DE10314412A1

DE10314412A1 - Genetische Immunisierung mit multiplen Expressionskonstrukten zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Info

Publication number: DE10314412A1
Application number: DE2003114412
Authority: DE
Original assignee: Genovac GmbH
Current assignee: Genovac GmbH
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2004-10-14
Also published as: WO2004087216A3; WO2004087216A2

Abstract

Offenbart wird ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern mittels der Methode der genetischen Immunisierung, bei dem durch die genetische Immunisierung mit mehreren, verschiedene Polypeptide kodierenden Nukleinsäuren gleichzeitig Antikörper gegen verschiedene Polypeptide produziert werden. Diese Methode erlaubt die parallele Herstellung einer Vielzahl von monoklonalen Antikörpern definierter Spezifität gegen beliebig viele Zielmoleküle im Hochdurchsatzverfahren. DOLLAR A Insbesondere ermöglicht dieses Verfahren, Antikörper gegen Polypeptide herzustellen, die bei alleiniger Immunisierung nur wenig immunogen sind, d. h. im Normalfall nicht zur Herstellung von Antikörpern geeignet sind. DOLLAR A Darüber hinaus ist es möglich, gegen aus mehreren individuellen Polypeptiden bestehenden Polypeptidkomplexen Antikörper zu induzieren. Dies ist nur möglich, da mit diesem Verfahren die DNAs, die für alle Untereinheiten des Polypeptidkomplexes kodieren, in ein und dieselbe Zelle eingeführt werden.

Description

Nach dem erfolgreichen Abschluss der Sequenzierungsprojekte vieler Genome, darunter auch des menschlichen Genoms, ist es die große Herausforderung der post-genomicchen Ära, die riesige Menge an genetischer Information der Genomprojekte für den Menschen nutzbar zu machen. Die dazu notwendigen Analysen finden auf der Ebene der Polypeptide, der eigentlichen biologischen Funktionsträger, statt, von denen es z.B. im menschlichen Organismus etwa 100.000 gibt. So erklärt es sich, dass Antikörper, die von der Natur als hochspezifische und hochaffine Erkennungsmoleküle modelliert wurden, zu unverzichtbaren Werkzeugen der Proteomforschung geworden sind. So können z.B. Fragestellungen nach der Expression und (subzellulären) Lokalisierung von Polypeptiden, der Modifikation von Polypeptiden oder des Aufbaus von heteromultimere Polypeptidkomplexen mittels Antikörper untersucht werden. Darüber hinaus spielen Antikörper in der Arzneimittelentwicklung zur Beurteilung potenzieller Zielstrukturen („target validation") sowie auch als diagnostisches und therapeutisches Werkzeug eine immer größer werdende Rolle.
Antikörper werden klassischerweise durch immunologische Methoden hergestellt. Ausgehend von der normalen Immunreaktion, wie sie z.B. auch in der aktiven Schutzimpfung ausgelöst wird, wird durch die Injektion eines antigenen Stoffes (Immunisierung), beispielsweise eines Polypeptids (meistens kombiniert mit einem Adjuvanz), eine spezifische Antikörperbildung induziert. Diese Immunisierung wird in der Regel noch mehrmals wiederholt, um eine ausreichende Immunreaktion bzw. Impfschutz zu erreichen.
Aus dem Serum immunisierter Organismen kann anschließend ein Antikörpergemisch gegen verschiedene Epitope dieses Antigens isoliert werden (sog. polyklonale Antikörper). Wird jedoch ein spezifischer Antikörper, der gegen ein einziges Epitop des Antigens gerichtet ist, in reproduzierbarer Qualität benötigt, so werden antikörperproduzierende Zellen aus dem Organismus isoliert und z.B. durch die Hybridomtechnik immortalisiert. Solche immortalisierten Hybridomzelllinien sind in der Lage, kontinuierlich identische Antikörper in das Wachstumsmedium abzugeben, so dass große Mengen an Antikörpern definierter Qualität produziert werden können.
Nachteilig bei diesen Methoden ist allerdings, dass zur Immunisierung das Antigen zur Verfügung stehen muss. Neben den grundsätzlichen Nachteilen, wie ein oftmals hoher Zeitaufwand zur Gewinnung und Aufreinigung der Antigene und potenzielle Verunreinigungen, tritt bei vielen Polypeptiden das Problem auf, dass sie nur sehr schlecht oder auch gar nicht in genügend reiner Form zu gewinnen sind. Dies betrifft insbesondere die für Diagnostik und Therapie interessanten Polypeptide mit transmembranen Helices und sezernierte Polypeptide.
Werden die Antigene durch Expression in Bakterienzellen hergestellt, fehlen zudem viele posttranslationale Modifikationen, die in eukaryotischen Zellen an Polypeptiden häufig erfolgen. Des Weiteren wird die Immunisierung mit Antigenen meist mit denaturierten, also nicht-natürlich gefalteten Polypeptiden, durchgeführt. Dies bedeutet, dass die mit Hilfe solcher Antigene im Rahmen der Immunreaktion induzierten Antikörper nicht oder nicht sehr effizient gegen das native, posttranslational modifizierte Polypeptid reaktiv sind.
Die Methode der genetischen Immunisierung umgeht die oben beschriebenen Probleme in der Weise, dass nicht ein Polypeptid injiziert wird, sondern das Antigen durch Einbringen eines Expressionsplasmids in den Zielorganismus in diesem direkt exprimiert wird und so eine Immunantwort erfolgt. Das antigene Polypeptid, gegen das ein Antikörper hergestellt werden soll, wird also direkt von dem Zielorganismus in situ synthetisiert. Das von ihm exprimierte Polypeptid wird unter bestimmten Voraussetzungen von dem Organismus als fremd erkannt und ruft so eine Immunreaktion hervor, die zur Bildung von Antikörpern in B-Zellen führt (Tang, D.C., De Vit, M. and Johnston, S.A. (1992): Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature (356): 152–154).
Bestimmte Techniken wie z.B. die Vorbehandlung der Tiere mit bestimmten Zytokinen können dabei den Erfolg der genetischen Immunisierung gravierend verbessern (Kilpatrick, K.E., Cutler, T., Whitehorn, E., Drape, R.J., Macklin, M.D., Witherspoon, S.M., Singer, S. and Hutchins, J.T. (1998): Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of marine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor. Hybridoma (17): 569–576). Jedoch bleibt festzustellen, dass manche Antigene nicht immunogen sind und so eine humorale Immunantwort nicht mit gängigen Methoden induziert werden kann.
Die aus den lymphatischen Organen gewonnenen Zellpopulationen enthalten u. a. Antikörperproduzierende B-Zellen, die durch verschiedene Techniken für die Antikörperherstellung nutzbar gemacht werden können. Eine der gängigsten Techniken stellt die Immortalisierung der Zellen durch Fusion mit transformierten Zellen dar (Hybridomtechnik: Kohler G, Milstein C (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. (256): 495–497). Eine solche unsterbliche Hybridomzelllinie produziert fortdauernd Antikörper einer gegebenen Spezifität.
Um eine genetische Immunisierung durchzuführen kann auf verschiedene Methoden zurückgegriffen werden. Neben Verfahren der subkutanen oder intramuskulären Injektion sind Verfahren der flächigen Applikation der DNA in die Haut bekannt. Das gebräuchlichste Verfahren beruht auf dem biolistischer Einbringen der DNA (Johnston SA, Tang DC. (1994): Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization. Methods Cell Biol. (43): 353–65.). Hierzu wird die DNA-Sequenz des Polypeptids, gegen das Antikörper hergestellt werden soll, in ein geeignetes Expressionsplasmid einkloniert, das dann an Goldpartikeln immobilisiert wird. Mittels einer Art von Gasdruckpistole (gene gun) werden dann die Goldpartikel mit der DNA in die Haut der Versuchstiere eingebracht. Die Plasmide vermitteln dann in den Zellen der Tiere die Expression der Antigene und induzieren so die Immunreaktion (s.o.).
Gegenstand der Erfindung ist eine Methode bei der gleichzeitig mit mehreren Expressionskonstrukten gegen verschiedene Polypeptide immunisiert wird (sog. multiple Koimmunisierung).
Polypeptide im Sinne der Erfindung umfassen die von DNA-Sequenzen kodierten Peptide und Oligopeptide ab einer Länge von 5 Aminosäuren. Beispiele für Polypeptide im Sinne der Erfindung sind Peptide inklusive Oligopeptide und Proteine. DNA-Sequenzen im Sinne der Erfindung sind Desoxyribonukleinsäurestränge ab einer Länge von 15 Nukleinsäuren. Wobei statt den natürlich vorkommenden Desoxyribonukleinsäuren auch deren Homologe erfindungsgemäß verwendet werden können, sofern diese den Transkriptionsprozess in der Zelle nicht inhibieren. Geeignete Homologe sind im Stand der Technik bekannt (z.B. Methylguanosin).
Überraschenderweise kann durch diese Methode der multiplen Koimmunisierung das Immunsystem des immunisierten Lebewesens in die Lage versetzt werden, auch gegen schwach immunogene Polypeptide, die in einer konventionellen Immunisierung keine oder nur eine sehr geringe Immunantwort induzieren, eine deutliche Immunantwort aufzubauen und entsprechende Antikörper gegen diese Polypeptide zu bilden.
Insbesondere ermöglicht die Erfindung auch Antikörper gegen aus mehreren Polypeptiden aufgebaute Polypeptidkomplexe zu isolieren. Konventionelle Immunisierungstechniken erlauben dies nicht, da entweder die den Komplex bildenden Polypeptide nicht gemeinsam in einer Zelle exprimiert werden, nicht nativ in das Tier eingebracht werden oder aber durch die Expression einer singulären Untereinheit immundominante Strukturen entstehen, die verhindern dass erfolgreich gegen die Oberfläche des Komplexes gerichtete Antikörper isoliert werden können.
Darüber hinaus reduziert die Erfindung den mit Immunisierungsprojekten unmittelbar einhergehenden Tierverbrauch enorm.
Immunisierungsprojekten liegt grundsätzlich ein Tierverbrauch zugrunde. Im Rahmen einer (genetischen oder konventionellen) Immunisierung wird für jedes Antigen eine gewisse Anzahl an Versuchstieren getötet, um das Serum oder die antikörperproduzierenden Zellen zu entnehmen. Neben den ethischen Aspekten des Tierverbrauchs bedeutet dies auch einen recht hohen Arbeits- und Logistikaufwand (Töten und Präparieren der Tiere, Tierstallkapazität, Entsorgung der Kadaver, Tierversuchsanträge), und letztendlich eine Limitierung des maximalen Durchsatzes für eine Firma (zeitlichen und finanziellen Limitierung der Produktionskapazität).
Deshalb ist es sinnvoll, die Anzahl der Polypeptide gegen die Antikörper gewonnen werden sollen, pro Tier zu erhöhen. Dieses Ziel wird durch die hier beschriebene multiple genetische Koimmunisierung erreicht.
Dabei werden den Tieren mehrere verschiedene, also für unterschiedliche Polypeptide kodierende, Immunisierungskonstrukte parallel im Gemisch oder unmittelbar hintereinander appliziert. Für die erfindungsgemäße Lehre spielt hierbei die exakte Applikation keine bevorzugte Rolle sondern vielmehr, dass die Synthese und Expression der Poylpeptide und damit die eigentliche Immunisierungreaktion in dem Zielgewebe des Organismus parallel stattfindet. Besonders bevorzugt ist dabei eine Ausführung in der die verschiedenen Konstrukte alle an dem gleichen Ort appliziert werden, so dass in einer Zielzelle gleichzeitig mehrere Polypetide von einem oder mehreren Plasmiden exprimiert werden. Gleichzeitig eingebracht im Sinne der Erfindung erfasst alle Methoden bei denen mehrere Expressionskonstrukte zur gleichen Zeit in einem geeigneten Lebewesen vorliegen und exprimiert werden. Geeignete Tiere sind dabei beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Mäuse, Ratten und Kaninchen. Es können aber generell alle Arten von Säugetieren für diese Methode verwendet werden.
Bei der genetischen Immunisierung kann es notwendig sein, initial mit einem Expressionsvektor zu immunisieren, der für ein Zytokin wie z.B. GM-CSF kodiert. Nachfolgend werden dann die Immunisierungsschritte mit den Vektoren vorgenommen, die für die gewünschten Polypetide kodieren.
Beispielsweise werden BALB/c-Mäuse am Bauch rasiert und initial mit einem Expressionsvektor, das das Zytokin GM-CSF exprimiert, stimuliert. Hierzu wird ein entsprechendes Expressionsplasmid auf Goldpartikel aufgebracht und mittels einer Gasdruckpistole in die Haut des Tieres eingebracht. Anschließend erfolgen vier bis fünf Applikationen des auf die Goldpartikel aufgebrachten Gemisches der Expressionsvektoren, die für die gewünschten Antigene kodieren. Dem Fachmann sind noch weitere Arten der genetischen Immunisierung bekannt, die auch alle erfindungsgemäß verwendet werden können. Zum Beispiel können die Expressionsplasmide auch injiziert werden, oder mittels Hilfstoffen nach äußerlicher Auftragung durch die Haut aufgenommen werden.
Ca. vier Wochen nach der Immunisierung können die Seren auf Anwesenheit der Antikörper untersucht werden. Kommt es zu einer Antikörperbildung, so können sowohl die Seren der Tiere als auch die Zellen aus den lymphatischen Organen, wie z.B. der Milz, isoliert werden. Polyklonale Seren können erfindungsgemäß eingesetzt werden, um z.B. neutralisierende Effekte gegen aus Polypeptiden bestehende Gifte und Viren hervorzurufen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden dann die Tiere getötet, die lymphatischen Organe entnommen und homogenisiert. Die Homogenisate können dann beispielsweise zur Herstellung von immortalisierten, antikörperproduzierenden Zelllinien (z.B. Hybridomzelllinien, welche dann monoklonale Antiköper herstellen) verwendet werden.
Erfindungsgemäß können auch B-Zellen mit geeigneten Agenzien stimuliert werden, um die Lebensfähigkeit zu verlängern oder aber die B-Zellen aus solchen Mäusen isoliert werden, die für Apoptose-Faktoren defizient sind (Knott CL, Reed JC, Bodrug S, Saedi MS, Kumar A, Kuus-Reichel K (1996): Evaluation of Bcl-2/B cell transgenic mice (B6) for hybridoma production. Hybridoma (15): 365–371; Nunez G, Hockenbery D, McDonnell TJ, Sorensen CM, Korsmeyer SJ (1991): Bcl-2 maintains B cell memory. Nature (353): 71–73). In diesem Fall ist ebenfalls die Lebensfähigkeit im Vergleich zu Wildtyp-B-Zellen verlängert. Die so erreichte Lebensdauer erlaubt aus einer gegebenen 8-Zelle die für den Antikörper kodierenden Nukleinsäuresegmente zu klonieren und dann in heterologe Zellen einzubringen, in denen dann der entsprechende Antikörper produziert wird (Hayden MS, Gilliland LK, Ledbetter JA (1997): Antibody engineering. Curr Opin Immunol (9): 201–212).
Des weiteren können erfindungsgemäß sog. „humanisierte" Mäuse eingesetzt werden: diese Mausstämme verfügen über die für das Antikörper-Repertoire kodierenden humanen Genloci anstelle der marinen Gene. Damit produzieren die Mäuse direkt humane Antikörper (Green LL (1999): Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies. J Immunol Methods (231): 11–23). Humane Antikörper rufen in Menschen, im Gegensatz zu marinen Antikörpern, keine gegen sie gerichtete Immunantwort hervor.
Die Zelllinien werden nach Standardverfahren selektioniert, so dass nur diejenigen der Hybridomzellen gewonnen werden, die die gesuchten Antikörper herstellen. Die Identifikation der gewünschten antikörperproduzierenden Klone ist in DE 198 52 800 C1 ausführlich beschrieben. Sind die gesuchten Hybridome erst einmal identifiziert, kann ohne Probleme durch Vermehren der Zelllinien mit der Antikörperproduktion begonnen werden. Die weiteren Verarbeitung- und Aufreinigungsschritte der monoklonalen Antikörper sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
In diesen Experimenten wurde unerwarteterweise festgestellt, dass bei der Verwendung multipler Expressionsplasmide es erstens zu einer Antikörperbildung gegen alle verwendeten Antigene kommt und zweitens, dass selbst Antigene, die in Einzel-Immunisierungsprojekten nur schwach immunogen sind und für die daher nur ein geringer Titer nachweisbar ist, unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens, nun eine ausgeprägte Antikörperbildung induzieren.
Überraschenderweise kann also mit der Methode der multiplen genetischen Immunisierung auch mit schwach immunogenen Polypeptiden ein guter Immunisierungserfolg erzielt werden. Dies ist ein bedeutender Meilenstein in der Herstellung von Antikörpern, da somit nicht nur die Herstellung von Antikörpern effizienter wird, es wird zudem möglich, Antikörper gegen nicht oder nur schwach immunogene Antigene in einer planbaren Weise herzustellen.
Antikörper im Sinne der Erfindung stellen nicht nur vollständige Immunglobuline dar, sondern auch funktionelle Fragmente dieser Antikörper, sofern sie in der Lage sind, an ein Epitop zu binden (beispielsweise sog. single-chain fragments, scFv).
Im Sinne der Erfindung kann gegen alle denkbaren Polypeptide die genetisch exprimierbar sind, immunisiert werden. Bevorzugt werden jedoch solche DNAs verwendet, die für Polypeptide kodieren, die nicht identisch sind zu den Polypeptiden des zu immunisierenden Organismus.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsweise wird gegen Antigene immunisiert, die auf einer Zelle vorkommen, in direktem Kontakt mit Körperflüssigkeiten stehen oder in diese abgegeben werden. Dies trifft insbesondere auf die extrazellulären Domänen von Rezeptoren und Ionenkanälen zu. Geeignete Rezeptoren im Sinne der Erfindung sind z.B. Chemokinrezeptoren, Zytokinrezeptoren, adrenerge und cholinerge Rezeptoren.
Insbesondere betrifft die Erfindung auch die Erzeugung von Antikörpern gegen heteromultimere Polypeptidkomplexe. Heteromultimere Polypeptidkomplexe sind funktionelle Einheiten, die aus verschiedenen individuell unterschiedlichen Polypeptidketten aufgebaut sind, d.h. durch individuell unterschiedliche DNAs kodiert werden. Sie sind nur dann stabil, wenn alle Untereinheiten koordiniert in einer Zelle (ko-)exprimiert werden (s.u.). Die multiple genetische Immunisierung erlaubt die koordinierte Expression aller Polypeptidketten des heteromultimeren Polypeptidkomplexes in einer Zelle aufgrund der Tatsache, dass beim ballistischen Verfahren die entsprechenden DNAs auf einem einzigen Goldpartikel immobilisiert sind und somit in die selbe Zelle eingebracht werden können. Aufgrund der Koexpression aller relevanter Polypeptiduntereinheiten des Komplexes in ein und derselben Zelle kommt es zum Aufbau nativer Komplexe, die also die gleiche dreidimensionale Struktur aufweisen wie der korrespondierende natürlich vorkommende Komplex dieser Polypeptidketten des Organismus, aus dem die DNAs abgeleitet wurden. Der Komplex verfügt damit über die gleichen Oberflächen- bzw. diskontinuierlichen Epitope. So ist es mit dem hier beschriebenen Verfahren möglich, Antikörper zu erzeugen, die den nativen Polypeptidkomplex erkennen.
Dieses Verfahren umgeht somit die Probleme konventioneller Immunisierungsstrategien gegen Polypeptidkomplex-Untereinheiten, die darauf beruhen, nur jeweils gegen eine einzelne Untereinheit des Komplexes eine Immunantwort zu induzieren. Eine solche Strategie bewirkt normalerweise, dass durch andere Polypeptiduntereinheiten des Komplexes abgedeckte, also im nativen Komplex nicht offen zugängliche Epitope bzw. Oberflächen präsentiert werden. Solche Epitope sind meist besonders immunogen. So erzeugte Antikörper reagieren aber nicht mit dem komplexierten Polypeptid, also nicht mit dem Komplex, da das erkannte Epitop von anderen Komponenten des Komplexes verdeckt wird. Insbesondere wenn das im Komplex verdeckte Epitop immundominant ist (also die meisten der im Laufe der Immunantwort gebildeten Antikörper dieses Epitop binden), erlaubt die multiple genetische Koimmunisierung, eine gezieltere, weniger Zeit- und Material-aufwendige Herstellung von Antikörpern, die die tatsächlich relevante, interessierende Oberfläche des Polypeptidkomplexes erkennen.
Ein Beispiel für einen solchen Fall stellt der T-Zell-Rezeptor (TCR)-Komplex dar, der durch mehrere paarweise Interaktionen in dem endoplasmatischen Retikulum (ER) aufgebaut wird. Dies beinhaltet z.B. die Bildung von CD3ε/γ- und CD3ε/δ-Dimeren (Manolios N, Letourneur F, Bonifacino JS, Klausner RD. (1991): Pairwise, cooperative and inhibitory interactions describe the assembly and probable structure of the T-cell antigen receptor. EMBO J. (10): 1643–51). Kommt es nicht zur korrekten Polypeptid-Polypeptid-Interaktion und damit zum korrekten Aufbau des Komplexes werden die Komponenten im ER zurückgehalten und dem Polypeptidabbauweg zugeführt. D.h., der Komplex erscheint nur dann an der Zelloberfläche, wenn alle relevanten Untereinheiten koordiniert koexprimiert werden (Exley M, Terhorst C, Wileman T. (1991): Structure, assembly and intracellular transport of the T cell receptor for antigen. Semin Immunol. (5): 283–97.; Hall C, Berkhout B, Alarcon B, Sancho J, Wileman T, Terhorst C. (1991): Requirements for cell surface expression of the human TCR/CD3 complex in non-T cells. Int Immunol. (4): 359–68.).
Eine bevorzugte Anwendung des Verfahrens betrifft solche Fälle, in denen nicht unmittelbar Antikörper gegen alle exprimierten Untereinheiten des Komplexes isoliert werden sollen, sondern nur gegen die oberflächenbildenden Komponenten. So würde z.B. eine Untereinheit, die keine Oberfläche des nativen Komplexes bildet aber als interner Strukturanker wesentlich zur Stabilität und damit zur Expression des Polypeptidkomplexes beiträgt, in diesem Verfahren mit den anderen Untereinheiten koexprimiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Polypetide zytosolischer Polypeptidkomplexe in einer Zelle koexprimiert. Solche Komplexe sind in der Biologie hinreichend bekannt. Beispiele dafür sind der nFκB/iκB-Polypeptidkomplex oder die sogenannten heterotrimeren G-Proteine. Gegen diese Komplexe werden dann Antikörper gebildet. Diese Antikörper können dann selektioniert werden, so dass nur Hybridomazellen gewonnen werden, welche Antikörper gegen den Komplex aber nicht gegen die einzelnen Polypetide produzieren.
Häufig werden Polypeptide posttranslational modifiziert. Beispiele dafür sind Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen, aber auch die Ausbildung von Disulfidbrücken. Solche Modifikationen können nicht in bakteriellen Zellen durchgeführt werden, weswegen diese modifizierten Polypeptide nur in eukaryotischen Zellen hergestellt werden können. Diese Modifikationen sind durch die Peptidsequenz vorgegeben und werden nach der Synthese der Polypeptide in der Zelle durchgeführt. So sind extrazelluläre Polypeptide häufig durch Glykosylierung gekennzeichnet. Antikörper werden in diesem Falle hauptsächlich gegen die glykosylierten Polypeptide gewünscht. Solche Polypeptide lassen sich normalerweise nur sehr schwer herstellen und aufreinigen. Eine weitere häufige posttranslationale Modifikation, die für die Bindung der Antikörper an native Polypeptide eine wesentliche Rolle spielen kann, sind sog. Disulfidbrücken zweier Cysteinreste. Diese Brücken sind zur Ausbildung der korrekten Struktur, und damit zur Erkennung durch Antikörper, elementar. Insbesondere ermöglicht das hier beschriebenen Verfahren auch die Bildung von Disulfidbrücken zwischen heterologen Komponenten eines heteromultimeren Polypeptidkomplexes.
Mit herkömmlichen prokaryotischen Epressionssystemen lassen sich sowohl glykosylierte Polypeptide als auch Polypeptide mit Disulfidbrücken nicht korrekt erzeugen und sind somit einer biotechnologischen Synthese nur sehr schwer zugänglich. Durch die in situ-Synthese dieser Modifikation im Säugerorganismus im Rahmen der genetischen Immunisierung wird dieses Problem auf sehr elegante Art und Weise gelöst.
Nukleinsäuresequenzen die für solche Modifikationen kodieren sind dem Fachmann bekannt und können problemlos in den Expressionsplasmiden verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden nicht nur die natürlichen DNA-Sequenzen verwendet, sondern auch DNA-Sequenzen, die mutiert worden sind, insbesondere DNA-Sequenzen die gezielt mutiert wurden. Mutierte DNA-Sequenzen sind z.B. Sequenzen, bei deren Expression sich eine veränderte Aminosäureabfolge im dem Polypeptid ergibt. Solche Mutationen kommen zum Teil auch in der Natur vor, so z.B. bei dem Dystrophin-Gen, das für die Duchenn'sche Muskeldystropie verantwortlich ist. Solche Antikörper gegen mutierte Polypeptide können so z.B. als diagnostisches Werkzeug bei Erbkrankheiten verwendet werden.
Bevorzugt weisen die genetischen Konstrukte, die in die Zellen eingebracht werden folgende funktionelle Untereinheiten auf Die für eukaryotische Expressionsplasmide allgemein üblichen funktionellen Einheiten wie Origin of Replication (z.B. pUC-origin), Resistenzgen zur Selektion (z.B. β-Lactamase zur Resistenz gegen Ampicillin), einen starken eukaryotischen Promotor (z.B. den Promotor des CMV-Virus), einen Transkriptionsstart, eine multiple cloning site (z.B. für Restriktionsenzyme wie BamHI EcoRI HindIII XhoI etc.), ein Signal für eine Polyadenylierungssequenz (z.B: BGH polyadenylation site) und darüber hinaus eine Nukleotidsequenz, die für eine zum Nachweis oder Isolierung dienende Polypeptidsequenz (Auffindungssequenz) kodiert (z.B. (HIS)₆-tag) und eine Sequenz, die dazu geeignet ist, das exprimierten Polypeptid in der Zellmembran zu verankeren und zu präsentieren (z.B. GPI-Anker). Geeignete Grundvektoren im Sinne der Erfindung sind eukaryotische Expressionsvektoren wie z.B. pcDNA3 von der Firma Invitrogen, in die die benötigten Nukleinsäuresequenzen (z.B. Auffindungssequenzen, Polypeptide) hineinkloniert werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können verschiedene Vektoren zum Immunisieren und zur Identifizierung der gebildeten Antikörper eingesetzt werden. Diese Vektoren unterscheiden sich mindestens in ihren Auffindungssequenzen, z.B. verfügt der Vektor zum Immunisieren über die Auffindungssequenz (His)₆-tag und der ansonsten identische Vektor, der zur Identifizierung eingesetzt wird, über die myc-Auffindungssequenz.
Dies ermöglicht bei multiplen Immunisierungsprojekten die Unterscheidung zwischen spezifischen Antikörpern und Antikörpern, die gegen die Auffindungsequenz gerichtet sind.
Beispiel
Die cDNA-Sequenzen, die für die (extrazellulären Domänen der) im Folgenden aufgelisteten Polypeptide kodieren, wurden in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert (das Verfahren ist in DE 198 52 800 C1 detailliert dargestellt):

Polypeptid: Zugriffsnummer (Swissprot, Genebank):

CEACAMS P06731

IL13-Rα AAB37127

PIIINP XP012546

RLX1 NP008842

TIMP1 NP003245
Die Plasmide wurden nach Transformation mittels Standardmethoden in Bakterien vermehrt, mithilfe eines Plasmidisolationskits (Qiagen, Hilden) isoliert und auf ihre Identität überprüft. Anschließend wurden die gereinigten Plasmide auf Goldpartikel aufgebracht (das Verfahren ist in DE 198 52 800 C1 detailliert dargestellt).
BALB/c-Mäuse wurden am Bauch und Rücken rasiert und nach folgenden Schema immunisiert: Zunächst wird ein Expressionsplasmid, das für GM-CSF kodiert, mit Hilfe der Helios Gene Trun (Bio-Rad, München) in vier Schüssen appliziert. Dabei erfolgten 2 Schüsse je einer links und rechts in die Leistengegend der rasierten Haut und weitere zwei Schüsse je einer links und rechts auf dem Rücken des Tieres möglichst nahe am Oberscherschenkelansatz. Anschließend wurde im Abstand von je einer Woche mit dem Gemisch der Expressionskonstrukte nach dem oben beschriebenen Vorgehen immunisiert.
Um nachzuweisen, gegen welche der durch die eingebrachten DNAs kodierten Polypeptide eine humorale Immunantwort induziert wurde, wurden Seren isoliert und analysiert (das Verfahren ist in DE 198 52 800 C1 detailliert dargestellt; siehe die beispielhaften Daten in 1).
Nach vier Wochen wurden die Tiere getötet und die lymphatischen Organe entnommen, püriert und die darin enthaltenden antikörperproduzierenden Zellen mit Myelomzellen fusioniert. Die entstandenen Hybridomzellen werden vereinzelt und vermehrt. Die im Zellüberstand der entstandenen Hybridomzelllinien enthaltenen Antikörper wurden dann mittels eines Zell-ELISA (CELISA) auf ihre Bindungsfähigkeit überprüft. Das Antigen wird dabei durch Expression der verschiedenen Plasmide in einer geeigneten Zelllinie hergestellt. Die genaue Methode ist in der DE 198 52 800 C1 hinreichend dargelegt und dem Fachmann bekannt.
Nach der Identifizierung der Zellen, die Antikörper einer gewünschten Spezifität produzieren, werden diese vermehrt und ggf. zur späteren Verwendung kryokonserviert.
Das Ergebnis dieses Vorgangs ist eine Vielzahl antikörperproduzierender Hybridomzellen, die gegen alle oder zumindest fast alle Antigene, die nach Einbringen der Immunisierungskonstrukte in den Tiere synthetisiert wurden, spezifische Antikörper mit einer hohen Bindungsaffinität produzieren (siehe Beispiel in 2). Dabei wird pro Hybridomzelle jeweils ein spezifischer Antikörper gebildet.
Legenden
1 Identifizierung antigenspezifischer Antikörper in Mäuseseren nach multipler genetischer Immunisierung. Die Mäuse wurden mit fünf unterschiedlichen Expressionskonstrukten (RLX1, TIMP1, IL13-Rα, PIIINP und CEACAM5) multipel genetisch immunisiert. Das Immunserum einer repräsentativen, multipel immunisierten Maus wurde 4 Wochen nach Immunisierungsbeginn gewonnen und in einer Verdünnung von 1:100 mit transient transfizierten Zellen inkubiert, die je eines, oder zur Kontrolle, keines der Zielantigene exprimierten. Als weitere Kontrolle diente das jeweilige Präimmunserum. Die Bindung der im Serum enthaltenen spezifischen Antikörper an die Antigen-exprimierenden Zellen wurde mit Fluoreszinisothiozyanat (FITC)-markiertem anti-Maus-Ig-Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen. Gezeigt sind beispielhaft die Daten für zwei der fünf Konstrukte. Expressionstest: Graue Kurve: Negativkontrolle (irrelevanter Antikörper), Schwarze Kurve: Positivkontrolle (Antikörper zum Nachweis der jeweiligen Expression des Antigens mittels anti-tag-Antikörper). Serentest: Graue Kurve: Präimmunserum, Schwarze Kurve: Immunserum. RLX1: Relaxin 1; TIMP1: Tissue inhibitor of metalloproteinase 1; IL13-Rα: Interleukin 13-Rezeptor α-Kette; PIIINP: ProCollagen type III N-Endopeptidase; CEACAMS: Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5.
2 Identifizierung von antigenspezifischen Antikörpern in Hybridomüberständen nach multipler genetischer Immunisierung. Aus lymphatischen Organen von Mäusen, die mit fünf unterschiedlichen Expressionskonstrukten (RLX1, TIMP1, IL13-Rα, PIIINP und CEACAMS) multipel genetisch immunisiert worden waren, wurden Hybridome hergestellt. Die Hybridomüberstände wurden mit den mit Expressionskonstrukten einzeln transient transfizierten Zellen inkubiert. Die Bindung der im Hybridomüberstand enthaltenen Antikörper an die Antigen-exprimierenden Zellen wurde mit Fluoreszinisothiozyanat (FITC)-markiertem anti-Maus-Ig-Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen. Gezeigt sind beispielhaft die Daten für zwei Hybridome. A) Expressionstest der multiplen Immunisierungskonstrukte: Graue Kurve: Negativkontrolle (irrelevanter Antikörper), Schwarze Kurve: Positivkontrolle (Antikörper zum Nachweis der Expression des jeweiligen Antigens mittels anti-tag-Antikörper). B) Test der Hybridomüberstände: Schwarze dicke Linie: Jeweiliger Überstand auf PIIINP-exprimierenden Zellen; Graue dicke Line: auf RLX1-exprimierenden Zellen; Schwarze dünne Linie: auf TIMP1-exprimierenden Zellen; Graue dünne Linie: Überstand auf IL13-Rα exprimierenden Zellen; Hellgraue dünne Linie: Überstand auf CEACAM5-exprimierenden Zellen; RLX1: Relaxin 1; TIMP1: Tissue inhibitor of metalloproteinase 1; IL13-Rα: Interleukin 13-Rezeptor α-Kette; PIIINP: ProCollagen type III N-Endopeptidase; CEACAM5: Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5.

Claims

Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch mit einem Polypeptid reagieren von dem die kodierende Nukleinsäure bekannt ist, dadurch gekennzeichnet, dass a) mehrere Expressionskonstrukte, die für Polypeptide kodieren, gegen die polyklonale oder monoklonale Antikörper hergestellt werden sollen, gleichzeitig in ein geeignetes Lebewesen, insbesondere auch genetisch modifizierte Lebewesen wie z.B. Mäuse mit menschlichen Genen zur Antikörperproduktion, eingebracht werden und b) mit diesen multiplen Expressionskonstrukten in dem geeigneten Lebewesen eine Immunantwort mit einer damit verbundenen Antikörperbildung gegen mindestens zwei der von den eingebrachten Expressionskonstrukten kodierten Polypeptidsequenzen induziert wird und c) Serum das die produzierten Antikörper enthält den Lebewesen entnommen wird.
Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch mit einem Polypeptid reagieren von dem die kodierende Nukleinsäure bekannt ist, dadurch gekennzeichnet, dass a) mehrere Expressionskonstrukte, die für Polypeptide kodieren, gegen die polyklonale oder monoklonale Antikörper hergestellt werden sollen, gleichzeitig in ein geeignetes Lebewesen, insbesondere auch genetisch modifizierte Lebewesen wie z.B. Mäuse mit menschlichen Genen zur Antikörperproduktion, eingebracht werden und b) mit diesen multiplen Expressionskonstrukten in dem geeigneten Lebewesen eine Immunantwort mit einer damit verbundenen Antikörperbildung gegen mindestens zwei der von den eingebrachten Expressionskonstrukten kodierten Polypeptidsequenzen induziert wird und c) Antikörper produzierende Zellen aus dem Lebewesen isoliert und diese zur Gewinnung von Antikörpern kultiviert werden.
Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch mit einem Polypeptid reagieren von dem die kodierende Nukleinsäure bekannt ist, dadurch gekennzeichnet, dass a) mehrere Expressionskonstrukte, die für Polypeptide kodieren, gegen die monoklonale Antikörper hergestellt werden sollen, gleichzeitig in ein geeignetes Tier eingebracht werden und b) mit diesen multiplen Expressionskonstrukten in dem geeigneten Tier eine Immunantwort mit einer damit verbundenen Antikörperbildung gegen mindestens zwei der von den eingebrachten Expressionskonstrukten kodierten Polypeptidsequenzen induziert wird und c) Antikörper produzierende Zellen isoliert werden und diese mittels der Hybridomtechnik immortalisiert werden.
Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch mit einem oder mehreren Polypeptiden reagieren von dem die kodierenden Nukleinsäuren bekannt sind, dadurch gekennzeichnet, dass a) die für mindestens zwei Polypeptide kodierende DNAs jeweils mit Hilfe von Vektoren, die wenigstens eine für mindestens ein Auffindungssignal kodierende Sequenzen aufweisen und in geeigneten Zellen exprimiert werden und diese Polypeptide an der Oberfläche der Zellen exponiert werden. Wobei diese verwendeten Vektoren ein anderes Auffindungssignal aufweisen können als die in b) verwendeten Immunisierungsvektoren. b) unabhängig von Schritt a) die für die gewünschten Polypeptide kodierende DNAs mittels eines oder mehrerer Vektoren direkt in ein Tier eingebracht werden, wodurch eine Expression der Polypeptide in dem Tier erfolgt, die die Bildung von Antikörpern gegen die Polypeptide verursacht und c) mindestens zwei der eingebrachten DNAs für ein Polypeptid kodieren, das eine immunogene Eigenschaft aufweist und d) die in Schritt b) gebildeten Antikörper an die in dem Schritt a) gebildeten Polypeptide binden und nachgewiesen oder angereichert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Auffindungssequenz ausgewählt ist aus der (HIS)₆-tag-Sequenz, der Hämagglutinin-Sequenz eines Influenzavirus, der Flag-tag-Sequenz oder der myc-tag-Sequenz.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der für das Polypeptid kodierende Vektor am 3'-Ende der Transkriptionseinheit ein Signal für eine Polyadenylierungssequenz aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der für die Polypeptide kodierende Vektor am 5'-Ende der für das Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz einen starken Promotor aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der für die Polypeptide kodierende Vektor am 3'-Ende der für das Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz zusätzlich eine GPI-Verankerungssequenz oder eine andere Verankerungssequenz aufweist, die das Genprodukt in der Zellmembran der Wirtszelle verankert.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem antikörperproduzierende Hybridomzellen oder B-Lymphozyten selektioniert werden, um monoklonale Hybridomzelllinien zu gewinnen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die antikörperproduzierenden Zellen aus der Milz oder den Lymphknoten der Tiere gewonnen werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die Expressionsvektoren mit Hilfe von Partikeln oder durch andere Methoden in die Haut, Schleimhaut oder die Muskeln eines Tieres eingebracht werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die Expressionsvektoren mit Hilfe von Goldpartikeln in die Haut eines Tieres eingebracht werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu der für die Polypeptide kodierenden DNA-Sequenzen ein genetisches oder sonstiges Adjuvanz appliziert wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das genetisches Adjuvanz ein Expressionsvektor für Zytokine ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die für die Polypeptide kodierenden DNA-Sequenzen Sequenzen für eine oder mehrere posttranslationale Modifikationen aufweisen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindesten zwei Polypeptide von einen oder mehreren Expressionsplasmiden gebildet werden, die zusammen einen heteromultimeren Polypeptidkomplex bilden, gegen den eine Antikörperbildung stattfinden kann.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindesten zwei Polypeptide von einem oder mehreren Expressionsplasmiden gebildet werden und an der Oberfläche der Zelle exprimiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines dieser Polypeptide im Normalfall nicht an der Zelloberfläche exprimiert wird.