CN108359012A - 稳定和可溶的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了经修饰以减少聚集倾向的抗体，以及产生此类抗体的方法。本发明还提供了特异于TNF的特别稳定的可溶性scFv抗体和Fab片段，其包含就稳定性、溶解度、TNF的体外和体内结合以及低免疫原性进行优化的特定轻链和重链序列。还公开了用于表达本发明的重组抗体的核酸、载体和宿主细胞、用于分离其的方法以及所述抗体在医药中的用途。

Description

稳定和可溶的抗体
交叉参考相关申请
根据35U.S.C.§119，本申请要求2010年10月22日提交的美国临时专利申请No.61/405,798和2011年5月11日提交的美国临时专利申请No.61/484,749(所述美国临时专利申请的完整内容通过引用并入本文)的优先权。
发明领域
本发明涉及减小抗体的聚集倾向的方法以及经修饰以减小聚集倾向的抗体。本发明还涉及结合肿瘤坏死因子α(TNFα)的抗体。具体地，本发明涉及包含减少聚集的修饰的稳定的可溶性抗体，包括scFv抗体和Fab片段，其包含就稳定性、溶解度和低免疫原性进行了优化的特定轻链和重链序列。此外，本发明涉及用于诊断和/或治疗TNF介导的病症的方法。
发明背景
肿瘤坏死因子α(TNFα，也称为恶病质素)是由许多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)响应内毒素或其它刺激而产生的天然存在的哺乳动物细胞因子。TNFα为炎性、免疫学和病理生理学反应的主要介质(Grell，M.，等人(1995)Cell，83：793－802)。
可溶性TNFα通过切割前体跨膜蛋白而形成(Kriegler等人(1988)Cell 53：45－53)，并且分泌的17kDa多肽装配成可溶性同三聚体复合物(Smith，等人(1987)，J.Biol.Chem.262：6951－6954；关于TNFA的综述，参见Butler，等人(1986)，Nature 320：584；Old(1986)，Science 230：630)。此类复合物随后结合见于多种细胞上的受体。结合产生一系列促炎症效应，包括(i)释放其它促炎症细胞因子例如白细胞介素(IL)－6、IL－8和IL－1，(ii)释放基质金属蛋白酶和(iii)上调内皮粘附分子的表达，且还通过将白细胞诱入血管外组织来放大炎症和免疫级联反应。
许多病症与升高的TNFα水平相关，它们中的许多具有显著的医学重要性。已显示，TNFα在许多人疾病中被上调，所述疾病包括慢性疾病例如类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病症包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、败血症、充血性心力衰竭、支气管哮喘(asthmabronchiale)和多发性硬化。人TNFα转基因小鼠组成型地产生高水平的TNFα并且产生自发的、破坏性的、类似RA的多关节炎(Keffer等人1991，EMBO J.，10，4025－4031)。因此TNFα称为促炎症细胞因子。
TNFα现被明确地确定为RA发病机制中的至关重要的因子，所述RA为慢性、进行性并且使患者虚弱的疾病，其特征在于多关节性关节炎症和破坏，伴有发热以及不舒服和疲劳的全身性症状。RA还导致慢性滑液炎症，经常进展成关节软骨和骨破坏。在患有RA的患者的滑液和外周血中都发现了升高水平的TNFα。当给患有RA的患者施用TNFα阻断剂时，它们减少炎症，改善症状以及延缓关节损伤(McKown等人(1999)，Arthritis Rheum.42：1204－1208)。
在生理上，TNFα还与免受特定感染的保护相关(Cerami.等人(1988)，Immunol.Today9：28)。TNFα由已被革兰氏阴性细菌的脂多糖激活的巨噬细胞释放。这样，TNFα显示为牵涉与细菌性脓毒症相关的内毒素性休克的发展和发病机制的至关重要的内源介质(Michie等人(1989)，Br.J.Surg.76：670－671.；Debets等人(1989)，Second ViennaShock Forum，p.463－466；Simpson等人(1989)Crit.Care Clin.5：27－47；Waage等人(1987).Lancet1：355－357；Hammerle等人(1989)Second Vienna Shock Forum p.715－718；Debets等人(1989)，Crit.Care Med.17：489－497；Calandra等人(1990)，J.Infect.Dis.161：982－987；Revhaug等人(1988)，Arch.Surg.123：162－170)。
与其它器官***一样，还已显示TNFα在中枢神经***中，特别是在神经***的炎性和自身免疫性病症(包括多发性硬化、格－巴二氏综合征(Guillain－Barre syndrome)和重症肌无力)以及神经***的退行性病症(包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病)中起着至关重要的作用。TNFα还牵涉视网膜和肌肉的相关***的病症，包括视神经炎、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、皮肌炎、肌萎缩侧索硬化和肌营养不良症，以及牵涉对神经***的损伤，包括外伤性脑损伤、急性脊髓损伤和中风。
肝炎是另一种TNFα相关炎性病症，除其它触发因子外，其还可由病毒感染(包括EB病毒、巨细胞病毒和肝炎A－E病毒)引起。肝炎在肝门和小叶区域引起急性肝炎症，随后引起纤维化和肿瘤进展。TNFα还可介导癌症的恶病质，其导致大部分癌症发病率和死亡率(Tisdale M.J.(2004)，Langenbecks Arch Surg.389：299－305)。
TNFα在炎症、细胞免疫应答以及许多疾病的病理学中所起的关键作用已引发对TNFα拮抗剂的寻找。被设计用于治疗TNFα介导的疾病的TNFα拮抗剂的一个种类是特异性结合TNFα，从而阻断其功能的抗体或抗体片段。抗－TNFα抗体的使用已显示，TNFα的阻断可逆转归因于TNFα的效应，包括IL－1、GM－CSF、IL－6、IL－8、粘附分子的降低和组织破坏(Feldmann等人(1997)，Adv.Immunol.1997：283－350)。最近已商购可得的TNFα特异性抑制剂包括，抗TNFα的单克隆、嵌合小鼠－人抗体(英夫利昔单抗，RemicadeTM；CentocorCorporation/Johnson & Johnson)，其已在RA和克罗恩氏病的治疗中显示临床功效。尽管已取得这些进展，但仍然需要用于治疗TNFα－相关病症例如RA的抗体的新型有效形式或其它抗体。特别地，存在对具有有效持续地治疗关节炎及其它TNFα介导的病症的最佳功能性质的抗体的急迫需要。
发明概述
本发明提供了包含至少一个减少聚集的突变的抗体以及用于产生此类抗体的方法。
在一个方面，本发明提供了减小抗体的聚集倾向的方法，所述方法包括，在参与抗体的可变轻链与可变重链之间的界面的残基位置上引入一个或多个减小聚集的修饰，其中置换使可变轻链与可变重链之间的自由能减小至少0.5kcal/mol，从而相较于不具有减小聚集的修饰的亲代抗体的聚集倾向，经修饰的抗体的聚集倾向得到减小。
在一个方面，本发明的方法包括，在抗体的可变轻链(VL)与可变重链(VH)的界面中引入一个或多个氨基酸置换，其中一个或多个置换在这样的残基位置上，其被选择以使VL与VH之间的自由能减小至少10％，从而使抗体的聚集倾向相较于亲代抗体得到减小。在具体方面，抗体的可变轻链的序列与SEQIDNO：1的序列具有至少65％的同一性。在其它方面，可变重链序列与SEQIDNO：3的序列或SEQIDNO：4的序列具有至少85％的同一性。
在某些方面，本发明的方法包括，修饰抗体的可变轻链中的AHo位置50上的残基和/或AHo位置47上的残基，从而使抗体的聚集倾向相较于亲代抗体获得减小。在其它方面，本发明的方法还包括，修饰可变重链的AHo位置12、103和144上的残基。
本发明还提供了具有减小的聚集倾向的抗体，其包含一个或多个减小聚集的修饰。在某些方面，本发明的抗体为Fab、Fab′、F(ab)′2、单链Fv(scFv)、Fv片段、或线性抗体。在其它方面，本发明提供了包含本发明的抗体的双特异性或双价分子。
在其它方面，减小聚集的修饰在可变轻链的AHo位置50上。在具体的方面，减小聚集的修饰包括可变轻链的AHo位置50上的精氨酸(R)。在其它方面，减小聚集的修饰包括，在可变轻链的AHo位置50上的精氨酸(R)对赖氨酸(K)的置换。
在其它方面，减小聚集的修饰在可变轻链的AHo位置47上。在具体的方面，减小聚集的修饰包括可变轻链的AHo位置47上的精氨酸(R)。在其它方面，减小聚集的修饰包括，在可变轻链的AHo位置47上的精氨酸(R)对赖氨酸(K)的置换。
本发明还提供了特异于TNFα的稳定的可溶性抗体，其包含针对稳定性、可溶性、TNFα的体外及体内结合以及低免疫原性进行了优化的特定轻链和重链序列。所述抗体被设计用以诊断和/或治疗TNFα介导的病症。还公开了用于表达本发明的重组抗体、可变轻链和可变重链的核酸、载体和宿主细胞、用于分离它们的方法以及所述抗体在医药中的用途。
本发明还提供了治疗TNFα介导的病症的方法，包括给有此需要的受试者施用包含本发明的抗－TNFα抗体的药物组合物。在某些方面，TNFα介导的病症为选自葡萄膜炎、白塞病(Bechet＇s disease)、视网膜炎、干眼、青光眼、综合征、糖尿病神经病变、巩膜炎、年龄相关黄斑变性和角膜炎的眼病症。
根据下列某些优选实施方案的更详细描述和权利要求，本发明的特别优选的实施方案将变得显然。
附图概述
图1显示两种不同的scFv分子34rFW1.4(黑色)和578rFW1.4(灰色)的残基位置VL47(实线)和VL50(虚线)的滴定曲线。
图2A显示在40℃下使用60mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图2B显示在40℃下使用60mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿VLK50R＿DHP在加速的条件下的稳定性。
图3A显示在40℃下使用40mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图3B显示在40℃下使用40mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿VLK50R＿DHP在加速的条件下的稳定性。
图4A显示在40℃下使用20mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图4B显示在40℃下使用20mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿VLK50R＿DHP在加速的条件下的稳定性。
图5A显示在40℃下使用60mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图5B显示在40℃下使用60mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿VL＿K50R在加速的条件下的稳定性。
图6A显示在40℃下使用40mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图6B显示在40℃下使用40mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿VLK50R在加速的条件下的稳定性。
图7A显示在40℃下使用20mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图7B显示在40℃下使用20mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿VLK50R在加速的条件下的稳定性。
图8A显示在40℃下使用60mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图8B显示在40℃下使用60mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿K47R在加速的条件下的稳定性。
图9A显示在40℃下使用20mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4在加速的条件下的稳定性。
图9B显示在40℃下使用20mg/ml的浓度温育2周后通过SE－HPLC分析测定的34rFW1.4＿K47R在加速的条件下的稳定性。
发明详述
本发明的总体目的是，提供在溶液中具有减小的聚集倾向的稳定的可溶性抗体。在优选实施方案中，所述抗体为scFv抗体或Fab片段。本发明的抗体优选包含本文中公开的轻链和重链。
本文中显示的细节仅仅是示例性的和用于举例论述本发明的优选实施方案，并且提供了这样的内容，其被认为是对本发明的各个实施方案的原理和概念方面的最有用和易于理解的描述。在这点上，未打算比深刻理解本发明所必需的内容更详细地显示本发明的结构内容，说明书与附图和/或实施例一起使本领域技术人员明白可如何在实践中实现本发明的几个形式。
为了可更容易地理解本发明，如下定义某些术语。其它定义示于整个详细描述中。除非在下列实施例中被清楚和明确地改变，或当含意的应用使得阐释(construction)无意义或基本上无意义，否则在任何阐释中意欲以下列定义和解释为准。在术语的阐释使得其无意义或基本上无意义的情况下，定义应当根据韦氏词典，第3版，或本领域技术人员已知的词典，例如牛津生物化学和分子生物学词典(Ed.Anthony Smith，Oxford UniversityPress，Oxford，2004)。
如本文中所用，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”、“抗原结合多肽”或“免疫结合剂”)或单链。“抗体”包括，包含通过二硫键链间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每一个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每一个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区还可被细分成其间***了较保守的区域(称为构架区(FR))的高变区(称为互补决定区(CDR))。每一个VH和VL包含3个CDR和4个FR，从氨基端至羧基端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq))的结合。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指抗体的保留特异性结合抗原(例如，TNF)的能力的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括，(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab＇)2片段，包括通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544－546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，所述接头使得它们能够产生为单个蛋白质链，其中VL与VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如，Bird等人(1988)Science242：423－426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879－5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。此类抗体片段可使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，以与完整抗体相同的方式就效用筛选所述片段。抗原结合部分可利用重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。抗体可具有不同的同种型，例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
术语“构架”是指，本领域公认的抗体可变区的部分，其存在于多个分散的CDR区之间。此类构架区通常称为构架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)并且提供用于在三维空间中保持重链或轻链抗体可变区中的3个CDR(以便CDR可形成抗原结合表面)的支架。此类构架还可被称为支架，因为它们为多个分散的CDR的呈现提供支持。免疫球蛋白超家族例如锚蛋白重复序列和纤连蛋白的其它CDR和构架可用作抗原结合分子(也参见，例如，美国专利No.6,300,064、6,815,540和美国专利公开案No.20040132028)。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原(例如，TNF)上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指，抗体对预定抗原上的表位的结合。通常，抗体以大致小于10－7M，例如大致小于10－8M、10－9M或10－10M或更低的亲和力(KD)结合，如在BIACORE仪中使用表面等离子共振(SPR)技术测定的。
术语“KD”是指特定抗体－抗原相互作用的解离平衡常数。在某些实施方案中，本发明的一些抗体以小于约10－7M，例如小于约10－8M、10－9M或10－10M或甚至更小的解离平衡常数(KD)结合TNF，例如，如在BIACORE仪中使用表面等离子共振(SPR)技术测定的。
如本文中所用，＂同一性＂是指两个多肽分子之间或两个核酸之间的序列匹配。当两个相比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单位占据时(例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置被赖氨酸占据)，那么各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分比同一性”是两个序列共有的匹配位置的数目除以相比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。举例来说，DNA序列CTGACT与CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个匹配)。一般而言，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。可使用例如Need leman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443－453的方法(其可方便地用计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)来执行)提供这样的比对。两个氨基酸序列之间的百分比同一性还可使用已被整合入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11－17(1988))，利用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性还可使用已被整合入GCG软件包的GAP程序(可在www.gcg.com上获得)的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444－453(1970))算法，利用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16，14，12，10，8，6或4的缺口权重(gapweight)和1，2，3，4，5或6的长度权重(length weight)来测定。
＂相似＂序列是指，当对齐时共有相同和相似氨基酸残基的那些序列，其中相似残基是比对的参照序列中的相应氨基酸残基的保守置换。在这一点上，参照序列中的残基的＂保守置换＂是指，用在物理或功能上与相应的参照残基相似的残基(例如具有相似尺寸、形状、电荷、化学性质(包括形成共价键或氢键的能力)等的残基)进行的置换。因此，“保守置换修饰的”序列是与参照序列或野生型序列相异在于存在一个或多个保守置换的序列。两个序列之间的＂百分比相似性＂是，两个序列共有的包含匹配残基或保守置换的位置的数目除以相比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配并且10个位置中有2个包含保守置换，那么两个序列具有80％的正相似性(positivesimilarity)。
如本文中所用，术语“保守序列修饰”意欲指，未负面影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸置换、添加和缺失。例如，可通过本领域已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变来引入修饰。保守氨基酸置换包括其中用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这类家族包括，具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，特定抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守置换的方法在本领域是公知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32：1180－1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879－884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：412－417(1997))。
如本文中所用的，＂氨基酸共有序列＂是指，可使用至少两个(优选更多个)比对的氨基酸序列的矩阵，并且在比对中允许存在缺口以便能够确定各个位置上频率最高的氨基酸残基，而产生的氨基酸序列。共有序列是在每一个位置上包含最频繁出现的的氨基酸的那个序列。如果两个或更多个氨基酸残基同等地出现在单个位置上，则共有序列包括两个或所有这些氨基酸。
可在不同的水平上分析蛋白质的氨基酸序列。例如，可在单个残基水平、多个残基水平、具有缺口的多个残基等上显示保守或可变性。残基可显示相同残基的保守性或可在种类水平上是保守的。氨基酸种类的实例包括，极性且不带电荷的R基(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的R基(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；带负电荷的R基(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水性R基(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；和特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其它种类对于本领域技术人员来说是已知的，并且可使用结构测定或评估可置换性的其它数据来定义。在该意义上，可置换的氨基酸可以指，在该位置上可被置换并且维持功能保守性的任何氨基酸。
然而，应注意，相同种类的氨基酸在其生物物理学性质上可存在不同程度的变化。例如，应注意，某些疏水性R基(例如，丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸)比其它疏水性R基(例如，缬氨酸或亮氨酸)更加亲水(即，具有更高的亲水性或更低的疏水性)。相对亲水性或疏水性可使用本领域公认的方法(参见，例如，Rose等人，Science，229：834－838(1985)和Cornette等人，J.Mol.Biol.，195：659－685(1987))来测定。
如本文中所用，当将一个氨基酸序列(例如，第一VH或VL序列)与一个或多个另外的氨基酸序列(例如，数据库中的一个或多个VH或VL序列)比对时，可将一个序列(例如，第一VH或VL序列)中的氨基酸位置与一个或多个另外的氨基酸序列中的“相应位置”相比较。如本文中所用，“相应位置”代表当将序列最佳比对时，即当比对序列以获得最高百分比同一性或百分比相似性时被比较的序列中的等同位置。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其被有效地连接于编码序列。在某些实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗体、本发明的可变轻链和/或本发明的可变重链的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的核酸分子编码：包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14具有至少97％的同一性的轻链可变区的多肽；包含与SEQ ID NO：5具有至少95％的同一性的重链可变区的多肽；或与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：17具有至少96％的同一性的抗体。
术语“载体”是指能够运输与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接于其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接进入病毒基因组。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主自制(例如，具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后被整合进入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门菌属(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)的成员，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢品系)和NS0细胞。
术语“治疗”、“医治”和“医疗”是指本文中描述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法包括，给需要这样的治疗的受试者(例如，患有TNFα介导的病症的受试者或最终可获得这样的病症的受试者)施用本发明的抗体，以预防、治愈、延迟病症或复发性病症、减轻所述病症的严重度，或改善所述病症的一个或多个症状，或以使受试者的存活延长超过在这样的治疗不存在的情况下预期的时间。
术语“TNF介导的病症”通常是指，与TNF相关的疾病状态和/或症状，包括其症状的发作、进展或持续需要TNF的参与的任何病症。TNF介导的病症的实例包括但不限于，年龄相关黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、卵巢雄性细胞瘤、***、子宫内膜癌、子宫内膜增生症、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi＇s sarcoma)、黑素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannoma)、少突神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨性肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌(urinary tract carcinomas)、甲状腺癌、肾母细胞瘤(Wilm＇stumor)、肾细胞癌、***癌、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的)、Meigs综合征(Meigs＇syndrome)、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。TNF介导的病症还包括干眼和TNFα相关炎性病况，例如眼部炎症(ocular inflammation)、过敏性结膜炎、皮炎、鼻炎和哮喘，例如，包括由直接或间接导致TNFα相关炎性病况的TNFα活性引起的那些细胞变化。此外，TNF介导的病症还包括眼部血管生成、白塞病、视网膜炎、青光眼、综合征、糖尿病神经病变、巩膜炎、角膜炎和葡萄膜炎。
术语“有效剂量”或“有效量”是指，足以获得或至少部分获得期望的作用的量。术语“治疗有效量”定义为足以治愈或至少部分停止已患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。对于该用途有效的量将取决于待治疗的病症的严重度和患者自已的免疫***的总体状态。
术语“受试者”是指任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有TNF介导的病症的受试者。
本文中用于确定抗体重链和轻链可变区中的氨基酸残基位置的编号***对应于由A.Honegger，J.Mol.Biol.309(2001)657－670定义的编号***(AHo***)。AHo***与由Kabat等人(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91－3242)定义的最常用***之间的换算表提供于A.Honegger，J.Mol.Biol.309(2001)657－670中。
如本文中所用，术语“聚集”是指在液体溶液中导致形成寡聚体种类的单体分子之间的分子间相互作用/缔合的过程。可在浓缩溶液中使用加速的稳定性研究在胁迫条件下评估聚集。加速的稳定性研究被设计用于通过使用极端贮存条件来增加化合物的分解、聚集或化学修饰的速率。通常在40℃和室温下进行加速的稳定性研究(也称为胁迫研究)。此类稳定性研究提供了关于暴露于超出正常标签贮存条件的环境条件(也称为胁迫条件)的影响的有价值的信息。高蛋白质浓度的溶液被广泛用于制药工业。蛋白质在高浓度下的溶液行为可因这些溶液中的热力学非理想状态而与基于稀释溶液分析预测的溶液行为显著不同。在此类***中观察到的非理想状态与蛋白质间相互作用(PPI)相关。不同类型的力在测定此类PPI的总体性质和程度中起着至关重要的作用，并且其相对贡献受溶质和溶剂性质影响。PPI的作用由这些分子间力驱动，以控制溶液特征，包括物理稳定性以及蛋白质自缔合和聚集。浓缩的溶液是其中PPI通过增加寡聚化速率来影响溶液中的蛋白质的那些溶液。浓缩的溶液可具有例如至少10mg/ml的蛋白质浓度。
该过程的可溶性产物可通过分析法例如SE－HPLC来检测。如本文中所用，术语“减少聚集的修饰”是指，与本文中描述的亲代抗体相比较，减小抗体在液体溶液中聚集的倾向的修饰，例如氨基酸置换。“亲代”抗体是包含与具有减小聚集的修饰的相应抗体大体上相同的序列的抗体。例如，亲代抗体可具有与修饰的抗体相同的CDR，可以除可变轻链序列中的AHo位置47和/或50上的残基外，具有与修饰的抗体完全相同的序列，且还可在可变重链序列中的AHo位置12、103和144上相异。也可存在其它差异，只要亲代抗体不包含存在于根据本发明方法而修饰的抗体中的减少聚集的修饰。
如本文中所用，术语“界面”是指，抗体的两个可变结构域(重链和轻链可变结构域)之间的相互作用。界面包括直接或间接参与可变结构域之间的相互作用的氨基酸残基。这样的相互作用包括但不限于，两个结构域之间的所有类型的非键合相互作用，例如范德瓦尔斯力、氢键键合、静电项(electrostatic term)和疏水相互作用。
除非另外明确地定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属的领域内的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但在下文中描述适当的方法和材料。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是举例说明性的，而并非是限定性的。
在下列分部分中更详细地描述本发明的各个方面。应理解，可随意组合各个实施方案、参数选择和范围。此外，取决于具体的实施方案，可以不应用选择的定义、实施方案或范围。
在一个方面，本发明提供了结合TNFα，从而适合于在体内阻断TNFα的功能的抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体是经优化的，其相对于亲代抗体具有减少聚集的修饰，从而本发明的抗体相较于亲代/未修饰的抗体具有减少的聚集倾向。此类修饰包括，参与可变轻链(VL)与可变重链(VH)界面的特定残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，减少聚集的修饰包括至少一个氨基酸置换，所述氨基酸置换在计算机(insilico)建模方法中减少VL－VH界面的自由能(相较于亲代抗体的VL－VH界面的自由能)，如本文中所描述的。此类修饰包括贡献VL－VH界面的自由能的特定残基的氨基酸置换)。
在某些实施方案中，本发明的减少聚集的修饰包括VL链中的AHo位置50上的置换。在一个实施方案中，置换为AHo位置50上的精氨酸(R)。在另一个实施方案中，AHo位置50上的精氨酸(R)替代赖氨酸(K)。
在其它实施方案中，本发明的减少聚集的修饰包括VL链中的AHo位置47上的置换。在一个实施方案中，置换为AHo位置47上的精氨酸(R)。在另一个实施方案中，AHo位置47上的精氨酸(R)替代赖氨酸(K)。
在Honegger，A.和A.(2001)J MoI.Biol.309：657－670)中详细地描述了AHo编号***。可变轻链中的AHo位置50相应于Kabat位置42。可变轻链中的AHo位置47相应于Kabat位置39。在Kabat等人(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91－3242)中详细地描述了Kabat编号***。AHo***与Kabat等人定义的最常用的***之间的换算表提供于A.Honegger，J.Mol.Biol.309(2001)657－670中。
为两个不同的用于确定抗体重链和轻链可变区中的氨基酸残基位置的编号***提供了下列换算表。在Kabat等人(Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91－3242)中进一步描述了Kabat编号***。在Honegger，A.和Pluckthun，A.(2001)J.Mol.Biol.309：657－670中进一步描述了AHo编号***。
重链可变区编号
表1：重链可变结构域中的残基位置的换算表
轻链可变区编号
表2：轻链可变结构域中的残基位置的换算表
本发明的抗体可根据需要包含另外的修饰。例如，本发明的抗体可包含根据例如美国专利申请No.12/973,968中描述的方法减小其体内免疫原性的氨基酸置换，和/或如WO09/155725中所描述的增强抗体的溶解性的置换。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体在重链位置12(AHo编号)上包含丝氨酸(S)；在重链位置103(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)和/或在重链位置144(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。此外，抗体可在重链位置97、98和/或99(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。优选，抗体在重链位置12(AHo编号)上包含丝氨酸(S)，在重链位置103(AHo编号)上包含苏氨酸(T)以及在重链位置144(AHo编号)上包含苏氨酸(T)。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含可变轻链：
SEQ ID NO：1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQKPGRAPKLLIY(X)n＝1- 50GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1-50FGQGTKLTVLG
在优选实施方案中，本发明的抗体包含可变轻链(CDR以下划线标示)：
SEQ ID NO；2：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSvYGNIWMAWYQQKPGRAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLG
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含可变重链：
SEQ ID NO.3：可变重链构架
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n＝1-50WVRQAPGKGLEWVG(X)n＝1- 50RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n＝1-50WGQGTLVTVSS
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含可变重链构架
SEQ ID NO：4：可变重链构架
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n＝1-50WVRQAPGKGLEWVG(X)n＝1- 50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n＝1-50WGQGTLVTVSS
在优选实施方案中，本发明的抗体包含可变重链(CDR以下划线标示)：
SEQ ID NO：5：
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS
如本文中所用，X残基为CDR***位点。X可以是任意天然存在的氨基酸；可存在至少3个和多至50个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的抗体的可变轻链构架包含SEQ ID NO：1并且可变重链构架包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
在另一个实施方案中，本发明的抗体的可变轻链构架包含与SEQ ID NO：1具有至少65％的同一性，更优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，更优选99％的同一性的序列。最优选，所述序列在AHo位置50上具有精氨酸(R)。在另一个实施方案中，所述序列在AHo位置47上具有精氨酸(R)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体的可变重链构架包含与SEQ ID No.3具有至少80％的同一性，更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的同一性，更优选99％的同一性的序列。优选，所述抗体在重链位置12(AHo编号)上包含丝氨酸(S)，在重链位置103(AHo编号)上包含苏氨酸(T)以及在重链位置144(AHo编号)上包含苏氨酸(T)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体的可变轻链构架包含与SEQ ID NO：2或SEQID NO：14具有至少97％、98％，更优选99％的同一性的序列。
在另一个实施方案中，本发明的抗体的可变重链构架包含与SEQ ID NO：5具有至少95％、96％、97％、98％，更优选99％的同一性的序列。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：17具有至少96％、97％、98％，更成选99％的同一性的序列。
在另一个实施方案中，本发明的抗体的可变轻链构架包含SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：14，并且可变重链构架包含SEQ ID NO：5。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体片段是单链抗体(scFv)或Fab片段。在scFv抗体的情况下，可通过柔性接头将VL结构域以任一方向连接于VH结构域。适当的现有技术接头由重复的GGGGS(SEQ ID NO：6)氨基酸序列或其变体组成。在本发明的优选实施方案中，使用(GGGGS)4(SEQ ID NO：7)接头或其衍生物，但也可使用1-3个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。可用于本发明的其它接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.MoI.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer ImmunoI.Immunother.50：51-59进行了描述。排列可以是VL-接头-VH或VH-接头-VL，前一个方向是优选的方向。在Fab片段的情况下，将选择的轻链可变结构域VL融合至人lg K链的恒定区，而将适当的重链可变结构域VH融合至人IgG的第一(N末端)恒定结构域CH1。在C末端，在两个恒定结构域之间形成链间二硫桥。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含序列：
SEQ ID NO：8
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQKPGRAPKLLIY(X)n＝1- 50GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1- 50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n＝1- 50WVRQAPGKGLEWVG(X)n＝1-50RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n＝1-50WGQGTLVTVSS
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含序列：
SEQ ID N0：9
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n＝1- 50GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1- 50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n＝1- 50WVRQAPGKGLEWVG(X)n＝1-50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n＝1-50WGQGTLVTVSS
在优选实施方案中，本发明的抗体包含序列：
SEQ ID NO：10
(34rFW1.4_VL_K50R_DHP)：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGRAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS
在一个实施方案中，本发明的抗体包含可变轻链：
SEQ ID NO.11：FW1.4(Kl27)的可变轻链构架
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)n＝1-50GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1-50FGQGTKLTVLG
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含可变轻链：
SEQ ID NO.12：FW1.4的置换的可变轻链构架
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)n＝1-50GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1-50FGQGTKLTVLG
在另一个优选实施方案中，本发明的抗体包含序列：
SEQ ID NO：13
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n＝1- 50GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1-50FGQGTKLTVLG
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含可变轻链(CDR以下划线标示)：
SEQ ID NO：14：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQRPGKAPKLLTYQASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVL
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含序列：
SEQ ID NO：15：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n＝1- 50GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1- 50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n＝1- 50WVRQAPGKGLEWVG(X)n＝1-50RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n＝1-50WGQGTLVTVSS
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含序列：
SEQ ID NO：16：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n＝1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n＝1- 50GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n＝1- 50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n＝1- 50WVRQAPGKGLEWVG(X)n＝1-50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n＝1-50WGQGTLVTVSS
在一个实施方案中，本发明的抗体包含序列：
SEQ ID NO：17
(34rFW1.4_VL_K47R_DHP)：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQRPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含序列：SEQ ID NO：18(34rFW1.4)
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS
在一个实施方案中，亲代抗体的VL为或包含，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具有至少65％的同一性，更优选80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，更优选99％的同一性的序列。在另一个优选实施方案中，亲代抗体的VH为或包含，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少80％的同一性，更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％，更优选99％的同一性的序列。
包含减少聚集的修饰的本发明的抗体优选包含来自兔抗体的一个或多个CDR。如本领域已知的，兔CDR与人或啮齿类动物CDR不同：它们可包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基可变成连接至构架的二硫桥或形成CDR间S－S桥。此外，兔CDR通常不属于任何先前已知的典范结构(canonical structure)。
本发明还表征了包含本发明的抗－TNFα抗体或其片段的双价和双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可被衍生至或连接至另一种功能性分子，例如另一种肽或蛋白(例如，另一种抗体或受体的配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。可将本发明的抗体衍生至或连接至超过一种的其它功能性分子，以产生结合超过两个的不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也意欲包括在本文使用的术语“双特异性分子”内。双特异性分子的非限定性实例包括双特异抗体(diabody)、单链双特异抗体和串联抗体，这对于本领域技术人员来说是已知的。
为了产生本发明的双特异性分子，可将本发明的抗体功能性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方式)于一个或多个其它结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肿瘤特异性或病原体特异性抗原、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。因此，本发明包括包含至少一个具有对于TNFα的特异性的第一结合分子和具有对于一个或多个另外的靶表位的特异性的第二结合分子的双特异性分子。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab＇、F(ab＇)2、Fv或单链Fv)的结合特异性。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利No.4,946,778(其内容通过引用明确地并入本文)中描述的。
虽然人单克隆抗体是优选的，但可用于本发明的双特异性分子的其它抗体可以为鼠、嵌合以及人源化单克隆抗体。
本发明的双特异性分子可通过使用本领域已知的方法缀合构成性结合特异性来制备。例如，可分别产生双特异性分子的每一种结合特异性，随后将其彼此缀合。当结合特异性为蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂来进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N－琥珀酰亚胺－S－乙酰基－硫代乙酸(SATA)、5，5＇－二硫代双(2－硝基苯甲酸)(DTNB)、邻－苯二马来酰亚胺(oPDM)、N－琥珀酰亚胺－3－(2－吡啶基二硫代)丙酸(SPDP)和4－(N－马来酰亚胺基甲基)环己烷－1－羧酸硫代琥珀酰亚胺酯(sulfo－SMCC)(参见例如，Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8648)。其它方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78，118－132；Brennan等人(1985)Science229：81－83和Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367－2375)中描述的方法。优选的缀合剂为SATA和sulfo－SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性为抗体时，可通过巯基键合，例如通过两个重链的C末端铰链区或其它位点(无论是天然存在的还是人工引入的)将它们缀合。在特别优选的实施方案中，铰链区在缀合之前经修饰以包含奇数个(优选1个)巯基残基。
或者，可在相同载体中编码两种结合特异性，并在相同宿主细胞中进行表达和装配。当双特异性分子为mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab＇)2或配体xFab融合蛋白时，该方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。此外，双特异性分子可以是特异性结合第一靶的scFv，其中利用柔性接头连接所述scFv的VH和VL，所述接头包含提供对第二靶的特异性结合的结构域。在例如国际专利申请WO2010/006454中描述了适当的接头。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203、美国专利号5,455,030、美国专利号4,881,175、美国专利号5,132,405、美国专利号5,091,513、美国专利号5,476,786、美国专利号5,013,653、美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858中。
双特异性分子对其特异性靶的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或通过免疫印迹测定来验证。此类测定的每一种通常通过使用特异于目标复合物的标记试剂(例如，抗体)来检测特定目标蛋白质－抗体复合物的存在。例如，TNF－抗体复合物可使用例如识别并且特异性结合抗体－TNF复合物的酶联抗体或抗体片段来进行检测。或者，复合物可使用多种其它免疫测定的任一种来检测。例如，可放射性标记抗体，并将其用于放射免疫测定(RIA)(参见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，其通过引用并入本文)。放射性同位素可通过这类方法例如使用γ计数器或闪烁计数器或使用放射自显影术来检测。
在另一个方面，本发明提供了用于产生本文中描述的抗体的方法。本文中提供的用于产生在溶液中具有减少的聚集倾向的抗体的方法基于令人惊讶的观察结果：通过调节轻链与重链之间的抗体结构域相互作用，可减少抗体的聚集倾向，以及可通过测定VL/VH界面的自由能(其定义为抗体(例如scFv)与单独的可变结构域的能量之间的差异)来容易地预测减少聚集的突变。如本文中所显示的，可产生通过降低可变结构域之间的自由能来调节抗体结构域相互作用的减少聚集的置换，而不影响抗体的稳定性或结合活性。
在一个实施方案中，本发明的方法包括步骤：
(i)提供包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体；
(ii)鉴定一个或多个参与抗体的可变轻链(VL)与可变重链(VH)之间的界面的残基位置；和
(iii)通过在鉴定的残基位置上引入置换来修饰抗体，以便所述置换使VL与VH结构域之间的自由能减少至少0.5kcal/mol，优选至少1.0kcal/mol，最优选至少2.0kcal/mol(即，具有置换的VL与VH结构域之间的自由能比不包含所述氨基酸置换的相应的VL与VH结构域之间的自由能低至少0.5kcal/mol)，从而与亲代抗体的聚集倾向相比较，减少修饰的抗体的聚集倾向。
如上所概述的，抗体可以是例如Fab、Fab＇、F(ab)＇2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双特异抗体、单链双特异抗体、串联抗体、或线性抗体；在优选实施方案中，抗体是单链Fv(scFv)。
在优选实施方案中，一个或多个参与抗体的可变轻链与可变重链之间的界面的残基位置的鉴定(即步骤(ii))包括，测定VL－VH界面之间的自由能。这可通过使用公知的生物信息学程序来完成。适当的生物信息学程序的一个实例为CHARMM(Chemistry atHARvard Macromolecular Mechanics)。
为了测定VL－VH界面之间的自由能，一般而言，提供蛋白质的完全原子学分子呈现(molecular presentation)。界面的自由能在隐式溶剂法(implicitsolventmethod)的背景中是指，包含两个可变结构域VL和VH的完整抗体与单独的结构域的能量之和之间的能量差异。这包括(1)针对抗体G(a)；(2)针对VLG(b)；和(3)针对VHG(c)的3个单独的能量计算。因此，界面的自由能为
G界面＝G(a)－G(b)－G(c)
在一个实施方案中，隐式溶剂法为本领域已知的GBMV或PBSA。
自由能测定还可包括，模拟蛋白质的电荷分布的步骤。所述电荷分布可基于静电力或范德瓦尔斯力来模拟。
为了确定适当的修饰，可选择一个或多个参与界面的氨基酸残基来进行置换。例如，产生在选择的位置上包含一个或多个置换(例如，将一个或多个残基改变成丙氨酸)的蛋白质的分子模型，并且测定经置换的分子呈现的界面自由能。如果置换的分子模型的界面自由能低于初始分子模型的界面自由能，则该氨基酸残基被选择用于置换。在CHARMm的背景中，可以例如利用BuildMutants方案构建突变。分子模型中的一个或多个置换可位于已知参与或怀疑参与VL/VH界面的位置上。
在一个实施方案中，进行使在所选择的位置上包含一个或多个置换的分子模型在围绕突变的区域内的能量最小化的另外步骤。所述区域可设为10埃。
在一个实施方案中，被鉴定用于置换的残基位置被带电荷的氨基酸占据。
由本发明的方法产生的抗体可包含本领域已知的任何适当的可变轻链或重链，优选包含至少一个来自兔抗体的CDR。本文中描述了某些优选的可变轻链和重链。例如，本发明的抗体可包含：VL抗体构架，其与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具有至少65％的同一性，更优选80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，更优选99％的同一性，且还在可变轻链的AHo位置47和/或AHo位置50上包含精氨酸(R)；和VH抗体构架，其与SEQ ID NO：3具有至少80％的同一性，更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％，更优选99％的同一性。
优选按照PCT/CH2008/000285(其通过引用整体并入本文)的教导进行一个或多个残基位置的修饰。简而言之，对于给定的抗体亚型，某些氨基酸存在于抗体构架的特定残基位置上。例如，
a)对于人VH3家族重链可变区，优选的氨基酸为：
(i)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置1上的谷氨酰胺(Q)；
(ii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置6上的谷氨酰胺(Q)；
(iii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置7上的苏氨酸(T)或丙氨酸(A)；
(iv)使用AHo编号***的氨基酸位置89(使用Kabat编号***的氨基酸位置78)上的丙氨酸(A)、缬氨酸(V)或苯丙氨酸(F)；和/或
(v)使用AHo编号***的氨基酸位置103(使用Kabat编号的氨基酸位置89)上的精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)；
b)对于人VH1a家族重链可变区，优选的氨基酸为：
(i)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置1上的谷氨酸(E)；
(ii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置6上的谷氨酸(E)；
(iii)使用AHo编号***的氨基酸位置12(使用Kabat编号***的氨基酸位置11)上的亮氨酸(L)；
(iv)使用AHo编号***的氨基酸位置13(使用Kabat编号***的氨基酸位置12)上的甲硫氨酸(M)：
(v)使用AHo编号***的氨基酸位置14(使用Kabat编号***的氨基酸位置13)上的谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；
(vi)使用AHo编号***的氨基酸位置19(使用Kabat编号***的氨基酸位置18)上的亮氨酸(L)；
(vii)使用AHo编号***的氨基酸位置21(使用Kabat编号***的氨基酸位置20)上的异亮氨酸(I)；
(viii)使用AHo编号***的氨基酸位置90(使用Kabat编号***的氨基酸位置79)上的苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)或天冬氨酸(D)；
(ix)使用AHo编号***的氨基酸位置92(使用Kabat编号***的氨基酸位置81)上的天冬氨酸(D)或谷氨酰胺(Q)；
(x)使用AHo编号***的氨基酸位置95(使用Kabat编号***的氨基酸位置82b)上的甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)或苏氨酸(T)；和/或
(xi)使用AHo编号***的氨基酸位置98(使用Kabat编号***的氨基酸位置84)上的苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)或苯丙氨酸(F)；
c)对于人VH1b家族重链可变区，优选的氨基酸为：
(i)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置1上的谷氨酸(E)；
(ii)使用AHo编号***的氨基酸位置10(使用Kabat编号***的氨基酸位置9)上的苏氨酸(T)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)或天冬氨酸(D)；
(iii)使用AHo编号***的氨基酸位置12(使用Kabat编号***的氨基酸位置11)上的亮氨酸(L)；
(iv)使用AHo编号***的氨基酸位置13(使用Kabat编号***的氨基酸位置12)上的缬氨酸(V)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸(M)：
(v)使用AHo编号***的氨基酸位置14(使用Kabat编号***的氨基酸位置13)上的谷氨酸(E)、精氨酸(R)或甲硫氨酸(M)；
(vi)使用AHo编号***的氨基酸位置20(使用Kabat编号***的氨基酸位置19)上的精氨酸(R)、苏氨酸(T)或天冬酰胺(N)；
(vii)使用AHo编号***的氨基酸位置21(使用Kabat编号***的氨基酸位置20)上的异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)；
(viii)使用AHo编号***的氨基酸位置45(使用Kabat编号***的氨基酸位置38)上的赖氨酸(K)；
(ix)使用AHo编号***的氨基酸位置47(使用Kabat编号***的氨基酸位置40)上的苏氨酸(T)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)；
(x)使用AHo编号***的氨基酸位置50(使用Kabat编号***的氨基酸位置43)上的赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酸(E)；
(xi)使用AHo编号***的氨基酸位置55(使用Kabat编号***的氨基酸位置48)上的异亮氨酸(I)；
(xii)使用AHo编号***的氨基酸位置77(使用Kabat编号***的氨基酸位置66)上的赖氨酸(K)；
(xiii)使用AHo编号***的氨基酸位置78(使用Kabat编号***的氨基酸位置67)上的丙氨酸(A)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
(xiv)使用AHo编号***的氨基酸位置82(使用Kabat编号***的氨基酸位置71)上的谷氨酸(E)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)；
(xv)使用AHo编号***的氨基酸位置86(使用Kabat编号***的氨基酸位置75)上的苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或亮氨酸(L)；
(xvi)使用AHo编号***的氨基酸位置87(使用Kabat编号***的氨基酸位置76)上的天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)或甘氨酸(G)；和/或
(xvii)使用AHo编号***的氨基酸位置107(使用Kabat编号***的氨基酸位置93)上的天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)；
d)对于人Vκ1家族轻链可变区，优选的氨基酸为：
(i)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置1上的谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)；
(ii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置3上的缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)；
(iii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置4上的缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
(iv)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置24上的谷氨酰胺(Q)；
(v)使用AHo编号***的氨基酸位置47(使用Kabat编号***的氨基酸位置39)上的精氨酸(R)或异亮氨酸(I)；
(vi)使用AHo编号***的氨基酸位置50(使用Kabat编号***的氨基酸位置42)上的精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、甲硫氨酸(M)或谷氨酰胺(Q)；
(vii)使用AHo编号***的氨基酸位置57(使用Kabat编号***的氨基酸位置49)上的组氨酸(H)、丝氨酸(S)或苯丙氨酸(F)；
(viii)使用AHo编号***的氨基酸位置91(使用Kabat编号***的氨基酸位置73)上的苯丙氨酸(F)；和/或
(ix)使用AHo编号***的氨基酸位置103(使用Kabat编号***的氨基酸位置85)上的缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)或异亮氨酸(I)；
e)对于人Vκ3家族轻链可变区，优选的氨基酸为：
(i)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置2上的苏氨酸(T)；
(ii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置3上的苏氨酸(T)；
(iii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置10上的异亮氨酸(I)；
(iv)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置12上的酪氨酸(Y)；
(v)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置18上的丝氨酸(S)；
(vi)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置20上的丙氨酸(A)；
(vii)使用AHo编号***的氨基酸位置56(使用Kabat编号***的氨基酸位置48)上的甲硫氨酸(M)；
(viii)使用AHo编号***的氨基酸位置74(使用Kabat编号***的氨基酸位置58)上的缬氨酸(V)或苏氨酸(T)；
(ix)使用AHo编号***的氨基酸位置94(使用Kabat编号***的氨基酸位置76)上的天冬酰胺(N)；
(x)使用AHo编号***的氨基酸位置101(使用Kabat编号***的氨基酸位置83)上的酪氨酸(Y)或丝氨酸(S)；和/或
(xi)使用AHo编号***的氨基酸位置103(使用Kabat编号***的氨基酸位置85)上的亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；
f)对于人Vλ1家族轻链可变区，优选的氨基酸为：
(i)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置1上的亮氨酸(L)、丝氨酸(S)或谷氨酸(E)；
(ii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置2上的丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)；
(iii)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置4上的缬氨酸(V)或甲硫氨酸(M)；
(iv)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置7上的谷氨酸(E)；
(v)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置11上的丙氨酸(A)；
(vi)使用AHo或Kabat编号***的氨基酸位置14上的苏氨酸(T)或丝氨酸(S)；
(vii)使用AHo编号***的氨基酸位置46(使用Kabat编号***的氨基酸位置38)上的组氨酸(H)；
(viii)使用AHo编号***的氨基酸位置53(使用Kabat编号***的氨基酸位置45)上的苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)或脯氨酸(P)；
(ix)使用AHo编号***的氨基酸位置82(使用Kabat编号***的氨基酸位置66)上的精氨酸(R)或谷氨酰胺(Q)；
(x)使用AHo编号***的氨基酸位置92(使用Kabat编号***的氨基酸位置74)上的甘氨酸(G)、苏氨酸(T)或天冬氨酸(D)；和/或
(xi)使用AHo编号***的氨基酸位置103(使用Kabat编号***的氨基酸位置85)上的缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、组氨酸(H)或谷氨酸(E)。
因此，本方法中产生的置换优选遵照PCT/CH2008/000285的教导。亚型测定对于本领域技术人员来说是已知的。
在一个实施方案中，本发明的方法包括，在可变轻链，特别地Vκ1可变轻链的AHo位置47和/或50上修饰抗体。优选，抗体经修饰以在可变轻链的AHo位置47和/或AHo位置50上包含精氨酸(R)。在一些实施方案，在可变轻链的AHo位置47和/或AHo位置50上赖氨酸(K)被精氨酸(R)置换。由于本发明的抗体可按需要包含另外的修饰，因此，本发明的方法可包括修饰抗体(例如以在重链位置12(AHo编号)上包含丝氨酸(S)；在重链位置103(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)和/或在重链位置144(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T))的另外步骤。此外，抗体可经修饰以在重链位置97，98和/或99(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。优选，所述方法包括修饰抗体以在重链位置12(AHo编号)上包含丝氨酸(S)，在重链位置103(AHo编号)上包含苏氨酸(T)和在重链位置144(AHo编号)上包含苏氨酸(T)的步骤。
本发明还提供了产生在溶液中具有低的聚集倾向的人源化抗体的方法，所述方法包括，选择在AHo位置47和/或AHo位置50上包含精氨酸(R)的可变轻链构架。所述方法还可包括，选择可变重链构架，所述构架在重链位置12(AHo编号)上包含丝氨酸(S)；在重链位置103(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)和/或在重链位置144(AHo编号)上包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。在一个实施方案中，基于选择的选择标准而鉴定的构架可被进一步修饰以具有本发明的减少聚集的修饰。例如，如果可变轻链构架经鉴定在位置50上具有精氨酸(R)，那么可用不同的氨基酸例如精氨酸(R)置换AHo位置上的残基，或者如果可变重链经鉴定在AHo位置12上具丝氨酸(S)，那么可用苏氨酸置换AHo位置103和144上的残基。
如本文中所用，“人源化”抗体是包含非人CDR以及人或人衍生的可变重链和/或人或人衍生的可变轻链的构架序列的抗体。抗体的人源化是本领域公知的。在一个实施方案中，人源化抗体包含至少1个，优选6个，来自在兔中产生的抗体的CDR或选自CDR文库的CDR。
可以例如基于与CDR所源自的抗体的可变构架序列的同一性和/或相似性，或基于另外优选的构架序列，从数据库(例如Kabat数据库、Genbank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、VBASE(http：//vbase.mrc－cpe.cam.ac.uk/)、VBASE2(http：//www.vbase2.org/)、The Kabat Database of Sequences of Proteins ofImmunological Interest(http：//www.kabatdatabase.com/index.html)、UniversalProtein Resource(UniProt；http：//pir.georgetown.edu/)和Abysis数据库(http：//www.bioinf.org.uk/abs/))中选择可变抗体构架。
各种计算机程序可用于寻找满足所选择的要求的适当的人构架序列。例如，“KabatMan”是来自Sequences of Immunological Interest书籍的Kabat抗体序列数据的可计算机搜寻的版本。KabatMan程序描述于论文：Martin(1996)Accessing the KabatAntibody Sequence Database by Computer PROTEINS：Structure，Function andGenetics，25，130－133中，并且可获自http：//www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html和http：//www.bioinf.org.uk/abs/kabatman.html。Abysis数据库(http：//www.bioinf.org.uk/abysis/)将来自Kabat、IMGT和PDB的序列数据与来自PDB的结构数据整合。其提供了允许按各种标准搜索序列数据并且以不同形式显示结果的综合性即点即选界面。对于来自PDB的数据，可将序列搜索与结构限定(constraint)相组合。
在另一个方面，本发明提供了由本文中公开的方法产生的抗体。在优选实施方案中，所述抗体包括，与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少80％的同一性，更优选85％，90％，95％，96％，97％，98％，更优选99％的同一性的VL抗体构架；优选，抗体在可变轻链的AHo位置47和/或AHo位置50上包含精氨酸(R)。
此外或备选地，VH抗体构架为或包含，SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3具有至少80％的同一性，更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％，更优选99％的同一性的序列。
在某些实施方案中，本发明还提供了：
(1)用于减少其为包含重链和轻链可变结构域的异源二聚体复合物的抗体的聚集倾向的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供抗体的完全原子学分子呈现；
(b)测定两个结构域之间的界面的自由能；
(c)通过下列来选择一个或多个参与界面的氨基酸残基用于进行置换：提供在所选择的位置上包含一个或多个置换的抗体的分子模型，和测定置换的分子呈现的界面的自由能；
(d)如果置换的分子模型的界面自由能低于初始分子模型的界面自由能，则选择该氨基酸残基用于进行置换；
(2)(1)的方法，其中在隐式溶剂法的背景中，通过计算复合物与单独的结构域的能量之和之间的能量差异来测定界面的自由能；
(3)(2)的方法，其中所述溶剂为GBMV或PBSA；
(4)前述(1)－(3)的任一项的方法，其还包括步骤：
(i)模拟蛋白质的电荷分布，其中在步骤a和b内进行所述步骤；
(5)(4)的方法，其中基于静电力或范德瓦尔斯力模拟电荷分布；
(6)前述(1)－(5)的任一项的方法，其中步骤(c)包括在围绕突变的区域中进行能量最小化的额外步骤；
(7)前述(1)－(7)的任一项的方法，其中所述抗体为单链可变片段(scFv)。
可使用重组遗传学领域中的常规技术产生本发明的抗体。在已知多肽的序列的情况下，可利用本领域公知的方法通过基因合成来产生编码其的cDNA。可将此类cDNA克隆进入适当的载体质粒。
可使用本领域技术人员公知的标准克隆和诱变技术来附加接头、改组(shuffle)结构域或构建融合物以产生Fab片段。公开本发明的一般方法的基础方案描述于MolecularCloning，A Laboratory Manual(Sambrook & Russell，第3版.2001)和Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel等人，1999)中。
将DNA序列(具有编码scFv多肽的基因，或在Fab片段的情况下，编码两个分开的基因或包含VL－Cκ和VH－CH1融合物的两个基因的双顺反操纵子)克隆入适当的表达载体，优选具有诱导型启动子的表达载体。必须注意，在每一个基因前提供适当的核糖体结合位点以确保翻译。应理解，本发明的抗体包含公开的序列，而非由其组成。例如，克隆策略可能需要制备这样的构建体，其可提供在N末端上具有一个或一些额外残基的抗体。特别地，从起始密码子产生的甲硫氨酸可存在于终蛋白质中(在其未被翻译后切除的情况下)。scFv抗体的大多数构建体在N末端上产生另外的丙氨酸。在本发明的优选实施方案中中，选择用于在大肠杆菌(E.coli)中进行周质表达的表达载体(Krebber，1997)。所述载体在可切割的信号序列之前包含启动子。随后将抗体肽的编码序列符合读框地融合至可切割的信号序列。这允许表达的多肽靶向细菌周质，在所述周质中信号序列被切除。随后抗体进行折叠。在Fab片段的情况下，必须将VL－Cκ和VH－CH1融合肽连接至输出信号。在肽到达周质后，在C末端半胱氨酸上形成共价S－S键。如果抗体的细胞质表达是优选的，则通常可以以高产率从包涵体获得所述抗体，所述包涵体可容易地与其它细胞片段和蛋白质分离。在该情况下，将包涵体溶解在变性剂例如盐酸胍(GndHCl)中，随后通过本领域技术人员公知的复性方法进行重折叠。
将表达scFv或Fab多肽的质粒引入适当的宿主，优选细菌、酵母或哺乳动物细胞，最优选适当的大肠杆菌菌株例如JM83(用于周质表达)或BL21(用于在包涵体中表达)。可从周质或从包涵体收获多肽，并且可使用本领域技术人员已知的标准技术例如离子交换层析、反相层析、亲和层析和/或凝胶过滤来纯化所述多肽。
可在产率、溶解度和体外稳定性方面表征本发明的抗体。例如，可通过ELISA或表面等离子共振技术(BIACore)，使用WO9729131中描述的重组人TNF来体外测试对TNF，优选对人TNFα的结合能力，后一种方法还允许测定koff速率常数，其优选应当小于10－3s－1。≤10nM的Kd值是优选的。
在一个实施方案中，本发明提供了结合TNFα，从而适合在体内阻断TNFα的功能的抗体。在具体的实施方案中，抗－TNFα抗体包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：17的序列。
对于治疗性应用，将本发明的抗－TNF抗体以药学上可接受的剂型(例如上文中论述的剂型)给哺乳动物(优选人)施用，所述剂型包括例如，可以通过静脉内途径(以团注的形式或在一段时间内通过连续输注)，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、硬膜内、口服、局部、眼内、鼻内、经耳、舌下、经皮或吸入途径给人施用的剂型。抗体还可通过肿瘤内、肿瘤旁、病灶内或病灶周围途径进行适当地施用，以产生局部以及全身性治疗效果。
为了预防或治疗疾病，适当的抗体剂量将取决于待治疗的疾病的类型(如上文中定义的)、疾病的严重度和过程、抗体的施用是预防性还是治疗性目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的反应，以及主治医生的判定。将抗体一次性地或在一系列治疗过程中适当地给患者施用。
本发明的抗－TNF抗体在治疗TNF介导的疾病中是有用的。取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至约50mg/kg(例如，0.1－20mg/kg)的抗体是给患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次单独的施用还是通过连续输注。常用的日或周剂量的范围可以为约1μg/kg至约20mg/kg或更多，这取决于上述因素。对于在数天或更长的时间内的重复施用，取决于病况，重复治疗直至发生期望的疾病症状的抑制。然而，其它给药方案可以是有用的。该疗法的进展可通过常规技术和测定(包括例如，放射肿瘤成像技术)来容易地监测。
根据本发明的另一个实施方案，抗体在预防或治疗疾病中的功效可通过连续施用抗体或将抗体与另一种对于此类目的是有效的试剂组合施用来进行改善，所述试剂例如血管内皮生长因子(VEGF)、能够抑制或中和酸性或碱性成纤维细胞生长因子(FGF)或肝细胞生长因子(HGF)的血管生成活性的抗体、能够抑制或中和组织因子、蛋白C、蛋白S的促凝剂活性的抗体(参见Esmon等人，1991年2月21日公布的PCT专利公开案No.WO91/01753)、能够结合HER2受体的抗体(参见Hudziak等人，1989年7月27日公布的PCT专利公开案No.WO 89/06692)或一种或多种常规治疗剂例如烷化剂、叶酸拮抗剂、核酸代谢的抗代谢物、抗生素、嘧啶类似物、5－氟尿嘧啶、顺铂、嘌呤核苷、胺、氨基酸、***核苷或皮质类固醇。此类其它试剂可存在于待施用的组合物中或可单独施用。同样地，可适当地连续施用抗体，或将其与放射疗法(无论是包括照射还是施用放射性物质)组合施用。
本发明的抗体可用作亲和纯化试剂。在该方法中，使用本领域公知的方法，将抗体固定在固相例如Sephadex树脂或滤纸上。将固定的抗体与包含该抗体所结合的待纯化的靶蛋白(或其片段)(例如在抗－TNFα抗体的情况下，TNF)的样品接触，随后利用除去样品中基本上所有材料(除了结合至固定的抗体的靶蛋白外)的适当溶剂洗涤支持物。最后，利用另一种将从抗体释放靶蛋白的适当溶剂例如甘氨酸缓冲液，pH5.0洗涤支持物。
抗体还可用于靶蛋白的诊断测定，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。此类诊断方法可用于癌症诊断。
对于诊断应用，通常用可检测的部分标记抗体。许多标记物是可获得的，其通常可分入下列类别：
(a)放射性同位素，例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S。可使用例如CurrentProtocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等人，Ed.Wiley－Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)中描述的技术，用放射性同位素标记抗体，并且可使用闪烁计数法来测量放射性。
(b)荧光标记物例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红是可获得的。可使用例如Current Protocolsin Immunology(同上)中公开的技术将荧光标记物缀合于抗体。可使用荧光计定量荧光。
(c)各种酶－底物标记物是可获得的，且美国专利No.4,275,149提供了一些此类标记物的综述。酶通常催化生色底物的化学改变，这可使用各种技术来测量。例如，酶可催化底物的颜色变化，这可利用分光光度计来测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。上文中描述了用于定量荧光变化的技术。化学发光底物可被化学反应电子激发，随后可发射可被测量(例如使用化学发光计(chemi luminometer))的光或将能量提供给荧光受体。酶促标记物的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3－二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β－半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖－6－磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合至抗体的技术描述于O＇Sullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme－Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay，in Methods in Enzym.(ed J.Langone & H.Van Vunakis)，Academicpress，New York，73：147－166(1981)中。酶－底物组合的实例包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，原次苯基二胺(OPD)或3，3＇，5，5＇－四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的对硝基苯基磷酸；和
(iii)β－D－半乳糖苷酶(β－D－Gal)与生色底物(例如，对－硝基苯基－β－D－半乳糖苷酶)或荧光底物4－甲基伞形酮－β－D－半乳糖苷酶。
许多其它酶－底物组合对于本领域技术人员来说是可获得的。关于此类组合的一般综述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。有时，将标记物与抗体间接缀合。本领域技术人员知晓，用于实现该缀合的各种技术。例如，可将抗体与生物素缀合，且可将上述3个广泛类别的标记物的任一种与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，从而可以以该间接方式将标记物与抗体缀合。或者，为了实现标记物与抗体的间接缀合，将抗体与小的半抗原(例如，地高辛)缀合，且将上述不同类型的标记物之一与抗－半抗原抗体(例如，抗－地高辛抗体)缀合。由此，可实现标记物与抗体的间接缀合。
在某些实施方案中，不必标记抗体，并且其存在可使用结合靶抗体的经标记的抗体来检测。
本发明的抗体可用于任何已知的测定方法，例如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定中。Zola，Monoclonal Antibodies：AManual of Techniques，pp.147－158(CRC Press，Inc.1987)。
竞争性结合测定依赖于经标记的标准物与测试样品分析物竞争对有限量的抗体的结合的能力。例如，测试样品中的TNF蛋白的量与结合至抗体的标准物的量成反比。为了帮助测定结合的标准物的量，抗体在竞争之前或之后通常是不溶的，从而可方便地将结合至抗体的标准物和分析物与保持未结合的标准物和分析物分离。
夹心测定包括两种抗体的使用，每一种抗体能够结合待检测的蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，测试样品分析物被固定在固体支持物上的第一抗体结合，随后第二抗体结合分析物，从而形成不溶性的三部分复合物。参见，例如，美国专利No.4,376,110。第二抗体本身可用可检测的部分标记(直接夹心测定)或可使用标记有可检测部分的抗－免疫球蛋白抗体来测量(间接夹心测定)。例如，夹心测定的一个类型是ELISA测定，在该情况下可检测的部分是酶。
对于免疫组织化学，组织样品例如肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或可被包埋在石蜡中并且用防腐剂例如***进行固定。
抗体还可用于体内肿瘤诊断测定。通常，抗体可用放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)进行标记，以便可使用免疫闪烁扫描术(immunoscintiography)来定位肿瘤。
可在试剂盒(预定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书的经包装的组合)中提供本发明的抗体。当用酶标记抗体时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其它添加剂例如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可广泛地变化，以在试剂的溶液中提供显著地优化测定的灵敏性的浓度。特别地，可以以包含赋形剂的干粉形式(通常冻干的)提供试剂，其在溶解后将提供具有适当浓度的试剂溶液。
本发明还提供了包含用于治疗目的的本发明的一种或多种抗体的药物制剂。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗TNF介导的疾病的抗－TNF抗体。
术语＂药物制剂＂是指，以这样的形式存在的制剂，其使得抗体的生物学活性是明确有效的，并且不包含对给其施用所述制剂的受试者有毒的另外的组分。＂药学上可接受的＂赋形剂(媒介物、添加剂)是可被合理地施用给受试哺乳动物以提供有效剂量的所使用的活性成分的赋形剂。
＂稳定的＂制剂是其中本文中的抗体在贮存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可获得的并且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery，247－301，Vincent LeeEd.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug DeliveryRev.10：29－90(1993)中。可在选择的温度下测量稳定性，进行选择的时间段。优选，制剂在室温(约30℃)或40℃下稳定至少1个月和/或在约2－8℃下稳定至少1年或至少2年。此外，制剂优选在制剂的冷冻(至例如，－70℃)和解冻后是稳定的。
如果抗体在颜色和/或澄清度的目测检查后，或如通过紫外光散射或通过大小排阻层析测量的，未显示聚集、沉淀和/或变性的迹象，则其在药物制剂中＂保持其物理稳定性＂。
如果在给定的时间上的化学稳定性使得蛋白质被认为仍然保持如下定义的其生物学活性，则抗体在药物制剂中＂保持其化学稳定性＂。化学稳定性可通过检测和定量蛋白质的化学改变的形式来评估。化学改变可以包括例如，可使用大小排阻层析、SDS－PAGE和/或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI/TOFMS)评估的大小修饰(例如，剪切(clipping))。其它类型的化学改变包括例如，可通过离子交换层析估计的电荷改变(例如，由于脱酰胺而发生的电荷改变)。
如果在给定的时间上抗体的生物学活性在例如药物制剂被制备时所展示的生物学活性的约10％误差内(在测定的误差内)，如在抗原结合测定中所测定的，则抗体在药物制剂中＂保持其生物学活性＂。抗体的其它＂生物学活性＂测定在下文中进行详尽描述。
＂等渗的＂意指，目标制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗制剂通常具有约250至350mOsm的渗透压。可使用例如蒸气压或冰冻类型的渗透计测量等渗性。
＂多元醇＂为具有多个羟基的物质，包括糖(还原性和非还原性糖)、糖醇和糖酸。本文中的优选多元醇具有低于约600kD(例如在约120至约400kD的范围内)的分子量。＂还原性糖＂是具有可还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其它氨基共价反应的半缩醛基团的糖，而＂非还原性糖＂是不具有还原性糖的这类性质的糖。还原性糖的实例为果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、***糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原性糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇(erythritol)、苏糖醇、山梨醇和甘油是糖醇的实例。关于糖酸，其包括L－葡糖酸及其金属盐。当期望制剂是冻－融稳定的时，多元醇优选是在冻结温度(例如－20℃)下不结晶(以便其使制剂中的抗体去稳定)的多元醇。非还原性糖包括但不限于，蔗糖和海藻糖。
如本文中所用，＂缓冲剂＂是指，通过其酸性－碱性共轭组分的作用抵抗pH的改变的缓冲溶液。本发明的缓冲剂具有约4.5至约7.0；优选约4.8至约6.5的pH。可将pH控制在该范围内的缓冲剂的实例包括醋酸盐(例如，醋酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂。当想要冻融稳定性制剂时，缓冲剂优选不是磷酸盐。
在药理学意义上，在本发明的背景中，抗体的“治疗有效量”是指，在抗体对于其治疗是有效的病症的预防或治疗中有效的量。＂疾病/病症＂是可从利用抗体的治疗中获益的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述病症的那些病理学病况。
＂防腐剂＂是例如可包含在制剂中以大体上减少其中的细菌作用，从而有利于多用途制剂的产生的化合物。潜在防腐剂的实例包括，氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯己双铵、苯扎氯铵(其中烷基为长链化合物的氯化烷基苄基二甲基铵的混合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇例如苯酚、丁基和苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3－戊醇和间－甲酚。本文中的最优选的防腐剂为苄基醇。
本发明还提供了包含一种或多种抗体和至少一种生理上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。药物组合物可包含例如水、缓冲剂(例如，中性缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、乙醇、矿物油、植物油、二甲亚砜、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、佐剂、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽和/或防腐剂中的一种或多种。如上文中所指出的，在本文中提供的药物组合物中可以(但不是必须)包含其它活性成分。
载体是可在给患者施用前与抗体结合(通常用于控制化合物的稳定性或生物利用度)的物质。此类制剂中使用的载体通常是生物相容性的，且还可以是生物可降解的。载体包括例如单价或多价分子例如血清白蛋白(例如，人或牛)、卵白蛋白、肽、多聚赖氨酸以及多糖例如氨基葡聚糖和聚酰胺胺。载体还包括固体支持物材料例如珠粒和微粒，其包含例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸/羟基乙酸)共聚物、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素或葡聚糖。载体可以以多种方式(包括共价键合(直接地或通过接头基团)、非共价相互作用或混合)携带化合物。
可配制药物组合物以用于任何适当的施用方式，包括例如经眼、鼻内、经耳、舌下、经皮、局部、口服、经鼻、经直肠或胃肠外施用。在某些实施方案中，以适用于口服使用的形式存在的组合物是优选的。此类形式包括例如丸剂、片剂、含片(troches)、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉剂或颗粒、乳剂、硬或软胶囊或糖浆剂或酏剂。在其它实施方案中，本文中提供的组合物可配制为冻干产物。如本文中所用，术语胃肠外包括皮下、真皮内、血管内(例如，静脉内)、肌内、经脊柱、颅内、硬膜内和腹膜内注射以及任何类似的注射或输注技术。
在某些实施方案中，本发明的抗体可通过眼组织注射例如眼周、结膜、球筋膜下、前房内、玻璃体内、眼内、视网膜下、结膜下、眼球后或小管内注射直接递送至眼；通过使用导管或其它安置装置例如视网膜片剂(retinal pellet)、眼内***物、栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入物直接施用至眼；通过局部滴眼剂或软膏；或通过陷凹(cul－de－sac)中的或邻近巩膜(经巩膜的)或于巩膜中(巩膜内的)或于眼内植入的缓释装置直接递送至眼。前房内注射可经由角膜进入前房，以允许试剂到达小梁网(trabecularmeshwork)。小管内注射可进入引流施莱姆管(Schlemm＇s canal)的静脉集合管或进入施莱姆管。
对于眼递送，可将本发明的抗体与眼科可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、粘性增强剂、穿透促进剂、缓冲剂、氯化钠或水组合，以形成水性无菌眼科悬浮液或溶液。可以例如以多剂量形式包装局部眼科产品。因此，可能需要防腐剂以在使用过程中防止微生物污染。适当的防腐剂包括：三氯叔丁酮、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙基醇、依地酸二钠、山梨酸、聚季铵盐－1或本领域技术人员已知的其它试剂。此类防腐剂通常以0.001至1.0％w/v的水平使用。本发明的单位剂量组合物是无菌的，且通常是无防腐剂的(unpreserved)。此类组合物因而通常不包含防腐剂。
在某些实施方案中，将意欲局部施用至眼的组合物配制为滴眼剂或眼膏剂，其中抗体的总量为约0.001至1.0％(w/w)。优选，TNFα抗体的量为约0.01至约1.0％(w/w)。
在某些情况下，将本发明的组合物作为用于局部施用的溶液来进行施用。基于配制的容易性以及患者容易地施用此类组合物(通过将1至2滴溶液滴入患病的眼中)的能力，水溶液通常是优选的。然而，组合物也可以是悬浮液、粘稠或半粘稠凝胶，或其它类型的固体或半固体组合物。
意欲用于口服使用的组合物可按照本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且其可包含一种或多种试剂，例如甜味剂、调味剂、着色剂、和防腐剂，以提供吸引人的和可口的制剂。片剂包含与适合于制造片剂的生理上可接受的赋形剂混合的活性成分。此类赋形剂包括例如惰性稀释剂(例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、粒化剂和崩解剂(例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合剂(例如，淀粉、明胶或或***胶(acacia))和润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石)。片剂可以是无包衣的，或可利用已知的技术进行包被，以在胃肠道中延迟崩解和吸收，从而在更长的时期内提供持续作用。例如，可使用时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服使用的制剂还可以以硬明胶胶囊的形式(其中将活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合)或以软明胶胶囊的形式(其中将活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合)提供。含水悬浮液包含与适合用于制造含水悬浮液的赋形剂混合的抗体。此类赋形剂包括混悬剂(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和***胶)；和分散剂或湿润剂(例如，天然存在的磷脂例如卵磷脂、烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物例如heptadecaethy leneoxycetanol、环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、或环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物例如聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮剂还可包含一种或多种防腐剂，例如对－羟基苯甲酸乙酯或正－丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。可利用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制糖浆剂和酏剂。此类制剂还可包含一种或多种缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂和/或着色剂。
油性悬浮液可通过将活性成分悬浮于植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油例如液体石蜡中来进行配制。油性悬浮液可包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂(例如上文中所述的甜味剂)和/或调味剂以提供适口的口服制剂。此类悬浮液可通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
适于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散的粉剂或颗粒剂提供了与分散剂或湿润剂、混悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂和混悬剂例如已在上文中提及的那些。也可存在其它赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂。
药物组合物还可以以水包油乳剂的形式存在。油相可以是植物油(例如，橄榄油或花生油)、矿物油(例如，液体石蜡)或其混合物。适当的乳化剂包括天然存在的树胶(例如，***胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如，大豆卵磷脂和从脂肪酸和己糖醇衍生的酯或偏酯)、酐(例如，去水山梨糖醇单油酸酯)以及从脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如，聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)。乳剂还可包含一种或多种甜味剂和/或调味剂。
可将药物组合物制备为无菌可注射水性或油性悬浮液，其中取决于所使用的媒介物和浓度，将调节剂悬浮或溶解在媒介物中。可按照已知的技术，使用适当的分散剂、湿润剂和/或混悬剂例如上文中提及的那些来配制这样的组合物。可使用的可接受的媒介物和溶剂是水、1，3－丁二醇、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，可将无菌的不挥发性油可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射组合物，且可将佐剂例如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂溶解在媒介物中。
可将药物组合物配制为持续释放制剂(即，在施用后实现调节剂的缓慢释放的制剂例如胶囊)。此类制剂通常可使用公知的技术来制备并且可通过例如口服、经直肠或皮下植入，或通过在期望的靶位置植入来进行施用。此类制剂中使用的载体是生物相容性的，且也可以是生物可降解的；优选地，制剂提供相对恒定水平的调节剂释放。持续释放制剂中包含的抗体的量依赖于例如植入的位置、释放的速率和预期的持续时间以及待治疗或预防的疾病/病症的性质。
可以以在体液(例如，血液、血浆、血清、CSF、滑液、淋巴液、细胞间隙液、泪液或尿液)中达到足以可检测地结合TNF并且预防或抑制TNF介导的疾病/病症的浓度的量施用本文中提供的抗－TNFα抗体。如本文中描述的，如果剂量导致可辨别的患者益处，则认为该剂量是有效的。优选的全身性剂量范围为约0.1mg至约140mg/千克的体重/日(约0.5mg至约7g/患者/日)，口服剂量通常为静脉内剂量的约5－20倍。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的抗体的量将取决于待治疗的宿主和具体的施用模式。剂量单位形式通常可包含约1mg至约500mg的活性成分。
在某些实施方案中，可包装药物组合物以用于治疗对抗TNF抗体起反应的病况。包装的药物组合物可包括装载有效量的至少一种本文描述的抗体的容器和说明书(例如，标贴)，所述说明书标明，所包含的组合物在给患者施用后用于治疗对所述抗体起反应的疾病/病症。
还可化学修饰本发明的抗体。优选的修饰基团是聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚烯烃(polyalkene)、聚亚烯基(polyalkenylene)或聚氧化烯烃(polyoxyalkylene)聚合物或分枝或未分枝的多糖。此类效应物基团可增加抗体的体内半衰期。合成的聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物。具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。可根据需要改变聚合物的大小，但其大小通常在500Da至50000Da的平均分子量范围内。对于其中抗体被设计来渗透组织的局部施用，聚合物的优选分子量为约5000Da。可将聚合物分子连接于抗体，例如通过WO0194585中描述的共价连接的铰链肽连接于Fab片段重链的C末端。关于PEG部分的连接，参考“Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnological and Biomedical Applications”，1992，J.Milton Harris(ed)，PlenumPress，New York和“Bioconjugation Protein Coupling Techniques for theBiomedical Sciences”，1998，M.Aslam和A.Dent，Grove Publishers，New York。
在制备上述目标抗体后，制备包含其的药物制剂。待配制的抗体未经历在先冻干并且本文中的目标制剂是含水制剂。优选，制剂中的抗体为抗体片段例如scFv。通过考虑例如期望的剂量体积和施用模式来确定存在于制剂中的抗体的治疗有效量。约0.1mg/ml至约50mg/ml，优选约0.5mg/ml至约25mg/ml和最优选约2mg/ml至约10mg/ml是制剂中的示例性抗体浓度。
在上述pH缓冲溶液中制备包含抗体的含水制剂。取决于例如缓冲剂和制剂的期望的等渗性，缓冲剂浓度可为约1mM至约50mM，优选约5mM至约30mM。
可在制剂中包含用作张力剂(tonicifier)并且可稳定抗体的多元醇。在优选实施方案中，制剂不包含张力(tonicifying)量的盐例如氯化钠，因为这可引起抗体沉淀和/或可导致低pH下的氧化。在优选实施方案中，多元醇为非还原性糖例如蔗糖或海藻糖。以可随期望的制剂等渗性而变化的量将多元醇添加至制剂。优选，含水制剂是等渗的，在该情况下制剂中多元醇的适当浓度在例如约1％至约15％w/v的范围内，优选在约2％至约10％w/v的范围内。然而，高渗或低渗制剂也可以是适合的。添加的多元醇的量也可随多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可添加较低量的单糖(例如，甘露醇)。
还可将表面活性剂添加至抗体制剂中。示例性表面活性剂包括非离子型表面活性剂例如聚山梨醇(例如，聚山梨酯20，80等)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。通常，添加的表面活性剂的量使得其减少配制的抗体/抗体衍生物的聚集和/或最小化制剂中颗粒的形成和/或减少吸附。例如，表面活性剂可以以约0.001％至约0.5％，优选约0.005％至约0.2％和最优选约0.01％至约0.1％的量存在于制剂中。
在一个实施方案中，制剂包含上文中描述的试剂(即抗体、缓冲剂、多元醇和表面活性剂)并且基本上不含一种或多种防腐剂，例如苯甲醇、苯酚、间－甲酚、三氯叔丁醇和苄索氯铵(benzethonium Cl)。在另一个实施方案中，可在制剂中包含防腐剂，特别地当制剂是多剂量制剂时。防腐剂的浓度可以为约0.1％至约2％，最优选约0.5％至约1％。可在制剂中包含一种或多种其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂例如Remington＇sPharmaceutical Sciences，第21版，Osol，A.Ed.(2006)中描述的那些，只要它们不会不利地影响期望的制剂特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度上对受者是无毒的并且包括：另外的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂例如EDTA；金属复合物(例如，Zn－蛋白复合物)；生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或盐形成抗衡离子例如钠。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易地通过在制备制剂之前或之后经由无菌滤过膜进行过滤来实现。
按照已知的方法例如静脉内施用(以团注的形式或通过在一段时间内的连续输注)，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、硬膜内、口服、局部或吸入途径，或本文中描述的其它途径，给需要利用抗体的治疗的哺乳动物优选人施用制剂。在某些实施方案中，通过静脉内施用给哺乳动物施用制剂。为此目的，可以例如使用注射器或通过IV线注射制剂。
抗体的适当的剂量(＂治疗有效量＂)将取决于例如待治疗的病况、病况的严重度和过程、抗体是预防性还是治疗性施用、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的反应、所使用的抗体类型以及主治医生的判定。一次地或在一系列治疗过程中给患者适当地施用抗体，并且可在诊断后的任何时间给患者施用抗体。抗体可以以单一治疗的形式施用或与在治疗所述病况中是有用的其它药物或疗法联合施用。
作为一般建议，施用的抗体的治疗有效量将在约0.1至约100mg/kg患者体重的范围内(无论是一次还是多次施用)，例如每日施用的所使用的抗体的常见范围为约0.3至约20mg/kg，更优选约0.3至约15mg/kg。然而，其它剂量方案可以是有用的。该疗法的进展可容易地通过常规技术来进行监测。
在某些实施方案中，给患有TNF介导的病症的患者施用包含本发明的抗－TNFα抗体的药物组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制品，所述制品包括装载本发明的含水药物制剂的容器，且任选地提供其使用说明书。适当的容器包括例如瓶子、小瓶和注射器。可从多种材料例如玻璃或塑料形成容器。示例性容器为3－20cc的一次性使用的玻璃小瓶。或者，对于多剂量制剂，容器可以是3－100cc的玻璃小瓶。容器装载制剂，并且在容器上或与之相随的标贴可显示使用说明。制品还可包括从商业和用户观点来看是期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有使用说明的装箱单。
将在整个本说明书中引用的任何专利、专利申请和参考资料的内容通过引用整体并入本文。
除非上下文另外要求，否则本文中使用的单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
实施例
通过下列实施例进一步举例说明本公开内容，所述实施例不应当解释为限定性的。在整个本申请中引用的所有图和所有参考资料、专利以及公布的专利申请的内容明确地通过引用整体并入本文。
在所有实施例中，除非另外指明，否则使用下列材料和方法。
一般材料和方法
一般而言，除非另外指明，否则本发明的实施使用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(特别地，例如抗体技术)和多肽制备的标准技术。参见，例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：APractical Approach(Practical ApproachSeries，169)，McCafferty，Ed.，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等人，John Wiley & Sons(1992)。
热稳定性测量
在Tensor Bruker中使用FT－IR Bio－ATR cell获得各种单链的衰减全反射傅利叶变换IR(FTIR－ATR)光谱并且跟踪观察分子。将分子浓缩至高达3mg/ml，随后在4℃下针对PBS，pH6.5透析过夜，收集流过的缓冲液作为空白对照。通过用宽范围的温度(步幅为5℃，25至95℃)热攻击分子来获得变性特征谱。使用OPUS软件进行所有光谱操作。从蛋白质光谱中扣除主缓冲液和瞬态大气(CO2和H2O)本底。随后对所得的蛋白质光谱进行基线修正，并根据预期区域中最宽可分辨峰的宽度测定蛋白质酰胺I光谱。使用三次多项式函数和光滑函数获得酰胺I带光谱的二阶导数光谱。使用初始曲线－拟合计算的线性校准曲线，通过酰胺I二阶导数分析估计蛋白质结构的变化(对于3个较低的测量值，假定0％的变性，并且对于3个较高的测量值，假定100％的变性)。使用Boltzmann S曲线模型，将变性特征谱用于估算每一个变体的热解折叠转换(thermal unfolding transition，TM)的中点。
溶解度测量
在硫酸铵存在的情况下，在增强蛋白质聚集和沉淀后测量各种scFv分子的相对溶解度。将硫酸铵添加至蛋白质水溶液中，以在终混合物盐－蛋白质中产生增量为5％的饱和度。凭经验测定动态范围中的沉淀，并且在终混合物中，饱和度间隔在该范围内减小至2.5％的间隔饱和度。在添加硫酸铵后，轻轻地混合样品，并以6000rpm离心30分钟。对于每一个硫酸铵饱和度百分数，回收上清液中剩余的蛋白质。通过使用NanoDropTM1000分光光度计测量上清液中的蛋白质浓度来测定溶解度曲线。将上清液中剩余的可溶性蛋白质的测量值标准化，然后通过应用Boltzmann S曲线模型将其用于估计每一个变体的相对溶解度的中点。
短期稳定性测试
在40℃下温育2周后检查蛋白质的可溶性聚集物和降解产物。将浓度为10mg/ml的蛋白质在4℃下针对宽pH范围(3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5和8.5)的PBS透析过夜。将标准缓冲液PBS(pH6.5)中的具有相同浓度的对照蛋白质在－80℃下贮存2周。在t＝0和t＝14d时间点上通过SDS－PAGE测定降解条带，且在SEC－HPLC中估量可溶性聚集物。在40℃下进行2周后，使用Biacore测定剩余的活性。
实施例1
优化抗－TNFα scFv抗体34rFW1.4以减少聚集
34rFW1.4抗体在溶液中显示pH依赖性聚集的倾向。与34rFW1.4共有相同构架结构的578rFW1.4抗体(参见国际申请WO2009155724)未显示聚集倾向。如下产生同源性模型，以鉴定34rFW1.4中可被修饰以减少其聚集倾向的潜在残基。
可变结构域序列用于构建34rFW1.4抗体和578rFW1.4抗体的同源性模型。为了产生所述模型，使用基于BLAST算法的搜索来分别鉴定每一个抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域序列的模板结构。由于抗体构架区的高保守性，BLOSUM80(用于较少差异比对的矩阵)被用作用于比对的矩阵。选择每一个链(VL/VH)的各自的模板，其与查询序列具有超过70％的同一性。
基于鉴定的可变结构域模板，将Discovery Studio 2.5.5版(DS2.5.5)软件的程序MODELER(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)用于产生100个scFv模型。将待建模的参照抗体序列与模板结构的比对用作输入数据。产生100个包含所有非氢原子的模型。基于PDF(概率密度函数)物理能量评分，选择最佳模型结构。设置VH和VL结构域的相对方向，以匹配来自可变结构域模板结构(其与建模的两个(VL和VH)序列具有最高同源性)的方向。除去模型中的可选构象(alternate conformation)，添加末端，并添加丢失的侧链原子。对scFv模型施加CHARMM力场，并使用0.01的RMS梯度和Generalized Born with Molecular Volume(GBMV)(作为隐式溶剂模型)，进行2000轮的能量最小化。
进行每一种抗体的蛋白质电离和残基pK计算。基于由Bashford和Karplus，1991开发的理论，使用Discovery Studio2.5.5版(DS2.5.5)中包括的协议实施(protocolimplementation)来进行计算。根据抗体的侧链的pK1/2和每一个可滴定残基(包括Asp、Glu、Arg、Lys、His、Tyr、Cys、N末端和C末端残基)的滴定曲线，比较两个分子的蛋白质电离和残基pK计算的结果。
对scFv模型施加CHARMM力场，在pH7.4下进行质子化，并使用0.2的pH步幅在pH2至pH14的范围内计算各个残基的滴定曲线和pK。578rFW1.4抗体的轻链中的位置47和50上的两个保守Lys残基与34rFW1.4中的这些位置上的Lys相比，存在不同(参见图1)。
优选置换的引入
将Discovery Studio软件用于进行分子动态模拟，以预测改善VL与VH之间的相互作用亲和力，从而阻止结构域分离和形成寡聚物和/或高级聚集物的突变。将34rFW1.4抗体的VL/VH界面的稳定性评估为能量术语如自由能G。CHARMM协议配接(protocoladaptation)(也包括在DS2.5.5中)用于计算完整scFv异二聚体复合物与每一个单独的可变结构域的能量之和之间的能量差异。使用Generalized Born with Molecular Volumeintegration(GBMV)在隐式溶剂法的背景中进行计算。计算2个结构域和复合物的能量，按照下列算式将输出结果测定为复合物与单独的结构域之和之间的能量差异：G界面＝G(a)－G(b)－G(c)，其中G(a)为抗体的能量，G(b)为VL的能量，G(c)为VH的能量。
将精氨酸(R)选择作为位置47和50上的赖氨酸(K)的可能残基置换，因为R的侧链pKa值(12.5)高于K的pKa(10.5)。通过在各自位置上分别用R替代K来产生突变体K47R和K50R。对距离突变周围区域10埃或更近的残基进行2000轮能量最小化，以使得新的模型分子能够适应变化。用于这些轮次的能量最小化的隐式溶剂模型为GBMV。突变体的预测的平均deltaG为－94kcal/mol。因此，与亲代抗－TNF scFv抗体相比较，突变的贡献被估计为4kcal/mol。
实施例2
优化的34rFW1.4抗体的稳定性分析
在34rFW1.4抗体(其公开于2009年6月25日提交的共同未决的国际申请No.PCT/CH2009/000219中，所述申请的内容通过引用整体并入本文)中产生K50R突变体和K47R突变体。按照美国专利申请No.12/973,968中描述的方法制备具有减小其体内免疫原性的额外置换的另一个34rFW1.4的突变体。具体地，称为34rFW1.4＿VLK50R＿DHP的第三突变体在重链位置12(AHo编号)上包含丝氨酸(S)，在重链位置103(AHo编号)上包含苏氨酸(T)以及在重链位置144(AHo编号)上包含苏氨酸(T)。如下在加速的条件下进行亲代和突变体34rFW1.4抗体的稳定性研究。
将34rFW1.4抗体、突变体34rFW1.4＿VL＿K50R、和34rFW1.4＿VLK50R＿DHP在磷酸缓冲盐溶液(50mM Na2HPO4，150mM NaCl，pH6.5)制剂中浓缩至高达20、40和60mg/mL并且在40℃温育2周。将34rFW1.4和34rFW1.4＿K47R抗体在磷酸缓冲盐溶液(50mM Na2HPO4，150mMNaCl，pH6.5)制剂中浓缩至高达20和60mg/mL，并在40℃下温育2周。在14天的温育之前和之后，在还原和非还原条件下，使用12.5％的十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析样品的降解。在温育期之前和之后，使用大小排阻高效液相色谱(SE－HPLC)来测定样品的单体含量和可溶性聚集物。在TSKgel Super SW2000柱(TOSOH Bioscience)上将单体与非单体种类区分开，并将单体蛋白质的百分比计算为单体峰的面积除以所有产物峰的总面积。34rFW1.4和34rFW1.4＿VLK50R＿DHP的研究结果分别示于图2A－B、3A－B和4A－B。34rFW1.4＿VL＿K50R的结果示于图5B、6B和7B。这些实验显示，相较于34rFW1.4，34rFW1.4＿VLK50R＿DHP具有减少的聚集倾向。突变体34rFW1.4＿K47R也显示这样的减少，如图8B和9B中显示的。
此外，比较了34rFW1.4和34rFW1.4＿VLK50R＿DHP抗体的热稳定性和结合亲和力。结果显示，与亲代34rFW1.4抗体相比，用于产生34rFW1.4＿VLK50R＿DHP抗体的突变不影响稳定性或结合活性。
等同物
根据前述说明，本发明的许多变动和改变的实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本说明书应被解释为仅仅是举例说明性的，并且用于教导本领域技术人员最好的实施本发明的模型。结构的细节可进行变化，而在不背离本发明的精神，并且保留落在权利要求的范围内的所有变动的独占性使用。本发明意欲仅限于所附权利要求和适用的法律规定所要求的程度。
本申请中引用的所有文献和类似材料，包括专利、专利申请、论文、书籍、毕业论文、学术演讲、网页、附图和/或附录(无论此类文献和类似材料为何种形式)明确地通过引用整体并入本文。如果并入的文献和类似材料中的一项或多项与本申请不同或相矛盾，包括定义的术语、术语用法、描述的技术等，则以本申请为准。
本文中使用的章节标题仅为了组织目的，并且决不被解释为限定描述的主题。
虽然已结合各种实施方案和实施例描述了本发明，但本教导无意限定于此类实施方案或实施例。相反地，本发明包括各种替代、变动和等同物，如本领域技术人员所理解的。
除非明确指明，否则权利要求不应当被解读为限定于所描述的顺序或元素。应当理解，可进行形式和细节的各种变化，而不背离所附权利要求的范围。因此，要求保护落在下列权利要求及其等同物的范围和精神内的所有实施方案。
序列表
<110> 艾斯巴技术-诺华有限责任公司(ESBATech, an Alcon Biomedical ResearchUnit LLC)
<120> 稳定和可溶的抗体
<130> 172210F1
<160> 18
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 1
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
65 70 75 80
Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
145 150 155 160
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<400> 2
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20 25 30
Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn Thr
85 90 95
Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(75)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(139)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (172)..(221)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser
130 135 140
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
145 150 155 160
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(75)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(139)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (172)..(221)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
145 150 155 160
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Cys Ile Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Thr Pro Leu Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 8
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 8
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
65 70 75 80
Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
145 150 155 160
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
275 280 285
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
290 295 300
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
305 310 315 320
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
325 330 335
Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
340 345 350
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
355 360 365
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
370 375 380
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys
385 390 395 400
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
405 410 415
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
420 425 430
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
435 440 445
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
450 455 460
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser
<210> 9
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (277)..(326)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (341)..(390)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (423)..(483)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 9
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
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Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
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Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
290 295 300
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
325 330 335
Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
340 345 350
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
355 360 365
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
370 375 380
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
385 390 395 400
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
405 410 415
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
420 425 430
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
435 440 445
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
450 455 460
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser
<210> 10
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<400> 10
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20 25 30
Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
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Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn Thr
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Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155 160
Ile Ser Arg Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Val Gly Cys Ile Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Thr Pro
180 185 190
Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr
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Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
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Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr
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Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 11
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 11
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
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Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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<211> 231
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 12
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
65 70 75 80
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
145 150 155 160
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230
<210> 13
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 13
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
65 70 75 80
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
145 150 155 160
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<400> 14
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20 25 30
Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn Thr
85 90 95
Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 15
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (277)..(326)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (341)..(390)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (423)..(483)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 15
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
65 70 75 80
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
145 150 155 160
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
275 280 285
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
290 295 300
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
305 310 315 320
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
325 330 335
Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
340 345 350
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
355 360 365
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
370 375 380
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys
385 390 395 400
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
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420 425 430
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
435 440 445
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
450 455 460
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser
<210> 16
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(73)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(138)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(220)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (277)..(326)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (341)..(390)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (423)..(483)
<223> X可以是任何天然存在的氨基酸。可存在至少1个直至50个氨基酸。
<400> 16
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
65 70 75 80
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
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145 150 155 160
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
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275 280 285
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
290 295 300
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
325 330 335
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340 345 350
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
355 360 365
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
370 375 380
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
385 390 395 400
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
405 410 415
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420 425 430
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
435 440 445
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
450 455 460
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser
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<211> 253
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<210> 18
<211> 253
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的肽
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr
225 230 235 240
Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250

Claims (22)

1.一种特异性结合人TNFα的抗体，其包含：
a.可变轻链，其包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少90％同一性的序列且在AHo位置50上包含精氨酸；和
b.可变重链，其包含SEQ ID NO：5的序列。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体为Fab、Fab＇、F(ab)＇2、单链Fv(scFv)、Fv片段或线性抗体。
3.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1或2的抗体，以及药学上可接受的载体。
4.权利要求3的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在对此有需要的受试者中治疗TNFα介导的疾病。
5.权利要求4的应用，其中所述TNFα介导的疾病是眼病症，其选自葡萄膜炎、白塞病、视网膜炎、干眼、青光眼、综合征、糖尿病神经病变、巩膜炎、年龄相关黄斑变性和角膜炎。
6.权利要求4的应用，其中通过经眼、鼻内、经耳、舌下、经皮、局部、口服、经鼻、直肠或胃肠外施用来施用所述药物组合物。
7.权利要求6的应用，其中以包含0.1至100mg所述抗体的单份或分份剂量施用所述药物组合物。
8.权利要求5的应用，其中所述TNFα介导的疾病为葡萄膜炎或干眼，并且对所述受试者的眼局部施用所述药物组合物。
9.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1或2的抗体。
10.一种载体，其包含权利要求9的核酸分子。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求10的载体。
12.一种双价或双特异性分子，其包含权利要求1或2的抗体。
13.包含序列为SEQ ID NO：10所述抗体的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在受试者中阻断TNFα功能，其中受试者患有干眼或葡萄膜炎，且其中对所述受试者的眼局部施用所述药物组合物。
14.权利要求13的应用，其中以包含0.1至100mg所述抗体的单一或份分剂量施用药物组合物。
15.一种包含抗体的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在有此需要的受试者中降低TNFα介导的炎症，所述抗体的可变轻链在AHo位置50上为精氨酸且序列为SEQID NO：2，所述抗体的可变重链包含序列SEQ ID NO：5，其中受试者患有干眼或葡萄膜炎，且其中对所述受试者的眼局部施用所述药物组合物。
16.权利要求15的应用，其中所述药物组合物中的所述抗体在约0.1至约100mg/kg患者体重的范围内。
17.权利要求15的应用，其中所述抗体包含SEQ ID NO：10的序列。
18.一种双价或双特异性分子，其包含特异性结合人TNFα的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO：10的序列。
19.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求18的分子和药学上可接受的载体。
20.权利要求19的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗TNFα介导的疾病。
21.权利要求20的应用，其中TNFα介导的疾病是眼疾病，其选自葡萄膜炎、白塞病、视网膜炎、干眼、青光眼、综合征、糖尿病神经病变、巩膜炎、年龄相关黄斑变性和角膜炎。
22.权利要求20的应用，其中所述药物组合物被配制用于眼、鼻内、耳、舌下、经皮、局部、口服、鼻、直肠或胃肠外施用。
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