CN104800147A - 用于大分子的增强的递送的方法和组合物 - Google Patents

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D·厄里什
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Abstract

本发明提供了增强大的大分子(即，大于10kDa)(例如结合抗原的多肽)穿过紧密连接的递送的组合物和方法。此类方法和组合物对于通过鼻内施用将治疗性结合抗原的多肽递送至CNS以治疗神经病症特别有用。

Description

用于大分子的增强的递送的方法和组合物
本申请是申请号为200980126247.5的中国专利申请的分案申请。
本申请要求2008年7月10日提交的美国临时申请案61/079586(其内容通过引用合并入本文)的优先权。
发明领域
本公开内容涉及促进分子穿过生物膜的递送，特别是结合抗原的多肽穿过血脑屏障进入中枢神经***(CNS)的递送的组合物和方法。
发明背景
根据2006年世界卫生组织的报告，世界上超过10亿人患有神经病症，并且此类病症每年导致将近680万人死亡。治疗性结合抗原的肽例如抗体可用于治疗多种(如果不是大部分的话)此类神经病症。然而，使用此类治疗性结合抗原的肽治疗神经病症经常受到与递送药物穿过血脑屏障(BBB)相关的困难的阻碍。
虽然已发现增强分子穿过上皮细胞层的递送的化合物，但通常显示其只在增强小分子的递送中有效。例如，已显示肽4-苯基偶氮苄基氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro增强小分子穿过上皮细胞层的运输，然而对于10kDa或更大的大分子未显示渗透增强作用(参见美国专利5,534,496；Yen等人1995,J Control Release,36:25-37)。尽管进行了大量研究，但目前还没有将治疗性结合抗原的多肽递送至CNS内的方便有效的方法。
因此，在本领域内存在对增强治疗性结合抗原的多肽穿过上皮层特别地至CNS的特异性递送以治疗CNS病症的组合物和方法的持续需要。
发明概述
本发明至少部分基于令人惊讶的发现：渗透增强剂(例如，Pz-肽或FMOC-肽)能够增强大的大分子(即，大于10kDa)例如结合抗原的多肽(例如scFv)至CNS的特异性递送，特别是当给鼻粘膜施用时。因此，本发明提供了增强大的大分子(即，大于10kDa)例如结合抗原的多肽(例如，scFv)穿过上皮层的递送的组合物和方法。此类方法和组合物是特别有利的，因为它们使得能够通过鼻内施用方便、有效和选择性地将结合抗原的多肽(例如scFv)递送至CNS以治疗神经病症。
在一个方面，本发明提供了包含一种或多种结合抗原的多肽例如免疫结合剂(例如,scFv)和一种或多种渗透增强剂(例如，Pz-肽或FMOC-肽)的组合物。在特定的实施方案中，将结合抗原的多肽共价连接至渗透增强剂。
在某些实施方案中，结合抗原的多肽特异性结合靶抗原特别是TNFα，所述靶抗原选自TNF-α、β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白衍生的可扩散配体受体、单胺氧化酶-B、L-3,4-二羟苯丙氨酸脱羧酶、乙酰辅酶A羧化酶、N-甲基-D-天冬氨酸受体(也称为GRIN1)、GRINA、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B、组胺H1受体、毒蕈碱受体(也称为CHRM1)、CHRM2、CHRM3、CHRM4、下丘泌素受体1、下丘泌素受体2、5-羟色胺(也称为HTRlA)、多巴胺受体(也称为DRD1)、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、肾上腺素能β1受体、去甲肾上腺素转运蛋白(NET)和多巴胺D2受体。
在其他实施方案中，结合抗原的多肽是包含与本文的表5、6和7中所示的一个或多个氨基酸序列具有至少80％，优选85％、90％、95％或99％的同一性或相似性的氨基酸序列的scFv。
在其他实施方案中，渗透增强剂促进结合抗原的多肽至中枢神经***的选择性鼻内递送。
本发明的组合物特别地可用作药物(或用于制造药物)，所述药物特别地用于治疗、预防或延迟神经病症的进展，所述神经病症包括但不限于偏头痛、抑郁症、阿尔茨海默氏病、帕金森病、精神***症、癫痫、中风、脑膜炎、肌萎缩侧索硬化、失眠(insomnia)、脑膜炎、记忆缺陷(memory impairment)、多发性硬化、发作性睡病、中风、创伤性脑损伤和应激(stress)。
在另一个方面，本发明提供了包括一种或多种结合抗原的多肽(例如scFv)、一种或多种渗透增强剂(例如，Pz-肽或FMOC-肽)以及使用说明书的试剂盒。
附图概述
当结合下列附图阅读下列详述时，将更好地理解本公开内容的特征和有利方面，其中：
图1描述了时程实验，其跟踪在鼻内施用400μg scFv后(A)嗅球、(B)大脑、(C)小脑和(D)脑干中的ESBA105浓度。
图2比较在鼻内(400μg/mL)或静脉内(40μg/mL)施用ESBA105后(A)嗅球、(B)大脑、(C)小脑、(D)脑干和(E)血清中ESBA105的浓度，以及在以400μg/mL的等浓度鼻内或静脉内施用ESBA105后(F)血清中ESBA105的浓度。
图3显示在使用或不使用Pz肽的情况下鼻内施用后，不同脑区域中ESBA105的(A)Cmax(平均值±SEM,n＝4)和(B)暴露(AUC)的脑组织对血液的浓度比率。
图4描述了在鼻内递送后ESBA105从鼻腔至CNS的迁移途径。施用的化合物可从鼻腔迁移入血液并且穿过血脑屏障，最后渗入脑组织(下面的途径)。可选择地，化合物可经嗅神经(N.olfactorius)轴突(即细胞内)或神经周围(即细胞外)迁移入嗅球，然后进入大脑。化合物还可经三叉神经(N.trigeminus)(神经周围地，即细胞外)迁移入脑干，然后进入小脑。
详述
定义
本语"渗透增强剂"包括增强药物穿过物理屏障例如组织屏障(例如上皮)的通过的任何组合物。适当的渗透增强剂包括但不限于，N-端连接至保护基团例如4-苯基偶氮苄基氧羰基(Pz)、N-甲基、叔丁基氧羰基(t-Boc)、芴基甲氧基羰基(FMOC)和苄氧羰基(CBZ)的肽Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQ ID NO:28]、Pro-Leu-Gly-Pro-Lys[SEQ IDNO:29]、Pro-Leu-Gly-Pro-Glu[SEQ ID NO:30]、Pro-Leu-Gly-Pro-Asp[SEQ ID NO:31]、Pro-Leu-Gly-Pro[SEQ ID NO:32]、Pro-Leu-Gly和Pro-Leu(参见例如，美国专利5,534,496,其通过引用合并入本文)。
术语"Pz-肽"是指N末端连接至Pz基团的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQ ID NO:28](参见例如，美国专利5,534,496,其通过引用合并入本文)。
术语"FMOC-肽"是指N端连接至FMOC基团的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQ ID NO:28](参见例如，美国专利5,534,496,其通过引用合并入本文)。
术语“选择性鼻内递送”是指在导致患者的CNS中分子的浓度比血清中的浓度高的条件下分子(例如，结合抗原的多肽)至患者的鼻内应用。
术语“结合抗原的多肽”是指大小为至少10kDa的多肽，其包括免疫结合剂、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体(scFv)和抗体片段以及基于本领域内已知的可选择的支架的抗原结合多肽，所述支架例如但不限于CTLA-4、淀粉酶抑肽、纤连蛋白(FN3)、新制癌菌素(neocarzinos tat in)、CBM4-2、脂质运载蛋白、T细胞受体、蛋白A结构域(蛋白Z)、Im9、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、设计的TPR蛋白、锌指、pVI I I、鸟胰腺多肽、GCN4、WW结构域、Src同源结构域3(SH3)、Src同源结构域2(SH2)、PDZ结构域、TEM-1β-内酰胺酶、GFP、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指、CI-2、BPT1APPI、HPSTI、ecot in、LACI-D1、LDTI、MTI-I I、蝎毒素、昆虫防御素A肽、EETI-I I、Min-23、CBD、PBP、细胞色素b562、Ld1受体结构域A、γ-晶体蛋白、泛素、转铁蛋白和C型凝集素样结构域(参见例如Binz 2005,Curr Opin Biotechnol.第16卷，第459-69页)。
术语“免疫结合剂”是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置，例如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，这样免疫结合剂能够特异性识别靶抗原。免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括但不限于(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有铰链区的一部分的Fab(参见,Fundamental Immunology(Paul编辑，3.sup.rd ed.1993)；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)包含抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)单结构域抗体例如Dab片段(Ward等人,(1989)Nature 341：544-546)，其由VH或VL结构域组成，Camelid(参见Hamers-Casterman,等人，Nature 363：446-448(1993)和Dumoul in等人，Protein Science 11：500-515(2002))或Shark抗体(例如，shark Ig-NARs)；和(vii)纳米抗体(Nanobody)，包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。
本文中使用的术语“抗体”是免疫球蛋白的同义词。根据本发明的抗体可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结构域，Fv(Skerra A.和Pluckthun，A.(1988)Science 240：1038-41)、scFv(Bird，R.E.等人(1988)Science242：423-26；Huston，J.S.等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-83)，Fab、(Fab')2或本领域技术人员熟知的其他片段。
术语“单链抗体”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
本文中使用的术语“抗体构架”是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环的支架(Kabat，E.A.等人,(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)。适当的构架的实例公开于PCT/CH2009/000219和PCT/CH2009/000222(其通过引用合并入本文)。
术语“接头”是指连接两个结构域的线性氨基酸序列。可通过遗传学和/或化学方法将本发明的接头融合至结构域。在某些实施方案中，接头包含通过存在于接头中的两个半胱氨酸之间形成的二硫桥形成的环。这样的接头的一般结构示于SEQ ID No.18和19中；SEQ ID No.16和17是所述接头的示例性实施方案。另外的适当的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变组成。在本发明的优选实施方案中，使用(GGGGS)4接头(SEQ ID No:36)或其衍生物(例如，使用SEQ ID No:37)，但也可以使用1至3个重复的变体(Hol l iger等人(1993),Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.Immunother.50:51-59描述。
术语“修饰的”或“修饰”，就多肽的氨基酸序列而言，是指氨基酸至多肽序列内的添加或多肽序列中现有氨基酸的置换。适合用于修饰多肽的氨基酸包括所有已知的天然氨基酸、非天然氨基酸和其功能化的衍生物(参见，例如，美国专利7,045,337和7,083,970,其以其全文通过引用合并入本文)。在某些实施方案中，术语是指多肽序列的氨基酸的缺失。
"靶抗原"是包含抗体特异性结合的抗原决定簇的分子(例如，可溶性蛋白质或具有一个或多个跨膜结构域的膜结合蛋白、多肽、肽或碳水化合物)。
术语“神经病症”包括可影响中枢神经***(即脑和脊髓)的疾病和病症。
术语CNS病症是指在CNS中表现的病症。例如，其可以是脑肿瘤或神经病症。
术语“有效量”定义为足以部分或完全预防或阻止患者的疾病或病症(例如，神经病症)的治疗剂(例如，结合抗原的多肽)的量。有效量将取决于疾病或病症的严重度和许多药代动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、使用的特定化合物的***速率、治疗的持续时间、与使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、待治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和以前的医疗史等医学领域中熟知的因素。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体结合预先确定的抗原上的表位。通常，抗体以大约低于大约10-7M，例如大约低于大约10-8M、10-9M或10-10M的亲和力(KD)结合。
如本文中所使用的，“同一性”是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置都被赖氨酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置的数目除以进行比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来提供。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J Mol Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16，14，12，10，8，6或4的缺口权重和1，2，3，4，5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。
“相似的”序列是当比对时共有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似的残基是进行比对的参照序列中的相应氨基酸残基的保守置换。在这点上，参照序列中的残基的“保守置换”是用在物理或功能上与相应的参照残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。因此，“经保守置换修饰的”序列是与参照序列或野生型序列相异在于存在一个或多个保守置换的序列。两个序列之间的“百分数相似性”是包含由两个序列共有的匹配残基或保守置换的位置的数目除以进行比较的位置的数目x 100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配以及10个位置中有2个包含保守置换，那么这两个序列具有80％的正相似性。
如本文中使用的，术语“保守的序列修饰”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守的序列修饰包括核苷酸和氨基酸置换、添加和缺失。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入修饰。保守氨基酸置换包括其中用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代人抗VEGF抗体中的预测的非必需氨基酸残基。鉴定不消除抗原结合作用的核苷酸和氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummel l等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Nat l Acad.Sci USA 94:412-417(1997))。
除非另外指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下面描述了适当的方法和材料。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。
在下面的部分更详细地描述本发明的多个方面。应理解，可随意组合不同实施方案。
改进的结合抗原的多肽的组合物
在一个方面，本发明提供了用于增强治疗性多肽例如结合抗原的多肽(例如，scFv)穿过组织屏障，更具体地穿过鼻粘膜进入CNS的递送的组合物。此类组合物通常包含结合抗原的多肽和渗透增强剂。此类组合物是特别有利的，因为它们能够将结合抗原的多肽选择性鼻内递送至中枢神经***。目前，通常全身性施用生物制品，因此需要更高剂量的药物和/或使有此需要的生物体经受所述药物；可选择地，可通过颅插管(cranial cannula)施用生物制品。因此，本发明显著改善了需要结合抗原的多肽的受试者的生活质量。
任何结合抗原的多肽适合用于本发明的方法。在某些实施方案中，结合抗原的多肽是免疫结合剂例如scFv。此类scFv优选包含高度稳定的和可溶的构架区例如WO09/000098(其内容通过引用合并入本文)中所示的构架区。在特别优选的实施方案中，scFv包含与表5、6和7中所示的一个或多个氨基酸序列具有至少80％的相似性(例如，85％、90％、95％或99％)的氨基酸序列。最优选，scFv包含与表5、6和7中所示的一个或多个氨基酸序列具有至少80％的同一性，优选85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。
在优选实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID No:20、SEQ ID No:21、SEQ ID No:22、SEQ ID No:23、SEQ ID No:24、SEQ ID No:25、SEQ ID No:26或SEQ ID No:27具有至少80％的相似性(例如，85％、90％、95％或99％)，更优选至少80％的同一性，更优选85％、90％、95％或99％的同一性的构架序列。
在另一个实施方案中，所述scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含与SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10或SEQ ID No:35具有至少80％的相似性(例如，85％、90％、95％或99％)，更优选至少80％的同一性，更优选85％,90％,95％或99％的同一性的氨基酸序列。另外或可选择地，所述scFv包含VL结构域，所述VL结构域含有与SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15或SEQ ID No:34具有至少80％的相似性(例如，85％、90％、95％或99％)，更优选至少80％的同一性，更优选85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，通过接头连接所述VH和/或VL以产生具有一般结构NH2-VH-接头-VL-COOH或NH2-VL-接头-VH-COOH的分子。所述接头分子可以例如选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:36和SEQ ID NO:37或可以是与上述序列至少具有80％的相似性的序列。
在优选实施方案中，scFv包含与SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:33具有至少80％的相似性(例如，85％、90％、95％或99％)，更优选至少80％的同一性，更优选85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。
任何渗透增强剂可用于本发明的组合物。在某些实施方案中，渗透增强剂是连接至保护基团的肽或拟肽(pept idomimet ic)。适合用于本发明的肽可包含任何已知的氨基酸，包括天然氨基酸、非天然氨基酸、D-氨基酸和氨基酸衍生物。在特定的实施方案中，渗透增强剂是选自N末端连接至保护基团例如4-苯基偶氮苄基氧羰基(Pz)、N-甲基、叔丁基氧羰基(t-Boc)、芴基甲氧基羰基(FMOC)和苄氧羰基(CBZ)的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQ ID NO:28]、Pro-Leu-Gly-Pro-Lys[SEQ IDNO:29]、Pro-Leu-Gly-Pro-Glu[SEQ ID NO:30]、Pro-Leu-Gly-Pro-Asp[SEQ ID NO:31]、Pro-Leu-Gly-Pro[SEQ ID NO:32]、Pro-Leu-Gly和Pro-Leu的肽(参见例如，美国专利5,534,496,通过引用合并入本文)。在优选实施方案中，渗透增强剂是N末端连接至Pz或FMOC基团的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQ ID NO:28](参见例如美国专利5,534,496,其通过引用合并入本文)。
在本发明的范围内预期，可将渗透增强剂和结合抗原的蛋白于单一药物组合物中共递送至靶组织，或可通过在不同的组合物中施用以在时间上分开它们的递送。
在本发明的范围内还预期，可将渗透增强剂缀合至结合抗原的蛋白。预期本领域已知的所有物理或化学缀合的模式。为了将化学基团缀合至氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物，可使用本领域内已知的任何适当的化学药品。可缀合至结合抗原的蛋白的任何氨基酸残基，包括赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基。
在某些实施方案中，本发明的组合物可包含适合于与上述结合抗原的蛋白共递送的另外的化合物。此类药物包括但不限于小分子、益智药、多肽和寡核苷酸。
本发明的组合物可用于将结合抗原的蛋白递送穿过任何生物膜(包括但不限于粘膜上皮(例如，鼻上皮)和角膜组织)的紧密连接。特别优选的靶膜是鼻上皮，因为本发明的组合物至鼻上皮的施用导致抗原结合蛋白直接和特异性递送至CNS内，优选无需首先进入血流。
CNS病症的治疗
本发明的组合物特别适合于治疗、预防和/或延迟CNS病症的进展，因为此类组合物允许通过鼻粘膜将结合抗原的多肽直接和选择性递送入CNS。可使用本发明的组合物治疗的适当的病症包括但不限于，行为/认知综合征、头痛症(例如偏头痛、丛集性头痛和紧张性头痛)、癫痫、创伤性脑损伤、神经退行性疾病(例如肾上腺脑白质营养不良、酒精中毒、亚历山大病(Alexander's disease)、阿尔珀斯病(Alper'sdisease)、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(也称为葛雷克氏病(LouGehrig's Disease))、共济失调毛细血管扩张、巴滕病(Batten disease)(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病、卡纳万病(Canavan disease)、脑性瘫痪、柯凯因综合征(Cockaynesyndrome)、皮质基底节变性、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、家族性致死性失眠症、额颞叶变性、亨丁顿病(Huntington's disease)、HIV相关痴呆、肯尼迪病(Kennedy's disease)、克拉伯病(Krabbe'sdisease)、路易体痴呆、神经疏螺旋体病、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)(脊髓小脑性共济失调3型)、多***萎缩、多发性硬化、发作性睡病、尼曼-匹克病(Niemann Pick disease)、帕金森病、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、皮克病(Pick'sdisease)、原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性核上性麻痹、雷夫叙姆病(Refsum's disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、希尔德病(Schi lder's disease)、继发于恶性贫血的脊髓亚急性联合变性、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓痨、和中毒性脑病、脑血管病(例如短暂性缺血发作和中风)、睡眠障碍、脑性瘫痪、感染(例如脑炎、脑膜炎、和脊髓炎)、肿瘤(例如脑和脊髓肿瘤)、运动障碍(例如偏侧投掷症、抽动障碍、和抽动秽语综合征(Gilles de la Tourette syndrome))、CNS的脱髓鞘疾病(例如多发性硬化格林-巴利综合征(Guillain-Barré syndrome)和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病)、周围神经病症(例如肌病和神经肌肉连接)、精神状态改变(例如脑病、木僵、和昏迷)、言语和语言障碍、神经***副肿瘤综合征和具有无明确生理学病因的功能性神经学症状的综合征。
因此，在另一个方面，本发明提供了治疗或预防中枢神经***的疾病或病症的方法，所述方法包括给需要此治疗的受试者的鼻粘膜施用有效量的组合物，所述组合物包含结合抗原的多肽(例如，scFv)和渗透增强剂(例如，Pz-肽)，以便治疗或预防所述疾病或病症。
在另一个方面，本发明提供了将结合抗原的多肽选择性递送至受试者的中枢神经***的方法，所述方法包括将包含结合抗原的多肽(例如，scFv)和渗透增强剂(例如,Pz-肽)的组合物与受试者的鼻粘膜接触，由此将结合抗原的多肽直接和选择性地递送至中枢神经***。
靶抗原
用于本发明的方法的结合抗原的多肽可结合一个或多个特定靶抗原。适当的靶抗原包括但不限于TNF-α(例如Genbank登录号:NP_000585.2)、β淀粉样蛋白(例如Genbank登录号:NP_000475.1)、β淀粉样蛋白衍生的可扩散配体受体(参见例如，WO/2004/031400)、单胺氧化酶-B(例如Genbank登录号:NP_000889.3)、L-3,4-二羟苯丙氨酸脱羧酶(例如Genbank登录号:NP_000781.1)、乙酰辅酶A羧化酶(例如Genbank登录号:NP_942131.1)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(也称为GRINl)(例如Genbank登录号:NP_000823.4))、GRINA(例如Genbank登录号:NP_000828.1)、GRIN2D(例如Genbank登录号:NP_000827.2)、GRIN2C(例如Genbank登录号:NP_000826.2)、GRIN3B(例如Genbank登录号:NP_619635.1)、GRIN2A(例如Genbank登录号:NP_000824.1)、GRIN2B(例如Genbank登录号:NP_000825.2)、GRIN3A(例如Genbank登录号:NP_597702.2)、组胺H1受体(例如Genbank登录号:NP_000852.1)、毒蕈碱受体(也称为CHRM1)(例如Genbank登录号:NP_000729.2)、CHRM2(NP_000730.1)、CHRM3(NP_000731.1)、CHRM4(NP_000732.2)、下丘泌素受体1(例如Genbank登录号:NP_00l516.2)、下丘泌素受体2(例如Genbank登录号:NP_00l517.2)、5-羟色胺(也称为HTRlA)(例如Genbank登录号:NP_000515.2)、多巴胺受体(也称为DRDl)(例如Genbank登录号:NP_000785.1)、DRD2(例如Genbank登录号:NP_000786.1)、DRD3(例如Genbank登录号:NP_000787.2)、DRD4(例如Genbank登录号:NP_000788.2)、DRD5(例如Genbank登录号:NP_000789.1)、去甲肾上腺素转运蛋白(NET)(例如Genbank登录号:NP_001034.1)、肾上腺素能β1受体(例如Genbank登录号:NP_000675.1)和多巴胺D2受体(例如Genbank登录号:NP_000786.1)。
制剂
本发明的另一个方面涉及本发明的结合抗原的多肽/渗透增强剂组合物的药物制剂。此类制剂通常包含一种或多种结合抗原的多肽，一种或多种渗透增强剂，和药学可接受的载体。如本文中使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选，载体适合于例如静脉内、肌内、皮下、局部(例如,至眼、皮肤或表皮层)、吸入、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用的途径，可将结合抗原的多肽/渗透增强剂组合物包被在材料中以保护化合物免受酸和可使化合物失活的其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物可以包含一种或多种药学可接受的盐。“药学可接受的盐”是指保持亲本化合物的期望的生物学活性并且不赋予任何不期望的毒理学效应的盐(参见例如，Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括从无毒性无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及从无毒性有机酸例如脂肪族一和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等衍生的盐。碱加成盐包括从碱土金属例如钠、钾、镁、钙等以及从无毒性有机胺例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等衍生的盐。
本发明的药物组合物还可包含药学可接受的抗氧化剂。药学可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明的药物组合物的适当的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适当的混合物、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，通过维持所需颗粒大小(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
此类组合物还可包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌操作(同上)和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可期望将等渗剂例如糖、氯化钠等包含在组合物中。此外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射药物形式的延长的吸收。
药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于无菌可注射液或分散体的临时制备的无菌粉剂。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途在本领域内是已知的。除非其与所述活性化合物不相容，否则预期任何常规介质或试剂在本发明的药物组合物中的用途。还可将补充的活性化合物掺入组合物中。
药物组合物在制造和贮存的条件下通常必须是无菌和稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适当的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过维持所需颗粒大小(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来产生可注射组合物的延长的吸收。
通过将活性化合物以所需的量与上面列举的成分之一或其组合一起(需要时)掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微过滤来制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物(其含有基本分散介质和所需的来自上面例举的成分的其他成分)来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)(所述方法从其之前的无菌过滤的溶液产生活性成分加任何额外的期望的成分的粉剂)。
可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分的量将视待治疗的受试者和特定的施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分的量通常可以是产生治疗效果的组合物的那个量。通常，除了百分之百外，该量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分(与药学可接受的载体组合)。
调整给药方案以提供最佳期望的应答(例如，治疗应答)。例如，可施用单次推注，可在一段时间内施用数个分开的剂量或可根据治疗情况的紧迫性所要求的，按比例减少或增加剂量。特别有利地以剂量单位形式配制胃肠外组合物以便于剂量的施用和均匀性。本文中使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理上分开的单位；每一个单位包含预先确定量的活性化合物，其经计算与所需的药物载体组合产生期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格(specification)受制于和直接取决于(a)活性化合物的独特特征和要获得的具体治疗效果，和(b)配制用于治疗个体的敏感性的此类活性化合物的领域中固有的限制。
本发明的另一个方面是施用本发明的药物组合物的方法。在本发明的范围内预期，代表性递送方案可包括口服、胃肠外(包括皮下、肌内和静脉内)、直肠、口腔、舌下、经肺、经皮、鼻内和口服途径。优选的递送方案是经鼻施用。
为了进行经鼻施用，可使用固体或液体载体。固体载体包括颗粒大小在例如大约20至大约500微米范围内的粗粉，并且利用通过鼻道快速吸入来施用此类制剂。在使用液体载体的情况下，可将制剂配制为鼻腔喷雾剂或滴剂，并且所述制剂可包含活性成分的油性或水性溶液。
提供适合于经鼻施用的制剂以便将包含活性化合物并且期望直径在0.5至7微米的范围内的颗粒递送入受者的支气管树中。作为一种可能性，此类制剂以细碎粉剂(finely comminuted powder)的形式存在，所述粉剂可方便地在可刺破的胶囊(适当地由例如明胶制成，用于吸入装置)中提供，或可选择地作为包含活性化合物、适当的液体或气体喷射剂和任选地其他成分例如表面活性剂和/或固体稀释剂的自喷射制剂提供。适当的液体喷射剂包括丙烷和氯氟碳类，适当的气体喷射剂包括二氧化碳。还可使用自喷射制剂，其中将活性化合物以溶液或悬浮液的微滴的形式分散。此类自喷射制剂与本领域内已知的自喷射制剂类似并且可通过已建立的方法来制备。适当地，在拥有手动开启的或自动作用的阀门(具有期望的喷射特征)的容器中提供它们；有利地所述阀门是在其每一次操作时递送固定体积例如25至100μl的计量型阀门。作为另外的可能性，活性化合物可以以溶液或悬浮液的形式存在，以用于喷雾器或化雾器，由此将加速的气流或超声搅拌用于产生用于吸入的微滴喷雾。当分散时，此类制剂应当期望地具有范围在10至200微米内的颗粒直径以使得能够保留在鼻腔中；这可通过使用适当颗粒大小的粉剂或选择适当的阀门(适当时)来实现。其他适当的制剂包括颗粒直径在20至500微米范围内的粗粉(通过鼻道通过从紧挨鼻子的容器快速吸入来进行施用)和在水性或油性溶液或悬浮液中包含0.2至5％w/v的活性化合物的滴鼻剂。
组合物的用途
本发明的组合物可用作例如用于治疗、预防和/或延迟神经病症的进展的药物。因此，本文中公开的组合物可用于制造用于治疗或预防神经病症的药物。
在优选实施方案中，此类病症选自偏头痛、抑郁症、阿尔茨海默氏病、帕金森病、精神***症、癫痫、中风、脑膜炎、肌萎缩侧索硬化、失眠、脑膜炎、记忆缺陷、多发性硬化、发作性睡病、中风、创伤性脑损伤和应激。
优选，配制用于鼻内递送的组合物。
实施例
通过下列不应当解释为进一步限定的实施例来进一步举例说明本公开内容。
一般地，除非另外指出，否则本发明的实施使用化学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学(尤其是例如免疫球蛋白技术)的常规技术。参见,例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody EngineeringProtocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,HumanaPr(1996)；Antibody Engineering:A Practical Approach(PracticalApproach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl Pr(1996)；Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow等人,C.S.H.L.Press,Pub.(1999)；Current Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel等人,JohnWiley&Sons(1992)。也参见例如，Polytherics US6803438；EP1701741A2；EP1648518A2；WO05065712A2；WO05007197A2；EP1496941A1；EP1222217B1；EP1210093A4；EP1461369A2；WO03089010A1；WO03059973A2和EP1210093A1)；Genentech US20070092940A1和EP1240337B1；和ESBATech U.S.S.N.60/899,907、PCT/CH2009/000225、PCT/CH2009/000222、PCT/CH2009/000222、WO 06/131013和WO03097697A2。
ESBA105的纯化
如之前所述(Furrer等人(2009)Invest Opthalmol Vis Sci 50,771-778；Ottiger等人(2009)Invest Opthalmol Vis Sci 50,779-786)从大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞纯化ESBA105(具有26.3kDa的分子量的抗TNF-α单链抗体片段)。简而言之，通过在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达，从包含体重折叠，然后进行尺寸排阻层析来产生ESBA105。对于动物研究，以10mg/ml(用于鼻内施用)或0.5mg/ml(用于静脉内注射)于50mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 6.5中配制ESBA105。在用于体内实验的所有制剂中，内毒素含量低于0.1EU，如在LAL凝集测定中测量的。
伊文斯蓝(Evans blue)的鼻内施用
通过经由鼻内途径将0.9％NaCl中的0.3％伊文斯蓝施用给Balb/c小鼠来初步确定将蛋白质靶向CNS的最佳条件。然后在预先确定的时间点上通过CO2吸入来处死动物，收获它们的肺和胃并且就伊文斯蓝的存在进行目视检查。通过在异氟烷(Provet,Lyssach,Switzerland)麻醉下将动物保持仰卧并且以5分钟的间隔用2μl伊文斯蓝处理每一个鼻孔直至达到总共40μl(45分钟)(表1)来获得最佳条件。然后，在所有本文描述的实施方案中，将该方案用于ESBA105的鼻内施用。
ESBA105的鼻内和静脉内施用
在用ESBA105鼻内或静脉内给药之前10天，收集全部动物的预采血样品(prebleed)。在异氟烷(Provet,Lyssach,Switzerland)麻醉下进行ESBA105的鼻内施用。将小鼠以仰卧位放置，利用吸量管以2μl的微滴施用总共40μl(400μg)ESBA105，在总共45分钟的时间内每5分钟处理各个鼻孔1次。对于鼻内PK研究，在第一次鼻内滴注后1、2、4、6、8、10、12和24小时处死4只动物。在一些实验中，将3mMPz-肽(4-苯基偶氮苄基氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg；Bachem,Bubendorf,Switzerland)(通过以短暂可逆的方式引发紧密连接开放来促进细胞旁标志物的运输的渗透增强剂)(Yen和Lee(1994)Journalof Controlled Release 28,97-109)加入至ESBA105制剂。在第一次施用后1、2和4小时处死4只动物。对于静脉内注射，将小鼠置于制动器(restrainer)中，将40μg(80μl)ESBA105注射入尾静脉。根据对于400μg ESBA105的鼻内施用在4小时的时期内观察到的血液浓度-时间曲线下的面积(AUC)，选择静脉内剂量以最接近全身性暴露。在各时间点(1、2和4小时)处死两只动物。在处死时，用***(Ketasol100,65mg/kg；Pharmacy,Schlieren,Switzerland)、赛拉嗪(Rompun,13mg/kg；Provet,Lyssach,Switzerland)和乙酰丙嗪(Prequillan,2mg/kg；Arovet,Zollikon,Switzerland)的混合物深度麻醉小鼠。在用20ml PBS输注小鼠之前通过心脏穿刺收集血液样品。小心地收获脑并且将其解剖成嗅球、大脑(包括丘脑和下丘脑)、小脑和脑干。称取组织的重量，将其在干冰上冷冻并且于-80℃下贮存直至分析。
组织的制备
如下制备组织以用于分析。向15mg脑组织中加入100μl裂解缓冲液(10mM Tris,pH 7.4,0.1％SDS，具有蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics,Rotkreuz,Switzerland))。将组织超声处理5秒(8个循环，100％的强度)(Sonoplus,Bandelin,Berlin,Germany)，离心，然后将上清液经历基于ELISA的ESBA105浓度测定。
血清和脑组织中的ESBA105的定量
通过在直接ELISA中以一式三份测量各样品来测定ESBA105的浓度。在4℃下用0.5μg/ml的在PBS中的人TNF-α(Peprotech,London,UK)包被96孔板(NUNC MaxiSorp；Omnilab,Mettmenstetten,Swi tzerland)过夜。在每一个下列步骤之间，使用微量板洗涤机(ASYSAtlantis,Salzburg,Austria)，用TBS-T(0.005％Tween20；Axon Lab,Baden-Dattwyl,Switzerland)洗涤板3次。通过在PBS/1％BSA/0.2％Tween20中温育1.5小时来饱和非特异性结合位点。在含有10％的各自基质的稀释缓冲液(PBS,0.1％BSA,0.2％Tween20)中制备各样品的预稀释物(predilution)(嗅球、大脑、小脑、脑干或血清)。在稀释缓冲液/10％的各自基质中制备ESBA105的标准参照稀释物系列(50-0.5ng/ml)。然后向孔中加入预稀释的样品和标准参照稀释物，将板在室温下温育1.5小时。用在稀释缓冲液中以1:20'000稀释的生物素化的亲和纯化的多克隆兔抗ESBA105抗体(AK3A,ESBATech,Schlieren,Switzerland)检测结合的ESBA105(1.5小时，室温)。然后，用0.2ng/ml稀释缓冲液的浓度的聚-辣根过氧化物酶链霉抗生物素蛋白(Stereospecific Detection Technologies,Baesweiler,Germany)检测AK3A。将POD(Roche Diagnostics,Rotkreuz,Switzerland)用作过氧化物酶底物，并且在2至20分钟(取决于颜色强度)后通过加入1M HCl来终止显色反应。在酶标仪(Sunrise；Tecan,Maennedorf,Swi tzerland)中在450nm处测量吸光度，通过多项式回归从标准曲线计算样品中ESBA105的浓度(GraphPad Prism 4,03；GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)。ESBA105的最小可定量浓度(LOQ)在血清和脑组中分别为5ng/ml和33ng/ml。将产生的信号低于定量的下限的未稀释的样品设置为LOQ以进行数学评估和图形显示。
实施例1
鼻内施用的模式
本实施例证明，低体积的经鼻施用导致至CNS的特异性递送。为了进行至CNS的有效和特异性药物递送，施用的物质应当保持在鼻腔中；然而，几个研究已显示，鼻内施用的物质可由于呼吸和摄取而迁移至呼吸***和胃肠道(Eyles等人(1999)Int J Pharm 189,75-79；Klavinskis等人(1999)J Immunol 162,254-262；Lundholm等人(1999)Vaccine 17,2036-2042；Trolle等人(2000)Vaccine 18,2991-2998))。本领域技术人员将理解，许多方面(例如麻醉、动物位置和施用的体积和频率)可影响施用的化合物在鼻腔中的驻留时间。通过使用上述鼻内施用方案，将伊文斯蓝用作示踪剂以估量鼻内应用后染料的施用后分布。通过几个不同的方法鼻内施用40-50μl伊文斯蓝。首先，给保持仰卧位的麻醉或警醒小鼠提供单个剂量，这在两种情况下都导致染料迁移至肺和胃。第二，给处于仰卧位的麻醉动物提供单个剂量，进行30至50分钟而非仅3分钟。第三，以2个分开的10μl剂量(以5分钟的间隔施用)施用染料。这些方法中没有一个减少伊文斯蓝至肺和胃的迁移。最后，将低至2μl的体积施用给处于仰卧位的已麻醉的动物，这导致在肺中只有最低痕量的伊文斯蓝并且蓝色染色完全不存在于胃中(表1)。
实施例2
ESBA105至CNS的递送
本实施例证明，scFv的鼻内施用导致scFv至CNS的递送。ESBA105(SEQ ID NO:1)是特异性结合和抑制TNFα的单链抗体(参见例如WO06/131013,其通过引用合并入本文)。在通过上述方案进行鼻内施用后，ESBA105在分析的脑的所有区域中达到显著的浓度，并且在一段时间内展示双峰分布。在第一次滴注后1小时达到小脑和脑干中的最大ESBA105浓度(Cmax)，且1小时后嗅球和大脑中的浓度达到峰值。然后ESBA105的水平在所有脑区域中下降，但在6至12小时后其再度上升，从而在嗅球、小脑和脑干中产生明显的第二、较低水平的浓度峰(图1)，这显示可能存在两个不同的迁移途径。在嗅球和脑干中测量到最高浓度。在通过嗅觉***(嗅神经)连接至鼻腔的嗅球中，浓度在9455ng/ml处达到极点。在通过周围三叉神经***(三叉神经)连接至鼻道的脑干中浓度甚至更高(11067ng/ml)(表2)。大脑中的Cmax(975ng/ml)稍微延迟(2小时)，并且分别为小脑或嗅球中的大约1/7至1/10。这些结果证明，ESBA105首先到达嗅球和脑干并且由此分配至大脑和小脑。与脑干和小脑类似，在第一次施用ESBA105后1小时达到血清中的Cmax并且其在5至10小时之间第二次达到峰值。有趣地，ESBA105的水平在最后12小时中几乎保持恒定(图1)。
实施例3
ESBA105至CNS的递送是直接的
本实施例证明，ESBA105的鼻内施用导致至CNS的直接递送而非通过血流递送。为确定ESBA105是从鼻腔通过BBB直接迁移至CNS还是通过全身性吸收和随后跨BBB递送间接迁移至脑，如上所述将鼻内施用与静脉内注射平行比较。在静脉内注射后，相当高浓度的ESBA105到达所有分析的区域，除了大脑(其中浓度低于定量的下限)。然而，在鼻内施用后在所有脑区域中测量到高得多的药物浓度(图2)。在鼻内给药后小脑和脑干中的最高ESBA105水平为静脉内注射之后的最高水平的大约10至18倍。此外，鼻内施用后嗅球中的Cmax为静脉内施用的60倍高(表3)。令人惊讶地，虽然对于两个途径都将给药设置为产生相似的全身性暴露，但在鼻内施用后血清浓度显著更低(图2),达到6006ng/ml，而在静脉内注射后Cmax为10倍高(63709ng/ml)(表3)。在静脉内注射后，嗅球、小脑和脑干中的最大浓度(Cmax)和暴露(AUC)达到相似的值，对于Cmax分别为202、257和174ng/ml，对于AUC分别为448、567和416ng-h/ml。在静脉内注射后脑组织中的Cmax出现在2小时处，并且在4小时时未能检测到ESBA105。相反地，在鼻内施用后，在所有脑区域中都测量到明显更高的浓度。对于嗅球获得最高值(Cmax:12586ng/ml；AUC:23130ng-h/ml)，然后是脑干(Cmax:3169ng/ml；AUC:7942ng-h/ml)、小脑(Cmax:2819ng/ml；AUC:5908ng-h/ml)和大脑(Cmax:1831ng/ml；AUC:2951ng-h/ml)。此外，与静脉内注射不同，在鼻内施用后4小时在所有脑区域中仍然存在可检测浓度的ESBA105。这些结果证明，ESBA105能够从血液穿过BBB进入CNS，并且最有效的递送途径是经由鼻内施用(表3)。
实施例4
PZ-肽促进ESBA105穿过BBB的递送
本实施例证明，Pz-肽显著增强scFv至CNS的鼻内递送。特别地，通过将3mM Pz-肽加入至ESBA105，然后估量至脑的运输来检查Pz-肽用作运输药物通过BBB的渗透增强剂的能力。在Pz-肽存在的情况下，嗅球、大脑和小脑中的Cmax比使用单独的ESBA105更早出现(在第一次给药后1小时而非2小时)(表4)。此外，Pz-肽的添加导致嗅球和大脑中的Cmax增加2至3倍(分别地，7309至15786ng/ml和1133至3417ng/ml)，而脑干中的Cmax保持未变。与单独施用ESBA105的情况相比较，在共施用ESBA105和Pz肽的情况下，嗅球和大脑中的Cmax的组织对血液的比率显著更高(图3A)。然而对至小脑、脑干和血清的递送的影响较不显著。概括而言，Pz-肽可增强大分子量蛋白质至嗅球和大脑的递送而不增加全身性暴露(图3)。因此，对于治疗性应用，Pz-肽可增强药物递送而不增加全身性副作用的风险(表4)。
表1：施用方案和在0.3％伊文斯蓝染料的鼻内递送后染料的存在。
      
表2:在400μg ESBA105的鼻内施用后的药代动力学参数。
      
表3.在鼻内或静脉内施用ESBA105后的药代动力学参数。
      
      a选择400μg(鼻内)和40μg(静脉内)的剂量以达到相似的全身性暴露。
      b针对1mg标准化的AUC，假定AUC随不同剂量线性增加。
      c等剂量的EBSA105(400μg)的鼻内或静脉内施用。
表4：在使用或不使用3mM Pz-肽鼻内递送400μg ESBA105后的药代动力学参数。
      
表5.scFv、VH和VL序列
      
      
      
表6.接头序列
      
表7.构架序列
      
      
      
表8.渗透增强剂序列
      
等同物
本领域技术人员将认识到或通过只使用常规实验能够确定本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物意欲包括在下列权利要求中。

Claims (18)

1.配制为用于鼻内递送结合抗原的多肽至中枢神经***的组合物，所述组合物包含有效量的结合抗原的多肽和渗透增强剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述结合抗原的多肽特异性结合靶抗原，特别是TNFα，所述靶抗原选自：TNF-α、β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白衍生的可扩散配体受体、单胺氧化酶-B、L-3,4-二羟苯丙氨酸脱羧酶、乙酰辅酶A羧化酶、N-甲基-D-天冬氨酸受体(也称为GRIN1)、GRINA、GRIN2D、GRIN2C、GRIN3B、GRIN2A、GRIN2B、GRIN3A、组胺H1受体、毒蕈碱受体(也称为CHRM1)、CHRM2、CHRM3、CHRM4、下丘泌素受体1、下丘泌素受体2、5-羟色胺(也称为HTRlA)、多巴胺受体(也称为DRD1)、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、肾上腺素能β1受体、去甲肾上腺素转运蛋白(NET)和多巴胺D2受体。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述结合抗原的多肽是scFv。
4.权利要求3的组合物，其中所述scFv包含与SEQ ID No:20、SEQID No:21、SEQ ID No:22、SEQ ID No:23、SEQ ID No:24、SEQ ID No:25、SEQ ID No:26或SEQ ID No:27具有至少80％的相似性的氨基酸序列。
5.权利要求3的组合物，其中所述scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含与SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10或SEQ ID No:35具有至少80％的相似性的氨基酸序列。
6.权利要求3的组合物，其中所述scFv包含VL结构域，所述VL结构域包含与SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15或SEQ ID No:34具有至少80％的相似性的氨基酸序列。
7.权利要求3的组合物，其中所述scFv包含与SEQ ID No:1、SEQID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:33具有至少80％的相似性的氨基酸序列。
8.权利要求3的组合物，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:36或SEQ IDNO:37具有至少80％的相似性的氨基酸序列。
9.前述权利要求的任一项的组合物，其中所述结合抗原的多肽共价连接至所述渗透增强剂。
10.前述权利要求的任一项的组合物，其中所述渗透增强剂是末端连接至保护基团的肽。
11.权利要求10的组合物，其中所述渗透增强剂是Pz-肽或FMOC-肽。
12.前述权利要求的任一项的组合物，其中通过使用固体或液体载体施用所述组合物。
13.前述权利要求的任一项的组合物，其中所述组合物以粉剂、喷雾剂或滴剂施用。
14.权利要求1-13任一项的组合物在制备用于治疗神经病症的药物中的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述病症选自偏头痛、抑郁症、阿尔茨海默氏病、帕金森病、精神***症、癫痫、中风、脑膜炎、肌萎缩侧索硬化、失眠、脑膜炎、记忆缺陷、多发性硬化、发作性睡病、中风、创伤性脑损伤和应激。
16.权利要求14的用途，其中所述神经病症是中枢神经***(CNS)的病症。
17.权利要求16的用途，其中所述中枢神经***(CNS)的病症是肿瘤。
18.权利要求17的用途，其中所述肿瘤是脑肿瘤或脊髓肿瘤。
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