MX2013004295A - Anticuerpos estables y solubles. - Google Patents

Anticuerpos estables y solubles.

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Abstract

La descripción provee anticuerpos que se modifican para reducir propensión de agregación, y los métodos de producir dichos anticuerpos. La presente descripción también provee en particular anticuerpos scFv estables y solubles y fragmentos Fab específicos para TNF, que comprenden secuencias específicas de cadena ligera y cadena pesada que se optimizan para estabilidad, solubilidad, unión in vitro o in vivo de TNF, e inmunogenicidad baja. También se describen ácidos nucleicos, vectores y células huésped para expresión de los anticuerpos recombinantes de la descripción, métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en la medicina.

Description

ANTICUERPOS ESTABLES Y SOLUBLES REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad bajo 35 U.S.C. § 119 a las solicitudes de patente provisional de E.U.A. Nos. 61/405,798, presentada el 22 de octubre e 2010, y 61/484,749, presentada el 11 de mayo de 2011, los contenidos enteros de las cuales se incorporan a la presente por referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos de reducir propensión de agregación de anticuerpos, y anticuerpos que se modifican para reducir propensión de agregación. La invención también se refiere a anticuerpos que unen factor alfa de necrosis tumoral (TNFa). En particular, la invención se refiere a anticuerpos estables y solubles que comprenden una modificación reductora de agregación, incluyendo anticuerpos scFv y fragmentos Fab, que comprenden secuencias específicas de cadena ligera y cadena pesada que se optimizan para estabilidad, solubilidad, y baja inmunogenicidad. Además, la invención se refiere a métodos para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos mediados con TNF.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor alfa de necrosis tumoral (TNFa, también conocido como cachectina), es una citosina de mamífero que ocurre de manera natural producida por numerosos tipos celulares, incluyendo monocitos y macrófagos en respuesta a endotoxina u otros estímulos. TNFa es un mediador principal de reacciones inflamatorias, inmunológicas y patofisiológicas (Grell, M., y otros (1995), Cell, 83: 793-802).
TNFa soluble se forma por el corte de una proteína de transmembrana de precursor (Kriegler, y otros (1988) Cell 53: 45-53), y los polipéptidos 17 kDa secretados se parecen a complejos de homotrímero solubles (Smith, y otros (1987) J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para revisiones de TNFA, ver Butler y otros (1986), Nature 320:584; Oíd (1986), Science 230:630). Estos complejos entonces unen a receptores encontrados en una variedad de células. La unión produce una distribución de efectos pro-inflamatorios, incluyendo (i) liberación de otras citocinas pro-inflamatorias tales como interleucina (IL)-6, IL-8 e IL-1, (ii) liberación de metaloproteinasas de matriz y (iii) hasta regulación de la expresión de moléculas de adhesión endoteliales, amplificando más la cascada inflamatoria e inmune al atraer leucocitos en tejidos extravasculares.
Un número grande de trastornos está asociado con niveles elevados de TNFa, muchos de ellos de importancia médica significativa. TNFa ha sido mostrado por regularse hacia arriba en un número de enfermedades humanas, incluyendo enfermedades crónicas tales como artritis reumatoide (RA), trastornos del intestino inflamatorio incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerante, sepsis, fallo al corazón congestivo, asma bronquial y esclerosis múltiple. Ratones transgénicos para TNFa humano producen altos niveles de TNFa constitutivamente y desarrollan un poliartritis espontáneo, destructor que se parece a RA (Keffer y otros, 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). Por lo tanto, TNFa es referido como una citosina pro-inflamatoria.
TNFa ahora está bien establecido como clave en la patogénesis de RA, que es una enfermedad crónica, progresiva y debilitante por inflamación y destrucción de articulaciones poliarticulares, con síntomas sistémicos de fiebre o malestar y fatiga. RA también conduce a inflamación sinovial crónica, con progreso frecuente a cartílago articular y destrucción de huesos. Los niveles aumentados de TNFa se encuentran tanto en el fluido sinovial como la sangre periférica de pacientes que sufren de RA. Cuando se administran agentes bloqueadores de TNFa a pacientes que sufren de RA, reducen la inflamación, mejoran los síntomas y retrasan el daño a articulaciones (McKown y otros (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208).
Fisiológicamente, TNFa también se asocia con protección de infecciones particulares (Cerami y otros (1988), Today 9:28). TNFa se libera por macrófagos que han sido activados por lipopolisacáridos de bacteria Gram-negativa. Como tal, TNFa parece ser un mediador endógeno de importancia central involucrada en el desarrollo y patogénesis de choque endotóxico asociado con sepsis bacteriana (Michie, y otros (1989), Br. J. Surg. 76:670-671; Debets y otros (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson y otros (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage y otros (1987), Lancet 1: 355-357; Hammerle y otros (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets y otros (1989), Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra y otros (1990), J. Infect. Dis. 161:982-987; Revhaug y otros (1988), Arch. Surg. 123: 162-170).
Como con otros sistemas de órgano, TNFa también ha sido mostrado por jugar un papel clave en el sistema nervioso central, en particular en trastornos inflamatorio y autoinmunes del sistema nervioso, incluyendo esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre y miastenia grave, y en trastornos degenerativos del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington. TNFa también está involucrado en trastornos de sistemas relacionados de la retina y de músculo, incluyendo neuritis óptica, degeneración macular, Yetinopatía diabética, dermatomiositis, esclerosis lateral amiotrófica, y distrofia muscular, así como en daños al sistema nervioso, incluyendo daño cerebral traumático, daño agudo a espina dorsal y embolia.
La hepatitis es otro trastorno inflamatorio relacionado con TNFa que entre otros detonantes puede ser causada por infecciones virales, incluyendo Epstein-Barr, citomegalovirus, y virus de hepatitis A-E. La hepatitis causa inflamación aguda al hígado en la región portal y lobular, seguido por fibrosis y progreso tumoral. TNFa también puede mediar caquexia en cáncer, lo que causa la mayor parte de morbidez y mortalidad de cáncer (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305).
El papel clave desempeñado por TNFa en inflamación, respuestas inmunes celulares y la patología de muchas enfermedades ha conducido a la búsqueda por antagonistas de TNFa. Una clase de antagonistas de TNFa diseñados para el tratamiento de enfermedades mediadas con TNFa son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que específicamente se unen a TNFa y por tanto bloquean su función. El uso de anticuerpo anti-TNFa ha mostrado que un bloqueo de TNFa puede invertir los efectos atribuidos a TNFa incluyendo disminuciones en IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adhesión y destrucción de tejido (Feldmann y otros (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350). Entre los inhibidores específicos de TNFa que recientemente se han hecho comercialmente disponibles incluyen un anticuerpo monoclonal, quimérico de ratón-humano dirigido contra TNFa (infliximab, Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) ha demostrado eficacia clínica en el tratamiento de RA y enfermedad de Crohn. A pesar de estos avances, permanece una necesidad por formas nuevas y efectivas de anticuerpos u otros anticuerpos para el tratamiento para trastornos asociados con TNFa tal como RA. En particular, hay una necesidad urgente por anticuerpos con propiedades funcionales óptimas para el tratamiento efectivo y continuo de artritis y otros trastornos mediados con TNFa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee anticuerpos que comprenden por lo menos una mutación reductora de agregación y métodos para producir dichos anticuerpos.
En un aspecto, la invención provee un método de reducir la propensión por agregación de un anticuerpo, el método que comprende introducir una o más modificaciones reductoras de agregación en una posición de residuo que participa en la interface entre la cadena ligera variable y la cadena pesada variable de un anticuerpo, en donde la sustitución reduce la energía libre entre la cadena ligera variable y la cadena pesada variable por al menos 0.5 kcal/mol, por tanto reduciendo la propensión de agregación del anticuerpo modificado comparado con aquél de un anticuerpo parental que carece de la modificación(es) reductora de agregación.
En un aspecto, un método de la invención comprende introducir una o más sustituciones de aminoácido en la interface de una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH) del anticuerpo, en donde la una o más sustituciones están en posiciones de residuo seleccionadas para reducir la energía libre entre la VL y VH por al menos 10%, así reduciendo la propensión de agregación del anticuerpo comparado con un anticuerpo parental. En un aspecto particular, la secuencia de la cadena ligera variable del anticuerpo tiene al menos 65% de identidad a la secuencia de SEC ID NO: 1. En otros aspectos, la cadena pesada variable tiene por lo menos 85% de identidad a la secuencia de SEC ID NO:3 o la secuencia de SEC ID NO: 4.
En ciertos aspectos, un método de la invención comprende modificar el residuo en la posición 50 AHo y/o el residuo en la posición -47 AHo en la cadena ligera variable de un anticuerpo, por tanto reduciendo la propensión de agregación del anticuerpo comparado con un anticuerpo parental. En otros aspectos, el método de la invención comprende además modificar residuos en la posición AHo 12, 103 y 144 de la cadena pesada variable.
La invención también provee anticuerpos que tienen propensión reducida para agregación que comprende una o más modificaciones reductoras de agregación. En ciertos aspectos, un anticuerpo de la invención es un fragmento Fab, Fab', un F(ab)2', Fv de una cadena (scFv), un Fv, o un anticuerpo lineal. En otros aspectos, la invención provee una molécula biespecífica o -bivalente que comprende un anticuerpo de la invención.
En otros aspectos, la modificación reductora de agregación está en la posición AHo 50 de la cadena ligera variable. En un aspecto particular, la modificación reductora de agregación comprende una arginina (R) en la posición AHo 50 de la cadena ligera variable. Todavía en otro aspecto, la modificación reductora de agregación comprende una sustitución de lisina (K) por arginina (R) en la posición AHo 50 de la cadena ligera variable.
Todavía en otros aspectos, la modificación reductora de agregación está en la posición AHo 47 de la cadena ligera variable. En un aspecto particular, la modificación reductora de agregación comprende una arginina (R) en la posición AHo 47 de la cadena ligera variable. Todavía en otro aspecto, la modificación reductora de agregación comprende una sustitución de lisina (K) por arginina (R) en la posición AHo 47 de la cadena ligera variable.
La invención también provee anticuerpos estables y solubles específicos para TNFoc, los cuales comprenden secuencias específicas de cadena ligera y cadena pesada que se optimizan para estabilidad, solubilidad, unión in vitro o in vivo de TNFoc, y baja ¡nmunogenicidad. Dichos anticuerpos están diseñados para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos mediados con TNFa. También se describen los ácidos nucleicos, vectores y células huésped para expresión de los anticuerpos recombinantes, cadeneas ligeras variables y cadenas pesadas variables de la invención, métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina.
La invención también provee métodos de tratar un trastorno mediado con TNFa que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo la composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-TNFa de la invención. En ciertos aspectos, el trastorno mediado con TNFa es un trastorno ocular seleccionado a partir del grupo que consiste de uveítis, enfermedad de Bechet, s retinitis, ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjórgen, neuropatía diabética, escleritis, degeneración macular relacionada con la edad y queratitis.
Modalidades preferidas específicas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas modalidades preferidas y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra cuervas de titulación de posiciones de residuo VL47 (líneas sólidas) y VL50 (líneas punteadas) en dos moléculas scFv diferentes, 34rFW1.4 (negro) y 578rFW1.4 (gris).
La figura 2A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 60 mg/ml.
La figura 2B muestra estabilidad de 34rFW1.4_VLK50R_DHP bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 60 mg/ml.
La figura 3A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 40 mg/ml.
La figura 3B muestra estabilidad de 34rFW1.4_VLK50R_DHP bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 40 mg/ml.
La figura 4A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 20 mg/ml.
La figura 4B muestra estabilidad de 34rFW1 4_VLK50R_DHP bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 20 mg/ml.
La figura 5A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 60 mg/ml.
La figura 5B muestra estabilidad de 34rFW1 4_VLK50R bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 60 mg/ml.
La figura 6A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 40 mg/ml.
La figura 6B muestra estabilidad de 34rFW1.4_VLK50R bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 40 mg/ml.
La figura 7A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 20 mg/ml.
La figura 7B muestra estabilidad de 34rFW1.4_VLK50R bajo condiciones aceléradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 20 mg/ml.
La figura 8A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 60 mg/ml.
La figura 8B muestra estabilidad de 34rFW1 4_K47R bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 60 mg/ml.
La figura 9A muestra estabilidad de 34rFW1.4 bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 20 mg/ml.
La figura 9B muestra estabilidad de 34rFW1.4_K47R bajo condiciones aceleradas determinadas por análisis de SE-HPLC después de 2 semanas de incubación a 40°C y usando concentración de 20 mg/ml.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un objeto general de la invención es proveer anticuerpos estables y solubles teniendo propensión reducida para agregar en solución. En una modalidad preferida dicho anticuerpo es un anticuerpo scFv o fragmento Fab. Los anticuerpos de la invención comprenden de preferencia una cadena ligera y pesada como se describe en la presente.
Los particulares mostrados en la presente son por medio de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención solamente y son presentadas en la causa de proveer lo que se cree es la descripción más útil y prontamente entendida de los principios y aspectos conceptuales de varias modalidades de la invención. En este respecto, no se hace ningún intento por mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle de lo que es necesario para el entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos y/o ejemplos haciendo evidentes a aquellos expertos en la técnica cómo las varias formas de la invención se pueden abarcar en la práctica.
A fin de que la presente invención sea entendida mejor, ciertos términos serán definidos de la siguiente manera. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada. Las siguientes definiciones y explicaciones deben y pretenden estar controlando en cualquier construcción futura a menos que se modifiquen de manera clara y no ambigua en los siguientes ejemplos o cuando la aplicación del significado haga cualquier construcción sin sentido o en esencia sin sentido. En casos en donde la construcción del término lo haría sin sentido o en esencia sin sentido, la definición sería tomada del diccionario Webster, 3a edición o un diccionario conocido a aquellos en la técnica, tal como el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).
El término "anticuerpo" como se usa en la presente incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno", "polipéptido de unión a antígeno" o "inmunoaglutinante") o una sola cadena del mismo. Un "anticuerpo" incluye una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro, o una porción de unión de antígeno de los mismos. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CD ), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas de terminal amino a terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactua con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de inmunoglobulina a tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (CIq) del sistema de complemento clásico.
El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "proteína de anticuerpo") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la habilidad de específicamente unir a un antígeno (por ejemplo, TNF). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominio VH, Vu, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un solo dominio o fragmento dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH¡ y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) o (vii) una combinación de dos o más CDRs aisladas que opcionalmente se pueden juntar por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se pueden juntar, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite hacerse como una sola cadena de proteína en donde las regiones VL y VH forman pareja para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadena única Fv (scFv); ver, por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242:423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena única también deben estar abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas con experiencia en la técnica, y los fragmentos son seleccionados para utilidad en la misma manera como son anticuerpos intactos. Se pueden producir porciones de unión a antígeno por técnicas de ADN recom binante, o por corte enzimático o químico de ¡nmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden ser de diferente isotipo, por ejemplo, un IgG (por ejemplo, un subtipo I g G 1 , lgG2, lgG3 o lgG4), anticuerpo I g A , lgA2, IgD, IgE o IgM.
El término "estructuras" se refiere a las porciones reconocidas en la técnica de una región variable de anticuerpo que existen entre las regiones CDR más divergentes. Dichas regiones de estructura típicamente son referidas como estructuras 1 a 4 (FR1, FR2, FR3 y FR4) y proveen un andamiaje para mantener, en espacio tridimensional, las tres CDRs encontradas en una región variable de anticuerpo de cadena pesada o ligera, de modo que las CDRs pueden formar una superficie de unión a antígeno. Dichas estructuras también pueden ser referidas como andamiajes ya que proveen soporte para la presentación de las CDRs más divergentes. Otras CDRs y estructuras de la superfamilia de inmunoglobulina, tales como repeticiones de anquirina y fibronectina, se pueden usar como moléculas de unión a antígeno (ver también, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 6,300,064, 6,815,540 y publicación de patente de E.U.A. No. 20040132028).
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al cual específicamente se une una inmunoglobulina o anticuerpo (por ejemplo, TNF). Un epítopo típicamente incluye por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
•Los términos "unión específica", "unión selectiva", "selectivamente une" y "específicamente une" se refieren a unión de anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad (KD) de aproximadamente menos de 10"7 M, tal como aproximadamente menos de 10"8 M, 10"9 M o 10"10 M o incluso menor, como se determina usando tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE.
El término "KD" se refiere al equilibrio de disociación constante de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. En ciertas modalidades, algunos anticuerpos de la invención se unen a TNF con un equilibrio de disociación constante (KD) de menos de aproximadamente 10"7 M, tal como menos de aproximadamente 10"8 M, 10"9 M o 10"10 M o incluso menos, por ejemplo, como se determina usando tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE.
Como se usa en la presente, "identidad" se refiere a la comparación de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas es ocupada por la misma subunidad monomérica de base o aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN es ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos es ocupada por una lisina), entonces las moléculas respectivas son idénticas en esa posición. La "identidad de porcentaje" entre dos secuencias es una función del número de posiciones de comparación compartidas por las dos secuencias divididas por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 a 10 de las posiciones en dos secuencias se comparan, entonces las dos secuencias tienen 60% de identidad. Por medio de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten 50% de identidad (3 de las 6 posiciones totales son igualadas). Por lo general, se hace una comparación cuando dos secuencias se alinean para dar máxima identidad. Dicha alineación se puede proveer usando, por ejemplo, el método de Needleman y otros (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, implementado de manera conveniente por programas de computación tal como el programa Align (DNAstar, Inc.). La identidad de porcentaje entre dos secuencias de aminoácido también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci. 4^.11-17 (1998)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud por cada gap (puntuación del alineamiento por cada hueco) de 12 y una penalidad por cada gap de 4. Además, la identidad de porcentaje entre dos secuencias de aminoácido se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48_:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PA 250, y un peso de gap de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
Secuencias "similares" son aquellas que, cuando se alinean, comparten residuos de aminoácido idénticos y similares, en donde los residuos similares son sustituciones conservadoras para residuos de aminoácido correspondientes en una secuencia de referencia alineada. En este respecto, una "sustitución conservadora" de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitución pro un residuo que es física o funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene un tamaño similar, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la habilidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. De esta manera, una "secuencia de sustitución conservadora" es una que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia de tipo silvestre en cuanto a que están presentes una o más sustituciones conservadoras. La "similitud de porcentaje" entre dos secuencias es una función del número de posiciones que contienen residuos de comparación o sustituciones conservadoras compartidas por las dos secuencias divididas por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias se igualan y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservadoras, entonces las dos secuencias tienen 80% de similitud positiva.
Como se usa en la presente, el término "modificaciones de secuencia conservadora" se debe referir a modificaciones de aminoácido que no afectan de manera negativa o alteran la características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácido. Dichas modificaciones de secuencia conservadora incluyen sustituciones, adiciones y omisiones de nucleótido y aminoácido. Por ejemplo, se pueden introducir modificaciones por técnicas estándar conocidas en la técnica, tal como mutagénesis dirigida de sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácido conservadoras incluyen aquellas en donde el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo particular preferiblemente es reemplazado con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Los métodos de identificar nucleótido y sustituciones conservadoras de aminoácido que no eliminan unión a antígeno son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Brummell y otros, Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi y otros Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks y otros Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
"Secuencia de consenso de aminoácido" como se usa en la presente se refiere a una secuencia de aminoácido que se puede generar usando una matriz de por lo menos dos, y preferiblemente más, secuencias de aminoácido alineadas, y permitiendo huecos en la alineación, de modo que es posible determinar el residuo de aminoácido más frecuente en cada posición. La secuencia de consenso es aquella secuencia que comprende los aminoácidos que son representados con más frecuencia en cada posición. En el caso de que los dos o más aminoácidos sean representados de manera igual en una sola posición, la secuencia de consenso incluye ambos o todos de aquellos aminoácidos.
La secuencia de aminoácido de una proteína se puede analizar a varios niveles. Por ejemplo, se puede exhibir la conservación o variabilidad en el único nivel de residuo, múltiple nivel de residuo, múltiple residuo con huecos, etc. Los residuos pueden exhibir conservación del residuo idéntico o se pueden conservar al nivel de clase. Ejemplos de clases de aminoácido incluyen grupos R polares pero no cargados (serina, treonina, asparagina y glutamina); grupos R cargados positivamente (lisina, arginina e histidina); grupos R cargados negativamente (ácido glutámico y ácido aspártico); grupos R hidrofóbicos (alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina); y aminoácidos especiales (cisteína, glicina y prolina). Otras clases son conocidas a un experto en la técnica y se pueden definir usando determinaciones estructurales u otros datos para evaluar habilidad de sustitución. En ese sentido, un aminoácido sustituible puede referirse a cualquier aminoácido que se puede sustituir y mantener conservación funcional en esa posición.
Sin embargo, se reconocerá que los aminoácidos de la misma clase pueden variar en grado por sus propiedades biofísicas. Por ejemplo, se reconocerá que ciertos grupos R hidrofóbicos (por ejemplo, alanina, serina o treonina) son más hidrofílicos (es decir, de mayor hidrofilicidad o menor hidrofobicidad) que otros grupos R hidrofóbicos (por ejemplo, valina o leucina). Se puede determinar la hidrofilicidad o hidrofobicidad relativa usando métodos reconocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Rose y otros, Science, 229: 834-838 (1985) y Cornette y otros, J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
Como se usa en la presente, cuando una secuencia de aminoácido se alinea (por ejemplo, una primera secuencia de VH o VL) con una o más secuencias de aminoácido adicionales (por ejemplo, una o más secuencias de VH o VL en una base de datos), una posición de aminoácido en una secuencia (por ejemplo, la primera secuencia de VH o VL) se puede comparar a una "posición correspondiente" en la una o más secuencias de aminoácido adicionales. Como se usa en la presente, la "posición correspondiente" representa la posición equivalente en la secuencia(s) siendo comparada cuando las secuencias se alinean óptimamente, es decir, cuando las secuencias se alinean para lograr una identidad de porcentaje más alta o similitud de porcentaje.
El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una cadena o de doble cadena, pero preferiblemente es ADN de doble cadena. Un ácido nucleico se "liga operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se liga operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia. En ciertas modalidades, la invención provee moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo de la invención, una cadena ligera variable de la invención y/o una cadena pesada variable de la invención. En ciertas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica: un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera teniendo por lo menos 97% de identidad a SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 14; un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada teniendo por lo menos 95% de identidad a SEC ID NO: 5; o un anticuerpo que tiene por lo menos 96% de identidad a SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 17.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un lazo de ADN de doble cadena circular en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de réplica autónoma en una célula huésped en donde se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos teniendo un origen bacteriano de réplica y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped al introducir en la célula huésped, y por tanto se replican junto con el genoma huésped.
El término "célula huésped" se refiere a una célula en donde un vector de expresión ha sido introducido. Las células huésped pueden incluir células bacterianas, microbianas, vegetales o animales. Bacteria, que son susceptibles a transformación, incluyen miembros de la enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonela; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; neumococo; estreptococo; y Haemophilus influenzae . Los microbios adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Las líneas de célula huésped animal adecuadas incluyen CHO (líneas de ovario de hámster chino) y células NSO.
Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en la presente. Los métodos de "tratamiento" emplean administración a un sujeto, en necesidad de dicho tratamiento, un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno mediado con TNFa o un sujeto que finalmente puede adquirir dicho trastorno, a fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la severidad de, o mejorar uno o más síntomas del trastorno o trastorno recurrente, o a fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo que se espera en ausencia de dicho tratamiento.
El término "trastorno mediado con TNF" por lo general se refiere a estados y/o síntomas de enfermedad asociados con TNF, incluyendo cualquier trastorno, el comienzo, progreso o la persistencia de los síntomas del cual requiere la participación de TNF. Ejemplos de trastornos mediados con TNF incluyen, pero no se limitan a, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, fibroplasia retrolental, carcinomas de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricas, carcinomas de esófago, carcinomas colorectales, carcinomas de hígado, carcinomas de ovario, las comas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinoma del endometrio, hiperplasia del endometrio, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma , cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de nasofaringe, carcinomas de laringe, hepatoblástoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernosa, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rhabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas de tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wilm, carcinoma de célula renal, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosas, edema (tal como aquella asociada con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, artritis reumatoide, psoriasis y aterosclerosis. Los trastornos mediados con TNF también incluyen ojo seco y condiciones inflamatorias relacionadas con TNFa, tales como inflamación ocular, conjuntivitis alérgica, dermatitis, rinitis y asma, por ejemplo, e incluyen aquellos cambios celulares que resultan de la actividad de TNFa que conduce directamente o indirectamente a la condición inflamatoria relacionada con TNFa. Además, los trastornos mediados con TNF también incluyen angiogénesís ocular, enfermedad de Bechet, retinitis, glaucoma, síndrome de Sjórgen, neuropatía diabética, escleritis, queratitis y uveítis.
El término "dosis efectiva" o "dosificación efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para lograr o al menos parcialmente lograr el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente efectiva" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos parcialmente detener la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya sufre de la enfermedad. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad del trastorno siendo tratado y el estado general del sistema inmune propio del paciente.
El término "sujeto" se refiere a cualquier humano o animal no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar un sujeto con un trastorno mediado con TNF.
Los sistemas de numeración como se usan en la presente para identificar posiciones de residuo e aminoácido en regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo corresponden a aquél definido por A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670 (el sistema AHo). Las tablas de conversión entre el sistema AHo y el sistema más comúnmente usado como se define por Kabat y otros (Kabat, E. A., y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de los Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, Publicación de NIH No. 91-3242) se proveen en A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.
Como se usa en la presente, el término "agregación" se refiere al proceso de interacciones/asociaciones intermoleculares entre moléculas monoméricas en solución líquida conduciendo a la formación de especies oligoméricas. Se puede evaluar la agregación bajo condiciones de estrés usando estudios de estabilidad acelerada en una solución concentrada. Los estudios de estabilidad acelerada están diseñados para aumentar la velocidad de modificaciones de degradación, agregación o químicas de un compuesto al usar condiciones de almacenamiento extremas. Estudios de estabilidad acelerada, también conocidos como estudios de estrés, típicamente se realizan a 40°C y temperatura ambiente. Estos estudios de estabilidad proveen información valiosa con respecto al efecto de exposición a condiciones ambientales fuera de las condiciones de almacenamiento de marca normal, también conocidas como condiciones de estrés. Se usan ampliamente soluciones de alta concentración de proteína en la industria farmacéutica. El comportamiento de la solución de proteínas a concentraciones altas puede ser notablemente diferente de aquél predicho con base en análisis de solución diluida debido a no idealidad termodinámica en estas soluciones. La no idealidad observada en estos sistemas se relaciona con las interacciones de proteína-proteína (PPI). Tipos diferentes de fuerzas juegan un papel clave en determinar la naturaleza y grado globales de estos PPI y sus contribuciones relativas son afectadas por propiedades de disolución y solvente. El rol de PPI es impulsado por estas fuerzas intermoleculares para gobernar características de solución, incluyendo estabilidad física y auto-asociación de proteína y agregación. Las soluciones concentradas son aquellas soluciones en donde PPI afecta las proteínas en solución al aumentar la velocidad de oligomerización. Una solución concentrada puede tener, por ejemplo, una concentración de proteína de por lo menos 10 mg/ml.
Los productos solubles de este proceso se pueden detectar con métodos analíticos, tales como SE-HPLC. El término "modificación reductora de agregación" como se usa en la presente se refiere a una modificación, tal como una sustitución de aminoácido, que reduce la propensión de un anticuerpo de agregar en una solución líquida comparado con un anticuerpo parental como se describe en la presente. Un anticuerpo "parental" es un anticuerpo que comprende en esencia la misma secuencia como el anticuerpo correspondiente que tiene modificaciones reductoras de agregación. Por ejemplo, el anticuerpo parental puede tener las mismas CDRs como el anticuerpo modificado, y pueden tener la misma secuencia exacta como el anticuerpo modificado excepto para residuos en posición AHo 47 y/o 50 en la secuencia de cadena ligera variable, y puede diferir además en las posiciones AHo 12, 103 y 144 en la secuencia de cadena pesada variable. Otras diferencias también pueden estar presentes, siempre y cuando el anticuerpo parental no contenga las modificaciones reductoras de agregación presentes en el anticuerpo modificado de conformidad con un método de la invención.
El término "interface" como se usa en la presente se refiere a la interacción entre los dos dominios variables (dominios variables pesados y ligeros) de un anticuerpo. La interface incluye los residuos de aminoácido que participan directa o indirectamente en la interacción entre los dominios variables. Dicha interacción incluye, pero no se limita a, todas las clases de interacciones no unidas, por ejemplo, fuerzas de van der Waals, unión de hidrógeno, términos electroestáticos e interacciones hidrofóbicas entre los dos dominios.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o probando la presente invención, métodos y materiales adecuados se describen más adelante. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no deben ser limitantes.
Varios aspectos de la invención se describen en más detalle en las siguientes subsecciones. Se entiende que varias modalidades, preferencias y rangos se pueden combinar a voluntad. Además, dependiendo de la modalidad específica, definiciones seleccionadas, modalidades o rangos quizá no puedan aplicar.
En un aspecto, la presente invención provee anticuerpos que unen TNFa y de esta manera son adecuados para bloquear la función de TNFa in vivo.
En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se optimizan con una modificación(es) reductora de agregación relativa a un anticuerpo parental, de modo que un anticuerpo de la invención tiene una propensión reducida para agregar en comparación con un anticuerpo parental/no modificado. Dicha modificación(es) incluye sustituciones de aminoácido de residuos particulares que participan en la interface de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH). En algunas modalidades, la modificación reductora de agregación comprende por lo menos una sustitución de aminoácido que reduce la energía libre de la interface de VL-VH del anticuerpo parental en una propuesta de modelación in silico, como se describe en la presente. Dichas modificaciones incluyen sustituciones de aminoácido de residuos particulares que contribuyen a la energía libre de la interface de VL-VH.
En ciertas modalidades, una modificación reductora de agregación de la invención comprende una sustitución en la posición AHo 50 en la cadena VH. En una modalidad, la sustitución es una arginina (R) en la posición AHo 50. En otra modalidad, la arginina (R) en la posición AHo 50 reemplaza una lisina (K).
En otras modalidades, una modificación reductora de agregación de la invención comprende una sustitución en la posición AHo 47 en la cadena VL. En una modalidad, la sustitución es arginina (R) en la posición AHo 47. En otra modalidad, la arginina (R) en la posición AHo 47 reemplaza una lisina (K).
El sistema de numeración AHo se describe en detalle en Honegger, A. y Plückthun, A. (2001) J Mol. Biol. 309:657-670). La posición AHo 50 en la cadena ligera variable corresponde a la posición Kabat 42. La posición AHo 47 en la cadena ligera variable corresponde a la posición Kabat 39. El sistema de numeración Kabat se describe más en Kabat y otros (Kabat, E. A. y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de los Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, Publicación NIH No. 91-3242). Las tablas de conversión entre el sistema AHo y el sistema más comúnmente usado como se define por Kabat y otros se proveen en A. Honegger, J. Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.
Las siguientes tablas de. conversión se proveen para dos sistemas de numeración diferentes usados para identificar posiciones de residuo de aminoácido en regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo. El sistema de numeración Kabat se describe más en Kabat y otros (Kabat, E. A. y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de los Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, Publicación NIH No. 91-3242). El sistema de numeración AHo se describe más en Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670).
Numeración de Región Variable de Cadena Pesada Tabla 1: Tabla de conversión para las posiciones de residuo en el dominio variable de cadena pesada Kabat AHo Kabat AHo Kabat AHo 1 1 44 51 87 101 2 2 45 52 88 102 Kabat AHo Kabat AHo Kabat AHo 3 3 46 53 89 103 4 4 47 54 90 104 5 5 48 55 91 105 6 6 49 56 92 106 7 7 50 57 93 107 * 8 51 58 94 108 8 9 52 59 95 109 9 10 52a 60 96 110 10 11 52b 61 97 111 11 12 52c 62 98 112 12 13 * 63 99 113 13 14 53 64 100 114 14 15 54 65 100a 115 15 16 55 66 100b 116 16 17 56 67 100c 117 17 18 57 68 100d 118 18 19 58 69 1 OOe 119 19 20 59 70 1 OOf 1'20 20 21 60 71 100g 121 21 22 61 72 100h 122 22 23 62 73 100i 123 23 24 63 74 * 124 24 25 64 75 * 125 25 26 65 76 * 126 Kabat AHo Kabat AHo Kabat AHo 26 27 66 77 * 127 * 28 67 78 * 128 27 29 68 79 * 129 28 30 69 80 * 130 29 31 70 81 * 131 30 32 71 82 * 132 31 33 72 83 * 133 32 34 73 84 * 134 33 35 74 85 * 135 34 36 75 86 * 136 35 37 76 87 101 137 35a 38 77 88 102 138 35b 39 78 89 103 139 * 40 79 90 104 140 * 41 80 91 105 141 * 42 81 92 106 142 36 43 82 93 107 143 37 44 82a 94 108 144 38 45 82b 95 109 145 39 46 82b 96 110 146 40 47 83 97 11 147 41 48 84 98 112 148 42 49 85 99 113 149 43 50 86 100 Columna 1, posición de residuo en sistema de numeración Kabat. Columna 2, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, posición de residuo en sistema de numeración Kabat. Columna 4, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 3. Columna 5, posición de residuo en sistema de numeración Kabat. Columna 6, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 5.
Numeración de Región Variable de Cadena Ligera Tabla 2: Tabla de conversión para las posiciones de residuo en el dominio variable de cadena ligera Kabat AHo Kabat AHo Kabat AHo 1 1 43 51 83 101 2 2 44 52 84 102 3 3 45 53 85 103 4 4 46 54 86 104 5 5 47 55 87 105 6 6 48 56 88 106 7 7 49 57 89 107 8 8 50 58 90 108 9 9 * 59 91 109 10 10 * 60 92 110 Kabat AHo Kabat AHo Kabat AHo 11 11 * 61 93 111 12 12 * 62 94 112 13 13 * 63 95 113 14 14 64 95"a 114 15 15 * 65 95b 115 16 16 * 66 95c 116 17 17 51 67 95d 117 18 18 52 68 95e 118 19 19 53 69 95f 119 20 20 54 70 * 120 21 21 55 71 * 121 22 22 56 72 * 122 23 23 57 73 * 123 24 24 58 74 * 124 25 25 59 75 * 125 26 26 60 76 * 126 27 27 61 77 * 127 * 28 62 78 * 128 27a 29 63 79 * 129 27b 30 64 80 * 130 27c 31 65 81 * 131 27d 32 66 82 * 132 27e 33 67 83 * 133 27f 34 68 84 * 134 Kabat AHo Kabat AHo Kabat AHo * 35 * 85 * 135 28 36 * 86 * 136 29 37 69 87 96 137 30 38 70 88 97 138 31 39 71 89 98 139 32 40 72 90 99 140 33 41 73 91 100 141 34 42 74 92 101 142 35 43 75 93 102 143 36 44 76 94 103 144 37 45 77 95 104 145 38 46 78 96 105 146 39 47 79 97 106 147 40 48 80 98 107 148 41 49 81 99 108 149 42 50 82 100 Columna 1, posición de residuo en sistema de numeración Kabat. Columna 2, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, posición de residuo en sistema de numeración Kabat. Columna 4, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 3. Columna 5, posición de residuo en sistema de numeración Kabat. Columna 6, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 5.
Los anticuerpos de la invención pueden comprender modificaciones adicionales según se desee Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede comprender sustituciones de aminoácido para reducir su inmunogenicidad in vivo de acuerdo con los métodos descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente de E.U.A. No. 12/973,968 y/o sustituciones para potenciar la solubilidad del anticuerpo, como se describe en WO 09/155725. De esta manera, en una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende Serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo); Serina (S) o Treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y/o Serina (S) o Treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo). Adicionalmente, el anticuerpo puede comprender Serina (S) o Treonina (T) en las posiciones 97, 98 y/o 99 de cadena pesada (numeración AHo). Preferiblemente, el anticuerpo comprende Serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo), Treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y Treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo).
En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la cadena ligera variable: SEC ID NO. 1 EIV TQSPSTLSASVGDRVllTC(X)n=1.5oWYQQ PGRAPK:LLIY (X)n=,.5oGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=I. soFGQGT LTVLG En una modalidad preferida, un anticuerpo de la invención comprende la cadena ligera variable (las CDRs están subrayadas): SEC ID NO. 2: EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC SSOSVYGNIWMAWYOO PGRAP LLIYOASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCOGN FNTGDRYAFGOGT LTVLG En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la cadena pesada variable: SEC ID NO. 3: estructura de cadena pesada variable EVGLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)„=i-5oWVRQAPGKGLEWG (X)„_ i .50RFTI S RDTSK.NTV Y LQMNSLRAEDTAV YYCAR(X)„„|. so WGQGTLVTV SS Todavía en otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la estructura de cadena pesada variable SEC ID NO. 4: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=|.5oWVRQAPGKGLEWVG (X)„=,.5o FTIS DTS NTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n = 1. soWGQGTLVTVSS En una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención comprende la cadena pesada variable (las CDRs están subrayadas): SEC ID NO. 5: EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVROAPGK.GL EWVGC1YGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTS NTVYLOMNSLRAE DTAYYCARLGYADYAYDLWGOGTTVTVSS - Como se usa en la presente, los residuos X son sitios de inserción de CDR, X puede ser cualquier aminoácido que ocurre de manera natural; pueden estar presentes por lo menos tres y hasta 50 aminoácidos.
En una modalidad, la estructura de cadena ligera variable de un anticuerpo de la invención comprende SEC ID NO: 1 y la estructura de cadena pesada variable comprende SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4.
En otra modalidad, la estructura de cadena ligera variable de un anticuerpo de la invención comprende una secuencia que tiene por lo menos 65% de identidad, más preferible por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% identidad, a SEC ID NO: 1. Muy preferible, dicha secuencia tiene una arginina (R) en la posición 50 AHo. En otra modalidad, dicha secuencia tiene una arginina (R) en la posición 47 AHo.
En otra modalidad, la estructura de cadena pesada variable de un anticuerpo de la invención comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad, más preferible por lo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% de identidad, a SEC ID NO. 3. Preferiblemente, dicho anticuerpo comprende Serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo), Treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y Treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo).
En otra modalidad, la estructura de cadena ligera variable de un anticuerpo de la invención comprende una secuencia que tiene por lo menos 97%, 98%, más preferible 99% de identidad, a SEC ID NO.2 o SEC ID NO.4.
En otra modalidad, la estructura de cadena pesada variable de un anticuerpo de la invención comprende una secuencia que tiene por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% de identidad, SEC ID NO. 5.
En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una secuencia que tiene por lo menos 96%, 97%, 98%, más preferible 99% de identidad, a SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 17.
En otra modalidad, la estructura de cadena ligera variable de un anticuerpo de la invención comprende SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 14, y la estructura de cadena pesada variable comprende SEC ID NO: 5.
En una modalidad, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención son anticuerpos de una cadena (scFv) o fragmentos Fab. En el caso de anticuerpos scFv, un dominio de VL se puede entrelazar a un dominio de VH en cualquier orientación por un enlazador flexible. Un estado adecuado del enlazador de la técnica consiste de secuencias de aminoácido GGGGS repetidas (SEC ID NO: 6) o variantes de las mismas. En una modalidad preferida de la presente invención, se usa un enlazador (GGGGS)4 (SEC ID NO:7) o su derivado, pero variantes de 1-3 repeticiones también son posibles (Holliger y otros (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Otros enlazadores que se pueden usar para la presente invención se describen por Alfthan y otros (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi y otros (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu y otros (1996), Cáncer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov y otros (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers y otros (2001), Cáncer Immunol. Immunother. 50:51-59. La distribución puede ser VL-enlazador-VH o VH-enlazador-VL, con la primera orientación siendo la preferida. En el caso de fragmentos Fab, los dominios variables de cadena ligera seleccionados VL se fusionan a la región constante de una cadena de Ig kappa humano, mientras que los dominios variables de cadena pesada VH adecuados se fusionan al primer dominio constante (N-terminal) CH1 de un IgG humano. En la terminal C, se forma un puente de disulfuro de inter-cadena entre los dos dominios constantes.
De esta manera, en una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 8: El VMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n„,.5oWYQQ PG AP LLI Y (X)n=i-5oGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n_i. 50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCTAS(X)n = , .50WVRQAPG GLEWVG(X)n=|. 50 FTISRDTS NTVYLQ NSLRAEDTAVYYCAR(X)n,|. 50WGQGTLVTVSS En otra modalidad, un anticuerpo de- la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 9: El V TQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=i-50WYQQRPG AP LLIY (X)„=,.5oGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=|. 50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCTVS(X)n=,.50WVRQAPG GLEWVG(X)n = i - 50RFTI S DTS NTVYLQMNSLRAEDTAV Y YC AR(X)n=| . soWGQGTLVTVSS En una modalidad preferida, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 10: (34rFW1.4_VL_K50R_DHP): El V TQSPSTLS ASVGD V1 ITCQSSQS V YGN IWMAWYQQ PGRAP LLIYQAS LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGN FNTGDRYAFGQGT LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE SGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICW VRQAPG GLEWVGCI YGDNDITPLYANWA GRFTISRDTS NTVYLQ SLRAEDTATYYC ARLG Y A DY A YDLWGQGTTVTVSS En una modalidad, un anticuerpo de la invención - com prende la cadena ligera variable: SEC ID NO. 11: estructura de cadena ligera variable de FW1.4 (K127) EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n = ,.5oWYQQKPGKAP LLIY (X)n=,.5oGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=i. soFGQGTKLTVLG En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la cadena ligera variable: SEC ID NO. 12: estructura de cadena ligera variable sustituida de FW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n = |.50WYQQ PG AP LLIY (X)n = ,_5oGVPS FSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=|. soFGQGTKLTVLG Todavía en otra modalidad preferida, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 13: EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X)„=1.50W YQQRPG AP LLI Y (X)n = i-5oGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X)„-i- 50FGQGT LTVLG En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la cadena ligera variable (las CDRs están subrayadas): SEC ID NO. 14: EIV TQSPSTLSASVGDRVIITCOSSOSVYGNIWMAWYOORPG AP KLLIYOASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLT1SSLOPDDFATYYCOGN FNTGDRYAFGOGT LTVL De esta manera, en una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 15: EIV TQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=,.5oWYQQRPG AP LLIY (X)„=, 50GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1. s FGQGT LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCTAS(X)n=l.5oWVRQAPG GLEWVG(X)„ = ,. soRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAV Y YCAR(X)n=,. soWGQGTLVTVSS En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 16: EIV TQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=i.50WYQQRPG APKLLIY (X)n=i.5(,GV SRFSGSGSGTEFTLTlSSLQPDDFATYYC(X)n=1. soFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCTVS(X)n=,.5oWVRQAPG GLEWVG(X)n = I. 5t>RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n=i. soWGQGTLVTVSS Eri una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 17: (34rFW1.4_VL_K47R_DHP): El VMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNI WMAWYQQRPG AP LLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGN FNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE SGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCI YGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTS NTVYLQMNSLRAEDTATYYC ARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS Todavía en otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEC ID NO. 18: (34rFW1.4) El VMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNI WM AW YQQ PG AP LLI YQAS LASG VPS FSGSGSG A EFTLTISSLQPDDFATYYCQGN FNTGDRYAFGQGT LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE SGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPG GLEWVGC1 YGDNDITPLYAN WAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYC ARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS En una modalidad, la VL de un anticuerpo parental es o comprende SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12 o una secuencia que tiene por lo menos 65% de identidad, más preferible 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% a SEC ID NO": 11 o SEC ID NO: 12. En otra modalidad preferida, la VH del anticuerpo parental es o comprende SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4 una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad, más preferible 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% a SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4.
Un anticuerpo de la invención que comprende una modificación reductora de agregación comprende de preferencia una o más CDRs de un anticuerpo de conejo. Como es sabido en la técnica, CDRs de conejo son diferentes de CDRs de humano o roedor; pueden contener residuos de cisteína que se ligan con disulfuro a la estructura o forman puentes S-S interCDR. Además, CDRs de conejo a menudo no pertenecen a cualquier estructura canónica previamente conocida.
La presente invención también muestra moléculas bivalentes y biespecíf ¡cas que comprenden un anticuerpo anti-TNFa, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antigeno del mismo, se pueden derivar o enlazar a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que une a por lo menos dos sitios de unión diferentes o moléculas diana. El anticuerpo de la invención se puede derivar o enlazar a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíf icas que unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas diana; dichas moléculas multiespecíf icas también deben estar abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se usa en la presente. Ejemplos no limitantes de moléculas biespecíf icas incluyen un diacuerpo, un diacuerpo de una cadena, y un anticuerpo tándem, como es sabido a aquellos expertos en la técnica.
Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o diferente) a una o más otras moléculas de unión, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, antígenos específicos tumorales o específicos patógenos, péptido o mimética de unión, de modo que resulta una molécula biespecífica. Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíf ¡cas que comprenden por lo menos una primera molécula de unión teniendo especificidad para TNFa y una segunda molécula de unión teniendo especificidad para uno o más epítopos diana adicionales.
En una modalidad, las moléculas biespecif icas de la invención comprenden una especificidad de unión por lo menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de una cadena. El anticuerpo también puede ser un dimero de cadena ligera o cadena pesada, o Cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de una cadena como se describe en Ladner y otros, patente de E.U.A. No. 4,946,778, los contenidos de la cual se incorpora expresamente a la presente por referencia.
Aunque se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecif icas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.
Las moléculas biespecif icas de la presente invención se pueden preparar al conjugar las especificidades de unión constituyentes usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y después conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de acoplamiento o agentes entrelazadores para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de entrelazamiento incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenileno-dimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carboxilato de sulfo- succinimidilo (sulfo-SMCC) (ver, por ejemplo, Karpovsky y otros (1984) J. Exp. Med. 160:1686: Liu, MA y otros (1985) Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 82/.8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan y otros (1985) Science 229:81-83). y Glennie y otros (1987) J. Immunol. 139:2367-2375). Agentes conjugadores preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar vía unión de sulfhidrilo, por ejemplo, vía las regiones de gozne de terminal C de las dos cadenas pesadas u otros sitios, ya sea que ocurran de manera natural o se introducen artificialmente. En una modalidad particularmente preferida, la región de gozne se modifica para contener un número non de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y expresar y ensamblar en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil en donde la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab proteína de fusión. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una cadena que comprende un anticuerpo de una cadena y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de una cadena que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender por lo menos dos moléculas de una cadena. Además, una molécula biespecífica puede ser un scFv que específicamente se une a una primera diana, en donde la VH y VL de dicho scFv se enlazan con un enlazador flexible que comprende un dominio que provee unión específica a una segunda diana. Se describen enlazadores adecuados, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2010/006454. Se describen métodos para preparar moléculas biespecíficas, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,260,203; patente de E.U.A. No. 5,455,030; patente de E.U.A. No. 4,881,175; patente de E.U.A. No. 5,132,405; patente de E.U.A. No. 5,091,513; patente de E.U.A. No. 5,476,786; patente de E.U.A. No. 5,013,653; patente de E.U.A. No. 5,258,498; y patente de E.U.A. No. 5,482,858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar, por ejemplo; por ensayo ¡nmunosorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición de crecimiento), o por ensayo inmunoblot. Cada uno de estos ensayos en general detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular al emplear un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, se pueden -detectar los complejos de TNF-anticuerpo usando, por ejemplo, un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y específicamente une a los complejos de anticuerpo-TNF. Alternativamente, se pueden detectar los complejos usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar radioactivamente y se usa en un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Séptimo Curso de Entrenamiento en Técnicas de Ensayo de Radioligando, La Sociedad Endocrina, Marzo 1986, que se incorpora a la presente por referencia). El isótopo radioactivo se puede detectar por dicho medio como el uso de un contador ? o un contador de centelleo o por autoradiografía.
En otro aspecto, la invención provee un método para producir los anticuerpos descritos en la presente. Los métodos para producir anticuerpos que tienen propensión reducida para agregar en solución como se provee en la presente se basan en la observación sorprendente que a través de la modulación de la interacción de dominio de anticuerpo entre la propensión de agregación de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos se puede reducir, y que mutaciones reductoras de agregación se pueden predecir confiablemente al determinar la energía libre de la interface de VL/VH definida como la diferencia entre la energía del anticuerpo (tal como un scFv) y los dominios variables individuales. Como se muestra en la presente, sustituciones reductoras de agregación que modulan interacción de dominio de anticuerpo al reducir la energía libre entre los dominios variables se pueden hacer sin afectar la estabilidad o actividad de unión del anticuerpo.
En una modalidad, un método de la invención comprende los pasos de: (i) proveer un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH); (ii) identificar una o más posiciones de residuo que participan en la interface entre la cadena ligera variable (VL) y la cadena pesada variable (VH) del anticuerpo; y (iii) modificar el anticuerpo al introducir una sustitución en la posición(es) de residuo identificado de modo que la sustitución(es) reduce la energía libre entre los dominios de VL y los de VH por al menos 0.5 kcal/mol, preferiblemente por lo menos 1.0 kcal/mol, y muy preferible al menos 2.0 kcal/mol (es decir, la energía libre entre los dominios de VL y VH con la sustitución es por lo menos 0.5 kcal/mol menos que la energía libre entre los dominios de VL y VH correspondientes que no comprenden la sustitución de aminoácido), por tanto reduciendo la propensión de agregación del anticuerpo modificado en comparación con aquél de un anticuerpo parental.
Como se delineó antes, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un Fab, un F(ab)'2, Fv de una ca'dena (scFv), un fragmento Fv, un diacuerpo, un diacuerpo de una cadena, un anticuerpo tándem, o un anticuerpo lineal; en una modalidad preferida, el anticuerpo es un Fv de una cadena (scFv).
En una modalidad preferida, la identificación de la una o más posiciones de residuo que participan en la interface entre la cadena ligera variable y la cadena pesada variable del anticuerpo (es decir, paso (¡i)) involucra la determinación de la energía libre entre la interface de VL - VH. Esto se puede realizar al usar programas bioinformáticos comúnmente conocidos. Un ejemplo de un programa bioinformático adecuado es CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics - Química en Mecánica Macromolecular de Harvard).
Para el propósito de determinar la energía libre entre la interface de VL - VH, típicamente, se provee una presentación molecular atomística completa de la proteína. La energía libre de la interface es la diferencia de energía entre el anticuerpo entero que comprende ambos dominios variables VL y VH y la suma de las energías de los dominios individuales en el contexto de un método solvente implícito. Esto involucra tres cálculos de energía únicos, (1) en el anticuerpo G(a); (2) en la VL G(b); y (3) en la VH G(c). Por consiguiente, la energía libre de la interface es G interface = G(a) - G(b) - G(c) En una modalidad, el método solvente implícito es GBMV o PBSA como es sabido en la técnica.
La determinación de energía libre puede comprender además el paso de simular la distribución de carga de la proteína. Dicha distribución de carga se puede simular con base en fuerzas electroestáticas o de van der Waals.
Para determinar una modificación adecuada, uno o más residuos de aminoácido que participan en la interface se pueden elegir para sustitución. Por ejemplo, un modelo molecular de la proteína que comprende la una o más sustituciones (por ejemplo, cambiar uno o más residuos a alanina) en las posiciones seleccionadas se genera y se determina la energía libre de la interface de la presentación molecular sustituida, si la energía libre de la interface del modelo molecular sustituido es menor que . la energía libre de la interface del modelo molecular inicial, el residuo de aminoácido se selecciona para sustitución. Dentro del contexto de CHARMm, se pueden construir mutaciones, por ejemplo, con el protocolo Build Mutants. La una o más sustituciones en el modelo molecular puede estar en las posiciones que son conocidas o se sospecha están involucradas en la interface de VL/VH.
En una modalidad, se realiza un paso adicional de minimización de energía del modelo molecular que comprende la una o más sustituciones en la posición(es) seleccionada en el área alrededor de la mutación(es). Dicha área se puede ajusfar a 10 Angstroms.
En una modalidad, una posición de residuo identificada para sustitución es ocupada por un aminoácido cargado.
Un anticuerpo producido por un método de la invención puede comprender cualquier cadena ligera o cadena pesada variable adecuada como es sabido en la técnica, y comprende de preferencia al menos una CDR de un anticuerpo de conejo. En la presente se describen ciertas cadenas ligeras y pesadas variables preferidas.
Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede comprender: una estructura de anticuerpo VL teniendo por lo menos 65% de identidad, más preferible 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% a SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12, que comprende además árginina (R) en la posición AHo 47 y/o en la posición AHo 50 de la cadena liger.a variable; y una estructura de anticuerpo VH teniendo por lo menos 80% de identidad, más preferible, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% a SEC ID NO: 3.
La modificación de la una o más posiciones de residuo se hace preferiblemente de conformidad con las enseñanzas de PCT/CH2008/000285, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. En breve, para un subtipo de anticuerpo dado, ciertos aminoácidos están presentes en posiciones de residuo específicas de la estructura de anticuerpo. Por ejemplo, a) para una región variable de cadena pesada VH3 humano, los aminoácidos preferidos son: (i) glutamina (Q) en la posición 1 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (ii) glutamina (Q) en la posición 6 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (iii) treonina (T) o alanina (A) en la posición 7 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (iv) alanina (A), valina (V) o fenilalanina (F) en la posición 89 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 78 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); y/o (v) arginina (R), glutamina (Q), isoleucina (I), leucina (L), metionina (M) o fenilalanina (F) en la posición 103 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 89 de aminoácido usando numeración Kabat); para una región variable de cadena pesada de la familia de VH1a humano, los aminoácidos preferidos son: (i) ácido glutámico (E) en la posición 1 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (ii) ácido glutámico (E) en la posición 6 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (iii) leucina (L) en la posición 12 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 11 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (iv) metionina (M) en la posición 13 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 12 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (v) ácido glutámico (E) o glutamina (Q) en la posición 14 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 13 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (vi) leucina (L) en la posición 19 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 18 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (vi¡) ¡soleucina (I) en la posición 21 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 20 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (viii) fenilalanina (F), serina (S), histidina (H) o ácido aspártico (D) en la posición 90 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 79 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (ix) ácido aspártico (D) o glutamina (Q) en la posición 92 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 81 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (x) glicina (G), asparagina. (N) o treonina (T) en la posición 95 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 82b de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xi) treonina (T), alanina (A), prolina (P) o fenilalanina (F) en la posición 98 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 84 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); para una región variable de cadena pesada de la familia de VH1b humano, los aminoácidos preferidos son: (i) ácido glutámico (E) en la posición 1 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (ii) treonina (T), prolina (P), valina (V) o ácido aspártico (D) en la posición 10 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 9 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (¡ii) leucina (L) en la posición 12 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 11 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (iv) valina (V), arginina (R), glutamina (Q) o metionina (M) en la posición 13 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 12 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (v) ácido glutámico (E), arginina (R) o metionina (M) en la posición 14 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 13 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (vi) arginina (R), treonina (T) o asparagina (N) en la posición 20 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 19 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (vii) ¡soleucina (I), fenilalanina (F) o leucina (L) en la posición 21 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 20 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (viii) lisina (K) en la posición 45 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 38 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (¡x) treonina (T), prolina (P), valina (V) o arginina (R) en la posición 47 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 40 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (x) Usina (K), histidina (H) o ácido glutámico (E) en la posición 50 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 43 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xi) isoleucina (I) en la posición 55 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 48 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xii) Usina (K) en la posición 77 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 66 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xüi) alanina (A), leucina (L) o isoleucina (I) en la posición 78 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 67 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xiv) ácido glutámico (E), treonina (T) o alanina (A) en la posición 82 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 71 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xv) treonina (T), serina (S) o leucina (L) en la posición 86 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 75 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xvi) ácido aspártico (D), asparagina (N) o glicina (G) en la posición 87 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 76 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xvii) asparagina (N) o serina (S) en la posición 107 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 93 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); para una región variable de cadena ligera de la familia de Vkappal humano, los aminoácidos preferidos son: (i) ácido glutámico (E) o isoleucina (I) en la posición 1 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (ii) valina (V) o isoleucina (I) en la posición 3 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (iii) valina (V), leucina (L) o isoleucina (I) en la posición 4 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (¡v) glutamina (Q) en la posición 24 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (v) arginina (R) o isoleucina (I) en la posición 47 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 39 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (vi) arginina (R), ácido glutámico (E), treonina (T), metionina ( ) o glutamina (Q) en la posición 50 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 42 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (vii) histidina (H), serina (S) o fenilalanina (F) en la posición 57 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 49 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (viii) fenilalanina (F) en la posición 91 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 73 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (ix) valina (V), serina (S), glicina (G) o isoleucina (I) en la posición 103 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 85 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); para una región variable de cadena ligera de la familia de Vkappa3 humano, los aminoácidos preferidos son: (i) treonina (T) en la posición 2 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (ii) treonina (T) en la posición 3 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (iii) isoleucina (I) en la posición 10 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (iv) tirosina (Y) en la posición 12 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (v) serina (S) en la posición 18 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (vi) alanina (A) en la posición 20 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (vii) metionina (M) en la posición 56 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 48 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (viii) valina (V) o treonina (T) en la posición 74 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 58 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (ix) asparagina (N) en la posición 94 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 76 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (x) tirosina (Y) o serina (S) en la posición 101 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 83 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xi) leucina (L) o alanina (A) en la posición 103 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 85 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); para una región variable de cadena ligera de la familia de Vlambdal humano, los aminoácidos preferidos son: (i) leucina (L), serina (S) o ácido glutámico (E) en la posición 1 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (ii) alanina (A), prolina (P), isoleucina (I) o tirosina (Y) en la posición 2 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (iii) valina (V) o metionina (M) en la posición 4 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (¡v) ácido glutámico (E) en la posición 7 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (v) alanina (A) en la posición 11 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (vi) treonina (T) o serina (S) en la posición 14 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o Kabat; (vii) histidina (H) en la posición 46 de aminoácido usando sistema de numeración AHo 46 (posición 38 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (viii) treonina (T), serina (S), asparagina (N), glutamina (Q) o prolina (P) en la posición 53 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 45 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (ix) arginina (R) o glutamina (Q) en la posición 82 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 66 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (x) glicina (G), treonina (T) o ácido aspártico (D) en la posición 92 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición '74 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat); (xi) valina (V), treonina (T), histidina (H) o ácido glutámico (E) en la posición 103 de aminoácido usando sistema de numeración AHo (posición 85 de aminoácido usando sistema de numeración Kabat).
Por consiguiente, las sustituciones hechas en el presente método siguen preferiblemente las enseñanzas de PCT/CH2008/000285. La determinación de subtipo es conocida al experto en la técnica.
En una modalidad, un método de la invención comprende modificación de un anticuerpo en la posición 47 y/o 50 AHo de la cadena ligera variable, en particular de una cadena ligera variable de Vkappal. Preferiblemente, el anticuerpo se modifica para comprender arginina (R) en la posición 47 AHo y/o posición 50 AHo de la cadena ligera variable. En algunas modalidades, Usina (K) se sustituye por arginina (R) en la posición 47 AHo y/o posición 50 AHo de la cadena ligera variable. Ya que los anticuerpos de la invención pueden comprender modificaciones adicionales según se desee, los métodos de la invención pueden comprender el paso adicional de modificar el anticuerpo tal como para comprender Serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo); Serina (S) o Treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo). Adicionalmente, el anticuerpo se puede modificar para comprender Serina (S) o Treonina (T) en las posiciones 97, 98 y/o 99 de cadena pesada (numeración AHo). Preferiblemente, el método comprende el paso de modificar el anticuerpo para comprender Serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo), Treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y Treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo).
La invención provee además un método de generar un anticuerpo humanizado con una propensión baja para agregar en solución, el método que comprende seleccionar una estructura de cadena ligera variable que comprende arginina (R) en la posición 47 AHo y/o en la posición 50 AHo. El método puede comprender además seleccionar una estructura de cadena pesada variable que comprende una serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo); serina (S) o treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y/o serina (S) o treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo). En una modalidad, una estructura identificada con base en un criterio de selección elegido se puede modificar más con una modificación reductora de agregación de la invención. Por ejemplo, si se identifica una estructura de cadena ligera variable que tiene una arginina (R) en la posición 50, el residuo en la posición AHo se puede sustituir con un aminoácido diferente, tal como arginina (R), o si se identifica una cadena pesada variable que tiene una serina (S) en la posición 12 AHo, los residuos en las posiciones 103 y 144 AHo se pueden sustituir con treoninas.
Como se usa en la presente, un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que comprende CDRs no humanas y secuencias de estructura de humano o cadena pesada variable derivada de humano y/o de humano o cadena ligera variable derivada de humano. La humanización de anticuerpos es bien conocida en la técnica. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende por lo menos una, y preferiblemente seis, CDRs de un anticuerpo producido en un conejo o seleccionado a partir de una colección de CDR.
Se pueden seleccionar las estructuras de anticuerpo variable a partir de, por ejemplo, una base de datos (tal como la base de datos Kabat, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), VBASE (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), VBASE2 (http://vbase2.org/), la base de datos Kabat de secuencias de proteínas de interés inmunológico (http://www.kabatdatabase.com/index.html), el recurso de proteína universal (UniProt; http://pir.georgetown.edu/), y base de datos Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abs/), con base en identidad y/o similitud con las secuencias de estructura variable del anticuerpo del cual las CDRS se originaron, y con base en secuencia(s) de estructura de lo contrario preferida.
Varios programas de computación están disponibles para buscar secuencias de estructura humana adecuadas que cumplan el requerimiento(s) seleccionado. Por ejemplo, "KabatMan" es una versión que se puede buscar en computadora de los datos de secuencia de anticuerpo Kabat del libro Sequences of Immunological Interest. El programa KabatMan es descrito en el documento: Martin (1996) "Accessing the Kabat Antibody Sequence Datábase" por Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25, 130-133, y esta disponible en http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html, y http://www.bioinf.org.uk/abs/kabatman.html. La base de datos Abysis, en http://www.bioinf.org.uk/abysis/, integra datos de secuencia de Kabat, IMGT y PDB con datos estructurales de la PDB. Provee una ¡nterface comprensiva de apuntar y hacer clic que permite a una persona buscar los datos de secuencia en varios criterios y mostrar resultados en formatos diferentes. Para datos de la PDB, se pueden combinar búsquedas de secuencia con restricciones estructurales.
En otro aspecto, la invención provee un anticuerpo generado por el método descrito en la presente. En una modalidad preferida, dicho anticuerpo comprende una estructura de anticuerpo VL teniendo por lo menos 80% de identidad, más preferible 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% a SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 13; preferiblemente, el anticuerpo comprende arginina (R) en la posición 47 AHo y/o en la posición 50 AHo de la cadena ligera variable.
Adicional o alternativamente, la estructura de anticuerpo VH es o comprende SEC ID NO: 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad, más preferible, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferible 99% a SEC ID NO: 3.
En ciertas modalidades, la invención provee además (1) Un método para reducir la propensión de agregación de un anticuerpo siendo un complejo heterodimérico que comprende dominios variables pesados y ligeros, el método que comprende los pasos de: (a) proveer una presentación molecular atomística completa del anticuerpo; (b) determinar la energía libre de la interface entre ambos dominios; (c) elegir uno o más residuos de aminoácido que participan en la interface para sustitución al proveer un modelo molecular del anticuerpo que comprende la una o más sustituciones en las posiciones seleccionadas y determinando la energía libre de la interface de la presentación molecular sustituida; (d) seleccionar un residuo de aminoácido para sustitución si la energía libre de la interface del modelo molecular sustituido es menor que la energía libre de la interface del modelo molecular inicial; Un método de (1), en donde la energía libre de la interface se determina al calcular la diferencia de energía entre el complejo y la suma de las energías de los dominios individuales en el contexto de un método de solvente implícito; El método de (2), en donde el solvente es GBMV o PBSA; El método de cualquiera de (1)-(3) precedentes, que comprende además el paso de (i) simular la distribución de carga de la proteína, en donde dicho paso se realiza dentro del paso a y b; El método de (4), en donde la distribución de carga se simula con base en fuerzas electroestáticas o de van der Waals; (6) El método de cualquiera de (1)-(5) precedentes, en donde el paso (c) comprende el paso adicional de minimización de energía en el área alrededor de la mutación; (7) El método de cualquiera de (1)-(7) precedentes, en donde el anticuerpo es un fragmento variable de una cadena (scFv) .
Se pueden generar anticuerpos de la invención usando técnicas de rutina en el campo de genética recombinante. Conociendo las secuencias de los polipéptidos, los cADNs codificándolos se pueden generar por síntesis genética pro métodos bien conocidos en la técnica. Estos cADNs se pueden clonar en plásmidos de vector adecuados.
Las técnicas estándar de clonación y mutagénesis bien conocidas al experto en la técnica se pueden usar para agregar enlazadores, dominios de traslado o fusiones de construcción para la producción de fragmentos Fab. Se describen protocolos básicos que describen los métodos generales de esta invención en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3a ed. 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, 1999).
La secuencia de ADN que alberga un gen codificando un polipéptido scFv, o en el caso de fragmentos Fab, codificando dos genes separados o un operón bi-cistrónico que comprende los dos genes para las fusiones de VL-Ck y VH-CH1 se clonan en un vector de expresión adecuado, preferiblemente uno con un promotor ¡nducible. Se debe tener cuidado que frente a cada gen hay un sitio de unión de ribosoma apropiado que asegura traducción. Se debe entender que los anticuerpos de la presente invención comprenden las secuencias descritas en vez de que consistan de ellas. Por ejemplo, las estrategias de clonación pueden requerir que una construcción esté hecha de lo que un anticuerpo con uno o pocos residuos adicionales en la termina N están presentes. Específicamente, la metionina derivada del codón de inicio puede estar presente en la proteína final en casos en donde no se ha cortado de manera post-traducción. La mayoría de las construcciones para anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo terminal N. En una modalidad preferida de la presente invención, un vector de expresión para expresión periplásmica en E. coli se elige (Krebber, 1997). Dicho vector comprende un promotor frente a una secuencia de señal que se puede cortar. La secuencia codificadora para el péptido de anticuerpo entonces se fusiona en marco a la secuencia de señal que se puede cortar. Esto permite la focalización del polipéptido expresado al periplasma bacteriano en donde se corta la secuencia de señal. Entonces se dobla el anticuerpo. En el caso de los fragmentos Fab, tanto los péptidos de fusión VL-CK como VH-CH1 se deben enlazar a una señal de exportación. El enlace S-S covalente se forma en las cisteínas de terminal C después de que los péptidos hayan alcanzado el periplasma. Si se prefiere expresión citoplásmica de anticuerpos, dichos anticuerpos usualmente se pueden obtener a rendimientos altos de cuerpos de inclusión, que se pueden separar con facilidad de otros fragmentos celulares y proteína. En este caso, los cuerpos de inclusión se solubilizan en un agente desnaturalizante tal como, por ejemplo, clorhidrato de guaridina (GndHCI) y después se vuelve a doblar por procedimientos de renaturación bien cónocidos a aquellos expertos en la técnica.
Los plásmidos que expresan los polipéptidos scFv o Fab son introducidos en un huésped adecuado, preferiblemente una célula bacteriana, de levadura o mamífero, muy preferible una cepa de E. coli adecuada como, por ejemplo, JM83 para expresión periplásmica o BL21 para expresión en cuerpos de inclusión. El polipéptido se puede cosechar del periplasma o formar cuerpos de inclusión y purificados usando técnicas estándar tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de fase invertida, cromatografía de afinidad y/o filtración de gel conocidas al experto en la técnica.
Los anticuerpos de la invención se pueden caracterizar con respecto al rendimiento, solubilidad y estabilidad in vitro. Por ejemplo, capacidades de unión hacia TNF, preferiblemente hacia TNFa humano, se pueden probar in vitro por ELISA o resonancia de plasmón superficial (BIACore), usando TNF humano recombinante como se describe en W09729131, el último método también permitiendo determinar el constante de velocidad koff, que debería ser preferiblemente de menos de 10~3s"1. Se prefieren valores Kd de < 10 nM.
En una modalidad, la presente invención provee anticuerpos que unen TNFa y de esta manera son adecuados para bloquear la función de TNFa in vivo. En una modalidad particular, el anticuerpo anti-TNFa comprende la secuencia SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 17.
Para aplicaciones terapéuticas, anticuerpos anti-TNF de la invención son administrados a un mamífero, preferiblemente un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tales como aquellas discutidas antes, incluyendo aquellas que se pueden administrar a un humano intravenosamente como una inyección intravenosa rápida o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por ruta intramuscular, intraperitonea I , intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, intraocular, intranasal, ótica, sublingual, transdérmica o inhalación, por ejemplo. Los anticuerpos también son administrados de manera adecuada por rutas intratumorales, péritumorales, ¡ntralesionales o perilesionales, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se definió antes, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea el anticuerpo administrado para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico. El anticuerpo es administrado de manera adecuada al paciente una sola vez o sobre una serie de tratamientos.
Anticuerpos anti-TNF de la invención son útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas con TNF. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria o semanal típica puede variar de alrededor de 1 ng kg a aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados antes. Para administraciones repetidas sobre varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es repetido hasta que ocurra una supresión deseada de síntomas de enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitorea con facilidad por técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, escaneo de tumor radiográfica.
De acuerdo con otra modalidad de la invención, la efectividad del anticuerpo para prevenir o tratar una enfermedad se puede mejorar al administrar el anticuerpo en serie o en combinación con otro agente que sea efectivo para aquellos propósitos, tal como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica de factor de crecimiento de fibroblasto ácido o básico (FGF) o factor de crecimiento de hepatocito (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes de factor de tejido, proteína C o proteína S (ver Esmon y otros, publicación de patente de PCT No. WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unir a receptor HER2 (ver Hudziak y otros, publicación de patente de PCT No. WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas de ácido fólico, anti-metabolitos de metabolismo de ácido nucleico, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracil, cisplatina, nulceósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticoesteroides. Dichos otros agentes pueden estar presentes en la composición siendo administrada o se pueden administrar por separado. También, el anticuerpo se administra de manera adecuada en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, ya sea involucrando irradiación o administración de sustancias radioactivas.
Se pueden usar anticuerpos de la invención como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado hace' contacto con una muestra que contiene una proteína diana (o fragmento de la misma) que el anticuerpo une, tal como TNF en el caso de anticuerpos anti-TNFa, a purificarse, y después el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína diana, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, tal como regulador de glicina, pH 5.0, que liberará la proteína diana del anticuerpo.
También pueden ser útiles anticuerpos en ensayos diagnósticos para una proteína diana, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos o suero. Dichos métodos diagnósticos pueden ser útiles en diagnóstico de cáncer.
Para aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo típicamente será marcado con una porción detectable. Numerosas etiquetas están disponibles que por lo general se agrupan en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 111ln, "Te, 1 C, 31l, 125l, 3H, 32P o 35S. El anticuerpo se puede marcar con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols ¡n Immunology, volúmenes 1 y 2, Coligen y otros, Ed. Wiley-I nterscience, Nueva York, N.Y., Pubs. (1991), por ejemplo, y se puede medir radioactividad usando conteo de centelleo. (b) Etiquetas fluorescentes tales como quelatos de tierra rara (quelatos de europio) o fluoresceína o sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lissamina; ficoeritrina y Texas Red están disponibles. Las etiquetas fluorescentes se pueden conjugar al anticuerpo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. Se puede cuantificar la fluorescencia usando un fluorímetro. (c) Varias etiquetas de sustrato de enzima están disponibles y la patente de E.U.A. No. 4,275,149 provee una revisión de algunas dé éstas. La enzima por lo general cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que se puede medir usando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. De manera alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Se describieron antes técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y entonces puede emitir luz que se puede medir (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente de E.U.A. No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, deshidrogenasa de malato, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido (por ejemplo, oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa y deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y oxidasa de xantina), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan y otros, "Methods for the Preparation of Enzy me-Antibody- Conjugates for use in Enzyme Immnoassay", en Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166 (1981). Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un sustrato, en donde ia peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenileno diamina (OPD) o clorhidrato de 3,3', 5, 5'-tetrametilo bencidina (TMB)); (ii) Fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, P-nitrofenil-p-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-met¡lumbeliferil-.beta.-D-galactosidasa.
Numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato están disponibles a aquellos expertos en la técnica. Para una revisión general de estos, ver las patentes de E.U.A. Nos. 4,275,149 y 4,318,980. A veces, la etiqueta se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto estará consciente de varias técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres categorías amplias de etiquetas mencionadas antes se pueden conjugar con avidina, o viceversa. Biotina une selectivamente a avidina y de esta manera, la etiqueta se puede conjugar con el anticuerpo en esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los tipos diferentes dé etiquetas mencionados antes se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). De esta manera, se puede lograr conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo.
En ciertas modalidades, no se necesita etiquetar un anticuerpo, y la presencia del mismo se puede detectar usando un anticuerpo marcado que se une a un anticuerpo diana.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitivos, ensayos de emparedado directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Los ensayos de unión competitivos dependen de la habilidad de un estándar marcado para competir con el analito de muestra de prueba para unir con una cantidad limitada de anticuerpos. Por ejemplo, la cantidad de proteína de TNF en la muestra de prueba a la inversa es proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos por lo general son insolubilizados antes o después de la competencia, de modo que el estándar y analito que se unen a los anticuerpos se pueden separar de manera conveniente del estándar y analito que permanecen no unidos.
Los ensayos de emparedado involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epitopo, de la proteína a detectarse. En un ensayo de emparedado, el analito de muestra de prueba se une por un primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se une al analito, de esta manera formando un complejo de tres partes insoluble. Ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,376,110. El segundo anticuerpo se puede marcar por sí mismos usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con una porción detectable (ensayo de emparedado indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de emparedado es un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción detectable es una enzima.
Para inmunohistoquímica, la muestra de tejido, tal como una muestra de tumor, puede ser fresca o congelada o se puede incrustar en parafina y se fija con un conservador tal como formalina, por ejemplo.
Los anticuerpos también se pueden usar para ensayos diagnósticos de tumor in vivo. Por lo general, el anticuerpo se marca con un radionúclido (tal como, 111ln, 99Tc, 1 C, 13 , 125l, 3H, 32P o 35S) de modo que se puede localizar el tumor usando inmunoscintiog rafia.
Un anticuerpo de la presente invención se puede proveer en un equipo, una combinación empacada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo diagnóstico. En donde el anticuerpo se marca con una enzima, el equipo incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que provee el cromoforo o fluoroforo detectable). Además, otros aditivos se pueden incluir tales como estabilizadores, reguladores (por ejemplo, un regulador de bloque o regulador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los varios reactivos se puede variar ampliamente para proveer para concentraciones en solución de los reactivos que sustancialmente optimizan la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos se pueden proveer como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proveerán una solución de reactivo teniendo la concentración apropiada.
La invención provee además formulaciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos de la invención para propósitos terapéuticos. En una modalidad, la invención provee anticuerpos anti-TNF para el tratamiento de enfermedades mediadas con TNF.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a preparaciones que están en tal forma para así permitir la actividad biológica del anticuerpo para ser inequívocamente efectiva, y que contienen ningún componente adicional que sean tóxicos a los sujetos a los cuales se administraría la formulación. Los excipientes "farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos) son aquellos que razonablemente se pueden administrar a un sujeto mamífero para proveer una dosis efectiva del ingrediente activo empleado.
Una formulación "estable" es una en donde el anticuerpo ahí retiene en esencia su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica al almacenar. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteína están disponibles en la técnica y son revisadas en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A., Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. Se puede medir la estabilidad a una temperatura seleccionada por un periodo de tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante al menos 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8°C durante al menos 1 año por al menos 2 años. Además, la formulación es preferiblemente estable después de congelar (a, por ejemplo, -70°C) y descongelar la formulación.
Un anticuerpo "retiene su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos de agregación, precipitación y/o desnaturación sobre examinación visual de color y/o claridad, o como se mide por dispersión de luz UV o por cromatografía de exclusión de tamaño.
Un anticuerpo "retiene su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es tal que la proteína es considerada como que todavía retiene su actividad biológica como se define más adelante. La estabilidad química se puede evaluar al detectar y cuantificar formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede involucrar modificación de tamaño (por ejemplo, recorte) que se puede evaluar usando cromatografía de exclusión de tamaño, SDS-PAGE y/o ionización de desorción de láser asistida con matriz/ espectrometría de masa de tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen alteración de carga (por ejemplo, ocurriendo como un resultado de desamidación) que se puede evaluar por cromatografía de intercambio de iones, por ejemplo.
Un anticuerpo "retiene su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado está dentro de aproximadamente 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica exhibida al momento que se preparó la formulación como se determina en un ensayo de unión a antigeno, por ejemplo. Otros ensayos de "actividad biológica" para anticuerpos se elaboran en la presente más adelante.
Por "isotónico" se quiere decir que la formulación de interés tiene en esencia la misma presión osmótica como la sangre humana. Las formulaciones isotónicas en general tendrán una presión osmótica de alrededor de 250 a 350 mOsm. Se puede medir la isotonicidad usando un osmómetro de tipo presión a vapor o congelación, por ejemplo.
Un " p o I i o i " es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductoras y no reductoras), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Los polioles preferidos en la presente tienen un peso molecular que es menos de aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en el rango de alrededor de 120 a aproximadamente 400 kD). Un "azúcar reductora" es una que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones de metal o reaccionar covalentemente con Usina y otros grupos amino en proteínas y un "azúcar no reductora" es una que no tiene estas propiedades de un azúcar reductora. Ejemplos de azúcares reductoras son fructosa, mañosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Azúcares no reductoras incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa y rafinosa. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En cuanto a ácidos de azúcar, estos incluyen L-gluconato y · sales metálicas de los mismos. En donde se desee que la formulación sea estable a congelación-descongelación, el poliol preferiblemente es uno que no se cristaliza a temperaturas de congelación (por ejemplo, -20°C) de modo que desestabiliza el anticuerpo en la formulación. Azúcares no reductoras incluyen, pero no se limitan a, sacarosa y trehalosa.
Como se usa en la presente, "regulador" se refiere a una solución regulada que resiste cambios en pH por la acción de sus componentes conjugados de ácido-base. El regulador de esta invención tiene un pH en el rango de alrededor de 4.5 a aproximadamente 7.0; preferiblemente de alrededor de 4.8 a aproximadamente 6.5. Ejemplos de reguladores que controlarán el pH en este rango incluye acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros reguladores de ácido orgánico. En donde se desee una formulación estable a congelación-descongelación, el regulador es preferiblemente no fosfato.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo se refiere a una cantidad efectiva en la prevención o tratamiento de un trastorno para el tratamiento del cual el anticuerpo es efectivo. Una "enfermedad/trastorno" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión .
Un "conservador" es un compuesto que se puede incluir en la formulación para reducir en esencia la acción bacteriana ahí, así facilitando la producción de una formulación de multí-uso, por ejemplo. Ejemplos de conservadores potenciales incluyen cloruro de amonio de octadecildímetilbencilo, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en donde los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservadores incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, butilo y alcohol bencílico, alquilparabenos tales como metil- o propílparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol , 3-pentanol y m-cresol. El conservador más preferido en la presente es alcohol bencílico.
La presente invención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos, junto con al menos un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, reguladores (por ejemplo, solución salina regulada neutral o solución salina regulada de fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsulfóxido, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutationa y/o conservadores. Como se señaló antes, otros ingredientes activos pueden (pero no necesitan) ser incluidos en las composiciones farmacéuticas provistas en la presente.
Un portador es una sustancia que se puede asociar con un anticuerpo antes de la administración a un paciente, a menudo para el propósito de controlar la estabilidad o biodisponíbilidad del compuesto. Los portadores para usarse dentro de dichas formulaciones por lo general son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables. Los portadores incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes tales como albúmina de suero (por ejemplo, humano o bovino), albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Los portadores también incluyen materiales de soporte sólido tales como cuentas y micropartículas que comprenden, por ejemplo, poliglicolato de poliacetato, poli(lactida-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un portador puede portar los compuesto en una variedad de maneras, incluyendo unión covalente (ya sea directamente o vía un grupo enlazador), interacción no covalente o mezcla.
Se pueden formular composiciones farmacéuticas para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, administración ocular, intranasal, ótica, sublingual, transdérmica, tópica, oral, nasal, rectal o parenteral. En ciertas modalidades, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso oral. Dichas formas incluyen, por ejemplo, pildoras, tabletas, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos que se pueden dispersar, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elíxires. Todavía dentro de otras modalidades, las composiciones provistas en la presente se pueden formular como un liofilizato. El término parenteral como se usa en la presente incluye, inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, asi como cualquier inyección o técnica de infusión similar.
En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención se puede administrar directamente al ojo por inyección al tejido ocular tal como inyecciones perioculares, conjuntivales, "subtenon", intracamerales, intravitreales, intraoculares, subretinales, subconjuntivales, retrobulbares o intracanaliculares; por aplicación directa al ojo usando un catéter u otro dispositivo de colocación tal como una bola pequeña - retí n a I , inserto infraocular, supositorio o un implante que comprende un material poroso, no poroso o gelatinoso por gotas oculares tópicas o ungüentos; o por un dispositivo de liberación lenta en el cul-de-sac o implantado adyacente a la esclera (tranescleral) o en la esclera (intraescleral) o dentro del ojo. La inyección intracameral puede ser a través de la córnea en la cámara anterior para permitir al agente alcanzar la malla trabecular. La inyección intracanalicular puede estar en los canales colectores venosos drenando canal de Schlemm o en el canal de Schlemm.
Para administración oftálmica, un anticuerpo de la invención se puede combinar con conservadores oftlamológicamente aceptables, so-solventes, agentes tensioactivos, potenciadores de viscosidad, potenciadores de penetración, reguladores, cloruro de sodio, o agua para formar una suspensión o solución acuosa, estéril u oftálmica. Se pueden empacar productos oftálmicos tópicos, por ejemplo, en forma de multidosis. De esta manera, se pueden requerir conservadores para prevenir contaminación microbiana durante el uso. Los conservadores adecuados incluyen: clorobutanol, metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico, policuaternio-1 , u otros agentes conocidos a aquellos conocidos en la técnica. Dichos conservadores típicamente se emplean a un nivel de 0.001 a 1.0% p/v. Las composiciones de dosis unitaria de la presente invención serán estériles, pero típicamente no conservadas. Por lo tanto, dichas composiciones por lo general no contendrán conservadores.
En ciertas modalidades, las composiciones destinadas para administrarse tópicamente al ojo se formulan como gotas para ojos o ungüentos para ojos, en donde la cantidad total de anticuerpo será de alrededor de 0.001 a 1.0% (p/p). Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo TNFa es de alrededor de 0.01 a aproximadamente 1.0% (p/p)- Se administrarán composiciones de la invención en ciertas circunstancias como soluciones para administración tópica. En general se prefieren soluciones acuosas, con base en facilidad de formulación, así como una habilidad del paciente de administrar con facilidad dichas composiciones por medio de instalar una a dos gotas de las soluciones en los ojos afectados. Sin embargo, las composiciones también pueden ser suspensiones, geles viscosos o semi-viscosos, u otros tipos de composiciones sólidas o semi-sólidas.
Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de conformidad con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y pueden contener uno o más agentes, tales como agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agente colorante, y agentes conservadores a fin de proveer preparaciones atractivas y apetecibles. Las tabletas contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la fabricación de tabletas. Dichos excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio), agentes granulantes y desintegrantes (por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico), agentes de unión (por ejemplo, almidón, gelatina o acacia) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco). Las tabletas pueden ser no revestidas o se pueden revestir por técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y por tanto proveen una acción sostenida sobre un periodo de tiempo más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retraso de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato e glicerilo.
También se pueden presentar formulaciones para uso oral como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín), o como cápsulas de gelatina blanda en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite (por ejemplo, aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva). Las suspensiones acuosas contienen el anticuerpo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen agentes de suspensión (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa , hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia); y agentes de dispersión y humectantes (por ejemplo, fosfatidas que ocurren de manera natural tal como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos tal como estearato de polioxiet'ileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tal como heptadecaetileno-oxietanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tal como monooleato de sorbitán de polietileno). Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más conservadores, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Se pueden formular jarabes o elíxires con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden comprender uno o más emolientes, conservadores, agentes saborizantes y/o agentes colorantes.
Se pueden formular suspensiones oleosas al suspender los ingredientes activos en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de ajonjolí o aceite de coco) o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Agentes edulcorantes, tales como aquellos establecidos antes, y/o agentes saborizantes se pueden agregar para proveer preparaciones orales apetecibles. Dichas suspensiones se pueden conservar por la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
Polvos y gránulos que se pueden dispersar adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por la adición de agua proveen el ingrediente activo en mezcla con un agente de dispersión o humectante, agente de suspensión y uno o más conservadores. Los agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión son ejemplificados por aquellos ya mencionados antes. Excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes, también pueden estar presentes.
Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en la forma de emulsiones de aceite-en-agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuate), un aceite mineral (por ejemplo, parafina líquida), o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsores adecuados incluyen gomas que ocurren de manera natural (por ejemplo, goma acacia y goma tragacanto), fosfatidas que ocurren de manera natural (por ejemplo, soya, lecitina, y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol), anhídridos (por ejemplo, monooleato de sorbitán), y productos de condensación de ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol con óxido de etileno (por ejemplo, monooleato de sorbitán de polioxietileno). Una emulsión también puede comprender uno o más agentes edulcorantes y/o saborizantes.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar como una suspensión acuosa o empalagosa inyectable estéril en donde el modulador, dependiendo del vehículo y concentración usados, se suspende o disuelve en el vehículo. Dicha composición se puede formular de conformidad con la técnica conocida usando agentes dispersantes, humectantes y/o de suspensión adecuados tales como aquellos mencionados antes. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear son agua, 1 ,3-butanodiol, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, se pueden emplear aceites fijos estériles como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, se pueden usar ácidos grasos tal como ácido oleico en la preparación de composiciones inyectables, y adyuvantes tales como anestésicos locales, conservadores y/o agentes reguladores se pueden disolver en el vehículo.
Se pueden formular composiciones farmacéuticas como formulaciones de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula que afecta una liberación lenta de modulador después de la administración). Dichas formulaciones en general se pueden preparar usando tecnología bien conocida y se administran, por ejemplo, por implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el sitio diana deseado. Los portadores para usarse dentro de dichas formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulación provee un nivel relativamente constante de liberación moduladora. La cantidad de un anticuerpo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende de,, por ejemplo, el sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de liberación y la naturaleza de la enfermedad/trastorno a tratarse o prevenirse.
Los anticuerpos anti-TNFa provistos en la presente se pueden administrar en una cantidad que logra una concentración en un fluido corporal (por ejemplo, sangre, plasma, suero, CSF, fluido sinovial, linfa, fluido intersticial celular, lágrimas u orina) que es suficiente para unir de manera detectable a TNF y prevenir o inhibir enfermedades/trastornos mediados con TNF. Una dosis es considerada como efectiva si resulta en un beneficio discernible al paciente como se describe en la presente. Las dosis sistémicas preferidas varían de alrededor de 0.1 mg á aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por día (de alrededor de 0.5 mg a aproximadamente 7 g por paciente por día), con dosis orales por lo general siendo de aproximadamente 5-20 veces más que las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. Las formas unitarias de dosificación en general contendrán entre alrededor de 1 mg a aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo.
En ciertas modalidades, composiciones farmacéuticas se pueden empacar para tratar condiciones responsivas a un anticuerpo dirigido a TNF. Las composiciones farmacéuticas empacadas pueden incluir un contenedor que mantiene una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo tal como se describe en la presente e instrucciones (por ejemplo, marca) indicando que la composición contenida se debe usar para tratar una enfermedad/trastorno responsivo a un anticuerpo después de la administración en el paciente.
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden modificar químicamente. Los grupos modificadores preferidos son polímeros, por ejemplo, un polímero de polialqueno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado. Dicho grupo efector puede aumentar la vida media del anticuerpo in vivo. Ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol) , alcohol polivinílico) de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido o derivados de los mismos. Los polímeros particulares que ocurren de manera natural incluyen lactosa, amilosa, dextrán, glicógeno o derivados de los mismos. El tamaño del polímero se puede variar según se desee, pero en general estará en un rango de peso molecular promedio de 500Da a 50000Da. Para aplicación local en donde el cuerpo está diseñado para penetrar tejido, un peso molecular preferido del polímero es alrededor de 5000Da. La molécula de polímero se puede fijar al anticuerpo, por ejemplo, al extremo de terminal C de una cadena pesada de fragmento Fab vía un péptido de gozne covalentemente enlazado como se describe en WO0194585. Con respecto a la fijación de porciones de PEG, se hace referencia a "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York.
Después de la preparación del anticuerpo de interés como se describió antes, se prepara la formulación farmacéutica que lo comprende. El anticuerpo a formularse no se ha sometido a liofilización previa y la formulación de interés en la presente es una formulación acuosa. Preferiblemente, el anticuerpo en la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo presente en la formulación se determina al considerar los volúmenes y modo(s) dé administración de dosis deseada, por ejemplo. De alrededor de 0.1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, preferiblemente de alrededor de 0.5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml y muy preferible de alrededor de 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml es una concentración de anticuerpo ejemplar en la formulación.
Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo en una solución regulada con pH como se describió antes. La concentración reguladora puede ser de alrededor de 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferiblemente de alrededor de 5 mM a aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del regulador y la isotonicidad deseada de la formulación.
Un poliol, que actúa como un tonificante y puede estabilizar al anticuerpo, se incluye en la formulación. En modalidades preferidas, la formulación no contiene una cantidad tonificante de una sal tal como cloruro de sodio, ya que esto puede causar que el anticuerpo se precipite y/o puede resultar en oxidación a pH bajo. En modalidades preferidas, el poliol es un azúcar no reductora, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se agrega a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. Preferiblemente, la formulación acuosa es isotónica, en cuyo caso concentraciones adecuadas del poliol en la formulación están en el rango de alrededor de 1% a aproximadamente 15% p/v, preferiblemente en el rango de alrededor de 2% a aproximadamente 10% p/v, por ejemplo. Sin embargo, también pueden ser adecuadas las formulaciones hipertónicas o hipotónicas. La cantidad de poliol agregado también puede alterarse con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, se puede agregar una cantidad menor de monosacárido (por ejemplo, manitol), en comparación con un disacárido (tal como trehalosa).
También se puede agregar un agente tensioactivo a la formulación de anticuerpo. Agentes tensioactivos ejemplares incluyen agentes tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). Típicamente, la cantidad de agente tensioactivo agregado es tal que reduce la agregación del anticuerpo formulado/derivado de anticuerpo y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el agente tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de alrededor de 0.001% a aproximadamente 0.5%, preferiblemente de alrededor de 0.005% a aproximadamente 0.2% y muy preferible de alrededor de 0.01% a aproximadamente 0.1%.
En una modalidad, una formulación contiene los agentes identificados antes (es decir, anticuerpo, regulador, poliol y agente tensioactivo) y en esencia está libre de uno o más conservadores, tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y Cl de bencetonio. En otra modalidad, se puede incluir un conservador en la formulación, en particular en donde la formulación es una formulación de multidosis. La concentración de conservador puede estar en el rango de alrededor de 0.1% a aproximadamente 2%, muy preferible de alrededor de 0.5% a aproximadamente 1%. Uno o más portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables tales como aquellos descritos en Pharmaceutical Sciences de Remington, 21a edición, Osol, A. Ed. (2006) se pueden incluir en la formulación siempre y cuando no afectan de manera adversa las características deseadas de la formulación. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a excipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen: agentes reguladores adicionales; co-solventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tal como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína de Zn); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sal tal como sodio.
Las formulaciones a usarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto prontamente se logra por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de, o después de, la preparación de la formulación.
La formulación es administrada a un mamífero en necesidad de tratamiento con el anticuerpo, preferiblemente un humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como una bola o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas intramusculares, intraperitoneales, intracerebroespinales, subcutáneas, intra-articulares, intrasinoviales, intratecales, orales, tópicas o inhalación, u otras rutas como se describe en la presente. En ciertas modalidades, la formulación es administrada al mamífero por administración intravenosa. Para dicho propósito, la formulación se puede inyectar usando una jeringa o vía una línea IV, por ejemplo.
La dosificación apropiada ("cantidad terapéuticamente efectiva") del anticuerpo dependerá, por ejemplo, de la condición a ser tratada, la severidad y curso de la condición, ya sea que el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, el tipo de anticuerpo usado, y la discreción del médico. El anticuerpo se administra de manera adecuada para el paciente en una sola ocasión o sobre una serie de tratamientos y se puede administrar como el único tratamiento o en conjunto con otros fármacos o terapias útiles para tratar la condición en cuestión.
Como una proposición general, la cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo adminrstrado estará en el rango de alrededor de 0.1 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente ya sea por una o más administraciones, con el rango típico de anticuerpo usado siendo de alrededor de 0.3 a aproximadamente 20 mg/kg, más preferible de alrededor de 0.3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrado diariamente, por ejemplo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitorea con facilidad por técnicas convencionales.
En ciertas modalidades, composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-TNFa de la invención se administran a un paciente que sufre de un trastorno mediado con TNF.
En otra modalidad de la invención, se provee un artículo de fabricación que comprende un contenedor que sostiene la formulación farmacéutica acuosa de la presente invención y opcionalmente provee instrucciones para su uso. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos y jeringas. El contenedor puede estar formado de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Un contenedor ejemplar es un frasco de vidrio de un solo uso de 3-20 ce. Alternativamente, para una formulación de multidosis, el contenedor puede ser un frasco de vidrio de 3-100 ce. El contendor mantiene la formulación y la etiqueta en, o asociado con, el contenedor puede indicar direcciones para usarse. El artículo de fabricación además puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, ' jeringas, e insertos de empaque con instrucciones para usarse.
Los contenidos de cualquier patente, solicitud de patente y referencias citadas a lo largo de la especificación por tanto se incorporan a la presente por referencia en sus totalidades.
A menos que se requiera lo contrario por el contexto, los términos únicos usados en la presente deberán incluir pluralidades y los términos en plural deberán incluir el singular.
EJEMPLOS La presente descripción se ilustra más por los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser considerados como limitantes. Los contenidos de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente a la presente por referencia en sus totalidades.
A lo largo de los ejemplos, los siguientes materiales y métodos se usaron a menos que se mencione lo contrario.
Materiales y métodos generales En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (en especial, por ejemplo, tecnología de anticuerpo), y técnicas estándar de preparación de polipéptido. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Clonación Molecular: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practica! Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty , Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y otros, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons (1992).
Mediciones de termoestabilidad Se obtuvieron espectros de transformación IR de Fourier de reflexión total atenuada (FTIR-ATR) para varias cadenas individuales y moléculas de seguimiento usando la célula FT-IR Bio-ATR en un Tensor Bruker. Las moléculas se concentraron hasta 3 mg/ml y se dializaron durante la noche a 4°C contra PBS, pH 6.5 y el flujo regulador fue recolectado como en blanco. Los perfiles de desnaturación fueron obtenidos al termo retar las moléculas con un rango amplio de temperaturas en pasos de 5°C (25 a 95°C). Se realizaron todas las manipulaciones de espectro usando software OPUS. El regulador principal y antecedente atmosférico transitorio (C02 y H20) se sustrajeron del espectro de proteína. El espectro de proteína resultante entonces se corrigió de línea base y se determinó el espectro de proteína amida I a partir del ancho del pico más amplio en la región esperada. Se obtuvieron segundos espectros derivados del espectro de banda de amida I usando una tercera función polinomial de tercer grado con una función suavizante. Se estimaron cambios en estructura de proteína por análisis derivado segundo de amida I usando una curva de calibración lineal para los cálculos de curva iniciales suponiendo 0% de desnaturación para las 3 mediciones menores y 100% de desnaturación para las 3 mediciones mayores. Se usaron los perfiles de desnaturación a puntos medios aproximados de las transiciones de desdoblado térmicas (TM) para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Mediciones de solubilidad La solubilidad relativa a varias moléculas scFv se midió después de la agregación de proteína potenciadora y precipitación en presencia de sulfato de amonio. Se agregó sulfato de amonio a la proteína en soluciones acuosas para dar incrementos de 5% de saturación en la mezcla final de sal-proteína. La precipitación en el rango dinámico se determinó empíricamente y los intervalos de saturación reducidos en este rango a 2.5% de saturación de intervalos en la mezcla final. Después de adición de sulfato de amonio, las muestras se mezclaron con cuidado y se centrifugaron 30 minutos a 6000rpm. La proteína restante en sobrenadantes se recuperó para cada porcentaje de sulfato de amonio de saturación. Se determinaron curvas de solubilidad al medir la concentración de proteína en el sobrenadante usando NanoDropTM 1000 espectrofotómetro. Se normalizaron las mediciones de proteína soluble restante en sobrenadantes y se usaron para estimar puntos medios de solubilidad relativa para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Prueba de estabilidad a plazo corto Se examinó la proteína después de dos semanas de incubación a 40°C para agregados solubles y productos de degradación. Las proteínas con una concentración de 10 mg/ml se dializaron durante la noche a 4°C contra PBS con un rango amplio de pHs (3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.5). La proteína de control con la misma concentración en PBS regulador estándar (pH 6.5) se almacenó a -80°C durante el periodo de 2 semanas. La determinación de bandas de degradación por SDS-PAGE se hizo a t = 0 y t=14d puntos de tiempo y los agregados solubles fueron evaluados en la SEC-HPLC. La determinación de actividad restante después de 2 semanas a 40°C se hizo usando Biacore.
EJEMPLO 1 Optimización de anticuerpo scFv anti-TNFa, 34rFW1.4, para reducir agregación El anticuerpo 34rFW1.4 muestra una propensión para agregación dependiente de pH en solución. El anticuerpo 578rFW1.4 (ver solicitud internacional WO2009155724) , que comparte la misma estructura como 34rFW1.4, no muestra una propensión por agregación. Se generaron modelos de homología para identificar residuos potenciales en el 34rFW1.4 que se podrían modificar para reducir su propensión de agregación de la siguiente manera.
Se usaron secuencias de dominio variable para construir modelos de homología del anticuerpo 34rFW1.4 y el anticuerpo 578rFW1.4. Para generar los modelos, se usaron búsquedas a base de algoritmo BLAST para identificar estructuras de plantilla para las secuencias de dominio variable de cadena ligera (VL) y cadena pesada (VH) para cada anticuerpo por separado. BLOSUM80 (matriz para menos alineaciones divergentes) se usó como la matriz para las alineaciones debido a la alta conservación de regiones de estructura en anticuerpos. Las plantillas individuales para cada cadena (VL/VH) se seleccionaron que mostraron más de 70% de identidad a las secuencias de búsqueda.
El programa MODELER del software Discovery Studio versión 2.5.5 (DS 2.5.5) (Accelrys, Inc., San Diego, CA) se usó para generar modelos 100 scFv con base en las plantillas de dominio variable identificado. La alineación de las secuencias de anticuerpo de referencia a modelarse con estructuras de plantilla se usaron como datos de entrada. Se prepararon 100 modelos que contienen todos los átomos de no hidrógeno. Se seleccionaron las mejores estructuras de modelo con base en una calificación de energía física de PDF (función de densidad de probabilidad). La orientación relativa de dominio VH y VL se ajustó para igualar aquella de la estructura de plantilla de dominio variable con la homología más alta a ambas secuencias modeladas (VL y VH). Se eliminaron conformaciones alternas en el modelo, se agregaron terminales, y se agregaron átomos de cadena lateral faltantes. Se aplicó campo de fuerza CHARMM a los modelos scFv y se sometieron a 2000 ciclos de minimización de energía usando un gradiente RMS de 0.01 y el "born" generalizado con volumen molecular (GBMV) como modelo de solvente implícito.
Se realizaron cálculos de ionización de proteína y residuo pK para cada uno de los anticuerpos. Se hicieron los cálculos usando la implementación de protocolo incluido en Discovery Studio versión 2.5.5 (DS 2.5.5), con base en la teoría desarrollada por Bashford y Karplus, 1991. Los resultados de ionización de proteína y cálculos de residuo pK se compararon para las dos moléculas en términos de pKi,2 de las cadenas laterales y curvas de titulación de cada residuo titulable, incluyendo Asp, Glu, Arg, Lys, His, Tyr, Cys, los residuos de terminal N y terminal C de los anticuerpos.
Se aplicó campo de fuerza CHARMM a los modelos scFv y se protonaron a pH 7.4, curvas de titulación y pKs de los residuos individuales se calcularon a partir del rango de pH 2 a pH 14 usando los pasos de pH de 0.2. Dos residuos de Lys conservados en las posiciones 47 y 50 en la cadena ligera del anticuerpo 578rFW1.4 difirieron en comparación con el Lys en aquellas posiciones en el 34rFW1.4 (ver figura 1).
Introducción de sustituciones preferidas Se usó el software Discovery Studio para conducir simulaciones dinámicas moleculares para predecir mutaciones que mejoran la afinidad de interacción entre VL y VH, asi previniendo que los dominios se separen y formando oligómeros y de agregados de orden más alto. La estabilidad de la interface de VL/VH del anticuerpo 34rFW1.4 se estimó como términos de energía como energía libre G. Una adaptación de protocolo CHARMM (también incluido en DS 2.5.5) se usó para calcular la diferencia de energía entre el complejo de heterodímero scFv entero y la suma de las energías de cada uno de los dominios variables individuales. Los cálculos se hicieron en el contexto de un método de solvente implícito usando el Born Generalizado con integración de volumen molecular (GBMV). Las energías de ambos dominios y el complejo se calcularon, y la salida se determinó como la diferencia en energía entre el complejo y la suma de los dominios individuales de acuerdo con el siguiente cálculo: G interface = G(a) - G(b) - G(c), en donde G(a) es la energía del anticuerpo, G(b) es la energía de la VL, y G(c) es la energía de la VH.
Se seleccionó arginina (R) como una sustitución de residuo posible para la lisina (K) en las posiciones 47 y 50, ya que el valor de pKa de cadena lateral para R (12.5) es mayor que pKa de K (10.5). Se generaron mutantes K47R y K50R al reemplazar K por R individualmente en las posiciones respectivas. 2000 ciclos de minimización de energía se realizaron para residuos 10 Angstroms o más cercano al área alrededor de la mutación para permitir a las nuevas moléculas de modelo adaptarse al cambio. El modelo de solvente implícito para estas rondas de minimización de energía fue GBMV. G delta promedio predicho para los mutantes fue -94 kcal/mol. Por lo tanto, la contribución de las mutaciones fue estimada a 4 kcal/mol en comparación con el anticuerpo scFv anti-TNF parental.
EJEMPLO 2 Análisis de estabilidad del anticuerpo 34rFW1.4 optimizado Se generaron el mutante K50R y mutante K47R en el anticuerpo 34rFW1.4 (que se describe en la solicitud internacional co-pendiente No. PCT/CH2009/000219, presentada el 25 de junio de 2009, los contenidos de la cual se incorporan a la presente por referencia en su totalidad). Otro mutante de 34rFW1.4 teniendo sustituciones adicionales para reducir su inmunogenicidad in vivo se preparó de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de E.U.A. No. 12/973,968. En particular, el tercer mutante, designado 34rFW1 4_VLK50R_DHP, contuvo una serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo), una treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo), y una treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo). Estudios de estabilidad de los anticuerpos 34rFW1.4 origen y mutantes se realizaron bajo condiciones aceleradas de la siguiente manera.
El anticuerpo 34rFW1.4, mutante 34rFW1.4_VL_K50R, y 34rFW1.4_VLK50R_DHP se concentraron hasta 20, 40 y 60 mg/mL en solución salina regulada con fosfato (50 mM Na2HP04, 150 mM NaCI, pH 6.5) formulación e incubada 2 semanas a 40°C. Los anticuerpos 34rFW1.4 y 34rFW1.4_K47R se concentraron hasta 20 y 60 mg/mL en solución salina regulada con fosfato (50 mM Na2HP04, 150 mM NaCI, pH 6.5) formulación e incubada 2 semanas a 40°C. Se analizaron muestras antes y después de 14 días de incubación para degradación usando 12.5% de electroforesis de gel de dodeciisulfato - poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) bajo condiciones reductoras y no reductoras. Se usó cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión de tamaño (SE-HPLC) para determinar el contenido de monómero y agregados solubles de las muestras antes y después del periodo de incubación. Los monómeros fueron resueltos de especies no monoméricas en una columna TSKgel Super SW2000 (TOSOH Bioscience) y el porcentaje de proteína monomérica se calculó como el área del pico de monómero dividido por el área total de todos los picos de producto. Los resultados de los estudios para 34rFW1.4 y 34rFW1.4_VLK50R_DHP se muestran en las figuras 2A-B, 3A-B y 4A-B, respectivamente. Los resultados para 34rFW1.4_VL_K50R se muestran en las figuras 5B, 6B y 7B. Estos experimentos demostraron que 34rFW1.4_VLK50R_DHP tuvo una propensión reducida para agregación en comparación con 34rFW1.4. El mutante 34rFW1.4_K47R también demostró dicha reducción como se muestra en las figuras 8B y 9B.
Además, se compararon la estabilidad térmica y afinidades de unión de los anticuerpos 34rFW1.4 y 34rFW1.4_VLK50R_DH P. Los resultados demostraron que las mutaciones hechas para generar el anticuerpo 34rFW1.4_VLK50R_DHP no afectaron la estabilidad o actividad de unión con respecto al anticuerpo 34rFW1.4 origen.
EQUIVALENTES Numerosas modificaciones y modalidades alternativas de la presente invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica en vista de la descripción anterior. Por consiguiente, esta descripción debe ser considerada solamente como ilustrativa y es para el propósito de enseñanza para aquellos expertos en la técnica el mejor modo para llevar a cabo la presente invención. Detalles de la · estructura pueden variar sustancialmente sin alejarse del espíritu de la invención, y se reserva el uso exclusivo de todas las modificaciones que entran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se pretende que la presente invención sea limitada sólo al grado requerido por las reivindicaciones anexas y las reglas de derecho aplicables.
Toda la literatura y material similar citados en esta solicitud, incluyendo, patentes, solicitudes de patente, artículos, libros, tratados, disertaciones, páginas web, figuras y/o apéndices, sin importar el formato de dicha literatura y materiales similares, se incorporan expresamente a la presente por referencia en su totalidad. En el caso de que uno o más de la literatura incorporada y materiales similares difieran de o contradigan esta solicitud, incluyendo términos definidos, uso de términos, técnicas descritas, o similares, esta aplicación controla.
Los encabezados de cada sección usados en la presente son sólo para propósitos de organización y no deben ser considerados como limitantes a la materia sujeto descrita en cualquier manera.
Aunque las presentes invenciones han sido descritas en conjunto con varias modalidades y ejemplos, no se pretende que las presentes enseñanzas sean limitadas a dichas modalidades o ejemplos. Por el contrario, las presentes invenciones abarcan varias alternativas, modificaciones y equivalentes, como serán apreciadas por aquellos expertos en la técnica.
Las reivindicaciones no deben ser leídas como limitadas al orden descrito o elementos a menos que se mencione a ese efecto. Cabe señalar que varios cambios en forma y detalle se pueden hacer sin alejarse del alcance de las reivindicaciones anexas. Por lo tanto, se reclaman todas las modalidades que se encuentran dentro del alcance y espíritu de las siguientes reivindicaciones y equivalentes de los mismos.

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. - Un anticuerpo que se une específicamente a TNFa humano, que comprende: a. una cadena ligera variable que comprende la secuencia de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 14; y b. una cadena pesada variable que comprende la secuencia de SEC ID NO: 5.
2. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde la cadena ligera variable comprende la secuencia de SEC ID NO: 2.
3. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde la cadena ligera variable comprende la secuencia de SEC ID NO: 14.
4.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que tiene además un enlazador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 7.
5. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de SEC ID NO: 10.
6 - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de SEC ID NO: 17.
7.- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
8. - Un método de tratar una enfermedad mediada con TNFa que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7.
9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la enfermedad mediada con TNFa es un trastorno ocular seleccionado a partir del grupo que consiste de uveítis, enfermedad de Bechet, retinitis, ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjórgen, neuropatía diabética, escleritis, degeneración macular relacionada con la edad y queratitis.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la composición farmacéutica es administrada por administración ocular, intranasal, ótica, sublingual, transdérmica, tópica, oral, nasal, rectal o parenteral.
11 - El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde la composición farmacéutica se administra en una dosis individual o dividida que comprende 0.1 a 100 mg del anticuerpo.
12 - El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la enfermedad mediada con TNFa es uveítis, y la composición farmacéutica se administra tópicamente a un ojo del sujeto.
13.- Una molécula de ácido nucleico aislada codificando el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.
14. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13.
15. - Una célula huésped que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 14.
16. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', un F(ab)'2, Fv(scFv) de una cadena, un Fv, o un anticuerpo lineal.
17. - Una molécula bivalente o biespecífica que comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.
18. - Un método para reducir la propensión para agregación de un anticuerpo, el método que comprende introducir una o más sustituciones de aminoácido en la interface de una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH) del anticuerpo, en donde las una o más sustituciones están en posiciones de residuo seleccionadas para reducir la energía libre entre la VL y VH por al menos 0.5 kcal/mol, así reduciendo la propensión de agregación del anticuerpo en comparación con un anticuerpo parental.
19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', un F(ab)'2, Fv(scFv) de una cadena, un Fv, un diacuerpo, un diacuerpo de una cadena, un anticuerpo tándem o un anticuerpo lineal.
20. - El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la secuencia de la cadena ligera variable del anticuerpo tiene por lo menos 65% de identidad a la secuencia de SEC ID NO: 1.
21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la modificación comprende una sustitución en la posición 50 AHo y/o posición 47 AHo de la cadena ligera variable.
22 - El método de conformidad con la reivindicación 21, en donde la sustitución es una arginina (R) en la posición 50 AHo y/o una arginina (R) en la posición 47 AHo de la cadena ligera variable.
23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde lisina (K) se sustituye por arginina (R) en la posición 47 AHo y/o 50 de la cadena ligera variable.
24. - El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el anticuerpo tiene una secuencia de cadena pesada variable que tiene por lo menos 85% de identidad a la secuencia de SEC ID NO: 1.
25. - El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el anticuerpo tiene una secuencia de cadena pesada variable que tiene por lo menos 85% de identidad a la secuencia de SEC ID NO: 3 o la secuencia de SEC ID NO: 4.
26.- El método de conformidad con la reivindicación 18, que comprende además sustituciones de aminoácido en posición 12, 103 y 144 AHo de la cadena pesada variable.
27 - Un anticuerpo producido por el método de conformidad con la reivindicación 18. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La descripción provee anticuerpos que se modifican para reducir propensión de agregación, y los métodos de producir dichos anticuerpos. La presente descripción también provee en particular anticuerpos scFv estables y solubles y fragmentos Fab específicos para TNF, que comprenden secuencias especificas de cadena ligera y cadena pesada que se optimizan para estabilidad, solubilidad, unión in vitro o in vivo de TNF, e inmunogenicidad baja. También se describen ácidos nucleicos, vectores y células huésped para expresión de los anticuerpos recombinantes de la descripción, métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en la medicina.
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