KR101635917B1 - 안정한 가용성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 응집 성향을 감소시키도록 변경된 항체 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 특히 TNF의 안정성, 가용성, 시험관내 및 생체내 결합, 및 저면역원성에 대해 최적화된 특이적 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 TNF에 특이적인 안정한 가용성 scFv 항체 및 Fab 단편을 제공한다. 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 이들의 분리방법 및 의약에서 상기 항체의 용도도 또한 개시된다.

Description

안정한 가용성 항체{STABLE AND SOLUBLE ANTIBODIES}
관련출원 상호참조
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 2010년 10월 22일 출원된 미국 임시 특허출원 제 61/405,798호 및 2011년 5월 11일 출원된 미국 임시 특허출원 제 61/484,749호를 우선권으로 주장하며, 이들의 전체내용은 본 원에 참고로 원용된다.
발명의 분야
본 발명은 항체의 응집 성향을 감소시키는 방법, 응집 성향을 감소시키도록 변경된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 안정성, 가용성 및 저면역원성에 대해 최적화된 특이적인 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는, scFv 항체 및 Fab 단편을 비롯한 응집 감소 변경을 포함하는 안정한 가용성 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TNFα-매개 장애의 진단 및/또는 치료방법에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 알파 (TNFα, 또한, 카켁틴이라도 함)는 내독소 또는 다른 자극에 반응하여 단핵구 및 대식세포를 포함한 다수의 세포 타입들에 의해 생산되는 천연적인 포유류 사이토카인이다. TNFα는 염증 반응, 면역 반응 및 병리생리학적 반응의 주요 매개체이다(Grell, M. , et al. (1995) Cell, 83: 793-802).
가용성 TNFα는 전구체 막관통 단백질의 절단에 의해 형성되며 (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53), 분비된 17 kDa의 폴리펩티드는 가용성 동형삼량체 복합체로 조합된다(Smith, et al.(1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; TNFA에 대한 리뷰는 Butler, et al. (1986), Nature 320:584 참조함; Old (1986), Science 230: 630). 그 후, 이 복합체는 다양한 세포 상에서 발견되는 수용체에 결합한다. 결합으로, (i) 인터루킨 IL-6, IL-8 및 IL-1과 같은 다른 전-염증성 사이토카인의 분비, (ii) 매트릭스 메탈로프로테이나제의 방출 및 (iii) 내피 유착 분자의 발현 상향 조절 등의, 일련의 전-염증성 작용이 이루어지게 되며, 나아가 백혈구를 혈관외 조직으로 끌어 들여 염증 및 면역 케스케이드를 증폭한다.
다수의 장애들이 TNFα의 농도 증가와 연관되어 있으며, 이들 대부분은 의학적으로 매우 중요하다. TNFα는 류마티스 관절염(RA), 크론 질환 및 궤양성 대장염 등의 염증성 장 질환, 패혈증, 울혈성 심부전, 기관지 천식 및 다발성 경화증을 비롯한 다수의 인간 질환들에서 상향 조절된 것으로 확인되었다. 인간 TNFα로 형질전환된 마우스에서는 구성적으로 TNFα가 고농도로 생산되며, RA와 유사하게 자발적이고 파괴적인 다관절염이 발생된다(Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). 따라서, TNFα는 전-염증성 사이토카인으로 지칭된다.
현재, TNFα는, 전신 열, 불안감 및 피로 증상과 함께, 다관절성 관절 염증 및 손상이 특징인 만성의 진행성 및 소모성 질환인 RA의 발병에 주된 요소로 잘 인지되고 있다. 또한, RA는 만성적인 활액 염증을 유도하며, 빈번히 관절 연골 및 골 손상으로 진행된다. TNFα의 농도 증가는 RA를 앓고 있는 환자의 활액 체액과 말초 혈액 모두에서 확인된다. TNFα 차단제를 RA 환자에게 투여하면, 염증이 경감되고, 증상이 개선되며, 관절 손상이 지연된다(McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208).
또한, TNFα는, 생리적으로는, 특정 감염원에 대한 보호와 관련있다(Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28). TNFα는 그람 음성 박테리아의 리포폴리사카라이드에 의해 활성화 되어진 대식세포로부터 방출된다. 이와 같이, TNFα는 박테리아 패혈증과 관련된 내독소 쇼크 발병 및 병태 발생에 관여하는 매우 중요한 내인성 매개체이다(Michie, et al. (1989), Br. J.Surg. 76:670-671; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. et al. (1990), J. Infect. Dis. 161:982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-170).
또한, TNFα는, 다른 장기 시스템에서와 같이, 중추 신경계에서, 특히 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군 및 중증 근무력증 등의 신경계의 염증 및 자가면역 장애, 및 알츠하이머 질환, 파킨슨병 및 헌팅턴병 등의 신경계의 퇴행성 장애에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, TNFα는 시신경염, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 피부근염, 근위축성 측삭 경화증 및 근이영양증 등의 망막과 근육 관련 시스템의 장애 뿐만 아니라 외상성 뇌 손상, 급성 척수 손상 및 뇌졸증 등의 신경계 손상에 관여한다.
간염은, 다른 유발제들 중에서도, 엡스타인-바, 사이토메갈로바이러스 및 A-E형 간염 바이러스 등의 바이러스 감염에 의해 유발될 수 있는, TNFα와 관련있는 다른 염증 장애이다. 간염은 간문과 소엽 부위에 급성 간 염증을 유발하며, 이후 섬유증 및 종양으로 진행된다. 또한, TNFα는 암에서 악액질을 매개할 수 있으며, 대부분 암 사망 및 치사에 원인이 된다(Tisdale MJ. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305).
염증, 세포성 면역 반응 및 다수 질환의 병인에서, TNFα가 수행하는 주된 역할은, TNFα의 길항제에 대한 연구로 이어졌다. TNFα 매개 질환의 치료용으로 고안된 TNFα 길항제의 한가지 유형은, TNFα에 특이적으로 결합하여 TNFα의 기능을 차단하는 항체 또는 항체 단편이다. 항-TNFα 항체를 사용하였을 때, TNFα의 차단이, IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, 유착 분자 및 조직 파괴의 감소 등의, TNFα에 기인한 효과들을 반전시킬 수 있는 것으로 확인되었다(Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997: 283-350). 최근 상업적으로 이용할 수 있게 된 TNFα의 특이적인 저해제로는, RA 및 크론 질환의 치료에 대한 임상 효능이 입증된, TNFα에 대한 모노클로날 키메라 마우스-인간 항체(인플릭시맵(infliximab), Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson)가 있다. 이러한 진보에도 불구하고, RA와 같은 TNFα-관련 장애를 치료하는데, 새롭고 유효한 항체 또는 다른 항체가 여전히 요구되고 있다. 특히, 관절염과 그외 TNFα-매개 질환의 효과적이고 계속적인 치료를 위한, 최적의 기능적 특성을 갖춘 항체가 절실히 요구되고 있다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 하나의 항체의 응집-감소 돌연변이를 포함하는 항체 및 상기 항체의 제조방법을 제공한다.
일 측면으로, 본 발명은 항체의 가변경쇄와 가변 중쇄 사이 인터페이스에 관여하는 잔기 위치에 하나 이상의 응집-감소 변경을 도입하는 것을 포함하고, 여기에서 치환은 가변경쇄와 가변 중쇄 간의 자유 에너지를 적어도 0.5 kcal/mol로 감소시킴으로써, 변경된 항체의 응집 성향을 응집-감소 변경(들)를 갖지 않는 친 항체의 것에 비해 감소시키는, 항체의 응집 성향을 감소시키는 방법을 제공한다
일 측면으로, 본 발명의 방법은 항체의 가변 경쇄 (VL)와 가변 중쇄 (VH)의 인터페이스에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하는 것을 포함하고, 여기에서 하나 이상의 치환은 VL과 VH 간의 자유 에너지를 적어도 10% 감소시키도록 선택된 잔기에 위치함으로써 항체의 응집 성향을 친 항체의 것에 비해 감소시킨다. 특정 측면으로, 항체의 가변 경쇄의 서열은 서열 번호 1의 서열과 적어도 65% 동일성을 가진다. 다른 측면으로, 가변 중쇄 서열은 서열 번호 3의 서열 또는 서열 번호 4의 서열과 적어도 85% 동일성을 가진다.
특정 측면으로, 본 발명의 방법은 항체의 가변 경쇄에서 50번 AHo 위치에 잔기 및/또는 47번 AHo 위치에 잔기를 변경하여 항체의 응집 성향을 친 항체의 것에 비해 감소시키는 것을 포함한다. 다른 측면으로, 본 발명의 방법은 추가로 가변 중쇄의 AHo 12, 103, 및 144번 위치에 잔기를 변경하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 응집-감소 변경을 포함하는 응집 성향이 감소된 항체를 제공한다. 특정 측면으로, 본 발명의 항체는 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 또는 선형 항체이다. 다른 측면으로, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 이중특이적 또는 2가 분자를 제공한다.
다른 측면으로, 응집-감소 변경은 가변 경쇄의 50번 AHo 위치에서이다. 특정 측면으로, 응집-감소 변경은 가변 경쇄의 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R)을 포함한다. 또 다른 측면으로, 응집-감소 변경은 가변 경쇄의 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R)에 의한 라이신 (K)의 치환을 포함한다.
또 다른 측면으로, 응집-감소 변경은 가변 경쇄의 47번 AHo 위치에서이다. 특정 측면으로, 응집-감소 변경은 가변 경쇄의 47번 AHo 위치에 아르기닌 (R)을 포함한다. 또 다른 측면으로, 응집-감소 변경은 가변 경쇄의 47번 AHo 위치에 아르기닌 (R)에 의한 라이신 (K)의 치환을 포함한다.
본 발명은 또한 TNFα의 안정성, 가용성, 시험관내 및 생체내 결합성과 낮은 면역원성에 대해 최적화된 특이적인 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는, TNFα에 특이적인 안정적이고 가용적인 항체를 제공한다. 이러한 항체는 TNFα-매개 장애의 진단 및/또는 치료용으로 고안된다. 또한, 본 발명의 재조합 항체, 가변성 경쇄 및 가변성 중쇄를 발현시키기 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 상기 항체의 분리 방법, 및 의학에서의 상기 항체의 용도를 기술한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TNFα 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, TNFα-매개 장애의 치료방법을 제공한다. 특정 측면으로, TNFα-매개 장애는 포도막염, 베체트병, 망막염, 건성안, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병 신경병증, 공막염, 연령관련 황반변성 및 각막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 안질환이다.
본 발명의 바람직한 특정 구체예는 이후 특정의 바람직한 구체예의 보다 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1은 상이한 두 scFv 분자, 34rFW1.4 (검은색) 및 578rFW1.4 (회색)에서 잔기 위치 VL47 (실선) 및 VL50 (점선)의 적정 곡선을 나타낸다.
도 2A는 40 ℃에서 60 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 2B는 40 ℃에서 60 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_VLK50R_DHP의 안정성을 나타낸다.
도 3A는 40 ℃에서 40 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 3B는 40 ℃에서 40 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_VLK50R_DHP의 안정성을 나타낸다.
도 4A는 40 ℃에서 20 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 4B는 40 ℃에서 20 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_VLK50R_DHP의 안정성을 나타낸다.
도 5A는 40 ℃에서 60 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 5B는 40 ℃에서 60 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_VL_K50R의 안정성을 나타낸다.
도 6A는 40 ℃에서 40 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 6B는 40 ℃에서 40 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_VLK50R의 안정성을 나타낸다.
도 7A는 40 ℃에서 20 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 7B는 40 ℃에서 20 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_VLK50R의 안정성을 나타낸다.
도 8A는 40 ℃에서 60 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 8B는 40 ℃에서 60 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_K47R의 안정성을 나타낸다.
도 9A는 40 ℃에서 20 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4의 안정성을 나타낸다.
도 9B는 40 ℃에서 20 mg/ml 농도를 사용하여 2 주 인큐베이션한 후, SE-HPLC 분석으로 결정된 가속 조건하에 34rFW1.4_K47R의 안정성을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일반적인 목적은 용액에서 감소된 응집 성향을 나타내는 안정적이고 가용적인 항체를 제공하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 scFv 항체 또는 Fab 단편이다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 본 원에 개시된 바와 같은 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
본 원에서 제시된 세부내용은 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하고 설명하기 위함이며, 본 발명의 다양한 구체예의 원리 및 개념적인 측면을 가장 유용하고 이해가 쉽게 설명할 목적으로 제공된다. 이와 관련하여, 본 발명의 구조적인 세부 사항을 본 발명의 기본적인 이해에 필요한 것 이상으로 상세히 나타내지는 않았으며, 본 발명의 다수 양태를 실시하기 위한 구체적인 방법은 도면 및/또는 실시예와 관련한 설명으로부터 당업자들에게 자명하다.
본 발명을 좀 더 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어들을 다음에 정의할 것이다. 추가 정의는 상세한 설명을 통해 서술한다. 이하 정의 및 설명은 하기 실시예에서 분명하고 명백하게 변형되지 않거나, 또는 의미 적용이 해석상 의미가 없거나, 사실상 의미가 없는 경우, 임의의 추후 구성에서 규제되도록 의도된다. 용어 해석으로 의미가 없거나, 사실상 의미가 없는 경우에는, 정의를 웹스터 사전 3판, 또는 당업자들에게 공지된 사전, 예컨대 옥스포드 생화학 분자생물학 사전(Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)의 것을 따르면 된다.
본 원에 사용된 용어 "항체"는 항체 전체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분", "항원 결합 폴리펩티드" 또는 "면역결합제") 또는 이들의 단일쇄를 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 쇄간 연결되어 있는 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 이들의 항원 결합 부분을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (여기서는 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (여기서는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 이루어져 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된, 더욱 잘 보존된 영역과 함께 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된, 초가변성 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 배열된, 3개의 CDR와 4개의 FR로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호반응하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 여러 세포 (예, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 (예, TNF)을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진, 단일 도메인 또는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 342:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL과 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩된다 하여도, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL과 VH 영역이 쌍을 이뤄 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)를 형성하도록 이들이 단일 단백질 쇄가 되도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기와 같은 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"내에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자들에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 무손상 항체와 동일한 방법으로 유용성에 대해 선별된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 항체는 상이한 동종형일 수 있으며, 예를 들면, IgG (예, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체일 수 있다.
용어 "프레임워크 (framework)"는 좀 더 분기적인 CDR 영역 사이에 존재하는 업계에서 인식되는 항체 가변 영역의 부분을 언급한다. 그러한 프레임워크 영역은 전형적으로 프레임워크 1 내지 4 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)를 가리키며, CDR이 항원-결합 표면을 형성할 수 있도록 하는 것과 같이, 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 영역에서 발견되는 3개의 CDR를 3차원 공간에서 유지시키기 위한 스캐폴드를 제공한다. 그러한 프레임워크는 또한 이들이 좀 더 분기적인 CDR의 표현용 지지체를 제공하는 것과 같이 스캐폴드로 언급될 수 있다. 안키린 반복체 (ankyrin repeat) 및 피브로넥틴과 같은, 면역글로불린 슈퍼패밀리의 다른 CDR 및 프레임워크가 항원 결합 분자로 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,300,064호, 제6,815,540호 및 미국 공개 공보 제20040132028호 참조).
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상의 부위를 언급한다(예, TNF). 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 배열에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 다음 문헌을 참조한다: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996).
용어 "특이적인 결합", "선택적인 결합", "선택적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"는 미리 정해진 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 의미한다. 전형적으로, 항체는 예컨대 BIACORE 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법으로 결정된 바에 따르면, 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 친화성(KD)으로 결합한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수이다. 전형적으로, 본 발명의 일부 항체는, 예컨대 BIACORE 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법으로 결정된 바에 따르면, 해리 평형 상수(KD) 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만으로 TNF에 결합한다.
본 원에서, "동일성"은 2개의 폴리펩티드, 분자 또는 2개의 핵산 간의 서열 매칭(matching)을 의미한다. 비교하는 2개의 서열들 모두 한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛이 있는 경우(예, 2가지 DNA 분자 각각의 한 위치에 아데닌이 존재하거나, 또는 2개의 폴리펩티드 각각에서 한 위치에 라이신이 존재하는 경우), 각 분자는 그 위치가 동일한 것이다. 2개의 서열 간의 "동일성%"은 두 서열이 공유하고 있는 매칭 위치의 갯수를 비교하는 위치의 갯수로 나누고, 100을 곱한 함수값이다. 예컨대, 2개 서열에서 위치 10 곳 중 6곳이 매칭된다면, 두 서열은 60％ 동일성을 갖는다. 예를 들면, DNA 서열 CTGACT와 CAGGTT는 50％ 동일성을 공유한다(전체 6개 중 3개의 위치가 매칭됨). 일반적으로, 두 서열이 최대 동일성을 갖도록 정렬하여, 비교한다. 이러한 정렬은 예컨대, ALIGN 프로그램(Align program)(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램으로 통상적으로 수행되는, Needleman et al. (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453의 방법을 사용하여 제공할 수 있다. 2개의 아미노산 서열간의 동일성%는 또한 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 이용하여, PAM120 웨이트(weight) 잔기 테이블, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4로 설정하여 정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 동일성%는 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능함)에서 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J MoI Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 이용하여 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스에서, 갭 웨이트 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4와 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 설정하여 정할 수 있다.
"유사한" 서열은 정렬하였을 때 동일하고 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 서열로서, 유사한 잔기는 정렬된 참조 서열내 대응되는 아미노산 잔기에 대한 보존적 치환이다. 이와 관련하여, 참조 서열에서 잔기의 "보존적 치환"은 대응되는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기, 예컨대, 크기, 형태, 전기적 전하, 및 공유 결합 또는 수소 결합 형성 능력과 같은 화학적 성질 등이 유사한 잔기에 의한 치환이다. 따라서, "보존적 치환으로 변형된" 서열은 하나 이상의 보존적 치환이 존재한다는 점에서 참조 서열 또는 야생형 서열과는 다른 서열이다. 2개의 서열 간의 "유사성%"는 두 서열이 공유하는, 매칭 잔기나 보존적 치환을 포함하는 위치의 갯수를 비교한 위치의 갯수로 나누고, 100을 곱하여 얻은 함수 값이다. 예컨대, 2개의 서열에서 10개 위치 중 6곳이 매칭되고, 10개 위치중 2곳이 보존적 치환을 포함한다면, 이들 두 서열은 80％의 포지티브 유사성을 갖는다.
본 원에서 사용되는 용어 "보존적인 서열 변형"은 그 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 불리하게 작용하지 않거나 결합 특성을 변경시키지 않는 아미노산 변형을 의미한다. 이러한 보존적인 서열 변형은 뉴클레오티드와 아미노산의 치환, 부가 및 결손을 포함한다. 예컨대, 변형은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같이, 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법에 의해 도입할 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은, 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환하는 치환이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기 패밀리들은 당해 기술 분야에 정해져 있다. 이러한 패밀리들로는, 염기성 측쇄(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있다. 따라서, 특정 항체에서 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환한다. 항원 결합성이 없어지지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적인 치환을 정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(참조예: Brummell et al, Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al Proc. Natl Acad. Set USA 94:412-417 (1997)).
본 원에서 사용되는 "아미노산 컨센서스 서열"은, 각 위치에 가장 빈번하게 나타나는 아미노산 잔기를 결정할 수 있도록 정렬에서 갭을 허용하여, 적어도 2가지, 바람직하게는 그 이상의 정렬된 아미노산 서열들의 매트릭스를 이용하여 생성할 수 있는 아미노산이다. 컨센서스 서열은 각 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산을 포함하는 서열이다. 2가지 이상의 아미노산이 단일 위치에서 균등하게 나타나는 경우, 컨센서스 서열에 이러한 아미노산 둘 또는 모두가 포함된다.
단백질의 아미노산 서열은 다양한 수준으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 보존성 또는 가변성은 단일 잔기 수준으로, 다중 잔기 수준으로, 갭을 포함하는 다중 잔기 수준 등으로 나타낼 수 있다. 잔기는 동일한 잔기의 보존을 나타내거나 또는 클래스 수준에서 보존될 수 있다. 아미노산 클래스의 예로는 비전하성 극성 R기 (세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민); 양전하성 R기 (라이신, 아르기닌, 및 히스티딘); 음전하성 R기 (글루탐산 및 아스파르트산); 소수성 R기 (알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신); 및 특수 아미노산 (시스테인, 글리신 및 프롤린)을 포함한다. 다른 클래스들도 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 이는 구조 결정법이나 치환가능성을 평가하는 다른 데이타를 사용함으로써 규명할 수 있다. 이러한 의미에서, 치환가능한 아미노산은 그 위치에서 치환가능하며, 기능적 보존성을 유지할 수 있는 임의의 아미노산을 지칭할 수 있다.
그러나, 동일 클래스의 아미노산도 생리물리학적 특성 수준에서 다양할 수 있음을 알게 될 것이다. 예컨대, 특정 소수성 R기(예, 알라닌, 세린 또는 트레오닌)는 다른 소수성 R기(예, 발린 또는 류신) 보다 친수성이 더 높다(즉, 보다 높은 친수성 또는 보다 낮은 소수성)는 것을 알게 될 것이다. 상대적인 친수성 또는 소수성은 당해 기술 분야에서 인지되는 방법을 이용하여 정할 수 있다(예, Rose et al, Science, 229: 834-838 (1985) 및 Cornette et al, J. MoI. Biol, 195: 659-685 (1987) 참조).
본 원에서, 한가지 아미노산 서열 (예, 제1 VH 또는 VL 서열)을 하나 이상의 다른 아미노산 서열 (예, 데이타베이스에서 하나 이상의 VH 또는 VL 서열)과 함께 정렬하였을 때, 하나의 서열 (예, 제1 VH 또는 VL 서열)내 아미노산 위치를 하나 이상의 다른 아미노산 서열내 "대응되는 위치"와 비교할 수 있다. 본 원에서, "대응되는 위치"는, 서열을 최적으로 정렬하였을 때, 즉, 동일성(％) 또는 유사성(％) 값이 최고치로 수득되게 서열을 정렬하였을 때, 비교하고 있는 서열(들)간의 등가의 위치를 의미한다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 가리킨다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥이며, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 핵산이, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 위치된 경우, "작동가능하게 연결"된다. 예컨대, 프로모터 또는 인핸서가, 서열의 전사에 영향을 미친다면, 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체, 본 발명의 가변 경쇄, 및/또는 본 발명의 가변 중쇄를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열 번호 2 또는 서열 번호 14와 적어도 97% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드; 또는 서열 번호 10 또는 서열 번호 17과 적어도 96% 동일한 항체를 코딩한다.
용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한가지 타입은 부가적인 DNA 세그먼트를 연결시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 가리키는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 타입은, 바이러스 게놈에 부가적인 DNA 세그먼트들을 연결시킬 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예, 박테리아의 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피좀 포유류 벡터). 그외 벡터(예, 비-에피좀 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 그로 인해 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포일 수 있다. 형질전환이 용이한 박테리아로는, 에셔리키어 콜리(Escherichia coli) 또는 살모넬라 균주와 같은 장내세균과; 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스과; 폐렴 쌍구균; 연쇄구군 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)에 속하는 균주가 있다. 적합한 미생물로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)가 있다. 적합한 동물 숙주 세포주로는 CHO (중국 햄스터 난소 세포주) 및 NSO 세포가 있다.
용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 본 원에 기술된 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다. "치료" 방법은, 이러한 치료가 필요한 대상에게, 예로 TNFα-매개 장애를 가진 대상 또는 궁극적으로 이러한 장애에 걸릴 수 있는 대상에게, 장애 또는 재발성 장애의 한가지 이상의 증상을 예방, 치유, 지연, 중증도 감소 또는 완화하기 위해, 또는 이러한 치료를 하지 않았을 때 예상되는 것 보다 대상의 생존을 연장시키기 위해, 본 발명의 항체를 투여하는 것을 이용한다.
용어 "TNF-매개 장애"란 일반적으로 TNF의 관여를 필요로 하는 임의의 장애, 증상의 개시, 진행 또는 지속을 비롯한, TNF가 연관되는 질환 상태 및/또는 증상을 의미한다. 예시적인 TNF-매개 장애로는, 연령관련 황반변성, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 수정체뒤 섬유증식, 유방암종, 폐암종, 위암종, 식도암종, 결장직장암종, 간암종, 난소암종, 코마, 남화아세포종, 자궁경부암종, 자궁내막암종, 자궁내막 이상증식, 자궁내막증, 섬유육종, 융모암종, 두경부암, 비인두암종, 후두암종, 간아세포종, 카포시육종, 흑색종, 피부암종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관모세포종, 췌장암종, 망막아종, 성상세포종, 교아종, 신경초종, 희돌기교종, 수모세포종, 신경아세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요로암종, 갑상선암종, 빌름스 종양, 신세포암종, 전립선암종, 모반증 관련 이상혈관증식, 부종 (예컨대 뇌종양과 관련된 것), 메이그 증후군, 류마티스성 관절염, 건선 및 죽상동맥경화증이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. TNF-매개 장애는 또한 건성안 및 TNF-관련 염증성 증상, 예컨대 안염증, 알레르기성 결막염, 피부염, 비염, 및 천식을 포함하고, 예를 들어, TNF-관련 염증성 증상에 직접 또는 간접적으로 이르는 TNF 활성화에 의한 세포 변성을 포함한다. 또, TNF-매개 장애는 또한 안혈관형성, 베체트병, 망막염, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병 신경병증, 공막염, 각막염 및 포도막염을 포함한다.
용어 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 바람직한 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료적 유효량"은 질병과 이 질병을 이미 앓고 있는 환자에서의 관련 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 억제하는데 충분한 양으로 정의된다. 이러한 용도에 유효한 양은 치료중인 장애의 중증도와 환자의 면역 시스템의 전반적인 상태에 따라 결정될 것이다.
용어 "대상"은 임의의 인간 또는 인간을 제외한 동물을 지칭한다. 예컨대, 본 발명의 방법 및 조성물은 TNF-매개 장애를 가진 대상을 치료하는데 사용할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에서 아미노산 잔기의 위치를 식별하기 위해, 본 원에 사용하는 번호 지정 체계는, A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670 (AHo 체계)에서 규정된 체계에 따른다. AHo 체계와 Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에서 규정된 가장 많이 사용되는 체계 간의 변환표는, A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670에 제시되어 있다.
본 원에 사용된 용어 "응집"은 용액에서 올리고머 종의 형성을 일으키는 단량체 분자간의 분자간 상호작용/회합 과정을 가리킨다. 응집은 농축 용액에서 가속 안정성 연구를 이용하여 스트레스 조건하에 평가될 수 있다. 가속 안정성 연구는 극한 저장 조건을 사용하여 화합물의 분해, 응집 또는 화학적 변경 속도를 증가시키도록 설계된다. 스트레스 연구로도 알려진 가속 안정성 연구는 전형적으로 40 ℃ 및 실온에서 수행된다. 이들 안정성 연구는 스트레스 조건으로도 알려져 있는 보통의 라벨 저장 조건밖의 환경 조건 노출 효과에 대해 유용한 정보를 제공한다. 고 단백질 농도 용액이 제약업계에서 널리 사용되고 있다. 고 농도에서 단백질의 용액 거동은 이들 용액에서 열역학적 비이상성으로 인해 묽은 용액 분석에 기초해 예상되는 것과 상당히 다를 수 있다. 이들 시스템에서 관찰된 비이상성은 단백질-단백질 상호작용 (PPI)과 관련된다. 상이한 타입의 힘이 이들 PPI의 전체 특성 및 정도를 결정하는데 중요한 역할을 하며, 이들의 상대적 기여는 용질 및 용매 성질로 영향을 받는다. PPI의 역할은 이들 분자간 힘에 의해 물리적 안정성 및 단백질 자기-회합 및 응집을 비롯한 용액 특성을 제어하도록 추진된다. 농축 용액은 PPI가 올리고마화 속도 증가로 용액중의 단백질에 영향을 미치는 용액이다. 농축 용액은, 예를 들어, 단백질 농도가 적어도 10 mg/ml일 수 있다.
상기 과정의 가용성 산물은 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC로 검출될 수 있다. 본 원에 사용된 용어 "응집-감소 변경"은 본 원에 기술된 바와 같이 친 항체에 비해용액에서 항체의 응집 성향을 감소시키는 변경, 예컨대 아미노산 치환을 가리킨다. "친" 항체는 응집-감소 변경을 갖는 대응 항체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 친 항체는 변경된 항체와 동일한 CDR을 가질 수 있고, 가변 경쇄 서열에서 47번 및/또는 50번 AHo 위치에 잔기를 제외하고 변경된 항체와 정확히 동일한 서열을 가질 수 있으며, 가변 중쇄 서열에서 AHo 12, 103, 및 144번 위치가 추가로 상이할 수 있다. 친 항체가 본 발명의 방법에 따라 변경된 항체에 존재하는 응집-감소 변경을 함유하지 않는 한, 다른 차이가 또한 존재할 수 있다.
본 원에 사용된 용어 "인터페이스"란 항체의 두 가변 도메인 (중쇄 및 경쇄 가변 도메인) 사이의 상호작용을 가리킨다. 인터페이스는 가변 도메인 사이의 상호작용에 직 간접적으로 참여하는 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 상호작용은 모든 종류의 비결합 상호작용, 예를 들어 판데르발스힘, 수소결합, 정전기 항목, 및 두 도메인간 소수성 상호작용을 포함하나 이로만 제한되지는 않는다.
다르게 정의되지 않으면, 본 원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 또는 시험에 본 원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질을 사용할 수 있지만, 적합한 방법과 물질을 하기에 기술한다. 상충되는 경우, 정의부를 비롯한 본 명세서가 적용될 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 다양한 측면들은 하기 세부 항목에서 더욱 상세하게 설명된다. 다양한 구체예들, 선호도 및 범위는 임의로 조합할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 특정 구체예, 선택된 정의, 구체예 또는 범위에 의존되지 않는다.
일 측면으로, 본 발명은 생체내에서 TNFα에 결합하여 TNFα의 기능을 차단하기에 적합한 항체를 제공한다.
특정 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 본 발명의 항체가 친/비변경된 항체에 비해 감소된 응집 성향을 가지도록, 친 항체에 비해 응집-감소 변경(들)이 최적화된다. 이러한 변경(들)은 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 인터페이스에 관여하는 특정 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 응집-감소 변경은 본 원에 기술된 바와 같이, 실리코 모델링 방법에서 친 항체의 VL-VH 인터페이스의 자유 에너지에 비해 VL-VH 인터페이스의 자유 에너지를 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 변경은 VL-VH 인터페이스의 자유 에너지에 관여하는 특정 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구체예에 있어서, 본 발명의 응집-감소 변경은 VL 쇄에서 50번 AHo 위치에서의 치환을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 치환은 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R)이다. 다른 구체예에 있어서, 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R)이 라이신 (K)을 대체한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 응집-감소 변경은 VL 쇄에서 47번 AHo 위치에서의 치환을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 치환은 47번 AHo 위치에 아르기닌 (R)이다. 다른 구체예에 있어서, 47번 AHo 위치에 아르기닌 (R)이 라이신 (K)을 대체한다.
AHo 번호 지정 체계는, [Honegger, A. and Plυeckthun, A. (2001) J MoI. Biol. 309:657-670)]에 상세히 기술되어 있다. 가변 경쇄에서 50번 AHo 위치는 카바트(Kabat) 42번 위치에 해당한다. 가변 경쇄에서 47번 AHo 위치는 카바트 39번 위치에 해당한다. 카바트 번호 지정 체계는 카바트 등에 의한 (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 추가로 기술되어 있다. AHo 체계와 가장 일반적으로 사용되는 카바트 등에 의해 정의된 체계 간의 변환표가 [A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670]에 제공되었다.
하기 변환표는 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에서 아미노산 잔기의 위치를 식별하기 위해 사용되는 두개의 상이한 번호 지정 체계에 대한 것이다. 카바트 번호 지정 체계는 카바트 등에 의한 (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 기술되어 있다. AHo 번호 지정 체계는 [Honegger, A. and Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670)]에 추가로 기술되어 있다.
Figure 112013044234331-pct00001
Figure 112013044234331-pct00002
Figure 112013044234331-pct00003
Figure 112013044234331-pct00004
본 발명의 항체는 필요에 따라 추가 변경을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 미국 특허 출원 제 12/973,968호에 기술된 방법에 따라 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키기 위한 아미노산 치환 및/또는 WO 09/155725호에 기술된 바와 같이, 항체의 가용성을 향상시키기 위한 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 중쇄 12번 위치에 세린 (S) (AHo 번호 지정); 중쇄 103번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정) 및/또는 중쇄 144번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 포함한다. 또한, 항체는 중쇄 97, 98 및/또는 99번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 중쇄 12번 위치에 세린 (S) (AHo 번호 지정), 중쇄 103번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정) 및 중쇄 144번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 경쇄를 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00005
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 경쇄를 포함한다 (CDR은 밑줄 침):
Figure 112013044234331-pct00006
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 중쇄를 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00007
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 중쇄 프레임워크를 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00008
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 중쇄를 포함한다 (CDR은 밑줄 침):
Figure 112013044234331-pct00009
본 원에 사용된 X 잔기는 CDR 삽입 부위이다. X는 임의의 천연 아미노산일 수 있으며; 3개 이상 최대 50개의 아미노산이 존재할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체의 가변 경쇄 프레임워크는 서열 번호 1을 포함하고, 가변 중쇄 프레임워크는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4를 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체의 가변 경쇄 프레임워크는 서열 번호 1에 적어도 65% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 서열은 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R)을 가진다. 다른 구체예에 있어서, 상기 서열은 47번 AHo 위치에 아르기닌 (R)을 가진다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체의 가변 중쇄 프레임워크는 서열 번호 3에 적어도 80% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 중쇄 12번 위치에 세린 (S) (AHo 번호 지정), 중쇄 103번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정) 및 중쇄 144번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체의 가변 경쇄 프레임워크는 서열 번호 2 또는 서열 번호 14에 적어도 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체의 가변 중쇄 프레임워크는 서열 번호 5에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 번호 10 또는 서열 번호 17에 적어도 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체의 가변 경쇄 프레임워크는 서열 번호 2 또는 서열 번호 14를 포함하고, 가변 중쇄 프레임워크는 서열 번호 5를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 단일쇄 항체 (scFv) 또는 Fab 단편이다. scFv 항체의 경우, 선택된 VL 도메인은 유연한 링커에 의해 양쪽 방향에 VH 도메인과 연결될 수 있다. 당해 기술 분야의 링커로서 적합한 형태는 반복된 GGGGS (서열번호 6) 아미노산 서열 또는 이의 변형체로 구성된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, (GGGGS)4 링커 (서열번호 7) 또는 이의 유도체가 사용되지만, 1-3번 반복된 서열의 변이체도 가능하다 (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 본 발명에 사용될 수 있는 다른 링커는 [Alftlian et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. MoI. Biol. 293:41-56 and Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59]에 기재되어 있다. 배열은 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL일 수 있지만, 전자 배열이 바람직하다. Fab 단편의 경우, 선택한 경쇄 가변 도메인 VL은 인간 Ig κ 쇄의 불변부에 융합되고, 적합한 중쇄 가변 도메인 VH는 인간 IgG의 첫번째(N-말단) 불변 도메인 CH1에 융합된다. C-말단에서는, 쇄간의 이황화 결합이 두 불변 도메인 간에 형성된다.
따라서, 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00010
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00011
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00012
일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 경쇄를 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00013
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 경쇄를 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00014
또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00015
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 가변 경쇄를 포함한다 (CDR은 밑줄 침):
Figure 112013044234331-pct00016
따라서, 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00017
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00018
일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00019
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 서열을 포함한다:
Figure 112013044234331-pct00020
일 구체예에 있어서, 친 항체의 VL은 서열 번호 11 또는 서열 번호 12, 또는 서열 번호 11 또는 서열 번호 12에 적어도 65% 동일성, 더욱 바람직하게는, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열이거나, 이를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 친 항체의 VH는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4, 또는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 적어도 80% 동일성, 더욱 바람직하게는, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열이거나, 이를 포함한다.
응집-감소 변경을 포함하는 본 발명의 항체는 바람직하게는 토끼 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 업계에 주지된 바와 같이, 토끼 CDR은 인간 또는 설치류 CDR과 상이하다: 이들은 프레임워크에 이황화 결합되거나 CDR 간 S-S 브리지를 형성하는 시스테인 잔기를 함유할 수 있다. 또한, 토끼 CDR은 이미 알려진 어떤 규정 구조에도 속하지 않는 경우가 흔하다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TNFα 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이가의 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 다른 기능성 분자, 예를 들면 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들면, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도하거나 결합시켜서 적어도 두개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성한다. 본 발명의 항체는 복수개의 다른 기능성 분자로 유도되거나 이에 결합되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자와 결합하는 다중특이적 분자를 생성하며; 이러한 다중특이적 분자는 또한 본 원에서 사용된 "이중특이적(bispecific) 분자"에 포함되도록 의도된다. 이중특이적 분자의 예로는 당업자들에 주지된 바와 같이, 디아바디(diabody), 단일쇄 디아바디 및 텐덤(tandem) 항체를 들 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 다른 항체, 항체 단편, 종양특이적 또는 병원체 특이적 항원, 펩티드 또는 결합 모방체에 (예를 들면, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 다른 방법에 의해) 기능적으로 연결되어 이중특이적 분자가 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 TNFα에 특이성을 가지는 적어도 하나의 제1 결합 분자 및 하나 이상의 추가적인 표적 에피토프에 특이성을 가지는 제2 결합 분자를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 적어도 하나의 결합 특이성 항체, 또는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv를 비롯한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 다이머이거나, 또는 그의 내용이 참고로 포함되는 Ladner 등의 미국 특허 제 4,946,778호에 기술된 Fv 또는 단일쇄 작제물과 같은 임의의 그의 최소 단편일 수 있다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 분자에서 사용될 수 있는 다른 항체로는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체가 있다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성성분 결합 특이성을 접합하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 분자의 각 결합 특이성을 별도로 생성한 다음, 서로에게 접합시킬 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제를 공유 접합에 사용할 수 있다. 가교제의 예로는, 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-SMCC)(예를 들면, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. ScL USA 82:8648 참조) 등이 있다. 다른 방법으로는 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375에 기술된 방법들이 있다. 바람직한 접합제로는 SATA와 sulfo-SMCC가 있으며, 이들은 모두 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL, USA)가 판매하고 있다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이들은 설프히드릴 결합, 예를 들면 자연적으로 발생한 것이나 인공적으로 도입된 것에 상관 없이, 2개의 중쇄 또는 다른 부위의 C-말단 힌지 영역을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서는, 힌지 영역을 변경하여 접합 전에 홀수의 설프히드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 포함시킬 수 있다.
다른 한편으로, 양 결합 특이성 모두를 동일한 벡터에서 코딩하여 동일한 숙주 세포에서 발현시키고 어셈블링할 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질일 때 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일쇄 항체와 결합 결정인자를 포함하는 단일쇄 분자이거나, 또는 2개의 결합 결정인자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 또한, 이중특이적 분자는 제1 표적에 특이적으로 결합하는 scFv일 수 있으며, 여기에서 상기 scFv의 VH와 VL은 제2 표적에 특이적 결합을 제공하는 도메인을 포함하는 신축성 링커와 결합된다. 적합한 링커는, 예를 들어 WO 2010/006454호에 기술되어 있다. 이중특이적 분자의 제조방법은, 예를 들면 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기술되어 있다.
이중특이적 분자와 이들의 특이적 표적의 결합은 예를 들어 효소결합 면역흡착 어세이(ELISA), 방사면역측정법(RIA), FACS 분석, 생체분석(예를 들면, 성장 억제), 또는 면역블로트 어세이에 의해 확인할 수 있다. 이러한 분석법은 각각 일반적으로 대상 복합체에 특이적인 표지 시료(예를 들면, 항체)를 사용하여 특히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들면, TNFα-항체 복합체는, 항체-TNFα 복합체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 효소결합 항체 또는 항체 단편 등을 사용하여 검출할 수 있다. 선택적으로, 복합체는 다양한 다른 면역어세이를 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체를 방사성 표지시켜서 방사면역측정법(RIA)에 사용할 수 있다(예를 들면, 본 원에 참고로 포함되는 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조). 방사성 동위원소는 γ 카운터 또는 섬광 카운터 또는 방사능사진촬영의 사용과 같은 수단으로 검출될 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 본 원에 기술된 바와 같은 항체의 생성방법을 제공한다. 본 원에 제공된 바와 같이 용액에서 응집 성향이 감소된 항체의 생성방법은 경쇄 및 중쇄간 항체 도메인 상호작용의 조절을 통해 항체의 응집 성향을 감소시킬 수 있고, VL/VH 인터페이스의 자유 에너지를 측정함으로써 항체 (예컨대 scFv) 및 개별 가변 도메인의 에너지 차이로 정의되는 응집-감소 변이를 신뢰성있게 예측할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 원에서 입증되는 바와 같이, 가변 도메인간 자유 에너지를 저하시킴으로써 항체의 안정성 또는 결합 활성에 영향을 주지 않으면서 항체 도메인 상호작용을 조절하는 응집-감소 치환이 이뤄질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은
(i) 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 항체를 제공하고;
(ii) 항체의 가변 경쇄 (VL)와 가변 중쇄 (VH) 사이 인터페이스에 관여하는 하나 이상의 잔기 위치를 확인하고;
(iii) 확인된 잔기 위치(들)에 치환을 도입하여 치환(들)이 VL 및 VH 도메인간 자유 에너지를 적어도 0.5 kcal/mol, 바람직하게는 적어도 1.0 kcal/mol, 및 가장 바람직하게는 적어도 2.0 kcal/mol로 저하시킴으로써 (즉, 치환에 의한 VL 및 VH 도메인 사이의 자유 에너지는 아미노산 치환을 갖지 않는 상응하는 VL 및 VH 도메인간 자유 에너지의 적어도 0.5 kcal/mol 미만이다), 변경된 항체의 응집 성향을 친 항체의 것에 비해 감소되도록 항체를 변경하는 단계를 포함한다.
상술한 바와 같이, 항체는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 디아바디, 단일쇄 디아바디, 텐덤 항체, 또는 선형 항체일 수 있으며; 바람직한 구체예에 있어서, 항체는 단일쇄 Fv (scFv)이다.
바람직한 구체예에 있어서, 항체의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 사이 인터페이스에 관여하는 하나 이상의 잔기 위치의 확인 (즉, 단계 (ii))은 VL-VH 인터페이스간 자유 에너지의 결정을 포함한다. 이는 일반적으로 공지된 생물정보 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 생물정보 프로그램의 일례는 CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics)이다.
VL-VH 인터페이스간의 자유 에너지를 결정하기 위해서는, 전형적으로 단백질의 완전 원자적 분자 표시(Full atomistic molecular presentation)가 제공된다. 인터페이스의 자유 에너지는 묵시적 용매 방법에서 양 가변 도메인 VL 및 VH를 포함하는 전체 항체와 개별 도메인 에너지의 합 사이의 에너지 차이다. 이는 (1) 항체 G(a); (2) VL G(b); 및 (3) VH G(c) 상에서의 단일 에너지 계산을 포함한다. 따라서, 인터페이스의 자유 에너지는 다음과 같다:
G 인터페이스 = G(a)-G(b)-G(c)
일 구체예에 있어서, 묵시적 용매 방법은 당업계에 공지된 GBMV 또는 PBSA이다.
자유 에너지 결정은 추가로 단백질의 전하 분포를 모의하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 전하 분포는 정전력 또는 판데르발스힘을 기초로 모의될 수 있다.
적합한 변경을 결정하기 위하여, 인터페이스에 관여하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환용으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 선택한 위치에서 하나 이상의 치환 (예컨대, 하나 이상의 잔기의 알라닌으로의 변경)을 포함하는 단백질의 분자 모델을 생성하고, 치환된 분자 표시의 인터페이스의 자유 에너지를 결정한다. 치환된 분자 모델의 인터페이스의 자유 에너지가 초기 분자 모델의 인터페이스의 자유 에너지보다 낮은 경우, 아미노산 잔기를 치환용으로 선택한다. CHARMm과 관련하여, 예를 들어, 빌드 돌연변이 프로토콜 (Build Mutants protocol)을 사용하여 변이를 작제할 수 있다. 분자 모델에서 하나 이상의 치환이 VL/VH 인터페이스에 연루될 것으로 예상되거나 공지 위치에 있을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 돌연변이(들) 주변 영역내 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 치환을 포함하는 분자 모델의 에너지 최소화를 위한 추가적인 단계가 수행된다. 상기 영역은 10 옹스트롬으로 설정될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 치환용으로 확정된 잔기 위치는 대전된 아미노산이 차지한다.
본 발명의 방법으로 생산된 항체는 업계에 공지된 임의의 적합한 가변 경쇄 또는 중쇄를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 토끼 항체로부터의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 바람직한 특정 가변 경쇄 및 중쇄는 본 원에 기술되었다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 다음을 포함할 수 있다: 서열 번호 11 또는 서열 번호 12에 적어도 65% 동일성, 더욱 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 VL 항체 프레임워크, 추가로 가변 경쇄의 47번 AHo 위치 및/또는 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R) 및 서열 번호 3에 적어도 80% 동일성, 더욱 바람직하게는, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 VH 항체 프레임워크.
하나 이상의 잔기 위치 변경은 바람직하게는 그의 전체내용이 본 원에 참고로 포함되는 PCT/CH2008/000285호에 따라 행해진다. 요약하면, 주어진 항체 서브타입을 위해, 특정 아미노산이 항체 프레임워크의 특정 잔기 위치에 존재한다. 예를 들어,
a) 인간 VH3 패밀리 중쇄 가변 영역을 위해 바람직한 아미노산은 다음과 같다:
(i) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 1번 위치에 글루타민 (Q);
(ii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 6번 위치에 글루타민 (Q);
(iii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 7번 위치에 트레오닌 (T) 또는 알라닌 (A);
(iv) AHo 번호 지정 체계계를 사용하여 아미노산 89번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 78번 위치)에 알라닌 (A), 발린 (V), 또는 페닐알라닌 (F); 및/또는
(v) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 103번 위치(카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 89번 위치)에 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M) 또는 페닐알라닌 (F);
b) 인간 VH1 패밀리 중쇄 가변 영역을 위해 바람직한 아미노산은 다음과 같다:
(i) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 1번 위치에 글루탐산 (E);
(ii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 6번 위치에 글루탐산 (E);
(iii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 12번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 11번 위치)에 류신 (L);
(iv) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 13번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 12번 위치)에 메티오닌 (M):
(v) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 14번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 13번 위치)에 글루탐산 (E) 또는 글루타민 (Q);
(vi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 19번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 18번 위치)에 류신 (L);
(vii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 21번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 20번 위치)에 이소류신 (I);
(viii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 90번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 79번 위치)에 페닐알라닌 (F), 세린 (S), 히스티딘 (H) 또는 아스파르트산 (D);
(ix) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 92번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 81번 위치)에 아스파르트산 (D) 또는 글루타민 (Q);
(x) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 95번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 82b번 위치)에 글리신 (G), 아스파라긴 (N) 또는 트레오닌 (T); 및/또는
(xi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 98번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 84번 위치)에 트레오닌 (T), 알라닌 (A), 프롤린 (P) 또는 페닐알라닌 (F);
c) 인간 VH1b 패밀리 중쇄 가변 영역을 위해 바람직한 아미노산은 다음과 같다:
(i) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 1번 위치에 글루탐산 (E);
(ii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 10번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 9번 위치)에 트레오닌 (T), 프롤린 (P), 발린 (V) 또는 아스파르트산 (D);
(iii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 12번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 11번 위치)에 류신 (L);
(iv) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 13번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 12번 위치)에 발린 (V), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q) 또는 메티오닌 (M):
(v) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 14번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 13번 위치)에 글루탐산 (E), 아르기닌 (R) 또는 메티오닌 (M);
(vi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 20번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 19번 위치)에 아르기닌 (R), 트레오닌 (T), 또는 아스파라긴 (N);
(vii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 21번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 20번 위치)에 이소류신 (I), 페닐알라닌 (F), 또는 류신 (L);
(viii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 45번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 38번 위치)에 라이신 (K);
(ix) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 47번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 40번 위치)에 트레오닌 (T), 프롤린 (P), 발린 (V) 또는 아르기닌 (R);
(x) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 50번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 43번 위치)에 라이신 (K), 히스티딘 (H) 또는 글루탐산 (E);
(xi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 55번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 48번 위치)에 이소류신 (I);
(xii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 77번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 66번 위치)에 라이신 (K);
(xiii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 78번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 67번 위치)에 알라닌 (A), 류신 (L) 또는 이소류신 (I);
(xiv) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 82번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 71번 위치)에 글루탐산 (E), 트레오닌 (T) 또는 알라닌 (A);
(xv) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 86번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 75번 위치)에 트레오닌 (T), 세린 (S) 또는 류신 (L);
(xvi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 87번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 76번 위치)에 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N) 또는 글리신 (G); 및/또는
(xvii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 107번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 93번 위치)에 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
d) 인간 Vkappa1 패밀리 경쇄 가변 영역을 위해 바람직한 아미노산은 다음과 같다:
(i) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 1번 위치에 글루탐산 (E) 또는 이소류신 (I);
(ii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 3번 위치에 발린 (V) 또는 이소류신 (I);
(iii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 4번 위치에 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I);
(iv) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 24번 위치에 글루타민 (Q);
(v) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 47번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 39번 위치)에 아르기닌 (R) 또는 이소류신 (I);
(vi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 50번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 42번 위치)에 아르기닌 (R), 글루탐산 (E) 트레오닌 (T), 메티오닌 (M) 또는 글루타민 (Q);
(vii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 57번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 49번 위치)에 히스티딘 (H), 세린 (S) 또는 페닐알라닌 (F);
(viii)AHo 번호지정 체계를 사용하여 아미노산 91번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 73번 위치)에 페닐알라닌 (F); 및/또는
(ix) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 103번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 85번 위치)에 발린 (V), 세린 (S), 글리신 (G) 또는 이소류신 (I);
e) 인간 Vkappa3 패밀리 경쇄 가변 영역을 위해 바람직한 아미노산은 다음과 같다:
(i) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 2번 위치에 트레오닌 (T);
(ii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 3번 위치에 트레오닌 (T);
(iii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 10번 위치에 이소류신 (I);
(iv) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 12번 위치에 티로신 (Y);
(v) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 18번 위치에 세린 (S);
(vi) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 20번 위치에 알라닌 (A);
(vii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 56번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 48번 위치)에 메티오닌 (M);
(viii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 74번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 58번 위치)에 발린 (V) 또는 트레오닌 (T);
(ix) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 94번 위치(카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 76번 위치)에 아스파라긴 (N);
(x) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 101번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 83번 위치)에 티로신 (Y) 또는 세린 (S); 및/또는
(xi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 103번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 85번 위치)에 류신 (L) 또는 알라닌 (A);
f) 인간 Vlambda1 패밀리 경쇄 가변 영역을 위해 바람직한 아미노산은 다음과 같다:
(i) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 1번 위치에 류신 (L), 세린 (S) 또는 글루탐산 (E);
(ii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 2번 위치에 알라닌 (A), 프롤린 (P), 이소류신 (I) 또는 티로신 (Y);
(iii) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 4번 위치에 발린 (V) 또는 메티오닌 (M);
(iv) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 7번 위치에 글루탐산 (E);
(v) AHo 또는 카바트 번호지정 체계를 사용하여 아미노산 11번 위치에 알라닌 (A);
(vi) AHo 또는 카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 14번 위치에 트레오닌 (T) 또는 세린 (S);
(vii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 46번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 38번 위치)에 히스티딘 (H);
(viii) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 53번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 45번 위치)에 트레오닌 (T), 세린 (S), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q) 또는 프롤린 (P);
(ix) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 82번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 66번 위치)에 아르기닌 (R) 또는 글루타민 (Q);
(x) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 92번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 74번 위치)에 글리신 (G), 트레오닌 (T) 또는 아스파르트산 (D); 및/또는
(xi) AHo 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 103번 위치 (카바트 번호 지정 체계를 사용하여 아미노산 85번 위치)에 발린 (V), 트레오닌 (T), 히스티딘 (H) 또는 글루탐산 (E).
따라서, 본 발명의 방법에 행해진 치환은 바람직하게는 PCT/CH2008/000285호의 교시를 따른다. 서브타입 결정은 당업자들에게 주지이다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 가변 경쇄, 특히 Vkappa1 가변 경쇄의 47번 및/또는 50번 AHo 위치에서 항체의 변경을 포함한다. 바람직하게, 항체는 가변 경쇄의 47번 및/또는 50번 AHo 위치에 AHo 위치에 아르기닌 (R)을 포함하도록 변경된다. 일부 구체예에서, 가변 경쇄의 47번 AHo 위치 및/또는 50번 AHo 위치에서 라이신 (K)이 아르기닌 (R)으로 치환된다. 본 발명의 항체는 필요에 따라 추가적인 변경을 포함할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 항체를 예컨대 중쇄 12번 위치 (AHo 번호 지정)에 세린 (S); 중쇄 103번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정) 및/또는 중쇄 144번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 포함하도록 변경하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 또한, 항체는 중쇄 97, 98 및/또는 99번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 포함하도록 변경될 수 있다. 바람직하게는, 방법은 중쇄 12번 위치에 세린 (S) (AHo 번호 지정), 중쇄 103번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정) 및 중쇄 144번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 포함하도록 항체를 변경하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 용액에서 응집 성향이 낮은 인간화 항체를 생성하는 방법을 제공하며, 이 방법은 47번 AHo 위치 및/또는 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R)을 포함하는 가변 경쇄 프레임워크를 선정하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 중쇄 12번 위치에 (AHo 번호 지정) 세린 (S); 중쇄 103번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정) 및/또는 중쇄 144번 위치에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 포함하는 가변 중쇄 프레임워크를 선정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 선택된 선정 기준에 기초해 확인된 프레임워크는 본 발명의 응집-감소 변경으로 추가 변경될 수 있다. 예를 들어, 가변성 경쇄 프레임워크가 50번 위치에 아르기닌 (R)을 가지는 것으로 확인된 경우, AHo 위치의 잔기는 상이한 아미노산, 예컨대 아르기닌 (R)으로 치환될 수 있거나, 또는 가변 중쇄가 AHo 12번 위치에 세린 (S)을 가지는 것으로 확인된 경우, AHo 103번 및 144번 위치의 잔기는 트레오닌으로 치환될 수 있다.
본 원에 사용된, "인간화" 항체는 비인간 CDR 및 인간 또는 인간-유래 가변 중쇄 및/또는 인간 또는 인간-유래 가변 경쇄 프레임워크 서열을 포함하는 항체이다. 항체의 인간화는 당업계에서는 주지이다. 일 구체예에 있어서, 인간화 항체는 토끼에서 생성된 항체 유래이거나, CDR 라이브러리로부터 선택된 적어도 하나, 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다
가변 항체 프레임워크는 CDR 기원 항체의 가변 프레임워크 서열을 가지는 동일성 및/또는 유사성, 또는 다르게는 바람직한 프레임워크 서열(들)에 준해, 예를 들어 데이터베이스 (예컨대 카바트 데이터베이스, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), VBASE (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), VBASE2 (http://www.vbase2.org/), 당해 면역 단백질 서열의 카바트 데이터베이스 (http://www.kabatdatabase.com/index.html), 보편적 단백질 재원 (UniProt; http://pir.georgetown.edu/), 및 Abysis 데이터베이스 (http://www.bioinf.org.uk/abs/)로부터 선택될 수 있다.
선정 요건(들)을 만족하는 적합한 인간 프레임워크 서열을 검색하는데 다양한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 예를 들어, "KabatMan"은 Sequences of Immunological Interest 책자로부터의 카바트 항체 서열 데이터의 컴퓨터로 검색가능한 버전이다. KabatMan 프로그램은 문헌[Martin (1996) Accessing the Kabat Antibody Sequence Database Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25, 130-133]에 기술되어 있으며, http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html, 및 http://www.bioinf.org.uk/abs/kabatman.html으로 이용가능하다. http://www.bioinf.org.uk/abysis/에 있는 Abysis 데이터베이스는 Kabat, IMGT 및 PDB로부터의 서열 데이터를 PDB로부터의 구조 데이터와 통합하였다. 이는 다양한 기준으로 서열 데이터를 검색하여 디스플레이가 상이한 포멧으로 나타날 수 있게끔 마우스로 이용가능한 포괄적인 인터페이스를 제공한다. PDB로부터의 데이터 경우, 서열 검색은 구조적 구속과 조합될 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 본 원에 개시된 방법으로 생성된 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 12 또는 서열 번호 13에 적어도 80% 동일성, 더욱 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 VL 항체 프레임워크를 포함하며; 바람직하게는, 항체는 가변 경쇄의 47번 AHo 위치 및/또는 50번 AHo 위치에 아르기닌 (R)을 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, VH 항체 프레임워크는 서열 번호 3, 또는 서열 번호 3에 적어도 80% 동일성, 더욱 바람직하게는, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 99% 동일성이 있는 서열이거나, 이를 포함한다.
특정 구체예에 있어서, 본 발명은 추가로 다음을 제공한다:
(1) (a) 항체의 완전 원자적 분자 표시를 제공하고;
(b) 양 도메인간 인터페이스의 자유 에너지를 결정하고;
(c) 선정 위치에서 하나 이상의 치환을 포함하는 항체의 분자 모델을 제공하여 치환을 위해 인터페이스에 관여하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하고, 치환된 분자 표시의 인터페이스의 자유 에너지를 결정하고;
(d) 치환된 분자 모델의 인터페이스의 자유 에너지가 초기 분자 모델의 인터페이스의 자유 에너지보다 낮으면, 치환을 위한 아미노산 잔기를 선정하는 단계를 포함하는,
중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 헤테로다이머 복합체인 항체의 응집 성향을 감소시키는 방법;
(2) 묵시적 용매 방법에서 개별 도메인의 에너지 합과 복합체 사이의 에너지 차이를 계산하여 인터페이스의 자유 에너지가 결정되는 (1)의 방법,
(3) 용매가 GBMV 또는 PBSA인 (2)의 방법;
(4) (i) 단백질의 전하 분포를 모의하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 단계는 단계 a 및 b 내에서 수행되는 (1)-(3)의 어느 한 방법;
(5) 전하 분포가 정전력 또는 판데르발스힘을 기초로 모의되는 (4)의 방법;
(6) 단계 (c)가 돌연변이 주변 영역에서 에너지 최소화의 추가적인 단계를 포함하는 (1)-(5)의 어느 한 방법;
(7) 항체가 단일쇄 가변 단편 (scFv)인 (1)-(7)의 어느 한 방법.
본 발명의 항체는 재조합 유전학 분야에서 통상적인 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 폴리펩티드의 서열을 알면, 당업계에 주지인 방법에 의해 유전자 합성으로 이를 코딩하는 cDNA를 생성할 수 있다. 이들 cDNA는 적합한 벡터 플라스미드로 클로닝될 수 있다.
당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 표준 클로닝 및 돌연변이화 기법들을 이용하여, Fab 단편을 제조하기 위한 링커, 셔플 도메인 또는 구조체 융합체를 부착시킬 수 있다. 본 발명의 일반적인 방법을 설명하는 기본 프로토콜은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3rd ed. 2001) 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999)에 기술되어 있다.
scFv 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 보유하는 DNA 서열, 또는 Fab 단편의 경우, VL-Cκ 및 VH-CH1 융합체에 대한 2가지 유전자를 포함하는 2가지 별개의 유전자나 바이-시스트론 오페론 중 어느 하나를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 DNA 서열은, 적합한 발현 벡터, 바람직하게는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터에 클로닝된다. 적합한 리보좀 결합부가 번역되도록 각 유전자의 앞 부분에 존재하여야 함에 주의를 기울여야 한다. 본 발명의 항체는 이들로 구성된 것 보다는 개시한 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 클로닝 전략에서는, N-말단에 하나 또는 수개의 부가적인 잔기가 있는 항체가 존재하는 구조체가 제조하여야 할 수 있다. 구체적으로, 개시 코돈으로 생성된 메티오닌은, 번역 후에 절단되지 않으면 최종 단백질에 존재할 수도 있다. 대부분의 scFv 항체 구조체들은 N-말단에 추가적인 알라닌이 생긴다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, E. coli에서 원형질막 공간으로 발현시키는 발현 벡터를 선택한다(Krebber, 1997). 상기 벡터에 절단가능한 신호 서열의 앞부분에 프로모터를 포함시킨다. 그 후, 항체 펩티드의 코딩 서열을 절단가능한 신호 서열과 프레임으로 융합시킨다. 이는, 신호 서열이 절단되는 박테리아 원형질막 공간으로 폴리펩티드의 발현을 타겟팅한다. 그 후, 항체는 폴딩(folding)된다. Fab 단편의 경우, VL-Cκ 및 VH- CH1 융합 펩티드를 유출 신호와 연결하여야 한다. 펩티드가 원형질막 공간에 도달한 다음에 C-말단의 시스테인에 S-S 공유 결합이 형성된다. 만일, 항체의 세포질 발현이 바람직하다면, 이 항체는 일반적으로 봉입체를 통해 고수율로 수득할 수 있으며, 다른 세포성 단편과 단백질들로부터 쉽게 분리할 수 있다. 이 경우, 봉입체는 예컨대 구아니딘 하이드로클로라이드(GndHCl)와 같은 변성제에서 용해시킨 다음, 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 재변성 공정에 의해 리폴딩한다.
scFv 또는 Fab 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드는 적합한 숙주, 바람직하게는 박테리아, 효모 또는 포유류 세포, 가장 바람직하게는 적절한 E. coli 균주, 예컨대 원형질막 공간으로 발현하기 위한 JM83 또는 봉입체로 발현하기 위한 BL21에 도입한다. 폴리펩티드는 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및/또는 겔 여과와 같은 표준 기법을 이용하여 원형질막 공간이나 봉입체로부터 회수하여 정제할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 항체는 생체내 수율, 가용성 및 안정성 측면에서 특정될 수 있다. TNF, 바람직하게는 인간 TNFα에 대한 결합능은, ELISA 또는 표면 플라스몬 공명(BIAcore)에 의해 WO 9729131에 기술된 재조합 인간 TNF를 이용하여 시험관내에서 시험할 수 있으며, 또한, 표면 플라스몬 공명 방법으로 koff 속도 상수를 결정할 수 있는데, 바람직하게는, 이는 10-3s-1 미만이 바람직하다. Kd 수치는 ≤ 10 nM이 바람직하다.
일 구체예에서, 본 발명은 TNFα에 결합하여 생체내에서 TNFα의 기능을 차단하는데 적합한 항체를 제공한다. 특정 구체예에서, 항-TNFα 항체는 서열 번호 10 또는 서열 번호 17의 서열을 포함한다.
치료학적 용도를 위한, 본 발명의 항-TNF 항체는, 포유류, 바람직하게는 인간에게, 인간에게 볼루스로서 또는 일정 기간 동안 지속적인 주입에 의한 정맥내, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 강내(intrathecal), 경구, 국소, 안내, 비강내, 귀, 설하, 경피 또는 흡입 경로로 투여될 수 있는 형태 등의, 전술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 투여된다. 또한, 항체는, 국소 뿐만 아니라 전신 치료 효과를 발휘하기 위해, 종양내, 종양 주변에, 병변내 또는 병변 주변 경로에 의해 적절하게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 항체의 적정 투여량은 상기에 정의된 치료할 질병의 타입, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 질병의 중증도 및 추이, 선행 요법, 환자의 임상 병력과 항체에 대한 반응 및 주치의 판단에 따라 결정될 것이다. 항체는 환자에게 한번 또는 일련의 치료 기간 동안 적절하게 투여된다.
본 발명의 항-TNF 항체는 TNF-매개 질환의 치료에 유용하다. 질환의 유형과 경중도에 따라, 환자에게 투여하기 위한, 예컨대 1회 이상의 개별 투여 또는 지속적인 주입에 의한, 항체의 초기 예상 투여량은, 약 1 μg/kg 내지 약 50 mg/kg (예, 0.1-20 mg/kg)이다. 전형적인 일별 또는 주당 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 약 20 mg/kg 범위일 수 있다. 증상에 따른 수일 또는 그 이상 동안의 반복 투여를 위해, 질병 증상이 원하는 수준으로 억제될 때까지 치료는 반복 실시된다. 그러나, 다른 투약 요법도 사용할 수 있다. 이러한 요법의 경과는 예컨대 방사선촬영에 의한 종양 영상 촬영 등의 통상적인 기법과 분석으로 쉽게 모니터링된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 질환을 예방 또는 치료하는데 있어 항체의 효능은 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 산성 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF)나 간세포 성장 인자(HGF)의 혈관신생 활성을 저해 또는 중화할 수 있는 항체, 조직 인자, 단백질 C 또는 단백질 S(참조: Esmon et al, PCT 특허 공개번호. WO 91/01753, 1991년 2월 21일 공개됨)의 응고 활성들을 저해 또는 중화할 수 있는 항체, HER2 수용체에 결합할 수 있는 항체(참조: Hudziak et al., PCT 특허 공개번호. WO 89/06692, 1989년 7월 27일 공개됨), 또는 예컨대 알킬화제, 엽산 길항제, 핵산 대사의 항-대사산물, 항생제, 피리미딘 유사체, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 푸린 뉴클레오시드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오시드 또는 코르티코스테로이드와 같은 1종 이상의 기존의 치료제 등의, 이러한 목적에 유효한 다른 제제와 조합하거나 또는 연속하여 항체를 투여함으로써, 개선시킬 수 있다. 이러한 다른 제제는 투여되는 조성물에 존재하거나 또는 개별 투여될 수 있다. 또한, 항체는, 방사능 물질의 조사 또는 투여가 수행되거나 수행되지 않든, 방사선 치료와 연속하여 또는 조합하여 적절하게 투여된다.
본 발명의 항체는 친화성 정제 제제로서 사용될 수 있다. 이러한 공정에서, 상기 항체는, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 세파덱스 수지 또는 필터지와 같은 고상에 고정된다. 고정된 항체는 정제할 항체가 결합하는 표적 단백질(또는 그의 단편), 예컨대 항-TNFα 항체의 경우 TNF가 함유된 샘플과 접촉시킨 다음, 샘플에서 고정된 항체에 결합된 표적 단백질을 제외한 모든 물질들을 실질적으로 제거시킬 수 있는 적정 용매로 상기 지지체를 헹군다. 마지막으로, 상기 지지체를, 항체에서 표적 단백질을 방출시킬 글리신 완충액(pH 5.0)과 같은 다른 적정 용매로 헹군다.
또한, 항체는 표적 단백질에 대한 진단 분석, 예컨대 특정 세포, 조직 또는 혈청내 이의 발현 검출에 유용할 수 있다. 이러한 진단 방법은 암 진단에 유용할 수 있다.
진단적 이용을 위해, 항체를 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지할 수 있다. 하기 카테고리로 일반적으로 분류될 수 있는 다수의 표지물이 이용가능하다:
(a) 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S 등의 방사성 동위원소. 항체는 예컨대 Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)의 Current Protocol에 기술된 기법을 이용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있으며, 방사성은 신틸레이션 카운팅으로 측정할 수 있다.
(b) 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 덱사스 레드 등의 형광 표지물질이 이용가능하다. 형광 표지물질은 예컨대 전술한 Immunology의 Current Protocol에 기술된 기법을 이용하여 항체에 접합할 수 있다. 형광은 형광계를 이용하여 정량할 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지물질을 이용할 수 있으며, 미국 특허 제 4,275,149호에 이러한 일부 물질에 대해 논의되어 있다. 효소는 일반적으로 다양한 기법으로 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변경을 촉매화한다. 예컨대, 효소는, 분광광도측정법으로 측정할 수 있는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있다. 다른 예로, 효소는 기질의 형광 또는 화학 발광을 변형시킬 수 있다. 형광 변화를 정량하는 기법은 상기에 언급되어 있다. 화학 발광 기질은 화학 반응에 의해 전기적으로 여기되기 시작하면, (예로, 발광측정계를 이용하여) 측정가능한 광이 발광되거나 또는 에너지가 형광 어셉터에 제공될 수 있다. 효소 표지물질의 예로는, 루시퍼라제(예, 개똥벌레 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 제 4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 서양고추냉이의 퍼옥시다제(HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(예, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예, 우리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다. 효소를 항체에 접합하는 기법들은 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기술되어 있다. 효소-기질 조합의 예로는, 예컨대 하기를 포함한다:
(i) 기질로서 수소 퍼옥시다제를 이용하는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 상기 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체(예, 오르소페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB))를 산화시킴;
(ii) 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 이용하는 알칼리 포스파타제(AP); 및
(iii) 발색성 기질 또는 형광성 기질을 이용하는 베타-D-갈락토시다제(베타-D-Gal)(예, P-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제, 4-메틸움벨리페릴-베타-D-갈락토시다제).
당해 기술 분야의 숙련자는 수많은 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 이러한 내용에 대한 일반적인 검토 사항에 대해서는, 미국 특허 제 4,275,149호 및 제 4,318,980호를 참조한다. 때로는, 항체에 표지물질을 간접 접합한다. 당업자는 이를 달성하기 위한 다양한 기법들을 인지하고 있을 것이다. 예를 들어, 항체를 바이오틴과 접합시킬 수 있으며, 전술한 3가지의 다양한 표지물질의 카테고리 중 임의의 것을 아비딘과 접합시키거나 반대로 접합시킬 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하므로, 표지물질은 이러한 간접적인 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 다른 구체예로, 표지물질을 항체에 간접적으로 접합시키기 위해, 항체를 소형 합텐(예, 디곡신)에 접합시키고, 전술한 여러가지 타입의 표지물질 중 한가지를 항-합텐 항체(예, 항-디곡신 항체)에 접합한다. 따라서, 항체에 표지물질을 간접 접촉시키는 것을 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체는 표지할 필요가 없으며, 이의 존재는 표적 항체에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 경쟁적인 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침강 분석 등의 임의의 공지된 분석 방법에 이용할 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
경쟁적인 결합 분석은, 표지된 표준물질의, 제한된 양의 항체와의 결합에 대한, 시험 샘플 분석물과의 경쟁력에 의존한다. 예를 들어, 시험 샘플내 TNF 단백질의 양은 항체에 결합되기 시작하는 표준물질의 양과 반비례한다. 결합되기 시작하는 표준물질의 양 결정을 용이하게 하기 위해, 일반적으로 항체는 경쟁 전 또는 후에 불용화되어, 항체에 결합된 표준물질과 분석물은, 결합되지 않은 남아있는 표준물질과 분석물로부터 쉽게 분리할 수 있다.
샌드위치 분석법에서는 각각 검출한 단백질의 여러가지 면역원성 부분이나 에피토프에 결합할 수 있는 2종의 항체를 사용한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고형 지지체에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 그 후 제2 항체가 상기 분석물에 결합하여, 불용성의 3성분으로 구성된 복합체가 형성된다. 예로, 미국 특허 제 4,376,110호를 참조한다. 상기 제2 항체는 검출가능한 모이어티로 표지된 항면역글로불린 항체를 이용하여(비간접 샌드위치 분석) 측정하거나, 또는 그 자체를 검출가능한 모이어티(직접 샌드위치 분석)로 표지할 수 있다. 예컨대, 샌드위치 분석의 한가지 유형은 ELISA 분석인데, 이 경우 검출가능한 모이어티는 효소이다.
면역조직화학법을 위해, 종양 샘플은 신선하거나, 냉동되거나 또는 파라핀에 포매하고 예컨대 포르말린과 같은 보존제로 고정할 수 있다.
또한, 항체는 생체내 종양 진단 분석에 사용할 수 있다. 일반적으로, 항체는 방사성 핵종(예, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지하여, 면역신티오그래피를 이용하여 종양의 위치를 확인할 수 있다.
본 발명의 항체는 선결된 함량의 시약과 진단 분석을 수행하기 위한 설명서가 함께 포장된, 키트로 제공할 수 있다. 항체를 효소로 표지하는 경우, 키트에는 효소에 필요한 기질과 조인자(예, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)가 포함될 것이다. 또한, 안정화제, 완충제(예, 차단 완충제 또는 용혈 완충제) 등의 다른 첨가제도 포함할 수 있다. 분석의 민감성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중에 농도를 제공하도록, 다양한 시약의 상대적인 양은 광의적으로 변경될 수 있다. 특히, 용해시 적절한 농도를 가진 시약 용액을 제공할 부형제 등의 시약은, 건조 분말로 제공되거나 또는 일반적으로 동결건조될 수 있다.
본 발명은 추가로 치료 목적으로 하나 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명은 TNF-매개 질환 치료용 항-TNF 항체를 제공한다.
용어 "약제학적 제제"는 항체의 생물 활성이 명백하게 유효하도록 하기 위한 형태의 조제물로서, 이 조제물에는 제제를 투여받는 대상에게 독성인 추가 성분들은 함유되지 않는다. "약학적으로 허용가능한 부형제(비히클, 첨가제)는 대상 포유류에 활성 성분의 유효량을 제공하도록 알맞게 제공될 수 있는 것이다.
"안정한" 제제는, 함유된 항체가 저장시 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 기본적으로 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기법들을 당해 기술 분야에서 이용할 수 있으며, 예컨대 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에 리뷰되어 있다. 안정성은 선정된 기간 동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 바람직하게는, 제제는 실온(약 30 ℃) 또는 40 ℃에서 적어도 1달간 안정적이거나 및/또는 약 2-8 ℃에서는 적어도 1년 또는 적어도 2년간 안정적이다. 또한, 제제는 바람직하게는 제제의 냉동(예, -70 ℃로) 및 해동 후에도 안정적이다.
항체가, 색 및/또는 투명성의 육안 검사시 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정시, 응집, 침강 및/또는 변성 징후를 보이지 않는다면, 이는 약제학적 제제에서 "물리적 안정성을 유지하는 것이다".
주어진 시간에 화학적으로 안정적이어서 단백질이 하기 정의된 바와 같은 생물학적 활성을 여전히 유지하고 있는 것으로 간주된다면, 항체는 약제학적 제제내에서 "이의 화학적 안정성을 유지하는 것이다". 화학적 안정성은, 단백질의 화학적으로 변형된 형태를 검출하고 정량하여 평가할 수 있다. 화학적 변형은, 예컨대 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화법/비행시간형 질량 분석기(MALDI/TOF MS)를 이용하여 평가할 수 있는, 크기 변형(예, 클립핑)을 포함할 수 있다. 화학적 변형의 다른 유형으로는, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가할 수 있는 전하 변형(예, 탈아미드화로 인해 형성됨)이 있다.
항체는, 예컨대 항원 결합 분석에서 결정된 바와 같이 주어진 시간에 항체의 생물학적 활성이 약제학적 제제가 제조된 시점에 확인된 생물학적 활성과 약 100%(분석의 오차 범위내)이면, 약제학적 제제내에서 "그것의 생물학적 활성을 유지하는 것이다". 하기에 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 분석도 상세하게 설명되어 있다.
"등장"은, 대상 제제가 본질적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가진 것을 의미한다. 등장 제제는 일반적으로 삼투압이 약 250 - 350 mOsm일 것이다. 등장성은 예컨대 증기압 또는 얼음-동결 타입의 삼투압측정계를 이용하여 측정할 수 있다.
"폴리올"은 복수의 하이드록실기를 가진 물질로, 당(환원 당 및 비환원 당), 당 알콜 및 당 산을 포함한다. 본 원에서 바람직한 폴리올은 분자량이 약 600 kD 미만 (예, 약 120 내지 약 400 kD의 범위)이다. "환원 당"은 금속 이온을 환원시키거나 단백질에서 라이신과 다른 아미노기와 공유적으로 반응할 수 있는 헤미아세탈기를 포함하는 것이며, "비환원 당"은 환원 당의 이러한 특성이 없는 당이다. 환원 당의 예로는 프럭토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스 및 글루코스이다. 비환원 당은 수크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스 및 라피노스이다. 당 알콜의 예는 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨 및 글리세롤이다. 당 산과 같이, 당 알콜은 L-글루코네이트 및 이의 금속성 염을 포함한다. 제제가 동결-해동에 안정적인 것이 바람직한 경우에는, 제제내에서 항체를 불안정하게 하는 동결 온도(예, -20 ℃)에서 결정화되지 않는 폴리올이 바람직하다. 수크로스 및 트레할로스와 같은 비환원 당이 본 원에서 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 원에서, "완충액"은 산-염기 접합 구성 요소들의 작용에 의해 pH 변화에 견디는 완충화된 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충액은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 가지며, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 6.5의 pH를 가진다. pH를 이러한 범위에서 조절하는 완충액의 예는, 아세테이트(예, 소듐 아세테이트), 숙시네이트(예, 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 히스디틴, 시트레이트 및 그외 유기산 완충액이 있다. 동결-해동에 안정적인 제제가 바람직한 경우, 완충액은 바람직하게는 포스페이트가 아니다.
약리학적 의미에서, 본 발명에서, 항체의 "치료적 유효량"은 항체가 치료에 효과적인 장애의 예방 또는 치료에 유효한 양을 지칭한다. "질환/장애"는 항체를 이용한 치료가 유익한 모든 증상이다. 이러한 것으로는, 포유류를 대상 장애에 걸리게 하는 소인이 되는 병태 증상들을 비롯한, 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다.
"보존제"는 제제내에서 박테리아 작용을 근본적으로 감소시켜, 예컨대 복수-사용 제제의 제조를 가능하게 하기 위해 제제에 포함될 수 있는 성분이다. 가능한 보존제의 예로는, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드(알킬기가 장쇄 화합물인, 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드류의 혼합물) 및 벤제토늄 클로라이드가 있다. 다른 유형의 보존제로는 페놀, 부틸알콜, 벤질 알콜과 같은 방향족 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸이 있다. 본 원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알콜이다.
또한, 본 발명은, 1종 이상의 항체를, 생리학적으로 허용가능한 1종 이상의 담체나 부형제와 함께 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은, 예컨대 물, 완충액(예, 중성으로 완충화된 염수나 포스페이트 완충화된 염수), 에탄올, 미네랄 오일, 식물성 오일, 디메틸설폭사이드, 탄수화물(예, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 애쥬번트, 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산, 항산화제, EDAT 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 다른 활성 성분도 본 원에 제공된 약제학적 조성물에 (반드시는 아니지만) 포함될 수 있다.
담체는, 화합물의 안정성이나 생체이용성을 조절하기 위한 목적으로, 환자에게 투여하기 전에 항체와 조합될 수 있는 물질이다. 이러한 제제에 사용하기 위한 담체는 일반적으로 생체적합성이며, 또한 생분해성일 수 있다. 담체는, 예컨대 1가 또는 다가 분자들, 예컨대 혈청 알부민(예, 인간 또는 소), 난 알부민, 펩티드, 폴리라이신 및 아미노덱스트란 및 폴리아미도아민과 같은 다당류일 수 있다. 또한, 담체는 예컨대 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리(락티드-co-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 락텍스, 전분, 셀룰로스 또는 덱스트란을 포함하는, 비드 및 미세결정과 같은 고형 지지체 물질을 포함한다. 담체는 (직접 또는 링커기를 통한) 공유 결합, 비공유성 상호작용 또는 이의 조합을 비롯한 다양한 방식으로 화합물을 가지고 있을 수 있다.
약제학적 조성물은 예컨대 안내, 비강내, 귀, 설하, 경피, 국소, 경구, 코, 직장 또는 비경구 투여 등의 임의의 적합한 투여 방식으로 제제화할 수 있다. 특정 구체예에서, 경구 사용에 적합한 형태가 바람직하다. 이러한 형태로는, 예컨대 환제, 정제, 트로키제, 로젠제, 수계 또는 오일성 현탁제, 분산성 산제 또는 과립제, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐제 또는 시럽제나 엘리시르제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 원에 제공되는 조성물은 동결건조물로서 제제화될 수 있다. 본 원에서 사용되는 용어 비경구는 피하, 진피내, 혈관내(예, 정맥내), 근육내, 척수, 두개내, 강내 및 복막내 주사 뿐만 아니라 임의의 유사한 주사 또는 주입 기법을 포함한다.
특정 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 눈주위, 결막, 테논낭하, 전방내, 유리체내, 안구내, 망막하, 결막하, 안구후 또는 관내 주사와 같은 안조직 주사; 카테터, 또는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질을 포함하는 망막 펠렛, 안구내 삽입물, 좌약 또는 이식물과 같은 다른 삽입 장치를 사용한 눈에 직접 적용; 국소 점안제 또는 연고; 또는 맹낭중 또는 공막에 인접해 이식되거나 (공막관통) 또는 공막중 (공막내) 또는 눈안의 서방출 장치에 의해 눈에 직접 전달될 수 있다. 전방내 주사는 각막을 통해 전방으로 도입됨으로써 액제가 섬유주대에 도달될 수 있다. 관내 주사는 슐렘관 드레인 정맥 집결관 또는 슐렘관속으로 적용될 수 있다.
안과적 전달을 위해, 본 발명의 항체는 안과적으로 허용되는 보존제, 공용매, 계면활성제, 점도 증진제, 침투 증강제, 완충액, 소듐 클로라이드, 또는 수성 무균 안 현탁액 또는 용액을 형성하기 위한 물과 배합될 수 있다. 국소적 안 제품은 예를 들어, 다회 투여 형태로 패키지될 수 있다. 따라서 사용동안 미생물 오염을 피하기 위해 보존제가 필요할 수 있다. 적합한 보존제는 클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 페닐에틸 알콜, 에데테이트 디소듐, 소르브산, 폴리쿼터늄-1, 또는 당업자들에게 알려져 있는 다른 제제를 포함한다. 이러한 보존제는 전형적으로 0.001 내지 1.0% w/v의 수준으로 사용된다. 본 발명의 단위 용량 조성물은 무균일 것이나, 전형적으로는 보존처리되지 않는다. 따라서 상기 조성물은 일반적으로 보존제를 포함하지 않는다.
특정 구체예에 있어서, 눈에 국소 투여되도록 의도된 조성물은 점안제 또는 안연고로서 제제화되며, 여기에서 항체의 총량은 약 0.001 내지 1.0% (w/w)일 것이다. 바람직하게는, TNFα 항체의 양은 약 0.01 내지 약 1.0% (w/w)이다.
본 발명의 조성물은 특정 상황에서 국소 투여용 용액으로 투여될 것이다. 제제화 용이성뿐 아니라 질병 눈에 1 내지 2 방울의 용액을 떨어뜨리는 것으로 환자가 이러한 조성물을 용이하게 투여할 수 있는 점에서 수용액이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 조성물은 또한 현탁액, 점성 또는 반점성 겔, 또는 다른 타입의 고체 또는 반고체 조성물일 수 있다.
경구 용도의 조성물은 약제학적 조성물의 제조를 위해 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 호의적이고 맛이 좋은 조제물을 제공하기 위해 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제와 같은 한가지 이상의 물질을 포함할 수 있다. 정제는 활성성분을 정제 제조에 적합한 생리학적으로 허용가능한 부형제와 혼합물 형태로 포함한다. 이러한 부형제로는, 예컨대 비활성 희석제(예, 칼슘 카르보네이트, 소듐 카르보네이트, 락토스, 칼슘 포스페이트 또는 소듐 포스페이트), 과립제 및 붕해제(예, 옥수수 전분 또는 알긴산), 결합제(예, 전분, 젤라틴 또는 아카시아) 및 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크)가 있다. 정제는 위장관에서의 분해와 흡수를 지연시켜, 장기간 동안 지속적인 작용을 제공하기 위해, 공지된 기법으로 코팅하거나, 코팅되지 않을 수 있다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 사용할 수 있다.
또한, 경구 용도의 제제는 활성 물질이 비활성 고체 희석제(예, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린)와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐제로서, 또는 활성 성분이 물이나 오일 매질(예, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일)과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐제로 제시될 수 있다. 수계 현탁제는 수계 현탁제의 제조에 적합한 부형제와 혼합물 형태로 항체를 포함한다. 이러한 부형제로는 현탁제(예, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트검 및 아카시아검); 및 분산제 또는 습윤제(예, 천연적으로 생겨나는 포스파티드, 예컨대 레시틴, 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 산물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 산물, 예컨대 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 산물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 산물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 포함한다. 또한, 수계 현탁제는 1종 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향미제, 및 1종 이상의 감미료, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 포함할 수 있다. 시럽제나 엘리시르제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로스와 같은 감미료와 함께 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 또한 1종 이상의 연화제, 보존제, 향미제 및/또는 착색제를 포함할 수 있다.
오일 현탁제는 식물성 오일(예, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일) 또는 액체 파라핀과 같은 미네랄 오일 중에 활성 성분을 현탁하여 제제화할 수 있다. 상기 오일 현탁제는, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜과 같은 증점제를 포함할 수 있다. 전술한 물질 등의 감미료, 및/또는 향미제를 첨가하여, 맛이 좋은 경구 조제물을 제공할 수 있다. 이러한 현탁제는 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가하여, 보존시킬 수 있다.
물을 첨가하여 수계 현탁제를 제조하기 적합한 분산성 산제 및 과립제는 분산제, 습윤제, 현탁제 또는 1종 이상의 보존제와 혼합된 형태로 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제, 습윤제 및 현탁제는 상기에 언급된 물질로 예시된다. 추가적인 부형제, 예컨대, 감미료, 향미제 및 착색제도 존재할 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 오일상은 식물성 오일(예, 올리브 오일 또는 아라키스 오일), 미네랄 오일(예, 액체 파라핀) 또는 그 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제로는 천연적으로 형성되는 검(예, 아카시아검 또는 트라가칸트검), 천연적으로 형성되는 포스파티드(예, 소이 빈, 렉시틴 및 지방산과 헥시톨로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르), 무수물(예, 소르비탄 모노올레에이트), 및 지방산과 헥시톨 유래 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 산물(예, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)이 있다. 또한, 에멀젼은 1종 이상의 감미료 및/또는 향미제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은, 사용되는 비히클과 농도에 따라, 모듈레이터가 비히클 중에 현탁되거나 용해된, 멸균 주사용 수성 또는 오일성 현탁제으로서 조제할 수 있다. 이러한 조성물은 전술한 물질 등의 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 이용하여 당해 기술 분야에 공지된 바에 따라 제제화할 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는, 물, 1,3-부탄디올, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이 있다. 또한, 무균 비휘발성 오일을 용매나 현탁 매질로서 사용할 수 있다. 이러한 목적으로, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 비롯한, 임의의 블렌드 비휘발성 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산을 주사용 조성물 제조에 사용할 수 있으며, 국소 마취제, 보존제 및/또는 완충화제와 같은 애쥬번트를 비히클에 용해시킬 수 있다.
약제학적 조성물은 서방형 제제로 (즉, 투여 후 모듈레이터의 방출을 느리게 하는 캡슐 등의 제제) 제제화될 수 있다. 이러한 제제는, 익히 공지된 기법을 이용하여 일반적으로 제조할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해, 또는 원하는 타겟 부위에 이식에 의해 투여할 수 있다. 이러한 제제에 사용하기 위한 담체는 생체적합한 것이며 또한 생분해성일 수 있으며; 바람직하게는 제제는 모듈레이터를 상대적으로 일정한 수준으로 방출한다. 서방성 제제내에 포함되는 항체의 양은, 예컨대 이식 부위, 방출 속도 및 예상 기간, 및 치료 또는 예방할 질환/장애의 특성에 따라 결정된다.
본 원에서 제공되는 항-TNFα 항체는 TNF에 검출가능하게 결합하여 TNF-매개 질환/장애를 예방 또는 저해하는데 충분한 농도를 체액(예, 혈액, 혈장, 혈청, CSF, 활액, 림프액, 세포성 세포간 체액, 눈물 또는 뇨)에서 달성하는 양으로 일반적으로 투여된다. 투여량은 본 원에 기술된 환자에게 식별가능한 이로움이 생기는 경우 유효한 것으로 간주된다. 바람직한 전신 투여량 범위는 1일 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 140 mg(1일 환자 1인 당 약 0.5 mg 내지 약 7 g)이며, 경구 투여량은 일반적으로 정맥내 투여량 보다 약 5-20배 높다. 단일 투여량을 형성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 항체의 양은 치료받는 숙주와 특정 투여 방식에 따라 변경될 것이다. 투여량 단위 형태는 활성 성분을 약 1 mg 내지 약 500 mg으로 일반적으로 포함할 것이다.
특정 구체예에서, 약제학적 조성물은 TNF에 대한 항체에 반응을 보이는 증상을 치료하기 위해 패키징될 수 있다. 패키징된 약제학적 조성물은, 본 원에 기술된 1종 이상의 항체가 유효량으로 포함된 용기와, 환자에게 투여한 후 하나의 항체에 반응하는 질환/장애를 치료하기 위해 포함된 조성물의 사용법이 표시된 설명서(예, 라벨링)를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 화학적으로 변형시킬 수 있다. 바람직한 변형기는, 폴리머, 예컨대 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 폴리머 또는 분지형 또는 비분지형의 다당류이다. 이러한 작용기는 생체내 항체 반감기를 증가시킬 수 있다. 합성 폴리머의 특정 예로는, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알콜) 또는 그 유도체를 포함한다. 특정 천연 폴리머로는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 그 유도체가 있다. 폴리머의 크기는 원하는 대로 변경할 수 있지만 일반적으로는 평균 분자량 500 Da 내지 50000 Da의 범위일 것이다. 항체가 조직에 침투되도록 고안된 국소 적용을 위해, 바람직한 폴리머 분자량은 약 5000 Da이다. 폴리머 분자는, 항체에, 특히 WO 0194585에 기술된 바와 같이 공유 결합된 힌지 펩티드를 통해 Fab 단편 중쇄의 C-말단에 부착될 수 있다. PEG 모이어티의 부착에 대해서는, "폴리(에틸렌글리콜) 화학, 생물기법 및 생의학적 적용", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York 및 "생의과학에 대한 생물접합 단백질 커플링 기법", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York을 참조한다.
전술한 대상 항체를 제조한 후, 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제조한다. 제제화할 항체는 선행 동결건조되지 않으며, 본 원의 대상 제제는 수성 제제이다. 바람직하게는, 제제내 항체는 scFv와 같은 항체 단편이다. 제제내에 존재되는 항체의 치료적 유효량은, 예컨대 바람직한 투여량 체적과 투여 방식(들)을 고려하여 결정된다. 제제내 항체 농도의 예는 0.1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 바람직하게는 약 0.5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 2 mg/ml 내지 약 10 mg/ml이다.
상술한 바와 같은 pH 완충 용액내에 항체를 포함하는 수성 제제가 제조된다. 완충액의 농도는, 예컨대 완충액 및 제제의 바람직한 등장성에 따라 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 30 mM이다.
삼투압제(tonicifier)로서 작용하며 항체를 안정화시킬 수 있는 폴리올이 제제에 포함된다. 바람직한 구체예에서, 항체를 침전시키고/시키거나 낮은 pH에서 산화시킬 수 있기 때문에, 제제에는 소듐 클로라이드와 같은 염은 삼투압을 형성하는 양으로 포함되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 폴리올은 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비환원 당이다. 폴리올은 제제의 바람직한 등장성 측면에서 변경될 수 있는 양으로 제제에 첨가된다. 바람직하게는, 수성 제제는 등장성이며, 이 경우 제제내 적절한 폴리올 농도는 예컨대 약 1% 내지 약 15% w/v, 바람직하게는 약 2% 내지 약 10% w/v 범위이다. 그러나, 고삼투압성 또는 저삼투압성 제제도 적합할 수 있다. 또한, 첨가되는 폴리올의 양은 폴리올의 분자량에 따라 변경될 수 있다. 예컨대, 단당류(예, 만니톨)는 이당류(예, 트레할로스)에 비해 소량으로 첨가될 수 있다.
또한, 항체 제제에 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제의 예로는, 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트(예, 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머(예, 폴록사머 188)가 있다. 첨가되는 계면활성제의 양은, 전형적으로 제제화된 항체/항체 유도체의 응집을 줄이거나, 및/또는 제제내 미립자의 형성을 최소화하거나, 및/또는 흡착을 감소시키는 양이다. 예컨대, 계면활성제는 제제내에 약 0.001% 내지 약 0.5%, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 0.2% 및 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.1%로 존재할 수 있다.
일 구체예에서, 제제는 상기 나타낸 제제(즉, 항체, 완충액, 폴리올 및 계면활성제)를 포함하며, 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤제토늄 Cl과 같은 1종 이상의 보존제가 본질적으로 없다. 다른 구체예에서, 보존제는, 특히 다중 투여량 제제인 제제에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 가장 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1%의 범위일 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006)에 기재된 것과 같은 1종 이상의 다른 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 제제에 포함시킬 수 있지만, 단 이는 상기 제제의 바람직한 특징에 부정적으로 작용하지 않는 것이다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여체에게 무독성이며, 부가적인 완충제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌 등의 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제; 금속 복합체(예, Zn-단백질 복합체); 폴리에스테르와 같은 생분해성 폴리머; 및/또는 소듐과 같은 염을 형성하는 반대이온을 포함한다.
생체내 투여용으로 사용될 제제는 무균이어야 한다. 이는, 제제의 제조 전 또는 후에 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
제제는, 항체를 이용한 치료가 필요한 포유류, 바람직하게는 인간에게, 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼루스로서 또는 일정 기간 동안 지속적인 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로, 또는 본 원에 기술된 다른 경로로 투여된다. 특정 구체예에서, 제제는 정맥내 투여에 의해 포유류에 투여된다. 이를 위해, 제제는 예컨대 시린지나 IV 선을 통해 주입될 수 있다.
항체의 적정 투여량("치료적 유효량")은 예컨대 치료할 증상, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되든 간에 증상의 중증도 및 추이, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체 반응성, 사용되는 항체의 유형 및 주치의의 판단에 따라 정해질 것이다. 항체는 환자에게 한번 또는 일련의 치료 기간 동안 적절하게 투여되며, 진단 후에 임의의 시간에 환자에게 투여될 수 있다. 항체는, 단독 치료제로 또는 대상 병태를 치료하는데 유용한 다른 약물이나 치료법과 조합하여 투여될 수 있다.
포괄적인 내용으로서, 투여되는 항체의 치료적 유효량은 1회 이상 환자 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 100 mg/kg의 범위일 것이며, 사용되는 항체의 전형적인 범위는 약 0.3 내지 약 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg이며, 예컨대 매일 투여된다. 그러나, 다른 투약 요법도 사용할 수 있다. 이러한 치료법의 경과는 통상적인 기법으로 쉽게 모니터링된다.
특정 구체예에 있어서, 본 발명의 항-TNFα 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 TNF-매개 장애로 고통받는 환자에게 투여된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 수성 약제학적 제제를 보유하는 용기를 포함하는 제조 물품이 제공되며, 임의로 사용 설명서가 구비된다. 적합한 용기로는, 예컨대 병, 바이얼 및 시린지가 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 제조될 수 있다. 용기의 예는 3-20 cc의 1회 사용 유리 바이얼이다. 다른 예로, 다중 투약 제제의 경우, 용기는 3-100 cc의 유리 바이얼일 수 있다. 용기에 제제가 수용되며, 라벨이 용기 상에 부착되거나 조합되며, 용기에 사용 지침이 표시될 수 있다. 제조 물품은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 설명서를 구비한 첨부 문서를 포함하며, 상업적 및 사용자 견지에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함될 수 있다.
본 명세서 전체에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참조문헌은 그 전체가 참고로 본 명세서에 원용된다.
문맥에서 달리 필요치 않으면, 본 원에 사용된 단수 용어는 복수 용어를 포함하며, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다.
실시예
본원은 하기 실시예를 통해 추가적으로 설명되지만 더욱 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전체에 인용된 모든 도면 및 모든 참조 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
실시예 전반에 걸쳐, 달리 언급된 경우를 제외하고는 하기 재료 및 방법들을 사용하였다.
일반 재료 및 방법
일반적으로, 본 발명의 실시는, 언급된 경우를 제외하고는, 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학(특히, 항체 기술)의 통상적인 기술, 및 표준적인 폴리펩티드 제조 기술을 채택한다. 예로, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S ., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992)을 참조한다.
열안정성 측정
다양한 단일쇄들에 대해 FTIR-ATR(Attenuated total reflectance Fourier transform IR) 스펙트럼을 얻고, Tensor Bruker에서 FT-IR Bio-ATR 셀을 이용하여 분자를 추적하였다. 분자를 최대 3 mg/ml로 농축시키고, PBS(pH 6.5)에서 4 ℃에서 밤새 투석한 다음, 완충액 통과 분획(flow through)을 블랭크로서 수집하였다. 분자를 다양한 온도 범위에서 5 ℃ 차이로(25 ℃에서 95 ℃) 열에 노출시켜, 변성 프로파일을 수득하였다. 모든 스펙트럼 조작은 OPUS 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 주요 완충액 백그라운드와 일시적인 대기(CO2 및 H2O) 백그라운드를 단백질 스펙트럼에서 제하였다. 그런 후, 수득되는 단백질 스펙트럼을 베이스라인으로 보정하고, 단백질 아미드 I 스펙트럼을 예상한 영역내 가장 넓은 분석가능한 피크의 폭으로 측정하였다. 아미드 I 밴드 스펙트럼에 대한 2번째 유도체 스펙트럼을 3차 다항식 함수와 미분가능한 함수를 이용하여 구하였다. 단백질 구조 변화를 초기 곡선-피트 계산을 위한 선형 보정 곡선을 이용하여 아미드 I 제2 유도체 분석에 의해 예측하여, 3개의 낮은 값에 대한 0% 변성과 3개의 높은 값에 대한 100% 변성을 추측하였다. 변성 프로파일을 이용하여, 볼츠만 시그모이드 모델을 적용하는 각 변이에 대해 열 언폴딩 전이(TM)의 중간값을 추정하였다.
가용성 측정
암모늄 설페이트의 존재하에 단백질 응집 및 침전을 증가시킨 후, 다양한 scFv 분자의 상대적인 가용성을 측정하였다. 암모늄 설페이트를 단백질 수용액에 첨가하여, 최종 혼합물 염-단백질에서 포화율을 5%씩 증가시켰다. 동적 범위에서의 침전을 실험을 통해 측정하였고, 최종 혼합물의 포화 간격을 상기 범위에서 2.5% 포화 간격으로 줄였다. 암모늄 설페이트를 첨가한 후, 샘플을 조심스럽게 혼합하고, 6000 rpm으로 30 분간 원심분리하였다. 각각의 암모늄 설페이트 포화율에서, 상층액에 잔류하는 단백질을 회수하였다. 가용성 곡선은 NanoDropTM 1000 분광광도계를 이용하여 상층액 중의 단백질 농도를 측정함으로써 구하였다. 상층액내 잔류하는 가용성 단백질 측정값을 정규화하고, 이를 이용하여 볼츠만 시그모이드 모델을 적용하는 각 변이에 대해 상대적인 가용성의 중간값을 예측하였다.
단기 안정성 테스트
단백질을 40 ℃에서 2 주간 인큐베이션한 후, 가용성 응집물과 분해 산물에 대해 분석하였다. 10 mg/ml 농도의 단백질을 밤새 4 ℃에서 다양한 pH 범위(3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.5)의 PBS에서 투석하였다. 표준 완충액 PBS(pH 6.5) 중의 동일 농도의 대조군 단백질은 2 주간 -80 ℃에 보관하였다. SDS-PAGE에 의한 분해 밴드 확인은 t=0 및 t=14일에 수행하였고, 가용성 응집물은 SEC-HPLC로 분석하였다. 40 ℃에서 2 주후의 잔류 활성 측정은 Biacore를 이용하여 수행하였다.
실시예 1
응집 감소를 위한 항-TNFα scFv 항체, 34rFW1.4의 최적화
34rFW1.4 항체는 용액에서 pH 의존성 응집 성향을 나타낸다. 34rFW1.4와 동일한 프레임워크 구조를 소유하는 578rFW1.4 항체 (국제 출원 WO2009155724호 참조)는 응집 성향을 나타내지 않는다. 34rFW1.4에서 그의 응집 성향을 감소시키도록 변경될 수 있는 잠재적 잔기를 확인하기 위해 상동 모델을 다음과 같이 생성하였다.
가변 도메인 서열을 사용하여 34rFW1.4 항체 및 578rFW1.4 항체의 상동 모델을 구축하였다. 모델 생성을 위해, BLAST 알고리즘-기반 검색으로 각 항체에 대한 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 가변 도메인 서열의 주형 구조를 별도로 확인하였다. 항체내 프레임워크 영역의 고도 보존성 때문에 BLOSUM80 (분지성이 덜한 정렬용 매트릭스)을 정렬 매트릭스로서 사용하였다. 각 쇄 (VL/VH)에 대해 쿼리 서열과 70% 초과의 동일성을 나타내는 개별 주형을 선정하였다.
Discovery Studio 버전 2.5.5 (DS 2.5.5) 소프트웨어 (Accelrys, Inc., San Diego, CA)의 프로그램 모델러를 사용하여 확인된 가변 도메인 주형을 기반으로 한 100 scFv 모델을 생성하였다. 주형 구조로 모델화 된 기준 항체 서열의 정렬을 입력 데이터로 사용하였다. 모두 비수소 원자를 함유하는 100개의 모델을 생성하였다. PDF (확률 밀도 함수) 물리적 에너지 점수에 준해 최적의 모델 구조를 선정하였다. VH 및 VL 도메인의 상대 배향을 모델화 된 양 (VL 및 VH) 서열과 최고의 상동성을 가지는 가변 도메인 주형 구조의 어느 하나와 매치되도록 설정하였다. 모델내 교호 배열을 제거하고, 말단을 가한 후, 누락된 측쇄 원자를 첨가하였다. CHARMM 힘의 장을 scFv 모델에 인가하고, 0.01의 RMS 구배 및 묵시적 용매 모델로서 GBMV (Generalized Born with Molecular Volume: 분자 부피를 갖는 일반화 본)을 사용해 2000 사이클의 에너지 최소화에 적용하였다.
각 항체에 대해 단백질 이온화 및 잔기 pK 계산을 수행하였다. 계산은 1991년에 배쉬포드(Bashford) 및 카플러스(Karplus)가 개발한 이론을 바탕으로 Discovery Studio 버전 2.5.5 (DS 2.5.5)에 포함된 프로토콜 실행을 이용해 행하였다. 단백질 이온화 및 잔기 pK 계산 결과를 두 분자에 대해 항체의 N-말단 및 C 말단 잔기, Asp, Glu, Arg, Lys, His, Tyr, Cys를 포함한 각 적정 잔기의 적정 곡선 및 측쇄의 pK1/2 면에서 비교하였다.
CHARMM 힘의 장을 scFv 모델에 인가하고, pH 7.4에서 양성화하고, 개별 잔기들의 적정 곡선 및 pK를 pH 2 내지 pH 14 범위에서 0.2 pH 스텝을 사용하여 계산하였다. 578rFW1.4 항체의 경쇄에서 47번 및 50번 위치에 있는 두 보존 Lys 잔기는 34rFW1.4에서 상기 위치에 있는 Lys와 비교해 상이하였다 (도 1 참조).
바람직한 치환 도입
VL과 VH 간의 상호작용 친화성을 향상시킴으로써 도메인이 서로 분리되어 올리고머 및 고차 응집물을 형성하는 것을 방지하는 돌연변이 예측을 위해 Discovery Studio 소프트웨어를 사용하여 분자동력학 시물레이션을 수행하였다. 34rFW1.4 항체의 VL/VH 인터페이스 안정성을 자유 에너지 G와 같은 에너지 항목으로 추정하였다. CHARMM 프로토콜 적응 (DS 2.5.5에 또한 포함)을 이용해 전체 scFv 헤테로다이머 복합체 및 각 개별 가변 도메인의 에너지 합간의 에너지 차를 계산하였다. GBMV (Generalized Born with Molecular Volume integration: 분자 부피 적분을 갖는 일반화 본)를 사용하여 묵시적 용매 방법과 관련한 계산을 하였다. 양 도메인 및 복합체의 에너지를 계산하고, 산출을 하기 계산에 따라 복합체 및 개별 도메인의 합 사이의 에너지 차이로 결정하였다: G 인터페이스 = G(a)-G(b)-G(c)(여기에서, G(a)는 항체의 에너지이고, G(b)는 VL의 에너지이며, G(c)는 VH의 에너지임).
R에 대한 측쇄 pKa 값 (12.5)이 K의 pKa (10.5) 보다 크기 때문에, 아르기닌 (R)을 47 및 50번 위치에서 라이신 (K)에 대한 가능한 잔기 치환으로 선정하였다. 각각의 위치에서 개별적으로 K를 R로 대체하여 돌연변이 K47R 및 K50R을 생성하였다. 새로운 모델 분자가 변화에 적응하도록 하기 위해 10 옹스트롬 또는 돌연변이 주변 영역에 인접한 잔기에 대해 2000 사이클의 에너지 최소화를 수행하였다. 이들 에너지 최소화에 대한 묵시적 용매 모델은 GBMV이었다. 돌연변이에 대한 예측 평균 델타 G는 -94 kcal/mol이었다. 따라서, 돌연변이 기여는 친 항-TNF scFv 항체에 비교해 4 kcal/mol인 것으로 추정되었다.
실시예 2
최적화된 34rFW1.4 항체의 안정성 분석
(2009년 6월 25일자로 출원된 함께 계류중인 국제 출원 PCT/CH2009/000219호(그의 내용은 그의 전체가 본 원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있는) 34rFW1.4항체에서 K50R 돌연변이 및 K47R 돌연변이를 생성하였다. 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해 추가적인 치환을 가지는 34rFW1.4의 다른 돌연변이를 미국 특허 출원 12/973,968호에 기술되어 있는 방법에 따라 제조하였다. 특히, 34rFW1.4_VLK50R_DHP로 명명된 세번째 돌연변이는 중쇄 12번 위치에 세린 (S) (AHo 번호 지정), 중쇄 103번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정) 및 중쇄 144번 위치에 트레오닌 (T) (AHo 번호 지정)을 함유한다. 친 항체 및 돌연변이 34rFW1.4 항체의 안정성 연구를 다음과 같이 가속 조건하에 수행하였다.
34rFW1.4 항체, 돌연변이 34rFW1.4_VL_K50R, 및 34rFW1.4_VLK50R_DHP를 포스페이트 완충 염수 (50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 6.5) 제제에서 20, 40 및 60 mg/mL 까지 농축하고, 40 ℃에서 2 주간 인큐베이션하였다. 34rFW1.4 및 34rFW1.4_K47R 항체를 포스페이트 완충 염수 (50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 6.5) 제제에서 20 및 60 mg/mL 까지 농축하고, 40 ℃에서 2 주간 인큐베이션하였다. 샘플을 환원 및 비환원 조건하에 12.5% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (SDS-PAGE)을 이용하여 인큐베이션 전 및 인큐베이션 14 일후 분해에 대해 분석하였다. 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 사용하여 인큐베이션 기간 전 후 샘플의 단량체 함량 및 가용성 응집물을 측정하였다. 단량체를 TSKgel Super SW2000 칼럼 (TOSOH Bioscience) 상에서 비단량체종으로부터 분리하고, 단량체 단백질의 백분율을 단량체 피크 면적을 모든 생성물의 총 피크 면적으로 나누어 계산하였다. 34rFW1.4 및 34rFW1.4_VLK50R_DHP에 대한 연구 결과를 도 2A-B, 3A-B, 및 4A-B에 각각 나타내었다. 34rFW1.4_VL_K50R에 대한 결과는 도 5B, 6B, 및 7B에 나타나 있다. 이들 실험은 34rFW1.4_VLK50R_DHP가 34rFW1.4에 비해 감소된 응집 성향을 나타냄을 입증한다. 도 8B 및 9B에 나타난 바와 같이, 돌연변이 34rFW1.4_K47R이 또한 이같은 감소를 입증하였다.
또, 34rFW1.4 및 34rFW1.4_VLK50R_DHP 항체의 열 안정성 및 결합 친화성도 비교하였다. 결과는 34rFW1.4_VLK50R_DHP 항체를 생성하도록 만들어진 돌연변이는 친 34rFW1.4 항체에 비해 안정성 또는 결합 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
등가물
당해 기술 분야의 숙련자라면, 전술한 설명에 비추어 본 발명에 대한 다수의 변형 및 대안적인 구체예들을 명확하게 인식할 것이다. 따라서, 본 명세서의 내용은 단지 예로만 해석되어야 하며, 당해 기술 분야의 숙련자에게 본 발명을 수행하기 위한 최상의 방식을 교시하기 위한 것이다. 구성에 대한 상세한 내용은 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위에서 실질적으로 변경될 수 있으며, 청구범위의 영역내에 포함되는 모든 변형으로만 제한된다. 본 발명은 청구범위와 적용가능한 법칙에 의해 규정되는 범위로만 한정되는 것으로 의도된다.
특허, 특허 출원, 기사, 책자, 보고서, 논문, 웹 페이지, 도면 및/또는 부록을 비롯한 본 출원에 인용된 모든 문헌과 유사 소재들은 이들 문헌과 유사 소재의 형식에 상관없이 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다. 포함되는 문헌과 유사 소재들 중 한가지 이상이, 정의된 용어, 용어 사용, 기술된 기법 등을 포함하여 본 발명과 다르거나 모순되는 경우, 본 발명을 따른다.
본 원에 사용되는 섹션의 제목은 단지 조직화를 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 기술된 내용으로 한정되는 것으로 해석되진 않는다.
본 발명은 다양한 구체예들과 실시예를 들어 설명되어 있지만, 본 발명의 내용은 이러한 구체예나 실시예로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명은 당해 기술 분야의 숙련자에게 인지되는 바와 같은 다양한 대안, 변형 및 등가를 포괄한다.
청구범위는 그 효과가 언급되어 있지 않더라도 기재된 지시 또는 요소로 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 청구범위의 영역내에서 형태나 구체적인 내용에 대한 다양한 변화가 가해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 하기 청구범위의 영역 및 취지, 그리고 이의 등가에 포함되는 모든 구체예들이 청구된다.
SEQUENCE LISTING <110> ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC Borras, Leonardo Urech, David <120> STABLE AND SOLUBLE ANTIBODIES <130> 3921 US <160> 18 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(73) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(138) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(220) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 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naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(326) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (341)..(390) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (423)..(483) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 8 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(138) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(220) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(326) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (341)..(390) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (423)..(483) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 9 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 10 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn 20 25 30 Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn Thr 85 90 95 Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 Ile Ser Arg Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Gly Cys Ile Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Thr Pro 180 185 190 Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 11 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(73) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(138) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(220) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 11 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 12 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(73) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(138) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(220) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 12 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 13 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(73) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(138) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(220) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 13 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn 20 25 30 Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn Thr 85 90 95 Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 15 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(73) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(138) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(220) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(326) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (341)..(390) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (423)..(483) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 15 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 16 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(73) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(138) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(220) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(326) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (341)..(390) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (423)..(483) <223> X can be any naturally occurring amino acid. at least one and up to 50 amino acids can be present <400> 16 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 17 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn 20 25 30 Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn Thr 85 90 95 Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 Ile Ser Arg Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Gly Cys Ile Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Thr Pro 180 185 190 Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 18 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 18 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn 20 25 30 Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn Thr 85 90 95 Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 Ile Ser Arg Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Gly Cys Ile Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Thr Pro 180 185 190 Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250

Claims (27)

  1. a. 서열 번호 2 또는 서열 번호 14의 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및
    b. 서열 번호 5의 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는,
    인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 가변 경쇄가 서열 번호 2의 서열을 포함하는 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 가변 경쇄가 서열 번호 14의 서열을 포함하는 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 링커(linker)를 추가로 가지는 항체.
  5. 제 1 항에 있어서, 서열 번호 10의 서열을 포함하는 항체.
  6. 제 1 항에 있어서, 서열 번호 17의 서열을 포함하는 항체.
  7. 치료적 유효량의 제 1 항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 연령관련 황반변성, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 수정체뒤 섬유증식, 유방암종, 폐암종, 위암종, 식도암종, 결장직장암종, 간암종, 난소암종, 코마, 남화아세포종, 자궁경부암종, 자궁내막암종, 자궁내막 이상증식, 자궁내막증, 섬유육종, 융모암종, 두경부암, 비인두암종, 후두암종, 간아세포종, 카포시육종, 흑색종, 피부암종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관모세포종, 췌장암종, 망막아종, 성상세포종, 교아종, 신경초종, 희돌기교종, 수모세포종, 신경아세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요로암종, 갑상선암종, 빌름스 종양, 신세포암종, 전립선암종, 모반증 관련 이상혈관증식, 뇌종양과 관련된 부종, 메이그 증후군, 류마티스성 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 건성안, 안염증, 알레르기성 결막염, 피부염, 비염, 천식, 안혈관형성, 베체트병, 망막염, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병 신경병증, 공막염, 각막염 및 포도막염에서 선택되는 TNFα-매개 질환 치료용 약제학적 조성물.
  8. 치료적 유효량의 제 1 항의 항체를 포함하는 연령관련 황반변성, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 수정체뒤 섬유증식, 유방암종, 폐암종, 위암종, 식도암종, 결장직장암종, 간암종, 난소암종, 코마, 남화아세포종, 자궁경부암종, 자궁내막암종, 자궁내막 이상증식, 자궁내막증, 섬유육종, 융모암종, 두경부암, 비인두암종, 후두암종, 간아세포종, 카포시육종, 흑색종, 피부암종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관모세포종, 췌장암종, 망막아종, 성상세포종, 교아종, 신경초종, 희돌기교종, 수모세포종, 신경아세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요로암종, 갑상선암종, 빌름스 종양, 신세포암종, 전립선암종, 모반증 관련 이상혈관증식, 뇌종양과 관련된 부종, 메이그 증후군, 류마티스성 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 건성안, 안염증, 알레르기성 결막염, 피부염, 비염, 천식, 안혈관형성, 베체트병, 망막염, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병 신경병증, 공막염, 각막염 및 포도막염에서 선택되는 TNFα-매개 질환 치료용 약제.
  9. 제 7 항에 있어서, TNFα-매개 질환이 포도막염, 베체트병, 망막염, 건성안, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병 신경병증, 공막염, 연령관련 황반변성 및 각막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 눈, 비강내, 귀, 설하, 경피, 국소, 경구, 코, 직장 또는 비경구 투여로 투여되는 약제학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 0.1 내지 100 mg의 항체를 포함하는 단일 또는 분할 용량으로 투여되는 약제학적 조성물.
  12. 제 7 항에 있어서, TNFα-매개 질환이 포도막염이고, 대상의 눈에 국소적으로 투여되는 약제학적 조성물.
  13. 제 1 항의 항체를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  14. 제 13 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제 14 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제 1 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 또는 선형 항체인 항체.
  17. 제 1 항의 항체를 포함하는 2가 또는 이중특이적 분자.
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