tc Coloide
de Trisulfuro de Antimonio; Tecnecio ^{99m}Tc Bicisato; Tecnecio
^{99m}Tc Disofenina; Tecnecio ^{99m}Tc Etidronato; Tecnecio
^{99m}Tc Exametazima; Tecnecio ^{99m}Tc Furifosmina; Tecnecio
^{99m}Tc Gluceptato; Tecnecio ^{99m}Tc Lidofenina; Tecnecio
^{99m}Tc Metirofenina; Tecnecio ^{99m}Tc Medronato; Tecnecio
^{99m}Tc Medronato Disódico; Tecnecio ^{99m}Tc Mertiatida;
Tecnecio ^{99m}Tc Oxidronato; Tecnecio ^{99m}Tc Pentetato;
Tecnecio^{99m}Tc Pentetato de Calcio Trisódico; Tecnecio
^{99m}Tc Sestamibi; Tecnecio ^{99m}Tc Siboroxima; Tecnecio
^{99m}Tc; Succimer; Tecnecio ^{99m}Tc Azufre Coloidal; Tecnecio
^{99m}Tc Teboroxima; Tecnecio ^{99m}Tc Tetrofosmina; Tecnecio
^{99m}Tc Tiatida; Tiroxina ^{125}I; Tiroxina ^{131}I;
Tolpovidona ^{131}I; Trioleína ^{125}I; o Trioleína
^{131}I.
Los conjugados de la invención pueden
administrarse también con citoquinas tales como el factor
estimulante de colonias de granulocitos. Agentes anticáncer
preferidos utilizados en cócteles anti-cáncer (v.g.,
en combinación con los agentes de la invención) incluyen (algunos
con sus MTDs indicadas entre paréntesis): gemcitabina (1000
mg/m^{2}); metotrexato (15 g/m^{2} i.v. + leuco. < 500
mg/m^{2} i.v. sin leuco); 5-FU (500 mg/m^{2}/día
x 5 días); FUDR (100 mg/kg x 5 en ratones, 0,5 mg/kg/día en humanos
i.a.); FdUMP; Hidroxiurea (35 mg/kg/d en el hombre); Docetaxel
(60-100 mg/m^{2}); discodermolida; epotilonas;
vincristina (1,4 mg/m^{2}); vinblastina (escalación:
3,3-11,1mg/m^{2}, o en raras ocasiones hasta 18,5
mg/m^{2}); vinorrelbina (30 mg/m^{2}/semana);
meta-pac; irinotecán (50-150
mg/m^{2},1 x/semana dependiendo de la respuesta del paciente);
SN-38 (-100 veces más potente que Irinotecán);
10-OH campto; topotecán (1,5 mg/m^{2}/día en
humanos, 1 x iv Ld1Oratones (sic) =75 mg/m^{2}); etoposido (100
mg/m^{2} en el hombre); adriamicina; flavopiridol;
Cis-Pt (100mg/m^{2} en el hombre);
carbo-Pt (360 mg/m^{2} en el hombre); bleomicina
(20 mg/m^{2}); mitomicina C (20 mg/m^{2}); mitramicina (30 sug
(sic)/kg); capecitabina (2,5 g/m^{2} vía oral); citarabina (100
mg/m^{2}/día); 2=Cl-2'desoxiadenosina;
Fludarabina-P04 (25 mg/m^{2}/día x 5 días);
mitoxantrona (12-14 mg/m^{2}); mitozolomida (>
400 mg/m^{2}); Pentostatina; y Tomudex.
X puede ser preferiblemente un agente
antimetabólico, tal como metotrexato. Los antimetabolitos incluyen
los compuestos siguientes: azatioprina, cladribina, citarabina,
dacarbazina, fludarabina fosfato, fluorouracil, gencitabina
clorhidrato, mercaptopurina, metotrexato, mitobronitol, mitotano,
proguanil clorhidrato, pirimetamina, raltitrexed, trimetrexato
glucuronato, uretano, vinblastina sulfato, vincristina sulfato. More
preferiblemente, X puede ser un antimetabolito del tipo del ácido
fólico, una clase de agentes que incluye, por ejemplo, metotrexato,
proguanil clorhidrato, pirimetamina, trimetoprima, o trimetrexato
glucuronato.
En otra realización, X puede ser también un
miembro de la familia de agentes antineoplásticos de la
antraciclina, con inclusión de aclarrubicina clorhidrato,
daunorrubicina clorhidrato, doxorrubicina clorhidrato, epirrubicina
clorhidrato, idarrubicina clorhidrato, pirarrubicina, o zorrubicina
clorhidrato. Adicionalmente, X puede ser una camptotecina, o
compuestos afines tales como
10,11-metilenodioxicamptotecina. X puede
seleccionarse también de la familia de compuestos maitansinoide,
que incluyen una diversidad de compuesto estructuralmente afines.
Por ejemplo, son maitansinoide ansamitocina P3, maitansina,
2'-N-desmetilmaitanbutina, o
maitanbiciclinol.
Y es una secuencia espaciadora hidrófila que
puede ser, preferiblemente, un péptido que aumenta la
biodistribución del conjugado, o un polímero hidrófilo. Por
ejemplo, Y puede ser una secuencia peptídica que aumenta la
biodistribución hidrófila del conjugado del péptido biológicamente
activo. En una realización preferida, Y tiene la fórmula
U(V-V)_{n}, donde U es
D-Pro, L-Pro,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
Sarcosina, Lys, Orn, Dab, Dap,
4-NH_{2}-Phe, o
(NH_{2}-(CH_{2})_{m}-COOH), donde m =
2-10, inclusive, o está suprimido; cada V se
selecciona independientemente del grupo constituido por:
D-Ser, L-Ser, D-Thr,
L-Thr, D-Gln, L-Gln,
D-Asn, L-Asn,
D-4-OH-Pro, o
L-4 hidroxi-Pro; y
n=1-50, inclusive. En otra realización preferida,
cada V es independientemente D-Ser o
L-Ser. En otra realización preferida, al menos un V
es un D-aminoácido.
Con arreglo a la doctrina de esta memoria, Y
puede seleccionarse para facilitar la biodistribución de un
conjugado de la invención. Y puede ser un péptido o un polímero tal
como PEG o PVA. Si Y es un péptido hidrófilo, Y puede tener
preferiblemente 1 a 50 aminoácidos de longitud, o más
preferiblemente 3 a 15 residuos de longitud. Por ejemplo Y puede
tener una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19 ó 20 residuos de aminoácidos. Cuando se trata de un
péptido, Y puede contener aminoácidos cargados o no polares, sus
análogos o derivados existentes naturalmente, sintéticos o
modificados.
Y puede ser también un polímero hidrófilo. Por
ejemplo, Y puede ser polietilenglicol (PEG), poli(acetato de
vinilo), poli(alcohol vinílico) (PVA),
N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida
(HPMA) o copolímeros de HPMA,
\alpha,\beta-poli(N-hidroxietil)-DL-aspartamida
(PHEA), o
\alpha,\beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida.
Se sabe también que los grupos PEG, PHEA, y PVA utilizados en los
conjugados de la invención son promotores excelentes de la secreción
renal rápida que está correlacionada generalmente con menores
toxicidades potenciales de los fármacos (véase, v.g., Yamoaka et
al., J. Pharmacol. Sci., 83: 601-606, 1994;
Rypacek et al., Pflugers Arch., 392:211-217,
1982; Yamoaka et al., J. Pharm. Pharmacol.,
47:479-486, 1995). Estos grupos pueden promover
también una toxicidad reducida proveniente de conjugados
biodisponibles, no internalizados.
Z es un péptido enlazador que preserva al menos
el 50% de la actividad biológica de Q, cuando Z está unido a Q a
través del grupo amino terminal o de la cadena lateral de Q.
generalmente, Z puede ser un péptido de 2, 3, 4, ó 5 residuos. Z
tiene la fórmula:
A-B-C-E-F,
donde A es D-Lys, D-Tyr,
D-Ser, o L-Ser, o deleted; B es
D-Lys o D-Tyr, o es deleted; C es
Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2,3, o 4)
3-pyridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap,
4-NH_{2}-Phe,
D-4-OH-Pro, o
L-4-OH-Pro, o es
deleted; E es D-Lys, D-Tyr,
D-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diido-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn, D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o L-Gln; y F es
D-Lys, D-Tyr, D-Ser,
L-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diido-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn, D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o L-GIn; provided that cuando
A, B, C, y E are Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectively, F no es Lys;
y cuando A, B, C, y E, son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectively, F no
es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y
Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys.
En otras realizaciones, Z tiene la fórmula (en
la que A, B, y C están suprimidos):
E-F
donde E es D-Lys;
D-Tyr, D-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diyodo-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn, D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o L-Gln; and F es
D-Lys, D-Tyr, D-Ser,
L-Ser,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
3-yodo-D-Tyr,
3-5 diyodo-D-Tyr,
3-astatina-D-Tyr,
3-5 astatina-D-Tyr,
3-bromo-D-Tyr,
3-5 dibromo-D-Tyr,
D-Asn, L-Asn D-Asp,
L-Asp, D-Glu, L-Glu,
D-Gln, o
L-Gln.
En realizaciones preferidas, Z es
D-Ser-Nle-D-Ser=D-Ser
(SEQ ID NO: 1),
D-Ser-Lys-D-Ser-D-Ser
(SEQ ID NO: 2),
D-Ser-Lys-D-Tyr
D-Tyr (SEQ ID NO: 3),
D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 4),
D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser
(SEQ ID NO: 5),
D-Ssr-Ser-D-Lys-Ser
(SEQ ID NO: 5),
D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 6),
D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 7),
D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser(SEQ
ID NO: 8),
Lys-D-Ser-D-Ser
(SEQ ID NO: 9),
Ser-D-Lys-D-Ser
(SEQ ID NO: 10),
Ser-D-Lys-Ser(SEQ
ID NO: 10),
Nle-D-Tyr-D-Ser
(SBQ ID NO: 11)_{;}
Lys-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 12),
Pal-D-Lys-D-Ser(SEQ
ID NO: 13),
Thr-D-Tyr-D-Ser
(SEQ ID NO: 14),
D-Ser-D-Lys,
D-Ser-D-Tyr,
D-Lys-D-Lys,
D-Lys-D-Tyr, o
D-Tyr-D-Lys.
Q es un resto de direccionamiento, tal como un
péptido biológicamente activo. Ligandos de proteínas, polipéptidos
o péptidos no inmunorreactivos que pueden utilizarse para formar los
conjugados de esta invención incluyen transferrina, factores de
crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido
liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de las
plaquetas, IL-2, IL-6, factores de
crecimiento tumoral ("TGF"), tales como
TGF-\alpha y TGF-\beta, factor
de crecimiento de vaccinia ("VGF"), factores de crecimiento de
insulina y semejantes a insulina I y II. Ligandos no peptídicos
pueden incluir, por ejemplo, esteroides, carbohidratos, vitaminas,
y lectinas.
En realizaciones preferidas, Q es un péptido,
tal como somatostatina, bombesina, o un anticuerpo, tal como un
anticuerpo monoclonal. Restos peptídicos o de direccionamiento
biológicamente activos preferidos están internalizados por células
seleccionadas por la vía de un proceso de internalización activo,
tal como en el caso en que se fijan receptores acoplados a una
proteína G o receptores de somatostatina tipo 2 (SSTR2).
Los conjugados de la invención inhiben la
acumulación de péptidos tóxicos en tejidos por la inclusión del
grupo Z (o péptido enlazador (es decir, extensión peptídica
terminal)), que contienen residuos hidrófilos, e inclusión opcional
de una secuencia espaciadora hidrófila. Estos componentes promueven
una inhibición rápida de péptidos intactos, no combinados, a través
de los riñones.
Los conjugados de la invención están diseñados
para preservar la potencia biológica total de los péptidos
biológicamente activos cuando se conjugan con un agente citotóxico.
Un análogo peptídico de la invención tiene una potencia biológica
que es preferiblemente mayor que o igual al análogo peptídico
originario del que se deriva, con una especificidad que es mayor,
menor, o equivalente a la especificidad de diana del péptido
parental. Por ejemplo, un análogo de somatostatina puede fijarse a
más subtipos de receptores de somatostatina que la somatostatina
existente naturalmente, o puede fijarse a un subtipo de receptor
particular. Algunos análogos de la invención contienen
D-isómeros de aminoácidos, o análogos de los mismos,
que facilitan el acoplamiento estable de los agentes citotóxicos al
tiempo que retienen alta afinidad de fijación y potencia biológica
del análogo peptídico.
Los conjugados citotóxicos de la invención
pueden emplear cualquiera del gran número de análogos de
somatostatina conocidos que reconocen el receptor somatostatina,
tales como los arriba descritos. Preferiblemente, la porción
análoga de somatostatina del conjugado contiene entre 10 y 18
aminoácidos, e incluye la secuencia de núcleo:
ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]
(SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38). Preferiblemente, el término C del
análogo es: Thr-NH_{2}. Los análogos de
bombesina, como se describe en esta memoria, pueden conjugarse
también con agentes citotóxicos en los agentes peptídicos de la
invención.
El direccionamiento específico de los agentes
citotóxicos permite la destrucción selectiva de un tumor que
expresa un receptor específico para un péptido biológicamente
activo. Por ejemplo, un tumor que expresa un receptor de
somatostatina incluye un neoplasma del pulmón, mama, próstata,
colon, cerebro, tracto gastrointestinal, eje neuroendocrino,
hígado, riñón kidney (see, Schaer et al., Int. J. Cancer,
70:530-537,1997, Chave et al; Br. J. Cancer
82(1):124-130,2000; Evans et al., Br.
J. Cancer 75(6):798-803,1997).
Péptidos para uso en conjugados de la invención
incluyen péptidos KiSS y análogos, péptidos de urotensina II y
análogos, péptidos GnRH I y II y análogos, octreotido, depreotido,
vapreotido, péptido vasoactivo intestinal (VIP), colecistoquinina
(CCK), factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), péptidos
que contienen RGD, hormona estimulante de los melanocitos (MSH)
peptide, neurotensin, calcitonin, peptides from complementarity
determining regions of an antitumor antibody, glutathione, YIGSR.
(leukocybe-avid peptides, e.g., P483H, which
contains the heparin-binding region of platelet
factor-4 (PF-4) and a
lysina-rich sequence), atrial natriuretic peptide
(ANP), \beta-amyloid peptides,
delta-opioid antagonists (such as
ITIPP(psi)), annexin-V, endotholin,
IL-1, IL-1ra, IL-2,
IL-8, leukotriene B4 (LTB4), chemotactic peptides
(e.g.,
N-formil-methionil-leucil-fenilalanina-lysina
(fMLFK)), GP Iib/IIIa receptor antagonists (e.g., DMP444),
epidermal growth factor, human neutrophil elastase inhibitor
(EPI-HNE-2 and
EPI-HNE-4), plasmin inhibitor,
antimicrobial peptides, apticide (P280 and P274), thrombospondin
receptor (including analogs such as TP-1300),
bitistatin, pituitary adenylyl cyclase type I receptor (PAC1),
cadena \alpha de fibrina, péptidos derivados de bibliotecas de
presentación de fago, y sustituciones conservadoras de los mismos,
que están direccionadas a una célula o tejido en el cuerpo de un
mamífero (v.g., tejido enfermo, tal como un tumor o un vaso
sanguíneo angiogénico proliferativo; véanse, v.g. los descritos por
Aina et al., Biopolymers 66: 184-199, 2002, y
derivados y análogos de los mismos. Véase, v.g. Signore et
al., Eur. J. Nucl. Med. 28 (10): 1555-65,
2001.
\newpage
Los análogos peptídicos de somatostatina
citotóxicos pueden ser también específicos para vasculaturas de
tumores, o vasos sanguíneos angiogénicos, tales como aquéllos que
sobre-expresan receptores de somatostatina (see
Denzler and Reubi, Cancer 85:188-198, 1999; Gulec
et al., J. Surg. Res. 97(2):131-137,
2001; Woltering et al., J. Surg. Res. 50:245, 1991).
Adicionalmente, dado que los análogos de somatostatina preferidos de
la invención son diversamente hidrófilos, los mismos son solubles
en agua y, por tanto, tienen uso intensificado en comparación con
los análogos hidrófobos previos. Los análogos hidrófilos descritos
en esta memoria son solubles en sangre, fluido cerebroespinal, y
otros fluidos corporales, así como en orina, lo que facilita la
excreción por los riñones. Este carácter hidrófilo facilita el
suministro de los análogos de la invención a prácticamente cualquier
área del cuerpo. La invención describe también elementos
específicos hidrófilos para incorporación en análogos peptídicos,
permitiendo la modulación del carácter hidrófilo del análogo para
ajustarse a la naturaleza química y estructural de los diversos
agentes citotóxicos conjugados.
Los análogos agonistas de somatostatina se
internalizan rápidamente después de fijación a sus receptores
(véase, v.g., Lukinius et al., Acta Onc., 38:
383-387, 1999) y pueden utilizarse por tanto como
vectores para direccionamiento de diversos agentes terapéuticos
-tales como agentes citotóxicos tumorales tradicionales. Es posible
que la especificidad de tales agentes
anti-tumorales pueden mejorarse drásticamente, dado
que muchos tipos de tumor sobre-expresan
fuertemente receptores de somatostatina tipo 2. De esta manera, los
autores de la invención proponen que los efectos tóxicos
secundarios asociados con todos los agentes citotóxicos conjugables
pueden reducirse útilmente con tal que pueda diseñarse una molécula
híbrida potente que retenga afinidad muy alta para receptores de
somatostatina.
Los ligandos inmunorreactivos para uso como
resto de direccionamiento en la invención incluyen una
inmunoglobulina de reconocimiento de antígeno (a la que se hace
referencia también como "anticuerpo"), o fragmento de
reconocimiento de antígeno de la misma. Inmunoglobulinas
particularmente preferidas son aquéllas que reconocen un antígeno
asociado a un tumor. Como se utiliza en esta memoria,
"inmunoglobulina" se refiere a cualquier clase o subclase
reconocida de inmunoglobulinas tales como IgG, IgA, IgM, IdD, o IgE.
Se prefieren aquellas inumunoglobulinas que caen dentro de la clase
de inmunoglobulinas IgG. La inmunoglobulina puede derivarse de
cualquier especie. Preferiblemente, sin embargo, la inmunoglobulina
es de origen humano, murino, o de conejo. Adicionalmente, la
inmunoglobulina puede ser policlonal o monoclonal, pero
preferiblemente es monoclonal.
Los conjugados de la invención pueden incluir un
fragmento de reconocimiento de antígeno de inmunoglobulina. Tales
fragmentos de inmunoglobulina pueden incluir, por ejemplo, los
fragmentos Fab', F(ab')_{2}, F_{v} o Fab, u otros
fragmentos de reconocimiento de antígeno de inmunoglobulina. Tales
fragmentos de inmunoglobulina pueden prepararse, por ejemplo, por
digestión con enzimas proteolíticas, por ejemplo, por escisión con
pepsina o papaína, alquilación reductora, o técnicas recombinantes.
Los materiales y métodos para la preparación de tales fragmentos de
inmunoglobulina son bien conocidos por los expertos en la técnica.
See Parham, J. Immunology, 131, 2895, 1983; Lamoyi et al.,
J. Immunological Methods, 56, 235, 1983.
La inmunoglobulina utilizada en los conjugados
de la invención puede ser un "anticuerpo quimérico" tal como
se reconoce dicho término en la técnica. Asimismo, la
inmunoglobulina puede ser un anticuerpo "bifuncional" o
"híbrido", es decir, un anticuerpo que puede tener una rama que
tenga especificidad para un sitio antigénico, tal como un antígeno
asociado a un tumor, mientras que la otra rama reconoce una diana
diferente, por ejemplo, un hapteno que es, o que está unido a, un
agente letal para la célula tumoral que lleva el antígeno.
Alternativamente, el anticuerpo bifuncional puede ser uno en el
cual cada rama tiene especificidad para un epítope diferente de un
antígeno asociado a un tumor de la célula a modificar terapéutica o
biológicamente. Los anticuerpos híbridos tienen por tanto una
especificidad dual, preferiblemente con uno o más sitios de fijación
específicos para el hapteno de elección o uno o más sitios de
fijación específicos para un antígeno diana, por ejemplo, un
antígeno asociado con un tumor, un organismo infeccioso, u otro
estado de enfermedad.
Antígenos biológicos bifuncionales se describen,
por ejemplo, en la Publicación de patente Europea, EPA 0105360.
Tales anticuerpos híbridos o bifuncionales pueden derivarse
biológicamente, por técnicas de fusión de células, o químicamente,
por ejemplo con agentes de reticulación o reactivos formadores de
puentes disulfuro, y pueden estar constituidos por anticuerpos
completos y/o fragmentos de los mismos. Métodos para obtención de
tales anticuerpos híbridos se describen, por ejemplo, en la
solicitud PCT WO 83/03679, publicada el 27 de octubre de 1983, y en
la Solicitud de Patente Europea publicada EPA 0217577, publicada el
8 de abril de 1987. Anticuerpos bifuncionales particularmente
preferidos son los preparados biológicamente a partir de un
"polidoma" o "quadroma" o que se preparan sintéticamente
con agentes de reticulación tales como
bis-(maleimido)-metil-éter ("BMME"), o con
otros agentes de reticulación familiares para los expertos en la
técnica.
Adicionalmente, la inmunoglobulina puede ser un
anticuerpo monocatenario ("SCA"). Un SCA puede estar
constituido por fragmentos F_{v} monocatenarios ("scFv") en
los cuales los dominios variables ligeros ("V_{L}") y los
dominios variables pesados ("V_{H}") están enlazados por un
puente peptídico o por enlaces disulfuro. Asimismo, la
inmunoglobulina puede estar constituida por dominios V_{H} (dAbs)
que poseen actividad de fijación de antígeno. See G. Winter and C.
Milstein, Nature 349:295,1991; R. Glockshuber et al.,
Biochemistry 29:1362,1990; and, E. S. Ward et al., Nature
341:544, 1989.
Especialmente preferidos para uso en la presente
invención son anticuerpos monoclonales quiméricos; preferiblemente
aquellos anticuerpos quiméricos que tienen especificidad para un
antígeno asociado a un tumor. Como se utiliza en esta memoria, el
término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo
monoclonal que comprende una región variable, es decir una región
de fijación, procedente de una fuente o especie, y al menos una
porción de una región constante derivada de una fuente o especie
diferente, preparado usualmente por técnicas de DNA recombinante.
Los anticuerpos quiméricos que tienen una región variable de murino
y una región constante humana son especialmente preferidos en
ciertas aplicaciones de la invención, particularmente terapia
humana, debido a que dichos anticuerpos se preparan fácilmente y
pueden ser menos inmunógenos que los anticuerpos monoclonales
exclusivamente murinos. Tales anticuerpos quiméricos murino/humano
son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que
comprenden segmentos de DNA, que codifican regiones variables de
inmunoglobulina de murino y segmentos de DNA que codifican regiones
constantes de inmunoglobulina humana. Otras formas de anticuerpos
quiméricos para uso en conjugados de la invención son aquéllos en
los cuales la clase o subclase se ha modificado o cambiado respecto
a la del anticuerpo original. A tales anticuerpos "quiméricos"
se hace referencia también como "anticuerpos conmutados de
clase". Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican
métodos convencionales de DNA recombinante y de transfección de
genes, bien conocids actualmente en la técnica. Véase Morrison,
S.L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 81: 6851, 1984.
El término "anticuerpo quimérico" incluye
también un "anticuerpo humanizado", es decir, aquellos
anticuerpos en los cuales el marco o las "regiones determinantes
de la complementariedad" ("CDR") se han modificado para
incluir la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente, en
comparación con la de la inmunoglobulina parental. En una
realización preferida, una CDR murina se injerta en la región de
marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo
humanizado". Véase, v.g., L. Riechmann et al., Nature
332:323, 1988; M. S. Neuberger et al., Nature 314:268, 1985.
Las CDRs particularmente preferidas corresponden a aquéllas que
representan secuencias que reconocen los antígenos arriba indicados
para los anticuerpos quiméricos y bifuncionales. Véase, v.g., EPA
0239400 (publicada el 30 de septiembre de 1987).
Un experto en la técnica reconocerá que puede
prepararse un anticuerpo bifuncional-quimérico que
podría tener los beneficios de menor inmunogenicidad del anticuerpo
quimérico o humanizado, así como la flexibilidad, especialmente
para tratamiento terapéutico, de los anticuerpos bifuncionales
arriba descritos. Tales anticuerpos
bifuncionales-quiméricos pueden sintetizarse, por
ejemplo, por síntesis química utilizando agentes de reticulación y/o
métodos recombinantes del tipo arriba descrito.
Los conjugados de la invención pueden incluir
también inmunoglobulinas (como se definen anteriormente) o
fragmentos de inmunoglobulina a los cuales están fusionadas
proteínas activas, por ejemplo, una enzima del tipo descrito en
Neuberger, et al., solicitud PCT WO 86/01533, publicada el 13
de marzo de 1986.
Como se utiliza en esta memoria, construcciones
de anticuerpos "bifuncionales", "fusionadas",
"quiméricas" (con inclusión de humanizadas), y "
bifuncionales quiméricas " (con inclusión de humanizadas)
incluyen también, dentro de sus contextos individuales,
construcciones que incluyen fragmentos de reconocimiento de
antígeno. Como reconocerá un experto en la técnica, tales
fragmentos pueden prepararse por escisión enzimática tradicional de
anticuerpos intactos bifuncionales, quiméricos, humanizados, o
bifuncionales quiméricos. En el caso de que los anticuerpos
intactos no sean susceptibles de dicha escisión, v.g., debido a la
naturaleza de la construcción implicada, las construcciones
indicadas pueden prepararse con productos de inmunoglobulina
utilizados como materiales de partida; o, si se utilizan técnicas
recombinantes, las secuencias de DNA propiamente dichas pueden
adaptarse para codificar el "fragmento" deseado que, una vez
expresado, puede combinarse in vivo o in vitro, por
medios químicos o biológicos, a fin de preparar el "fragmento"
de inmunoglobulina intacto deseado final. Es en este contexto en el
que se utiliza el término "fragmento" en esta memoria.
La inmunoglobulina (anticuerpo) o fragmento de
la misma, utilizada en los conjugados de la presente invención
puede ser de naturaleza policlonal o monoclonal. Los anticuerpos
monoclonales son las inmunoglobulinas preferidas. La preparación de
anticuerpos policlonales o monoclonales es bien conocida por los
expertos en la técnica (véase, v.g., G. Kohler y C. Milstein,
Nature 256: 495, 1975. Por otra parte, están públicamente
disponibles hibridomas y/o anticuerpos monoclonales que son
conocidos por dichos hibridomas y que son útiles en la práctica de
la presente invención.
En una realización adicional, la invención
caracteriza el uso de un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1-23 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de las enfermedades siguientes:
enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide,
acromegalia, tuberculosis, un tumor de pulmón, mama, cerebro, ojo,
próstata o colon; un tumor de origen neuroendocrino; y angiogénesis
que causa proliferación inadecuada de vasos sanguíneos. Este
medicamento está destinado a ser administrado a un animal de sangre
caliente que se encuentra en necesidad del mismo, y contiene una
cantidad terapéuticamente eficaz o modificadora de una función
biológica de un conjugado de la invención. Una persona con
experiencia en la técnica reconocerá que el conjugado particular
utilizado dependerá del estado de enfermedad a tratar o del sistema
biológico a modificar. En particular, un experto en la técnica
podrá seleccionar un resto de direccionamiento y un agente
citotóxico particulares para preparar un conjugado de la invención
que tiene especificidad para el tratamiento de la enfermedad o es
capaz de modificar la función biológica deseada. Se contempla que
varias enfermedades pueden tratarse utilizando los conjugados de la
invención, con inclusión, por ejemplo, de tumores de pulmón, mama,
cerebro, ojo; próstata o colon; tumores de origen neuroendocrino
(v.g., síndrome carcinoideo); y vasos sanguíneos angiogénicos
proliferativos (en, v.g., el ojo), tales como los asociados con
tumores, degeneración retinal macular, o retinopatía diabética.
Los conjugados de la invención pueden
administrarse a un animal mamífero, tal como un humano, directamente
o en combinación con cualquier portador o sal farmacéuticamente
aceptable conocido en la técnica. Sales farmacéuticamente
aceptables pueden incluir sales de adición de ácido no tóxicas o
complejos metálicos que se utilizan comúnmente en la industria
farmacéutica. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen ácidos
orgánicos tales como los ácidos acético, láctico, pamoico, maleico,
cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico,
subérico, salicílico, tartárico, metanosulfónico, toluenosulfónico,
o trifluoroacético, ácidos polímeros tales como ácido tánico,
carboximetil-celulosa; y ácidos inorgánicos tales
como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido
fosfórico. Los complejos metálicos incluyen cinc y hierro. Un
portador farmacéuticamente aceptable ilustrativo es solución salina
fisiológica. Otros portadores fisiológicamente aceptables y sus
formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica y se
describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences,
(18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company,
Easton, PA.
Las formulaciones farmacéuticas de una cantidad
terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, pueden administrarse por vía
oral, parenteral (v.g., intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea, o inyección ocular, inhalación,
intradérmica, gotas ópticas o implante), nasal, vaginal, rectal,
sublingual o tópica, en mezcla con un portador farmacéuticamente
aceptable adaptado para la ruta de administración.
Métodos bien conocidos en la técnica para la
producción de formulaciones se encuentran, por ejemplo, en
Remington's Pharmaceutical Sciences (edición 18ª), ed. A. Gennaro,
1990, Mack Publishing Company, Easton, PA. Composiciones propuestas
para uso oral pueden prepararse en forma sólida o líquida de acuerdo
con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de
composiciones farmacéuticas. Las composiciones pueden contener
opcionalmente agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes,
perfumantes, y/o conservantes a fin de proporcionar una preparación
más agradable al paladar. Las formas de dosificación sólidas para
administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos,
y gránulos. En tales formas sólidas, el compuesto activo está
mezclado con al menos un portador o excipiente inerte
farmacéuticamente aceptable. Éstos pueden incluir, por ejemplo,
diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de
sodio, lactosa, sacarosa, almidón, fosfato de calcio, fosfato de
sodio, o caolín. Pueden utilizarse también agentes aglomerantes,
agentes tampón, y/o agentes lubricantes (v.g., estearato de
magnesio). Las tabletas y píldoras pueden prepararse adicionalmente
con recubrimientos entéricos.
Las formas de dosificación líquidas para
administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones,
jarabes, y cápsulas de gelatina dura farmacéuticamente aceptables.
Estas formas contienen diluyentes inertes utilizados comúnmente en
la técnica, tales como agua o un medio aceitoso. Además de tales
diluyentes inertes, las composiciones pueden incluir también
adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes,
y agentes de suspensión.
Las formulaciones para administración parenteral
incluyen soluciones, suspensiones, o emulsiones estériles, acuosas
o no acuosas. Ejemplos de vehículos adecuados incluyen
propilenglicol, poli(etilenglicol), aceites vegetales,
gelatina, naftalenos hidrogenados, y ésteres orgánicos inyectables,
tales como oleato de etilo. Tales formulaciones pueden contener
también adyuvantes, tales como agentes conservantes, humectantes,
emulsionantes y dispersantes. Pueden utilizarse polímeros de
lactida, copolímero lactida/glicolida, o copolímeros
polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y
biodegradables a fin de controlar la liberación de los compuestos.
Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles para
los polipéptidos de la invención incluyen partículas de copolímeros
etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas,
sistemas de infusión implantables, y liposomas.
Las formulaciones líquidas pueden esterilizarse,
por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de
bacterias, por incorporación de agentes esterilizantes en las
composiciones, o por irradiación o calentamiento de las
composiciones. Alternativamente, las formulaciones pueden fabricarse
también en forma de composiciones estériles sólidas que pueden
disolverse en agua estéril u otro medio inyectable estéril
inmediatamente antes de su utilización.
Las composiciones para administración rectal o
vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener,
además de las sustancias activas, excipientes tales como manteca de
cacao o una cera de supositorios. Las composiciones para
administración nasal o sublingual se preparan también con
excipientes estándar conocidos en la técnica. Las formulaciones
para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o
pueden ser soluciones acuosas que contengan, por ejemplo,
polioxietilen-9-lauril-éter,
glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones aceitosas para
administración en la forma de gotas nasales o pulverización, o en
forma de un gel.
La cantidad de ingrediente activo en las
composiciones de la invención puede variar. Un experto en la técnica
apreciará que las dosis individuales exactas pueden ajustarse más o
menos dependiendo de una diversidad de factores, que incluyen el
polipéptido a administrar, el tiempo de administración, la ruta de
administración, la naturaleza de la formulación, la tasa de
excreción, la naturaleza de las condiciones del individuo, y la
edad, peso, salud, y sexo del paciente. Adicionalmente, la gravedad
de la condición direccionada por el péptido biológicamente activo
tal como somatostatina o bombesina tendrá también impacto sobre el
nivel de dosificación. Por lo general, se administran diariamente
niveles de dosificación comprendidos entre 0,1 \mug/kg y 100
mg/kg de peso corporal como una dosis simple o divididos en dosis
múltiples. Preferiblemente, el intervalo general de dosificación
está comprendido entre 250 \mug/kg y 5,0 mg/kg de peso corporal
por día. Pueden esperarse amplias variaciones en la dosis necesaria
teniendo en cuenta las diferentes eficiencias de las diversas rutas
de administración. Por ejemplo, sería de esperar que la
administración oral requiera por regla general niveles de
dosificación mayores que la administración por inyección
intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación
pueden ajustarse utilizando rutinas empíricas estándar para
optimización, que son bien conocidas en la técnica. En general, la
dosificación precisa terapéuticamente eficaz será determinada por
el médico que tenga a su cargo el tratamiento teniendo en cuenta los
factores arriba identificados.
Los conjugados de la invención pueden
administrarse en una composición de liberación sostenida, tal como
las descritas, por ejemplo, en U.S.P.N. 5.672.659 y U.S.P.N.
5.595.760. El uso de composiciones de liberación inmediata o
sostenida depende del tipo de afección a tratar. Si la afección
consiste en un trastorno agudo o superagudo, se preferirá un
tratamiento con una forma de liberación inmediata a una composición
de liberación prolongada. Alternativamente, para tratamientos
preventivos o a largo plazo, se preferirá generalmente una
composición de liberación sostenida.
Los polipéptidos utilizados en la presente
invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Los
polipéptidos pueden aislarse de fuentes existentes naturales,
producirse por medios recombinantes, o producirse por síntesis, o
producirse por una combinación de estos métodos. La síntesis de
péptidos cortos es bien conocida en la técnica. Véase, v.g. Stewart
et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co.,
2ª edición, 1984). Los péptidos de la presente invención pueden
sintetizarse de acuerdo con métodos estándar de síntesis de péptidos
conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Captotecina (250 mg) y
4-dimetilaminopiridina (DMAP; 50 mg) se suspendieron
en 3 ml de piridina anhidra y 50 ml de cloruro de metileno anhidro.
Se añadió fosgeno (750 \mul de una solución al 20% en tolueno) al
lodo y se mezcló durante 2 h a la temperatura ambiente. Se
evaporaron el exceso de fosgeno y cloruro de metileno en una
vitrina química de humos y el cloroformiato de camptotecina se
disolvió en DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió amida de Rink
MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina],
mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al
recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático
CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida
(DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se
añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF (2 min). La
resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en
exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la
eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la
desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación
el primer aminoácido protegido, Fmoc-Thr (tBut)
(0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo
los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-t-butil-L-treonina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-L-lisina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano,
Fmoc-L-fenilalanina,
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
Fmoc-O-t-butil-D-
tyrosine,
N^{\alpha}-Fmoc-norleucina,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido
bromoacético a la resina peptídica (3 eq), se añadió
N-Boc-etilenodiamina en
N-metil-\alpha-pirrolidinona
(NMP) y se mezcló (2 h), después de lo cual se lavó 3 veces con DMF
y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del
Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con
cantidades copiosas de DMF seguido por metanol. Después de una
filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante
una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 2 (0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo
redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido
trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%),
1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%).
La suspensión se agitó (2 h) y se filtró y lavó varias veces con
TFA. El TFA se evaporó a vacío y se añadió éter al aceite
resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en
ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una solución
concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica hasta que se
formó una coloración parda permanente, después de lo cual se eliminó
el exceso de yodo por adición de una pequeña cantidad de ácido
ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de
aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido de camptotecina bruto se
purificó por cromatografía líquida a alta presión en fase inversa
preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250
mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución en gradiente lineal a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A consistía en TFA al 0,1% y el
tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a B
50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280 nm.
Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas por
HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con desorción láser asistida por matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió paclitaxel (0,6 mmol) en 30 ml de
DCM anhidro en un matraz de fondo redondo (RB) de 100 ml. Se añadió
a esta solución diisopropiletilamina (DIEA; 3 mmol) disuelta en 20
ml de DCM anhidro, durante 20 minutos a 0ºC en atmósfera de
nitrógeno seco. Se añadió fosgeno (3 mmol) al lodo y se mezcló
durante 30 minutos a 0ºC y 2 horas a la temperatura ambiente. Se
evaporaron el exceso de fosgeno y cloruro de metileno, y el
cloroformiato de paclitaxel se disolvió en cloruro de metileno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió resina de
FMOC-Amino-Xanten-MBHA
(hidrocloruro de
4-metilbenzhidrilamina)-poliestireno
(0,063 mmol) [Bachem, catálogo #D-2040, lote
#0541173] a la vasija de reacción de un sintetizador automático de
péptidos CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF
durante aproximadamente 1 hora. La resina se filtró y se añadió un
exceso de piperidina al 20% en DMF y se mezcló durante 2 minutos. La
resina se filtró y se añadió una vez más una cantidad en exceso de
piperidina al 20%, que se mezcló durante 20 minutos para asegurar
la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la
desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación
el primer aminoácido protegido, Fmoc-Thr (tritilo)
(0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina
que se mezcló (1 h), seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo
los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-trityl-L-treonina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}mtt-L-lisina,
N^{\alpha}-Fmoc-D-triptófano,
Fmoc-L-fenilalanina,
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-trityl-D-serina,
Fmoc-O-trityl-D-tirosina,
N^{\alpha}-Fmoc-norleucina,
Fmoc-O-trityl-D-serina,
ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento de ácido
bromoacético a la resina peptídica, se añadió etanolamina (3 eq) en
NMP y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces
con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de paclitaxel del
Ejemplo 4 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con
cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una
filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una
noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina paclitaxel-péptido
preparada en el Ejemplo 5 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al
que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético
(2%) en cloruro de metileno. La suspensión se agitó (2 h), se
filtró, y se lavó varias veces con cloruro de metileno. El cloruro
de metileno se evaporó a vacío y se añadió éter al aceite
resultante para dar un polvo blanco que se disolvió luego en ácido
acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una solución
concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica hasta que se
formó una coloración parda permanente, después de lo cual se eliminó
el exceso de yodo por adición de una pequeña cantidad de ácido
ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de
aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido de paclitaxel
bruto se purificó por cromatografía líquida de alta presión en fase
inversa preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4
x 250 mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%
y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a
B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280
nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas
por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con desorción láser asistida por matriz.
Se añadió amida de Rink
MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina],
mallas 100-200 (Nova-Biochem, San
Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos
automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en
dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la
resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF
durante 2 min. La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo
una cantidad en exceso de piperidina al 20% durante 20 min para
asegurar la eliminación completa del grupo Fmoc de la resina.
Después de la desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a
continuación el primer aminoácido protegido,
Fmoc-Norleucina) (0,188 mmol),
diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo
los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-L-fenilalanina,
Fmoc-N^{im}-trityl-L-histidina,
Fmoc-\betaAla, Fmoc-Valina,
Fmoc-alanina,
Fmoc-N^{in}-Boc-L-triptófano,
Fmoc-glutamina,
Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-D-lysina,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido
bromoacético a la resina peptídica, se añadió
N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NMP y
se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con
DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del
Ejemplo 1 a la resina, se mezcló durante una noche, y se lavó con
cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una
filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una
noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 7 (0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo
redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido
trifluoroacético (TFA que contenía agua (2,5%) y triisopropilsilano
(1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias
veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite
resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido
acético al 60% (250 ml).
La solución se redujo a un volumen de
aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se
purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en
fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250
mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%
y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a
B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280
nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas
por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con desorción láser asistida por matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió amida de Rink
MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina],
mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al
recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático
CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF durante
aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un
exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se
filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de
piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación
completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección,
la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer
aminoácido protegido, Fmoc-Norleucina) (0,188
mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo
los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-L-fenilalanina,
Fmoc-N^{im}-trityl-L-histidina,
Fmoc-\betaAla, Fmoc-Valina,
Fmoc-alanina,
Fmoc-N^{in}-Boc-L-triptófano,
Fmoc-glutamina, Fmoc-
O-t-butil-D-Tyr,
Fmoc-O-t-butyl-D-serina,
ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido
bromoacético a la resina peptídica, se añadió
N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NMP y
se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con
DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del
Ejemplo 1 a la resina, se mezcló durante una noche, y se lavó con
cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una
filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una
noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 9 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al
que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético
(TFA) que contenía agua (2,5%) y triisopropilsilano (1%). La
suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con
TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió éter al aceite
resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en ácido
acético al 60% (250 ml).
La solución se redujo a un volumen de
aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se
purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en
fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250
mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%
y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a
B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280
nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas
por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con desorción láser asistida por matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
11
Se añadió amida de Rink
MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina],
mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al
recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático
CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF durante
aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un
exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se
filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de
piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la eliminación
completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la desprotección,
la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación el primer
aminoácido protegido, Fmoc-Thr(tBut)) (0,188
mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó una vez más por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo
los mismos procedimientos de acoplamiento generales, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-t-butil-L-treonina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-L-lisina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano,
Fmoc-L-fenilalanina,
Fmoc-S-tritil-L-ciateína,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
Fmoc-O-t-butil-D-tirosina,
N\alpha-Fmoc-Norleucina,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
ácido bromoacético. Una vez completado el acoplamiento del ácido
bromoacético a la resina peptídica, se añadió
N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NPM
y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con
DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de combretastatina
del Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con
cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una
filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante
una
noche.
noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
12
La resina
combretastatina-péptido preparada en el Ejemplo 11
(0,063 mmol) se puso en un matraz de fondo redondo al que se
añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) que
contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol (2,5%), y
triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y
se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y se añadió
éter al aceite resultante para dar un polvo blanco que se disolvió
luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota a gota una
solución concentrada de yodo en metanol con agitación enérgica
hasta que se formó una coloración parda permanente, después de lo
cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una pequeña
cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de
aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se
purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en
fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250
mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%
y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a
B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280
nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas
por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con desorción láser asistida por matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió amida de Rink
MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina],
mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al
recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático
CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida
(DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se
añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min.
La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en
exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la
eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la
desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación
el primer aminoácido protegido,
Fmoc-Thr(tBut) (0,188 mmol),
diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF, y, siguiendo
los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-t-butil-L-treonina,
N^{\alpha}- Fmoc-N^{\varepsilon}-
Boc-L-lisina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano,
Fmoc-L-fenilalanina,
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
Fmoc-O-t-butil-D-tirosina,
N^{\alpha}-Fmoc-Norleucina,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
ácido bromoacético.
Una vez completado el acoplamiento del ácido
bromoacético a la resina peptídica, se añadió
N-Boc-metiletilenodiamina (3 eq) en
NPM y se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces
con DMF y 3 veces con DCM. Se añadió el cloroformiato de
camptotecina del Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una
noche, se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por
metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se
secó al aire durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 13 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al
que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético
(TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol
(2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se
filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y
se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que
se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota
a gota una solución concentrada de yodo en metanol con agitación
enérgica hasta que se formó una coloración parda permanente,
después de lo cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una
pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de
aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido bruto de camptotecina se
purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa en
fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250
mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%
y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a
B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280
nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas
por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con desorción láser asistida por matriz.
Se añadió amida de Rink, resina
MBHA-poliestireno (0,063 mmol), mallas
100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al recipiente
de reacción de un sintetizador de péptidos automático CS136 (CS Bio,
Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en DMF durante aproximadamente 1
hora. Se filtró la resina y se añadió y mezcló un exceso de
piperidina al 20% en DMF durante 2 min. La resina se filtró y se
añadió y mezcló de nuevo una cantidad en exceso de piperidina al
20% durante 20 min para asegurar la eliminación completa del grupo
Fmoc de la resina. Después de la desprotección, la resina se lavó 4
veces con DMF y a continuación el primer aminoácido protegido,
Fmoc-Serina (tBut) (0,188 mmol),
diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF, y, siguiendo
los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-N-e-1(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)3-3metil-butil-L-Lisina,
Fmoc-O-t-butil-L-Serina,
N^{\alpha}-Fmoc-L-Isoleucina,
N-Fmoc-L-Glutamina,
N-Fmoc-L-Prolina,
N-Fmoc-O-Tritil-L-Tirosina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-L-triptófano,
N-Fmoc-L-Prolina,
N-Fmoc-L-Glutamina,
N^{\alpha}-Fmoc-L-Isoleucina,
N-Fmoc-L-Glutamina,
N^{\alpha}-Fmoc-Leucina,
Boc-O-t-butil-L-Histidina.
La resina peptídica protegida se trató luego 3
veces (3 min cada vez) con una solución al 2% de hidrato de
hidrazina en DMF a fin de eliminar el grupo
N-e-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)-3-metil-butilo
(ivDde) en el residuo lisina. El grupo e-amino
libre se acopló luego con ácido bromoacético seguido por adición de
N-Boc-N-etilenodiamina
(3 eq, 12 h) en NMP. Se añadió cloroformiato de camptotecina del
Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, se lavó con
cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una
filiación final, la resina derivatizada se secó al aire durante una
noche.
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 15 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al
que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético
(TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol
(2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (5 h), se
filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y
se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que
se purificó por cromatografía líquida de alta presión preparativa
en fase inversa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250
mm) de sílice combinada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución lineal en gradiente a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%
y el tampón B, TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde B 20% a
B 50% a razón de 1% por minuto. La separación se monitorizó a 280
nm. Las fracciones que contenían el producto puro, identificadas
por HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con desorción láser asistida por matriz.
Se suspendieron
O-t-butil-D-serina
(0,0062 mol) y
O-t-butil-L-serina
(0,0062 mol) en 55 ml de tetrahidrofurano (THF) anhidro en
atmósfera de nitrógeno. Se añadió fosgeno (0,025 mol) a la
suspensión y la suspensión se mantuvo a reflujo durante 15 minutos.
Se evaporaron el disolvente y el exceso de fosgeno, y el aceite
resultante se disolvió en 10 ml de THF y se añadió luego a 600 ml
de hexanos, después de lo cual se cristalizó
a-20ºC.
Se añadió amida de Rink
MBHA-poliestireno (0,063 mmol) [resina de
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina],
mallas 100-200 (NovaBiochem, San Diego, CA) al
recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos automático
CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en dimetilformamida
(DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la resina y se
añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF durante 2 min.
La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una cantidad en
exceso de piperidina al 20% durante 20 min para asegurar la
eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la
desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación
el primer aminoácido protegido,
Fmoc-Thr(tBut) (0,188 mmol),
diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF, y, siguiendo
los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se hicieron
reaccionar sucesivamente los aminoácidos siguientes con la cadena
peptídica en crecimiento:
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-t-butil-L-treonina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{\varepsilon}-Boc-L-lisina,
N^{\alpha}-Fmoc-N^{in}-Boc-D-triptófano,
Fmoc-L-fenilalanina,
Fmoc-S-tritil-L-cisteína,
Fmoc-O-t-butil-D-serina,
Fmoc-O-t-butil-D-tirosina,
N^{\alpha}-Fmoc-norleucina,
Fmoc-O-t-butil-D-serina.
En este punto, se eliminó el grupo Fmoc N-terminal,
se lavó varias veces la resina con DMF, y se transfirió luego la
resina a un matraz RB de 100 ml. Se disolvió
O-terc-butil-serina
NCA (1,5 g) en DMF anhidra y se añadió a la resina peptídica,
después de lo cual la resina suspendida se sacudió durante una noche
a 40ºC. La resina se filtró y se lavó varias veces con DMF, después
de lo cual se llevó nuevamente al sintetizador CS Bio. Se acopló
luego ácido bromoacético a la serina N-terminal en
DCM/DIC. Una vez completado el acoplamiento del ácido bromoacético
a la resina peptídica, se añadió
N-Boc-etilenodiamina (3 eq) en NMP y
se mezcló durante 2 horas, después de lo cual se lavó 3 veces con
DMF y 3 veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del
Ejemplo 1 a la resina, se mezcló durante una noche, y se lavó con
cantidades abundantes de DMF seguida por metanol. Después de una
filtración final, la resina derivatizada se secó al aire durante una
noche.
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 18 (0,063 mmol) se puso en un matraz RB al
que se añadieron 15 ml de una solución de ácido trifluoroacético
(TFA) que contenía agua (2,5%), 1,2-etanoditiol
(2,5%), y triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó (2 h), se
filtró, y se lavó varias veces con TFA. Se evaporó a vacío el TFA y
se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que
se disolvió luego en ácido acético al 60% (250 ml). Se añadió gota
a gota una solución concentrada de yodo en metanol con agitación
enérgica hasta que se formó una coloración parda permanente,
después de lo cual se eliminó el exceso de yodo por adición de una
pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución se redujo a un volumen de
aproximadamente 10 ml a vacío y el péptido de camptotecina bruto se
purificó por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa
preparativa (RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250
mm) de sílice aglomerada C-18 (Dynamax 300, 8
\mum). Se empleó un sistema de elución en gradiente lineal a un
caudal de 20 ml/min: el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%,
y el tampón B TFA al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde 20% B a
50% B a razón de 1% por min. La separación se monitorizó a 280 nm.
Las fracciones que contenían el producto puro, como se comprobó por
HPLC analítica, se agruparon, se concentraron a vacío, y se
sometieron a liofilización. El péptido se obtuvo como un polvo
amarillo esponjoso de peso constante por liofilización a partir de
ácido acético acuoso. La composición correcta se demostró por
análisis de aminoácidos de un hidrolizado ácido y espectrometría de
masas con difracción láser asistida por matriz.
Se testaron in vitro y in vivo
compuestos conjugados con un enlazador carbamato respecto a la tasa
de liberación del agente citotóxico. Se seleccionó un enlazador
carbamato debido a que el mismo es razonablemente estable en plasma
comparado, por ejemplo, con los enlaces tipo éster utilizados
comúnmente. Se testaron también compuestos de carbamato que
contenían un resto intramolecular cíclico que permite el ajuste de
la tasa de liberación del componente alcohólico del carbamato que
culmina en la liberación de un derivado alcohol fijado y formación
de una urea cíclica que puede utilizarse para controlar las tasas de
liberación de citotoxinas adecuadas (Fig. 1). Es sabido que el
valor pKa del alcohol lábil de un carbamato es importante para la
estabilidad del profármaco, por lo cual se seleccionaron dos
agentes citotóxicos diferentes químicamente adecuados, cada uno de
los cuales contenía un grupo hidroxilo con valores pKa
significativamente diferentes. Un agente citotóxico era el
inhibidor de la topoisomerasa I, camptotecina, que lleva un grupo
hidroxilo terciario en la posición 20 del anillo (Fig. 1) con un
pKa de aproximadamente 18. El otro agente citotóxico seleccionado
como agente citotóxico de referencia era el agente de fijación de
tubulina, combretastatina, que tiene un grupo hidroxilo fenólico
unido a un anillo aromático, por lo que exhibe un valor pKa mucho
menor, de aproximadamente 10,3.
Todos los conjugados peptídicos que se
encuentran en la Tabla 1 se sintetizaron totalmente sobre soporte de
resina de amida de Rink utilizando la estrategia estándar de
protección/desprotección con FMOC
(9-fluorenilmetoxicarbonilo) que empleaba
acoplamientos simples DIC y activación con HBTU como segundo paso
únicamente si un test Kaiser era positivo (como se ha descrito
arriba). Una vez que la porción peptídica del conjugado estaba
completa, se acopló ácido bromoacético al término N utilizando
DIC/DCM. Después del lavado de la resina, se añadió un exceso 5M de
N-BOC-etilenodiamina (o la diamina
protegida apropiada) en NMP, y se mezcló durante 1 h. Por separado,
se mezclaron camptotecina (200 mg; Aldrich) y DMAP (400 mg) en DCM
anhidro (40 ml), y se enfrió luego a 0ºC. Se añadió a esta
suspensión fosgeno al 20% en tolueno (600 \mul) y la mezcla se
dejó reaccionar durante aproximadamente 45 min. Después de
evaporación del disolvente, se suspendió el polvo en DCM (40 ml),
se añadió a la resina peptídica que llevaba la amina secundaria
libre, y se dejó reaccionar durante una noche seguido por varios
lavados con DMF, DCM, y metanol. El péptido se escindió luego de la
resina durante 2 h utilizando la mezcla de ácidos estándar
TFA:H_{2}O:EDT:TIS, 95:2:2:1. Después de la escisión, el conjugado
se precipitó 4 veces en éter etílico, se disolvió en HOAC al 60%, y
se cicló con yodo en metanol. Se sometió luego a cromatografía
preparativa y se caracterizó por MS y análisis de aminoácidos. Todos
los péptidos se obtuvieron con al menos 90%+ de pureza, y los
rendimientos eran aproximadamente 35% de los teóricos. La retención
total de las potencias de los agonistas conjugados con relación a la
somatostatina propiamente dicha se demostró por su capacidad para
inhibir la liberación de GH estimulada por la hormona liberadora de
gonadotropina (GNRH) a partir de cultivos monocapa de células de
hipófisis de rata, un sistema de ensayo que se ha demostrado se
correlaciona bien con la afinidad de fijación al receptor de
somatostatina humana tipo 2 (véase, v.g., Raynor et al.,
Mol. Pharmacol. 43: 838, 1993). Las potencias inhibidoras (CI50's)
de los conjugados que se muestran en la Tabla 2 oscilaban desde
0,26 a 0,49 nM comparadas con 0,63 nM para la
somatostatina-14 propiamente dicha. Esta retención
de la afinidad total es debida al empleo de la extensión
tripeptídica N-terminal
Nle-d-Tyr-d-Ser
de la porción cíclica de somatostatina del conjugado que, según han
encontrado los autores de la invención, permite por regla general
la unión de grupos grandes con poca o ninguna pérdida de
afinidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada conjugado peptídico se sometió a estudios
de estabilidad en tampón de fosfato y suero de rata. Los análogos
se incubaron en tampón de fosfato 0,1 M o suero reciente de rata a
37ºC y se tomaron partes alícuotas en diferentes momentos, que se
examinaron por HPLC. Los compuestos 1, 3, y 4 exhibían una
estabilidad total en tampón durante toda la duración del
experimento (50 h; Tabla 2). El compuesto 2 era menos estable en
tampón, con una semivida de aproximadamente 120 h, mientras que el
compuesto 6 era el menos estable con una semivida de sólo 30 h en
tampón. En suero de rata, esta misma tendencia era evidente, excepto
que había un efecto catabólico claro del suero sobre la estabilidad
de los compuestos. Los compuestos 1, 3, y 4 eran una vez más los más
estables, mientras que la semivida del compuesto 2 era 18 h y la
del compuesto 6 de combretastatina, que contiene el hidroxilo
fenólico, era la menos estable, con una semivida de 4 h.
Las actividades citotóxicas de estos conjugados
se midieron utilizando un kit estándar de ensayo MTT (Promega
Corporation, Madison, WI). Cada compuesto se incubó durante 3 días
con células IMR32 de neuroblastoma humano (sobreexpresión del
receptor somatostatina) a diferentes concentraciones por
cuadruplicado y se generaron valores CI50's a partir de las curvas
dosis-respuesta (Fig. 2). Aunque el compuesto 6
combretastatina-etilenodiamina BINAR era el más
citotóxico, después de revisar los datos de estabilidad en tampón,
es evidente que el 50% de este conjugado es citosina libre después
de 3 días y quizás más dado que los medios de células contendrán
algunas enzimas. El conjugado 2
N-Me-etilenodiamina-camptotecina
era el segundo más potente. Después de 3 días, más del 80% de este
conjugado estaba todavía intacto. El siguiente más potente era el
compuesto 1 de etilenodiamina. Este análogo demostró estabilidad
completa en tampón de fosfato, pero era 7 veces menos potente que
el compuesto 2 y ligeramente más activo que el compuesto 3 aun
cuando el mismo era más estable en suero. Esta propiedad es debida
probablemente a la capacidad del compuesto 1 para formar una urea
cíclica, mientras que el compuesto 3 es incapaz de formar esta
misma especie.
En estudios preliminares con animales portadores
de tumores, los compuestos 1 y 2 parecen ser igualmente eficaces
para inducir un efecto citotóxico en el tumor después de
administración intraperitoneal repetida. Los compuestos basados en
N,N-dimetiletilenodiamina, diaminopropilo, y grupos
2-hidroxietilamina BINAR (Fig. 2, Tabla 2) eran
esencialmente inactivos, debido probablemente a la ausencia de
liberación de cualquier agente citotóxico libre intra- o
extracelularmente. El conjugado 2 de camptotecina líder era capaz de
estabilizar significativamente el crecimiento de los carcinomas de
pulmón de células pequeñas NCI-H69 trasplantados
(expresión de SSTR2) en ratones atímicos a dosis muy inferiores a
las dosis máximas equivalentes toleradas de camptotecina sola. Los
datos sugieren no solamente un componente químico a la tasa de
liberación del alcohol, sino también algún componente
enzimático.
El valor de la estrategia de enlace BINAR está
basado no sólo en su aptitud para ajustarse a fin de acomodar tasas
de liberación ideales para diversos tipos de grupos que contienen
alcohol, sino también en su facilidad de incorporación en un grupo
amino libre de un péptido por químicas sencillas de fase sólida. La
química para introducción de los grupos es muy adecuada para la
síntesis en fase sólida y se adapta fácilmente para muchos péptidos
diferentes, agentes terapéuticos, y citotoxinas. Aunque esta
estrategia se aplica fácilmente al término N, puede aplicarse
también a una cadena lateral protegida ortogonalmente en caso de que
esto sea necesario para preservación de la afinidad de fijación del
péptido. Con los presentes conjugados de camptotecina, se alcanzó
una toxicidad alta en el caso de los compuestos 1 y 2 (Fig. 2; Tabla
2) aunque los mismos eran muy estables en las condiciones de
incubación de los medios. Concentraciones elevadas de conjugado
peptídico intacto se fijarán específicamente a las células
tumorales, después de lo cual podría tener lugar internalización.
Adicionalmente, los conjugados son muy solubles y las tasas y rutas
de aclaramiento tisular pueden ajustarse adicionalmente por
alteración del carácter hidrófilo del componente peptídico, como se
ha descrito arriba. Si el conjugado peptídico se mantiene
razonablemente intacto durante el aclaramiento, entonces los efectos
tóxicos secundarios deberían reducirse mucho.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió resina amida de Rink
[4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina]
(0,063 mmol), mallas 100-200 (NovaBiochem, San
Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos
automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en
dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la
resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF (2
min). La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una
cantidad en exceso de piperidina al 20% (20 min) para asegurar la
eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la
desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF/DCM y a
continuación el primer aminoácido protegido,
Fmoc-S-tritil-L-cisteína
(0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF y se añadieron a la resina,
que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo
los mismos procedimientos de acoplamiento general, se añadió
Fmoc-N-(2-Boc-aminoetil)glicina
(Neosystem). Se eliminó el grupo Fmoc y la resina peptídica se lavó
varias veces con DCM. Se añadió a la resina cloroformiato de
camptotecina del Ejemplo 1 y se mezcló durante una noche, después
de lo cual se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por
metanol. Después de una filtración final, la resina derivatizada se
secó al aire durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 21 (0,063 mmol) se puso en un matraz de
fondo redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido
trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%),
1,2-etanoditiol (2,5%), y triisopropilsilano (1%).
La suspensión se agitó (2 h), se filtró, y se lavó varias veces con
TFA. El TFA se evaporó a vacío y se añadió éter al aceite
resultante para dar un polvo amarillo que se disolvió luego en
ácido acético al 60% (15 ml).
El péptido de camptotecina bruto se purificó por
cromatografía líquida de alta presión en fase inversa preparativa
(RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice
aglomerada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó
un sistema de elución en gradiente lineal a un caudal de 20 ml/min:
el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%, y el tampón B TFA
al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde 20% B a 50% B a razón de 1%
por min. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que
contenían el producto puro, como se comprobó por HPLC analítica, se
agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización.
El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso
constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La
composición correcta, que se muestra a continuación, se demostró
por espectrometría de masas con difracción láser asistida por
matriz.
Se añadió resina amida de Rink
[4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-(aminometil)fenoxi-acetamido-norleucil-metilbenzhidrilamina]
(0,063 mmol), mallas 100-200 (NovaBiochem, San
Diego, CA) al recipiente de reacción de un sintetizador de péptidos
automático CS136 (CS Bio, Inc., San Carlos, CA) y se hinchó en
dimetilformamida (DMF) durante aproximadamente 1 hora. Se filtró la
resina y se añadió y mezcló un exceso de piperidina al 20% en DMF (2
min). La resina se filtró y se añadió y mezcló de nuevo una
cantidad en exceso de piperidina al 20% (20 min) para asegurar la
eliminación completa del grupo Fmoc de la resina. Después de la
desprotección, la resina se lavó 4 veces con DMF y a continuación
el primer aminoácido protegido,
Fmoc-L-p-benzoil-Fenilalanina
(0,188 mmol), diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,188 mmol), y
N-hidroxibenzotriazol monohidratado (HOBt) (0,188
mmol) se disolvieron totalmente en DMF/DCM y se añadieron a la
resina, que se mezcló durante 1 h, seguido por lavado 4 veces con
DMF.
El grupo Fmoc se eliminó de nuevo por
tratamiento con solución de piperidina al 20% en DMF y, siguiendo
los mismos procedimientos generales de acoplamiento, se añadió
Fmoc-N-(2-Boc-aminoetil)glicina
(Neosystem). Se eliminó el grupo Fmoc y la resina peptídica se lavó
varias veces con DCM. Se añadió cloroformiato de camptotecina del
Ejemplo 1 a la resina y se mezcló durante una noche, después de lo
cual se lavó con cantidades abundantes de DMF seguida por metanol.
Después de una filtración final, la resina derivatizada se secó al
aire durante una noche.
La resina camptotecina-péptido
preparada en el Ejemplo 23 (0,063 mmol) se puso en un matraz de
fondo redondo al que se añadieron 15 ml de una solución de ácido
trifluoroacético (TFA) que contenía agua (2,5%), y
triisopropilsilano (1%). La suspensión se agitó durante 2 h, se
filtró, y se lavó varias veces con TFA. El TFA se evaporó a vacío y
se añadió éter al aceite resultante para dar un polvo amarillo que
se disolvió luego en ácido acético al 60% (15 ml).
El péptido de camptotecina bruto se purificó por
cromatografía líquida de alta presión en fase inversa preparativa
(RP-HPLC) en una columna (21,4 x 250 mm) de sílice
aglomerada C-18 (Dynamax 300, 8 \mum). Se empleó
un sistema de elución en gradiente lineal a un caudal de 20 ml/min:
el tampón A estaba constituido por TFA al 0,1%, y el tampón B TFA
al 0,1% en MeCN al 80%; se aumentó desde 20% B a 50% B a razón de 1%
por min. La separación se monitorizó a 280 nm. Las fracciones que
contenían el producto puro, como se comprobó por HPLC analítica, se
agruparon, se concentraron a vacío, y se sometieron a liofilización.
El péptido se obtuvo como un polvo amarillo esponjoso de peso
constante por liofilización a partir de ácido acético acuoso. La
composición correcta, que se muestra a continuación, se demostró
por espectrometría de masas con difracción láser asistida por
matriz.
<110> The Administrators of the Tulane
Educational Fund et al.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Conjugados de Agentes Terapéuticos o
Citotóxicos y Péptidos Biológicamente Activos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 07005/007EP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/03/06657
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-03-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/360,831
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Nle
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= pal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= NLE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Pal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= GIn, Asn, Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Ava, Gly, Leu, Val, Ile, Nle, o
Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=BAla, 4Abu, Gly, Ala,
D-Ala, N-Me-Ala, o
N-Me-D-Ala.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Phe, Tyr,
4-Chloro-Phe,
4-Fluoro-Phe,
4-Bromo-Phe,
4-NO2-Phe, Ala, Gly, Leu, Val, Ile,
Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Met, Phe, Tyr,
4-Chloro-Phe,
4-Fluoro-Phe,
4-Bromo-Phe,
4-NO2-Phe, Ala, Gly, Leu, Val, Ile,
Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= amida o
N-alquilamida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 9 es Ava, Gly, Leu,
Val, Ile, Nle, o Nva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 10 es Ava, Gly, Leu,
Val, Ile, Nle, Nva, o una alquilamida inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6,11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 6 y 11 están
circularizados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala en posición 8 es bAla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 11 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala en posición 8 es bAla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 11 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 4 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 4 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 7 y 12 están
circularizados
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 5 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 6 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 7 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 8 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 9 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 10 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 11 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 12 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 13 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 14 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 15 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 16 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 17 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 18 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 1 y 6 están
circularizados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
<222 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 3 es Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6, 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 6 y 11 están
circularizados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm51
Claims (40)
1. Un compuesto conjugado representado por la
fórmula siguiente:
en
donde:
- \quad
- X es un agente citotóxico unido al enlace carbamato por un grupo alquil-OH;
- \quad
- n = 2;
- \quad
- R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono;
- \quad
- Y es una secuencia espaciadora hidrófila seleccionada de un péptido que aumenta la biodistribución de dicho compuesto conjugado o un polímero hidrófilo, o se omite;
- \quad
- Z es un péptido enlazador que, cuando está unido a Q en el término N o en un grupo amino compatible de cadena lateral de Q, conserva al menos 50% de la actividad biológica de Q, teniendo Z la fórmula:
A-B-C-E-F,
- \quad
- en donde:
- \quad
- A es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, o L-Ser; o está suprimido;
- \quad
- B es D-Lys o D-Tyr, o está suprimido;
- \quad
- C es Lys, Ser, hSer, Thr, Nle, Abu, Nva, (2, 3, o 4) 3-piridil-Ala (Pal), Orn, Dab, Dap, 4-NH_{2}-Phe, D-4-OH-Pro, o L-4-OH-Pro, o está suprimido;
- \quad
- E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln, y
- \quad
- F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln;
- \quad
- con la condición de que cuando A, B, C, y E son Tyr, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Lys; y cuando A, B, C, y E son Lys, Tyr, Lys, y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y cuando A y B están suprimidos, y C y E son Lys y Tyr, respectivamente, F no es Tyr o Lys; y
- \quad
- Q es un resto de direccionamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el
cual dicho agente citotóxico X es un agente alquilante, un
antibiótico, un antimetabolito, un inhibidor de tubulina, un
inhibidor de la topoisomerasa I o II, un agonista o antagonista
hormonal, un agente apoptótico, o un inmunomodulador.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en
donde X es camptotecina, homocamptotecina, colchicina,
tiocolchicina, combretastatina, dolistatina, doxorrubicina,
metotrexato, podofilotoxina, rizoxina, rizoxina D, un taxol,
paclitaxel, CC1065, o un maitansinoide.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde dicho péptido Y tiene la fórmula
U(V-V)_{n}, donde U es
D-Pro, L-Pro,
D-4-OH-Pro,
L-4-OH-Pro,
Sarcosina, Lys, Orn, Dab, Dap,
4-NH_{2}-Phe, o
(NH_{2}-(CH_{2})_{m}-COOH), donde
m=2-10, inclusive, o está suprimido; cada V se
selecciona independientemente del grupo constituido por:
D-Ser, L-Ser, D-Thr,
L-Thr, D-Gln, L-Gln,
D-Asn, L-Asn,
D-4-OH-Pro, y
L-4 hidroxi-Pro; y
n=1-50, inclusive.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en
donde al menos un V es un D-aminoácido.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde dicho polímero hidrófilo Y es polietilenglicol,
poli(acetato de vinilo), poli(alcohol vinílico), HPMA
(N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida)
o copolímeros de HPMA,
\alpha,\beta-poli(N-hidroxietil)-DL-aspartamida
(PHEA), o
\alpha,\beta-poli(N-hidroxipropil)-DL-aspartamida.
7. El compuesto de la reivindicación 1, en el
cual dicho resto de direccionamiento Q es un péptido biológicamente
activo.
8. El compuesto de la reivindicación 7, en
donde dicho péptido biológicamente activo es somatostatina,
bombesina, un péptido KiSS, un péptido de urotensina II, péptidos
de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) I y II,
octreotido, depreotido, vapreotido, péptido vasoactivo intestinal
(VIP), colecistoquinina (CCK), factor de crecimiento afín a la
insulina (IGF), péptidos que contienen RGD, péptido de la hormona
estimulante de los melanocitos (MSH), neurotensina, calcitonina, un
péptido que comprende la región determinante de la complementariedad
de un anticuerpo antitumoral, glutatión, un péptido ávido de
leucocitos que comprende la secuencia de YIGSR, la región de
fijación de heparina del factor 4 (PF-4) de las
plaquetas y una secuencia rica en lisina, péptido natriurético
atrial (ANP), un péptido \beta-amiloide, un
antagonista delta-opioide,
annexina-V, endotelina, interleuquina
(IL)-1, IL-1ra,
IL-2, IL-8, leucotrieno B4 (LTB4),
un péptido quimiotáctico, un antagonista de los receptores GP
IIb/IIIa, factor de crecimiento epidérmico, un inhibidor de la
elastasa de los neutrófilos humanos, inhibidor de plasmina, un
péptido antimicrobiano, apticida P280, apticida P274, un receptor de
trombospondina, bitistatina, receptor tipo I de la
adenilil-ciclasa de la hipófisis (PAC1), cadena
\alpha de fibrina, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
9. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde dicho péptido ávido de leucocitos es P483H.
10. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde dicho antagonista delta-opioide es ITIPP
(psi).
11. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde dicho péptido quimiotáctico es
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina-lisina
(fMLFK).
12. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde dicho antagonista del receptor GP IIb/IIIa es DMP444.
13. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde dicho inhibidor de la elastasa de los neutrófilos humanos es
EPI-HNE-2 o
EPI-HNE-4.
14. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde dicho receptor de trombospondina es
TP-1300.
15. El compuesto de la reivindicación 7, en
donde dicho péptido biológicamente activo direcciona dicho compuesto
a una célula o tejido en el cuerpo de un mamífero.
16. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde dicho resto de direccionamiento Q es un péptido derivado de
una biblioteca de presentación de fago, o sustituciones
conservadoras del mismo, que direcciona dicho compuesto a una
célula o tejido en el cuerpo de un mamífero.
17. El compuesto de la reivindicación 15 ó 16,
en donde dicha célula o tejido comprende una célula de cáncer, un
glóbulo blanco de la sangre, tejido cardiaco, tejido cerebral, o un
tubérculo infectado con tuberculosis.
18. El compuesto de la reivindicación 15 ó 16,
en donde dicho tejido es un tumor de un vaso sanguíneo angiogénico
proliferativo.
19. El compuesto de la reivindicación 18, en
donde dicho vaso sanguíneo se encuentra en el ojo.
20. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde Q es un péptido de somatostatina o un péptido de
bombesina.
21. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento
del mismo.
22. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde Z es
D-Ser-Nle-D-Ser-D-Ser
o
D-Ser-Lys-D-Ser-D-Ser,
o
D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr,
o
D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser,
o
D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser,
o
D-Ser-Ser-D-Lys-Ser,
o
D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser,
o
D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser,
o
D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser,
o
Lys-D-Ser-D-Ser,
o
Ser-D-Lys-D-Ser,
o Ser-D-Lys-Ser, o
Nle-D-Tyr-D-Ser,
o
Lys-D-Tyr-D-Ser,
o
Pal-D-Lys-D-Ser,
o
Thr-D-Tyr-D-Ser,
o D-Ser-D-Lys, o
D-Ser-D-Tyr, o
D-Lys-D-Lys, o
D-Lys-D-Tyr, o
D-Tyr-D-Lys.
23. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde Z tiene la fórmula:
E-F,
\newpage
donde:
- \quad
- E es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Gln, o L-Gln; y F es D-Lys, D-Tyr, D-Ser, L-Ser, D-4-OH-Pro, L-4-OH-Pro, 3-yodo-D-Tyr, 3-5 diyodo-D-Tyr, 3-astatina-D-Tyr, 3-5 astatina-D-Tyr, 3-bromo-D-Tyr, 3-5 dibromo-D-Tyr, D-Asn, L-Asn, D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Gln, o L-Gln.
\vskip1.000000\baselineskip
24. El compuesto de la reivindicación 1 para
uso como medicamento.
25. El compuesto para uso como medicamento de
acuerdo con la reivindicación 24, en donde la secuencia espaciadora
hidrófila Y se define como en las reivindicaciones 4 a 5.
26. El compuesto para uso como medicamento de
acuerdo con la reivindicación 24, en el cual dicho polímero
hidrófilo Y es polietilenglicol, poli(acetato de vinilo) o
poli(alcohol vinílico).
27. El compuesto para uso como medicamento de
acuerdo con la reivindicación 24, en el cual el resto de
direccionamiento Q es como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 19 ó 21.
28. El compuesto para uso como medicamento de
acuerdo con la reivindicación 24, en donde Q es somatostatina o un
análogo de la misma, bombesina, o un análogo de la misma, o un
anticuerpo, o un péptido de somatostatina, o un péptido de
bombesina.
29. El compuesto para uso como medicamento de
acuerdo con la reivindicación 24, en donde Z es como se define en
las reivindicaciones 22 ó 23.
30. El compuesto de la reivindicación 20, en
donde dicho análogo de somatostatina incluye
ciclo[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]
y el término C del análogo es Thr-NH_{2}.
31. El compuesto de la reivindicación 30, en
donde dicho compuesto comprende camptotecina como X,
D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser
como Z, N(R_{1}R_{2}) como R, donde R_{1} y R_{2}
son hidrógeno y metilo, respectivamente, y en donde Y está
suprimido.
32. Un compuesto representado por la fórmula
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde:
- \quad
- X es un agente citotóxico fijado al enlace carbamato a través de un grupo alquil-OH;
- \quad
- n = 2;
- \quad
- R es N(R_{1}R_{2}), OR_{1}, o SR_{1}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo inferior de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 8 átomos de carbono, y en donde R_{3} es un grupo NH(CH_{2})_{m}SH y m = 2 a 6, D o L cisteína, una benzofenona, o un grupo OH.
\vskip1.000000\baselineskip
33. El compuesto de la reivindicación 32, en
donde el grupo R_{3} puede utilizarse para fijar un péptido,
proteína, o anticuerpo a dicho compuesto.
34. El compuesto de la reivindicación 32, en
donde R_{3} es NH(CH_{2})_{m}SH y m = 2 a 6, y
en donde dicho péptido, proteína o anticuerpo está unido a dicho
compuesto por una reacción de tiol.
35. El compuesto de la reivindicación 32, en
donde R_{3} es una benzofenona y dicho péptido, proteína o
anticuerpo está fijado a dicho compuesto por una reacción
fotoquímica.
36. El compuesto de la reivindicación 33, en
donde dicha benzofenona es
p-benzoil-fenilalanina.
37. Uso de un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1-23, 30 ó 31 para la preparación
de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades
siguientes: enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide,
acromegalia, tuberculosis, un tumor del pulmón, mama, cerebro, ojo,
próstata o colon; un tumor de origen neuroendocrino; y angiogénesis
que causa proliferación inadecuada en vasos sanguíneos.
38. El uso de la reivindicación 37, en donde
dicho tumor de origen neuroendocrino es síndrome carcinoide.
39. El uso de la reivindicación 37, en donde
dicho vasos sanguíneos se encuentran en el ojo.
40. El uso de la reivindicación 37, en donde
dicha angiogénesis causa degeneración retinal macular o retinopatía
diabética.
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