MX2012011901A - Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas. - Google Patents

Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas.

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Philip Wilson Howard
Andrew Polson
Luke Masterson
Arnaud Tiberghien
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Janet L Gunzner
Helga E Raab
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Abstract

Se desvelan conjugados y compuestos para fabricar conjugados que son moléculas de PBD engarzadas mediante la posición N10, junto con el uso de los conjugados para tratar enfermedades proliferativas, incluyendo cáncer.

Description

PIRROLOBENZODIACEPINAS Y CONJUGADOS DE LAS MISMAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a pirrolobenzodiacepinas (PBD), en concreto pirrolobenzodiacepinas que tienen un grupo protector N10, en forma de un engarce a un agente de unión a célula .
Antecedentes de la Invención Pirrolobenzodiacepinas Algunas pirrolobenzodiacepinas (PBS) tienen la capacidad de reconocer y unirse a secuencias especificas de ADN; la secuencia preferida es PuGPu. El primer antibiótico antitumoral de PBD, antramicina, se descubrió en 1965 (Leimgruber, y col., J. Am. Chem. Soc, 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, y col., J. Am. Chem. Soc, 87, 5791-5793 (1965)). Desde entonces se han comunicado numerosas PBD naturales y se han desarrollado más de 10 vias sintéticas de una serie de análogos (Thurston, y col., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994)). Los miembros de la familia incluyen abeimicina (Hochlowski, y col., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), quicamicina (Konishi, y col., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (patente japonesa 58-180 487; Thurston, y col., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, y col., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramicina (Kuminoto, y col., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramicinas A y B (Takeuchi, y col., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicina (Tsunakawa, y col., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protracarcina (Shimizu, y col., J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley y Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicina (DC-102) (Hará, y col., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, y col., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), sibiromicina (Leber, y col., J. Am. Chem. Soc, 110, 2992-2993 (1988)) y tomamicina (Arima, y col . , J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)) Las PBD tienen la estructura general Difieren en el número, tipo y posición de los sustituyentes, en sus anillos A aromáticos y en los anillos C de pirrólo, y en el grado de saturación del anillo C. En el anillo B hay una imina (N=C), una carbinolamina (NH-CH(OH)), o un carbinolamina metiléter (NH-CH (OMe) ) en la posición N10-C11, que es el centro electrófilo responsable de la alquilación del AND. Todos los productos naturales conocidos tienen una configuración (S) en la posición Clla quiral que les proporciona un giro dextrogiro cuando se ve desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les da la forma tridimensional adecuada para isohelicidad con la ranura menor del ADN de la forma B, lo que conduce a un acoplamiento preciso en el sitio de unión (Kohn, En Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley y Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Su capacidad para formar un aducto en la ranura menor les permite interferir en el procesamiento del ADN, de ahí su uso como agentes antitumorales .
Los presentes inventores han divulgado anteriormente en el documento WO 2005/085251, compuestos de PBD diméricos portadores de sustituyentes de arilo C2, tales como; Se ha demostrado que estos compuestos son muy útiles como agentes citotóxicos.
Un compuesto de pirrolobenzodiacepina particularmente ventajoso se describe en Gregson y col. (Chem. Commun. 1999, 797-798) como compuesto 1 y Gregson y col. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) como compuesto 4a. Este compuesto, también conocido como SJG-136, se muestra a continuación: Los presentes inventores han divulgado previamente que los compuestos de PBS pueden emplearse como profármacos protegiéndoles en la posición N10 con un grupo protector de nitrógeno, que se puede eliminar in vivo (documento WO 00/12507). Muchos de estos grupos protectores son carbamatos y tienen, por ejemplo, la estructura: En la que el asterisco (*) indica el punto de unión al átomo N10 de 1 PBD.
Los presentes inventores también han descrito la preparación de compuestos de PBD que tienen un grupo protector de carbamato de nitrógeno en la posición N10 (documento 2005/023814). Los grupos protectores se pueden eliminar de la posición N10 del resto PBD para dejar un enlace imina N10-Cll. Se describe una serie de grupos protectores, incluidos grupos que se pueden escindir mediante la acción de enzimas. El documento WO 2007/085930 describe la preparación de compuestos diméricos de OBS que tienen grupos conectores para conectar con un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo. El engarce está presente en el puente que une las unidades monoméricas de PBD del dimero.
Conjugados anticuerpo-fármaco Se ha establecido una terapia de anticuerpos para el tratamiento dirigido de pacientes con cáncer, trastornos inmunológicos y angiogénicos (Cárter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) , es decir inmunoconjugados, para la liberación local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir fármacos para matar o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer, está dirigido a la liberación del resto farmacológico a tumores, y acumulación celular en los mismos, mientras que la administración sistémica de estos fármacos no conjugados puede tener como resultado niveles inaceptables de toxicidad en las células normales así como en las células tumorales que se busca eliminar (Xie y col. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6 (3) : 281-291; Kovtun y col. (2006) Cáncer Res. 66 (6) : 3214-3121; Law y col. (2006) Cáncer Res. 66 (4) :2328-2337; u y col. (2005) Nature Biotech. 23 (9) : 1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther.
Patentes 15 (9) : 1087-1103; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Trail y col. (2003) Cáncer Immunol. I munother. 52:328-337; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614) .
De este modo se busca una eficacia máxima con una toxicidad mínima. Los esfuerzos para diseñar y perfeccionar los CAF se han centrado en la selectividad de los anticuerpos monoclonales (AcMo) además de en el mecanismo de acción, la unión al fármaco y la proporción fármaco/anticuerpo (carga) y las propiedades de liberación de fármaco (Junutula, y col., 2008b Nature Biotech., 26 ( 8 ): 925-932 ; Dornan y col (2009) Blood 114 (13) : 2721-2729; documento US 7521541; documento US 7723485; documento WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina y col. (2006) Bioconj . Chem. 17:114-124 ; Erickson y col ( 2006 ) Cáncer Res. 66 ( 8 ) :l- 8 ; Sanderson y col. ( 2005 ) Clin. Cáncer Res. 11:843-852; Jeffrey y col. ( 2005 ) J. ed. Chem. 48:1344-1358; Hamblett y col. ( 2004 ) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070). Los restos farmacológicos pueden ejercer sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos, incluida la unión a tubulina, la unión a ADN o la inhibición de topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas.
Los presentes inventores han desarrollado un nuevo enfoque a la formación de conjugados de PBD con agentes de unión a célula y, en concreto, conjugados de anticuerpos con PBD.
Sumario de la Invención En un aspecto general, la presente invención proporciona un conjugado que comprende un compuesto de PBD conectado a través de la posición N10 mediante un engarce a un agente de unión a célula. El engarce es un engarce lábil y puede ser un engarce lábil a enzimas. El agente de unión a célula es, preferentemente, un anticuerpo.
En una realización, el conjugado comprende un agente de unión a célula conectado a un espaciador, el espaciador conectado a un activador, el activador conectado a un engarce de auto-destrucción y el engarce de auto-destrucción conectado a la posición N10 del compuesto de PBD.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona nuevos compuestos conjugados de fórmula (A) : y sales y solvatos de los mismos, en la que: las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se seleccionan adicionalmente entre halo o dihalo; en la que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H, y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R10 es un engarce conectado a un agente de unión a célula; Q se selecciona independientemente entre 0, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es 0, S03M, en el que M es un catión metálico; cada uno de R y R' se selecciona independientemente entre alquilo Ci_i2 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-2o y arilo C5.20, y opcionalmente en relación con el grupo NRR', R y R' , junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterociclico opcionalmente sustituido de 4 , 5, 6 ó 7 miembros; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -0- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2, o el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) , o siendo un monómero de la fórmula (A) y siendo el otro de la fórmula (B) : en la que R2, R6, R9, R1, y R8 son como se han definido de acuerdo con los compuestos de la fórmula (A) , y los grupos R7 o los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros ; en el que R" es un grupo alquileno C3-12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, estando dichos anillos opcionalmente sustituidos; y cada X es 0, S o N (H) ; o cuando el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) , el grupo R10 en uno de los monómeros es un grupo de terminación, Rc, o es un engarce conectado a un agente de unión a célula. Para evitar dudas, el agente de unión a célula es parte del grupo R10.
La presente invención también está relacionada con el uso de un conjugado para proporcionar un compuesto de fórmula (C) en una localización diana: C y sales y solvatos de los mismos, en la que: las lineas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, 0R, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se seleccionan adicionalmente entre halo o dihalo; en las que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H, y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, e3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; R y R' se seleccionan independientemente entre alquilo Ci-12 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-20 y arilo Cs-2o, y opcionalmente en relación con el grupo NRR' , R y R' , junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterociclico opcionalmente sustituido de 4, 5, 6 ó 7 miembros; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -O- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2 o el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (C) , y los grupos R7 o los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros; en la que R" es un grupo alquileno C3_i2, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo O, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2; y cada X es O, S o N (H) .
La presente invención también está relacionada con el uso de un conjugado para proporcionar un compuesto de fórmula (D) en una localización diana: y sales y solvatos de los mismos, en la que: las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, 0R, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se seleccionan adicionalmente entre halo o dihalo; en las que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, 0R, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, e3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; Q se selecciona independientemente entre O, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es O, SO3M, en el que M es un catión metálico; cada uno de R y R' se selecciona independientemente entre alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-2o y arilo C5-20, y opcionalmente en relación con el grupo NRR' , R y R' , junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido de 4, 5, 6 ó 7 miembros; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -0- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2; o el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (D), o siendo un monómero de la fórmula (D) y siendo el otro de la fórmula (C) ; y los grupos R7 o grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros; en la que R" es un grupo alquileno C3-12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2; y cada X es 0, S o N (H) ; en la que la unidad monomérica de fórmula (C) es como se ha definido anteriormente.
La presente invención también proporciona compuestos de fórmula (E) para su uso en la preparación de los compuestos conjugados de la invención: y sales y solvatos de los mismos, en la que: las lineas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, 0R, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se seleccionan adicionalmente entre halo o dihalo; en las que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; RL es un engarce para la conexión a un agente de unión a célula; Q se selecciona independientemente entre 0, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es 0, R11 es S03M, en la que M es un catión metálico; cada uno de R y R' se selecciona independientemente entre alquilo Ci_i2 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3_20 y arilo C5-20, y opcionalmente en relación con el grupo NRR', R y R' , junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterociclico opcionalmente sustituido de , 5, 6 ó 7 miembros; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -0- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2; o el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (E) , o siendo un monómero de la fórmula (E) y siendo el otro de la fórmula (B) : en la que R2, R6, R9, R7, y R8 son como se han definido de acuerdo con los compuestos de la fórmula (A) , y los grupos R7 o los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros ; en la que R" es un grupo alquileno C3-i2, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos , por ejemplo 0, S, N (H) , NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2; y cada X es 0, S o (H) ; y en la que el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (E) , el grupo RL es uno de los monómeros es un grupo de terminación, Rc, o es un engarce para la conexión a un agente de unión a célula.
Como alternativa, en una realización, R" es un grupo alquileno C3..12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2.
Como alternativa, los nuevos compuestos conjugados pueden seleccionarse entre compuestos de la fórmula (A) como se ha descrito anteriormente y (A-I) , en la que (A-I) se selecciona entre (A-A) y (A-B) : y sales y solvatos de los mismos, en las que: R6, R9, R10, Q, R11, R y R' son como se han definido de acuerdo con los compuestos de la fórmula (A) ; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -0- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2, R2 con R1 o R3, junto con los átomos de carbono del anillo C al que están unidos, forman un anillo benceno opcionalmente sustituido; cada uno de V y W se seleccionan entre (CH2)n, 0/ S, NR, CHR y CRR' en la que n es 1, 2 ó 3, excepto que V sea C cuando R1 y R2, junto con los átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido, y w sea C cuando R3 y R2, junto con los átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido; T se selecciona entre CH2/ NR, CO, BH, SO, y S02; U se selecciona entre CH2, NR, O y S; Y es (CH2)n, en la que n es 1, 2, 3 ó 4; excepto que T, U e Y no sean todos CH2; o el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) , siendo cada monómero de la fórmula (A-I) , siendo un monómero de la fórmula (A) y siendo el otro de la fórmula (B) como se ha descrito anteriormente o (B-I), o siendo un monómero de la fórmula (A-I) y siendo el otro de la fórmula (B) o (B-I), y (B-I) se selecciona entre (B-A) y (B-B) : B-A B-B en las que R1, R2, R3, R6, R9, R7, y R8 son como se han definido de acuerdo con los compuestos de la fórmula (A-I), y los grupos R7 o los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros; en la que R" es un grupo alquileno C3-12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2; y cada X es 0, S o N (H) ; y en la que el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A-I) y/o formula (A) , el grupo R10 en uno de los monómeros es un grupo de terminación, Rc, o es un engarce conectado a un agente de unión a célula.
Por conveniencia, todas las referencias a A pueden aplicarse a A-I (y A-A y A-B) , y todas las referencias a B pueden aplicarse a B-I (y B-A y B-B) . Referencias similares a C, D y E también son aplicables a (C-I) , (D-I) y (E-I) , según sea adecuado .
Como alternativa, el conjugado también puede usarse para proporcionar un compuesto en una localización diana, en la que el compuesto es un compuesto de la fórmula (C) como se ha descrito anteriormente o (C-I), en el que (C-I) se selecciona entre (C-A) y (C-B) : y sales y solvatos de los mismos, en las que: R6, R9, R y R' son como se han definido de acuerdo con los compuestos de la fórmula (C) ; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -0- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2, R2 con R1 o R3, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, forman un anillo benceno opcionalmente sustituido; cada uno de V y W se seleccionan entre (CH2)n/ 0, S, NR, CHR, y CRR' en la que n es 1, 2 ó 3, excepto que V sea C cuando R1 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido, y W sea C cuando R3 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido; T se selecciona entre CH2, NR, CO, BH, SO, y S02; U se selecciona entre CH2, NR, 0 y S; Y es (CH2)n, en la que n es 1, 2, 3 ó 4 ; excepto que T, U e Y no sean todos CH2; o el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (C) , siendo cada monómero de la fórmula (C-I), o siendo un monómero de la fórmula (C) y siendo el otro de la fórmula (C-I), y los grupos R7 o los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros; en la que R" es un grupo alquileno C3-i2, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2; y cada X es 0, S o N (H) .
La presente invención también está relacionada con el uso de un conjugado para proporcionar un compuesto en una localización diana, en la que el compuesto es un compuesto de la fórmula (D) como se ha descrito anteriormente o la fórmula (D-I) ; en la que (D-I) se selecciona entre (D-A) y (D-B) : y sales y solvatos de los mismos, en la que: R6, R9, R y R' son como se han definido de acuerdo con los compuestos de la fórmula (D) ; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, e3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -0- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2, Q se selecciona independientemente entre O, S y NH; Ru es H o R o, cuando Q es 0, S03M, en la que M es un catión metálico; R2 con R1 o R3, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, forman un anillo benceno opcionalmente sustituido; cada uno de V y se seleccionan entre (CH2)n, 0, S, NR, CHR, y CRR' en las que n es 1, 2 ó 3, excepto que V sea C cuando R1 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido, y W sea C cuando R3 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido; T se selecciona entre CH2, NR, CO, BH, SO, y S02; U se selecciona entre CH2, NR, 0 y S; Y es (CH2)n, donde n es 1, 2, 3 ó 4; excepto que T, U e Y no sean todos CH2; o el compuesto es un dímero, siendo cada monómero de la fórmula (D) , siendo cada monómero de la fórmula (D-I), o siendo un monómero de la fórmula (D) y siendo el otro de la fórmula (D-I) , y los grupos R7 o los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros; en la que R" es un grupo alquileno C3-12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos , por ejemplo O, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2; y cada X es 0, S o N (H) .
Como alternativa, la presente invención también proporciona compuestos de fórmula (E) como se ha descrito anteriormente y (E-I) para su uso en la preparación de los compuestos conjugados de la invención; en la que (E-I) se selecciona entre (E-A) y (E-B) : y sales y solvatos de los mismos, en las que: R6, R9, R y R' son como se han definido de acuerdo con los compuestos de la fórmula (D); R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R8 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; o cualquier par de grupos adyacentes de R6 a R9 forman juntos un grupo -0- (CH2) p-0-, en el que p es 1 ó 2, RL es un engarce para la conexión a un agente de unión a célula; Q se selecciona independientemente entre O, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es O, S03 , en la que M es un catión metálico; R2 con R1 o R3, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, forman un anillo benceno opcionalmente sustituido; cada uno de V y W se seleccionan entre (CH2)n, 0, S, NR, CHR, y CRR' en las que n es 1, 2 ó 3, excepto que V sea C cuando R1 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido, y sea C cuando R3 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, forme n anillo benceno opcionalmente sustituido; T se selecciona entre CH2, NR, CO, BH, SO, y S02; U se selecciona entre CH2, NR, 0 y S; Y es (CH2)n, donde n es 1, 2, 3 ó 4; excepto que T, U e Y no sean todos CH2; o el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (E) , siendo cada monómero de la fórmula (E-I), o siendo un monómero de la fórmula (E) o (E-l) y siendo el otro de la fórmula (E) , (E-I), (B) o (B-l); y los grupos R7 o grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula -X-R"-X- que engarza los monómeros; en la que R" es un grupo alquileno C3-12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos , por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2; y cada X es 0, S o N(H).
Breve Descripción De Las Figuras de la Invención La Figura 1 muestra realizaciones particulares de la presente invención; Las Figuras 2 a 6 muestran el resultado de los ensayos biológicos en realizaciones particulares de la presente invención.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un conjugado que comprende un compuesto de PBD conectado a través de la posición N10 mediante un engarce a un agente de unión a célula. En una realización, el conjugado comprende un agente de unión a célula conectado a un grupo espaciador de conexión, el espaciador conectado a un desencadenante, el desencadenante conectado a un engarce de auto-destrucción y el engarce de auto-destrucción conectado a la posición N10 del compuesto PBD. Dicho conjugado se ilustra a continuación: en el que CBA es un agente de unión a célula y PBD es un compuesto de pirrolobenzodiazepina, como se describe en el presente documento. La ilustración muestra las porciones que corresponden a R10, A, L1 y L2 en ciertas realizaciones de la invención .
La presente invención es adecuada para su uso en la prestación de un compuesto de PBD a un sitio preferido en un sujeto. En las realizaciones preferidas, el conjugado permite la liberación de un compuesto de PBD activo que no retiene ninguna parte del engarce. No hay ningún detalle presente que pueda afectar a la reactividad del compuesto de PBD.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona conjugados que comprenden un grupo dimérico de PBD que tiene un engarce conectado a un agente de unión a célula. Los inventores de la presente invención describen en el presente documento procedimientos de síntesis que dicho dimero se conjugue para que pueda prepararse mediante el uso de nuevas técnicas de desimetrización de PBD.
Preferencias Las siguientes preferencias pueden aplicarse a todos los aspectos de la invención como se ha descrito anteriormente o pueden referirse a un solo aspecto. Las preferencias pueden combinarse entre sí en cualquier combinación.
Doble enlace En una realización, no hay doble enlace presente en Cl y C2, y C2 y C3.
En una realización, las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C2 y C3, como se muestra a continuación : En una realización, un doble enlace está presente entre C2 y C3 cuando R2 es arilo C5-20 o alquilo C1-12.
En una realización, las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2, como se muestra a continuación : En una realización, un doble enlace está presente entre Cl y C2 cuando R2 es arilo C5-20 o alquilo C1-12.
H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se seleccionan adicionalmente entre halo o dihalo.
En una realización, R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR.
En una realización, R2 se selecciona independientemente entre H, =0, =CH2, R, =CH-RD y =C(RD)2.
En una realización, R2 es independientemente H.
En una realización, R2 es independientemente =0.
En una realización, R2 es independientemente =CH2, En una realización, R2 es independientemente =CH-RD. Dentro del compuesto PBD, el grupo =CH-RD puede tener las dos configuraciones que se muestran a continuación: (I) En una realización, la configuración es la configuración (I) .
En una realización, R2 es independientemente =C(RD)2- En una realización, R2 es independientemente =CF2.
En una realización, R2 es independientemente R.
En una realización, R2 es arilo Cs_2o sustituido opcional e independientemente .
EEnn uunnaa rreeaalliizzaacciióónn, R2 es alquilo C1-12 sustituido opcional e independientemente .
En una realización, R2 es arilo C5_2o sustituido opcional e independientemente .
En una realización, R2 es arilo C5-7 sustituido opcional e independientemente .
En una realización, R2 es arilo Ce-io sustituido opcional e independientemente .
En una realización, R2 es fenilo sustituido opcional e independientemente .
En una realización, R2 es naftilo sustituido opcional e independientemente .
En una realización, R2 es piridilo sustituido opcional e independientemente .
En una realización, R2 es quinolinilo o isoquinolinilo sustituido opcional e independientemente.
En una realización, R2 porta de uno a tres grupos sustituyentes, prefiriéndose más 1 y 2, y siendo lo más preferido grupos sustituidos una sola vez. Los sustituyentes pueden estar en cualquier posición.
Cuando R2 es un grupo arilo C5-7, un solo sustituyente está preferentemente en un átomo del anillo que no es adyacente al enlace con el resto del compuesto, es decir, es preferentemente ß o ? con respecto al enlace con el resto del compuesto. Por lo tanto, cuando el grupo arilo Cs- es fenilo, el sustituyente está preferentemente en las posiciones meta o para y más preferentemente está en la posición para.
En una realización, R2 se selecciona entre: en las que los asteriscos indican el punto de unión.
Cuando R2 es un grupo arilo Ce-iOf po ejemplo quinolinilo o isoquinolinilo, éste puede portar cualquier número de sustituyentes en cualquier posición de los anillos de quinolina o isoquinolina . En algunas realizaciones, éste porta uno, dos o tres sustituyentes, y éstos pueden estar en los anillos proximales o distales, o en ambos (si hay más de un sustituyente) .
En una realización, cuando R2 está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan entre los sustituyentes dados en la sección de sustituyentes posterior.
Cuando R está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan preferentemente entre: Halo, Hidroxilo, Éter, Formilo, Acilo, Carboxi, Ester, Aciloxi, Amino, Amido, Acilamido, Aminocarboniloxi, Ureido, Nitro, Ciano y Tioéter.
En una realización, cuando R o R2 está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan entre el grupo que consiste en R, OR, SR, NRR' , N02, halo, C02R, COR, CONH2, CONHR y CONRR' .
Cuando R2 es alquilo Ci_i2, el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-20 y arilo C5_2o-Cuando R2 es heterociclilo C3-20 el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos alquilo C1-12 y arilo C5-20. Cuando R2 es un grupo arilo C5.2o, el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-20 y alquilo C1-12.
Se entiende que el término "alquilo" abarca las subclases alquenilo y alquinilo, asi como cicloalquilo . Por lo tanto, cuando R2 es alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, se entiende que el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, que pueden formar parte de un sistema conjugado. En una realización, el grupo alquilo C1-12 opcionalmente sustituido contiene al menos un doble o triple enlace carbono-carbono, y este enlace está conjugado con un doble enlace presente entre Cl y C2, o C2 y C3. En una realización, el grupo alquilo C1-12 es un grupo seleccionado entre alquilo C1-12 saturado, alquenilo C2-12 alquinilo C2-12 cicloalquilo C3-12.
Si un sustituyente en R2 es halo, éste es preferentemente F o Cl, más preferentemente Cl.
Si un sustituyente en R2 es éter, éste puede ser en algunas realizaciones un grupo alcoxi, por ejemplo, un grupo alcoxi C1-7 (por ejemplo, metoxi, etoxi) o puede ser en algunas realizaciones un grupo ariloxi C5-7 (por ejemplo, fenoxi, piridiloxi, furaniloxi) .
Si un sustituyente en R2 es alquilo C1-7, éste puede ser preferentemente un grupo alquilo Ci_4 (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo) .
Si un sustituyente en R2 es heterociclilo C3-7, éste puede ser en algunas realizaciones un grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno, por ejemplo morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo. Estos grupos pueden estar enlazados al resto del resto PBD mediante el átomo de nitrógeno. Estos grupos pueden estar adicionalmente sustituidos, por ejemplo, con grupos alquilo C1-4.
Si un sustituyente en R2 es bis-oxi-alquileno C1-3, éste es preferentemente bis-oxi-metileno o bis-oxi-etileno.
Los sustituyentes particularmente preferidos para R2 incluyen metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metil-tienilo .
Los grupos R2 sustituido particularmente preferidos incluyen, pero sin limitación, 4-metoxi-fenilo, 3-metoxifenilo, 4-etoxi-fenilo, 3-etoxi-fenilo, 4-fluoro-fenilo, 4-cloro-fenilo, 3, 4-bisoximetileno-fenilo, 4-metiltienilo, 4-cianofenilo, 4-fenoxifenilo, quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo, isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinaftilo y naftilo.
En una realización, R2 es halo o dihalo. En una realización, R2 es -F o -F2, sustituyentes que se ilustran a continuación como (III) y (IV) respectivamente: (III) (IV) RD En una realización, RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo.
En una realización, RD es independientemente R.
En una realización, RD es independientemente halo.
R6 En una realización, R6 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn- y Halo.
En una realización, R6 se selecciona independientemente entre H, OH, OR, SH, NH2, N02 y Halo.
En una realización, R6 se selecciona independientemente entre H y Halo.
En una realización, R6 es independientemente H.
En una realización, R6 y R7 juntos forman un grupo -0-(CH2)p-0-, en el que p es 1 ó 2.
R7 R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo.
En una realización, R7 es independientemente OR.
En una realización, R7 es independientemente 0R7A, en el que R7A es alquilo Ci-6 sustituido opcional e independientemente. En una realización, R7A es alquilo Ci-ß saturado sustituido opcional e independientemente.
En una realización, R7A es sustituido alquenilo C2_4 opcional e independientemente .
En una realización, R7A es independientemente Me.
En una realización, R7A es independientemente CH2Ph.
En una realización, R7A es independientemente alilo.
En una realización, el compuesto es un dímero en el que los grupos R7 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula X-R"-X engarzando los monómeros.
R8 En una realización, el compuesto es un dimero en el que los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la formula X-R"-X engarzando los monómeros.
En una realización, R8 es independientemente OR8A, en el que R8A es alquilo C1-4 sustituido opcional e independientemente. En una realización, R8A es alquilo Ci_6 saturado sustituido opcional e independientemente o alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido .
En una realización, R8A es independientemente Me.
En una realización, R8A es independientemente CH2Ph.
En una realización, R8A es independientemente alilo.
En una realización, R8 y R7 juntos forman un grupo -0-(CH2)p- 0-, en el que p es 1 ó 2.
En una realización, R8 y R9 juntos forman un grupo -0-(CH2)p- 0-, en el que p es 1 ó 2.
R9 En una realización, R9 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn- y Halo.
En una realización, R9 es independientemente H.
En una realización, R9 es independientemente R u OR.
Rio Para evitar dudas, cuando R10 es un engarce conectado a un agente de unión a célula, el agente de unión a célula es parte del grupo R10.
En ciertas realizaciones de la invención, cuando el conjugado es un dimero que comprende dos monómeros A, un monómero tiene un grupo R10 que es un engarce conectado a un agente de unión a célula, y el otro monómero tiene un grupo R10 que es un engarce conectado a un agente de unión a célula o un grupo de terminación R°. Preferentemente, el otro monómero tiene un grupo R que es un grupo de terminación R . Por lo tanto, es esta realización preferida, existe una sola unión única al agente de unión a célula.
En una realización, el grupo R10 puede retirarse de la posición NIO del resto PBD para dejar un enlace N10-imina Cll, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, en la que QR11 es OS03M, un aducto de bisulfito, una tiocarbinolamina, una tiocarbinolamina sustituida o una carbinalamina sustituida, como se ilustra a continuación: N10-imina C11 carbinolamina carbinolamina sustituida aducto de bisulfito tiocarbinolamina tiocarbinolamina sustituida tiocarbinalamina sustituida en las que R y M son como se definen para los conjugados de la invención.
En una realización, el grupo R10 puede retirarse de la posición N10 del resto PBD para dejar un enlace N10-imina Cll.
En algunas realizaciones, el conjugado de la invención es un compuesto dimérico que comprende un monómero de fórmula (A) y un monómero de fórmula (B) . En esta realización, el grupo R10 no necesita retirarse de la posición N10, puesto que el monómero (B) tiene una funcionalidad adecuada en las posiciones N10 y Cll para actividad biológica.
Sin embargo, se prefiere que el grupo R10 pueda retirarse asi para proporcionar un dimero que tenga una funcionalidad adecuada en las posiciones NIO y Cll en ambas unidades monoméricas. Dicha funcionalidad se considera necesaria para permitir la actividad reticulante del dimero PBD.
La presente solicitud se refiere particularmente a aquellos grupos 10 que tienen una unión carbamato en la posición N10. El engarce une el Agente de Unión a Célula (CBA) , por ejemplo un anticuerpo, al resto D del profármaco PBD a través de un enlace o enlaces covalentes. El engarce es un resto bifuncional o monofuncional que pude usarse para enlazar uno o más restos de fármaco (D) y una unidad de anticuerpo (Ab) para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) . El engarce (L) puede ser estable fuera de una célula, es decir extracelular, o puede escindirse por actividad enzimática, hidrólisis u otras condiciones metabólicas. Pueden prepararse convenientemente conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) usando un engarce que tenga una funcionalidad reactiva para unir el resto de fármaco al anticuerpo. Un tiol de cisteina o una amina, por ejemplo terminal N o cadena lateral de aminoácido, tal como lisina, del anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional de un reactivo engarce o espaciador, resto de fármaco PBD (D) o reactivo de enlace a fármaco (D-L) .
Muchos grupos funcionales reactivos en el engarce unidos a la posición N10 del resto PBD pueden ser útiles para hacerlo reaccionar con el agente de unión a célula. Por ejemplo, pueden formarse uniones éster, tioéster, amida, tioamida, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, éter, tioéter o disulfuro a partir de la reacción de los intermedios engarce-fármaco PBD y el agente de unión a célula.
Los engarces de los ADC previenen preferentemente la agregación de moléculas de ADC y mantienen el ADC fácilmente soluble en medios acuosos y en estado monomérico.
Los engarces de los ADC son preferentemente estables extracelularmente . Antes del transporte o liberación en una célula, el conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) es preferentemente estable y permanece intacto, es decir, el anticuerpo permanece unido al resto de fármaco. Los engarces son estables fuera de la célula diana y pueden escindirse con cierto grado de eficacia dentro de la célula. Un engarce eficaz: (i) mantendrá las propiedades de enlace especificas del anticuerpo; (ii) permitirá la liberación intracelular del conjugado o resto de fármaco; (iii) se mantendrá estable e intacto, es decir no se escindirá, hasta que el conjugado se haya liberado o transportado a su sitio elegido; y (iv) mantendrá un efecto linfocitico citotóxico o un efecto citostático del resto de fármaco PBD. La estabilidad del ADC puede medirse por técnicas analíticas convencionales, tales como espectroscopia de masas, HPLC, y la técnica de separación/análisis CL/E .
La unión covalente del anticuerpo y el resto de fármaco requiere que el engarce tenga dos grupos funcionales reactivos, es decir, bivalencia en un sentido reactivo. Los reactivos engarces bivalentes que son útiles para unir dos o más restos funcionales o biológicamente reactivos, tales como péptidos, ácidos nucleicos, fármacos, toxinas, anticuerpos, haptenos grupos indicadores son conocidos, y se han descrito procedimientos para sus derivados conjugados (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nueva York, p 234-242) .
En otra realización, el engarce puede estar sustituido con grupos que modulan la agregación, solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente sulfonato puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo engarce con el anticuerpo o el resto de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L con D, o D-L con Ab, dependiendo de la ruta sintética empleada para preparar el ADC.
En una realización, R10 es un grupo: En el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, CBA es un agente de unión a célula, L1 es un engarce, A es un grupo de conexión que conecta L1 al agente de unión a célula, L2 es un enlace covalente o junto con -OC(=0)- forman un engarce de auto-destrucción y L1 o L2 es un engarce escindible.
L1 es preferentemente el engarce escindible y puede denominarse como un desencadenante de la activación para la escisión del engarce.
La naturaleza de L1 y L2, cuando están presentes, puede variar ampliamente. Estos grupos seleccionan en base a sus características de escisión, que pueden estar dictadas por condiciones en el sitio en el que se libera el conjugado. Se prefieren aquellos engarces que se escinden por la acción de enzimas, aunque también pueden usarse engarces que puedan escindirse por cambios en el pH (por ejemplo, lábiles a ácido o base), temperatura o después de irradiación (por ejemplo, fotolábiles) . También pueden encontrar uso engarces que puedan escindirse en condiciones de reducción u oxidación en la presente invención.
L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser el sustrato diana para la escisión enzimática, permitiendo de esta manera la escisión de R10 de la posición N10.
En una realización, L1 puede escindirse por la acción de una enzima. En una realización, la enzima es una esterasa o una peptidasa .
En una realización, L2 está presente, y junto con -C(=0)0-, forma un engarce de auto-destrucción. En una realización, L2 es un sustrato para la actividad enzimática, permitiendo de esta manera la liberación de R10 de la posición N10.
En una realización, en la que L1 puede escindirse por la acción de una enzima y L2 está presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.
L1 y L2, cuando están presentes, pueden estar conectados por un enlace seleccionado entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC (=0) -, -0C(=0)-, -0C (=0)0-, -NHC (=0)0-, -0C(=0)NH- y -NHC (=0)NH-.
Un grupo amino de L1 que conecta a L2 puede ser el terminal N de un aminoácido o puede obtenerse a partir de un grupo amino de una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, una cadena lateral de aminoácido de lisina.
Un grupo carboxilo de L1 que conecta a L2 puede ser el C-terminal de un aminoácido o puede obtenerse a partir de un grupo de una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, una cadena lateral de aminoácido de ácido glutámico.
Un grupo hidroxilo de L1 que conecta a L2 puede obtenerse a partir de un grupo hidroxilo de una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, una cadena lateral de aminoácido de serina .
La expresión "cadena lateral de aminoácido" aquellos grupos encontrados en: (i) aminoácidos que se encuentran en la naturaleza, tales como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina; (ii) aminoácidos menores, tales como ornitina y citrulina; (iii) aminoácidos no naturales, beta-aminoácidos, análogos sintéticos y derivados de aminoácidos que aparecen en la naturaleza; y (iv) todos los enantiómeros, diastereómeros, enriquecidos isoméricamente, marcados isotópicamente (por ejemplo, 2H, 3H, 14C, 15N) , formas protegidas y mezclas racémicas de los mismos.
En una realización, -C(=0)0- y L2 forman juntos el grupo: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, la linea ondulada indica el punto de unión al engarce L1, Y es -N (H) -, -0-, -C(=0)N(H)- o -C(=0)0-, y n es de 0 a 3. El anillo fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como se describen en el presente documento. En una realización, el grupo fenileno está opcionalraente sustituido con halo, NO2, R u OR.
En una realización, Y es NH.
En una realización, n es 0 ó 1. Preferentemente, n es 0.
Cuando Y es NH y n es 0, el engarce de auto-destrucción puede denominarse como un engarce de p-aminobencilcarbonilo (PABC) . El engarce de auto-destrucción permitirá la liberación del compuesto protegido cuando se activa un sitio remoto, realizándose según los principios que se muestran a continuación (para n = 0) : cuando L es la forma activada de la porción restante del engarce. Estos grupos tienen la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que se está protegiendo. Como se ha descrito anteriormente, el grupo fenilo puede estar opcionalmente sustituido.
En una realización descrita en el presente documento, el grupo L* es un engarce L1 como se describe en el presente documento, que pueden incluir un grupo dipeptidico.
En otra realización, -C(=0)0- y L2 forman juntos un grupo seleccionado entre: en el que el asterisco, la linea ondulada, Y y n son como se han definido anteriormente. Cada anillo fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como se describen en el presente documento. En una realización, el anillo fenileno que tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido y el anillo fenileno que no tiene el sustituyente Y está sin sustituir. En una realización, el anillo fenileno que tiene el sustituyente Y está sin sustituir y el anillo fenileno que no tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido.
En otra realización, -C(=0)0- y L2 forman juntos un grupo seleccionado entre: en el que el asterisco, la linea ondulada, Y y n son como se han definido anteriormente, E es 0, S o NR, D es N, CH, o CR, y F es N, CH, o CR.
En una realización, D es N.
En una realización, D es CH.
En una realización, E es O o S.
En una realización, F es CH.
En una realización preferida, el engarce es un engarce lábil de catepsina.
En una realización, L1 comprende un dipéptido. El dipéptido puede representarse como -NH-Xi-X2-CO-, en el que -NH- y -CO-representan los N- y C-terminales de los grupos aminoacidicos Xi y X2 respectivamente. Los aminoácidos en el dipéptido pueden ser cualquier combinación de aminoácidos naturales. Cuando el engarce es un engarce lábil de catepsina, el dipéptido puede estar en el sitio de acción para la escisión mediante por catepsina.
Además, para aquellos grupos aminoacidicos que tienen una funcionalidad carboxilo o de cadena lateral amino, por ejemplo Glu y Lys respectivamente, CO y NH pueden representar dicha funcionalidad de cadena lateral.
En una realización, el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-CO-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg-, -Trp-Cit-en el que Cit es citrulina.
Preferentemente, el grupo -Xi~X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-C0-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-.
Más preferentemente, el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-CO-, es -Phe-Lys- o -Val-Ala-.
Pueden usarse otras combinaciones dipeptidicas, incluyendo las descritas por Dubowchik y col., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869, que se incorpora en la presente memoria como referencia.
En una realización, la cadena lateral de aminoácido se derivatiza, cuando es adecuado. Por ejemplo, un grupo amino o grupo carboxi de una cadena lateral de aminoácido puede derivatizarse .
En una realización, un grupo amino NH2 de una cadena lateral de aminoácido, tal como lisina, es una forma derivatizada seleccionada entre el grupo que consiste en NHR y NRR' .
En una realización, un grupo carboxi COOH de un aminoácido de cadena lateral, tal como ácido aspártico, es una forma derivatizada seleccionada entre el grupo que consiste en COOR, CONH2, CONHR y CONRR' .
En una realización, la cadena lateral de aminoácido está químicamente protegida, cuando es adecuado. El grupo protector de cadena lateral puede ser un grupo como se expone más adelante en relación al grupo RL. Los inventores de la presente invención han establecido que las secuencias de aminoácido protegidos pueden escindirse mediante enzimas. Por ejemplo, se ha establecido que una secuencia dipeptidica que comprende un residuo Lys de cadena lateral protegido con Boc puede escindirse con catepsina.
Los grupos protectores para las cadenas laterales de aminoácidos se conocen bien en la técnica y se describen en el Novabiochem Catalog. Se exponen estrategias adicionales de grupo protector en Protective Groups in Organic Synthesis, Greene y Wuts.
A continuación, se muestran grupos protectores posibles de cadena lateral para aquellos aminoácidos que tienen una funcionalidad reactiva de cadena lateral: Arg: Z, Mtr, Tos; Asn: Trt, Xan; Asp: Bzl, t-Bu; Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt; Glu: Bzl, t-Bu; Gln: Trt, Xan; His: Boc, Dnp, Tos, Trt; Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc; Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS; Thr: Bz; Trp: Boc; Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
En una realización, la protección de la cadena lateral se selecciona para que sea ortogonal con respecto a un grupo proporcionado como, o como parte de, un grupo de terminación, cuando esté presente. Por lo tanto, la eliminación del grupo protector de cadena lateral no elimina el grupo de terminación, o cualquier funcionalidad del grupo protector que sea parte del grupo de terminación.
En otras realizaciones de la invención, los aminoácidos seleccionados son aquellos que no tienen ninguna funcionalidad de cadena lateral reactiva. Por ejemplo, los aminoácidos pueden seleccionarse entre: Ala, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Pro y Val.
En una realización, el dipéptido se usa junto con un engarce de auto-destrucción. El engarce de auto-destrucción puede estar conectado a -X2-.
Cuando un engarce de auto-destrucción está presente, -X2-está conectado directamente al engarce de auto-destrucción. Preferentemente, el grupo -X2-CO- está conectado a Y, en el que Y es NH, formando de esta manera al grupo-X2-CO-NH- .
-NH-Xi- está conectado directamente a A. A puede comprender la funcionalidad -CO- para formar de esta manera una unión amida con -Xi~.
En una realización, L1 y L2 junto con -0C(=0)- comprenden el grupo NH-X1-X2-CO-PABC-. El grupo PABC está conectado directamente a la posición N10. Preferentemente, el engarce de auto-destrucción y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuación: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, y la linea ondulada indica el punto de unión a la porción restante del engarce L1 o el punto de unión a A.
Preferentemente, la línea ondulada indica el punto de unión a A. La cadena lateral del aminoácido Lys puede estar protegida, por ejemplo, con Boc, Fmoc o Alloc, como se ha descrito anteriormente.
Como alternativa, el engarce de auto-destrucción y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuación: en el que el asterisco y la línea ondulada son como se han definido anteriormente.
Como alternativa, el engarce de auto-destrucción y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuación: en el que el asterisco y la línea ondulada son como se han definido anteriormente.
En algunas realizaciones de la presente invención, puede preferirse que si el PBD/resto de fármaco contiene un enlace imina sin proteger, por ejemplo si el resto B está presente, entonces el engarce no contenga un grupo amino libre (H2N-) .
Por tanto, si el engarce tiene la estructura -A-L1-L2-, entonces este no contendría preferentemente un grupo amino libre. Esta preferencia es particularmente pertinente cuando el engarce contiene un dipéptido, por ejemplo como L1; en esta realización, se preferiría que uno de los dos aminoácidos no se seleccione entre lisina.
Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores de la presente invención han descubierto que la combinación de un enlace de imina sin proteger en el resto de fármaco y un grupo amino libre en el engarce provocan la dimerización del esto fármaco-engarce que puede interferir con la conjugación de dicho resto fármaco-engarce a un anticuerpo. La reacción cruzada de estos grupos puede acelerarse en caso de que el grupo amino esté presente como un ion amonio (H3 +-) , tal como cuando se ha usado un ácido fuerte (por ejemplo, TFA) para desproteger el grupo amino libre.
En una realización, A es un enlace covalente. Por lo tanto, L1 y el agente de unión a célula están conectados directamente. Por ejemplo, cuando L1 comprende una secuencia de aminoácido contigua, el terminal N de esta secuencia puede conectar directamente al agente de unión a célula.
Por lo tanto, cuando A es un enlace covalente, la conexión entre el agente de unión a célula y L1 puede seleccionarse entre : -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC (=0) -, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC (=0)0-, -OC(=0)NH-, -NHC (=0) H- , -C(=0)NHC(=0)-, -s-, -S-S-, -CH2C(=0)-, y =N-NH- .
Un grupo amino de L1 que conecta al agente de unión a célula puede ser el terminal N de un aminoácido o puede obtenerse a partir de un grupo amino de una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, una cadena lateral de aminoácido de lisina.
Un grupo carboxilo de L1 que conecta el agente de unión a célula puede estar en el terminal C de un aminoácido o puede obtenerse a partir de un grupo carboxilo de una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo una cadena lateral de aminoácido de ácido glutámico.
Un grupo hidroxilo de L1 que conecta al agente de unión a célula puede obtenerse a partir de un grupo hidroxilo de una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo una cadena lateral de aminoácido de serina.
Un grupo tiol de L1 que conecta al agente de unión a célula puede obtenerse a partir de un grupo tiol de una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo una cadena lateral de aminoácido de serina.
Los comentarios anteriores en relación a los grupos amino, carboxilo, hidroxilo y tiol de L1 también se aplican al agente de unión a célula.
En una realización, L2 junto con -OC(=0)- representa: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, la linea ondulada indica el punto de unión a L1, n es de 0 a 3, Y es un enlace covalente o un grupo funcional, y E es un grupo activable, por ejemplo por acción enzimática o luz, para generar de esta manera una unidad de auto-destrucción. El anillo fenileno está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno, dos o tres sustituyentes como se describen en el presente documento. En una realización, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido adicionalmente con halo, N02, R u OR. Preferentemente n es 0 ó 1, lo más preferido 0.
E se selecciona para el grupo sea susceptible a activación, por ejemplo, por medio de luz o por la reacción de una enzima. E puede ser -N02 o ácido glucorónico. El anterior puede ser susceptible a la acción de una nitroreductasa, el último a la acción de una ß-glucoronidasa .
En esta realización, el engarce de auto-destrucción permitirá la liberación del compuesto protegido cuando se active E, realizándose de la forma que se indica a continuación (para en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición NIO, E* es la forma activada de E, e Y es como se ha descrito anteriormente. Estos grupos tienen la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que se está protegiendo. Como se ha descrito anteriormente, el grupo fenileno puede estar opcionalmente sustituido adicionalmente. El grupo Y puede ser un enlace covalente con L1.
El grupo Y puede ser un grupo funcional seleccionado entre: -C(=0)- -NH- -0- -C (=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC (=0) -, -0C(=0)-, -0C (=0) 0-, -NHC (=0)0-, -0C (=0)NH-, -NHC (=0)NH-, -NHC (=0)NH, -C (=0) HC (=0) -, y -S-.
Cuando L1 es un dipéptido, se prefiere que Y sea -NH- o -C(=0)-, para formar de esta manera un enlace de amida entre L1 e Y. En esta realización, la secuencia dipeptidica no necesita ser un sustrato para una actividad enzimática.
En otra realización, A es un grupo espaciador. Por lo tanto, L1 y el agente de unión a célula está conectados indirectamente .
L1 y A pueden estar conectados mediante un enlace seleccionado entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC (=0) -, -0C(=0)-, -0C (=0)0-, -NHC (=0) 0-, -0C(=0)NH-, y -NHC(=0)NH-.
Preferentemente, el engarce contiene un grupo funcional electrófilo para la reacción con un grupo funcional nucleófilo en el agente de unión a célula. Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, pero sin limitación: (i) grupos de amina terminal N, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteina, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar cuando el anticuerpo es glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilo en restos de engarce y reactivos de engarce, incluyendo: (i) grupos maleimida (ii) disulfuros activados, (iii) ésteres activos, tales como ésteres de NHS (N-hidroxisuccinimida) , ésteres de HOBt (N-hidroxibenzotriazol) , haloformiatos y haluros de ácido; (iv) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; y (v) aldehidos, cetonas, carboxilo, y algunos de los mismos se ilustran de la siguiente manera: Determinadas realizaciones tienen disulfuros reducibles dentro de la cadena, es decir, puentes de cisteina. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para su conjugación con reactivos de engarce por tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol) . Por tanto, cada puente de cisteina formará, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleófilos adicionales en anticuerpos a través de la reacción de Usinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Pueden introducirse grupos tiol reactivos en el anticuerpo (o fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteina (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuo aminoacidicos de cisteina no nativa) . El documento US 7521541 enseña anticuerpos de ingeniería por introducción de aminoácidos reactivos de cisteina .
En algunas realizaciones, un Engarce tiene un grupo nucleófilo reactivo, que es reactivo con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos reactivos útiles en un anticuerpo incluyen , pero sin limitación, aldehido, cetona u grupos carbonilo. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un Engarce puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un Engarce incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidroxilo, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida . El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión a un Engarce.
En una realización, el grupo A es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L , la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, y n es de 0 a 6. En una realización, n es 5, En una realización, el grupo A es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L , la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, y n es de 0 a 6. En una realización, n es 5, En una realización, el grupo A es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L1, la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, n es 0 ó 1, y m es de 0 a 30. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 8, preferentemente de 4 a 8, y lo más preferido 4 u 8. En otra realización, m es de 10 a 30, y preferentemente de 20 a 30. Como alternativa, m es de 0 a 50. En esta realización, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
En una realización, el grupo A es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L , la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, n es 0 ó 1 y m es de 0 a 30. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 8, preferentemente de 4 a 8, y lo más preferidos de 4 u 8. En otra realización, m es de 10 a 30, y preferentemente de 20 a 30. Como alternativa, m es de 0 a 50. En esta realización, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
En una realización, la conexión entre el agente de unión a célula y A es a través de un residuo de tiol del agente de unión a célula y un grupo maleimida de A.
En una realización, la conexión entre el agente de unión a célula y A es: en el que el asterisco indica el punto de unión a la porción restante de A y la linea ondulada indica el punto de unión a la porción restante del agente de unión a célula. En esta realización, el átomo de S se obtiene típicamente a partir del agente de unión a célula.
En cada una de las realizaciones anteriores, puede usarse una funcionalidad alternativa en lugar del grupo derivado de maleimida que se muestra a continuación: en el que la línea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula como antes, y el asterisco indica el enlace a la porción restante del grupo A.
En una realización, el grupo derivado de maleimida está reemplazado por el grupo: en el que la línea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, y el asterisco indica el enlace a la porción restante del grupo A.
En una realización, el grupo derivado de maleimida está reemplazado por un grupo, que opcionalmente junto con el agente de unión a célula, se selecciona entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC (=0) -, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC (=0) 0-, -0C (=0) NH-, -NHC (=0) NH-, -NHC (=0) H, -C(=0)NHC(=0)-, -s-, -S-S-, -CH2C(=0) - -C(=0)CH2-, =N-NH- yd -NH-N=.
En una realización, el grupo derivado de maleimida está reemplazado por un grupo, que opcionalmente junto con el agente de unión a célula, se selecciona entre: en los que la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula o el enlace a la porción restante del grupo A, y el asterisco indica el otro punto de unión al agente de unión a célula o el enlace a la porción restante del grupo A.
Otros grupos adecuados para conectar L1 al agente de unión a célula se describen en el documento WO 2005/082023.
El grupo R10 es derivable del grupo RL. El grupo RL puede convertirse en un grupo R10 por conexión de un agente de unión a célula a un grupo funcional de RL. Pueden tomarse otras etapas para convertir RL en R10. Estas etapas pueden incluir la eliminación de grupos protectores, cuando estén presentes, o al instalación de un grupo funcional adecuado.
Q En una realización, Q se selecciona entre 0, S o N(H).
Preferentemente, Q es 0.
R11 En una realización, R11 es H o R o, cuando Q es 0, S03M, en el que M es un catión metálico.
En una realización, R11 es H.
En una realización, R11 es R.
En una realización, cuando Q es 0, R11 es SO3 , en el que M es un catión metálico. El catión pude ser Na+.
RL En una realización, RL es un engarce para la conexión a un agente de unión a célula.
En una realización, el engarce se proporciona con un grupo funcional para formar una conexión a un agente de unión a célula. La presente solicitud se refiere particularmente a aquellos grupos RL que tienen una unión carbamato en la posición N10. La descripción del grupo de engarce en Rx0 anterior también es relevante para sus precursores inmediatos en el presente documento.
RL es diferente de Rc, que no es adecuado para reacción con un agente de unión a célula. Sin embargo, en algunas realizaciones, Rc puede convertirse en un grupo RLr por ejemplo mediante manipulación adecuada de los grupos protectores y otras funcionalidades que son, o forman parte de, Rc.
En una realización, RL es un grupo: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, G1 es un grupo funcional para formar una conexión a un agente de unión a célula, L1 es un engarce, L2 es un enlace covalente o junto con -0C(=0)- forma un engarce de auto-destrucción, y L1 o L2 es un engarce escindióle.
L1 y L2 son como se han definido anteriormente en relación a R10. Las referencias a la conexión con A pueden interpretarse en el presente documento como haciendo referencia a la conexión con G1.
En una realización, en la que L1 comprende un aminoácido, la cadena lateral de dicho aminoácido puede estar protegida. Puede usarse cualquier grupo protector adecuado. En una realización, los grupos protectores de cadena lateral pueden eliminarse con otros grupos protectores en el compuesto, cuando estén presentes. En otras realizaciones, los grupos protectores pueden ser ortogonales con respecto a otros grupos protectores en la molécula, cuando estén presentes. Los grupos protectores adecuados para las cadenas laterales de aminoácidos incluyen los grupos que se describen en Novabiochem Catalog 2006/2007. También se describen grupos protectores para su uso en un engarce lábil de catepsina en Dubowchik y col.
En ciertas realizaciones de la invención, el grupo L1 incluye un residuo aminoacidico Lys. La cadena lateral de este aminoácido puede estar protegida con un grupo protector Boc o Alloc. Se prefiere más un grupo protector Boc.
El grupo funcional G1 forma un grupo de conexión A después de reacción un agente de unión a célula.
En una realización, el grupo funcional G1 es o comprende un grupo amino, ácido carboxílico, hidroxilo, tiol o maleimida para reacción con un grupo adecuado en el agente de unión a célula. En una realización preferida, G1 comprende un grupo maleimida .
En una realización, el grupo G1 es un grupo alquil maleimida. Este grupo es adecuado para reacción con grupos tiol, particularmente grupos tiol de cisteina, presentes en el agente de unión a célula, por ejemplo presentes en un anticuerpo .
En una realización, el grupo G1 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L1 y n es de 0 a 6. En una realización, n es 5.
En una realización, el grupo G1 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L y n es de 0 a 6. En una realización, n es 5.
En una realización, el grupo G1 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L , n es 0 ó 1, y m es de 0 a 30. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 2, preferentemente de 4 a 8 y lo más preferido 4 u 8. Como alternativa, m es de 0 a 50. En esta realización, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
En una realización, el grupo G1 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L1, n es 0 ó 1, y m es de 0 a 30. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 8 , preferentemente de 4 a 8, y lo más preferido 4 u 8. Como alternativa, m es de 0 a 50. En esta realización, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
En cada una de las realizaciones anteriores, puede usarse una funcionalidad alternativa en lugar del grupo maleimida que se muestra a continuación: en el que el asterisco indica el enlace a la porción restante del grupo G.
En una realización, el grupo derivado de maleimida está reemplazado por el grupo: en el que el asterisco indica el enlace a la porción restante del grupo G.
En una realización, el grupo maleimida está reemplazado por un grupo seleccionado entre: -C (=0) OH, -OH, -NH2, -SH, -C(=0)CH2D, en el que D es Cl, Br o I, -CHO, -NHNH2 -C=CH y -N3 (azida) .
En una realización, cuando L1 está presente, G1 es -NH2, NHMe, -C00H, -OH o -SH.
En una realización, cuando L1 está presente, G1 es -NH2 o -NHMe. Ambos grupos pueden estar en el N de una secuencia aminoacidica de L1.
En una realización, cuando L1 está presente, G1 es -NH2, y L1 es una secuencia aminoacidica -Xi-X2-, como se ha definido anteriormente en relación a R10.
En una realización, cuando L1 está presente, G1 es COOH. Este grupo puede estar en el terminal C de una secuencia aminoacidica de L1.
En una realización, cuando L1 está presente, G1 es OH.
En una realización, cuando L1 está presente, G1 es SH.
El grupo G1 puede convertirse de un grupo funcional en otro. En una realización, cuando L1 está presente, G1 es - H2. Este grupo puede convertirse en otro grupo G1 que comprende un grupo maleimida. Por ejemplo, el grupo -NH2 puede hacerse reaccionar con un ácido o ácido activado (por ejemplo, formas de N-succinimida) de estos grupos G1 que comprende la maleimida mostrada anteriormente.
Por tanto, el grupo G1 puede convertirse en un grupo funcional que sea más adecuado para reacción con un agente de unión a célula.
En otras realizaciones, RL es un grupo que es un precursor para el engarce que se proporciona con un grupo funcional. Como se ha indicado anteriormente, en una realización, cuando L1 está presente, G1 es -NH2, -NHMe, -COOH, -OH o -SH. En una realización más, estos grupos se proporcionan en una forma químicamente protegida. Por tanto, la forma protegida químicamente es un precursor para el engarce que se proporciona con un grupo funcional.
En una realización, G1 es -NH2 en una forma químicamente protegida. El grupo puede protegerse con un grupo protector carbamato. El grupo protector carbamato puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Cbz y PNZ.
Preferentemente, cuando G1 es -NH2, está protegido con un grupo Alloc o Fmoc.
En una realización, cuando G1 es -NH2, está protegido con un grupo Fmoc.
En una realización, el grupo protector es igual que el grupo protector de carbamato del grupo de terminación.
En una realización, el grupo protector no es igual que el grupo protector de carbamato del grupo de terminación. En esta realización, se prefiere que el grupo protector pueda eliminarse en condiciones que no eliminen el grupo protector de carbamato del grupo de terminación.
El grupo protector químico puede eliminarse para proporcionar un grupo funcional para formar una conexión a un agente de unión a célula. Opcionalmente, este grupo funcional puede después convertirse en otro grupo funcional como se ha descrito anteriormente.
En una realización, el grupo activo es una amina. Esta amina es preferentemente la amina N terminal de un péptido, y puede estar en la amina terminal N de los dipéptidos preferidos de la invención.
El grupo activo puede hacerse reaccionar el grupo funcional que se pretende para formar una conexión a un agente de unión a célula.
En otras realizaciones, el engarce es un precursor para el engarce que tiene un grupo activo. En esta realización, el engarce comprende el grupo activo, que está protegido mediante un grupo protector. El grupo protector puede eliminarse para proporcionar el engarce que tiene un grupo activo .
Cuando el grupo activo es una amina, el grupo protector puede ser un grupo protector de amina, tal como los que se describen en Green y Wuts.
El grupo protector es preferentemente ortogonal con respecto a otros grupos protectores, cuando estén presentes, el grupo RL.
En una realización, el grupo protector es ortogonal con respecto al agente de finalización. Por lo tanto, el grupo protector de grupo activo puede eliminarse mientras se conserva el grupo de terminación. En otras realizaciones, el grupo protector y el grupo de terminación pueden eliminarse en las mismas condiciones que las usadas para eliminar el grupo de terminación.
En una realización, RL es: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, y la linea ondulada indica el punto de unión a la porción restante del engarce L1 o el punto de unión a G1. Preferentemente, la linea ondulada indica el punto de unión a G1.
En una realización, RL es: en el que el asterisco y la linea ondulada son como se han definido anteriormente.
En una realización, RL es: en el que el asterisco y la linea ondulada son como se han definido anteriormente.
Otros grupos funcionales adecuados para su uso en la formación de una conexión entre L1 y el agente de unión a célula se describen en el documento WO 2005/082023.
Los engarces incluyen restos peptidicos escindibles de proteasas que comprenden una o más unidades aminoacídicas . Pueden prepararse reactivos de engarce a péptido por procedimientos de síntesis en fase sólida o en fase líquida (E. Schroder y K. Lübke, The Peptidesr volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press) que se conocen bien en el campo de la química de péptidos, incluyendo química de t-BOC (Geiser y col . "Automation of solid-phase peptide synthesis" en Macromolecular Sequencing y Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218) y química de Fmoc/HBTU (Fields, G. y Noble, R. (1990) "Solid phase peptide synthesis using 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214), en un sintetizador automático, tal como el Rainin Symphony Peptide Synthesizer (Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ), o Model 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA) .
Los engarces de aminoácido ejemplares incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos aminoacidicos que comprenden un componente de engarce aminoacidico incluyen los de origen natural, asi como aminoácidos menores y análogos aminoacidicos que no son de origen natural, tales como citrulaina. Pueden diseñarse y optimizarse componentes de engarce aminoacidico en su selectividad para escisión enzimática por enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.
Los aminoácidos de cadena lateral incluyen aquellos que aparecen en la naturaleza, asi como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que no aparecen en la naturaleza, tales como citrulina. Las cadenas laterales de aminoácido incluyen hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, - (CH2) 3NHC (=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3NHCOCH3 - (CH2) 3NHCHO, - (CH2) 4NHC (=NH)NH2, -(CH2)4NH2, - (CH2) 4NHCOCH3, - (CH2) 4NHCHO, - (CH2) 3NHCONH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH (OH) CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil- , 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo, asi como las siguientes estructuras: Cuando las cadena laterales de aminoácido incluyen otras distintas de hidrógeno (glicina) , el átomo de carbono al que la cadena lateral de aminoácido está unida es quiral. Cada átomo de carbono al que la cadena lateral de aminoácido está unida está independientemente en la configuración (S) o (i?), o es una mezcla racémica. Los reactivos de engarce a fármaco pueden por tanto ser enantioméricamente puros, racémicos o diastereoméricos .
En realizaciones ejemplares, las cadenas laterales de aminoácido se seleccionan entre aminoácidos naturales y no naturales, incluyendo alanina, ácido 2-amino-2-ciclohexilacético, ácido 2-amino-2-fenilacético, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norleucina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, ácido y-aminobutirico, ácido a,a-dimetil ?-aminobutirico, ácido ß,ß-dimetil ?-aminobutírico, ornitina, y citrulina (Cit) .
Un reactivo de engarce dipeptídico valina-citrulina (val-cit o ve) ejemplar, útil para la construcción de un resto intermedio de fármaco engarce-PBD para conjugación a un agente de unión a célula, por ejemplo un anticuerpo, que tiene un espaciados de auto-destrucción para-aminobencilcarbamoilo (PAB) tiene la estructura: En la que Q es alquilo Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -halógeno, -N02 o -CN; y m es un número entero que varia de 0-4.
Un reactivo de engarce dipeptídico phe-lys (Mtr) ejemplar que tiene un grupo p-aminobencilo puede prepararse de acuerdo con Dubowchik, y col. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60, y tiene la estructura en la que Mtr es mono-4-metoxitritilo, Q es alquilo C^-Ce, -0- (alquilo Ci-C8) , -halógeno, -N02 o -CN; y m es un número entero que varía de 0-4.
El "engarce de auto-destrucción" PAB (para-aminobenciloxicarbonilo) , une el resto de fármaco al anticuerpo en el conjugado de anticuerpo fármaco (Cari y col. (1981) J. Med. Chem. 24:479-480; Chakravarty y col. (1983) J. Med. Chem. 26:638-644; US 6214345; US20030130189; US20030096743; US6759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US20040018194 ; O98/13059; US20040052793; US6677435; US5621002; US20040121940; WO2004/032828) . Otros ejemplos de espaciadores de auto-destrucción además de PAB incluyen, pero sin limitación: (i) compuestos aromáticos que son similares electrónicamente al grupo PAB, tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay y col. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), trazóles (US 7375078), unidades de PAB múltiples y alargadas (de Groot y col. (2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830); y orto o para-aminobencilacetales ; y (ii) análogos de estiril PAB homologados (US 7223837) . Pueden usarse espaciadores que experimenten ciclación después hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutirico sustituidas y sin sustituir (Rodrigues y col. (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillo biciclo [2, 2, 1] y biciclo [2, 2, 2] adecuadamente sustituidos (Storm y col. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, y col. (1990) J. Org. Chem. 55:5867). La eliminación de fármacos que contienen amina que están sustituidos en la glicina (Kingsbury y col. (1984) J. Med. Chem. 27:1447) también son ejemplos de espaciadores de auto-destrucción útiles en ADC.
En una realización, un reactivo de análogo de PAB dipeptidico valina-citrulina tiene un grupo a 2,6 dimetil fenilo y tiene la estructura: Los reactivos de engarce útiles para los conjugados de anticuerpo fármaco de la invención incluyen, pero sin limitación: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS , HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ( succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) y reactivos de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-bis-maleimidodietilenglicol (B (PEO)2) y 1,11-bis-maleimidotrietilenglicol (BM(PE0)3), que están disponibles en el mercado de Pierce Biotec nology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, y otros proveedores de reactivos. Los reactivos de bis-maleimida permiten la unión del grupo tiol libre de un residuo de cisteina de un anticuerpo a un resto, marca o engarce intermedio de fármaco que contiene tiol, de una manera secuencial o concurrente. Otros grupos funcionales además de maleimida, que son reactivos con un grupo tiol de un anticuerpo, resto de fármaco PBD o intermedio de engarce incluyen yodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, piridil disulfuro, isocianato y isotiocianato .
BM(PEO)2 BM(PEO)3 Otras realizaciones de reactivos de engarce son: N-succinimidil-4- (2-piridiltio) pentanoato (SPP) , propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditio) (SPDP, Carlsson y col. (1978) Biochem. J. 173:723-737), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimidometilo) (SMCC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetil HC1), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activo (tales como 1, 5-difluoro-2, -dinitrobenceno) . También pueden obtenerse reactivos de engarce útiles mediante otras fuentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) , o sintetizarse de acuerdo con procedimientos descritos en Toki y col. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
El Engarce puede ser un engarce de tipo dendritico para una unión covalente de más de un resto de fármaco a través de un resto de engarce ramificado multifuncional a un anticuerpo (US 2006/116422; US 2005/271615; de Groot y col. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494; Amir y col. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499; Shamis y col. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731; Sun y col. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun y col. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King y col. (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Los engarces dendriticos pueden aumentar la proporción molar del fármaco con respecto al anticuerpo, es decir la carga, que está relacionada con la potencia del ADC . Por lo tanto, cuando un anticuerpo porta solo un grupo tiol de cisteina reactivo, una multitud de restos de profármaco pueden unirse a través de un engarce dendritico o ramificado.
Una realización ejemplar de un engarce de tipo dendritico tiene la estructura: en la que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10 de un resto de PBD.
Agente de unión a célula Un agente de unión a célula puede ser de cualquier tipo e incluye péptidos y no péptidos. Estos pueden incluir anticuerpos o un fragmento de un anticuerpo que contiene al menos un sitio de unión, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas para transporte de nutrientes o cualquier otra molécula o sustancia de unión a célula.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dimeros, multimeros, anticuerpos multiespecificos (p. ej . , anticuerpos biespecíficos ) y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Miller y col. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos o derivados de otras especies. Un anticuerpo es una proteina generada por el sistema inmunitario que es capaz de reconocer y unirse a un antigeno especifico. (Janeway, C, Travers, P., Walport, M. , Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a Ed. , Garland Publishing, New York) . En general, un antigeno diana tiene numerosos sitios de unión, también denominados epitopos, reconocidos por CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir una molécula que contiene un sitio de unión a antigeno que se une inmunoespecíficamente a un antigeno de una diana de interés o parte de la misma, incluyendo dichas dianas, entre otras, células cancerosas o células que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados con una enfermedad autoinmunitaria . La inmunoglobulina para ser de cualquier tipo (IgG, IgE, Ig , IgD e IgA) , clase (p. ej . , IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden derivar de cualquier especie, incluidos los orígenes humano, murino o de conej o .
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el fragmento de unión a antigeno o una región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab ' , F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotipicos (anti-Id) , CDR (región determinante de la complementariedad) y fragmentos de unión a epitopo de cualquiera de los anteriores que se unen inmunoespecíficamente a antigenos de células cancerosas, antígenos virales o antigenos microbianos, moléculas de anticuerpo de una cadena y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales sn ventajosos en cuanto a que pueden sintetizarse no contaminados con otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica la naturaleza del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler, y col., (1975) Nature 256:495, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase el documento US 4816567) . Los anticuerpos monoclonales pueden también aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson, y col. (1991) Nature 352:624-628); Marks, y col., (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" En los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos concretos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (documento US 4816567; y Morrison, y col. (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej . , mono del viejo mundo o simio) y secuencias de la región constante humana.
En el presente documento, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios VL y VH, asi como un dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (p. ej . , dominios constantes de la secuencia nativa humana) o una variante de la secuencia de aminoácidos de los mismos. El anticuerpo intacto puede tener una o más "funciones efectoras", que hacen referencia a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de la secuencia nativa o una región Fe de la variante de la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Ejemplos de las funciones efectoras del anticuerpo incluyen unión a Clq; citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA) ; fagocitosis; y regulación por disminución de los receptores de superficie, tal como el receptor de células B y BCR.
En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden además dividirse en "subclases" (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Ejemplos de agentes de unión a célula incluyen los agentes descritos para usar en el documento WO 2007/085930, que se incorpora en el presente documento.
El agente de unión a célula puede ser, o comprender, un polipéptido . El polipéptido puede ser un polipéptido cíclico . El agente de unión a célula puede ser un anticuerpo . Por tanto, en una realización, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) . Carga del fármaco La carga de fármaco es el número medio de fármacos PBD por anticuerpo. La carga de anticuerpo puede variar de 1 a 8 fármacos (F) por anticuerpo (Ac) , es decir cuando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 restos farmacológicos están unidos covalentemente al anticuerpo. Las composiciones de CAF incluyen grupos de anticuerpos conjugados con un intervalo de fármacos, de 1 a 8. El número medio de fármacos por anticuerpo en preparaciones de CAF de reacciones de conjugación se pueden caracterizar por medios convencionales, tales como espectroscopia de masas, ensayo ELISA, electroforesis y HPCL. La distribución cuantitativa de CAF en términos de p también se puede determinar. Se puede determinar mediante ELISA, el valor medio de p en una preparación concreta de CAF (Hamblett y col. (2004) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070; Sanderson y col. (2005) Clin. Cáncer Res. 11:843-852). No obstante, la distribución de los valores p (fármaco) no se puede discernir por la unión anticuerpo-antigeno y la limitación de la detección de los ELISA. Asimismo, el ensayo ELISA para la detección de conjugados de anticuerpo-fármaco no determina donde se unen los restos de fármaco al anticuerpo, tal como los fragmentos de la cadena pesada o de la cadena ligera, o los residuos aminoacidicos concretos. En algunos casos, se puede conseguir la separación, purificación y caracterización de CAF homogéneos en los que p es un valor cierto a partir de CAF con otras cargas de fármaco por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis .
Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos de cisteina tiol o puede tener solo uno o varios grupos tiol reactivos suficientemente a través de los cuales se puede unir un engarce. Cargas mayores de fármaco, por ejemplo p > 5, pueden producir agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de permeabilidad celular de ciertos conjugados de anticuerpo-fármaco.
Normalmente, menos del máximo teórico de los restos farmacológicos está conjugado con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos residuos de lisina que no reacciona con el intermedio conector del fármaco (D-L) o reactivo conector. Solo los grupos de lisina más reactivos pueden reaccionar con un reactivo conector reactivo con amina. Asimismo, solo los grupos de cisteina tiol más reactivos pueden reaccionar con un reactivo conector reactivo con tiol. En general, los anticuerpos no contienen muchos, si contienen alguno, grupos de cisteina tiol libres y reactivos que pueden estar unidos a un resto farmacológico. La mayoría de cisteina tiol en los anticuerpos de los compuestos existe como puentes disulfuro y deben reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o TCEP, en condiciones de reducción parcial o total. La carga (proporción fármaco/anticuerpo) de un CAF puede controlarse de varios modos, incluidos: (i) limitar el exceso molar del intermedio fármaco-conector (D-L) o el reactivo conector respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo de la reacción de conjugación o la temperatura; y (iii) condiciones reductoras parciales o limitadas para la modificación de la cisteína tiol.
Los aminoácidos de cisteína se pueden someter a ingeniería en sitios reactivos en un anticuerpo y que no forman puentes disulfuro intracatenarios o intermoleculares (Junutula, y col., 2008b Nature Biotech., 26 (8 ): 925-932/ Dornan y col (2009) Blood 114 (13) :2721-2729; documento US 7521541; documento US 7723485; documento WO2009/0522 9) . Las cisteína tioles sometidas a ingeniería pueden reaccionar con reactivos de engarce o los reactivos de engarce del fármaco de la presente invención que tienen grupos electrófilos reactivos con tiol, tal como maleimida o alfa-haloamidas para formar CAF con anticuerpos sometidos a ingeniería con cisteína y los restos de fármaco PBD. Por tanto, la localización del resto farmacológico puede diseñarse, controlarse y conocerse. La carga de fármaco se puede controlar, ya que los grupos de cisteína tiol sometidos a ingeniería normalmente reaccionan con reactivos de engarce reactivos con tiol o reactivos de engarce de fármaco con un rendimiento elevado. La ingeniería de un anticuerpo IgG para introducir un aminoácido de cisteína mediante sustitución en un único sitio en las cadenas pesada o ligera proporciona dos cisteínas nuevas en el anticuerpo simétrico. Se puede conseguir una carga de fármaco de casi 2 se puede conseguir y la casi homogeneidad del producto de conjugación CAF.
Cuando más de un grupo nucleófilo o electrófilo del anticuerpo reacciona con un intermedio conector con fármaco, o reactivo conector seguido del reactivo del resto farmacológico, el producto resultante es una mezcla de compuestos CAF con una distribución de restos de fármaco unidos a un anticuerpo, por ejemplo, 1, 2 ,3 etc. Los métodos de cromatografía líquida, tales como de fase inversa polimérica (PLRP) e interacción hidrófoba (HIC) pueden separar compuestos en la mezcla por valor de carga de fármaco. Las preparaciones de CAF con un valor único de carga de fármaco (p) se pueden aislar, no obstante, estos CAF de valor de carga único pueden ser mezclas heterogéneas porque los restos de fármaco pueden estar unidos, mediante el conector, en diferentes sitios sobre el anticuerpo.
Por tanto, las composiciones de conjugado de anticuerpo-fármaco de la invención incluyen mezclas de compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco en los que el anticuerpo tiene uno o más restos de fármaco de PBD y en las que los restos de fármaco pueden estar unidos al anticuerpo en varios residuos de aminoácidos.
En una realización, el número medio de grupos monoméricos o diméricos de pirrolobenzodiacepina por agente de unión a célula está en el intervalo de 1 a 20. En algunas realizaciones, el intervalo se selecciona de 1 a 8, de 2 a 8, de 2 a 6, de 2 a 4 y de 4 a 8.
En algunas realizaciones, hay un grupo monomérico o dimérico de pirrolobenzodiacepina por agente de unión a célula.
Péptidos En una realización, el agente de unión a célula es un péptido lineal o cíclico que comprende 4-20, preferentemente 6-20, residuos de aminoácidos contiguos. En esta realización, se prefiere que un agente de unión a célula esté unido a un compuesto monomérico o dimérico de pirrolobenzodiacepina.
En una realización, el agente de unión a célula comprende un péptido que se une a integrina a?ßß· El péptido puede ser selectivo para ?ßß sobre XYS .
En una realización, el agente de unión a célula comprende el polipéptido A20FMDV-Cys . El A20FMDV-Cys tiene la secuencia: NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC. Como alternativa se puede usar una variante de la secuencia A20FMDV-Cys en la que uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos de aminoácidos están sustituidos con otro residuo de aminoácido.
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; anticuerpo quimérico; anticuerpo humanizado; anticuerpo completamente humano o un anticuerpo monocatenario . En una realización, el anticuerpo es un fragmento de uno de estos anticuerpos que tienen actividad biológica. Ejemplos de dichos fragmentos incluyen fragmentos Fab, Fab1 , F(ab' )2 y Fv.
En estas realizaciones, cada anticuerpo puede estar unido a uno o varios grupos monoméricos o diméricos de pirrolobenzodiacepina . Las proporciones preferidas entre la pirrolobenzodiacepina y el agente de unión a célula se proporcionan anteriormente.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo de dominio (DAB) .
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
Los anticuerpos para usar en la presente invención incluyen los anticuerpos descritos en el documento WO 2005/082023 que se incorpora en el presente documento. Particularmente preferidos son los anticuerpos para antigenos asociados a tumores. Ejemplos de los antigenos conocidos en la técnica incluyen, entre otros, los antigenos asociados a tumores indicados en el documento WO 2005/082023. Véase, por ejemplo, las páginas 41-55.
Los conjugados de la invención están diseñados para dirigirse a células tumorales diana a través de sus antigenos de la superficie celular. Normalmente, los antigenos son antigenos de la superficie celular normales que se sobreexpresan o expresan en momentos anormales. Idealmente, el antigeno diana solo se expresa en células proliferativas (preferentemente células tumorales), no obstante, esto rata vez se observa en la práctica. Como resultado, los antigenos diana normalmente se seleccionan en base a la expresión diferencial entre tejido proliferativo y sano.
Se han producido anticuerpos frente a antigenos relacionados con tumores específicos de la diana, incluidos: Cripto, CD30, CD19, CD33, Glicoproteína N B, CanAg, Her2 (ErbB2/Neu) , CD56 (NCAM) , CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3) , CD79, CD138, PSCA, PSMA (antigeno de membrana específico de la próstata), BCMA, CD20, CD70, E-selectina, EphB2, Melanotransferina, Mucl6 y TMEFF2.
En la técnica se conocen antígenos asociados con tumores (AAT) y se pueden preparar para usar en la generación de anticuerpos usando procedimientos e información muy conocidos en la técnica. En intentos de descubrir dianas celulares eficaces para el diagnóstico y terapia del cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos transmembrana o, de otro modo, asociados con tumores que se expresan específicamente sobre la superficie de uno o más tipos concretos de células cancerosas en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, dichos polipéptidos asociados con tumores se expresan de forma más abundante sobre la superficie de las células cancerosas en comparación con sobre la superficie de las células no cancerosas. La identificación de dichos polipéptidos antigénicos de superficie celular asociados con tumores ha dado lugar a la capacidad de dirigirse específicamente a células cancerosas para la destrucción mediante terapias basadas en anticuerpos.
Ejemplos de AAT incluyen, entre otros, AAT (l)-(36) que se indican a continuación. Por comodidad, la información en relación de estos antígeno, todos ellos conocidos en la técnica, se indica a continuación e incluye nombres, nombres alternativos, números de registro en Genbank y referencia (s) primarias, siguiendo consensos de identificación de ácido nucleico y de proteínas del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) . Las secuencias de ácido nucleico y de proteínas correspondientes a los AAT (l)-(36) están disponibles en las bases de datos públicas, tales como GenBank. Los antígenos asociados a tumores a los que están dirigidos los anticuerpos incluyen variantes de secuencias de aminoácidos e isoformas que poseen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % respecto a las secuencias identificadas en las referencias citadas o que exhiben sustancialmente las mismas propiedades biológicas o características como un ATT que tiene una secuencia encontrada en las referencias citadas. Por ejemplo, un AAT que tiene una secuencia variante generalmente puede unirse a específicamente un anticuerpo que se une específicamente al ATT con la correspondiente secuencia indicada. Las secuencias y divulgación en la referencia citada específicamente en el presente documento se incorporan expresamente por referencia.
ANTÍGENOS ASOCIADOS CON TUMORES (l)-(36): (I) BMPR1B (receptor de proteina morfogenética ósea de tipo IB, N° de registro en Genbank NM_001203) ten Dijke, P., y col. Science 264 ( 5155 ): 101-104 (1994), Oncogene 14 (II) .1377-1382 (1997)); documento WO2004/063362 (Reivindicación 22); documento WO2003/042661 (Reivindicación 12); documento US2003/134790-A1 (Páginas 38-39); documento WO2002/102235 (Reivindicación 13; Página 296); documento WO2003/055443 (Página 91-92); documento O2002/99122 (Ejemplo 2; Página 528-530); documento WO2003/029421 (Reivindicación 6); documento WO2003/024392 (Reivindicación 2; Fig 112); documento O2002/98358 (Reivindicación 1; Página 183); documento WO2002/54940 (Página 100-101); documento WO2002/5937 (Página 349-350); documento WO2002/30268 (Reivindicación 27; Página 376); documento O2001/48204 (Ejemplo; Fig 4); NP_001194 receptor de proteina morfogenética ósea de tipo IB /pid=NP_001194.1. Referencias cruzadas: IM: 603248; NP_001194.1; AY065994 (2) E16 (LATI, SLC7A5, n° de registro en Genbank NM_003486) Biochem. Biophys . Res. Comm n. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 ( 6699 ): 288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., y col. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16) : 11267-11273) ; documento WO2004/048938 (Ejemplo 2); documento WO2004/032842 (Ejemplo IV); documento WO2003/042661 (Reivindicación 12); documento WO2003/016475 (Reivindicación 1); documento WO2002/78524 (Ejemplo 2); documento WO2002/99074 (Reivindicación 19; Página 127-129); documento WO2002/86443 (Reivindicación 27; Páginas 222, 393); documento WO2003/003906 (Reivindicación 10; Página 293); documento WO2002/64798 (Reivindicación 33; Página 93-95); documento WO2000/14228 (Reivindicación 5; Página 133-136); documento US2003/224454 (Fig 3); documento WO2003/025138 (Reivindicación 12; Página 150); NP_003477 familia del transportador de solutos 7 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+) , miembro 5 /pid=NP_003477.3 - Homo sapiens; Referencias cruzadas: MIM: 600182; NP_003477.3; N _015923; NM_003486_1 (3) STEAP1 (seis antigenos epiteliales transmembrana de la próstata, n° de registro en Genbank NM_012449); Cáncer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., y col. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 96 (25) : 14523-14528 ) ; documento WO2004/065577 (Reivindicación 6) ; documento WO200 /027049 (Fig 1L) ; EP1394274 (Ejemplo 11); documento O2004 /016225 (Reivindicación 2); documento WO2003/042661 (Reivindicación 12); documento US2003/157089 (Ejemplo 5); documento US2003/185830 (Ejemplo 5); documento US2003/064397 (Fig 2); documento WO2002/89747 (Ejemplo 5; Página 618-619); documento WO2003/022995 (Ejemplo 9; Fig 13A, Ejemplo 53; Página 173, Ejemplo 2; Fig 2A) ; NP_036581 seis antigenos epiteliales transmembrana de la próstata; Referencias cruzadas: MIM: 604415; NP_036581.1; NM_012449_1 (4) 0772P (CA125, MUC16, n° de registro en Genbank AF361486) ; J. Biol. Chem. 276 (29) : 27371-27375 (2001)); documento WO2004/045553 (Reivindicación 14); documento WO2002/92836 (Reivindicación 6; Fig 12) ; documento O2002/83866 (Reivindicación 15; Página 116-121); documento US2003/124140 (Ejemplo 16); Referencias cruzadas: GI:34501467; AA 74120.3; AF361486_1 (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina, n° de registro en Genbank NM_005823) Yamaguchi, N . , y col. Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20) : 11531-11536 (1999) , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37 ): 21984-21990 (1995)); documento O2003/101283 (Reivindicación 14); (documento WO2002/102235 (Reivindicación 13; Página 287-288); documento WO2002/101075 (Reivindicación 4; Página 308-309); documento WO2002/71928 (Página 320-321); documento WO94/10312 (Página 52-57); Referencias cruzadas: MIM: 601051; NP_005814.2; NM_005823_1 (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2 , familia de transportadores de soluto 34 (fosfato sódico), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, n° de registro en Genbank NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22) :19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., y col. (1999) Biochem. Biophys . Res. 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(2000) DNA Res. 7 (2 ): 143-150) ; documento WO2004/000997 (Reivindicación 1); documento O2003/003984 (Reivindicación I) ; documento O2002/06339 (Reivindicación 1; Página 50); documento WO2001/88133 (Reivindicación 1; Página 41-43, 48-58); documento O2003/054152 (Reivindicación 20); documento WO2003/101400 (Reivindicación 11); Registro: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC: 10737 (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN ADNc 2700050C12, gen RIKEN ADNc 2700050C12, n° de registro en Genbank AY358628); Ross y col. 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EMBL; M11761; AAA35808.1 (18) NCA (CEACAM6, n° de registro Genbank M18728); Barnett T., y col. Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., y col. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 99:16899-16903, 2002; documento WO2004/063709; documento EP1439393 (Reivindicación 7); documento WO2004/044178 (Ejemplo 4); documento WO2004/031238 ; documento O2003/042661 (Reivindicación 12); documento WO2002/78524 (Ejemplo 2); documento O2002/86443 (Reivindicación 27; Página 427); documento WO2002/60317 (Reivindicación 2); Registro: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728 (19) MDP (DPEP1, N° de registro en Genbank BC017023) ; Proc. Nati. Acad. Sci . 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El anticuerpo parental también puede ser una proteina de fusión que comprende una secuencia peptidica de unión a albúmina (ABP) (Dennis y col. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; documento WO 01/45746) . Los anticuerpos de la invención incluyen las proteínas de fusión con secuencias de ABP como se describe en: (i) Dennis y col. (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 en las Tablas III y IV, página 35038; (ii) documento US 2004/0001827 en
[0076]; y (iii) documento WO 01/45746 en las páginas 12-13, todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia.
En una realización, el anticuerpo se ha producido destinado al antigeno relacionado con tumoral a?ßd: El agente de unión a célula está conectado al conector. En una realización, el agente de unión a célula está conectado con A, cuando está presente, del conector .
En una realización, la conexión entre el agente de unión a célula y el conector es a través del enlace tioéter .
En una realización, la conexión entre el agente de unión a célula y el conector es a través del enlace disulfuro • En una realización, la conexión entre el agente de unión a célula y el conector es a través del enlace amida .
En una realización, la conexión entre el agente de unión a célula y el conector es a través del enlace éster .
En una realización, la conexión entre el agente de unión a célula y el conector se forma entre un grupo tiol de un residuo de cisteina del agente de unión a célula y un grupo maleimida del conector.
Los residuos de cisteina del agente de unión a célula puede estar disponible para reacción con el grupo funcional de RL para formar una conexión. En otras realizaciones, por ejemplo, cuando el agente de unión a célula es un anticuerpo, los grupos tiol del anticuerpo pueden participar en los puentes disulfuro intercatenarios . Estos enlaces intercatenarios pueden convertirse en grupos tiol libres mediante, por ejemplo, tratamiento del anticuerpo con DTT antes de la reacción con el grupo funcional de RL.
El agente de unión a célula se puede marcar para, por ejemplo, ayudar a la detección o purificación del agente, antes de la incorporación como conjugado o como parte del conjugado. El marcador puede ser un marcador de biotina. En otra realización, el agente de unión a célula puede marcarse con un radioisótopo.
R y R' En una realización, R se selecciona independientemente entre grupos alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, heterociclilo C3-20 y grupos C5-20. Cada uno de estos grupos se define en la sección de sustituyentes posterior.
En una realización, R es alquilo C1-12 sustituido opcinonal e independientemente .
En una realización, R es heterociclilo C3-20 sustituido opcinonal e independientemente.
En una realización, R es arilo Cs-2o sustituido opcinonal e independientemente .
En una realización, R es alquilo Ci_i2 sustituido opcinonal e independientemente .
Se describen anteriormente en relación a R2 diversas realizaciones relacionadas con grupos alquilo y arilo preferidos y la indentidad y número de sustituyentes opcionales. Las preferencias establecidas para R2 según se aplican a R pueden aplicarse, cuando sea adecuado, a todos los grupos R, por ejemplo, cuando R6, R7, R8 o R9 es R.
Las preferencias para R también se aplican a R' .
En algunas realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto que tiene un grupo sustituyente -NRR' . En una realización, R y R' , junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico opcionalmente sustiutido de 4, 5, 6 ó 7 miembros. El anillo puede contener un heteroátomo adicional, por ejemplo N, 0 o S.
En una realización, el anillo heterocíclico está sustituido en sí mismo con un grupo R. Cuando un heteroátomo N adicional está presente, el sustituyente puede estar en el heteroátomo N.
R " R" es un grupo alquileno C3-12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, estando dichos anillos opcionalmente sustituidos. En una realización, R" es un grupo alquileno C3-12, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina.
En una realización, el grupo alquileno está opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos seleccionados entre 0, S, y NMe y/o anillos aromáticos, estando dichos anillos opcionalmente sustituidos.
En una realización, el anillo aromático es un grupo arileno C5-20, en el que arileno se refiere a un grupo divalente obtenido por la retirada de dos átomos de hidrógeno de dos átomos aromáticos en el anillo de un compuesto aromático, teniendo dicho restp de 5 a 20 átomos en el anillo.
En una realización, R" es un grupo alquileno C3-12 pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos con NH2.
En una realización, R" e im grupo alquileno C3-12.
En una realización, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3/ C5, C7, Cg y Cu.
En una realización, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3, C5 y C7.
En una realización, R" se selecciona entre un grupo alquileno c3 y c5.
En una realización, R" es un grupo alquileno C3.
En una realización, R" es un grupo alquileno C5.
Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, estando dichos anillos opcionalmente sustituidos.
Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina.
Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden ser grupos alquileno alifáticos lineales sin sustituir.
X En una realización, X se selecciona entre 0, S o N(H).
Preferentemente, X es 0.
A-A, B-A, C-A, D-A y E-A Los compuestos de fórmula A-A, B-A, C-A, D-A y E-A tienen un grupo R2 que con R1 o R3, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, forman un anillo benceno opcionalmente sustituido. El anillo benceno opcionalmente sustituido puede considerarse como condensado al anillo C de la pirrolobenzodiazepina . El anillo benceno condensado puede denominarse como el anillo D ring. La estructura del anillo condensado se ilustra a continuación: R1 y R2 R3 y R4 en las que cada uno de D1, D2, D3 y D4 representa H o un sustituyente .
En una realización, el anillo benceno está sin sustituir.
En una realización, el anillo benceno está opcionalmente sustituido con uno, dos, tres o cuatro grupos seleccionados entre OH, CN, R, OR, 0-S02-R, C02R, COR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo.
En una realización, el anillo benceno está monosustituido . El monosustituyente puede ser uno cualquiera de D1, D2, D3 o D4 (siendo el resto H) . En una realización el anillo benceno está sustituido en D2 y D1, D3 y D4 son cada uno H. En una realización, el anillo benceno está sustituido en D3, y D1, D2 y D4 son cada uno H.
En una realización, R2 con R1, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, forman un anillo benceno opcionalmente sustituido.
Las preferencias para V y W se exponen más adelante.
?-?, B-B, C-B, D-B y E-B En una realización, U es CH2, cuando T es NR, BH, SO o S02. En una realización, T es CH2 o CO cuando U es NR, O o S.
En una realización, T se selecciona entre CH2 y CO.
En una realización, U se selecciona entre NR, O y S.
En una realización, Y es (CH2)n, en la que n es 1 ó 2.
En una realización, el anillo C del compuesto A-B tiene una estructura seleccionada entre las que se muestran a continuación : V y W cada uno de V y W se seleccionan entre (CH2)n, 0, S, NR, CHR y CRR' cuando n es 2,3 ó 4, excepto que V sea C cuando R1 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido, y W sea C cuando R3 y R2, junto con átomos de carbono del anillo C al que están unidos, formen un anillo benceno opcionalmente sustituido.
En una realización, cuando uno de V y W es C, el otro de V y W se selecciona entre CH2 y NR.
En una realización, cuando uno de V y W es C, el otro de V y W es CH2.
Compuestos diméricos En una realización, el conjugado del primer aspecto de la invención, cada uno del compuesto C, compuesto D y compuesto E es un dimero .
Conjugados En una realización, el conjugado es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) .
En una realización, el compuesto dimérico es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) y el compuesto que tiene la estructura que se muestra a continuación: AA en la que R2", R6", R7", R9", R10", X", Q" y R11" y son como se definen de acuerdo R2, R6, R7, R9, R10, X y R11, respectivamente .
En una realización, el conjugado es un dímero, siendo cada monómero de la fórmula (A) , y teniendo el compuesto la estructura que se muestra a continuación: AB en la que R2", R6", R7", R9", X", Q" y R11" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, X y R11 respectivamente, y Rc es un grupo de terminación. En esta realización, cada grupo R10 es un engarce conectado a un agente de unión a célula.
En una realización, el conjugado es un dímero, siendo un monómero de la fórmula (A) y siendo el otro de la fórmula (B) .
En una realización, el conjugado es un dímero, siendo un monómero de la fórmula (A) y siendo el otro de la fórmula (B) , y teniendo el compuesto la estructura que se muestra a continuación : AC en la que R2", R6", R7", R9", X" y R11" y son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, X, y R11 respectivamente .
En una realización, el conjugado es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) , y los grupos R2, R6, R9, X, R11 y R7 y R8 cuando sea adecuado, son iguales.
En una realización, el compuesto es un dimero, siendo cada monómero de fórmula (A) , los grupos R2, R6, R9, X, R11, R10, y R7 y R8 cuando es adecudo, son iguales. Dicho compuesto puede denominarse como un dimero simétrico.
En una realización, el conjugado es un dimero, siendo un monómero de la fórmula (A) y siendo el otro de la fórmula (B) , y los grupos R2, R6, R9, y R7 y R8 cuando es adecuado, de (A) son iguales que los grupos del compuesto (B) .
Para cada uno de los compuestos diméricos anteriores, un monómero de fórmula (A) o (B) puede estar reemplazado por un monómero de fórmula (A-I) o (B-I) como se describen en el presente documento.
Compuesto C En una realización, el compuesto C es un dimero.
En una realización, el compuesto C tiene la estructura que se muestra a continuación: en la que R2", R6", R7 ', R9" y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9 y X respectivamente.
Compuesto D En una realización, el compuesto D es un dimero.
En una realización, el compuesto D tiene la estructura que se muestra a continuación: en la que R , R , R , R , Q", R 11 y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, Q, R11 y X respectivamente .
Compuesto E En una realización, el compuesto E es un dimero.
En una realización, el compuesto E tiene la estructura que se muestra a continuación: en la que R2 ", R6", R7 ", R9 ', R11", RL", Q" y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, R11, RL y X respectivamente .
En una realización, el compuesto E tiene la estructura que se muestra a continuación: en la que R2 ', R6", R7", R9", R11", Q" y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, R11, y X respectivamente. R° es un grupo de terminación.
En una realización, el compuesto E tiene la estructura que se muestra a continuación: en la que R2", R6", R7", R9" y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9 y X respectivamente.
Compuestos monoméricos En una realización, el conjugado del primer aspecto de la invención, compuesto C, compuesto D y compuesto E son monómeros .
En una realización, un conjugado o compuesto de fórmula (C) , (D) o (E) puede estar reemplazado por un monómero de fórmula (A-I), (C-I), (D-I) o (E-I) como se describen en el presente documento .
Rc, Grupo de Terminación El conjugado del primer aspecto de la invención puede tener un grupo de terminación Rc en la posición N10. El compuesto E puede tener un grupo de terminación Rc.
En una realización, en la que el conjugado es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) , el grupo R10 en una de las unidades monoméricas es un grupo de terminación Rc o es un grupo R10.
En una realización, cuando el conjugado es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (A) , el grupo R10 en una de las unidades monoméricas es un grupo de terminación Rc.
En una realización, cuando el compuesto E es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (E) , el grupo RL en una de las unidades monoméricas es un grupo de terminación Rc o es un engarce para la conexión a un agente de unión a célula. En una realización, cuando el compuesto E es un dimero, siendo cada monómero de la fórmula (E) , el grupo RL en una de las unidades monoméricas es un grupo de terminación Rc.
EL grupo Rc puede eliminarse de la posición N10 del resto PBD para dejar un enlace N10-imina Cll, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, en la que QR11 es OSO3 , un aducto de bisulfito, una tiocarbinolamina, una tiocarbinolamina sustituida o una carbinalamina sustituida.
En una realización, Rc, puede ser un grupo protector que puede eliminarse para dejar un NlO-enlace imina Cll, una carbinolamina, una cabinolamina sustituida, o, cuando QR11 es OSO3M, un aducto de bisulfito. En una realización, Rc es un grupo protector que puede eliminarse para dejar un NlO-enlace imina Cll.
Se pretende que el grupo Rc puede eliminarse en las mismas condiciones que las que se necesitan para eliminar el grupo R10, por ejemplo para producir un NlO-enlace de imina Cll, una carbinolamina y asi sucesivamente. El grupo de terminación actúa como un grupo protector para la funcionalidad pretendida en la posición N10. Se pretende que el grupo de terminación no sea reactivo hacia un agente de unión a célula. Por ejemplo, Rc no es lo mismo que RL.
Pueden usarse que tiene un grupo de terminación como intermedios en la síntesis de dímeros que tengan un monómero de imina. Como alternativa, pueden usarse compuestos que tienen un grupo de terminación como conjugados, en los que el grupo de terminación se elimina en la localización diana para producir una imina, una carbinolamina, una cabinolamina sustituida y asi sucesivamente. Por lo tanto, en esta realización, el grupo de terminación puede denominarse como un grupo protector de nitrógeno eliminable terapéuticamente, como se define en la solicitud anterior de los inventores O 00/12507.
En una realización, el grupo Rc puede eliminarse en las condiciones que escinden el engarce RL del grupo R10. Por lo tanto, en una realización, el grupo de terminación puede escindirse mediante la acción de una enzima.
En una realización alternativa, el grupo de terminación puede eliminarse antes de la conexión al engarce RL al agente de unión a célula. En esta realización, el grupo de terminación puede eliminarse en condiciones que no escinden el engarce RL.
Cuando un compuesto incluyen un grupo funcional G1 para formar una conexión al agente de unión a célula, el grupo de terminación puede eliminarse antes de la adición o desenmascarado de G1.
EL grupo de terminación puede usarse como parte de una estrategia de grupo protector para asegurar que sólo una de las unidades monoméricas en un dimero esté conectada a un agente de unión a célula.
El grupo de terminación puede usarse como una máscara para un N10-enlace imina Cll. El grupo de terminación puede eliminarse en un momento tal que que la funcionalidad imina se necesite en el compuesto. El grupo de terminación también es una máscara para una carbinolamina, una cabinolamina sustituida y un aducto de bisulfito, como se ha descrito anteriormente .
Rc puede ser un grupo protector de N10, tal como los grupos descritos en la solicitud anterior de los inventores, O 00/12507. En una realización, Rc es un grupo protector de nitrógeno eliminable terapéuticamente, como se define en la solicitud anterior de los inventores, WO 00/12507.
En una realización, Rc es un grupo protector de carbamato. En una realización, el grupo protector de carbamato se selecciona entre: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ.
Opcionalmente, el grupo protector de carbamato se selecciona adicionalmente entre Moc.
En una realización, Rc es un grupo de engarce RL que carece del grupo funcinal para la conexión al agente de unión a célula .
La presente solicitud se refiere particularmente a aquellos grupos Rc que son carbamatos.
En una realización, R° es un grupo: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, G2 es un grupo de terminación, L3 es un enlace covalente o es un engarce escindible L1, L2 es un enlace covalente o junto con OC(=0) forma un engarce de auto-destrucción .
Cuando L3 y L2 son ambos enlaces covalente, G2 y OC(=0) forman juntos un grupo protector de carbamato como se ha definido anteriormente .
L1 es como se ha definido anteriormente en relación a R10.
L2 es como se ha definido anteriormente en relación a R10.
Diversos grupos de terminación se describen a continuación, incluyendo los basados en grupos protectores bien conocidos. En una realización L3 es un engarce escindible L1, y L2, junto con OC(=0), forma un engarce de auto-destrucción. En esta realización, G2 es Ac (acetilo) o Moc, o un grupo protector de carbamato seleccionado entre: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ .
Opcionalmente, el grupo protector de carbamato se selecciona adicionalmente entre Moc.
En otra realización, G2 es un grupo acilo -C(=0)G3, en el que G3 se selecciona entre alquilo (incluyendo cicloalquilo, alquenilo y alquinilo) , heteroalquilo, heterociclilo y arilo (incluyendo heteroarilo y carboarilo) . Estos grupos pueden estar opcionalmente sustituidos. El grupo acilo junto con un grupo amino de L3 o L2, cuando sea adecuado, pueden formar un enlace de amida. EL grupo acilo junto con un grupo hidroxi de L3 o L2, cuando sea adecuado, puede formar un enlace de éster.
En una realización, G3 es heteroalquilo. El grupo heteroalquilo puede comprender polietilenglicol . El grupo heteroalquilo puede tener un heteroátomo, tal como 0 o N, adyacente al grupo acilo, formando de esta manera un grpo carbamato o carbonato, cuando sea adecuado, con un heteroátomo presente en el grupo L3 o L2, cuando sea adecuado. En una realización, G3 se selecciona entre NH2, NHR y NRR' . Preferentemente, G3 es NRR' .
En una realización G2 es el grupo: en el que el asterisco indica el punto de unión a L3, n es de 0 a 6 y G4 se selecciona entre OH , OR, SH , SR , COOR , CONH2 , CONHR , CONRR' , NH2 , NHR, NRR' , N02 y halo. Los grupos OH , SH, NH2 y NHR están protegidos. En una realización, n es de 1 a 6 y preferentemente n es 5. En una realización, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR' . En una realización, G4 es OR, SR, y NRR' . Preferentemente G4 se selecciona entre OR y NRR' , lo más preferido G4 es OR. Más preferentemente G4 es OMe .
En una realización, el grupo G2 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L3, y n y G4 son como se han definido anteriormente.
En una realización, el grupo G2 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L3, n es 0 ó 1, m es de 0 a 50, y G4 se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' , NH2, NHR, NRR' , N02 y halo. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 2, preferentemente de 4 a 8, y lo más preferido 4 u 8. En otra realización, n es 1 y m es de 10 a 50, preferentemente de 20 a 40. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una realización, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR' . En una realización, G4 es OR, SR, y NRR' . Preferentemente G4 se selecciona entre OR y NRR' , lo más preferido G4 es OR. Preferentemente G4 es OMe.
En una realización, el grupo G2 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L y n, m y G4 son como se han definido anteriormente.
En una realización, el grupo G2 es: en el que n es 1-20, m es 0-6 y G se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR' , N02 y halo. En una realización, n es 1-10. En otra realización, n es de 10 a 50, preferentemente de 20 a 40. En una realización, n es 1. En una realización, m es 1. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una realización, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR' . En una realización, G4 es OR, SR, y NRR' . Preferentemente G4 se selecciona entre OR y NRR' , lo más preferido G4 es OR. Preferentemente G4 es OMe.
En una realización, el grupo G2 es: en el que el asterisco indica el punto de unión a L y n, m y G4 son como se han definido anteriormente.
En cada una de las realizaciones anteriores G4 puede ser OH, SH, NH2 y NHR. Prefermetemente, estos grupos están protegidos. En una realización, OH está protegido con Bzl, TBDMS o TBDPS. En una realización, SH está protegido con Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl- e o Trt.
En una realización, NH2 o NHR están protegidos con Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z o Alloc.
En una realización, el grupo G2 está presente junto con un grupo L3, siendo dicho grupo un dipéptido.
No se prentende que el grupo de terminación se conecte al agente de unión a célula. Por lo tanto, el otro monómero presente en el dimero sirve como el punto de conexión al agente de unión a célula mediante un engarce. Por consiguiente, se prefiere que la funcionalidad presente en el grupo de terminación no esté disponible para reacción con un agente de unión a célula. Por lo tanto, prefieren evitarse grupos funcionales reactivos, tales como OH, SH, NH2, COOH.
Sin embargo, dicha funcionalidad puede estar presente en el grupo de terminación si se protege, como se ha descrito anteriormente .
En la preparación de los compuestos de la invención, el grupo de terminación puede usarse para preparar un engarce RL.
Una realización ejemplar de un compuesto conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) , y un resto de fármaco PBD (PBD) en el que el anticuerpo está unido mediente un resto de enfarce (L) a PBD; teniendo la composición la fórmula: Ab-(L-PBD)P en la que p es un número entero de 1 a aproximadamente 8, y representa la carga de fármaco. Si Ab es un anticuerpo diseñado de cisteina, el número de estos de fármaco que que pueden conjugarse mediante un resto de engarce reactivo de tio a una molécula de anticuerpo está limitado por el número de residuos de cisteina que se introducen mediante los procedimientos descritos en el presente documento. Por tanto, los ADC ejemplares comprenden anticuerpos que tienen 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos diseñados de cisteina.
Compuestos Preferidos En una realización, el conjugado es un dimero en el que cada uno de los monómeros tiene un grupo metileno C2, es decir, cada R2 es =CH2. Se prefiere que el agente de unión a célula sea un anticuerpo.
En otra realización, el conjugado es un dimero en el que cada uno de los monómeros tiene un grupo arilo C2, es decir, cada R2 es arilo C5-2o opcionalmente sustituido. Se prefiere que el agente de unión a célula sea un anticuerpo.
Alquileno C2 En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1 y L2 son como se han definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1, L2 y G2 son como se han definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
Para cada uno de los compuestos anteriores, las siguientes preferencias pueden aplicarse, cuando sea adecuado: n es 0; n es 1; RE es H; RE es RD, en el que RD es alquilo opcionalmente sustituido; RE es RD, en el que RD es metilo; CBA es un anticuerpo; CBA es un péptido cíclico; L1 es o comprende un dipéptido; L1 es (H2N) -Val-Ala- (CO) o (H2N) -Phe-Lys- (CO) , en el que (H2N) y (CO) indican los terminales N y C respectivos; L2 es p-aminobencileno; G2 se selecciona entre Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ.
Las siguiente prefencias también pueden aplicarse, además de las preferencias anteriores: G2 es: en el que el asterisco indica el punto de unión terminal N de L1; A es : en el que el asterisco indica el punto de unión al terminal N de L1, la línea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula y m es 4 u 8; en el que el asterisco indica el punto de unión al terminal N de L1, la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, y m es 4 u 8.
En una realización particularmente preferida, n es 1; RE es H; CBA es un anticuerpo; L1 es (H2N) -Val-Ala- (CO) o (H2N)-Phe-Lys- (CO) , en los que (H2N) y (CO) indican los terminales N y C respectivos; L2 es p-aminobencileno; G2 es: en el que el asterisco indica el punto de unión terminal N de L1; y A es en el que el asterisco indica el punto de unión al terminal N de L1, y la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula.
Arilo C2 En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1 y L2 son como se han definido anteriormente. Cada uno de Ar1 y Ar2 are es arilo C5-20 sustituido opcinonal e independientemente, y n es 0 ó 1. Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1, L2 y G2 son como se han definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5-20 sustituido opcinonal e independientemente y n es 0 ó 1.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1 es como se ha definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5-20 sustituido opcinonal e independientemente y n es 0 ó 1.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1 es como se ha definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5_2o sustituido opcinonal e independientemente y n es 0 ó 1.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5-20 sustituido opcinonal e independientemente y n es 0 ó 1.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5-20 sustituido opcinonal e independientemente y n es 0 ó 1.
En una realización, Ar1 y Ar2 en cada una de las realizaciones anteriores, se selecciona cada uno independientemente entre fenilo, furanilo, tiofenilo y piridilo opcionalmente sustituido.
En una realización, Ar1 y Ar2 en cada una de las realizaciones anteriores es fenilo opcionalmente sustituido.
En una realización, Ar1 y Ar2 en cada una de las realizaciones anteriores es tiofen-2-ilo o tiofen-3-ilo opcionalmente sustituido.
En una realización, Ar1 y Ar2 en cada una de las realizaciones anteriores es quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido .
El grupo quinolinilo o isoquinolinilo puede estar enlazado al núcleo de PBD a través de cualquier posición del anillo disponible. Por ejemplo, el quinolinilo puede ser quinolin-2-ilo, quínolin-3-ilo, quinolin-4ilo, quinolin-5-ilo, quinolin-6-ilo, quinolin-7-ilo y quinolin-8-ilo . De estos, pueden preferirse quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo . El isoquinolinilo puede ser isoquinolin-l-ilo, isoquinolin-3-ilo, isoquinolin-4ilo, isoquinolin-5-ilo, isoquinolin-6-ilo, isoquinolin-7-ilo e isoquinolin-8-ilo. De estos, pueden preferirse isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo .
Vinilo C2 En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1 y L2 son como se han definido anteriormente, RV1 y Rv2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pudiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6 , y n es 0 ó 1, Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1, L2 y G2 son como se han definido anteriormente, Rvl y Rv2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5_6, y n es 0 ó 1, Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1 es como se ha definido anteriormente, Rl y Rv2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo Cs-6 , y n es 0 ó 1, Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, L1 es como se ha definido anteriormente, Rvl y Rv2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6 , y n es 0 ó 1, Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico, y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, Rvl y Rv2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6 y n es 0 ó 1, Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el conjugado es un compuesto: en el que CBA es un agente de unión a célula, tal como un anticuerpo o un péptido lineal o cíclico y n es 0 ó 1. L1 es como se ha definido anteriormente, Rvl y Rv2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6, y n es 0 ó 1, Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes.
En algunas de las realizaciones anteriores, Rvl y Rv2 pueden seleccionarse independientemente entre H, fenilo y 4-fluorofenilo .
Intermedios Preferidos La presente invención también proporciona intermediates para su uso en la preparación de los compuestos conjugados que se describen en el presente documento.
Se describen a continuación intermedios preferidos y se corresponden estrechamente con los conjugados preferidos descritos anteriormente.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que n es 0 ó 1, G1, L1 y L2 son como se han definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que G1, L1 y L2 son como se han definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5-20 sustituido opcinonal e independientemente, y n es 0 ó 1. Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que G1, L1 y L2 son como se han definido anteriormente, Rvl y R2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6, y n es 0 ó 1 R VI V2 y R pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que n es es como se ha definido anteriormente y cada uno de R R " se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que L1 es como se ha definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5_2o sustituido opcinonal e independientemente y n es 0 ó 1.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que L1 es como se ha definido anteriormente, y R VI y Rv2 se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6 y n es 0 ó 1. Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes. En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que n es O ó 1. L es como se ha definido anteriormente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente entre H o RD.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que n es 0 ó 1. L es como se ha definido anteriormente, cada uno de Ar1 y Ar2 es arilo C5-20 sustituido opcinonal e independientemente y n es 0 ó 1.
En una realización, el intermedio es un compuesto: en el que L1 es como se ha definido anteriormente, Rvl y RV£ se seleccionan independientemente entre H, metilo, etilo y fenilo (pupdiendo estar el fenilo opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6 y n es 0 ó 1. Rvl y Rv2 pueden ser iguales o diferentes. Sustituyentes La expresión "opcionalmente sustituido", como se usa en el presente documento, se refier a un grupo precursor que puede estar sin sustituir o que puede estar sustituido.
A menos que se especifique otra cosa, el término "sustituido", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo precursor que porta uno o más sustituyentes . El término "sustituyente" se usa en el presente documento en el sentido convencional y se refiere a un resto químico que está unido covalentemente a, o si fuera adecuado, condensado a, un grupo precursor. Se conocen bien una amplia variedad de sustituyentes y también se conocen bien procedimientos para su formación e introducción en una diversidad de grupos precursores.
En una realización preferida, los sustituyentes descritos en el presente documento (que incluyen sustituyentes opcionalmente) se limitan a aquellos grupos que no son reactivos con un angente de unión a célula. El engarce al agente de unión a célula en el presente caso se forma a partir de la posición N10 del compuesto PBD a través de un grupo de engarce (que comprende, por ejemplo, L1, L2 y A) al agente de unión a célula. Los grupos funcionales reactivos localizados en otras partes de la estructura de PBD pueden ser capaces de formar enlaces adicionales al agente de unión a célula (esto puede denominarse como reticulación) . Estos enlaces adicoinales pueden alterar el transporte y la actividad biológica del conjugado. Por lo tanto, en alguna realización, los sustituyentes adicionales se limitan a los que carecen de funcionalidad reactiva.
En una realización, los sustituyentes se seleccionan entre el grupo que consiste en R, OR, SR, NRR' , N02, halo, C02R, COR, CONH2, CONHR y CONRR' .
En una realización, los sustituyentes se seleccionan entre el grupo que consiste en R, OR, SR, NRR', N02, C02R, COR, CONH2, CONHR y CONRR' .
En una realización, los sustituyentes se seleccionan entre el grupo que consiste en R, OR, SR, NRR', N02 y halo.
En una realización, los sustituyentes se seleccionan entre el grupo que consiste en R, OR, SR, NRR' y N02.
Una cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente puede aplicarse a uno cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento. Como alternativa, los sustituyentes pueden seleccionarse entre uno cualquiera o mas de los grupos enumerados a continuación.
A continuación se describen con mayor detalle ejemplos de sustituyentes.
Alquilo Ci-12 : La expresión "C1-12 alquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono de un compuesto hidrocarburo que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, que puede ser alifático o aliciclico, y que puede ser saturado o insaturado (por ejemplo, parcialmente insaturado, totalmente insaturado) . Por lo tanto, el término "alquilo" incluye las subclases alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, etc., expuestas a continuación.
Los ejemplos de grupos alquilo saturados incluyen, pero sin limitación, metilo (Ci) , etilo (C2) , propilo (C3) , butilo (C4) , pentilo (C5) , hexilo (C6) y heptilo (C7) .
Los ejemplos de grupos alquilo lineales saturados incluyen, pero sin limitación, metilo (Ci) , etilo (C2) , n-propilo (C3) , n-butilo (C4) , n-pentilo (amilo) (C5) , n-hexilo (C6) y n-heptilo (C7) .
Los ejemplos de grupos alquilo ramificados saturados incluyen iso-propilo (C3) , iso-butilo (C4) , sec-butilo (C4) , terc-butilo (C ) , iso-pentilo (C5) y neo-pentilo (C5) .
Un grupo alquilo puede estar opcoinalmente interrumpido por uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N(H) y S. Dichos grupos puede denominarse como "heteroalquilo" .
Heteroalquilo C2-20: La expresión "heteroalquilo C2-12 ", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono de un compuesto hidrocarburo que tiene de 2 a 12 átomos de carbono, uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N(H) y S, preferentemente O y S.
Los ejemplos de grupos heteroalquilo incluyen, pero sin limitación los que comprenden una o más unidades de etilenglicol del tipo -(OCH2CH2)-. El terminal de un grupo heteroalquilo puede ser la forma primaria de un heteroátomo, por ejemplo -OH, -SH o -NH2. En una realización preferida, el terminal es -CH3.
Alquenilo C2-12: La expresión "alqueniloC2-i2 "/ como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono.
Los ejemplos de grupos alquenilo insaturados incluyen, pero sin limitación, etenilo (vinilo, -CH=CH2) , 1-propenilo (-CH=CH-CH3) , 2-propenilo (alilo, -CH-CH=CH2) , isopropenilo ( 1-metilvinilo, -C (CH3) =CH2) , butenilo (C4) , pentenilo (C5) y hexenilo (Ce) · Alquinil C2-i2: La expresión "alquinilo C2-i2 ", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono.
Los ejemplos de grupos alquinilo insaturados incluyen, pero sin limitación, etinilo (-C=CH) y 2-propinilo (propargilo, -CH2-C=CH) .
Cicloalquilo C3-12 : La expresión "cicloalquilo C3-12 ", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo que también es un grupo ciclilo; es decir, un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de anillo aliciclico de un compuesto hidrocarburo cíclico (carbocíclico) , teniendo dicho resto de 3 a 7 átomos de carbono, incluyendo de 3 a 7 átomos en el anillo .
Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de: compuestos de hidrocarburo monocíclico saturado: ciclopropano (C3) , ciclobutano (C4) , ciclopentano (C5) , ciclohexano (C6) , cicloheptano (C7) , metilciclopropano (C4) , dimetilciclopropano (C5) , metilciclobutano (C5) , dimetilciclobutano (Ce) , metilciclopentano (C6) , dimetilciclopentano (C7) y metilciclohexano (C7) ; compuestos de hidrocarburo monociclco insaturado: ciclopropeno (C3) , ciclobuteno (C4), ciclopenteno (C5) , c clohexeno {Cs) , metilciclopropeno (C4) , dimetilciclopropeno (C5) , metilciclobuteno (C5) , dimetilciclobuteno (C6) , metilciclopenteno (Ce) , dimetilciclopenteno (C7) y metilciclohexeno (C7) / y compuestos de hidrocarburo policiclico saturado: norcarano (C7) , norpinano (C7) , norbornano (C7) .
Heterociclilo C3-20: La expresión "Heterociclilo C3-20"/ como se usa en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación un átomo de hidrógeno de un átomo del anillo de un compuesto heterociclico, teniendo dicho resto de 3 a 20 átomos en el anillo, de los que de 1 a 10 son heteroátomos en el anillo. Preferentemente, cada anillo tiene de 3 a 7 átomos en el anillo, de los que de 1 a 4 son heteroátomos en el anillo. En este contexto, los subfijos (por ejemplo, C3-20/ C3_7, C5-6, etc.) indican el número de átomos en el anillo, o intervalo de número de átomos en el anillo, tanto átomos de carbono como heteroátomos. Por ejemplo, la expresión "heterociclilo C5-6", como se usa en la presente memoria, se refiere a un grupo heterociclilo que tiene 5 ó 6 átomos en el anillo.
Los ejemplos de grupos heterociclilo monociclicos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de: Ni: aziridina (C3) , azetidina (C ) , pirrolidina (tetrahidropirrol) (C5) , pirrolina (por ejemplo, 3-pirrolina, 2, 5-dihidropirrol) (C5) , 2H-pirrol o 3H-pirrol (isopirrol, isoazol) (C5) , piperidina {Ce) , dihidropiridina (C6) , tetrahidropiridina (C6) , azepina (C7) ; Oi: oxirano (C3) , oxetano (C4) , oxolano ( tetrahidrofurano) (C5) , oxol (dihidrofurano) (C5) , oxano ( tetrahidropirano) (?ß) , dihidropirano (C6) , pirano (C6) , oxepina (C7) ; Si: tiirano (C3) , tietano (C4) , tiolano ( tetrahidrotiofeno) (C5) , tiano (tetrahidrotiopiran) (C6) , tiepano (C7) ; O2: dioxolano (C5) , dioxano (C6) y dioxepano (C7) ; 03: trioxano (C^) ; N2: imidazolidina (C5) , pirazolidina (diazolidina) (C5) , imidazolina (C5) , pirazolina (dihidropirazol) (C5) , piperazina (C6) ; 1O1: tetrahidrooxazol (C5) , dihidrooxazol (C5) , tetrahidroisoxazol (C5), dihidroisoxazol (C5) , morfolina (C6) , tetrahidrooxazina (C&) , dihidrooxazina (C6) , oxazina (C6) ; 1S1: tiazolina (C5) , tiazolidina (C5) , tiomorfolina (C6) ? N20i : oxadiazina (Ce) ; O1S1: oxatiol (C5) y oxatiano (tioxano) {Cs) ; y, N1O1S1: oxatiazina (C6) .
Los ejemplos de grupos heterociclilo monocíclicos sustituidos incluyen los obtenidos a partir de sacáridos, en forma cíclica, por ejemplo, furanosas (C5) , tales como arabinofuranosa, lixofuranosa, ribofuranosa y xilofuransa, y piranosas (Ce) , tales como alopiranosa, altropiranosa, glucopiranosa, mannopiranosa, gulopiranosa, idopiranosa, galactopiranosa, y talopiranosa .
Arilo C5-20'. La expresión "arilo C5-20"/ como se usa en la presente memoria, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación un átomo de hidrógeno de un átomo de anillo aromático de un compuesto aromático, teniendo dicho resto de 3 a 20 átomos en el anillo. Preferentemente, cada anillo tiene de 5 a 7 átomos en el anillo.
En este contexto los subfijos (por ejemplo, C3-20 / Cs-7/ C5-6 , etc.) indican el número de átomos en el anillo, o intervalo del número de átomos en el anillo, tanto átomos de carbono como heteroátomos . Por ejemplo, la expresión "arilo C5-6 " , como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo arilo que tiene 5 ó 6 átomos en el anillo.
Los átomos en el anillo pueden ser todos átomos de carbono, como en "grupos carboarilo".
Los ejemplos de grupos carboarilo incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de benceno (es decir fenilo) (0d) , naftaleno (Cío) , azuleno (Cío) antraceno ( C14 ) , fenantreno ( C14 ) , naftaceno (Ci8) y pireno (Ci6) .
Los ejemplos de grupos arilo que comprenden anillos condensados, siendo al menos uno de los mismos aromático, incluyen, pero sin limitación, grupos obtenidos a partir de indano (por ejemplo, 2, 3-dihidro-lH-indeno) (Cg) , indeno (Cg) , isoindeno (Cg) , tetralina (1, 2, 3, 4-tetrahidronaftaleno (Ci0) , acenafteno ( C12 ) , fluoreno ( C13 ) , fenaleno ( C13 ) , acefenantreno ( C15 ) y aceantreno (Ci6) .
Como alternativa, los átomos en el anillo pueden incluir uno o más heteroátomos, como en "grupos heteroarilo" . Los ejemplos de grupos heteroarilo monociclicos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de: Ni: pirrol (azol) (C5) , piridina (azina) (C6) ; Oí: furano (oxol) (C5) ; Si: tiofeno (tiol) (C5) ; Nid: oxazol (C5) , isoxazol (C5), isoxazina (Ce) ; 2O1: oxadiazol (furazano) (C5) ; 3O1: oxatriazol (C5) ; 1S1: tiazol (C5) , isotiazol (C5) ; N2: imidazol (1,3-diazol) (C5) , pirazol (1,2-diazol) (C5) , piridazina (1, 2-diazina) {Ce) , pirimidina ( 1, 3-diazina) (C6) (por ejemplo, citosina, timina, uracilo) , pirazina (1, -diazina) (C6) / N3: triazol (C5) , triazina (0¾) ; y N4: tetrazol (C5) .
Los ejemplos de heteroarilo que comprenden anilos condensados, incluyen, pero sin limitación: Cg (con 2 anillos condensados) obtenido a partir de benzofurano (Oí) , isobenzofurano (Oí) , indol (??) , isoindol (Ni), indolizina (Ni), indolina (Ni), isoindolina (Ni), purina (N4) (por ejemplo, adenina, guanina), benzoimidazol (N2) , indazol (N2) , benzoxazol (N1O1) , benzoisoxazol (N1O1) , benzodioxol (02) , benzofurazano (N2Oi) , benzotriazol (N3) , benzotiofurano (Si) , benzotiazol (N1S1) , benzotiadiazol (N2S) / Cío (con 2 anillos condensados) obtenidos a partir de cromeno (Oí) , isocromeno (Oí) , cromano (Oí) , isocromano (Oí) , benzodioxano (02) , quinolina (Ni) , isoquinolina (Ni) , quinolizina (Ni) , benzoxazina (N1O1) , benzodiazina (N2) , piridopiridina (N2) , quinoxalina (N2) , quinazolina (N2) , cinnolina (N2) , ftalazina (N2) , naftiridina (N2) , pteridina (N4) ; C (con 2 anillos condensados) obtenidos a partir de benzodiazepina (N2) ; C13 (con 3 anillos condensados) obtenidos a partir de carbazol (Ni), dibenzofurano (Oí) , dibenzotiofeno (Si), carbolina (N2) , perimidina (N2) , piridoindol (N2) ; y, C14 (con 3 anillos condensados) obtenios a partir de acridina (N2) , xanteno (??) , tioxanteno (Si) , oxantreno (02) , fenoxatiina (O1S1) , fenazina (N2) , fenoxazina ( 1O1) , fenotiazina (NiSi) , tiantreno (S2) , fenantridina (Ni), fenantrolina (N2) , fenazina (N2) .
Los grupos canteriores, tanto solos o como parte de otros sustituyente, pueden estar en si mismos sustituidos con uno o más grupos seleccionados entre ellos mismos y los sustituyentes adicionales que se enumeran a continuación.
Halo: -F, -Cl, -Br y -I.
Hidroxi: -OH. Éter: -OR, en el que R es un sustituyente de éter, por ejemplo, un grupo alquilo Ci-7 (también denominado como un grupo alcoxi Ci_7, descrito más adelante), un grupo heterociclilo C3-2o (también denominado como un grupo heterocicliloxi C3_2o) , o un grupo arilo C5-20 (también denominado como un grupo ariloxi C5-20) r preferentemente un grupo alquilo C1-7.
Alcoxi: -OR, en el que R es un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo Ci-7. Los ejemplos de grupos alcoxi Ci_7 incluyen, pero sin limitación, -OMe (metoxi) , -OEt (etoxi), -O(nPr) (n-propoxi), -O(iPr) (isopropoxi) , -O(nBu) (n-butoxi) , -O(sBu) (sec-butoxi) , -O(iBu) (isobutoxi) y-O(tBu) (terc-butoxi) .
Acetal: -CH (OR1) (OR2) , en el que R1 y R2 son independientemente sustituyentes acetal, por ejemplo, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3_2o o un grupo arilo C5-20r preferentemente un grupo alquilo Ci_7, o, en el caso de un grupo acetal "cíclico", R1 y R2, tomados junto con los dos átomos de oxigeno a los que están unidos, y los átomos de carbono a los que están unidos, forman un anillo heterociclico que tiene de 4 a 8 átomos en el anillo. Los ejemplos de grupos acetal incluyen, pero sin limitación, -CH(OMe)2, -CH(OEt)2, y -CH (OMe) (OEt) .
Hemiacetal: -CH(OH) (OR1) , en el que R1 es un sustituyente de hemiacetal, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-2o o un grupo arilo Cs-20r preferentemente un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos hemiacetal incluyen, pero sin limitación, -CH(OH) (OMe) y -CH (OH) (OEt ) .
Cetal: -CR (OR1) (OR2) , en el que R1 y R2 con como se ha definido para acétales, y R es un sustituyente de cetal distinto de hidrógeno, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-20 ° un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo Cx-7. Los ejemplos de grupos cetal incluyen, pero sin limitación, -C (Me) (OMe) 2, -C (Me) (OEt) 2, -C (Me) (OMe) (OEt) , -C (Et ) (OMe) 2, -C(Et) (0Et)2 y -C (Et) (OMe) (OEt) .
Hemicetal: -CR (OH) (OR1) , en el que R1 es como se ha definido para hemiacetales y R es un sustituyente hemicetal distinto de hidrógeno, por ejemplo, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20 preferentemente un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos hemiacetal incluyen, pero sin limitación, -C(Me) (OH) (OMe), C (Et) (OH) (OMe) , -C (Me) (OH) (OEt ) y -C (Et ) (OH) (OEt) .
Oxo (ceto, -ona) : =0.
Tiona (tiocetona) : =S.
Imino (imina): =NR, en el que R es un sustituyente de imino, por ejemplo, hidrógeno, grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20/ preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo C1-7. Los ejemplos de grupos éster incluyen, pero sin limitación, =NH, =NMe, =NEt y =NPh.
Formilo (carbaldehido, carboxaldehido) : -C(=0)H.
Acilo (ceto) : -C(=0)R, en el que R es un sustituyente de acil, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7 (también denominado como alquiladlo Ci_7 o alcanoilo Ci_7) , un grupo heterociclilo C3-20 (también denominado como heterociclilacilo C3-20) / 0 un grupo arilo C5-20 (también denominado como arilacilo C5-20) , preferentemente un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos acilo incluyen, pero sin limitación, -C(=0)CH3 (acetilo), -C(=0)CH2CH3 (propionilo) , -C (=0) C (CH3) 3 (t-butirilo) y -C(=0)Ph (benzoilo, fenona) .
Carboxi (ácido carboxilico) : -C(=0)0H.
Tiocarboxi (ácido tiocarboxilico) : -C(=S)SH.
Tiolocarboxi (ácido tiolocarboxilico): -C(=0)SH.
Tionocarboxi (ácido tionocarboxilico): -C(=S)0H. Ácido imidico: -C(=NH)0H. Ácido hidroxámico: -C(=N0H)0H. Éster (carboxilato, éster de ácido carboxilico, oxicarbonilo) : -C(=0)OR, en el que R es un sustituyente de éster, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo Ci-7. Los ejemplos de grupos éster, pero sin limitación, -C(=O)0CH3, -C (=0) OCH2CH3, -C (=0) OC (CH3) 3 y -C(=0)0Ph.
Aciloxi (éster inverso): -0C(=0)R, en el que R es un sustituyente de aciloxi, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7/ un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20/ preferentemente un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos aciloxi incluyen, pero sin limitación, -0C(=0)CH3 (acetoxi) , -OC(=0)CH2CH3, -OC(=0)C(CH3)3, -OC(=0)Ph y -OC (=0) CH2Ph .
Oxicarboiloxi : -OC(=0)OR, en el que R es un sustituyente de éster, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 y un grupo heterociclilo C3-2o o un grupo arilo C5-2o/ preferentemente un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos éster incluyen, pero sin limitación, -OC(=0)OCH3, -OC (=0) OCH2CH3, -OC(=0)OC(CH3)3 y -0C(=0)0Ph.
Amino: -NR3^2, en el que R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo Ci_7 (también denominado como alquilamino C1-7 o di-alquilamino C1-7) , un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20f preferentemente H o un grupo alquilo Ci-7, o, en el caso de un grupo amino "ciclcio", R1 y R2, tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico que tiene de 4 a 8 átomos en el anillo. Los grupos amino pueden ser primarios (-NH2) , secundarios (-NHR1) o terciarios (-NHR1R2) y e forma catiónica, pueden ser cuaternarios (-+NR1R2R3) . Los ejemplos de grupos amino incluyen, pero sin limitación, -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 y -NHPh. Los ejemplos de grupos amino cíclicos incluyen, pero sin limitación, aziridino, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino y tiomorfolino .
Amido (carbamoílo, carbamilo, aminocarbonilo, carboxamida) : -C(=0)NR1R2, en el que R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se ha definido para los grupos amino. Los ejemplos de grupos amido incluyen, pero sin limitación, -C(=0)NH2, -C(=0)NHCH3, -C (=0) N (CH3) 2, -C(=0)NHCH2CH3 y -C (=0) N (CH2CH3) 2, así como grupos amido en los que R1 y R2, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman una estructura heterociclica como en, por ejemplo, piperidinocarbonilo, morfolinocarbonilo, tiomorfolinocarbonilo y piperazinocarbonilo.
Tioamido (tiocarbamilo) : -C(=S)NR1R2, en el que R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se ha definido para grupos amino. Los ejemplos de grupos amido incluyen, pero sin limitación, -C(=S)NH2, -C(=S) NHCH3 , -C(=S)N(CH3)2 y -C (=S)NHCH2CH3.
Acilamido (acilamino) : -NR1C(=0)R2, en el que R1 es un sustituyente de amida, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo i-lf un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo Ci-7 y R2 es un sustituyente de acilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-2o, preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos acilamida incluyen, pero sin limitación, -NHC(=0)CH3 , -NHC (=0) CH2CH3 y -NHC(=0)Ph. R1 y R2 pueden formar juntos una estructura cíclica, como en, por ejemplo, succinimidilo, maleimidilo y ftalimidilo: succinimidilo maleimidilo ftalimidilo Aminocarboniloxi : -0C (=0) NR1R2, en el que R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se ha definido para grupos amino. Los ejemplos de grupos aminocarboniloxi incluyen, pero sin limitación, -0C(=0)NH2, -0C(=0)NHMe, -0C(=0)NMe2 y -0C(=0)NEt2.
Ureido: -N (R1) CONR2R3, en el que R2 y R3 son independientemente sustituyentes de amino, como se ha definido para grupos amino y R1 es un sustituyente de ureido, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos ureido incluyen, pero sin limitación, -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, N eCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2 y -NMeCONEt2.
Guanidino: -NH-C (=NH) NH2.
Tetrazolilo: un anillo aromático de cinco miembros que tiene cuatro átomos de nitrógeno y un átomo de carbono, Imino: =NR, en el que R es un sustituyente de imino, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-2o o un grupo arilo C5-20, preferentemente H o un grupo alquilo Ci-7. Los ejemplos de grupos imino incluyen, pero sin limitación, =NH, =NMe y =NEt .
A idina (amidino) : -C(=NR)NR2, en el que cada R es un susituyente de amidina, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20Í preferentemente H o un gruop alquilo Ci-7. Los ejemplos de grupos amidina incluyen, pero sin limitación, -C(=NH)NH2, -C(=NH)N e2 y -C (=NMe) Me2.
Nitro: -N02.
Nitroso: -NO.
Azido: -N3.
Ciano (nitrilo, carbonitrilo) : -CN.
Isociano: -NC.
Cianato: -OCN.
Isocianato: -NCO.
Tiociano (tiocianato) : -SCN.
Isotiociano (isotiocianato) : -NCS.
Sulfhidrilo (tiol, mercapto) : -SH.
Tioéter (sulfuro) : -SR, en el que R es un sustituyente tioéter, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 (también denominado como un grupo alquiltio C1-7) , un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Los ejemplos de grupos alquiltio C1-7 incluyen, pero sin limitación, -SCH3 y -SCH2CH3, Sisulfuro: -SS-R, en el que R es un sustituyente disulfuro, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo Ci_7 (también denominado en el presente documento como sidulfuro de alquilo C1-7 ) . Los ejemplos de grupos disulfuro de alquilo C1-7 incluyen, pero sin limitación, -SSCH3 y -SSCH2CH3.
Sulfina (sulfinilo, sulfóxido) : -S(=0)R, en el que R es un sutituyente de sulfina, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-2o o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Los ejemplos de grupos sulfina incluyen, pero sin limitación, -S(=0)CH3 y -S (=0)CH2CH3, Sulfona (sulfonilo) : -S(=0)2 , en el que R es un sustituyente de sulfona, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3_2o o un grupo arilo C$-2o, preferentemente un grupo alquilo C1-7, incluyendo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 fluorado o perfluorado. Los ejemplos de grupos sulfona incluyen, pero sin limitación, -S(=0)2CH3 (metanosulfonilo, mesilo) , -S(=0)2CF3 (triflilo) , -S (=0) 2CH2CH3 (esilo) , -S(=0)2C4F9 (nonaflilo) , -S (=0) 2CH2CF3 (tresilo) , -S (=0) 2CH2CH2 H2 (taurilo) , -S(=0)2Ph (fenilsulfonilo, besilo) , 4-metilfenilsulfonilo (tosilo) , 4-clorofenilsulfonilo (closilo) , 4-bromofenilsulfonilo (brosilo) , 4-nitrofenilo (nosilo) , 2-naftalenosulfonato (napsilo) y 5-dimetilamino-naftalen-l-ilsulfonato (dansilo) . Ácido sulfinico (sulfino) : -S(=0)0H, -S02H. Ácido sulfónico (sulfo) : -S(=0)20H, -S03H.
Sulfinato (éster de ácido sulfínico) : -S(=0)0R; en el que R es un sustituyente sulfinato, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20/ preferentemente un grupo alquilo alquilo C1-7. Los ejemplos de grupos sulfinato incluyen, pero sin limitación, -S(=0)0CH3 (metoxisulfinilo; sulfinato de metilo) y -S (=0) OCH2CH3 (etoxisulfinilo; sulfinato de etilo) .
Sulfonato (éster del ácido sulfónico): -S(=0)20R, en el que R es un sustituyente de sulfonato, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-.20 o un grupo arilo C5-20? preferentemente un grupo alquilo C1-7. Los ejemplos de grupos sulfonato incluyen, pero sin limitación, -S(=0)2OCH3 (metoxisulfonilo; sulfonato de metilo) y -S (=0) 2OCH2CH3 (etoxisulfonilo; sulfonato de etilo) .
Sulfiniloxi: -0S(=0)R, en el que R es un sustituyente sulfiniloxi, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos sulfiniloxi incluyen, pero sin limitación, -0S(=0)CH3 y -OS (=0) CH2CH3.
Sulfoniloxi: -0S(=0)2R, en el que R es un sustituyente de sulfoniloxi, por ejemplo, un grupo alquilo Ci_7 un grupo heterociclilo 03-2? o un grupo arilo C5_2o, preferentemente un grupo alquilo Ci_7. Los ejemplos de grupos sulfoniloxi incluyen, pero sin limitación, -OS(=0)2CH3 (mesilato) y -OS (=0) 2CH2CH3 (esilato) .
Sulfato: -0S(=0)20R; en que R es un sustituyente de sulfato, por ejemplo, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3_ 20 o un grupo arilo Cs-2o, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Los ejemplos de grupos sulfato incluyen, pero sin limitación, -OS(=O)20CH3 y -SO (=0) 2OCH2CH3.
Sulfamilo (sulfamoílo; amida del ácido sulfinico; sulfinamida) : -S(=0)NR1R2, en el que R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se ha definido para grupos amino. Los ejemplos de grupos sulfamilo incluyen, pero sin limitación, -S(=0)NH2, -S (=0) H (CH3) , -S(=0)N(CH3)2, -S (=0)NH(CH2CH3) , -S (=0) N (CH2CH3) 2 y -S (=0) NHPh . Sulfonamido (sulfinamoilo; amida del ácido sulfónico; sulfonamida) : -S (=0) 2NR1R2, en el que R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se ha definido para grupos amino. Los ejemplos de grupos sulfonamido incluyen, pero sin limitación, -S(=0)2NH2, -S(=0)2NH(CH3) , -S(=0)2N(CH3)2, -S (=0) 2NH (CH2CH3) , -S (=0) 2N (CH2CH3) 2 y -S(=0)2NHPh.
Sulfamino: -NRXS (=0) 20H, en el que R1 es un sustituyente de amino, como se ha definido para grupos amino. Los ejemplos de grupos sulfamino incluyen, pero sin limitación, -NHS(=0)20H y -N(CH3)S(=0)2OH.
Sulfonamino: -NR1S(=0)2R, donde R1 is an amino substituent, como se ha definido para amino groups, y R is a sulfonamino substituent, por ejemplo, a Ci_7 alquilo group, a C3-2o heterociclilo group, o a Cs-2o arilo group, preferentemente a Ci_ alquilo group. Ejemplos of sulfonamino groups incluyen, pero sin limitación, -NHS(=0)2CH3 y -N (CH3) S (=0) 2C6H5, Sulfinamino: -NR1S(=0)R, en el que R1 es un sustituyente de amino, como se ha definido para grupos amino y R es un sustituyente de sulfinamino, por ejemplo, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo Ci-7. Los ejemplos de grupos sulfinamino incluyen, pero sin limitación, -NHS(=0)CH3 y -N(CH3)S(=0)C6H5.
Fosfino (fosfina) : -PR2, en el que R es un sustituyente de fosfino, por ejemplo, -H, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo Cs-2o, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Los ejemplos de grupos fosfino incluyen, pero sin limitación, -PH2, -?((¾)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2 y -P(Ph)2.
Fosfo: -P(=0}2.
Fosfinilo (óxido de fosfina) : -P(=0)R2, en el que R es un sustituyente de fosfinilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-2o o un grupo arilo C5-2o, preferentemente un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Los ejemplos de grupos fosfinilo incluyen, pero sin limitación, -P(=0) (CH3)2, -P(=0) (CH2CH3)2, -P(=0) (t-Bu)2 y-P(=0) (Ph)2. Ácido fosfinico (fosfono) : -P(=0) (0H)2.
Fosfonato (éster de fosfono) : -P(=0) (0R)2, en el que R es un sustituyente de fosfonato, por ejemplo, -H, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-2o, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Los ejemplos de grupos fosfonato incluyen, pero sin limitación, -P (=0) (0CH3) 2, -P (=0) (OCH2CH3) 2, -P (=0) (0-t-Bu) 2 y -P (=0) (0Ph)2. Ácido fosfórico (fosfonooxi) : -OP (=0) (OH) 2.
Fosfato (éter fosfonooxi: -OP(=0) (OR)2, en el que R es un sustituyente de fosfato, por ejemplo, -H, un grupo alquilo Ci_ , un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5_2o, preferentemente -H, un grupo alquilo Ci_7 o un grupo arilo C5-20- Los ejemplos de grupos fosfato incluyen, pero sin limitación, -0P(=0) (OCH3)2, -0P(=0) (OCH2CH3)2, -0P(=0) (0-t-Bu)2 y -0P(=0) (0Ph)2. Ácido fosforoso: -0P(0H)2.
Fosfito: -0P(0R)2, en el que R es un sustituyente de fosfito, por ejemplo, -H, un grupo alquilo Ci_7, un grupo heterociclilo C3-2o o un grupo arilo C5-20/ preferentemente -H, un grupo alquilo Ci_7 o un grupo arilo 05-20· Los ejemplos de grupos fosfito incluyen, pero sin limitación, -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -0P(0-t-Bu)2 y -0P(0Ph)2.
Fosforamidita: -OP (OR1) -NR22, en el que R1 y R2 son sustituyentes de fosforamidita, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7 (opcionalmente sustituido) , un grupo heterociclilo C3_2o o un grupo arilo C5-20; preferentemente -H, un grupo alquilo Ci_7 o un grupo arilo C5-.20. Los ejemplos de grupos fosforamidita incluyen, pero sin limitación, -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP (OCH2CH3) -N ( i-Pr ) 2 y -OP (OCH2CH2CN) -N(i-Pr)2.
Fosforamidato: -OP (=0) (OR1) -NR22, en el que R1 y R2 son sustituyentes de fosforamidato, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7 (opcionalmente sustituido) , un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20/ preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-2o- Los ejemplos de grupos fosforamidato incluyen, pero sin limitación, -0P(=0) (OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP (=0) (OCH2CH3) -N (i-Pr) 2 y -0P(=0) (OCH2CH2CN) -N (i-Pr)2.
Alquileno Alquileno C3-12 : La expresión "alquileno C3-12 "/ como se usa en la presente memoria, se refiere a un resto bidentato obtenido mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno, ambos del mismo átomo de carbono, o uno de cada uno de dos átomos de carbono diferentes, de un compuesto hidrocarburo que tiene de 3 a 12 átomos de carbono (a menos que se indique otra cosa) , que puede ser alifático o aliciclico y que puede estar saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado. Por lo tanto, el término "alquileno" incluye las subclases alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, etc., que se describen a continuación.
Los ejemplos de grupos alquileno C3-12 saturados lineales incluyen, pero sin limitación, -(CH2)n- en las que n es un número entero de 3 a 12, por ejemplo, -CH2CH2CH2- (propileno) , -CH2CH2CH2CH2- (butileno), -CH2CH2CH2CH2CH2- (pentileno) y -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- (heptileno) .
Los ejemplos de grupos alquileno C3-12 saturados ramificados incluyen, pero sin limitación, -CH (CH ) CH2- , -CH (CH3) CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH (CH3) CH2-, -CH2CH (CH3) CH2CH2-, -CH(CH2CH3)-, -CH(CH2CH3)CH2- y -CH2CH (CH2CH3) CH2- .
Los ejemplos de gruupos alquileno C3-12 parcialmente insaturados lineales (grupos alquenileno y alquinileno C3_i2) incluyen, pero sin limitación, -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH- , -CH=CH-CH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH=CH- , -CH=CH-CH2-CH2-CH=CH- y -CH2-C=C-CH2- .
Los ejemplos de grupos alquileno C3-12 parcialmente insaturados ramificado (grupos alquenileno y alquinileno C3-12) incluyen, pero sin limitación, -C(CH3)=CH-, -C(CH3) =CH-CH2-, -CH=CH-CH(CH3) - y -C=C-CH (CH3) - .
Los ejemplos de grupos alquileno C3-12 alicíclicos saturados (cicloalquilenos C3-12) incluyen, pero sin limitación, ciclopentileno (por ejemplo, ciclopent-1, 3-ileno) y ciclohexileno (por ejemplo, ciclohex-1 , -ileno) .
Los ejemplos de grupos alquileno C3-12 parcialmente insaturados alicíclicos (cicloalquilenos C3-12) incluyen, pero sin limitación, ciclopentenileno (por ejemplo, 4-ciclopenten-1, 3-ileno), ciclohexenileno (por ejemplo, 2-ciclohexen-l, 4-ileno; 3-ciclohexen-l , 2-ileno; 2 , 5-ciclohexadien-l , 4-ileno) . Incluye Otras Formas A menos que se especifique otra cosa, se incluyen en lo anterior formas iónicas, sales, solvatos y protegidas bien conocidas de estos sustituyentes . Por ejemplo, una referencia a ácido carboxílico (-COOH) también incluye la forma aniónica (carboxilato) (-C00-) , una sal o solvato del mismo, así como formas protegidas convencionales. De forma análoga, un areferencia a un grupo amino incluye la forma protonada (-N+HR1R2) , una sla o solvato del grupos aimno, por ejemplo, una sal clorhidrato, así como formas protegidas convencionales de un grupo amino. De forma análoga, una referencia a un grupo hidroxilo también incluye la forma aniónica (-0-) , una sal o solvato del mismo, así como formas protegidas convencionales.
Sales Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar y/o manejar una sal correspondiente del compuesto activo, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Se describen ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables en Berge y col., J. Phacm. Sci., 66, 1-19 (1977).
Por ejemplo, si el compuesto es aniónico o tiene un grupo funcional que pueda ser aniónico (por ejemplo, -COOH puede ser -C00-) , después una sal puede formarse con un catión adecuado. Los ejemplos de cationes adecuados incluyen, pero sin limitación, iones de metal alcalino, tales como Na+ y K+, cationes alcalinotérreos, tales como Ca2+ y Mg2+, y otros cationes, tales como Al+3. Los ejemplos de cationes orgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, ion amonio (es decir NH4+) e iones amonio sustituidos (por ejemplo, NH3R+, H2R2+? NHR3+, NR4+) . Son ejemplos de algunos iones amonio sustituidos adecuados los que se obtienen a partir de: etilamina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, bencilamina, fenilbencilamina, colina, meglumina y trometamina, asi como aminoácidos, tales como lisina y arginina. Un ejemplo de un ion amonio cueternario común es N(CH3)4+.
Si el compuesto es catiónico o tiene un grupo funcional que pueda ser catiónico (por ejemplo, -NH2 puede ser -NH3+) , entonces una sal puede formarse con un anión adecuado. Los ejemplos de aniones inorgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de los siguientes ácidos inorgánicos: clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, sulfúrico, sulfurous, nítrico, nitroso, fosfórico y fosforoso.
Los ejemplos de aniones orgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de los siguientes ácidos orgánicos: 2-acetyoxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, canforsulfónico, cinámico, cítrico, edético, etanodisulfónico, etanosulfónico, fumárico, glucheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, hidroximaleico, hidroxinaftaleno carboxílico, isetiónico, láctico, lactobiónico, laurico, maleico, málico, metanosulfónico, múcico, oleico, oxálico, palmitico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fenilsulfónico, propiónico, pirúvico, salicilico, esteárico, succínico, sulfanilico, tartárico, toluenosulfónico, ácido trifluoroacético y valérico. Los ejemplos de aniones orgánicos poliméricos adecuados incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de los siguientes ácidos poliméricos: ácido tánico, carboximetil celulosa.
Solvatos Puede ser vonveniente o deseable preparar, purificar y/o manejar un solvato correspondiente del compuesto activo. El término "solvate" se usa en el presente documento en el sentido convencional para referirse a un complejo de un soluto (por ejemplo, compuesto activo, sal de compuesto activo) y u disolvente. Si el disolvente es agua, el solvato puede denomiarse convenientemente como hidrato, por ejemplo, un mono-hidrato, un di-hidrato, un tri-hidrato, etc.
La invención incluye compuestos en los que el disolvente se añade a través del enlace de imina del resto PBD, que se ilustra a continuación, en el que el disolvente es agua o un alcohol (R¾OH, donde RA es Ci_4 alquil) : ES tas formas pueden llamarse las formas éter de carbinolamina y carbinolamina del PBD (como se describe en sección relacionada con R10 anterior) . El balance de estos equilibrios dependde de las condiciones en que los compuestos se encuentren, asi como de la naturaleza del resto en si mismo .
Estos compuestos particulares pueden aislarse en forma sólida, por ejemplo, por liofilización .
Isómeros Ciertos compuestos de la invención pueden existir en una o más formas geométricas, ópticas, enantioméricas, diastereoméricas, epiméricas, atrópicas, estereoisoméricas, tautoméricas , conformacionales o anoméricas particulares, incluyendo, pero sin limitación, formas cis y trans; formas E y Z; formas c, t y r; formas endo y exo; formas R, S y meso; formas D y L; formas d y 1; formas ( + ) y (-) ; formas ceto, enol y enolato; formas syn y anti; formas sinclinales y anticlinales; formas y ß; formas axiales y ecuatoriales; formas de bote, de silla, torcidas, cubiertas y de semisilla; y combinaciones de los mismos, en lo sucesivo denominadas en su conjunto como "isómeros" (o "formas isoméricas").
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de so puperponerse al compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que pueden superponerse sobre su comoañero de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tiene nidéntica contitución química, pero se diferencian con respecto a la disposición de los átomos de carbono o grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen difementes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Pueden separarse mezclas de diastereómeros con procedimientos analítidos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatografía .
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que no son imágenes especulares que puedan superponerse entre sí.
Las definiciones estereoquímicas y convenciones usadas generalmente en el presnente documento aparecen a continuación S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y ilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994. Los compuestos de la invención pueden contener centros asimétricos o quirales, y por tanto existen en formas estereoisoméricas diferentes. Se pretenden que todas las formas estereoisoméricas de los compuestos de la invención, incluyendo, pero sin limitación, diastereómeros, enantiómeros y atropisómeros, así como mezclas de los mismos, tales como mezclas racémicas, formen parte de la presente invención. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar en el plano del plano de luz polarizada. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula entorno a su centro o centros quirales. Los prefijos d y 1 o ( + ) y (-) se emplean para designar el sentido de giro del plano de la luz polariza por el compuesto, significando con (-) o 1 que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto porque son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero también puede denominarse como un enantiómero y una mezcla de dichos isómeros se llama comúnmente mezcla enantiomérica . Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina como una mezcla racémica o un racemato, que pueden aparecer cuando no hubo estereoselección o estereospecificidad en una reacción o procedimiento químico. Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, carentes de actividad óptica.
Debe observaarse que, excepto como se ha descrito anteriormente para formas tautoméricas, se excluyen específicamente del término "isómeros", como se usa en la presente memoria, isómeros estructurales (o constitucionales) (es decir isómeros que se diferencian en las conexiones entre átomos en vez de únicamente en la posición de los átomos en el espacio) . Por ejemplo, una referencia a un grupo metoxi, -OCH3, no debe interpretarse como una referencia a su isómero estructural, un grupo hidroximetilo, -CH2OH. De forma análoga, una referecia a orto-clorofenilo no debe interpretarse como una referencia a su isómero estructural, meta-clorofenilo . Sin embargo, una referencia a una clase de estructuras muy bien puede incluir formas estructuralmente isoméricas que entren dentro de dicha clase (por ejemplo, alquilo C1-7 incluye n-propilo e iso-propilo butilo incluye n-, iso-, sec- y tere-butilo; metoxifenilo incluye orto-, meta- y para-metoxifenilo) .
La excepción anterior no se refier a formas tautoméricas, por ejemplo, formas ceto, enol y enolate, como en, por ejemplo, los siguientes pares tautoméricos : ceto/enol (ilustrados a continuación) , imina/enamina, amida/imino alcohol, amidina/amidina, nitroso/oxima, tiocetona/enetiol, N-nitroso/hiroxiazo y nitro/aci-nitro. ceto enol enolato El término "tautómero" o "forma tautomérica " se refiere isómeros estructurales de energías diferentes que pueden intercambiarse mediante una barrera de baja energía. Por ejemplo, los tautómero protónicos (también conocidos como tautómeros prototrópicos) incluyen interconversiones mediante migración de un protón, tal como isomerizaciones ceto-enol e imina-enamina . Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones por reorganización de algunos de los electrones de fijación.
Debe observarse que se incluyen específicamente en el término "isómero", compuestos con una o más sustituciones isotópicas. Por ejemplo, H puede estar en cualquier forma isotópica, incluyendo 1H, 2H (D) y 3H (T) ; C puede estar en cualquier forma isotópica, incluyendo 12C, 13C y 14C; 0 puede estar en cualquier forma isotópica, inluyendo 160 y 180; y similares. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro, tales como, pero sin limitación 2H (deuterio, D) , 3H (tritio), UC, 13R, 14R(_, 15M, 18,F-,, 31DP, 32DP, 35s-, 36Cl „y 125IT. Se iJ„nco-r„_p?or,,a= ?n, diversos compuestos marcados isotópicamente de la presente invención, por ejemplo aquellos en los que se incorporan isótopos radiactivos, tales como 3H, 13C y 14C. Dichos compuestos marcados isotópicamente pueden ser útiles en estudios metabólicos, estudios de cinética de reacción, técnicas de detección o formación de imágenes, tales como tomografia de emisión de positrones (PET) o tomografia computerizada de emisión de un solo fotón (SPECT) , incluyendo ensayos de distribución en tejido de fármaco o sustrato, o tratamientos radioactivos de pacientes. Los compuestos de la invención marcados con deuteroi o sustituidos terapéuticamente pueden tener propiedades de DMPK mejoradas (metabolismo de fármaco y farmacocineticas) , en relación a la distribución, metabolismo y excreción (ADME) . La sustitución con isótopos más pesados, tales como deuterio, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo mayor semi-vida in vivo o menos requisitos de dosificación. Un compuesto marcado con 18F puede ser útil para estudios PET o SPECT. Pueden prepararse compuestos marcados isotópicamente de la presente invención y profármacos de los mismos realizando los procedimientos desvelados en los esquemas o en los ejemplos y preparaciones que se describen más adelante mediante sustitución de un reactivo marcado isotópicamente fácilmente disponible por un reactivo no marcado isotópicamente. Además, la sustitución con isótopos más pesados, particularmente deuterio (es decir, 2H o D) puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, semivida in vivo aumentada o requerimientos de dosificación reducidos, o una mejora en el indica terapéutico. Se entiende que deuterio, en este contexto, se considera un sustituyente . La concentración de dicho isótopo más pesado, específicamente deuterio, puede definirse por un factor de enriquecimiento isotópico. En los compuestos de esta invención cualquier átomo que no se designe específicamente como un isótopo en particular pretende representar cualquier isótopo estable de dicha forma .
A menos que se especifique otra cosa, una referencia a un compuesto en particular incluye todas estas formas tautoméricas, incluyendo (total o parcialmente) racémicas y otras mezclas de las mismas. Los procedimientos para la preparación (por ejemplo, síntesis asimétrica) y separación (por ejemplo, cristalización fraccionada y medios cromatográficos) de dichas formas tatutoméricas se conocen en la técnica o pueden obtenerse fácilmente adaptando los procedimientos que se enseñan en el presente documento, o procedimientos conocidos, de una manera conocida.
Actividad biológica Ensayos de proliferación celular in vitro En general, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) se mide: exponiendo las células de mamífero que tienen proteínas receptoras, por ejemplo HER2, al anticuerpo del CAF en un medio de cultivo celular; cultivando las células durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días y midiendo la viabilidad celular. Los ensayos in vitro basados en células se usan para medir la viabilidad (proliferación) , la citotoxicidad y la inducción de apoptosis (activación de la caspasa) de un CAF de la invención.
La potencia in vitro de los conjugados fármaco-anticuerpo se pueden medir mediante un ensayo de proliferación celular. El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® está disponible comercialmente (Promega Corp., Madison, WI), método de ensayo homogéneo basado en la expresión recombinante de la luciferasa de Coleóptera (patentes de EE.UU. n° 5583024; 5674713 y 5700670). Este ensayo de proliferación celular determina el número de células viables en cultivo en base a la cuantificación del ATP presente, un indicador de células metabólicamente activas (Crouch y col. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; documento US 6602677). El ensayo CellTiter-Glo® se realiza en un formato de 96 pocilios, lo que lo hace favorable para la detección selectiva de alto rendimiento (HTS) (Cree y col. (1995) AntiCancer Drugs 6:39.8-404). El procedimiento de ensayo homogéneo implica añadir el único reactivo (reactivo CellTiter-Glo®) directamente a las células cultivadas en medio suplementado con suero. No se requieren etapas de lavado, eliminación del medio y múltiple pipeteo. El sistema detecta solo 15 células/pocilio en un formato de 384 pocilios en 10 minutos tras la adición del reactivo y el mezclado. Las células se pueden tratar de forma continua con CAF o se pueden tratar y separar de los CAF. En general, las células tratadas brevemente, es decir 3 horas, mostraron los mismos efectos de potencia que las células tratadas de forma continua.
El formato de "añadir-mezclar-medir" homogéneo tiene como resultado lisis celular y generación de una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. La cantidad de ATP es directamente proporcional al número de células presentes en cultivo. El ensayo CellTiter-Glo® genera una señal luminiscente de "tipo brillo" producida por la reacción de la luciferasa, que tiene una semivida generalmente superior a cinco horas, en función del tipo de célula y del medio usado. Las células viables se reflejan en unidades de luminiscencia relativa (ULR) . El sustrato, la luciferina de escarabajo, se descarboxila de forma oxidativa mediante la luciferasa de luciérnaga recombinante con conversión concomitante de ATP en A P y generación de fotones .
Eficacia in vivo La eficacia in vivo de los conjugados fármaco-anticuerpo (CAF) de la invención se puede medir mediante estudios de xenoinjerto tumoral en ratones. Por ejemplo, la eficacia in vivo de un anti-HER2 ADC de la invención se puede medir mediante un modelo en ratón de explante transgénico de alta expresión de HER2. Un aloinjerto se propaga desde el ratón transgénico Fo5 mmtv que no responde o responde mal a la terapia con HERCEPTIN®. Los sujetos fueron tratados una vez con CAF a ciertos niveles de dosis (mg/kg) y exposición al fármaco de PBD ( (pg/m2) ; y control con tampón placebo (vehículo) y monitorizados en dos semanas o más para medir el tiempo hasta la duplicación del tumor, el log de muerte celular y la disminución del tamaño del tumor.
Uso Los conjugados de la invención se pueden usar para proporcionar un compuesto de PBD en una localización diana. La localización diana es, preferentemente, una población de células proliferativas . El anticuerpo es un anticuerpo para un antigeno presente en una población de células proliferativas .
En una realización, el antigeno está ausente o presente a un nivel reducido en una población de células no proliferativas en comparación con la cantidad de antigeno presente en la población de células proliferativas , por ejemplo una población de células tumorales.
En la localización diana, el conector puede escindirse de modo que libere un compuesto de fórmula (D) . Por tanto, el conjugado de la invención se pueden usar para proporcionar de forma selectiva un compuesto de fórmula (D) en la localización diana.
El conector se puede escindir mediante una enzima presente en la localización diana.
La localización diana puede estar in vitro, in vivo o ex vivo.
Los compuestos del conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) de la invención incluyen aquéllos con utilidad para actividad anticancerosa. En particular, los compuestos incluyen un anticuerpo conjugado, es decir unido covalentemente a través de un conector, a un resto de fármaco de PBD, es decir la toxina. Cuando el fármaco no está conjugado a un anticuerpo, el fármaco de PBD tiene un efecto citotóxico. Por tanto, la actividad biológica del resto de fármaco de PBD se modula mediante conjugación con un anticuerpo. Los conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) de la invención liberan de forma selectiva una dosis eficaz de un agente citotóxico al tejido tumoral, de modo que se puede conseguir una selectividad mayor, es decir una dosis eficaz menor.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto conjugado como se ha descrito en el presente documento para uso en terapia.
En un aspecto adicional se proporcionan un compuesto conjugado como se describe en el presente documento para usar en el tratamiento de enfermedades proliferativas . Un segundo aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto conjugado en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa .
Un experto en la técnica puede determinar fácilmente si un conjugado candidato trata o no una afección proliferativa para cualquier tipo de célula concreta. Por ejemplo, ensayos que se pueden usar de forma conveniente para evaluar la actividad ofrecida por un compuesto concreto se describen en los ejemplos siguientes.
El término "enfermedad proliferativa" atañe a una proliferación celular indeseada o no controlada de células excesivas o anormales que no se desea, tales como un crecimiento neoplásico o hiperplásico, in vitro o in vivo Ejemplos de afecciones proliferativas incluyen, entre otras, proliferación celular benigna, premaligna y maligna, incluidas, entre otras, neoplasias y tumores (p. ej . , histocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma) , cánceres (p. ej . , cáncer de pulmón, cáncer de pulmón microcitico, cáncer gastrointestinal, cáncer intestinal, cáncer de colon, carcinoma de mama, carcinoma ovárico, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer hepático, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, sarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma) , leucemias, psoriasis, enfermedades óseas, trastornos fibroproliferativos (p. ej . , de tejidos conectivos) y aterosclerosis . Cánceres de interés concreto incluyen, entre otros, leucemias y cánceres de ovarios.
Se puede tratar cualquier tipo de célula, incluyendo, entre otras, de pulmón, gastrointestinal (incluidas, por ejemplo, intestinal, de colon) , de mama (mamarias) , de ovarios, de próstata, de hígado (hepáticas) , de riñon (renal) , de vejiga urinaria, de páncreas, de cerebro y de piel.
En una realización, el tratamiento es de un cáncer pancreático .
En una realización, el tratamiento es de un tumor que tiene ???ßß integrina sobre la superficie de la célula.
Se contempla que los conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) de la presente invención pueden usarse para tratar varias enfermedades o trastornos, caracterizados, por ejemplo, por la sobreexpresión de un antígeno tumoral. Ejemplos de afecciones de trastornos hiperproliferativos incluyen tumores benignos o malignos; leucemia, neoplasias malignas hematológicas y linfoides. Otros incluyen trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos, glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales, blastocoélicos , inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, incluidos trastornos autoinmunitarios .
En general, la enfermedad o trastorno que se va a tratar es una enfermedad hiperproliferativa tal como cáncer. Ejemplos de cáncer que se va a tratar en el presente documento incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias linfoides. Ejemplos más concretos de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (p. ej . , cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer de pulmón, incluido cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón amicrocítico, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma pulmonar escamoso, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluido cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga urinaria, hematoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o de útero, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peneano, así como cáncer de cabeza y cuello.
Enfermedades autoimunitarias para las que se pueden usar compuestos de CAF en el tratamiento incluyen trastornos reumatológicos (tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tal como LES y nefritis lúpica, polimiositis/dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome del anticuerpo anti-fosfolípidos y artritis psoriásica), osteoartritis, trastornos hepáticos y gastrointestinales autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades intestinales inflamatorias (p. ej . , colitis ulcerosa y enfermedad de Chron) , gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y enfermedad celíaca) , vasculitis (tales como, por ejemplo, vasculitis asociada con ANCA, incluida la vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener y poliarteritis) , trastornos neurológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple, síndrome de mioclono opsoclono, miastenia gravis, neuromielitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y polineuropatías autoinmunitarias ) , trastornos renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture y enfermedad de Berger) , trastornos dermatológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, habones, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y lupus eritematoso cutáneo) , trastornos hematológicos (tales como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura postransfusión y anemia hemolitica autoinmunitaria) , aterosclerosis, uveitis, enfermedades autoinmunitarias de la audición (tales como, por ejemplo, enfermedad del oído interno y pérdida de la audición) , enfermedad de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de órgano y trastornos endocrinos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la diabetes tales como diabetes mellitas dependiente de insulina (DMDI) , enfermedad de Addison y enfermedad autoinmunitaria del tiroides (p. ej . , enfermedad de Graves y tiroiditis) ) . Entre estas enfermedades, las más preferidas incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, vasculitis asociada con ANCA, lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjógren, enfermedad de Graves, DMDI, anemia perniciosa, tiroiditis y glomerulonefritis .
Procedimientos de tratamiento Los conjugados de la presente invención se pueden usar en un procedimiento de terapia. También se proporciona un procedimiento de tratamiento que comprende administrar a un sujeto que necesite tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto conjugado de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser, al menos, mejora de al menos un síntoma.
La cantidad real administrada y la velocidad y evolución en el tiempo de la administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo decisiones sobre la dosis, entra dentro de la responsabilidad de los profesionales generales y otros médicos.
Un compuesto de la invención se puede administrar solo o en combinación con otros tratamientos, simultánea o secuencialmente, dependiendo de la afección que se vaya a tratar. Ejemplos de tratamientos y terapias incluyen, entre otros, quimioterapia (administración de agentes activos, incluidos, por ejemplo, fármacos tales como quimioterapéuticos ) , cirugía y radioterapia.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer, con independencia del mecanismo de acción. Clases de agentes quimioterapéuticos incluyen, entre otros: Agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides antimitóticos de origen vegetal, antibióticos citotóxicos/antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, anticuerpos, fotosensibilizadores e inhibidores de la quinasa. Agentes quimioterapéuticos incluyen compuestos usados en "terapia dirigida" y quimioterapia convencional. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis) , 5-FU (fluorouracilo, 5-fluorouracilo, N° CAS 51-21-8), gemcitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (N° CAS 391210-10-9, Pfizer) , cisplatino (cis-diamina, dicloroplatino (II), N° CAS 15663-27-1), carboplatino (N° CAS 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech) , temozolomida (4-metil-5-???- 2 , 3, 4 , 6, 8-pentazabiciclo [4.3.0] nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, ?° CAS 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough) , tamoxifeno ( ( Z) -2- [ - ( 1 , 2-difenilbut-1-enil) fenoxi] -N, -dimetiletanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) , y doxorubicina (ADRIAMYCIN®) , Akti-1/2, HPPD y rapamicina.
Más ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen: oxaliplatino (ELOXATIN®, Sanofi) , bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis) , imatinib mesilato (GLEEVEC®, Novartis) , XL-518 (inhibidor de Mek, Exelixis, documento WO 2007/044515), ARRY-886 (inhibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca) , SF-1126 (inhibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals) , BEZ-235 (inhibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (inhibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca) , leucovorina (ácido folinico) , rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth) , lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline) , lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecán (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (sin Cremofor) , formulaciones de nanoparticulas de paclitaxel con albúmina mediante ingeniería (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II) , vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucilo, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) , temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline) , canfosfamida (TELCYTA®, Telik) , tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®) ; sulfonatos de alquilo, tal como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluidas altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona) ; una camptotecina (incluido el análogo sintético topotecán) ; briostatina; callistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina clorhidrato, melfalán, novembichina fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (p.ej., caliceamicina, caliceamicina gammall, caliceamicina omegall {Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; asi como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de la cromoproteina endiina) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, nemorubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, ß-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico, tal como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2' , 2 "-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C") ; ciclofosfamida; tiotepa; ß-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINA®) ; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche) ; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos y derivados de cualquiera de los anteriores.
También se incluye en la definición de "agente quimioterapéutico" : (i) agentes antihormonales que actúan para regular o inhibid la acción de las hormonas sobre tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM) , incluidos, por ejemplo, tamoxifeno (incluido NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON® (citrato de toremifina) ; (ii) inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer) , formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) , y ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca) ; (iii) antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido y goserelina; asi como troxacitabina (un análogo del nucleósido citosina de 1, 3-dioxolano) ; (iv) inhibidores de las proteina quinasas tales como inhibidores de MEK (documento WO 2007/044515); (v) inhibidores de las lipido quinasas; (vi) oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de genes en las vías de señalzación implicadas en la proliferación celular aberrante, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras, tales como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas tales como inhibidores de la expresión de VEGF (p.ej., ANGIOZYME®) inhibidores de la expresión de HER2; (viii) vacunas tales como vacunas de terapia génica, por ejemplo ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, y VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidores de la topoisomerasa 1 tales como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes antigiogénicos tales como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) ; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores .
En la definición de "agentes quimioterapéutico" también se incluyen anticuerpos terapéuticos tales como alemtuzumab (Campath) , bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) ; cetuximab (ERBITUX®, Imclone) ; panitumumab (VECTIBIX®, Amgen) , rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idee) , pertuzumab (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech) , tositumomab (Bexxar, Corixia) , y el conjugado anticuerpo-fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth) .
Los anticuerpos monoclonales con potencial terapéutico como agentes quimioterapéuticos en combinación con los conjugados de la invención incluyen: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab mertansine , cantuzumab mertansine, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pertuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, tucotuzumab celmoleuquina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab y visilizumab.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención y para usar de acuerdo con la presente invención pueden comprender, además del ingrediente activo, es decir un compuesto conjugado, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante u otro material farmacéuticamente aceptables bien conocidos para los expertos en la técnica. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral o mediante inyección, por ejemplo cutánea, subcutánea o intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden ser en forma de comprimido, cápsula, polvo o líquido. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido o un adyuvante. En general, las composiciones farmacéuticas líquidas pueden comprenden un vehículo líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir solución fisiológica salina, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol . Una cápsula puede comprender un vehículo sólido tal como gelatina .
Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea o la inyección en el punto de afección, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que carece de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica tienen la capacidad de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. Según se requiera se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos. Formulaciones Aunque es posible usar (p. ej . , administrar) el compuesto conjugado solo, a menudo es preferible presentarlo como una composición o formulación.
En una realización, la composición es una composición farmacéutica (p. ej . , formulación, preparación, medicamento) que comprende un compuesto conjugado, como se describe en el presente documento, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición es una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto conjugado, como se describe en el presente documento, junto con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica, incluidos, entre otros, vehículos, diluyentes, excipientes, adyuvantes, cargas, tampones, conservantes, antioxidantes, lubricantes, estabilizantes, solubilizantes, tensioactivos (p. ej . , agentes humectantes) , agentes de enmascaramiento, agentes colorantes, agentes aromatizantes y agentes edulcorantes farmacéuticamente aceptables.
En una realización, la composición comprende además otros agentes activos, por ejemplo otros agentes terapéuticos o profilácticos .
Los vehículos, diluyentes, excipientes etc. adecuados se pueden encontrar en textos farmacéuticos convencionales. Véase, por ejemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a Edición (eds. M. Ash y col. Ash) , 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), Reminqton ' s Pharmaceutical Sciences, 20a edición, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, 1994.
Otro aspecto de la presente invención atañe a procedimientos de fabricar una composición farmacéutica que comprende mezclar al menos un conjugado radiomarcado con [nC] o un compuesto de tipo conjugado, como se define en el presente documento, junto con uno o más de los otros ingredientes farmacéuticamente aceptable bien conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo vehículos, diluyentes, excipientes etc. Si se formula como unidades pequeñas (p. ej . , comprimidos etc.), cada unidad contiene una cantidad predeterminada (dosis) del compuesto activo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos, ingredientes, materiales, composiciones, formas de dosificación etc., que son, dentro del alcance del firme juicio médico, adecuados para usar en contacto con los tejidos del sujeto en cuestión (p. ej . , seres humanos sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una razonable proporción de beneficios/riesgos. Cada vehículo, diluyente, excipiente etc. debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación.
Las formulaciones pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de farmacia. Dichos procedimientos incluyen la etapa de llevar el compuesto activo en asociación con un vehículo, que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto de forma uniforme y estrecha el compuesto activo con vehículos (p. ej . , vehículos líquidos, vehículo sólido finamente dividido etc.) y, después, en caso necesario, dando forma al producto. La formulación puede prepararse para proporcionar liberación lenta; liberación inmediata, retardada, programada o sostenida; o una combinación de los mismos.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral (p. ej . , mediante inyección) incluyen líquidos acuosos o no acuosos, isotónicos, apirógenos, estériles (p. ej . , soluciones, suspensiones) en los que el ingrediente activo se disuelve, suspende o, por el contrario, proporciona (p. ej . , en un liposoma u otra micropartícula) . Dichos líquidos pueden además contener otros ingredientes farmacéuticamente aceptables, tales como antioxidantes, tampones, conservantes, estabilizantes, bacteriostáticos, agentes de suspensión, agentes espesantes y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre (u otros fluido corporal relevante) del receptor objetivo. Ejemplos de excipientes incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerol, aceites vegetales y similares. Ejemplos de vehículos isotónicos adecuados para usar en dichas formulaciones incluyen cloruro sódico, inyección, solución de Ringer o inyección de Ringer lactato. Normalmente, la concentración del ingrediente activo en el líquido es de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 g/ml, por ejemplo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1 µq/ml. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de multidosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere sólo la adición del transportador líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.
Dosificación El experto en la técnica apreciará que las dosificaciones adecuadas del compuesto conjugado y las composiciones que comprenden el compuesto conjugado pueden variar de un paciente a otro. En general, la determinación de la dosificación óptima implicará el equilibrio del nivel del beneficio terapéutico contra cualquier riesgo o efecto secundario perjudicial. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de diversos factores incluyendo, entre otros, la actividad del compuesto concreto, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación, la gravedad de la afección y la especie, el sexo, la edad, el peso, la afección, el estado de salud general y el historial médico previo del paciente. La cantidad del compuesto y la via de administración serán, en última instancia, a criterio del médico, veterinario o clínico, aunque, en general, la dosis se seleccionará para obtener concentraciones locales en el sitio de acción que ejerzan el efecto deseado sin producir muchos daños o efectos secundarios perjudiciales.
La administración se puede efectuar en una dosis, de forma continua o intermitente (p. ej . , en dosis divididas a intervalos adecuados) a lo largo del ciclo de tratamiento. Los procedimientos de determinar el medio y la dosis de administración más eficaces son bien conocidos para los expertos en la técnica y variará con la formulación usada para terapia, el objetivo de la terapia, la(s) célula (s) diana que se estén tratando y el sujeto que se esté tratando. Se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples siendo los niveles y el patrón de dosis seleccionados por el médico, veterinario o clínico encargado del tratamiento.
En general, una dosis adecuada del compuesto activo está en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 25 mg (más normalmente de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 10 mg) por kilogramo de peso corporal del sujeto al día. Cuando el compuesto activo es una sal, un éster, una amida, un profármaco o similares, la cantidad administrada se calcula en base al compuesto parental y, de este modo, el peso real que se va a usar aumenta proporcionalmente .
En una realización, el compuesto activo se administra a un paciente humano de acuerdo con el siguiente régimen de dosificación: aproximadamente 100 mg, 3 veces al día.
En una realización, el compuesto activo se administra a un paciente humano de acuerdo con el siguiente régimen de dosificación: aproximadamente 150 mg, 2 veces al día.
En una realización, el compuesto activo se administra a un paciente humano de acuerdo con el siguiente régimen de dosificación: aproximadamente 200 mg, 2 veces al día.
No obstante, en una realización, el compuesto conjugado se administra a un paciente humano de acuerdo con el siguiente régimen de dosificación: aproximadamente 50 o aproximadamente 75 mg, 3 o 4 veces al día.
En una realización, el compuesto conjugado se administra a un paciente humano de acuerdo con el siguiente régimen de dosificación: aproximadamente 100 o aproximadamente 125 mg, 2 veces al día.
Las cantidades de dosis descritas anteriormente se pueden aplicar al conjugado (incluido el resto de PBD y el conector al anticuerpo) o a la cantidad eficaz de compuesto de PBD proporcionada, por ejemplo la cantidad de compuesto que se puede liberar tras la escisión del conector.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada de un CAF de la invención dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, como se ha definido anteriormente, la gravedad y evolución de la enfermedad, si la molécula se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapias previas, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el juicio del médico encargado de la atención. La molécula se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (p. ej . , . 0,1-20 mg/kg) de molécula es una dosificación candidata inicia para la administración al paciente, mediante, por ejemplo, una o más administraciones distintas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, en función de los factores mencionados anteriormente. Una dosificación de ejemplo del CAF que se va a administrar a un paciente está en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg del peso del paciente. Para administraciones repetidas en varios días o más, según la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un régimen de dosificación de ejemplo comprende un ciclo de administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de dosis adicionales cada semana, dos semanas o tres semanas de un CAF. Pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
Tratamiento El término "tratamiento", como se usa en el presente documento en el contexto de tratamiento de una afección, se refiere, en general, a tratamiento y terapia, sea de un ser humano o de un animal (p. ej . , en aplicaciones veterinarias), en las que se consigue algún efecto terapéutico deseado, por ejemplo la inhibición de la progresión de la afección, e incluye reducción de la velocidad de la progresión, detención en la velocidad de la progresión, regresión de la afección, mejora de la afección y cura de la afección. También se incluye el tratamiento como una medida profiláctica (es decir, profilaxis, prevención) .
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto activo o material, composición o dosis que comprende un compuesto activo que es eficaz para producir algún efecto terapéutico deseado, acorde con una proporción beneficios/riesgo razonable, cuando se administra de acuerdo con un régimen terapéutico deseado.
De un modo similar, como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto activo o material, composición o dosis que comprende un compuesto activo que es eficaz para producir algún efecto profiláctico deseado, acorde con una proporción beneficios/riesgo razonable, cuando se administra de acuerdo con un régimen terapéutico deseado.
Preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco Los conjugados de anticuerpo y fármaco se pueden preparar mediante varias vías, usando reacciones de química orgánica, afecciones y reactivos conocidos por los expertos en la técnica, incluidos: (1) reacción de un grupo nucleófilo o un grupo electrófilo de un anticuerpo con un reactivo conector bivalente, para formar el intermedio anticuerpo-conector Ac-C, a través de un enlace covalente, seguida de reacción con un reactivo del resto de fármaco activado; y (2) reacción de un reactivo del resto de fármaco con un reactivo conector, para formar el reactivo fármaco-conector F-C, a través de un enlace covalente, seguida de reacción con el grupo nucleófilo o un grupo electrófilo de un anticuerpo. Los procedimientos de conjugación (1) y (2) se pueden usar con diversos anticuerpos y engarces para preparar los conjugados anticuerpo-fármaco de la invención.
Los grupos nucleófilos sobre anticuerpos incluyen, entre otros: (i) grupos amina en N-terminal, (ii) grupos amina en la cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol en la cadena lateral, por ejemplo cisteina, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar en la que el anticuerpo esta glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos sobre restos engarces y reactivos conectores, incluidos: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y de bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir puentes de cisteina. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos conectores mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (reactivo de Cleland, ditiotreitol) o TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato; Getz y col. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, A) . Cada puente disulfuro de cisteina formará de este modo, en teoría, dos nucleófilos de tiol reactivo. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en antibióticos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) que tiene como resultado la conversión de una amina en un tiol.
También se pueden producir conjugados de anticuerpo-fármaco mediante modificación del anticuerpo para introducir restos electrófilos que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo conector. Los azúcares de los anticuerpos glicosilados se pueden oxidar, por ejemplo con reactivos de oxidación de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona, que pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos conectores o los restos de fármaco. Los grupos de base de Schiff de imina pueden formar un conector estable o se pueden reducir mediante, por ejemplo, reactivos de borohidruro para formar enlaces amina estables. En una realización, la reacción de la porción de hidrato de carbono de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o metaperyodato sódico puede dar grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la protéina que pueden reaccionar con grupos adecuados sobre el fármaco (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242). En otra realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina en N-terminal pueden reaccionar con metaperyodato sódico, lo que tiene como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; documento US 5362852) . Dicho aldehido se puede hacer reaccionar con un resto de fármaco o conector nucleófilo.
Asimismo, los grupos nucleófilos sobre un resto de fármaco incluyen, entre otros: Grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazina, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos sobre restos conectores y reactivos conectores, incluidos: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y de bencilo tales como haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida. Se pueden introducir grupos nucleófilos reactivos en los compuestos derivados de antraciclina mediante interconversiones del grupo funcional estándar. Por ejemplo, los grupos hidroxilo se pueden convertir en grupos tiol mediante reacciones de tipo Mitsunobu para formar compuestos de fármaco modificados con tiol.
El sujeto/paciente El sujeto/paciente puede ser un animal, mamífero, un mamífero con placenta, un marsupial (p. ej . , un canguro, un wombat) , un monotrema (p. ej . , ornitorrinco), un roedor (p. ej . , una cobaya, un hámster, una rata, un ratón), murino (p. ej . , un ratón), un lagomorfo (p. ej . , un conejo), un ave (p. ej . , un pájaro), un canino (p. ej . , un perro), un felino (p. ej . , un gato), un equino (p. ej . , un caballo), un porcino (p. ej . , un cerdo), un ovino (p. ej . , una oveja), un bovino (p. ej . , una vaca), un primate, un simio (p. ej . , un mono o gorila), un mono (p. ej . , un tití, babuino), un simio (p. ej . , gorila, chimpancé, orangután, gibón) o un ser humano.
Además, el sujeto/paciente puede estar en cualquiera de sus formas de desarrollo, por ejemplo un feto. En una realización preferida, el sujeto/paciente es un ser humano. En una realización, el paciente es una población en la que cada paciente tiene un tumor que tiene a? ß integrina sobre la superficie de la célula.
Síntesis En una realización, un conjugado dimérico de fórmula VIII puede prepararse a partir de los compuestos I y II como se muestra en el Esquema 1. (i) Reducción de éster (ii) Acetilación (iii) Reducción de nitro (i) Deprotección de acetato (ii) Ciclación (i) Elminación del Analizador (i) Modificación opcional de R (ii) Acoplamiento al agente de unión celular En general, pueden prepararse dimeros asimétricos tratando compuestos bis-amino de fórmula IV con un equivalente de un reactivo de cloroformiato disponible en el mercado (o que puede prepararse fácilmente) para romper la simetría de las moléculas. Después, la mina libre restante puede funcionalizarse independientemente para introducir el progrupo lábil terapéuticamente (RL) . La manipulación adicional del grupo funcional para cerrar el anillo PBD B, eliminar los grupos de protección y terminación e introducir el grupo funcional de unión a anticuerpo, por ejemplo G1, proprciona la molécula diana.
Los compuestos de fórmula IV se preparan típicamente acoplando un fragmento de anillo C adecuadamente funcionalizado (I) a un núcleo dimérico que contiene el anillo A de fórmula II. Pueden prepararse fragmentos del anillo C a partir de componentes básicos de 4-oxoprolinato de metilo protegidos con carbamato conocidos. Puede emplearse olefinación en condiciones de Wittig o Horner-Emmons para formar alquenos endo- o exo- insaturados. Como alternativa, pueden usarse consecutivamente reacciones de triflación y acoplamiento de Suzuki para obtener fragmentos del anillo C 3,4 o , 5-insaturado sustituidos con 4-arilo. Pueden acoplarse fragmentos del anillo C y del ainllo A en condiciones convencionales, en presencia de trietilamina, usando derivados cloruro de ácido de los franmentos de anillo A para dar molélucas de fórmula III. Los compuestos de tipo III puden reducirse, sin afectar a la insaturación del endo o exo del anillo C, con cinc en ácido acético para proporcionar molécules de fórmula IV.
Pueden prepararse carbamatos asimétricos de tipo VI tratando bis-aminas de tipo IV con un sólo equivalente de cloroformiatos disponibles en el mercado (o que pueden prepararse fácilmente) , en presencia de piridina o trietilamina. Pueden seleccionarse cloroformiatos para proporcionar unidades de terminación de carbbamato (Rc) que son tanto ortogonales como idénticas a las usadas en el progrupo (RL) . Carbamatos idénticos permiten la elminación simultánea de ambos grupos protectores ahorrando etapas sintéticas. Sin embargo, la eliminación de los carbamatos de terminación (Rc) requiere que la adición de la funcionalidad de unión a anticuerpo tanga lugar en presencia de un resto sensible N10- imina o carbinolamina Cll. Si fuera necesario, esta situación puede evitarse mediante el uso de grupos protectores de carbamato ortogonales que permiten la adición de restos de unión a anticuerpo mientras se mantiene el resto N10-carbinolamina Cll protegido. En esta estratégia, el resto N10-C11 debe desenmascararse en presencia del resto de unión a anticuerpo y los reactivos usados deben ser compatibles con este resto. Por ejemplo, si una NIO-imina Cll debe desenmascararse en presencia de un grupo maleimida, Troc y Teoc serian grupos Rc adecuados como los agentes de desprotección, par Cd/Pb y TBAF, no deberían afectar al grupo maleimida. Por otro lado, el grupo Alloc debería evitarse puesto que pueden añadirse neutralizadores de p-alilo, tales como de una manera 1,4 al grupo maleimida. El carbamato RL puede introducirse convirtiendo el grupo amino restante en un isocianato e inactivándolo con el alcohol RL. Como alternativa, el alcohol RL puede convertirse en un cloroformiato o equivalente funcional (fluoroformiato, p-nitrocarbonato, pentafluorocarbonato o hidroxibenzotriazol carbonato) . Finalmente, el grupo amino restante puede convertirse en un p-nitrocarbamato, pentafluorocarbamato o carbamato hidroxibenzotriazol reactivo, que puede desplazarse con el alcohol RL para proporcionar moléculas de fórmula VI. Pueden prepararse moléculas fórmula VII a partir de moléculas de fórmula VI eliminando los grupos protectores de acetato, con carbonato potásico en metanol acuoso, o en presencia de un grupo Fmoc en RL con trietilborohidruro de litio. La oxidación con peryodinano de Dess-Martin (o como alternativa TPAP/NMO, PDC o en condiciones de Swern) proporciona el producto de anillo cerrado.
Pueden prepararse conjugados de fórmula V a partir de moléculas de fórmula VII mediante la eliminación del grupo de terminación Rc, elaboración de RL para incluir un rento de unión a anticuerpo (por ejemplo, un grupo maleimidocaproilo) que puede conjugarse con un agente de unión celular, tal como un anticuerpo, en condiciones convencionales (véase Dubowchik y col. Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869). La elaboración de RL puede incluir la etapa de extender el grupo para que incluya un elemento espaciador, tal como un grupo G1, que después puede usarse para conectar a un agente de unión a célula (formando de esta manera el grupo A) .
Pueden prepararse compuestos monoméricos y dimeros siméticos de una manera similar al dímero antisimétrico como se ha descrito anteriormente.
En otra realización, un conjugado de fórmula XVIII puede prepararse a partir del compuesdto IX como se muestra en el Esquema 2 .
Compuesto II La síntesis de compuestos de fórmula (II) se describe en la solicitud anterior del solicitante, WO 2006/111759 y también se describe por Gregson y col. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) . La preparación del compound (II) como se describe en los mismos se incorpora específicamente por referencia en el presente documento. El compuesto (lia) tiene un engarce de tres carbonos. El compuesto (Ilb) tiene un engarce de cinco carbonos .
Esquema 2 XVIII En este esquema, el grupo R es un grupo arilo C5-20. Los compuestos de fórmula IX se describen en el documento WO 2004/043963.
Los compuestos de fórmula X pueden sintetizarse a partir de compuestos de fórmula IX mediante oxidación, por ejemplo, usando: TCCA y TEMPO; BAIB y TEMPO; TPAP; condiciones de Dess-Martin; o condiciones de Swern.
Los compuestos de fórmula IX pueden sintetizarse acoplando compuestos adecuados de fórmulas B y C, o derivados activados de los mismos: Los compuestos de fórmulas B y C están generealmente disponibles en el mercado o pueden sintetizarse fácilmente. Si el compuesto B es un dimero, entonces éste puede sintetizarse como se describe en el documento WO 00/12508. Los compuestos de fórmula XI pueden prepararse a partir de un compuesto de fórmula X en un procedimiento que comprende tratar X con el anhídrido adecuado y 2,6-lutidina anhidra o 2, 6- tBu-piridina anhidra, a una temperatura de -35 °C o inferior, en un disolvente orgánico seco, en una atmósfera inerte. XI está sustancialmente libre del compuesto que tiene un doble enlace C1-C2.
Nota, la preparación de compuestos que tienen un doble enlace C1-C2 se describe por Kang y col., Chem. Commun., 2003, 1680-1689 Los compuestos de fórmula XI pueden convertirse en compuestos de fórmula XII. La conversión (un acoplamiento de Suzuki) se realiza por acoplamiento cruzado catalizado por paladio de XI con el derivado de aril boro adecuado. La catalizador de paladio puede ser cualquier catalizador adecuado, por ejemplo Pd(PPh3)4, Pd(OCOCH3)2, PdCl2, Pd(dba)3.
Los compuestos de fórmula XII pueden convertirse en compuestos de fórmula XIV mediante el compuesto XIII. La conversión se consigue mediante la reducción en primer lugar del éster y reprotección en forma de un acetato (o silil éter en un enfoque alternativo) . La redudcción puede conseguirse por medios convencionales, por ejemplo con LiAlH4 o NaBH4. La reprotección en forma de un an acetato puede conseguirse, por ejemplo, por reacción con cloruro de acetilo (reprotección en forma de un silil éter puede conseguirse, por ejemplo, por reacción con el cloruro de sililo adecuado) . Después, la reducción del grupo se realiza usando, por ejemplo, cinc en ácido acético.
Los compuestos de fórmula XIV pueden convertirse en compuestos de fórmula XV. Esta conversión se consigue normalmente por reacción de XIV con trifosgeno para obtener el isocianato seguido de reacción con RL-OH. Este enfoque se describe en el documento WO 2005/023814. Como alternativa, también puden introducirse grupos protectores de nitrógeno individuales como un cloroformiato, fluoroformiato o azidoformiato . Los grupos protectores de nitrógeno más complejos, asi como los grupos protectores de nitrógeno simples, pueden introducirse como carbonatos de 0-succinamida, carbonatos de 0-pentaflurofenilo y carbonatos de O-nitrofenilo.
La conversión de XV a XVII puede conseguirse por elminación inicial del grupo protector de acetato, con carbonato potásico, en metanol acuoso o con trietilborohidruro de litio. La oxidación con con peryodinano de Dess-Martin (o como alternativa, TPAP/NMO, TFAA/DMSO, complejo S03.Piridina /DMSO, PDC, PCC, BAIB/TEMPO o en condiciones de Swern) proporciona el producto cerrado de anillo. Si se usa un silil éter en lugar de unacetato, la conversión de XV en XVII pueden conseguirse mediante la eliminación inicial del grupo protector silil éter, por ejemplo usando TBAF en THF, ácido acético en THF acuoso, CsF en DMF o HF en piridina, seguido de oxidación como se ha descrito anteriormente.
Después, el compuesto XVIII se acopla al agente de unión a célula. La secuencia de etapa o etapas de XVII a XVIII depende de la naturaleza de RL. Este grupo puede modificarse y después acoplarse al agente de unión a célula para formar un conjugado de la invención. Por ejemplo, una terminación de grupo puede eliminarse para proporcionar una funcionalidad adecuada par la reacción con un agente de unión a célula. En otras etapas, esta misma funcionalidad puede usarse para un elemento espaciador adicional, tal como un grupo G1, y después dicho elemento espaciador puede a su vez conectarse al agente de unión a célula (formando de esta manera el grupo A) .
En algunas realizaciones de la invención se proporcionan compuestos de fórmula A-I, incluyendo compuestos de fórmula A-A y A-B. Pueden prepararse compuesros de este tipo usando procedimientos similares a los ¦ que se describen en el documento WO 2010/091150. Los compuestos intermedios descrios en el documento WO 2010/091150 también pueden emplearse en los procedimientos descritos anteriormente.
Por ejemplo, un compuesto dimérico (15) que se muestra en el párrafo [164] puede usarse como compuesto (III) en el Esquema I anterior. Se muestran compuestos monoméricos de este tipo como compuestos (3), (6) y (9). Estas y otras adaptacioens, serian evidentes para un experto en la materia.
Síntesis preferidas En una realización, el conjugado es el compuesto 14, y se prepara como se muestra en el Esquema 3. Los dipéptidos 7a, b y 8 se preparan coo se describe en la sección experimental posterior. En dicho esquema, las porciones de engarce L1 y L2 tienen las estructuras: i96 9a, X = Fmoc, LN = LA, P = Boc 9b, X = Alloc, I_N = LA, P = Boc 9c, X = Alloc, LN = LB 83, X = Boc, LN = LC 10a, X = Fmoc, LN - LA, P = Boc 10b, X = Alloc, LN = LA, P = Boc 10c, X = Alloc, LN = LB 11b, X = Alloc, LN = LA, P = Boc 11c, X = Alloc, LN = LB 85, X = Boc, LN = Lc Compuesto 14a, LN = LA, P = H Compuesto 14c, LN = LB Compuesto 88, LN = Lc El compuesto 13c, cuando el dipéptido se corresponde con L2, puede prepararse a partir de 12c por un procedimiento análogo .
En una realización, el conjugado es el compuesto 16a o 16b, y el compuesto se prepara como se muestra en el Esquema 4 siguiente, en el que el compuesto 12a puede prepararse como se ha descrito anteriormente: Esquema 4 . 12a, LN = LA, P = Boc 12c, LN = LB Compuesto 16a, LN = LA, P = H, n = 4 Compuesto 16b, LN = LA P = H, n = 8 Compuesto 16c, LN = LB, P = H, n = 4 Compuesto 16d, LN = LB, P = H, n = 8 Compuesto 16e, LN = LB, P = H, n = 24 Esquema 5. 7b, P = Boc Alloc^. A Me Esquema . 32, P = Boc Esquema 8 Esquema 9. 205 206 207 60 Esquema 15.
A continación, la invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes Ejemplos no limitante. Otras realizaciones de la invención se les corrirán a los expertos en la materia a la luz de es estas.
La divulgación de todas la referencias citadas en el presente documento, considerando que pueden usarse por los expertos en la materia para realizar la invención, se incorpora en el presente documento específicamente por remisión.
Ejemplos Información general El progreso de reacción se se controló por cromatografía de capa fina (TLC) usando gel de sílice Merck Kieselgel 60 F254, con indicador de fluorescencia sobre placas de aliminio. La visualización de TLC se consiguió con luz UV o vapor de yodo a menos que se indique otra cosa. La cromatografía ultrarrápida se realizó usando gel de sílice Merck Kieselgel 60 F254. Los disolventes de extracción y cromatografía se adquirieron y se usaron sin purificación adicional de Fisher Scientific, U.K. Todos los productos químicos se adquirieron de Aldrich Lancaster o BDH.
Las condiciones de CL/EM fueron como se indica a continuación: La HPLC (Waters Alliance 2695) se realizó usando una fase móvil de agua (A) (ácido fórmico al 0,1%) y acetonitrilo (B) (ácido fórmico al 0,1%). Gradiente: composición inicial B al 5% durante 1,0 min, después B del 5% al 95% B en 3 min. La composición se mantuco durante 0,5 min a B al 95% y después se devolció a B al 5% en 0,3 minutos. Tiempo de operación de gradiente total igual a 5 min. Caudal 3,0 ml/min, se separaron 400 µ? mediante una pieza con forma de T de un volumen muerto de cero que se pasó a través del espectrómetro de masas. Intervalo de longitud de onda de detección: 220 a 400 nm. Tipo de función: diodos alineados (535 exploraciones). Columna: Phenomenex® Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm.
Se usó rl siguiente protecedimiento de HPLC semi-preparativa: se realizó cromatografía líquida de alta resolución y fase inversa (HPLC) en columnas Zorbax Eclipse XDB C-18 de las siguientes dimensiones: 150 x 4,6 mm para análisis y 250 x 9,4 mm para tranajo preparativo. Todos los experimentos de HPLC se realizaron con condiciones de gradiente: composición inicial fija de B al 0,5% a B al 50% durante 20 min, detención durante 5 min a B al 50%, después de B al 50% a B al 100% en 2 min, detención durante 3 min a B al 100%, devolución a B al 5% en 2 min y detención durante 3 min. La duración total de la operación de gradiente fur 35 min. Los eluyentes usados fueron, disolvente A (H20 con TFA al 0,02%) y disolvente B (CH3CN con TFA al 0,02%). Los caudales que se usaron fueron 1,20 ml/min para analitica y 5,00 ml/min para HPLC preparativa.
Compuesto 2 - Cloruro de (S) -2- (metoxicarbonil) -4-metilenpirrolidinio El compuesto 2 también se describe para su uso en el documento WO 2007/085930 en la preparación de compuestos de PBD.
El compuesto 2 puede prepararse a partir de trans-4-hidroxi-prolina como se describe en el documento WO 2007/085930, que se incorpora por referencia por la presente. En particular, el Ejemplo 13, que describe la preparación de la sal TFA del compuesto 2, es particularmente relevante.
Como alternativa, el compuesto 2 puede prepararse a partir del compuesto 1 como se describe a continuación. 4-metilenpirrolidin-l, 2-dicarboxilato de (S) -1- terc-butil-2-metilo Se añadió carbonato potásico (19,92 g, 14 mmol, 3 equiv.) a una solución agitada del compuesto 1 (10,92 g, 48 mmol, 1 equiv.) en DMF (270 mi). La suspensión de color blanco resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, momento en el que se añadió yodometano (21,48 g/9,5 mi, 151 mmol, 3,15 equiv.). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 días. La DMF se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, proporcionando un residuo de color amarillo que se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, salmuera y se secaron sobre sulfato de magnesio. El acetato de etilo se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, dando el producto en bruto en forma de un aceite de color amarillo. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida [n-hexano al 85%/acetato de etilo al 15%], proporcionando el producto en forma de un aceite incoloro (véase también F Maniré y col., J. Org. Chem. 1992, 57, 2060-2065) .
Cloruro de (S) -2- (metoxicarbonil) -4-metilenpirrolidinio Se añadió una solución de acido clorhídrico en dioxano (4 M, 63 mi, 254,4 mmol, 4,5 equiv.) a 4-metilenpirrolidin-l, 2-dicarboxilato de (S) -1- terc-butil 2-metilo (13,67 g, 56,6 mmol, 1 equiv.) a temperatura ambiente. Se observó la efervescencia lo que indicaba la liberación de C02 y la eliminación del grupo Boc. El producto precipitó en forma de un sólido de color blanco, se añadió más cantidad de dioxano para facilitar la agitación, la mezcla de reacción se dejó en agitación durante un ahora y después se diluyó con éter. El producto precipitado se recogió por filtración al vacío y se lavó con más cantidad de éter. El secado al aire proporcionó el producto deseado 2 en forma de un polvo de color blanco (9,42 g, 94%) (véase también P Herd ijn y col., Canadian Journal of Chemistry. 1982, 60, 2903-7) .
Compuesto 3 El compuesto 3 puede prepararse como se describe en el documento WO 2006/111759 y Gregson y col.
Compuesto 4 El compuesto 4 puede prepararse a partir del compuesto 3 y el compuesto 2.
Se añadió una cantidad catalítica de DMF anhidra (0,5 mi) a una suspensión agitada de cloruro de oxalilo (9,1 g, 6,25 mi, 71,7 mmol, 3 equiv.) y el compuesto 3 (11,82 g, 23,9 mmol, 1 equiv.) en DCM anhidro (180 mi) a temperatura ambiente. Se observó una efervescencia vigorosa después de la adición de DMF y la mezcla de reacción se dejó en agitación durante 18 h en un matraz de fondo redondo equipado con un tubo de secado de cloruro cálcico. La solución transparente resultante se evaporó a presión reducida y el sólido se trituró con éter. El producto sólido se recogió por filtración al vacío, se lavó con más cantidad de éter y se secó al vacío a 40 °C durante 1,5 horas. Después, este sólido se añadió en porciones a una suspensión del compuesto 2 (9,35 g, 52,6 mmol, 2,2 equiv.) en TEA (12,08 g, 119,6 mmol, 5 equiv.) y DCM seco (110 mi) , manteniendo la temperatura entre -40 °C y -50 °C con la ayuda de un baño de hielo seco/acetonitrilo . La mezcla de reacción se dejó en agitación a -40 °C durante 1 hora y después se dejó calentar a temperatura ambiente, momento en el que el análisis por CLE indicó el consumo completo del material de partida. La mezcla de reacción se diluyó con más cantidad de DCM, se lavó secuencialmente con ácido clorhídrico acuoso (1 M, 2 x 200 mi) , bicarbonato sódico acuoso saturado (2 x 250 mi), agua (250 mi), salmuera (250 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. El DCM se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, proporcionando el producto en forma de una espuma de color amarillo (13,94 g, 79%). Datos Analíticos: TR 3,95 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 741 ( [M + 1]+", 100).
Compuesto 5 El compuesto 5 puede prepararse a partir del compuesto 4 en tres etapas a través del bis-alcohol y el bis-acetato. j is-Alcohol Se añadió en una porción borohidruro de litio sólido (0,093 g, 4,3 ramol, 3 equiv. ) a una solución de éster 4 (1,05 g, 142 mmol, 1 equiv.) en THF seco (10 mi) en una atmósfera de nitrógeno a 0 °C (baño de hielo) . La mezcla de reacción se dejó en agitación a 0 °C durante 30 min y después se dejó calentar hasta la temperatura ambiente, momento en el que se observó la precipitación de una goma de color naranja. La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas más, después se enfrió en un baño de hielo y se trató con agua (20 mi) , dando una suspensión de color amarillo. Se añadió cuidadosamente ácido clorhídrico (1 M) (efervescencia vigorosa) hasta que la efervescencia se detuvo. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (4 x 50 mi) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (100 mi), salmuera (100 mi) y se secaron sobre sulfato de magnesio. Se eliminó el acetato de etilo por evaporación rotatoria a presión reducida, produciendo el producto de bis-alcohol en forma de una espuma de color amarillo (0,96 g, 99%) . La reacción se repitió en una escala de 12,4 g, produciendo 11,06 g de producto (96%). Datos Analíticos: TR 3,37 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 685 ([M + 1]+·, 100) . bis-Acetato Se añadió gota a gota una solución de cloruro de acetilo (3,4 g/3,1 mi, 43,5 mmol, 2,6 equiv.) en DC seco (100 mi) a una solución agitada del ¿is-alcohol (11,46 g, 16,73 mmol, 1 equiv.) y trietilamina (5,07 g, 6,98 mi, 50,2 mmol, 3 equiv.) en DCM seco (200 mi) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y la agitación continuó durante una hora. El análisis por TLC y por CLEM reveló que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se lavó con salmuera (200 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. La eliminación de DC por evaporación rotatoria a presión reducida dio el producto en bruto. El análisis por cromatografía ultrarrápida [gradiente de elución de n-hexano al 20%/acetato de etilo al 80% a n-hexano al 10%/acetato de etilo al 90%] proporcionó jbis-acetato puro en forma de una espuma de color amarillo (10,8 g, 84%). Datos Analíticos: TR 3,35 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 769 ( [M + 1]+·, 100).
Compuesto 5 Se añadió polvo de cinc (14,2 g, 2,17 mmol, 30 equiv. ) a una solución del his-acetato (5,56 g, 7,24 mmol, 1 equiv.) en etanol (250 mi) y ácido acético (65 mi) . La mezcla de reacción agitada se calentó a reflujo, convirtiéndose la solución de color amarillo en incolora (también se observó agregación de cinc haciendo difícil agitar la reacción) . La reacción se dejó continuar durante una hora, momento en el que el análisis por CLEM indicó que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se dejó enfriar, se filtró a través de celite y la capa de filtró se lavó con DCM. El filtrado se lavó con agua (3 x 500 mi), bicarbonato sódico acuoso saturado (2 x 250 mi), salmuera (500 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. La evaporación rotatoria a presión reducida produjo el producto 5 en forma de una espuma de color blanquecino (4,71 g, 92%). Datos Analíticos: TR 3,33 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 709 ( [M + 1]+·, 100). Compuesto 6 Compuesto 6 puede prepararse a partir del compuesto 5 en tres etapas .
Producto mono-Alloc Se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0,634 g/0,56 mi, 5,6 mmol, 0,9 equiv. ) en DCM seco (150 mi) a una solución del compuesto 5 (4,145 g, 5,8 mmol, 1 equiv.) y piridina (0,106 g/0,11 mi, 11,1 mmol, 1,9 equiv.) en DCM seco (500 mi) a -78 °C (baño de hielo seco/acetona) . La mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 1 hora y después se dejó que alcanzara la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con una solución acuosa saturada de sulfato de cobre (2 x 300 mi), agua (400 mi), salmuera (400 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. La evaporación rotatoria a presión reducida proporcionó el producto en bruto en forma de una espuma de color oscuro. La purificación por cromatografía ultrarrápida [n-hexano al 40%/acetato de etilo al 60% a metanol al 5%/acetato de etilo al 95%] dio el producto bis-alloc (0,84 g) , el producto mono-alloc deseado (1,94 g, 44%) y la £>is-anilina recuperada (0,81 g) .
Datos Analíticos: TR 3,32 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 793 ( [M + 1]+·, 100); EM (EN-) m/z (intensidad relativa) 791 ( [M - 1])"·, 100).
Isocianato Se añadió trietilamina (0,018 g/25 DI, 0,18 mmol, 1,35 equiv.) a una solución agitada del producto mono-alloc (0,106 g, 0,134 mmol, 1 equiv.) y trifosgeno (0,015 g, 4,8 x 10"2 mmol, 0,36 equiv.) en tolueno seco (5 mi) en una atmósfera de nitrógeno a -10 °C. Después de 1 hora, la espectroscopia por IR reveló un tramo de isocianato a 2268 cm _1 y la mezcla de reacción se dejó que alcanzara la temperatura ambiente.
Compuesto 6 Se añadió gota a gota una solución del alcohol 6a (0,106 g, 0,15 mol, 1,1 equiv. ) y trietilamina (0,018 g, 25 01, 0,18 mmol, 1,35 equiv.) en THF seco (5 mi) al isocianato recién preparado. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4 horas, momento en el que el análisis por TLC la formación de un nuevo producto. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y se repartió entre DCM y agua. La fase acuosa se separó y la fase orgánica se lavó con salmuera (100 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. La evaporación rotatoria a presión reducida proporcionó el producto en bruto en forma de un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía ultrarrápida [gradiente de elución de n-hexano al 40%/acetato de etilo al 60% a n-hexano al 20%/acetato de etilo al 80%, con aumentos del 5% en acetato de etilo], proporcionando el producto deseado en forma de una espuma de color blanco (0,092 g, rendimiento del 45%).
Datos Analíticos: TR 4,05 min; E (EN+) m/z (intensidad relativa) 1540 ( [M + 2]+", 30); 1557 ( [M + 18] )+', 50); EM (EN" ) m/z (intensidad relativa) 1585 ( [M - +2Na])~-, 50).
Compuesto 7 El compuesto 7 puede prepararse a partir del compuesto 6 en dos etapas.
Producto bis Desacetilado Se añadió gota a gota a través de una jeringa una solución de superhydride™ en THF (1 M, 0,35 mi, 0,35 mmol, 4 equiv.) a una solución agitada del acetato 6 (0,135 g, 8,8 x 10"2 mmol, 1 equiv.) en THF seco (7 mi) a -78 °C (hielo seco/acetona). La mezcla de reacción se dejó en agitación a -78 °C durante una hora, momento en el que el análisis por CLEM reveló la ausencia de material de partida y la formación de dos nuevos compuestos que correspondían al producto mono y bis desacetilado . A la mezcla de reacción se le añadió una alícuota más de superhydride™ (1 M, 0,35 mi, 0,35 mmol, 4 equiv. ) y la agitación continuó durante una hora más. El análisis por CLEM en este momento reveló la conversión completa en el producto bis desacetilado. Se añadió ácido cítrico (1 M, 1 mi) a la mezcla de reacción (efervescencia vigorosa) que después se dejó que alcanzara la temperatura ambiente, momento en el que se añadió una alícuota más de ácido cítrico (1 M, 1 mi) . El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida y el residuo resultante se repartió entre acetato de etilo (25 mi) y agua (25 mi) . La fase acuosa se separó y la fase de acetato de etilo se lavó con agua (25 mi) , salmuera (25 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. La eliminación del disolvente por evaporación rotatoria a presión reducida proporcionó el producto en bruto en forma de un aceite de color amarillo que se sometió a cromatografía ultrarrápida [gradiente de elución de acetato de etilo ? metanol al 1%/acetato de etilo al 99% a metanol al 2%/acetato de etilo al 98%], proporcionando el producto puro en forma de un vidrio incoloro (0,056 g, 44%). Datos Analíticos: TR 3,78 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1456 ( [M + 1]+·, 75).
Compuesto 7 Se añadió en una porción peryodinano de Dess-Martin (0,026g, 6,1 x 10~5 mol, 2,1 equiv.) a una solución del producto bis desacetilado (0,042 g, 2,9 x 10"5 mol, 1 equiv.) en DCM seco (5 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, momento en el que el análisis por indicó que la reacción se había completado. La suspensión turbia se filtró mediante lavado con DCM (20 mi) . El filtrado se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (25 mi) , agua (25 mi) , salmuera (25 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, dando el producto 7 en forma de una espuma de color blanquecino (0,035 g, 84%). Datos Analíticos: TR 3,70 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1451 ( [M + 1]+·, 30).
Compuesto 14 El compuesto 14a o 14b puede prepararse a partir del compuesto 7 a través del compuesto 8 . El producto protector alloc en el compuesto 7 puede eliminarse en las condiciones apropiadas, por ejemplo, tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) en presencia de pirrolidina. En estas condiciones, el grupo protector Fmoc también se elimina. Como alternativa, el grupo Fmoc puede eliminarse en una etapa separada, antes o después de la eliminación del grupo Alloc, usando piperidina en DMF. El producto de la etapa de desprotección es un producto de imina-carbinolamina que tiene funcionalidad imina en la posición N10-C11 de un monómero de PBD, y una funcionalidad carbinolamina en la posición N10-C11 del otro monómero, en el que la carbinolamina tiene un enlazador -C(=0)-L1-NH2 en la posición N10.
La imina-carbinolamina puede hacerse reaccionar con MC-OSu en presencia de base para generar el compuesto 8 . Véase, por ejemplo, Dubowchik y col., Bioconjugate Chem. 2002 , 13, 855-869.
Después, el grupo protector de la cadena lateral aminoacidica puede eliminarse del compuesto 8 , por ejemplo, en condiciones ácidas. Después, el producto resultante puede conjugarse con un anticuerpo apropiado que tiene funcionalidad tiol, dando el compuesto 9 .
En un ejemplo, un anticuerpo puede tratarse con DTT para reducir los enlaces de disulfuro intercatenarios . Después, el anticuerpo resultante, que tiene grupos tiol libres, puede hacerse reaccionar con un compuesto que contiene maleimida obtenido a partir del compuesto 8 para generar el compuesto 9 . El compuesto 9 puede purificarse, por ejemplo, mediante diafiltración. Véase, por ejemplo, Dubowchik y col., Bioconjugate Chem. 2002 , 13, 855-869.
Compuesto 18 Se añadió diciclohexilcarbodiimida (2,46 g, 11, 92 mmol, 1,05 equiv.) a una suspensión de N-hidroxisuccinimida (1,44 g, 12,5 mmol, 1,1 equiv.) y N-alloc fenilalanina ( 17 ) (2,83 g, 11,35 mmol, 1 equiv.) en DCM seco (120 mi) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 min y después a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió de nuevo en DCM (50 mi), se dejó en reposo durante 1 h y se filtró para eliminar la diciclohexilurea precipitada. La evaporación a presión reducida dio el producto en forma de un sólido de color blanco (3,91 g, 99%). Datos Analíticos: TR 2,93 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 369 ( [M + Na]+-, 50).
Compuesto 20 Se añadió una solución de succinimida ( 18 ) (3,91 g, 11,29 mmol, 1 equiv.) en THF (50 mi) a una solución de H-Lys(Boc)-OH ( 19 ) (2,92 g, 11,85 mmol, 1,05 equiv.) y NaHC03 (1, 04 g, 12,42 mmol, 1,1 equiv.) en THF (50 mi) y H20 (100 mi). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 h y el THF se evaporó a presión reducida. El pH se ajustó a pH 3-4 con ácido cítrico para precipitar una goma de color blanco. Esta se extrajo con acetato de etilo (2 x 250 mi) y los extractos combinados se lavaron con H20 (200 mi), salmuera (200 mi), se secaron (MgS04) y se evaporaron a presión reducida, dando el producto en forma de una espuma de color blanco (4,89 g, 91%). Datos Analíticos: TR 3,03 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 478 ( [M + 1])+·, 80).
Compuesto 7b Se añadió EEDQ (2,66 g, 10,75 mmol, 1,05 equiv.) a una solución de p-aminobencil alcohol (21) (1,32 g, 10,75 mmol, 1,05 equiv.) y Alloc-Phe-Lys (Boc) -OH (4,89 g, 10,24 mmol, 1,0 equiv.) en THF seco (75 mi). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. El disolvente se evaporó a presión reducida, dando un sólido de color pardo pálido. El sólido se trituró con éter dietílico y se filtró mediante lavado con un exceso de éter dietílico. Esto proporcionó el producto en forma de un sólido de color blanco (4,54 g, 76%). Datos Analíticos: TR 3,08 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 583, 8 ( [M + 1]+·, 100) .
La síntesis de 7b se describe a continuación en el Esquema 12.
Esquema 12.
Compuesto 9b Se añadió trietilamina (0,18 g, 0,25 mi, 1,79 mmol, 2,3 equiv.) a una solución agitada de la Jbis-anilina mono-alloc protegida (6) (0,608 g, 0,77 mmol, 1,06 equiv.) y trifosgeno (0,088 g, 0,3 mmol, 0,39 equiv.) en THF seco (5 mi) en una atmósfera de nitrógeno a -10 °C. La mezcla de reacción se dejó que alcanzara la temperatura ambiente, una muestra se trató con metanol, y se analizó por CLEM como el carbamato de metilo .
Al isocianato recién preparado se le añadió gota a gota una solución del alcohol bencílico (7b) (0,422 g, 0,72 mmol, 1,0 equiv. ) y trietilamina (0,18 g, 0,25 mi, 1,79 mmol, 2,3 equiv. ) en THF seco (20 mi). La mezcla de reacción se calentó a 60-65 °C durante 4 horas y después se dejó en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente, momento en el que el análisis por CLEM reveló la formación de un nuevo producto. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, proporcionando el producto en bruto en forma de un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía ultrarrápida [gradiente de elución de r¡-hexano al 50%/acetato de etilo al 50% a n-hexano al 10%/acetato de etilo al 90% en aumentos del 10%], dando el producto deseado en forma de una espuma de color blanco (0, 385 g, 38%). Datos Analíticos: TR 3,78 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1402,8 ( [M + H]+\ 15).
Compuesto 10b Se añadió una solución de K2C03 (0,158 g, 1,15 mmol, 5 equiv.) en H20 (1 mi) a una solución del acetato (9b) (0,32 g, 0,23 mmol, 1 equiv.) en metanol (6 mi). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El metanol se evaporó a presión reducida, el residuo se diluyó con H20 (50 mi) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 75 mi) . Los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con H20 (100 mi) , salmuera (100 mi) , se secaron (MgS04) y se evaporaron a presión reducida, dando el producto en forma de una espuma de color blanco (0,292 g, 97%). Datos Analíticos: TR 3,52 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1318,6 ( [M + 1]+·, 15).
Compuesto 11b Se añadió en una porción peryodinano de Dess-Martin (0,197 g, 0,465 mmol, 2,1 equiv. ) a una solución del producto bis desacetilado (10b) (0,292 g, 0,22 mmol, 1 equiv.) en DCM seco (15 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 h, momento en el que el análisis por CLEM indicó que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (50 mi), se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (3 x 100 mi), agua (100 mi), salmuera (100 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, dando el producto en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de acetato de etilo al 80%/n-hexano al 20% a acetato de etilo al 100% en aumentos del 5%] dio el producto 11b en forma de una espuma de color amarillo (0,235 g, 81%). Datos Analíticos: TR 3,42 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1314,8 ( [M + 1]+·, 8).
Compuesto 12a Se añadió Pd(PPh3)4 (4 mg, 3,5 x 10"6 mol 0,02 equiv.) a una solución del compuesto £>is-alloc (11b) (0,230 g, ,0,175 mmol, 1 equiv.) y pirrolidina (31 mg, 36 µ?, 0,44 mmol, 2,5 equiv.) en DCM seco (10 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, momento en el que el análisis por CLEM indicó que quedaba (11b) sin reaccionar. Se añadieron más equivalentes de pirrolidina (31 mg, 36 µ?, 0,44 mmol, 2,5 equiv.) y Pd(PPh3) (4 mg, 3,5 x 10~6 mol, 0,02 equiv.) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h más. El análisis por CLEM indicó que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (40 mi) y se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (100 mi), agua (100 mi), salmuera (100 mi), se secó (MgS04) y se evaporó a presión reducida, dando una espuma de color amarillo. Esto se trituró con éter dietilico, dando el producto (0,187 g, 95%) que se usó sin purificación adicional. Datos Analíticos: TR 2,80 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1128,5 ( [M + 1]+·, 20) .
Compuesto 23 Se añadió una solución de Alloc-Val-OSu ( 22 ) ( (RT 2,67 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 321,4 ( [M + Na]+-, 57) preparada de acuerdo con el procedimiento para la preparación del compuesto ( 16 ) ) (11,67 g, 39,0 mmol, 1 equiv. ) en THF (50 mi) a una solución de H-Ala-OH (3,66 g, 41,08 mmol, 1,05 equiv.) y NaHC03 (3,61 g, 43,03 mmol, 1,1 equiv.) en THF (100 mi) y H20 (100 mi) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas y el THF se evaporó a presión reducida. El pH se ajustó a pH 3-4 con ácido cítrico para precipitar una goma de color blanco. Esta se extrajo con acetato de etilo (6 x 150 mi) y los extractos combinados se lavaron con H20 (200 mi), salmuera (200 mi), se secaron (MgSC ) y se evaporaron a presión reducida, dando un sólido de color blanco. La trituración con éter dietilico (exceso) proporcionó el producto puro 23 en forma de un polvo de color blanco (7, 93 g, 74%) .
Datos Analíticos: TR 2,17 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 295 ( [M + Na]+', 63), 273 ( [M + 1]+·, 60).
Compuesto 8 Se añadió EEDQ (4,79 g, 19,3 mmol, 1,05 equiv.) a una solución de p-aminobencil alcohol ( 21 ) (2,38 g, 19,3 mmol, 1,05 equiv.) y Alloc-Val-Ala-OH (5,02 g, 18,4 mmol, 1,0 equiv. ) en THF seco (100 ml) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. El disolvente se evaporó a presión reducida, dando un sólido de color pardo pálido. El sólido se trituró con éter dietilico y se filtró, mediante lavado con un exceso de éter dietilico. Esto proporcionó el producto en forma de un sólido de color blanco (6,2 g, 89%). Datos Analíticos: TR 2,50 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 400, 6 ( [M + Na]+-, 50), 378, 6 ( [M + 1]+·, 60) .
La síntesis de 8 se muestra a continuación en el Esquema 13. Esquema 13.
Compuesto 9c Se añadió trietilamina (0,16 g, 0,22 ml 1,59 mmol, 2,2 equiv.) a una solución agitada de la j is-anilina mono-alloc protegida (6) (0,572 g, 0,72 mmol, 1 equiv.) y trifosgeno (0,077 g, 0,26 mmol, 0,36 equiv.) en THF seco (20 ml) en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C, una muestra se trató con metanol y se analizó por CLEM como el carbamato de metilo.
A isocianato recién preparado se le añadió gota a gota una solución del alcohol bencílico (8) (0,4 g, 1,06 mmol, 1,5 equiv. ) y trietilamina (0,109 g, 0,15 mi, 1,08 mmol, 1,5 equiv. ) en THF seco (20 mi). La mezcla de reacción se controló por CLEM en intervalos de 30 min. Después de 3 h, el análisis por CLEM mostró la conversión en el producto, la presencia de carbamato de metilo y bis-anilina mono-alloc protegida (6). Se añadió una porción más de trifosgeno (0,038 g, 0,128 mmol, 0,18 equiv.) y la reacción continuó a 40 °C durante 18 h más. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, proporcionando el producto en bruto en forma de un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía ultrarrápida [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 97%/metanol al 3% en aumentos del 0,5%], dando el producto deseado en forma de una espuma de color blanco (0,59 g, 69%). Datos Analíticos: TR 3,58 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1197 ( [M + l]+>, 60).
Compuesto 10c Se añadió una solución de K2CO3 (0,195 g, 1,41 mmol, 5 equiv.) en H20 (1,4 mi) a una solución del acetato (9c) (0, 338 g, 0,282 mmol, 1 equiv.) en metanol (8,5 mi). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El metanol se evaporó a presión reducida, el residuo se diluyó con H20 (50 mi) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 75 mi) . Los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con H20 (100 mi), salmuera (100 mi), se secaron (MgS04) y se evaporaron a presión reducida, dando el producto en forma de una espuma de color blanco (0,298 g, 95%). Datos Analíticos: TR 3,28 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1113 ( [M + 1]+·, 40) .
Compuesto 11c Se añadió en una porción peryodinano de Dess-Martin (0,312 g, 0,74 mmol, 2,1 equiv. ) a una solución del producto bis desacetilado ( 10c ) (0,39 g, 0,35 mmol 1 equiv.) en DCM seco (20 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 h, momento en el que el análisis por CLEM indicó que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (50 mi), se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (3 x 100 mi), agua (100 mi), salmuera (100 mi) y se secó (MgS04) . El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, dando el producto en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 97%/metanol al 3% en aumentos del 1%] dio el producto en forma de un sólido de color blanco (0,201 g, 52%). Datos Analíticos: TR 3,15 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1109 ( [M + 1]+·, 30), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 1107 ( [M - 1]"·, 100).
Compuesto 12c Se añadió Pd(PPh3)4 (8 mg, 7 x 10"6 mol 0,04 equiv.) a una solución del compuesto j is-alloc ( 11c) (0,190 g, 0,17 mmol, 1,0 equiv.) y pirrolidina (61 mg, 71 µ?, 0,86 mmol, 5,0 equiv.) en DCM seco (5 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, dando una suspensión turbia. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se trituró con acetato de etilo, dando un sólido de color blanquecino que se recogió por filtración, dando el producto (0,13 g, 82%) que se usó sin purificación adicional. Datos Analíticos: TR 2,55 min; E (EN+) m/z (intensidad relativa) 922 ( [M + 1]+·, 52).
Compuesto 13a Se añadió EEDQ (18,4 mg, 7,45 x 10"5 mol, 2,2 equiv. ) a una solución del dipéptido de amina (12a) (40 mg 3,5 x 10~5 mol, 1.0 equiv.) y ácido maleimida caproico (8,2 mg, 3,9 x 10"5 mol 1.1 equiv.) en DCM (2 mi) y metanol (1 mi). La solución se agitó a 40 °C durante 72 h. El disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en DCM (50 mi), se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCC>3 (2 x 50 mi) , H20 (50 mi), salmuera (50 mi), se secó (MgS04) y se evaporó a presión reducida, dando una espuma de color blanco. Esto se trituró con éter dietílico y se filtró mediante lavado con un exceso de éter dietílico, proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (36 mg, 78%). Datos Analíticos: TR 3,27 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1320 ( [M + 1]+·, 75) .
Compuesto 13b Se añadió ácido trifluoroacético frío (13 mi) al derivado de maleimida (13a) (65 mg, 4,9 x 10"5 mol) a 0 °C. La solución se agitó a esta temperatura durante 30 min y el ácido trifluoroacético se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió de nuevo en DCM anhidro (5 mi) . El disolvente se evaporó, el residuo se trituró con éter dietílico, el sólido de color amarillo resultante se recogió por filtración y se secó al vacío (64 mg, 97%). Datos Analíticos: TR 2,83 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1222 ( [ + 2]+·, 5).
El acoplamiento de un reactivo de maleimida-PEG-succinimida con 12a o 12b proporciona los enlaces al fármaco PBD 15. La figura la muestra las estructuras de los enlaces al fármaco PBD MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 15ba, MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 15bb y P-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 15d, en los que PEG es etilenoxi, y PAB es para-aminobenciloxicarbonilo .
Compuesto 15aa El dipéptido de amina (12a) (83 mg, 7,4 x 10"5 mol, 1 equiv.) se disolvió en una mezcla de DMF seca al 10%/DCM (2 mi) y se añadió maleimida-4Peg-succinimida (353 µ? de una solución 250 mmol en DC seco) seguida de N, N-diisopropiletilamina (8,2 mg, 11 µ?, 8,1 x 10"5 mol, 1,1 equiv.)- La solución se agitó a temperatura ambiente durante 72 h en una atmósfera de nitrógeno. El disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 92%/metanol al 8% en aumentos del 1%] proporcionó el producto en forma de una espuma de color amarillo (85 mg, 76%) . Datos Analíticos: TR 3,13 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1526 ( [M + 1]+·, 5) .
Compuesto 15 h El dipéptido de amina (12a) (70 mg, 76,2 x 10"5 mol, 1 equiv.) se disolvió en una mezcla de DMF seca al 10%/DCM (2 mi) y se añadió nnaleimida-8Peg-succinimida (263 µ? de una solución 250 mmol en DCM seco) seguida de NN-diisopropiletilamina (6,9 mg, 9,5 µ?, 6,6 x 10"5 mol, 1,06 equiv.). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 72 h en una atmósfera de nitrógeno. El disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 92%/metanol al 8% en aumentos del 1%] proporcionó el producto en forma de una espuma de color pardo (44 mg, 41,5%). Datos Analíticos: TR 3,20 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1703 ( [M + 2 ] +" , 5) .
Compuesto 15ba (MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD; 1 l-hidroxi-7-metoxi-8- (5- ( (S) -7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5, lla-tetrahidro-pirrólo [2,1-c] [l,4]benzodiazepin-8-iloxi)pentiloxi) -2-metilen-5-oxo-2, 3 , 11 , lla-tetrahidro-pirrolo [2 , 1-c] [l,4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (US, llaS) -4- ( (2S,5S) -2- (4-aminobutil) -5-bencil-25- (2 , 5-dioxo-2, 5-dihidro-lH-pirrol-l-il) -4, 7,23-trioxo-10, 13, 16, 19-tetraoxa-3, 6,22-triazapentacosanamido) bencilo) Se añadió ácido trifluoroacético frío (17 mi) al derivado de maleimida (15aa) (85 mg, 5,6 x 10~5 mol) a 0 °C. La solución se agitó a esta temperatura durante 30 min y el ácido trifluoroacético se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió de nuevo en DCM anhidro (5 mi) . El disolvente se evaporó, el residuo se trituró con éter dietílico, el sólido de color amarillo resultante se recogió por filtración y se secó al vacío (70 mg, 81%). Datos Analíticos: TR 2,78 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1444 ( [M + 2]+', 1).
Compuesto 15hb (MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD; ll-hidroxi-7-metoxi-8- (5- ( (S) -7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5, lla-tetrahidro-pirrolo [2, 1-c] [1,4]benzodiazepin-8-iloxi)pentiloxi) -2- etilen-5-oxo-2 , 3, 11 , lla-tetrahidro-pirrolo [2, 1-c] [1 ,4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (US, llaS) -4- ( (2S,5S) -2- (5-aminobutil) -5-bencil-37- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidro-lH-pirrol-l-il) -4, 7, 35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3, 6, 34-triazaheptatriacontanamido) bencilo) Se añadió ácido trifluoroacético frío (9 mi) al derivado de maleimida (15ab) (44 mg, 2,6 x 10"5 mol) a 0 °C. La solución se agitó a esta temperatura durante 30 min y el ácido trifluoroacético se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió de nuevo en DCM anhidro (5 mi) . El disolvente se evaporó, el residuo se trituró con éter dietilico, el sólido de color amarillo resultante se recogió por filtración y se secó al vacio (40 mg, 91%) .
Datos Analíticos: TR 2,80 min; E (EN+) m/z (intensidad relativa) 1603 ( [M + 2]+·, 1).
Compuesto 15d (MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD; ll-hidroxi-7-metoxi-8- (5- ( (S) -7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5, lla-tetrahidro-pirrólo [2,1-c] [1,4]benzodiazepin-8-iloxi)pentiloxi) -2-metilen-5-oxo-2, 3, 11 , 1 la-tetrahidro-pirrolo [2, 1-c] [l,4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (11S, llaS) -4- ( (2S,5S) -37- (2, 5-dioxo-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il) -5-isopropil-2-metil-4 , 7,35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3, 6, 34-triazaheptatriacontanamido) bencilo) Se añadió EEDQ (12 mg, 4,8 x 10"5 mol, 1,1 equiv.) a una suspensión del dipéptido de amina ( 12c ) (40,3 mg 4,4 x 10"5 mol, 1,0 equiv.) y maleimida-8 Peg-ácido (28 mg, 4,8 x 10~5 mol, 1,1 equiv.) en DCM seco (5 mi). Se añadió dimetilacetamida seca (0,05 mi), dando una solución de color amarillo pálido que se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se trituró con éter dietilico. El producto sólido resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna. Datos Analíticos: TR 2,90 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1496 ( [M + ?]+·,40).
Compuesto 15e Se añadió N, W-diisopropildietilamina (10,8 µ?, 8 mg, 7,6 x 10~5 mol, 2,2 equiv.) a una solución del dipéptido de amina ( 12c ) (32 mg, 3,5 x 10"5 mol, 1,0 equiv.) y maleimida-dPeg®24-NHS éster (58 mg, 4,16 x 10"5 mol, 1,2 equiv.) en DC seco (5 ml) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 96 h. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (15 ml) , se lavó con NaHC03 saturado (25 ml) , salmuera (25 ml) , se secó ( gS0 ) y se evaporó a presión reducida, dando un vidrio de color amarillo pálido. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 91%/metanol al 9% en aumentos del 1%] dio el producto en forma de una goma viscosa de color amarillo (17 mg, 22%) .
Compuesto 16d Se seleccionó el péptido biotina-A20FMDV-Cys (59) que es altamente selectivo para la integrina a?ß6/ que se regula de forma ascendente significativamente por muchos cánceres, para la conjugación de los derivados del enlazador PBD.
Se añadió una solución del péptido (59) (11,3 mg, 4,35 µp???, 0,98 equiv.) en 1/1 de acetonitrilo/agua (2 ml) a una solución de (15d) (6,91 mg, 4,62 µ????, 1,0 equiv.) en 1/1 acetonitrilo/agua (3 ml) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 96 h. El acetonitrilo se evaporó a presión reducida y el agua se eliminó por liofilización, dando una espuma de color blanco. La purificación por HPLC semi-preparativa seguida de liofilización dio el producto en forma de una espuma de color blanco ( 3 , 8 mg, 21%). Datos Analíticos: EM (MaldiTOF) m/z (intensidad relativa) 3991,1 ( [M + ?]+·, 100) .
Compuesto 24a El compuesto 24a se desvela como el compuesto 3 del documento WO 2004/043963.
Compuesto 24b Se añadió en porciones TCCA sólido (18 g, 77,4 mmol, 1,1 equiv.) a una solución de TEMPO (730 mg, 4,67 mmol, 0,07 equiv.) y alcohol 24a (25g, 70,5 mmol, 1 equiv.)/ en DCM (500 mi) a 0 °C. Se observó una ligera exotermia. La reacción se consideró completa por TLC (acetato de etilo) y CL/EM (2,38 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 353,34 ( [M + H]+', 100)) después de 30 minutos. La suspensión se filtró a través de celite y se lavó con DCM. El filtrado se lavó con bisulfito sódico acuoso seguido de NaHCC»3 saturado (precaución, efervescencia vigorosa), salmuera (100 mi) y se secó (MgS04) . La filtración y la evaporación del disolvente al vacio proporcionaron el producto en bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (elución: 20:80 v/v de n-hexano/EtOAc) , produciendo la cetona 24b en forma de un sólido de color blanco (20 g, 80%). Datos Analíticos: [<x]26D = 15° (c = 0,2, CHCI3) ; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 353, 34 ( [M + ?]+·, 100); ) ; IR (ATR, CHC13) 1748, 1642, 1518, 1425, 1335, 1222, 1176, 1063, 1032, 986, 857, 785, 756 cm"1. Compuesto 25 Se inyectó en una porción 2,6-lutidina anhidra (0,395 mi, 365 mg, 3,40 mmol) a una solución agitada vigorosamente de cetona 24b (200 mg, 0,57 mmol) en DCM seco (10 mi) a -45 °C (baño de refrigeración de hielo seco/acetonitrilo) en una atmósfera de nitrógeno. Se inyectó rápidamente gota a gota anhídrido tríflico anhidro, tomado de una ampolla recién abierta (477 ?1, 800 mg, 2,83 mmol), al mismo tiempo que se mantuvo la temperatura a -40 °C o inferior. La mezcla de reacción se dejó en agitación a -45 °C durante 1 hora, momento en el que el análisis por TLC (50/50 v/v de n-hexano/EtOAc) reveló el consumo completo del material de partida. La mezcla de reacción fría se diluyó inmediatamente con DCM (20 mi) y, con agitación vigorosa, se lavó con agua (1 x 50 mi) , una solución al 5% de ácido cítrico (1 x 50 mi) , NaHCC>3 saturado (50 mi), salmuera (30 mi) y se secó (MgS04) . La filtración y la evaporación del disolvente al vacío proporcionaron el producto en bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (gradiente de elución: 60:40 de v/v n-hexano/EtOAc a 50:50 v/v de r¡-hexano/EtOAc) , proporcionando el triflato 25 en forma de una espuma de color amarillo (151 mg, 55%) .
Ninguno de los compuestos 1,2 insaturados correspondientes fue visible por RMN. Datos Analíticos: [oc]28D = -55° (c = 0,2, CHCI3) ; RMN XH (400 MHz, CDC13) d 7,75 (s, 1H) , 6,92 (s, 1H) , 6,25 (t, 1H, J= 1,84 Hz) , 5,19 (dd, 1H, J= 5, 05 , 11, 93 Hz) , 4, 03 (s, 6H), 3,90 (s, 3H) , 3,50 (ddd, 1H, J = 2,29, 11, 96, 16,59 Hz), 3,02 (ddd, 1H, J= 1,60, 5,05, 16,58 Hz) ; IR (ATR, CHCI3) 1748, 1653, 1577, 1522, 1415, 1335, 1276, 1205, 1130, 1061, 1024, 933, 908, 820, 783, 757, 663, cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 485, 45 ( [M + ?]+·, 100).
Compuesto 26 Se añadió Pd(PPh3)4 (860 mg, 744 µp???, 0,04 equiv.) a una mezcla agitada de triflato de enol 25 (9,029 g, 18,6 mmol, 1 equiv.)/ ácido 4-metoxifenilborónico (3,67 g, 24,1 mmol, 1,3 equiv.), Na2C03 (5,13 g, 48,3 mmol, 2,6 equiv.), EtOH (45 mi), tolueno (90 mi) y agua (45 mi) . La mezcla de reacción se dejó en agitación en una atmósfera de nitrógeno durante una noche, después de lo cual se observó el consumo completo del material de partida por TLC (60/40 de EtOAc/hexano) y CL/EM (3,10 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 443, 38 ( [M + H]+-, 100)). La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (400 mi), se lavó con H20 (2 x 300 mi) , salmuera (200 mi) , se secó (MgSOí) , se filtró y se evaporó a presión reducida, proporcionando el producto en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida (gradiente de elución: 60:40 v/v de hexano/EtOAc a 40:60 v/v de hexano/EtOAc) proporcionó el compuesto C2-arilo 26 en forma de un sólido de color naranja (7,0 g, 85%).
Datos Analíticos: [oc]25D = -122° (c = 0,2, CHC13) ; RMN XH (400 MHz, CDC13) d 7,78 (s, 1H) , 7,30 (d, 2H, J = 8,81 Hz), 6,95 (s, 1H) , 6,87 (s, 1H) , 6,83 (d, 2H, J = 8,88 Hz) , 5,03 (dd, 1H, J = 11,71, 5,28 Hz) , 3,95 (s, 3H) , 3,93 (s, 3H) , 3,76 (s, 3H) , 3,73 (s, 3H), 3, 48-3, 43 (m, 1H) , 2,99-2, 93 (m, 1H) , RMN 13C (100 MHz, CDC13) d 170,7, 162, 5, 158, 4, 153, 9, 149, 1, 137, 9, 126, 3, 125, 6, 125, 3, 122, 9, 122, 3, 113, 8, 110, 03, 107, 6, 59, 7, 57, 9, 56, 5, 56,2, 55, 1, 54,9, 52,2, 33, 9, 20, 7, 14,.0; IR (ATR, CHCI3) 1736, 1624, 1575, 1516, 1424, 1326, 1253, 1178, 1069, 1031, 863, 820, 803, 786, 757, 653, 617 cm" x; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 443,38 ( [M + H]+>, 100. Compuesto 27 Se añadió en porciones LiBH4 (464 mg, 21,3 mmol, 1,5 eguiv.) a una solución agitada del éster 26 (6,28 g, 14,2 mmol, 1 equiv.) en THF anhidro (100 mi) y EtOH (120 mi). Se observó una exotermia acompañada por una espumación vigorosa y la temperatura se mantuvo entre 15 °C y 25 °C con la ayuda de un baño de refrigeración (hielo/agua) . La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 1 hora, después de lo cual se observó la conversión completa del material de partida por TLC (acetato de etilo) . La mezcla de reacción se diluyó cuidadosamente con acetato de etilo (500 mi) y el exceso de borohidruro se destruyó con ácido cítrico acuoso frío. La fase orgánica se lavó con HC1 acuoso 1 N (100 mi) seguido de NaHC03 acuoso saturado (100 mi), salmuera (100 mi), se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó a presión reducida a 35 °C, proporcionando el alcohol intermedio (4,50 g, 10,8 mmol, rendimiento intermedio del 76%) que se disolvió de nuevo inmediatamente en DCM anhidro (200 mi) . La solución se enfrió a 0 °C y se añadió TEA (2,26 mi, 0,162 mmol, 1,5 equiv.) seguido de una solución de cloruro de acetilo (1 mi, 14,0 mmol, 1,3 equiv.) en DCM anhidro (30 mi). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y reaccionar durante 1 hora. Se observó la reacción completa por TLC (EtOAc) . La solución se lavó con ácido cítrico acuoso 2 N (50 mi) , NaHC03 acuoso saturado (50 mi) , salmuera (50 mi) , se secó sobre MgS04 se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 50/50 hasta 60/40 de EtOAc/hexano) , produciendo 2,65 g (41% en dos etapas) del producto puro en forma de un sólido de color naranja. Datos Analíticos: [ct]24D = -130° (c = 0,28, CHC13) ; RMN XH (400 MHz, CDC13) d 7,74 (s, 1H), 7,12 (d, 2H, J = 8,84 Hz) , 6,91 (s a, 1H), 6,80 (d, 2H, J = 8,88 Hz) , 6,15 (s, 1H) , 5, 04-5, 00 (m, 1H), 4,61-4,42 (m, 2H) , 4,01 (s, 6H) , 3,78 (s, 3H) , 3,35-3,25 (m, 1H), 2, 85-2, 79 (m, 1H) , 2,06 (s, 3H) . RMN 13C (100 MHz, CDCI3) d 171,1, 159,1, 149,5, 126,1, 126,0, 114, 1, 107,2, 56,8, 56, 6, 55, 3, 33, 5, 20, 9; IR (ATR, CHC13) 1731, 1643, 1623, 1577, 1517, 1421, 1333, 1278, 1248, 1222, 1183, 1076, 1059, 1032, 864, 821, 802, 787, 756, 644, 619 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 456,81 ( [M + ?]+·, 100.
Compuesto 28 Se añadió polvo de cinc (365 mg, 5,58 mmol, 15 equiv.) a una solución del compuesto 27 (170 mg, 0,372 mmol, lequiv. ) en etanol (7,6 mi) y ácido acético (1,97 mi). La mezcla se agitó vigorosamente y se calentó a reflujo. El control por TLC (acetato de etilo) y el análisis por CL/E (2,97 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 427,57 ( [M + H]+-, 100)) revelaron que la reacción se completó después de 5 min. La reacción se dejó enfriar, se filtró a través de celite y se lavó con DCM (50 mi). El filtrado se lavó con agua (3 x 30 mi), NaHC03 saturado (2 x 30 mi), salmuera (30 mi), se secó sobre MgS0 , se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 60/40 hasta 80/20 de EtOAc/Hexano) , produciendo 140 mg (88%) de producto puro en forma de una espuma de color blanco. Datos Analíticos: [a]24D = -108° (c = 0,20, CHC13) ; RMN *H (400 MHz, CDCI3) d 7,22 (d, 2H, J = 8,80 Hz) , 6,89 (s a, 1H) , 6,86 (d, 2H, J = 8,82 Hz), 6,80 (s, 1H) , 6,29 (s, 1H) , 5, 02-4, 96 (m, 1H), 4, 50-4, 40 (m, 4H) , 3,89 (s, 3H) , 3,82 (s, 3H) , 3,81 (s, 1H), 3,30-3,25 (m, 1H) , 2,85-2,79 (m, 1H) , 2,06 (s, 3H) . RMN 13C (100 MHz, CDCI3) 5194, 6, 171, 1, 171,0, 170, 4, 164, 0, 160,8, 155,1, 149,5, 146,2, 143,6, 130,5, 129,2, 125,8, 115,5, 114, 1, 107, 6, 105, 4, 100,9, 63, 5, 60, 4, 56, 9, 56, 3, 37,4, 21,0, 20,6, 14,2; IR (ATR, CHC13) 1733, 1589, 1512, 1396, 1209, 1176, 1113, 1031, 823, 791, 762 cnf1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 427,57 ( [M + ?]+·, 100).
Compuesto 29 Se añadió gota a gota una solución de la amina 28 (400 mg, 0,93 mmol, 1 equiv.) y TEA (350 DI, 2,5 mmol, 2,6 equiv.) en THF seco a una solución recién preparada de trifosgeno (125 mg, 0,42 mmol, 0,45 equiv.) en THF seco (4 ral) a 0 °C. La suspensión de color blanco se dejó en agitación a 0 °C durante 10 min. Se añadió rápidamente una solución del alcohol 7b (Alloc-Phe-Lys (Boc) -PABOH, 546 mg, 0,93 mmol, 1 equiv.) y TEA (350 DI, 2,5 mmol, 2,6 equiv.) en THF seco (40 mi) . La suspensión de color blanco se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 15 minutes, después se calentó a 65 °C durante 2 horas y después se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche. Las sales TEA de color blanco se eliminaron por filtración a través de algodón hidrófilo. El filtrado se concentró y se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente, MeOH al 1% en cloroformo hasta MeOH al 3% en cloroformo) , produciendo 700 mg del carbamato deseado (72%). Datos Analíticos: [a]24D = -30,2° (c = 0,18, CHCI3) ; RMN 2H (400 MHz, CDC13) d 8,54 (s, 1H), 8,43 (s, 1H) , 7,74 (s, 1H) , 7,45 (d, 2H, J = 8,43 Hz) , 7,23 (d, 2H, J = 8,52 Hz) , 7,16-7,06 (m, 7H) , 6,78-6,72 (m, 4H), 6,46 (d, 1H, J = 7,84 Hz) , 5, 82-5, 73 (m, 1H) , 5,30 (s, 1H), 5,19-5,06 (m, 2H) , 5,03 (d, 1H, J = 1,29 Hz) , 4,93-4,87 (m, 1H), 4,63 (m, 1H) , 4, 47-4, 28 (m, 6H) , 3,87 (s, 3H) , 3,76 (s, 3H), 3,72 (s, 1H) , 3,16-3,09 (m, 1H) , 3, 07-2, 95 (m, 4H) , 2, 72-2, 67 (m, 1H) , 1, 95-1, 83 (m, 1H) , 1,60-1,51 (m, 1H) , 1, 43-1, 39 (m, 2H) , 1,35 (s, 9H) , 1,28-1,19 (m, 2H) . RMN 13C (100 MHz, CDCI3) d 171, 5, 171, 1, 169, 2, 165, 8, 159, 1, 156,2, 153,8, 151,6, 144,1, 137,8, 135,8, 132,2, 131,9, 129,1, 129,0, 128,9, 127,3, 126,2, 125,9, 123,5, 123,4, 119,9, 118,2, 114, 2, 111, 3, 66, 5, 66, 2, 64, 0, 56,5, 56, 1, 55, 3, 53,8, 33,1, 30,9, 29,4, 28,4, 22,6, 20,8; IR (ATR, CHC13) 1697, 1652, 1604, 1516, 1456, 1418, 1245, 1225, 1177, 1115, 1033, 824, 750 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1036,25 ( [M + ?]+·, 100) .
Compuesto 30 Se añadió una solución acuosa (3,3 mi) de carbonato potásico (600 mg, 4,34 mmol, 5 equiv.) a una solución del éster acetato 29 (920 mg, 0,89 mmol, 1 equiv.) en metanol (20 mi). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 50 min, momento en el que el análisis por TLC (cloroformo/metanol, 90/10) mostró la finalización. La mezcla se repartió entre agua (150 mi) y diclorometano (200 mi) . La fase orgánica se lavó con ácido cítrico 1 N (50 mi) seguido de salmuera (50 mi), se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó a presión reducida, produciendo el alcohol deseado 30 (700 mg, 79%). Datos Analíticos: [a]24D = -61° (c = 0,18, CHC13); RMN H (400 MHz, CDCI3) d 8,60 (s, 1H) , 8,51 (s, 1H) , 7,64 (s, 1H), 7,42 (d, 2H, J = 8,38 Hz) , 7,24-7,18 (m, 2H) , 7,1-7,05 (m, 7H) , 6, 83-6, 66 (m, 5H) , 5,81-5,71 (m, 1H) , 5,43 (s, 1H) , 5,18-5,08 (m, 2H) , 4,99 (s, 2H) , 4, 75-4, 69 (m, 2H) , 4,48-4,25 (m, 5H) , 3,86 (s, 3H) , 3,82-3,76 (m, 2H) , 3,74 (s, 3H), 3,72 (s, 3H) , 3,19-3,12 (m, 1H) , 3, 05-2, 92 (m, 4H) , 2, 62-2, 57 (m, 1H) , 1,85-1, 75 (m, 2H) , 1,59-1,51 (m, 1H) , 1, 38-1,34 (m, 11H) , 1,28-1,18 (m, 2H) . RMN 13C (100 MHz, CDCI3) d 171,7, 169, 5, 167, 0, 159,2, 156,3, 153,9, 151, 6, 144,4, 137,8, 135,9, 132,3, 131,9, 129,2, 128,8, 127,2, 126, 0, 124,5, 123, 3, 120, 1, 118, 1, 114,2, 111, 3, 66, 6, 66, 1, 61, 6, 56, 5, 56, 1, 55, 3, 53, 8, 39, 9, 33, 6, 31, 1, 29, 4, 28,4, 22,6; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 994, 7 ( [M + H]+I, 100) .
Compuesto 31 El alcohol 30 (500 mg, 0,503 mmol, 1 equiv. ) se disolvió en DCM anhidro (50 mi) a temperatura ambiente. A la mezcla se le añadió peryodinano de Dess-Martin sólido (300 mg, 0,707 mmol, 1,4 equiv.) seguido de 75 mg más en 1 h, seguido de 57 mg más en 2 h, y 31 mg en 5 h, tomando la masa total del peryodinano de Dess-Martin a 463 mg (1,09 mmol, 2,17 equiv.). La reacción se controló continuamente por TLC (cloroformo/metanol, 95/5, dos eluciones). Después de 6,5 horas, la reacción se trató repartiendo la mezcla de reacción entre DCM y NaHS03 acuoso saturado. Después, la fase orgánica se lavó con NaHCC>3 acuoso saturado seguido de salmuera, se secó sobre MgSC^, se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 0/100 hasta 2/98 de metanol/cloroformo) , produciendo 259 mg (52%) del producto puro 31. Datos Analíticos: [a]24D = +106° (c = 0,16, CHC13) ; MN XH (400 MHz, CDC13) d 8,68 (s, 1H) , 7, 54-7, 46 (m, 2H) , 7,36 (s, 1H), 7,31-7,16 (m, 8H) , 6,89 (d, 2H, J = 8,70 Hz) , 6,75 (s a, 1H) , 6,61 (s, 1H) , 5,89-5,84 (m, 2H) , 5,45 (d, 1H, J = 4,80 Hz), 5,28-5,08 (m, 3H) , 4,84-4,76 (m, 2H) , 4,58-4,47 (m, 4H) , 4,28 (s a, 1H) , 4, 02-3, 95 (m, 1H) , 3,92 (s, 3H) , 3,83 (s, 3H) , 3,74 (s, 2H) , 3,41-3,32 (m, 1H) , 3,16-3,02 (m, 5H), 2, 03-1, 83 (m, 1H) , 1,68-1,61 (m, 1H) , 1, 55-1,39 (m, 11H), 1,36-1,28 (m, 2H) . RMN 13C (100 MHz, CDC13) d 171,7, 169,5, 163,2, 159,1, 156,3, 151,1, 148,6, 138,0, 135,9, 132,3, 129,2, 128,8, 127,2, 126,3, 126,2, 121,7, 120,0, 118,2, 114,2, 112,7, 110,7, 86,2, 79,3, 67,6, 66,2, 59,5, 56,4, 56,15, 56,1, 55,3, 53,8, 39,9, 38,1, 35,1, 31,0, 29,4, 28, 4, 22,7 ; IR (ATR, CHC13) 3313, 2935, 2356, 1691, 1603, 1512, 1431, 1253, 1177, 1119, 1033, 824, 750, 698 cnf1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 992, 41 ( [M + ?]+·, 100).
Compuesto 32 Se añadió Pd(PPh3) 4 sólido (8 mg, 6,9 Dmol, 0,02 equiv.) a una solución recién preparada del material de partida 31 (346 mg, 0,349 mmol, 1 equiv.) y pirrolidina (43,3 DI, 0,523 mmol, I, 5 equiv.) en DCM seco (10 mi) en una atmósfera inerte a temperatura ambiente. La reacción se completó después de 45 min como se indicó por TLC (90/10 v/v de cloroformo/metanol) y CL/E (2,93 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 908, 09 ( [M + H]+', 100)). Los volátiles se eliminaron por evaporación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 2/98 hasta 5/95 de metanol/cloroformo) , produciendo 298 mg (94%) del producto puro 32. Datos Analíticos: R N *H (400 MHz, CDC13) d 8,87 (s, 1H), 7,86 (d, 1H, J = 8,06 Hz) , 7,51 (d, 2H, J = 8,42 Hz) , 7,36-7,11 (m, 9H) , 6,89 (d, 2H, J = 8,73 Hz) , 6,58 (s a, 1H) , 5,85 (d, 1H, J = 9,47 Hz) , 5,32 (m, 1H) , 4,83 (d, 1H, J = II, 68 Hz), 4,65 (m, 1H) , 4,47 (q, 1H, J = 6,14 Hz) , 4,03-3,97 (m, 1H), 3,94 (s, 3H) , 3,84 (s, 3H) , 3, 74-3, 69 (m, 4H) , 3,39-3,33 (m, 1H) , 3,26 (dd, 1H, J = 13,73 Hz, J = 4,00 Hz) , 3,16-3,03 (m, 3H) , 3,26 (dd, 1H, J = 8,91 Hz, J = 13,74 Hz) , 2,05-1, 96 (m, 1H) , 1,78-1,49 (m, 3H) , 1, 48-1, 42 (m, 9H) , 1, 42-1, 24 (m, 2H) . RMN 13C (100 MHz, CDC13) d 175, 45, 163, 2, 159,1, 156,2, 148,6, 137,3, 129,3, 128,8, 127,0, 126,2, 126,2, 121,7, 119,8, 114,2, 112,6, 56,2, 55,3, 40,7, 35,1, 30,5, 28,4, 22,8; EM (EN+) /z (intensidad relativa) 908,09 ( [M + ?]+·, 100) .
Compuesto 33 Se añadió EEDQ sólido (108 mg, 0,436 mmol, 2 equiv.) a una solución de la amina 32 (199 mg, 0,219 mmol, 1 equiv.) y ácido maleimido hexanoico (57 mg, 0,269, 1,23 equiv.) en una mezcla de DCM (6 mi) y metanol (3 mi) . La solución se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. Se descubrió que la reacción se había completado mediante el análisis por CL/EM (3,45 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1101,78 ([M + H]+-, 100)). Los volátiles se eliminaron por evaporación a presión reducida. El residuo se repartió entre DCM y NaHC03 acuoso saturado, se lavó son salmuera, se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 1/99 hasta 2,5/97,5 de metanol/cloroformo) , produciendo 165 mg (68%) del producto puro 33. Datos Analíticos: [a]24D = +94° (c = 0,09, CHC13); RMN XH (400 MHz , CDC13) d 8,62 (s, 1H), 7, 46-7, 39 (m, 2H) , 7,27 (s, 1H) , 7, 22-7, 06 (m, 9H) , 6,79 (d, 2H, J = 8,65 Hz), 6,75 (s a, 1H) , 6,57 (s, 2H) , 6,52 (s, 1H), 6,28 (s, 1H), 5,77 (s a, 1H) , 5,21 (s, 1H) , 4,75-4,60 (m, 2H), 4,40 (q, 1H, J = 5,54 Hz) , 3, 93-3, 86 (m, 1H) , 3,83 (s, 3H) , 3,73 (s, 3H) , 3,65 (s, 2H) , 3,36 (t, 2H, J = 7,16 Hz), 3, 30-3,23 (m, 1H) , 3, 08-2, 90 (m, 5H) , 2,09 (t, 2H, J = 7,14 Hz), 1,93-1,75 (m, 1H) , 1,62-1,31 (m, 17H) , 1,30-1,04 (m, 6H) . RMN 13C (100 MHz, CDC13) 5 173,5, 170, 9, 170, 3, 169, 6, 163, 2, 159, 1, 156, 3, 151, 1, 148, 6, 136, 1, 134, 0, 129,1, 128,7, 127,2, 126,3, 126,2, 124,9, 123,3, 121,7, 120,0, 114,2, 112,7, 110,7, 86,1, 79,3, 67,6, 59,5, 56,2, 56,1, 55, 3, 54, 6, 53, 9, 53, 4, 37, 8, 37, 5, 36, 7, 35,2, 31, 0, 29,4, 28,5, 28,2, 26,2, 24,8, 22,7; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1101,78 ([ + H]+>, 100).
Compuesto 34 Se añadió una solución enfriada de TFA al 10% en DCM (12 mi) a una muestra enfriada (-20 °C) de 33 (75 mg, 0,068 mmol, 1 equiv. ) . La reacción se controló por CL/EM (2,87 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1001,13 ( [M + ?]+·, 100)). La temperatura alcanzó altos de -10 °C sin reacciones adversas. La reacción se completó después de 4 horas. La mezcla de reacción se vertió en agua desionizada (50 mi) y se liofilizó durante una noche (baño de nitrógeno liquido, permitió evaporar sin recargar) , produciendo la sal TFA pura 34 (75 mg, 99%). Datos Analíticos: RMN 1H (400 Hz, CDC13) d 9,05 (s, 1H) , 7,87-7,62 (m, 4H) , 7,35 (m, 2H) , 7,24 (s, 1H) , 7,16-7,11 (m, 2H) , 7,10-6,96 (m, 8H) , 6,92 (s, 1H) , 6, 82-6, 66 (m, 3H), 6, 63-6, 42 (m, 3H) , 5,75 (d, 1H, J = 9,54 Hz) , 5,15-5,03 (m, 1H), 4, 77-4, 74 (m, 1H) , 4, 68-4, 56 (m, 1H) , 4,39 (s, 1H) , 3,97-3,84 (m, 1H) , 3,80 (s, 3H) , 3,72 (s, 3H) , 3,65 (s, 2H) , 3,33-3,21 (m, 3H) , 3, 04-2, 69 (m, 5H) , 2,04 (m, 2H) , 1, 979-1,64 (m, 1H) , 1,63-1,45 (m, 3H) , 1,44-1,12 (m, 6H) , 1,07-0,95 (m, 2H) . EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1001,13 ( [M + ?]+·, 100) .
Compuesto 35 Se añadió la amina 32 (99 mg, 0,109 mmol, 1 equiv.) a una solución de NHS-PEG4-maleimida (Thermo Scientific, 61,6 mg, 0,120 mmol, 1,1 equiv.) y TEA (18,2 DI, 0,130 mmol, 1,2 equiv.) en una mezcla de DCM anhidro (5 mi) y DMF (1 mi). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche, momento en el que se descubrió la casi finalización por CL/EM (3,27 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1307,55 ( [M + ?]+·, 100)). Los volátiles se eliminaron por evaporación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 3/97 hasta 5/95 de metanol/cloroformo) , produciendo 71 mg (50%) del producto puro 35. Datos Analíticos: RMN XH (400 MHz, CDC13) d 8,58 (s, 1H) , 7,50 (d, 2H, J = 8,47 Hz) , 7,28 (s, 1H), 7,25-7, 20 (m, 2H) , 7,18-7,01 (m, 9H) , 6,89 (d, 1H, J = 7,58 Hz), 6,79 (d, 2H, J = 8,68 Hz) , 6,59 (s, 2H) , 6,51 (s, 1H), 5,77 (d, 1H, J = 6,42 Hz) , 5,25 (d, 1H, J = 11,43 Hz) , 4,83-4,64 (m, 2H) , 4,63-4,49 (m, 1H) , 4,43-4,38 (m, 1H) , 4,18 (s, 1H), 3, 96-3, 85 (m, 1H) , 3,84 (s, 3H) , 3, 76-3, 56 (m, 9H) , 3,57-3,34 (m, 15H) , 3, 34-3,20 (m, 3H) , 3,15 (dd, 1H, J = 14,22 Hz, J = 5,60 Hz) , 3,07-2,89 (m, 4H) , 2,48-2,29 (m, 4H) , 1,97-1,90 (m, 1H) , 1,61-1,39 (m, 3H) , 1,35 (s, 9H) , 1,29-1,12 (m, 4H) . E (EN+) m/z (intensidad relativa) 1307, 55 ( [M + ?]+·, 100).
Compuesto 36 Se añadió una solución enfriada de TFA al 10% en DCM (10 mi) a una muestra enfriada (-20 °C) de 35 (70 mg, 0,054 mmol, 1 equiv. ) . La reacción se controló por CL/EM (2,77 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1206, 94 ( [M + H]+", 100)). La reacción alcanzó la finalización después de 18 horas a -25 °C. La mezcla de reacción se vertió en agua desionizada (50 mi) y se liofilizó durante una noche (baño de nitrógeno líquido, permitió evaporar sin recargar) , produciendo la sal TFA pura 36 (75 mg, 99%) .
Compuesto 37 Se añadió una solución de 33 (9,5 mg, 8,6 LTmol, 1 equiv.) en metanol (1,5 mi) a una solución del tiopéptido cíclico c(RGDfC) (5 mg, 8,6 Oriol, 1 equiv., de pepnet.com) en una mezcla de metanol (2 mi) y agua (1 mi) . La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 1 hora. El precipitado resultante se recogió por filtración, se aclaró con una mezcla de metanol y agua (0,6 ml/0, 4 mi) y se secó mediante succión al vacio, dando 8 mg (55%) de producto puro como se muestra mediante el análisis por CL/EM (3,03 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1681,19 ( [M + ?]+·, 10), 790,85 (100)). Compuesto 38 El compuesto 37 (7 mg) se trató con TFA al 10% en DCM (1 mi) a 0 °C (baño de hielo) durante 2 horas. Se descubrió gue la reacción se había completado como se muestra por CL/EM (2,70 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 791, 44 ( [ [M + 2H)/2] +·, 100) ) . La mezcla de reacción se vertió en agua desionizada (10 mi) y se liofilizó durante una noche (baño de nitrógeno líquido, permitió evaporar sin recargar) , produciendo la sal TFA pura 38 (7 mg, rendimiento cuantitativo) .
Compuesto 39a El compuesto 39a y sus síntesis se desvela en los documentos WO 00/012508 y O 2006/111759.
Compuesto 39b Procedimiento I: Se añadió una cantidad catalítica de DMF (2 gotas) (efervescencia) a una solución agitada del nitro-ácido 39a (1,0 g, 2,15 mmol) y cloruro de oxalilo (0,95 mi, 1,36 g, 10,7 mmol) en THF seco (20 mi). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 16 horas a temperatura ambiente y el disolvente se eliminó por evaporación al vacío. El residuo resultante se disolvió de nuevo en THF seco (20 mi) y la solución de cloruro de ácido se añadió gota a gota a una mezcla agitada de clorhidrato de (2S, 4.R) -metil-4-hidroxipirrolidina-2-carboxilato (859 mg, 4,73 mmol) y TEA (6,6 mi, 4,79 g, 47,3 mmol) en THF (10 mi) a -30 °C (hielo seco/etilenglicol) en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas más, después de lo cual el análisis por TLC (95:5 v/v de CHCl3/MeOH) y CL/EM (2,45 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 721 ( [M + H]+\ 20)) revelaron la formación de producto. El exceso de THF se eliminó por evaporación rotatoria y el residuo resultante se disolvió en DCM (50 mi) . La fase orgánica se lavó con HC1 1 N (2 x 15 mi), NaHC03 saturado (2 x 15 mi), H20 (20 mi), salmuera (30 mi) y se secó (MgS04) . La filtración y la evaporación del disolvente dieron el producto en bruto en forma de un aceite de color oscuro. La purificación por cromatografía ultrarrápida (gradiente de elución: CHC13 al 100% a 96:4 v/v de CHCl3/MeOH) aisló la amida pura 39b en forma de un vidrio de color naranja (840 mg, 54%) .
Procedimiento II: Se añadió cloruro de oxalilo (9,75 mi, 14,2 g, 111 mmol) a una suspensión agitada del nitro-ácido 39a (17,3 g, 37,1 mmol) y DMF (2 mi) en DCM anhidro (200 mi). Tras la efervescencia inicial, la suspensión de la reacción se convirtió en una solución y la mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 16 horas. La conversión en el cloruro de ácido se confirmó tratando una muestra de la mezcla de reacción con MeOH, y el éster bis-metílico resultante se observó por CL/EM. La mayor parte del disolvente se eliminó por evaporación al vacío, la solución concentrada resultante se disolvió de nuevo en una cantidad mínima de DCM seco y se trituró con éter dietílico. El precipitado de color amarillo resultante se recogió por filtración, se lavó con éter dietílico frío y se secó durante 1 hora en una estufa de vacío a 40 °C. El cloruro de ácido sólido se añadió en porciones durante un periodo de 25 minutos a una suspensión agitada de clorhidrato de {2S,AR)-metil-4-hidroxipirrolidin-2-carboxilato (15,2 g, 84,0 mmol) y TEA (25,7 mi, 18,7 g, 185 mmol) en DCM (150 mi) a -40 °C (hielo seco/CH3CN) . Inmediatamente, la reacción se completó según se determinó mediante el análisis por CL/E (2,47 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 721 ( [M + ?]+·, 100)). La mezcla se diluyó con DCM (150 mi) y se lavó con HC1 1 N (300 mi), NaHC03 saturado (300 mi), salmuera (300 mi), se filtró (a través de un separador de fase) y el disolvente se evaporó al vacio, dando el producto puro 39b en forma de un sólido de color naranja (21,8 g, 82%). Datos Analíticos: [a]22D = -46,1° (c = 0,47, CHC13); RMN XH (400 MHz, CDC13) (rotámeros) d 7,63 (s, 2H) , 6,82 (s, 2H) , 4,79-4,72 (m, 2H) , 4,49-4,28 (m, 6H) , 3,96 (s, 6H), 3,79 (s, 6H) , 3,46-3,38 (m, 2H) , 3,02 (d, 2H, J = 11,1 Hz), 2, 48-2, 30 (m, 4H) , 2,29-2, 04 (m, 4H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) (rotámeros) d 172,4, 166,7, 154,6, 148,4, 137,2, 127,0, 109,7, 108,2, 69,7, 65,1, 57,4, 57,0, 56,7, 52,4, 37,8, 29,0; IR (ATR, CHC13) 3410 (a), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 721 ( [M + H]+-, 47), 388 (80); HRMS [M + H]+" teórico C31H36 4O16 m/z 721,2199, observado (EN+) m/z 721,2227.
Compuesto 39c Se añadió en porciones TCCA sólido (32 g, 137 mmol, 2,2 equiv. ) a una solución de TEMPO (1 g, 6,4 mmol, 0, 1 equiv. ) y bis-alcohol 18 ( 45 g, 62,5 mmol, 1 equiv.), en DCM normal (500 mi) a 0 °C. Se observó una ligera exotermia. La reacción se consideró completa por TLC (acetato de etilo) y CL/EM (2,95 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 718,10 ( [M + ?]+·, 100)) después de 30 minutos. La suspensión se filtró a través de celite y se lavó con DCM. El filtrado se lavó con bisulfito sódico acuoso seguido de NaHCC>3 saturado (precaución, efervescencia vigorosa) , salmuera (200 mi) y se secó (MgSC ) . La filtración y la evaporación del disolvente al vacio proporcionaron el producto en bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (elución: 20:80 v/v de n-hexano/EtOAc) , proporcionando la cetona 39c en forma de un sólido de color blanco (28,23 g, 63%). Datos Analíticos: [oc]21D = +18° (c = 0,2, CHC13); EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 718,10 ( [M + H]+', 100); RMN 1H (400 MHz, CDC13) mezcla de rotámeros d 7,70 (m, 2H) , 6,79 (m 2H) , 5,27 (m, 1H), 4,44 (m, 1H) , 4,30 (m, 4H) , 3,93 (m, 6H) , 3,81 (s, 3H),3,75 (m, 1H) , 3,63 (s, 2H) , 3,58 (m, 1H) , 3, 09-2, 89 (m, 2H), 2,74-2, 53 (m, 2H) , 2,40 (p, 2H, J = 5,73 Hz) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) mezcla de rotámeros d 206,5, 206,4, 206,0, 205, 9, 171,2, 171, 1, 170, 6, 167, 0, 166,7, 155,0, 154, 5, 148,8, 137,7, 137,3, 126,4, 125,4, 109,8, 109,1, 108,6, 108,4, 108,4, 65,7, 65,6, 65,5, 60,4, 57,9, 56,7, 56,7, 55,1, 53, 6, 52, 9, 52, 9, 51, 6, 41,2, 40,1, 28, 7, 28, 6, 21,0, 14, 1; IR (ATR, CHCI3) 1764, 1650, 1578, 1518, 1415, 1333, 1274, 1217, 1060, 870, 824 759 cm"1 Compuesto 40 Se inyectó en una porción 2,6-lutidina anhidra (4,26 mi, 3,92 g, 36,6 mmol) a una solución agitada vigorosamente de bis-cetona 39c (4,23 g, 5,90 mmol) en DCM seco (100 mi) a -45 °C (baño de refrigeración de hielo seco/acetonitrilo) en una atmósfera de nitrógeno. Se inyectó rápidamente gota a gota anhídrido tríflico anhidro, tomado de una ampolla recién abierta (5,96 mi, 10 g, 35,4 mmol) , mientras se mantuvo la temperatura a -40 °C o inferior. La mezcla de reacción se dejó en agitación a -45 °C durante 1 hora, momento en el que el análisis por TLC (50/50 v/v de n-hexano/EtOAc) reveló el consumo completo del material de partida. La mezcla de reacción fría se diluyó inmediatamente con DCM (200 mi) y, con agitación vigorosa, se lavó con agua (1 x 300 mi), una solución al 5% de ácido cítrico (1 x 200 mi), aHCÜ3 saturado (200 mi) , salmuera (150 mi) y se secó (MgS0 ) . La filtración y la evaporación del disolvente al vacío proporcionaron el producto en bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (gradiente de elución: 70:30 v/v de n-hexano/EtOAc a 40:60 v/v de n-hexano/EtOAc) , proporcionando el bis-triflato 40 en forma de una espuma de color amarillo (1,32 g, 23%). Datos Analíticos: [cc]25D = -68° (c = 0,2, CHC13) ; RMN 1H (400 MHz, CDC13) d 7,73 (s, 2H) , 6,85 (s, 2H) , 6,20 (t, 2H, J = 1,81 Hz), 5,13 (dd, 2H, J = 5,05, 11,93 Hz) , 4,33 (t, 4H, J = 5,91 Hz) , 3,95 (s, 6H) , 3,84 (s, 6H) , 3,43 (ddd, 2H, J = 2,28, 11,92, 16, 59 Hz) , 2,96 (ddd, 2H, J = 1, 60, 5, 05, 16, 58 Hz) , 2,44 (p, 2H, J= 5,79 Hz) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) d 169,4, 164,1, 154,7, 149,2, 138,0, 135,2, 124,4, 121,1, 120,0, 116,8, 110,0, 108,4, 65,7, 65,6, 57,0, 56,8, 53, 1, 33,3, 28, 6; IR (ATR, CHC13) 1749, 1654, 1576, 1522, 1418, 1337, 1277, 1207, 1131, 1061, 1023, 910, 821, 757 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 981, 86 ( [M + H]+\ 100) .
Compuesto 41 Se añadió Pd(PPh3)4 ( 660 mg, 571 µ????, 0,08 equiv. ) a una mezcla agitada de bis enol triflato 40 (7 g, 7,13 mmol, 1 equiv.), ácido 4-fluorofenilborónico (2,6 g, 18,5 mmol, 2,6 equiv.), Na2C03 (3,93 g, 37,0 mmol, 5,2 equiv.), EtOH (25 mi), tolueno (50 mi) y agua (25 mi) . La mezcla de reacción se dejó en agitación en una atmósfera de nitrógeno durante una noche, después de lo cual se observó el consumo completo del material de partida por TLC (60/40 de EtOAc/Hexano) y CL/EM (3,68 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 873, 90 ( [M + ?]+·, 100)). La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (300 mi) y se lavó con H2O (2 x 200 mi), salmuera (100 mi), se secó (MgS04) , se filtró y se evaporó a presión reducida, proporcionando el producto en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida (gradiente de elución: 50:50 v/v de Hexano/EtOAc a 80:20 v/v de Hexano/EtOAc) proporcionó el compuesto bis C2-arilo 41 en forma de un sólido de color naranja (5,46 g, 88%). Datos Analíticos: [a]22D = -107° (c = 0,2, CHCI3) ; RMN XH (400 MHz, CDC13) 5 7, 76 (s, 2H) , 7,14-7,04 (m, 4H) , 6, 97-6, 87 [m, 6H) , 6,31 (s, 2H) , 5,18 (dd, 2H, J = 11,68, 5, 03 Hz), 4,36 (t, 4H, J = 5,87 Hz) , 3,97 (s, 6H) , 3,84 (s, 6H), 3, 53-3,39 (m, 2H) , 3,00 (ddd, 2H, J = 1,22, 5, 01, 16,28 Hz) , 2,46 (p, 2Hr J = 5,98 Hz) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) 5171, 0, 163,3, 148, 9, 138,0, 128,1, 126, 3, 126,2, 125,8, 123,1, 122,6, 115,7, 115,5, 110,3, 108,5, 65,7, 58,3, 56,8, 34,7, 28,7; IR (ATR, CHC13) 1738, 1650, 1578, 1512, 1416, 1333, 1275, 1212, 1064, 1023, 869, 808, 758, 654, 613 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 873, 90 ( [M + H]+\ 100) ) .
Compuesto 42 Se añadió en una porción LiBH4 (132 mg, 21,3 mmol, 3 equiv.) a una solución agitada del éster 41 (5,30 g, 6,07 mmol, 1 equiv. ) en THF anhidro (100 mi) a 0 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y en agitación durante 1 hora, después de lo cual se observó directamente la conversión completa del material de partida por CL/EM (3,42 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 818,35 ( [M + H]+I, 100)). La mezcla de reacción se diluyó cuidadosamente con acetato de etilo (500 mi) y el exceso de borohidruro se destruyó con ácido cítrico acuoso frío. La fase orgánica se lavó con HC1 acuoso 1 N (100 mi) seguido de NaHC03 acuoso saturado (100 mi), salmuera (100 mi), se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó a presión reducida a 35 °C, proporcionando el alcohol intermedio que se disolvió de nuevo inmediatamente en DCM anhidro (200 mi) . La solución se enfrió a 0 °C y se añadió imidazol (3,97 g, 58,0 mmol, 9,6 equiv.) seguido de TBDMS-C1 (4,390 g, 29,1 mmol, 4,8 equiv.). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la TA y reaccionar durante 2 horas. La reacción completa se observó por TLC (EtOAc/hexano, 50/50) y CL/EM (4,23 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1045, 99 ( [M + H]+-, 100)). La solución se lavó con ácido cítrico acuoso 2 N (50 mi), NaHCC>3 acuoso saturado (50 mi), salmuera (50 mi), se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 80/20 hasta 60/40 hexano/EtOAc) , produciendo 2,45 g (38,6% en dos etapas) de producto puro en forma de un sólido de color naranja. Datos Analíticos: [a]22D = -123° (c = 0,18, CHC13) ; RMN 1H (400 Hz, CDC13) d 7,76 (s, 2H) , 7,17-7,06 (m, 4H), 6, 96-6, 87 (m, 4H) , 6,81 (s, 2H) , 6,17 (s, 2H) , 4, 84-4, 72 (m, 2H) , 4,35 (t, 4H, J = 5,87 Hz) , 3,93 (s, 6H) , 3, 25-3, 07 (m, 2H) , 3,03-2,91 (m, 2H) 2,45 (p, 2H, J = 5,92 Hz), 0,84 (s, 18H) , 0,07 (s, 12H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) d 163.2, 160,7, 154,5, 148,6, 137,9, 130,1, 130,0, 126,7, 126.3, 126,2, 124,3, 123,0, 115,6, 115,4, 110,0, 108,5, 65,7, 60,4, 59,2, 56,7, 33,2, 28,7, 25,8, 25,7, 21,0, 18,2, 14,2, -5,3; IR (ATR, CHC13) 2953, 1742, 1650, 1576, 1512, 1417, 1334, 1274, 1214, 1063, 1023, 869, 808, 759, 654, 612 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1045, 99 ( [M + ?]+·, 100).
Compuesto 43 Se añadió una solución de ácido fórmico en etanol (5% v/v, 100ml) a una suspensión del compuesto bis-nitro 42 (2,35 g, 2,25 mmol, 1 equiv. ) y polvo de cinc (8,82 g, 0,135 mmol, 60 equiv. ) en etanol (35 mi). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 25 min, momento en el que el análisis por TLC (metanol/cloroformo, 2/98) y CL/EM (4,23 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 986,3 ( [M + ?]+·, 10), 493, 9 ( [ [M + 2?)/2]+·, 100)) revelaron la reacción completa. La suspensión se filtró y el filtrado se repartió entre acetato de etilo (400 mi) y NaHC03 acuoso saturado (200 mi) . Los productos orgánicos se lavaron con salmuera (100 mi), se secaron sobre MgS04, se filtraron y se evaporaron a presión reducida, produciendo bis-amina pura (2,20g, 98%) que se llevó directamente a la siguiente etapa.
Compuesto 44 Se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0,209 mi, 1,97 mmol, 0,9 equiv.) en DCM seco (50 mi) a una solución del compuesto bis-anilino 43 (2, 15 g, 2,18 mmol, 1 equiv.) y piridina (0,335 mi, 4,14 mmol, 1,9 equiv.) en DCM seco (250 mi) a -78 °C. La mezcla de reacción se dejó en agitación a -78 °C durante 2 horas, y se dejó calentar hasta la temperatura ambiente. La solución se lavó con sulfato de cobre acuoso saturado (2 x 50 mi), agua (250 mi), con salmuera (100 mi), se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 70/30 hasta 30/70 de hexano/EtOAc) , produciendo 668 mg (26,5%) del compuesto bis-Alloc protegido como se indicó por CL/EM (4,45 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1154,32 ( [M + ?]+·, 100)) y 800 mg del compuesto mono-alloc protegido deseado ligeramente contaminado (4,32 min (EN+) m/z (intensidad relativa) 1070,58 ( [M + H]+', 100)). Este compuesto se purificó adicionalmente por cromatografía ultrarrápida (gradiente de 40/60 hasta 20/80 de hexano/éter dietílico) , dando 700 mg (30%) del compuesto mono-alloc puro deseado. Datos Analíticos: [ ]22D = -41° (c = 0,16, CHC13) ; RMN XH (400 MHz, CDCI3) d 8,72 (s a, 1H) , 7,88 (s, 2H) , 7,25-7,18 (m, 4H) , 7, 02- 6, 93 (m, 4H) , 6, 93-6, 83 (m, 3H) , 6,80 (s, 1H) , 6,36 (s, 1H) , 6, 00-5, 84 (m, 1H) , 5,32 (dd, 1H, J = 1,37, J = 17,21 Hz) , 5,21 (dd, 1H, J = 0,90, J = 10,40 Hz), 4,85-4,71 (m, 2H) , 4,60 (dd, 2H, J = 1,02, J = 5,62 Hz), 4,46 (s, 2H) , 4,31 (t, 2H, J = 5,96 Hz) , 4,25 (t, 2H, J = 6,31 Hz) , 3,98 (m, 2H), 3,86 (m, 2H) , 3,81 (s, 3H) , 3,76 (s, 3H) , 3,19-3,05 (m, 2H) , 3,05-2, 93 (m, 2H) , 2,41 (p, 2H, J = 6,16 Hz) , 0,84 (m, 18H) , 0,05 (m, 12H) ; IR (ATR, CHCI3) 2952, 2359 , 1732, 1652, 1601, 1507, 1472, 1406, 1225, 1119, 836, 777, 668 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1070, 58 ([? + ?]+·, 100).
Compuesto 45 Se añadió gota a gota una solución de la amina 44 ( 650 mg, 0, 607 mmol, 1 equiv.) y TEA (220 DI, 1,58 mmol, 2,6 equiv.) en THF seco a una solución recién preparada de trifosgeno (81 mg, 0,273 mmol, 0,45 equiv. ) en THF seco (4 mi) a 0 °C. La suspensión de color blanco se dejó en agitación a 0 °C durante 10 min. Se añadió rápidamente una solución de alcohol (Alloc-Val-Ala-PABOH, 229 mg, 0,607 mmol, 1 equiv.) y TEA (220 DI, 1,58 mmol, 2,6 equiv.) en THF seco (30 mi). La suspensión de color blanco se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 15 minutes, después se calentó a 65 °C durante 2 horas y después se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche. Las sales TEA de color blanco se eliminaron por filtración a través de algodón hidrófilo. El filtrado se concentró y se purificó por cromatografía ultrarrápida (Gradiente, MeOH al 0% en cloroformo hasta MeOH al 3% en cloroformo) , produciendo 220 mg del carbamato deseado (25%). Datos Analíticos: [a]24D = -46,1° (c = 0,13, CHC13); RMN XH (400 MHz, CDC13) d 8,70 (s a, 2H) , 8,46 (s, 1H), 7,83 (s, 2H) , 7,50 (m, 2H) , 7,31 (d, 2H, J = 8,50 Hz) 7,25-7,15 (m, 4H) , 7,03-6,93 (m, 4H) , 6,92-6,77 (m, 4H) , 6,51 (d, 1H, J = 7,48Hz), 5,99-5,81 (m, 1H) , 5,38-5,15 (m, 5H) , 5,13-5,03 (m, 2H) , 4,77 (s a, 2H) , 4, 66-4,53 (m, 5H) , 4,38-4, 22 (m, 4H) , 4, 08-3, 94 (m, 3H) , 3,93-3,81 (m, 2H) , 3,79 (s, 6H), 3,20-3, 05 (m, 2H) , 3, 05-2, 94 (m, 2H) , 2,41 (p, 2H, J = 5,95 Hz), 2,22-2, 08 (m, 1H) , 1,45 (d, 3H, J = 7,03 Hz) , 0,94 (dd, 6H, J = 6,81, 14,78 Hz) , 0,84 (m, 18H) , 0,14-0,02 (m, 12H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) d 171, 7, 169, 8, 165, 9, 163, 1, 153,6, 151,0, 144,3, 137,8, 132,4, 132,3, 132,0, 130,2, 129,2, 126,2, 126,1, 125,3, 123,3, 123,2, 119,8, 118,2, 118,0, 115,7, 115,5, 112,0, 106,0, 66,5, 66,2, 65,8, 65,4, 62, 5, 60, 4, 59,5, 56, 6, 49, 6, 30,8, 28, 9, 25, 7, 19,2, 18,2, 18,1, 17,7, 17,3, 14,2, -5,4; IR (ATR, CHCI3) 2950, 2356, 1725, 1691, 1602, 1512, 1408, 1201, 1109, 1023, 832, 774, 668 cm"1; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1473, 43 ( [M + H]+", 100) .
Compuesto 12 Se hidrogenó 19- (2, 5-dioxopirrolidin-l-il) 4,7,10,13,16-pentaoxanonadecano-1, 19-dioato de 1-bencilo (II) (100 mg, 0,19 mmol, 1 equiv.) en acetato de etilo seco (15 mi) a 206,84 kPa (30 psi) sobre paladio al 10% sobre carbono (10 mg, 10% en peso) durante 45 minutos. La mezcla de reacción se filtró a través de celite mediante lavado con acetato de etilo seco. La evaporación a presión reducida dio el producto 12 en forma de un aceite incoloro (74 mg, 89%) . Datos Analíticos: TR (no visible por CL) EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 458 ( [M + Na]+ , 55), 436 ( [M + ?]+·, 12).
Compuesto 13 Se añadió -V,N-diisopropildietilamina (8,4 µ?, 6 mg, 5,97 x 10-5 mol, 1,1 equiv.) a una solución del dipéptido de amina (12c) (50 mg, 5,42 x 10"5 mol, 1,0 equiv.) y ácido-dPeg®5-NHS éster (12) (28 mg, 6,5 x 10"5 mol, 1,2 equiv.) en DCM seco (5 mi) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida, dando un aceite de color amarillo pálido. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 96%/metanol al 4% a cloroformo al 92%/metanol al 8% en aumentos del 0,5%] dio el producto 13 en forma de un vidrio de color amarillo (42 mg, 64%) . Datos Analíticos: TR 2,78 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1242 ( [M + ?]+·,40) .
Compuesto 49 Se añadió l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (9,1 mg, 4,76 x 1CT5 mol, 1,6 equiv.) a una solución de N-hidroxisuccinimida (5,8 mg, 5,06 x 10"5 mol, 1,7 equiv.) y un ácido (13) en DCM seco (6 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. La solución se filtró lavando con DCM (10 mi). La solución de DCM se lavó con agua (20 mi) , salmuera (20 mi) , se secó (MgS0 ) y se evaporó a presión reducida. El producto 49 (32 mg, 80%) se usó sin purificación adicional. Datos Analíticos: TR 2,88 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1339 ( [M + ?]+·, 100).
Compuesto 50 Se añadió Pd(PPh3)4 (61 mg, 0, 053 mmol, 0,01 equiv.) a una solución del compuesto alloc (8) (2,0 g, 5,3 mmol, 1,0 equiv.) y pirrolidina (0,47 g, 0,55 mi, 6,63 mmol, 1,25 equiv.) en DCM seco en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El análisis por CLEM indicó la presencia del compuesto alloc sin reaccionar. Se añadieron porciones adicionales de pirrolidina (0,38 g, 0,44 mi, 5,3 mmol, 1,0 equiv.) y Pd(PPh3)4 (61 mg, 0,053 mmol, 0,01 equiv.) y la reacción continuó durante 30 minutos. El disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100%, después cloroformo al 98%/metanol al 2% a cloroformo al 90%/metanol 10% en aumentos del 1%] dio el producto 50 en forma de un polvo de color blanco (1,37 g, 88%). Datos Analíticos: TR 0,33 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 294 ( [M + ?]+·,60 ), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 292 ( [M - H] ~" , 100). Compuesto 51 Se añadió EEDQ (1,22 g, 4,93 mmol, 1,05 equiv.) a una solución del dipéptido de amina (50) (1,37 g, 4,69 mmol, 1 equiv.) y m-dPeg®2 ácido (0,73 g, 4,93 mmol, 1,05 equiv.) en THF seco (60 mi) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 días. El disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna [cloroformo al 100% a cloroformo al 95%/metanol al 5% en aumentos del 1%], dando el producto 51 en forma de un sólido de color blanco (1,46 g, 74%). Datos Analíticos: TR 2,22 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 446 ( [M + Na]+-, 80 ), 424 ( [M + H]+',70 ), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 422 ( [M - H]"', 100).
La síntesis de 51 se muestra a continuación en el Esquema 1 . Esquema 14. 51 Compuesto 52 Se añadió trietilamina (0,47 g, 0,65 mi 4,66 mmol, 2,2 equiv.) a una solución agitada de la ¿ás-anilina mono-alloc protegida (6) (1,68 g, 2,12 mmol, 1 equiv.) y trifosgeno (0,226 g, 0,76 mmol, 0,36 equiv.) en THF seco (40 mi) en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C, una muestra se trató con metanol y se analizó por CLEM como el carbamato de metilo.
Al isocianato recién preparado se le añadió gota a gota una solución del dPeg®2-bencil-alcohol ( 51 ) (1,35 g, 3,18 mmol, 1,5 equiv.) y trietilamina (0,32 g, 0,44 mi, 3,18 mmol, 1,5 equiv.) en THF seco (60 mi). La mezcla de reacción se controló por CLEM en intervalos de 30 minutos. Después de 3 horas, el análisis por CL-EM mostró la conversión en el producto, la presencia de carbamato de metilo y jis-anilina mono-alloc protegida ( 9 ) . Se añadió una porción más de trifosgeno (0,056 g, 0,19 mmol, 0,09 equiv.) y la reacción continuó a 40 °C durante 3 horas más. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, proporcionando el producto en bruto en forma de un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía ultrarrápida [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 95%/metanol al 5% en aumentos del 1%], dando el producto deseado 52 en forma de una espuma de color amarillo (1,91 g, 73%). Datos Analíticos: TR min 3,42 min EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1243 ( [M + H]+-, 50), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 1241 ( [M - H] ) , 100) .
Compuesto 53 Se añadió Pd(PPh3)4 (35 mg, 3,0 x 10"5 mol 0,02 equiv.) a una solución del compuesto alloc ( 52 ) (1,87 g, 1,5 mmol, 1,0 equiv.) y pirrolidina (0,27 mg, 310 µ?, 3,8 mmol, 2,5 equiv.) en DCM seco (30 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se evaporó a presión reducida y el producto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 95%/metanol al 5% en aumentos del 1%], dando el producto 53 en forma de una espuma de color amarillo (1,57 g, 90%). Datos Analíticos: TR min 3,17 min EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1159 ( [M + ?]+·, 65) .
Compuesto 54 Se añadió trietilamina (0,26 g, 0,36 mi 2,6 mmol, 2,2 equiv.) a una solución agitada de la bis-anilina mono-protegida (53) (1,37 g, 1,18 mmol, 1 equiv.) y trifosgeno (0,126 g, 0,43 mmol, 0,36 equiv.) en THF seco (40 mi) en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C, una muestra se trató con metanol y se analizó por CL-EM según el carbamato de metilo indicó la formación completa de isocianato.
Al isocianato recién preparado se le añadió gota a gota una solución del alcohol bencílico (8) (0,67 g, 1,8 mmol, 1,5 equiv.) y trietilamina (0,18 g, 0,25 mi, 1,8 mmol, 1,5 equiv.) en THF seco (50 mi). La mezcla de reacción se controló por CLEM y se completó después de 18 horas a 40 °C. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, proporcionando un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía ultrarrápida [gradiente de elución de acetato de etilo al 95%/metanol al 5% a acetato de etilo al 93%/metanol al 7% en aumentos del 1%] , dando el producto deseado 54 en forma de una espuma de color blanco (1,21 g, 66%). Datos Analíticos: TR min 3,42 min EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1562 ( [M + ?]+·, 15).
Compuesto 55 Se añadió una solución de K2C03 (0,522 g, 3,78 mmol, 5 equiv.) en H2O (5,0 mi) a una solución del acetato (54) (1,18 g, 0,756 mmol, 1 equiv.) en metanol (29 mi). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El metanol se evaporó a presión reducida, el residuo se diluyó con H2O (50 mi) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mi). Los extractos combinados de acetato de etilo se lavaron con H20 (200 mi), salmuera (200 mi), se secaron (MgS04) y se evaporaron a presión reducida, dando el producto 55 en forma de una espuma de color blanco (1,052 g, 94%). Datos Analíticos: TR min 3,15 min EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1478 ( [M + H]+>, 5), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 1477 ( [M - H] ) , 100).
Compuesto 56 Se añadió en una porción peryodinano de Dess-Martin (0,152 g, 0,36 mmol, 2,1 equiv.) a una solución del producto bis desacetilado (55) (0, 252 g, 0,17 mmol 1 equiv.) en DCM seco (5 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, momento en el que el análisis por CLEM indicó que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (50 mi) y se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (3 x 100 mi), agua (100 mi), salmuera (100 mi) y se secó (MgS04) · El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, dando el producto en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 92%/metanol al 8% en aumentos del 1%] dio el producto 56 en forma de una espuma de color blanco (0,17 g, 68%). Datos Analíticos: TR min 6,17 min EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1474 ( [M + ?]+·, 5), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 1472 ( [M - H] ) "' , 100).
Compuesto 57 Se añadió Pd(PPh3)4 (8 mg, 6,9 µ????, 6,0 equiv.) a una solución del compuesto alloc (56) (160 mg, 0,108 mmol, 1,0 equiv.) y una solución 0,5 M de pirrolidina en DCM (0,27 mi, 0,135 mmol, 1,25 equiv.) en DCM seco (18 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 100% a cloroformo al 91%/metanol al 9% en aumentos del 1%] dio el producto 57 en forma de un polvo de color blanco (0,114 g, 74%). Datos Analíticos: TR min 2,50 min E (EN+) m/z (intensidad relativa) 1390 ( [M + ?]+·, 5).
El acoplamiento de un reactivo de maleimida-PEG-succinimida con 57 proporciona el enlazador al fármaco de PBD 58. La figura Ib muestra las estructuras del enlazador al fármaco de PBD MP-PEG8-Val-Ala-PAB- (imp) PBD 58 en el que MP es maleimidopropanamida, PEG es etilenoxi, y PAB es para-aminobenciloxicarbonilo, e imp es el grupo protector 2\7-10 imina : 3- (2-metoxietoxi) propanoato-Val-Ala-PAB .
Compuesto 58 (MP-PEG8-Val-Ala-PAB- (imp) PBD; ll-hidroxi-8- (5- ((HS,llaS) -ll-hidroxi-10- ( (4- ( (IOS, 13S) -10-isopropil-13-metil-8, ll-dioxo-2, 5-dioxa-9, 12-diazatetradecanamido) benciloxi) carbonil) -1'-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5, 10, 11 , lla-hexahidro-pirrolobenzo [2,1-c] [1 , 4] diazepin-8-iloxi)pentiloxi) -7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,11 , lla-tetrahidro-pirrolobenzo [2 , 1-c] [1,4]diazepin-10 (5H) -carboxilato de (HS,llaS) -4- ( (2S,5S) -37- (2,5-dioxo-2, 5-dihidro-lH-pirrol-l-il) -5-isopropil-2-metil- , 7,35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3, 6,34-triazaheptatriacontanamido) bencilo) Se añadió una solución 0,5 M de _V,]V-diisopropildietilamina en DCM seco (176 µ?, 8,8 x 10"5 mol, 2,2 equiv.) a una solución del dipéptido de amina (57) (55 mg, 3,96 x 10"5 mol, 1,0 equiv.) y maleimida-dPeg®8-NHS éster (33 mg, 4,75 x 10"5 mol, 1,2 equiv.) en DC seco (6 mi). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió de nuevo en DCM (50 mi) . La solución de DCM se extrajo con carbonato ácido sódico saturado (2 x 100 mi), agua (100 mi), salmuera (100 mi), se secó (MgS04) y se evaporó a presión reducida, dando una goma de color amarillo. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo a cloroformo al 91%/metanol al 9% en aumentos del 1%] dio el producto 58 en forma de una espuma de color blanco (41 mg, 52%). Datos Analíticos: TR min 5,8 min. EM (MaldiTOF) m/z (intensidad relativa) 1987, 9 ( [M + Na]+-, 100).
Conjugado 60 Se seleccionó el péptido biotina-A20FMDV-Cys (59) que es altamente selectivo para la integrina a?ße, que se regula de forma ascendente significativamente por muchos cánceres, para la conjugación de los derivados del enlazador de PBD. Se añadió una solución del péptido (59) (7,7 mg, 3,08 µp???, 1,2 equiv.) en 1/1 de acetonitrilo/agua (1 mi) a una solución de (58) (5,05 mg, 2,57 pmol, 1,0 equiv.) en 1/1 de acetonitrilo/agua (2 mi) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El acetonitrilo se evaporó a presión reducida y el agua se eliminó por liofilización, dando el producto 60 en forma de una espuma de color blanco. La purificación por HPLC semi-preparativa seguida de liofilización dieron el producto en forma de una espuma de color blanco (3,4 mg, 29%). Datos Analíticos: EM (MaldiTOF) m/z (intensidad relativa) 4458, 3 ( [M + ?]+·, 100).
Compuesto 61 (MP-PEG24-Val-Ala-PAB- (imp) PBD; ll-hidroxi-8- ((5-(( (llS,llaS) -ll-hidroxi-10- ( ( (4- ( (10S,13S) -10-isopropil-13-metil-8, ll-dioxo-2, 5-dioxa-9, 12-diazatetradecanamido) bencil) oxi) carbonil) -T-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3,5, 10, 11 , lla-hexahidro-lH-pirrolo [2, 1 -c] [1,4]benzodiazepin-8-il) oxi)pentil) oxi) -1'-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3,11 , lla-tetrahidro-lH-pirrolo [2, 1-c] [1 ,4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (US, llaS) -4- ( (2S,5S) -16- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidro-lH-pirrol-l-il) -5-isopropil-2-metil-4 , 7, 14-trioxo-10-oxa-3, 6,13-triazahexadecanamido) bencilo) Se añadió NN-diisopropildietilamina (6 µ?, 4,3 x 10"5 mol, 2,2 equiv. ) a una solución del dipéptido de amina (57) (27 mg, 1,94 x 10"5 mol, 1 equiv.) y maleimida-dPeg®24-NHS éster (30 mg, 2,13 x 10"5 mol, 1,1 equiv.) en DCM seco (5 mi). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió de nuevo en DCM (25 mi) . La solución de DCM se extrajo con carbonato ácido sódico saturado (2 x 50 mi), agua (50 mi), salmuera (50 mi), se secó (MgS04) y se evaporó a presión reducida, dando una goma de color amarillo. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo a cloroformo al 91%/metanol al 9% en aumentos del 1%] dio el producto en forma de una goma incolora (22 mg, 42%). Datos Analíticos: EM (MaldiTOF) m/z (intensidad relativa) 2691, 8 ( [M + ?]+·, 100). 1, 1 '- (4, 4 ' - (propan-1 , 3-diilbis (oxi) )bis (5-metoxi-2-nitrobenzoil) ) bis (4- ( (E) -prop-l-en-l-il) -2,3-dihidro-lH-pirrol-2-carboxilato) de (2S, 2' S,E) -dimetilo (71) Se añadió tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) (21,6mg) al triflato 40 (230 mg) , ácido trans-propenilborónico (52,3 mg) y carbonato sódico (129 mg) en una mezcla de tolueno (5 mi), etanol (2,5 mi) y agua (2,5 mi). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 3 horas en una atmósfera de argón a 32 °C. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua, salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de la filtración, el exceso de acetato de etilo se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida. El producto de acoplamiento en bruto se purificó por cromatograf a ultrarrápida en columna (gel de sílice; gradiente de acetato de etilo/hexano al 50%/50% a acetato de etilo/hexano al 80%/20%) . Las fracciones puras se combinaron y la eliminación del exceso de eluyente proporcionó el producto puro 71 en forma de un sólido de color naranja (110 mg, rendimiento del 61,4%, CL/EM 3,52 min, m/z EN+ 764,92). La reacción se repitió a una escala mayor, proporcionando 7,21 g del producto de acoplamiento de Suzuki. RMN lH (400 MHz, CD3OD) . d 7,78 (s, 2H) 6,92 (s, 2H) , 5,98 (d, 2H) , 5,89 (s, 2H), 5, 46-5, 55 (m, 2H) , 5,10 (dd, 2H) , 4,37 (t, 4H) , 3,93-4,00 (m, 6H) , 3,86 (s, 6H) , 3,19-3,26 (m,2H), 2,80 (dd, 2H) , 2,45-2,51 (m, 2H) , 1,77 (d, 6H 0CH3) .
(S,E) - ( (propan-1 , 3-diilbis (oxi) )bis (5-metoxi-2-nitro-4 ,1-fenilen) )bis ( ( (S) -2- (hidroximetil) -4- ((E) -prop-l-en-l-il) -2, 3-dihidro-lH-pirrol-l-il)metanona) (72) El ¿»is-éster 71 (7,21 g) se añadió en una porción en forma de un sólido a una solución de borohidruro de litio (622 mg) en tetrahidrofurano seco (300 mi) a 0 °C (baño de hielo) . El baño de hielo se eliminó y la mezcla de reacción se dejó que alcanzara la temperatura ambiente. Después de 1 hora, el análisis por TLC (tras un mini tratamiento con acetato de etilo y agua) reveló que las reacciones no estaban completas y por ello se añadió más cantidad de borohidruro de litio (0,75 equivalentes). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 2,5 horas más, momento en el que el análisis por TLC (después de un mini tratamiento) reveló que la reacción se había completado. El borohidruro de litio restante se inactivo con un gran exceso de acetato de etilo (baño de hielo) y la mezcla de reacción se dejó en agitación durante 50 min. La fase orgánica se lavó con agua, salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. El sulfato de magnesio se eliminó por filtración al vacío y el acetato de etilo se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, proporcionando el diol 72 (5, 46 g, rendimiento del 82%) que se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional (CL/EM 3,17 min, m/z EN+ 708, 84). RMN XH (400 MHz, CD30D) . d 7,78 (s, 2H) 6,85 (s, 2H) , 5,97 (d, 2H) , 5,77 (s, 2H) , 5,61-5,53 (m, 2H) , 4,75-4,82 (m, 2H) , 4,38 (t, 4H) , 3,89-4,00 (m, 12H), 3,01-3,08 (m, 2H) 2,46-2,51 (m, 4H) , 1,77 (d, 6H OCH3) . ( (2S,2'S,E) -1,1 '- (4,4'- (propan-1, 3-diilbis (oxi))bis (5-metoxi-2-nitrobenzoil) ) bis (4- ( (E) -prop-l-en-l-il) -2, 3-dihidro-lH-piirol-2, 1-diil) ) bis (metilen) diacetato (73) Se añadió gota a gota una solución de cloruro de acetilo (1,64 mi) en diclorometano seco (40 mi) a una solución del bis alcohol 72 (6,2 g) en diclorometano (200 mi) en presencia de trietilamina (3,68 mi) a 0 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y la reacción se controló por TLC y CL/EM. Una vez que la reacción se completó, la fase orgánica se lavó secuencialmente con agua, ácido cítrico (0,5 N) , bicarbonato sódico saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y el exceso de diclorometano se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice; gradiente, acetato de etilo al 60%/hexano al 40% a acetato de etilo al 70%/hexano al 30%) . Las fracciones puras se combinaron y la eliminación del exceso de eluyente proporcionó el ¿is-acetato 73 (2, 50 g, rendimiento del 36%, CL/E 3,60 min, m/z EN+ 792, 63). RMN XH (400 MHz, CDC13) d 7,77 (d, J = 3,4 Hz, 2H) , 6, 89 (s, 2H) , 5,99 (d, J = 15,2 Hz, 2H) , 5,78 (s, 2H) , 5,65 -5,45 (m, J = 15,4, 6,8 Hz, 2H) , 5,02 - 4, 86 (m, J = 9,7, 5,5 Hz, 2H), 4,57 (s, 2H) , 4,37 (t, J = 5,9 Hz, 4H) , 4,00 (s, 6H), 3,10 - 2,92 (m, J = 10,7 Hz, 2H) , 2,60 (dd, J = 16,3, 3,1 Hz, 2H), 2,52 - 2,43 (m, 2H) , 2,10 (s, 6H) , 1,78 (d, J = 6, 7 Hz, 4H) . ( (2S,2'S,E) -1,1 ' - (4 ,4 ' - (propan-1 ,3-diilbis (oxi) ) bis (2-amino-5-metoxibenzoil) )bis (4- ( (E) -prop-l-en-l-il) -2, 3-dihidro-lH-pirrol-2, 1-diil) ) bis (metilen) diacetato (74) Se añadió polvo de cinc (10 g) a una solución del compuesto bis-nitro 73 (2,5 g) en etanol (20 mi) y acetato de etilo (20 mi) seguido de una solución de ácido fórmico en etanol (5% v/v; 100 mi) . La reacción tenía exotermia con el aumento de temperatura a 33 °C, la temperatura se redujo a 15 °C con un baño de hielo y la mezcla de reacción se dejó en agitación mientras se controlaba estrechamente por TLC y CL/EM. Después de 30 min, se dedujo que la reacción se había completado ya que no se detectaron trazas de material de partida ni intermedios. La mezcla se decantó y se filtró a través de algodón hidrófilo. El filtrado se repartió entre acetato de etilo (300 mi) y NaHC03 acuoso saturado (300 mi) . La fase orgánica se lavó adicionalmente con salmuera (200 mi) y se secó sobre sulfato de magnesio. El exceso de disolventes se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, proporcionando el producto 74 (2,09 g; rendimiento del 90%, CL/EM 3,35 min, m/z EN+ 732, 06). RMN 1ti (400 MHz, CDC13) d 6,76 (s, 2H), 6,45 (s, 2H) , 6,33 (s, 2H) , 6,12 (d, J = 15,3 Hz, 2H), 5,54 (de, J = 13,2, 6,6 Hz, 2H) , 4,90 (td, J = 9,6, 4,5 Hz, 2H) , 4,48 (s, 4H) , 4,42 - 4,33 (m, 4H) , 4,23 (t, J = 6,1 Hz, 4H) , 3,79 (s, 6H) , 2,95 (dd, J = 16,0, 10,4 Hz, 2H) , 2, 55 (dd, J = 16,2, 3,5 Hz, 2H ) , 2, 42 - 2, 32 (m, 2H) , 2,07 (s, 6H), 1,81 (d, J = 6,6 Hz, 6H) .
( (S) -l-(4- (3- (4- ( (S) -2- (acetoximetil) -4- ( (E) -prop-l-en-l-il) -2, 3-dihidro-lH-pirrol-l -carhonil) -5- ( ( (aliloxi) carhonil) amino) -2-metoxifenoxi)propoxi) -2-amino-5-metoxibenzoil) -4- ( (E) -prop-l-en-l-il) -2, 3-dihidro-lH-pirrol-2-il)metil (75) Se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo en diclorometano seco a una solución de la bis-anilina 74 y piridina en diclorometano seco a -78 °C. La mezcla de reacción se dejó en agitación a -78 °C durante 2 horas y después se dejó que regresara a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó secuencialmente con sulfato de cobre II acuoso, agua, bicarbonato sódico saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró al vacio y el exceso de diclorometano se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida. Los análisis por TLC y CL/EM revelaron la presencia de tanto el producto mono Alloc deseado 75 como el producto £>is-Alloc. La mezcla del producto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice; gradiente de acetato de etilo al 40%/hexano al 60% a acetato de etilo al 70%/hexano al 40%) . Las fracciones puras que contenían el producto mono Alloc deseado 75 se recogieron y se combinaron, y el exceso de eluyente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, proporcionando el producto (580 mi, rendimiento del 25%). CL/EM 3,58 min, EN+ 817,02 RMN XH (400 MHz, CDC13) d 8,60 (s, 1H) , 7,85 (s, 1H) , 6.80 (s, 1H), 6,72 (s, 1H) , 6,42 (s, 1H) , 6,37 (s, 1H) , 6,33 (s, 1H), 6,08 (dd, J = 15,4, 6,1 Hz, 2H) , 6, 00 - 5, 87 (m, 1H), 5, 62 - 5, 44 (m, 2H) , 5,34 (dd, J = 17,2, 1,4 Hz, 1H) , 5,23 (dd, J = 10,4, 1,2 Hz, 1H) , 4,88 (cd, J = 9,5, 4,5 Hz, 2H) , 4, 67 - 4,57 (m, 2H) , 4, 50 - 4,25 (m, 8H) , 4,22 (t, J = 6,3 Hz, 2H) , 3,82 (s, 3H) , 3,76 (s, 3H) , 3,00 - 2,85 (m, 2H) , 2,58 - 2,47 (m, 2H) , 2,37 (p, J = 6,1 Hz, 2H) , 2,06 (s, 6H) , 1.81 - 1, 73 (m, 6H) .
Acetato de ( (2S) -1- (4- (3- (4- ( (S) -2- (acetoximetil) -4- ( (E) -prop-l-en-l-il) -2, 3-dihidro-lH-pirrol-l-carbonil) -5- (( ( (4- (2- (2- ( ( (aliloxi) carbonil) amino) -3-metilbutanamído)propanamido) bencil) oxi) carbonil) amino) -2-metoxifenoxi)propoxi) -2- ( ( (aliloxi) carbonil) amino) -5-metoxibenzoil) -4- ( (E) -prop-l-en-l-il) -2, 3-dihidro-lH-pirrol-2-il)metilo (76) Se añadió trietilamina seca (0,206 mi) a una solución agitada de la j is-anilina mono-alloc protegida 75 (560 mg) y trifosgeno (72 mg) en tetrahidrofurano seco (20 mi) en una atmósfera inerte. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C, y una muestra se eliminó y se trató con metanol . El análisis por CL/EM reveló la conversión completa en el carbamato de metilo indicando que el grupo de amina libre se había convertido con éxito en el intermedio de isocianato reactivo. Una solución del alloc-val-ala-PABOH (381 mg) y trietilamina (0,14 mi) en tetrahidrofurano seco (20 mi) se inyectó rápidamente en el recipiente de reacción a 40 °C. La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche, después de lo cual una muestra se eliminó y se trató con metanol. El análisis por CL/EM reveló que no había ninguna traza de carbamato de metilo, lo que indicaba que todo el isocianato se había consumido. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, proporcionando el producto en bruto que se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice; gradiente de cloroformo a metanol al 2%/cloroformo al 98%). Las fracciones puras se recogieron y se combinaron, y la eliminación del exceso de eluyente por evaporación rotatoria a presión reducida proporcionó el producto puro 76 (691 mgr rendimiento del 84%). CL/EM 3,73 min, EN+1220,21. ( (S,E)- (propan-1 , 3-diilbis (oxi) )bis (2- ( (S) -2- (hidroximetil) -4-( (E) -prop-l-en-l-il) -2,3-dihidro-lH-pirrol-l-carbonil) -4-metoxi-5, 1-fenilen) ) dicarbamato de alil 4-(2-(2- ( ( (aliloxi) carbonil) amino) -3-metilbutanamido)propanamido) bencilo (77) Se añadió una solución acuosa de carbonato potásico (770 mg en 4,8 mi de agua) a una solución del j is-acetato 76 (680 mg) en metanol (29 mi) a temperatura ambiente. La desacetilación se completó en 30 min según se controló por CL/EM. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (200 mi) y la fase orgánica se lavó secuencialmente con ácido cítrico (0,5 N, 100 mi), agua (200 mi) y salmuera (100 mi). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, la suspensión se filtró (filtración al vacío) y el exceso de disolvente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice; gradiente de metanol al 1, 5% /cloroformo al 98,5% a metanol al 3, 5%/cloroformo al 96,5%). Las fracciones puras se combinaron y la eliminación del exceso de eluyente por evaporación rotatoria a presión reducida proporcionó el diol 77 (530 mg, rendimiento del 84%). CL/EM 3,40 min, EN+ 1136,49. 8- (3- ( ( (HS,llaS) -10- (( (4- ( (S) -2- ( (S) -2- ( ( (aliloxi) carbonil) amino) -3-metilbutanamido)propanamido)bencil) oxi) carbonil) -11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2- ( (E) -prop-l-en-l-il) -5, 10, 11 , lla-tetrahidro-pirrolo[2,1 -c] [1,4]benzodiazepin-8-il) oxi)propoxi) -11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2- ( (E) -prop-l-en-l-il) -11 , lla-dihidro— pirrólo [2, 1-c] [1 , 4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (HS,llaS) -alilo (78) Se añadió en una porción peryodinano de Dess-Martin (373 mg, 4 equiv.) a una solución de 77 (250 mg) y piridina (0,36 mi, 20 equiv.) en diclorometano seco (10 mi) a temperatura ambiente. El control estrecho por TLC (metanol al 5%/cloroformo) reveló la desaparición del material de después de 30 minutos. La reacción se trató con una solución de metabisulfito sódico y carbonato ácido sódico seguido de salmuera. La fase de diclorometano se secó sobre sulfato de magnesio y se filtró al vacio. Después, la solución de diclorometano se trató con una cantidad catalítica de DMAP (aprox. 10 mg) , haciendo que la mancha de producto principal se fusionara en una como se observó por TLC/CL/EM. La solución se filtró y el diclorometano se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida. El residuo resultante se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice; gradiente de metanol al 1, 5%/cloroformo al 98,5% a metanol al 3%/cloroformo al 97%) . Las fracciones puras se recogieron y la eliminación del eluyente por evaporación rotatoria a presión reducida proporcionó el producto ciclado deseado 78 (62 mg, rendimiento del 25%). CL/EM 3,35 min, EN+1132,19, EN"1130,25. ll-hidroxi-7-metoxi-8- (3- ( ( (S) -7-metoxi-5-oxo-2- ( (E) -prop-1-en-l-il) -5, lla-dihidro-pirrolo [2, 1-c] [l,4]d benzoiazepin-8-il) oxi)propoxi) -5-oxo-2- ( (E) -prop-l-en-l-il) -11 , lla-dihidro-pirrolo[2,1-c] [1,4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (HS,llaS) -4-((S) -2-((S) -2-a ino-3-metilbutanamido)propanamido) bencilo (79) Se añadió Pd(PPh3)4 (1,9 mg) a una solución del compuesto alloc ( 78 ) (62 mg) y pirrolidina (22,6 DI ) en DCM seco (3 mi) en una atmósfera de argón. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de metanol al 3%/cloroformo al 97% a cloroformo al 90%/metanol al 10%] dio el producto en forma de un polvo de color blanco (26 mg, 50%). CL/EM: TR 2,70 min EM (EN+) 946,17, ll-hidroxi-7-metoxi-8- (3- ( ( (S) - 7-metoxi-5-oxo-2- ( (E) -prop-l-en-l-il) -5, lla-dihidro-pirrolo [2,1-c] [1,4]benzodiazepin-8-il) oxi)propoxi) -5-oxo-2- ( (E) -prop-l-en-l-il) -11 , lla-dihidro-pirrolobenzo [2, 1-c] [1 , 4] diazepin-10 (5H) -carboxilato de (HS,llaS) -4- ( (2S,5S) -25- (2, -dioxo-2, 5-dihidro-lH-pirrol-l-il) -5-isopropil-2-metil-4 , 7,23-trioxo-10, 13, 16, 19-tetraoxa-3, 6, 22-triazapentacosanamido) bencilo (80) Se añadió una solución de N,iV-diisopropildietilamina (2,6 µ?) a una solución del dipéptido de amina 79 (13 mg) y maleimida-dPeg®4-NHS éster (8,5mg) en DCM seco (4 mi) La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 h . La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida y el residuo se sometió a TLC semi-preparativa (metanol al 10%/cloroformo al 90%), proporcionando una muestra pura de la 14 deseada. Tiempo de retención de CL-EM 2,87 min EN+ 1344,29.
Boc-Val-Cit-PABOH (82) Se añadió una solución de Boc-Val-OSu (10,0 g, 31,8 mmol, 1 equiv.) en THF (50 mi) a una solución de H-Cit-OH (5,85 g, 33,4 mmol, 1,05 equiv.) y NaHC03 (2, 94 g, 34,9 mmol, 1,1 equiv.) en THF (50 mi) y H20 (100 mi). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas y el THF se evaporó a presión reducida. El pH se ajustó a 3 con ácido cítrico para precipitar una goma de color blanco. Esta se extrajo con IPA al 10%/acetato de etilo (8 x 150 mi), los extractos combinados se lavaron con salmuera (300 mi) y se secaron (MgSC>4 ) . La evaporación a presión reducida dio una espuma de color blanco que se secó a presión reducida durante 18 horas. La espuma se suspendió en éter con sonicación seguida de filtración, dando el producto en forma de un polvo fino de color blanco (10,6 g, 89%). Una porción de este material (7,2 g, 19,2 mmol, 1 equiv.), p-aminobencil alcohol (2,6 g, 21,15 mmol, 1,1 equiv.) y EEDQ (9,5 g, 38,5 mmol, 2,0 equiv.) en DCM/MeOH (100 ml/50 mi) se agitaron a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se evaporó a presión reducida, la goma residual se trituró con éter con sonicación, el producto resultante se recogió por filtración y se secó a presión reducida, dando el producto 82 en forma de un sólido de color blanco (6,6 g, 71%). Datos Analíticos: TR 2,42 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 479, 8 ( [M + 1]+·, 60), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 477, 6 ( [M - H] )" -, 90).
La síntesis del compuesto 82 se muestra en el esquema 16 que se indica a continuación.
Esquema 16 82 Acetato de ( (S) -1- (4- ( (5- (4- ( (S) -2- (acetoximetil) -4-metilenpirrolidin-l-carbonil) -5- ( ( ( (4- ( (S) -2- ( (S) -2- ( (terc-butoxicarbonil) amino) -3-metilbutanamido) -5-ureidopentanamido) bencil) oxi) carbonil) amino) -2-metoxifenoxDpentil) oxi) -2- ( ( (aliloxi) carbonil) amino) -5-metoxibenzoil) -4-metilenpirrolidin-2-il) metilo (83) Se añadió trietilamina (0,14 g, 0,19 mi 1,4 mmol, 2,2 equiv.) a una solución agitada de la ¿is-anilina mono-alloc protegida (6) (0,505 g, 0,64 mmol, 1 equiv.) y trifosgeno (0, 068 g, 0,23 mmol, 0,36 equiv.) en THF seco (10 mi) en una atmósfera de argón a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C, una muestra se trató con metanol y se analizó por CLEM como el carbamato de metilo.
Al isocianato recién preparado se le añadió gota a gota una solución del alcohol bencílico (82) (0,46 g, 0,96 mmol, 1,5 equiv.) y trietilamina (0, 096 g, 0,13 mi, 0,96 mmol, 1,5 equiv.) en THF seco/DMF (20 ml/1 mi). La mezcla de reacción se controló por CL-EM y se completó después de 2 horas a 40 °C. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se repartió entre IPA al 10%/DCM y agua. La porción orgánica se separó, se lavó con agua (100 mi), salmuera (100 mi), se secó (MgS04) y se evaporó a presión reducida, dando una espuma de color pardo. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo a cloroformo al 93%/metanol al 7% en aumentos del 1%] dio el producto en forma de un sólido de color blanco (0,5 g, 60%). Datos Analíticos: TR 3,42 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1298 ([? + ?]+·, 100).
( (S) - (Pentan-1 ,5-diilbis (oxi) )bis (2- ( (S) -2- (hidroximetil) -4-metilenpírrolidin-l-carbonil) -4-metoxi-5, 1 -fenilen) ) dicarbamato de alil 4- ( (S) -2- ( (S) -2- ( (terc-butoxicarbonil) amino) -3-metilbutanamido) -5-ureidopentanamido) bencilo (84) Se añadió una solución de K2C03 (0,28 g, 2,0 mmol, 5,4 equiv.) en H20 (2 mi) a una solución del acetato (83) (0,49 g, 0,4 mmol, 1 equiv.) en metanol (10 mi). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El metanol se evaporó a presión reducida, el residuo se diluyó con H20 (10 mi) y se acidificó a pH 3 con ácido cítrico 1 M. La mezcla se extrajo con DCM (4 x 50 mi) y los extractos combinados se lavaron con salmuera (100 mi) , se secaron (MgSC ) y se evaporaron a presión reducida, dando el producto en forma de una espuma de color blanco (0,43 g, 94%). Datos Analíticos: TR 3,12 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1214 ( [M + ?]+·, 100), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 1212 ( [M - H])~ ·, 100) . 8- ((5-(( (HS,llaS) -10- (3- (4- ( (S) -2- ( (S) -2- ( (terc-butoxicarbonil) amino) -3-metilbutanamido) -5-ureidopentanamido) fenil)propanoil) -ll-hidroxi-7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5,10, 11 , lla-hexahidro-lH-pirrolo [2,1-c] [1 , 4]benzodiazepin-8-il) oxi)pentil) oxi) -ll-hidroxi-7- metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3, 11 , lla-tetrahidro-lH-pirrolo [2, 1 -c] [1 , 4]benzodiazepin-10 (5?) -carboxilato de (HS,llaS) -alilo (85) Se añadió en una porción ácido 2-yodoxibenzoico estabilizado al 45% en peso (IBX) (0,18 g, 0,29 mmol, 2,4 equiv. ) a una solución del producto bis desacetilado (55) (0,147 g, 0,12 mmol, 1 equiv.) en DMSO seco (4 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 26 horas. Se añadió una porción más de IBX (15 mg, 2,4 x 10~5, 0,2 equiv.) y la reacción continuó durante 18 horas más. La mezcla de reacción se diluyó con H2O (10 mi), se extrajo con MeOH al 10%/DCM (4 x 25 mi) y los extractos combinados se lavaron con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (2 x 100 mi), agua (100 mi), salmuera (100 mi) y se secaron (MgS04) . El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria a presión reducida, dando el producto en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de diclorometano al 100% a diclorometano al 94%/metanol al 6% en aumentos del 1%] dio el producto 85 en forma de un sólido de color blanco (77 mg, 53%). Datos Analíticos: TR 2,98 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1210 ( [ + ?]+·, 100), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 1208 ( [M - H] ) , 100). 8- ((5-(( (HS,llaS) -10-(((4-( (S) -2- ( (S) -2-amino-3-metilbutanamido) -5-ureidopentanamido) bencil) oxi) carbonil) -11-hidroxi-7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5, 10, 11 , lla-hexahidro-lH-pirrolo [2, 1-c] [1,4]benzodiazepin-8-il) oxi)pentil) oxi) -11-hidroxi-7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 11 , lla-tetrahidro-lH-pirrolo[2,l-c] [1 , 4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (US, llaS) -alilo (86) Se añadió ácido trifluoroacético frío (3 mi) al compuesto Boc protegido ( 85 ) (72 mg, 6,0 x 10"5 mol) a 0 °C. La solución se agitó a esta temperatura durante 15 minutos. La mezcla de reacción se vertió sobre hielo y el pH se ajustó a pH 8 con una solución saturada de NaHC03. La solución se extrajo con DCM (4 x 25 mi) y los extractos combinados se lavaron con salmuera saturada (100 mi), se secaron (MgS04) y se evaporaron a presión reducida, dando el producto en forma de un sólido de color blanco (55 mg, 83%). Datos Analíticos: TR 2,53 min; EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1110 ( [M + ?]+·, 100), EM (EN") m/z (intensidad relativa) 1108 ( [M - H] ) ~" , 100) . ll-hidroxi-7-metoxi-8- ( (5- ( ( (S) -7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5, lla-tetrahidro-lH-pirrolo [2, 1-c] [1,4]benzodiazepin-8-il) oxi)pentil) oxi) -2-metilen-5-oxo-2, 3, 11 , lla-tetrahidro-lH-pirrolo [2, 1-c] [1 , 4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (HS,llaS) -4- ( (S) -2- ( (S) -2-amino-3-metilbutanamido) -5-ureidopentanamido) bencilo (86) Se añadió Pd(PPh3)4 (2,7 mg, 2,3 µ???, 0,03 equiv.) a una solución del compuesto alloc ( 85) (80 mg, 72 pmol, 1,0 equiv.) y pirrolidina (30 µ?, 26 mg, 0,36 mmol, 5 equiv.) en DCM seco (3 mi) en una atmósfera de nitrógeno. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo al 90%/metanol al 10% a cloroformo al 76%/metanol al 24%] dio el producto en forma de un polvo de color blanco (62,5 g, 86%). Datos Analíticos: TR 2,45 min EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1008 ( [M + H]+>, 80). ll-hidroxi-7-metoxi-8- ( (5- ( ( (S) -7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5, lia-tetrahidro-lH-pirrolo [2 ,1-c] [1,4]benzodiazepin-8-il) oxi)pentil) oxi) -2-metilen-5-oxo-2, 3, 11 , lla-tetrahidro-lH-pirrolo[2 ,1-c] [1 ,4]benzodiazepin-10 (5H) -carboxilato de (HS,llaS) -4- ( (S) -2- ( (S) -2- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidro-lH-pirrol-l-il) hexanamido) -3-metilbutanamido) -5-ureidopentanamido) bencilo (87) Se añadió N,N-diisopropildietilamina (12 µ?, 7,1 x 10"5 mol, 5,0 equiv.) a una solución del dipéptido de amina (86) (14,2 mg, 1,4 x 10~5 mol, 1 equiv.) y 6-maleimida-ácido hexanoico-NHS éster (4,8 mg, 1,55 x 10"5 mol, 1,1 equiv.) en DCM seco/DMA (2 ml/0,2 mi) en una atmósfera de argón La solución se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna [gradiente de elución de cloroformo a cloroformo al 93%/metanol al 7% en aumentos del 1%] , dando el producto en forma de una espuma de color blanquecino (5 mg, 29%). Datos Analíticos: TR 2,83 min EM (EN+) m/z (intensidad relativa) 1201 ( [ + ?]+·, 100 ).
Reducción/Oxidación de tioAcMo para conjugación Los anticuerpos monoclonales de longitud completa sometidos a ingeniería con cisteína (TioAcMo) expresados en células CHO se redujeron con un exceso de 20-40 veces de TCEP (tris(l-carboxietil) fosfina clorhidrato o DTT (ditiotreitol) en Tris 50 mM a pH 7,5 con EDTA 2 mM durante 3 horas a 37 °C o durante la noche a temperatura ambiente (Getz y col. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) . El TioAcMo reducido se diluyó y cargó en una columna de HiTrap en acetato sódico 10 mM, a pH 5, y se eluyó con PBS con cloruro sódico 0,3M. Como alternativa, el anticuerpo se acidificó mediante la adición de 1/20 del volumen de ácido acético al 10 % diluido con succinato 10 mM a pH 5, se cargó sobre la columna y después se lavó con 10 volúmenes de columna del tampón succinato. La columna se eluyó con tris 50 mM, a pH 7,5, EDTA 2 mM.
El TioAcMo reducido eluido se trató con sulfato de cobre acuoso (CUSO4) 200 n o un exceso molar de 15 veces de DHAA (ácido deshidroascórbico) . La oxidación de los enlaces disulfuro intercatenarios se completó en aproximadamente tres horas o más. La oxidación al aire ambiente fue también eficaz. El anticuerpo reoxidado se dializó en succinato sódico 20 mM, pH 5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM y se almacenó congelado a -20 °C.
Conjugación de TioAcMo con compuestos de fármaco-conector para preparar conjugados de anticuerpo-fármaco Los TioAcMo reoxidados como se ha descrito anteriormente se combinaron con un exceso de 2,5 a 10 veces del intermedio fármaco-conector (15ba, 15bb, 15d, 58) mezclado y dejado reposar durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente para efectuar la conjugación y formar los conjugados anticuerpo-fármaco TioAcMo 101-115 en la Tabla 1. La mezcla de conjugación se purificó mediante filtración en gel, cromatografía de intercambio de cationes o diálisis para eliminar el exceso de intermedio fármaco-conector y otras impurezas .
Tabla 1 Tr = tio trastuzumab, anti HER2, 4D5 HC A118C (numeración secuencial) , A114C (numeración de Kabat) imp = W-10 imina protegida: 3- (2-metoxietoxi) propanoato-Val- Ala-PAB- En concreto, el intermedio fármaco-conector 15d (? 1496,65) se solubilizó en DMA (dimetilacetamida) hasta una concentración de 20 mM. El anticuerpo trastuzumab (Tr) H118C sometido a ingeniería con cisteína y reoxidado se descongeló y se añadió un exceso molar de 3 veces de 15d. La reacción se llevó a cabo a pH después de que los experimentos mostraran un incremento de la agregación del anticuerpo a un pH mayor.
La extensión de la conjugación del fármaco se monitorizó mediante análisis CL-EM. Tras 3 horas se añadió 1 equivalente adicional de 15d y se dejó proceder la reacción durante la noche a 4 °C para dar el CAF 114 bruto.
El conjugado anticuerpo-fármaco, trastuzumab-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 114, se aplicó después a una columna de intercambio catiónico tras dilución con succinato, se lavó con al menos 10 volúmenes de columna de succinato y se eluyó con PBS. El conjugado anticuerpo-fármaco 114 se formuló en His/acetato 20 mM a pH 5, sacarosa 240 mM usando columnas de filtración en gel. El conjugado anticuerpo-fármaco 114 se caracterizó mediante espectroscopia UV para determinar la concentración proteica, SEC analítica (cromatografía de exclusión por tamaño) para análisis de agregación y CL-EM antes y después de la reducción para determinar la carga del fármaco.
La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó usando una columna Shodex KW802.5 en fosfato potásico 0,2M a pH 6,2 con cloruro potásico 0.25 mM e IPA al 15 % a un caudal de 0,75 ml/min. El estado de agregación del conjugado se determinó mediante integración de la absorbancia del área máxima eluida a 280 nm. El análisis mediante SEC mostró un 4,1 % mediante el área integrada del CAF agregado a 8,08 min y 95,9 % de CAF monomérico 114 a 8,99 min.
El análisis CL-EM se realizó usando un instrumento Agilent QTOF 6520 ESI. Como ejemplo, 114 trastuzumab-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD se redujo con DTT (ditiotreitol ) y se cargó en una columna de 1000 Á, 8ym PLRP-S (Varían) calentada hasta 80 °C y se luyó con un gradiente del 30 % de B al 40 % de B en 5 minutos. La fase móvil A era H20 con TFA al 0,05%, la fase móvil B era acetonitrilo con TFA al 0,04%. El caudal fue de 0,5 ml/min. La elución de proteínas se monitorizó mediante detección de absorbancia UV a una A 280 nm antes del análisis de ionización por electropulverización y TOF. Se obtuvo la resolución cromatográfica basal de la cadena ligera desnuda, la cadena pesada desnuda residual y la cadena pesada con fármaco. Los espectros m/z obtenidos se aclararon usando el software Agilent Mass Hunter(TM) para calcular la masa de los fragmentos de anticuerpo reducido.
Peso molecular (PM) de MP-PEG8-Val-Ala-PAB- (imp) PBD 58 (Figura 1) = 1964 daltons Masas aclaradas observadas: 23440 daltons corresponden al PM de la CL desnuda 50627 daltons corresponden al PM de la CH desnuda 52591 daltons corresponden al PM de la CH con fármaco Por tanto, el pico observado a 52591 daltons corresponde al fragmento esperado de la cadena pesada (CH) (50627 daltons) portador de un resto de fármaco, el intermedio fármaco-conector 58 (daltons) .
Cuando el anticuerpo para conjugar a un intermedio-conector de PBD no es un anticuerpo sometido a ingeniería con cisteína, los puentes disulfuro intercatenarios se reducen parcialmente mediante la adición de un exceso molar de aproximadamente 2,2 veces de TCEP en fosfato a pH 7,5 durante 2 horas a 37 °C. Cada equivalente de TCEP tiene como resultado, en teoría, 2 cisteínas reactivas. Normalmente, para una proporción de fármaco/anticuerpo (PFA) diana de aproximadamente 3,5 se añade un exceso molar de 1,8-2 veces de TCEP. Normalmente no se necesita ninguna etapa de purificación tras la reducción. Se añade un ligero exceso (1,2-1,5 X) del intermedio fármaco-conector a las cisteinas reactivas, aproximadamente 8 equivalentes molares de intermedio fármaco-conector al anticuerpo y la reacción se lleva a cabo durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La purificación se puede realizar mediante diafiltración, intercambio iónico o filtración en gel. La PAF se puede determinar mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) o CL-EM del conjugado reducido usando una integración del área A280 UV.
Ensayos de proliferación celular in vitro La eficacia del CAF se midió mediante un ensayo de proliferación celular usando el protocolo siguiente (ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo, Promega Corp. Boletín Técnico TB288; Mendoza y col. (2002) Cáncer Res. 62:5485-5488) : 1. Un alícuota de 100 µ? de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 células (por ejemplo, KPL-4, una línea celular de cáncer de mama humano, Kurebayashi y col. (1999) Brit. Jour. Cáncer 79 (5-6) : 707-717) , SKBR-3, BT474, MCF7 o MDA-MB-468) en medio se depositó en cada pocilio de una placa de paredes opacas de 96 pocilios. 2. Se prepararon pocilios control que contienen medio y sin células . 3. A los pocilios experimentales se añadió CAF y se incubó durante 3-5 días. 4. Las placas se equilibraron hasta temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. 5. Se añadió un volumen de reactivo de CellTiter-Glo igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada pocilio . 6. Los contenidos se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir lisis celular. 7. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de luminiscencia. 8. La luminiscencia se registró e indicó en los gráficos como ULR= unidades de luminiscencia relativas.
Determinadas células se siembran a 1.000-2.000/pocillo o 2.000-3.000/pocillo en una placa de 96 pocilios, 50 ul/pocillo. Tras uno o dos días, los CAF se añaden en volúmenes de 50 µ? hasta una concentración final de 9.000, 3.000, 1.000, 333, 111, 37, 12,4, 4,1 o 1,4 ng/ml, con pocilios control "sin CAF" que reciben solo medio. Las condiciones están por duplicado o por triplicado. Tras 3-5 dias, se añaden 100 µ?/pocillo de Cell TiterGlo II (ensayo basado en luciferasa, proliferación medida por los niveles de ATP) y los recuentos celulares se determinan usando un luminómetro. Los datos se representan como la media de la luminiscencia para cada conjunto de duplicados, con barras de error de desviación estándar. El protocolo es una modificación del ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega) ; 1. Sembrar en placa 1.000 células/pocilio en 50 µ?/pocillo de medio con FBS/glutamina . Dejar que las células se unan durante la noche. 2. El CAF se diluye en serie a 1:3 en medio comenzando a una concentración de trabajo de 18 g/ml (esto tiene como resultado una concentración final de 9 g/ml) . Se añaden 50 µ? de CAF diluido a los 50 µ? de células y el medio ya en el pocilio . 3. Incubar 72-96 horas (lo normal es 72 horas, pero vigilar la concentración de 0 ug/ml para detener el ensayo cuando las células llegan a un 85-95 % de confluencia. 4. Añadir 100 µ?/pocillo del reactivo Promega Cell Titer Glo, agitar 3 minutos y leer en el luminómetro.
Resultados La Figura 2 muestra un gráfico de SK-BR-3 viabilidad celular in vitro a 5 días frente a concentraciones de: Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101 (·), antiCD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102 (A), Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103 (?) , y antiCD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104, donde Tr es anti HER2 tio trastuzumab 4D5 HC A118C, los mutantes del anticuerpo sometidos a ingeniería con cisteína en la cadena pesada se numeran mediante el esquema de numeración secuencial.
La proliferación de las células SK-BR-3 que expresan HER2 es inhibida de forma selectiva por los conjugados anticuerpo-fármaco antiHER2 101 y 103, pero no por los conjugados anticuerpo-fármaco antiCD22 102 y 104. Estos resultados confirman el efecto de destrucción selectiva dependiente de la diana in vitro de los conjugados anticuerpo-fármaco de PBD.
La Figura 3 muestra un gráfico de KPL-4 viabilidad celular in vitro a 5 días frente a concentraciones de: Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101 (·) , antiCD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102 (A), Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103 (?) , y antiCD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104 (T) , donde Tr es anti HER2 tio trastuzumab 4D5 HC A118C, los mutantes de anticuerpo sometidos a ingeniería con cisteína en la cadena pesada se numeran mediante el esquema de numeración secuencial Los conjugados anticuerpo-fármaco, trastuzumab-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 114 y trastuzumab-MP-PEG8-Val-Ala-PAB- ( imp) PBD 115 se analizaron de nuevo contra células SK-BR-3, KPL-4 y MCF-7 (Levenson y col. (1997) Cáncer Res. 57 (15) : 3071-3078) para medir la viabilidad celular in vitro en estudios de cinco días. El valor de la CI50 ( g/ml) para 114 contra SK-BR-3 fue de 17,2 y contra KPL-4 fue de 68,1. El valor de la CI5o para 115 contra SK-BR-3 fue de 12,3 y contra KPL-4 fue de 50,7. Tanto 114 como 115 fueron inactivos de un modo eficaz contra MCF-7, que es una linea celular de adenocarcinoma de mama humano que no expresa HER2. Por tanto, los conjugados 114 y 115 demuestran potencia de destrucción celular dirigida .
Inhibición del crecimiento tumoral, eficacia in vivo en ratones transgenicos con explantes que expresan niveles altos de HER2 Se pueden obtener animales adecuados para experimentos transgénicos a partir de fuentes comerciales estándar tales como Taconic (Germantown, N.Y.). Son adecuadas muchas cepas, pero se prefieren ratones FVB hembra por su mayor susceptibilidad a la formación de tumores. Los ratones FVB macho se usaron para apareamiento y se usaron sementales CD.l vasectomizados para estimular seudogestación . Se pueden obtener ratones vasectomizados a partir de cualquier proveedor comercial. Los animales fundadores fueron criados con ratones FVB o con ratones heterocigotos 129/BL6 x FVB p53. Los ratones con heterocigosidad en el alelo p53 se usaron para incrementar potencialmente la formación del tumor. No obstante, esto se ha demostrado que es innecesario. Por tanto, algunos tumores Fl son ce una cepa mixta. Los tumores fundadores son solo FVB. Se obtuvieron seis fundadores con algunos tumores en desarrollo sin tener carnadas .
Los animales con tumores (aloinjerto propagado de ratones transgénicos Fo5 mmtv) fueron tratados con una o múltiples dosis mediante inyección IV de CAF. El volumen tumoral se evaluó a varios puntos de tiempo tras la inyección.
Los tumores se producen fácilmente en ratones transgénicos que expresan una forma mutacionalmente activada de neu, el homologo en rata de HER2, pero HER2 que se sobreexpresa en los cánceres de mama humanos no está mutado y la formación del tumor es mucho menos sólida en ratones transgénicos que sobreexpresan HER2 no mutada (Webster y col. (1994) Semin. Cáncer Biol. 5:69-76).
Para mejorar la formación de tumor con HER2 no mutada, se produjeron ratones transgénicos usando un plásmido de ADNc de HER2 en el que se delecionó una ATG cadena arriba con el fin de prevenir el inicio de la traducción en dichos codones de ATG cadena arriba, lo que, por otro lado, reduciría la frecuencia del inicio de la traducción desde el codón de iniciación auténtico cadena debajo de HER2 (por ejemplo, véase Child y col. (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341). Adicionalmente se añadió un intrón quimérico en el extremo 5' , que debería también potenciar el nivel de expresión, como se ha indicado anteriormente (Neuberger y Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16:6713; Buchman y Berg (1988) Mol . Cell. Biol. 8:4395; Brinster y col. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:836). El intrón quimérico derivó de un vector Promega, vector de expresión en mamíferos Pci-neo (pb 890-1022) . El extremo 3' del ADNc está flanqueado por los exones 4 y 5 de la hormona de crecimiento humana y las secuencias de poliadenilación . Además, se usaron ratones FVB porque esta cepa es más susceptible al desarrollo de tumores. El promotor de MMTV-LTR se usó para garantizar la expresión de HER2 especifica de tejido en la glándula mamaria. Los animales se alimentaron con la dieta AIN 76A con el fin de aumentar la susceptibilidad de la formación de tumores (Rao y col. (1997) Breast Cáncer Res. y Treatment 45 : 149-158) .
Modelo de tumor mamario murino Fo5 El modelo Fo5 es un modelo de ratón transgénico en el que el gen HER2 humano, bajo la regulación transcripcional del promotor del virus de tumor mamario murino (MMTV-HER2 ) , se sobreexpresa en el epitelio mamario. La sobreexpresión produce el desarrollo espontáneo de tumores mamarios que sobreexpresan el receptor HER2 humano. El tumor mamario de uno de los animales fundadores (fundador n° 5 [Fo5]) se ha propagado en generaciones posteriores de ratones FVB mediante transplante en serie de fragmentos tumorales. Antes de usarse para un estudio de eficacia in vivo, el tumor mamario transgénico MMTV-HER2 Fo5 se transplantó mediante cirugía en la almohadilla de grasa de mama n° 2/3 de ratones un/un (de Charles River Laboratories) en fragmentos que medían aproximadamente 2 2 mm. Cuando los tumores alcanzaron los volúmenes deseados, los ratones portadores del tumor fueron aleatorizados y se les administró una única dosis mediante inyección IV del CAF.
Resultados La Figura 4 muestra un gráfico del cambio de volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en el modelo de cáncer de mama MMTV-HER2 Fo5 de tumores de aloinjerto mamario inoculados en ratones un/un CRL tras una única dosis iv el día 0 con: (1) Vehículo de histidina acetato 20mM, pH 5,5, sacarosa 240mM, (2) antiSteapl- P-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 107 a 10 /mg/kg, (3) antiSteapl-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 108 a 10 mg/kg, (4) Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101 a 10 mg/kg y (5) Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103 a 10 mg/kg. Las líneas en la figura están indicadas con los símbolos siguientes: — *— Vehículo - 4- 107 - «r - 108 — ^ 101 -O- 103 Los conjugados anti-HER2 101 y 103 mostraron inhibición del crecimiento tumoral específica de la diana. De los 10 animales tratados con el conjugado 101, dos mostraron respuestas parciales. De los 10 animales tratados con el conjugado 103, tres mostraron respuestas parciales. Los CAF control no dirigidos 107 y 108 no tuvieron ningún efecto sobre el crecimiento del tumor.
En otro estudio de ejemplo, el cambio de volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en el modelo de cáncer de mama MMTV-HER2 Fo5 de tumores de aloinjerto mamario inoculados en ratones nu/nu CRL se midió tras una única dosis iv el día 0 con: (1) Vehículo histidina acetato 20mM, pH 5,5, sacarosa 240mM; (2) 112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD a 5 mg/kg (dosis de CAF) , 300 ug/m2 (exposición al fármaco con PBD) (3) 112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD a 10 mg/kg, 600 pg/m2; (4) 114 trastuzumab-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD a 5 mg/kg, 284 g/m2; (5) 114 trastuzumab-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD a 10 mg/kg, 569 pg/m2; (6) 113 gD5B60- P-PEG8-Val-Ala-PAB- (imp) PBD a 10 mg/kg, 807 g/m2; y (7) 115 trastuzumab-MP-PEG8-Val-Ala-PAB- (imp) PBD a 10 mg/kg, 790 g/m2. El tamaño del tumor se midió a los 0, 3, 7 y 10 días. Tras 10 dias se administró a los animales: (1) Vehículo mostraron un incremento del tamaño del tumor y ninguna inhibición del tumor en el grupo de 10 animales; (2) 112 mostró ausencia de respuestas parciales o completas en el grupo de 10 animales; (3) 112 mostró ausencia de respuestas parciales o completas en el grupo de 10 animales; (4) 114 mostró diez respuestas parciales en el grupo de 10 animales; (6) 113 mostró ausencia de respuestas parciales o completas en el grupo de 10 animales; y (7) 115 mostró diez respuestas parciales en el grupo de 10 animales. Por tanto, los CAF antiHER2 dirigidos 114 y 115 mostraron inhibición dirigida del tumor, mientras que el vehículo control negativo y los CAF no dirigidos 112 y 113 no lo hicieron.
Modelo de tumor de próstata humano LuCap35V LuCap35V, obtenido de la University of Washington (Seattle, WA) , es una Variante independiente de andrógenos del modelo de tumor de explante de próstata humano LuCap35 (Corey E, Quinn JE, Buhler KR, y col. LuCap35: a new model of prostate cáncer progression to androgen independence . The Prostate 2003;55:239-46). El tejido usado para establecer LuCap35 se aisló de la biopsia de los ganglios linfáticos inguinales que contienen cáncer de próstata metastásico y, después, se implantó en el flanco de los ratones (Corey y col. 2003). El modelo de explante LuCap35V se mantuvo mediante implantaciones en serie en ratones C.B-17 Fox Chase SCID macho castrados durante 38 pases en la University of Washington y, después, en ratones C.B-17 SCID-beige macho castrados de Charles River Laboratories para continuos pases en Genentech. Antes de usarse para un estudio de eficacia in vivo, las piezas de tumor LuCap35V (de aproximadamente 20-30 rara3) se implantaron por via subcutánea en el flanco derecho de los ratones C.B-17 SCID-beige macho castrados. Los animales fueron castrados 2 semanas antes de la implantación del tumor para dar tiempo a que los niveles residuales de testosterona alcanzaran un valor de cero. Cuando los tumores alcanzaron los volúmenes deseados, se aleatorios a los ratones portadores del tumor y se les administró una única dosis mediante inyección IV del CAF.
Resultados La Figura 5 muestra un gráfico del cambio del volumen del tumor medio en el tiempo en el modelo de cáncer de próstata LuCap35V de tumores xenoinj ertados en ratones SCID beige macho castrados tras una única dosis iv el día 0 con (1) Vehículo acetato de histidina 20mM a pH 5,5, sacarosa 240 mM ), (2) La Figura 6 muestra un gráfico del cambio del volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en el modelo de cáncer de próstata LuCap35V de tumores xenoinj ertados en ratones SCID beige macho castrados tras una única dosis iv el día 0 con (1) Vehículo histidina acetato 20mM, a pH 5,5, sacarosa 240 mM (A) (2) 107 antiSteapl-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD, 9,8 mg/kg, 60 Ug/m2 (¦) , (3) 107 antiSteapl-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD, 19,5 mg/kg, 120 yg/m2 (·), (4) 108 antiSteapl-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD, 3,3 mg/kg, 60 vq/ 2 (?) , (5) 108 antiSteapl-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD, 6,5 mg/kg, 120 g/m2 (o) , (6) 105 trastuzumab-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 9.4 mg/kg, 120 µq/m2 (?) y (7) 106 trastuzumab-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD, 8,6 mg/kg (dosis de CAD) , 120 ug/m2 (exposición al fármaco de PBD) (X) .
En otro estudio de ejemplo, el cambio del volumen del tumor medio en el tiempo en el modelo de cáncer de próstata LuCap35V de tumores xenoinj ertados en ratones SCID beige macho castrados se midió tras una única dosis iv el día 0 con (1) Vehículo acetato de histidina 20mM a pH 5,5, sacarosa 240 mM (A ) , (2) 112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD, 3 mg/kg (dosis de CAF), 68.3 µg/m2 (exposición al fármaco de PBD), (3) 111 antiSteapl-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD, 1 mg/kg, 22,15 Ug/m2, (4) 111 antiSteapl-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD, 3 mg/kg, 66,4 ug/m2, (5) 113 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB- (imp) PBD a 3 mg/kg, 70,1 g/m2; y (6) 109 antiSteapl-MP-PEG8-Val-Ala-PAB- (imp) PBD 3 mg/kg, 64,6 yg/m2. El tamaño del tumor se midió cada 4 días. Tras 27 días se administró a los animales: (1) Vehículo mostraron un incremento del tamaño del tumor y ninguna inhibición del tumor en el grupo de 8 animales; (2) 112 mostró una respuesta parcial del grupo de 8 animales; (3) 111 mostró cuatro respuestas parciales y cuatro respuestas completas en el grupo de 6 animales; (4) 111 mostró cinco respuestas parciales y tres respuestas completas en el grupo de 5 animales; (5) 113 mostró ausencia de respuestas parciales o completas en el grupo de 8 animales; y (6) 109 mostró siete respuestas parciales y una respuesta completa en el grupo de 7 animales. Los CAF antiSteapl dirigidos 109 y 111 mostraron inhibición dirigida del tumor, mientras que el vehículo control negativo y los CAF no dirigidos 112 y 113 no lo hicieron .
Abreviaturas Ac acetilo Acm acetamidometilo Alloc aliloxicarbonilo Boc dicarbonato de di-terc-butilo t-Bu tere-butilo Bzl bencilo, en el que Bzl-OMe es metoxibencilo y Bzl-Me es metilbenceno Cbz o Z benciloxi-carbonilo, en el que Z-Cl y Z-Br son cloro- y bromobenciloxi carbonilo, respectivamente DMF iV,N-dimetilformamida Dnp dinitrofenilo DTT ditiotreitol Fmoc 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo imp grupo protector de imina N-10: 3- (2- metoxietoxi) propanoato-Val-Ala-PAB C-OSu maleimidocaproil-O-iV-succinimida Moc metoxicarbonilo P maleimidopropanamida Mtr 4-metoxi-2 , 3 , 6-trimetilbencenosulfonilo PAB para-aminobenciloxicarbonilo PEG etilenoxi PNZ carbamato de p-nitrobencilo Psec 2- (fenilsulfonil) etoxicarbonilo TBDMS terc-butildimetilsililo TBDPS terc-butildifenilsililo Teoc 2- (trimetilsilil) etoxicarbonilo Tos tosilo Troc cloruro de 2, 2, 2-tricloretoxicarbonilo Trt tritilo Xan xantilo Referencias La siguientes referencias se incorporan por referencia totalidad : EP 0522868 EP 0875569 EP 1295944 EP 1347046 EP 1394274 EP 1394274 EP 1439393 JP 05003790 JP 2004113151 JP 58180487 US 2001/055751 US 2002/034749 US 2002/042366 US 2002/150573 US 2002/193567 US 2003/0228319 US 2003/060612 US 2003/064397 US 2003/065143 US 2003/091580 US 2003/096961 US 2003/105292 US 2003/109676 US 2003/118592 US 2003/119121 US 2003/119122 US 2003/119125 US 2003/119126 US 2003/119128 US 2003/119129 US 2003/119130 US 2003/119131 US 2003/124140 US 2003/124579 US 2003/129192 US 2003/134790-Al US 2003/143557 US 2003/157089 US 2003/165504 US 2003/185830 US 2003/186372 US 2003/186373 US 2003/194704 US 2003/206918 US 2003/219806 US 2003/224411 US 2003/224454 US 2003/232056 US 2003/232350 US 20030096743 US 20030130189 US 2003096743 US 2003130189 US 2004/0001827 US 2004/005320 US 2004/005538 US 2004/005563 US 2004/005598 US 2004/0101899 US 2004/018553 US 2004/022727 US 2004/044179 US 2004/044180 US 2004/101874 US 2004/197325 US 2004/249130 US 20040018194 US 20040052793 US 20040052793 US 20040121940 US 2005/271615 US 2006/116422 US 4816567 US 5362852 US 5440021 US 5583024 US 5621002 US 5644033 US 5674713 US 5700670 US 5773223 US 5792616 US 5854399 US 5869445 US 5976551 US 6011146 US 6153408 US 6214345 US 6218519 US 6268488 US 6518404 US 6534482 US 6555339 US 6602677 US 6677435 US 6759509 US 6835807 US 7223837 US 7375078 US 7521541 US 7723485 WO 00/012508 WO 00/12507 WO 00/12508 WO 01/16318 WO 01/45746 WO 02/088172 WO 03/026577 WO 03/043583 WO 04/032828 WO 2000/12130 WO 2000/14228 WO 2000/20579 WO 2000/36107 WO 2000/40614 WO 2000/44899 WO 2000/55351 WO 2000/75655 WO 200053216 WO 2001/00244 WO 2001/38490 WO 2001/40269 WO 2001/40309 WO 2001/41787 WO 2001/46232 WO 2001/46261 WO 2001/48204 WO 2001/53463 WO 2001/57188 WO 2001/62794 WO 2001/66689 WO 2001/72830 WO 2001/72962 WO 2001/75177 WO 2001/77172 WO 2001/88133 WO 2001/90304 WO 2001/94641 WO 2001/98351 WO 2002/02587 WO 2002/06339 WO 2002/101075 WO 2002/10187 WO 2002/102235 WO 2002/10382 WO 2002/12341 WO 2002/13847 WO 2002/14503 WO 2002/16413 WO 2002/16429 WO 2002/22153 WO 2002/22636 WO 2002/22660 WO 2002/22808 WO 2002/24909 WO 2002/26822 WO 2002/30268 WO 2002/38766 WO 2002/54940 WO 2002/59377 WO 2002/60317 WO 2002/61087; WO 2002/64798 WO 2002/71928 WO 2002/72596 WO 2002/78524 WO 2002/81646 WO 2002/88170 WO 2002/89747 WO 2002/92836 WO 2002/94852 WO 2002/98358 WO 2002/99074 WO 2002/99122 WO 2003/000842 WO 2003/002717 WO 2003/003906 WO 2003/003984 WO 2003/004989 WO 2003/008537 WO 2003/009814 WO 2003/014294 WO 2003/016475 WO 2003/016494 WO 2003/018621 WO 2003/022995 WO 2003/023013 WO 2003/024392 WO 2003/025138 WO 2003/025148 WO 2003/025228 WO 2003/026493 WO 2003/029262 WO 2003/029277 WO 2003/035846 WO 2003/042661 WO 2003/045422 WO 2003/048202 WO 2003/054152 WO 2003/055439 WO 2003/055443 WO 2003/062401 WO 2003/062401 WO 2003/072035 WO 2003/072036 WO 2003/077836 WO 2003/081210 WO 2003/083041 WO 2003/083047 WO 2003/083074 WO 2003/087306 WO 2003/087768 WO 2003/088808 WO 2003/089624 WO 2003/089904 WO 2003/093444 WO 2003/097803 WO 2003/101283 WO 2003/101400 WO 2003/104270 WO 2003/104275 WO 2003042661 WO 2003104399 WO 2004/000997 WO 2004/001004 WO 2004/009622 WO 2004/011611 WO 2004/015426 WO 2004/016225 WO 2004/020595 WO 2004/022709 WO 2004/022778 WO 2004/027049 WO 2004/031238 WO 2004/032828 WO 2004/032842 WO 2004/040000 WO 2004/043361 WO 2004/043963 WO 2004/044178 WO 2004/045516 WO 2004/045520 WO 2004/045553 WO 2004/046342 WO 2004/047749 WO 2004/048938 WO 2004/053079 WO 2004/063355 WO 2004/065577 WO 2004/074320 WO 2004000221 WO 2004020583 WO 2004042346 WO 2004065576 WO 2005/023814 WO 2005/082023 WO 2005/085251 WO 2006/111759 WO 2007/044515 WO 2007/085930 WO 2009/052249 WO 2010/091150 WO 91/02536 WO 92/07574 WO 92/17497 WO 94/10312 WO 94/28931 WO 9630514 WO 97/07198 WO 97/44452 WO 98/13059 WO 98/37193 WO 98/40403 WO 98/51805 WO 98/51824 O 99/28468 WO 99/46284 WO 99/58658 Am. 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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un conjugado de Fórmula (AB) o (AC) : y sales y solvatos del mismo, en la que: la linea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, 0R, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se selecciona adicionalmente entre halo o dihalo; en los que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, 0R, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R10 es un engarce conectado a un agente de unión a célula seleccionado entre un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que contiene al menos un sitio de unión y un polipéptido cíclico; Q se selecciona independientemente entre 0, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es 0, SO3M, en el que M es un catión metálico; cada uno de R y R' se selecciona independientemente entre alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-20 y grupos C5-20/ y opcionalmente en relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido de 4, 5, 6 ó 7 miembros; y en el que R2", R6", R7", R9", X", Q" y R11" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, X, Q y R11 respectivamente, y Rc es un grupo de terminación. 2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que R10 puede eliminarse de la posición N10 para dejar un enlace N10-imina CU. 3. El conjugado de una cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que R10 es un grupo: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, CBA es un agente de unión a célula, L1 es un engarce escindible, A es un grupo de conexión que conecta al agente de unión a célula, L2 es un enlace covalente junto con -0C(=0)-, forma un engarce de auto-destrucción. 4. El conjugado de la reivindicación 3, en el que L1 es una enzima escindible. 5. El conjugado de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que L1 comprende una secuencia contigua de aminoácidos. 6. El conjugado de la reivindicación 5, en el que L1 comprende un dipéptido y el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-CO-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg-, -Trp-Cit-. 7. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-C0-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-. 8. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 7, en e que el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-CO-, es -Phe Lys-, -Val-Ala- o -Val-Cit-. 9. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el grupo X2-C0- está conectado a L2. 10. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que el grupo ??-??- está conectado a A. 11. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que L2 junto con OC(=0) forma un engarce de auto-destrucción. 12. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 11, en el que C(=0)0 y L2 forman juntos el grupo: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, la linea ondulada indica el punto de unión al engarce L1, Y es H, O, C(=0)NH o C(=0)0, y n es de 0 a 3. 13. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 12, en el que Y es NH. 14. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que n es 0. 15. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que L1 y L2 junto con -OC(=0)- comprenden un grupo seleccionado entre: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, y la linea ondulada indica el punto de unión a la porción restante del engarce L1 o el punto de unión a A. 16. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la linea ondulada indica el punto de unión a ? . 17. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 16, en el que A es: (i) en el que el asterisco indica el punto de unión a L1, la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, y n es de 0 a 6; o (ü) en el que el asterisco indica el punto de unión a L1, la linea ondulada indica el punto de unión al agente de unión a célula, n es 0 ó 1, y m es de 0 a 30. 18. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 17, en el que el agente de unión a célula está conectado a A a través de un enlace tioéter formado por a partir de un residuo de tiol de cisteina del agente de unión a célula y un grupo malemida de A. 19. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de unión a célula de R10 es un anticuerpo p un fragmento activo del mismo . 20. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el anticuerpo o fragmente de anticuerpo es un anticuerpo p fragmento de anticuerpo para un antigeno asociado a tumor. 21, El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R9 es independientemente H. 22. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R6 es independientemente H. 23. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R7 es independientemente 0R7A, en el que R7A es Ci- alquilo sustituido opcional e independientemente. El conjugado de la reivindicación en el que 25. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X es O. 26. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R11 es H. 27. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la linea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre C2 y C3. 28. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R2 se selecciona independientemente entre H, =0, =CH2, R, =CH-RD y =C(RD)2. 29. El conjugado de acuerdo con uno cualquie reivindicación 28 anterior, en el que independientemente =CH2. 30. El conjugado de acuerdo con uno cualquiera de la reivindicación 28 anterior, en el que R2 es independientemente R. 31. El conjugado de acuerdo con uno cualquiera de la reivindicación 30 anterior, en el que R2 es arilo C5_2o sustituido opcional e independientemente. 32. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que R" es un grupo alquileno C3 o un grupo alquileno C5. 33. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que Rc puede eliminarse de la posición N10 para dejar un enlace NlO-imina Cll. 34. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 33, en el que Rc es un grupo protector de carbamato seleccionado entre: Alloc Fmoc Boc Troc Teoc Psec Cbz PNZ. 35. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 33, en el que Rc es un grupo: en el que el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, G2 es un grupo de terminación, L3 es un enlace covalente o un engarce escindible L1, L2 es un enlace covalente o, junto con 0C(=0), forma un engarce de auto-destrucción . 36. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 35, en el que L3 es un engarce escindible L1, y se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9. 37. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 35 o reivindicación 36, en el que L2 junto con 0C(=0) forma un engarce de auto-destrucción, y el engarce de auto-destrucción es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14. 38. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en el que G2 es Ac o Moc, o es un grupo protector de carbamato seleccionado entre: Alloc Fmoc Boc Troc Teoc Psec Cbz PNZ. 39. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso en terapia. 40. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, para su uso en el tratamiento de a una enfermedad proliferativa en un sujeto. 41. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 40, en el que la enfermedad es cáncer. 42. El conjugado de acuerdo con de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene la fórmula : Ab-(L-D)p en la que Ab es un anticuerpo unido mediante un resto de engarce (L) al resto de fármaco de PBD (D) de la fórmula formula (AB) o (AC) , y p es un número entero de 1 a aproximadamente 8. 43. El conjugado de la reivindicación 42 en el que Ab es un anticuerpo que se une a uno o más antigenos asociados a tumores o receptores de la superficie celular seleccionados de (1) - (36) : (1) BMPR1B (receptor de la proteina morfogenética ósea de tipo IB) ; (2) El6 (LATI, SLC7A5); (3) STEAP1 (seis antigenos epiteliales transmembrana del la próstata) (4) 0772P (CA125, MUC16) ; (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos , mesotelina) ; (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2 , familia 34 de transportadores de sólito (fosfato sódico) , transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, miembro 2); (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B) . (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN ADNc 2700050C12, RIKEN ADNc 2700050C12 gen) ; (9) ETBR (receptor de tipo B de la endotelina) ; (10) MSG783 (RNF124, proteina hipotética FLJ20315) ; (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMPl, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteina 1 asociada al cáncer de próstata, seis antigenos epiteliales transmembrana de la próstata 2, seis proteínas prostéticas transmembrana) ; (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM , TRP 4B, potencial canal catiónico del receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4 ) ; (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1 , factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma) ; (14) CD21 (CR2 (receptor 2 del complemento) o C3DR (receptor C3d/del virus de Epstein Barr) o Hs 73792); (15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (beta asociado a inmunoglobulina) , B29) ; (16) FcRH2 ( IFGP4 , IRTA4, SPAP1A (proteína la de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2) , SPAP1B, SPAP1C) ; (17) HER2; (18) NCA; (19) MDP; (20) IL20Ra; (21) Brevican; (22) EphB2R; (23) ASLG659; (24) PSCA; (25) GEDA; (26) BAFF-R (receptor del factor de activación de células B, receptor BLyS 3, BR3) ; (27) CD22 (receptor de células B, isoforraa CD22-B) ; (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa asociada con inmunoglobulina) ; (29) CXCR5 (receptor 2 del linfoma de Burkitt); (30) HLA-DOB (subunidad beta de la molécula de clase II del MHC (antígeno la) ) ; (31) P2X5 (canal iónico 5 dependiente de ligando P2X del receptor purinérgico) ; (32) CD72 (antigeno CD72 de diferenciación de las células B, Lyb-2); (33) LY64 (antigeno 64 de linfocitos (RP105) , proteína de membrana de tipo 1 de la familia de repeticiones rica en leucina (LRR) ; (34) FcRHl (proteína 1 similar al receptor de Fe); (35) IRTA2 (receptor de la superfamilia de las inmunoglobulinas 2 asociado a la translocación) ; y (36) TENB2 (proteoglicano transmembrana putativo) . 44. El conjugado de la reivindicación 42, en el que el Ac es un anticuerpo sometido a ingeniería con cisteína. 45. El conjugado de la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el Ac es un anticuerpo que se une al receptor ErbB. 46. El conjugado de la reivindicación 45, en el que el Ac es trastuzumab . 47. El conjugado de la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el Ac es un anticuerpo anti-HER2, anti-Steap 1 o anti-CD22. 48. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 47, en el que p es 1, 2, 3 o 4. 49. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 48, que comprende una mezcla de los compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco, en el que la carga media de fármaco por anticuerpo en la mezcla de los compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. 50. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 49 que tiene una fórmula seleccionada de: en la que n es un número entero de 1 a 24. 51. El conjugado de la reivindicación 50, en el que n es un número entero de 1 a 12. 52. El conjugado de la reivindicación 51, en el que n es 4 u 8. 53. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52, un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 54. La composición farmacéutica de la reivindicación 53 comprende adicionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico. 55. Uso de un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52 en la preparación de un médicamente para uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa en un sujeto. 56. Un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un paciente la composición farmacéutica de la reivindicación 53. 57. El procedimiento de la reivindicación 56 en el que al paciente se le administra un agente quimioterapéutico, junto con el conjugado. 58. Uso de un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52 para proporcionar un compuesto de fórmula (CA) a una localización diana: y sales y solvatos del mismo, en la que: la linea de puntos indica la presencia opcional de a doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se selecciona adicionalmente entre halo o dihalo; en los que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; cada uno de R y R' se selecciona independientemente entre alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-20 y arilo C5-20, y opcionalmente en relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterociclico opcionalmente sustituido de 4, 5, 6 o 7 miembros; R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo O, S, N(H), NMe y/o anillos aromático, por ejemplo benceno o piridina, estando dichos anillos opcionalmente sustituidos con NH2; cada X es O, S o N (H) ; y en la que R2', R6", R7", R9" y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9 y X respectivamente. 59. El uso de acuerdo con la reivindicación 58, en el que la localización diana es una población celular proliferativa . 60. Uso de un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52 para proporcionar un compuesto de fórmula (DA) a una localización diana: y sales y solvatos de los mismos, en la que: la linea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, 0R, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se selecciona adicionalmente entre halo o dihalo; en los que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; Q se selecciona independientemente entre 0, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es O, R11 es S03M, en el que M es un catión metálico; cada uno de R y R' se selecciona independientemente entre alquilo Ci-i2 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-2o y arilo Cs-.2o, y opcionalmente en relación al grupo NRR', R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterociclico opcionalmente sustituido de 4, 5, 6 ó 7 miembros; R" e un grupo alquileno C3-12/ cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, estando dichos anillos opcionalmente sustituidos con NH2; cada X es 0, S o N (H) ; y en el que R2", R6', R7", R9", Q", R11" y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, Q, R11 y X respectivamente . 61. Un compuesto de fórmula (EB) o (EC) EC y sales y solvatos del mismo, en la que la línea de puntos indica la presencia opcional de a doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, 0R, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente se selecciona adicionalmente entre halo o dihalo; en los que RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H, y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; RL es un engarce para la conexión a un agente de unión a célula seleccionado entre un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que contiene al menos un sitio de unión y un polipéptido cíclico; Q se selecciona independientemente entre 0, S y NH; R11 es H, o R o, cuando Q es 0, R11 es S03M, en el que M es un catión metálico; cada uno de R y R' se selecciona independientemente entre alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, heterociclilo C3-20 y arilo C5-20, y opcionalmente en relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido de 4, 5, 6 o 7 miembros; R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos , por ejemplo 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, estando dichos anillos opcionalmente sustituidos con NH2; cada X es 0, S o N (H) ; y en el que R2", R6", R7", R9", Rn", Q" y X" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, R11, Q y X respectivamente, y R° es un grupo de terminación. 62. El compuesto de la reivindicación 61 que tiene la estructura : en la que n es un número entero de 1 a 24. 63. El compuesto de la reivindicación 62, en el que n es un número entero de 1 a 12. 64. El compuesto de la reivindicación 63, en el que n es 4 u 8. 65. El compuesto de la reivindicación 61 que tiene la estructura : en la que n es un número entero de 1 a 24. 66. El compuesto de la reivindicación 65, en el que n es un número entero de 1 a 12. 67. El compuesto de la reivindicación 66, en el que n es 4 u 8. 68. El compuesto de la reivindicación 61 que tiene la estructura : en la que n es un número entero de 1 a 24. 69. El compuesto de la reivindicación 68, en el que n es un número entero de 1 a 12. 70. El compuesto de la reivindicación 69, en el que n es 4 u 8. 72. Un procedimiento de preparación de un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52, comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un agente de unión a célula con el compuesto (EB) o (EC) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 61 a 71. 73. Un artículo de fabricación que comprende una composición farmacéutica de la reivindicación 53; un contenedor; y unas instrucciones de empleo o etiqueta que indican que la composición farmacéutica puede usarse para tratar el cáncer.
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