TWI540136B - 吡咯并苯并二氮呯及其共軛物 - Google Patents

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Description

吡咯并苯并二氮呯及其共軛物
本發明係關於吡咯并苯并二氮呯(PBD)，特定言之，具有呈連至細胞結合劑之連接子形式之不穩定N10保護基的吡咯并苯并二氮呯。
 吡咯并苯并二氮呯
一些吡咯并苯并二氮呯(PBD)能夠識別且鍵結至特定DNA序列；較佳序列為PuGPu。第一種PBD抗腫瘤抗生素胺茴黴素(anthramycin)發現於1965年(Leimgruber等人，J. Am. Chem. Soc.，87，5793-5795(1965)；Leimgruber等人，J. Am. Chem. Soc.，87，5791-5793(1965))。自彼時起，已報導許多天然存在之PBD，且已開發超過10種合成多種類似物之途徑(Thurston等人，Chem. Rev. 1994，433-465(1994))。家族成員包括赤黴素(abbeymycin)(Hochlowski等人，J. Antibiotics，40，145-148(1987))、芝加黴素(chicamycin)(Konishi等人，J. Antibiotics， 37，200-206(1984))、DC-81(日本專利58-180487；Thurston等人，Chem. Brit.，26，767-772(1990)；Bose等人，Tetrahedron，48，751-758(1992))、混胺茴黴素(mazethramycin)(Kuminoto等人，J. Antibiotics，33，665-667(1980))、新茴黴素A(neothramycin A)及新茴黴素B(Takeuchi等人，J. Antibiotics，29，93-96(1976))、坡咯黴素(porothramycin)(Tsunakawa等人，J. Antibiotics，41，1366-1373(1988))、普咯黴素(prothracarcin)(Shimizu等人，J. Antibiotics，29，2492-2503(1982)；Langley及Thurston，J. Org. Chem.，52，91-97(1987))、西巴黴素(sibanomicin)(DC-102)(Hara等人，J. Antibiotics，41，702-704(1988)；Itoh等人，J. Antibiotics，41，1281-1284(1988))、西伯利亞黴素(sibiromycin)(Leber等人，J. Am. Chem. Soc.，110，2992-2993(1988))及托馬黴素(tomamycin)(Arima等人，J. Antibiotics，25，437-444(1972))。PBD具有以下通用結構：
其在其芳族A環與吡咯C環中之取代基數目、類型及位置方面以及在C環之飽和度方面不同。在B環中，在作為負責使DNA烷基化之親電子中心之N10-C11位置處存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))。所有已知天然產物在對掌性C11a位置處皆具有(S)構型，從而在自C環向A環觀察時使該等產物具備右旋扭曲(right-handed twist)。此賦予該等產物具有B型DNA之小溝之適當等螺旋性三維形狀，從而在結合位點處產生適貼配合(snug fit)(Kohn，Antibiotics III. Springer-Verlag，New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter，Acc. Chem. Res.，19，230-237(1986))。其在小溝中形成加合物之能力使其能夠干擾DNA加工，因此其用作抗腫瘤劑。
本發明人先前已在WO 2005/085251中揭示具有C2芳基取代基之二聚PBD化合物，諸如：
已顯示此等化合物為高度適用之細胞毒性劑。
一種尤其有利之吡咯并苯并二氮呯化合物由Gregson等人(Chem. Commun. 1999，797-798)描述為化合物1，且由Gregson等人(J. Med. Chem. 2001，44，1161-1174)描述為化合物4a。亦稱為SJG-136之此化合物展示如下：
本發明人先前已揭示PBD化合物可藉由在N10位置處用可活體內移除之氮保護基對其加以保護而用作前藥(WO 00/12507)。許多此等保護基為胺基甲酸酯且具有例如以下結構：
其中星號(*)指示連至PBD之N10原子之連接點。
本發明人亦已描述在N10位置處具有氮胺基甲酸酯保護基之PBD化合物之製備(WO 2005/023814)。保護基可自PBD部分之N10位置移除而得到N10-C11亞胺鍵。已描述各種保護基，包括可藉由酶之作用分解之基團。
WO 2007/085930描述具有用於連接細胞結合劑(諸如抗體)之連接基團之二聚體PBD化合物的製備。連接子存在於連接二聚體之單體PBD單元之橋中。
抗體-藥物共軛物
已建立抗體療法用於靶向治療患有癌症、免疫及血管生成病症之患者(Carter，P.(2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357)。在癌症治療中為局部傳遞細胞毒性劑或細胞生長抑制劑(亦即藥物)以殺傷或抑制腫瘤細胞而使用抗體-藥物共軛物(ADC)(亦即免疫共軛物)可使藥物部分靶向傳遞至腫瘤且使其在細胞內積累，而全身性投與此等非共軛藥劑可能導致對正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞的毒性程度不可接受(Xie等人，(2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291；Kovtun等人，(2006) Cancer Res. 66(6): 3214-3121；Law等人，(2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337；Wu等人，(2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145；Lambert J.(2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549；Hamann P.(2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103；Payne，G.(2003) Cancer Cell 3:207-212；Trail等人，(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Syrigos及Epenetos(1999) Anticancer Research 19:605-614)。
因此尋求功效最大且毒性最小。設計及改進ADC之努力已集中在單株抗體(mAb)之選擇性以及藥物作用機制、藥物連接、藥物/抗體比率(裝載量)及藥物釋放性質方面(Junutula等人，2008b Nature Biotech.，26(8):925-932；Dornan等人，(2009) Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO 2009/052249；McDonagh(2006) Protein Eng. Design ＆ Sel. 19(7)：299-307；Doronina等人，(2006) Bioconj. Chem. 17:114-124；Erickson等人，(2006) Cancer Res. 66(8):1-8；Sanderson等人，(2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852；Jeffrey等人，(2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358；Hamblett等人，(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070)。藥物部分可藉由包括微管蛋白(tubulin)結合、DNA結合或拓撲異構酶(topoisomerase)抑制之機制賦予其細胞毒性及細胞生長抑制效應。一些細胞毒性藥物在與大抗體或蛋白質受體配位體共軛時易呈非活性或較小活性。
本發明人已開發一種與細胞結合劑形成PBD共軛物，且特定言之PBD抗體共軛物之新穎方法。
在一般性態樣中，本發明提供包含PBD化合物經由連接子經由N10位置與細胞結合劑連接之共軛物。連接子為不穩定連接子，且可為酶不穩定連接子。細胞結合劑較佳為抗體。
在一實施例中，共軛物包含細胞結合劑連至間隔子、該間隔子連至觸發物、該觸發物連至自我分解型連接子及該自我分解型連接子連至PBD化合物之N10位置。
在第一態樣中，本發明提供式(A)之新穎共軛化合物：
及其鹽及溶劑合物，其中：
點線指示視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；
R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況另外選自鹵基或二鹵基；
其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；
R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R10為與細胞結合劑連接之連接子；
Q獨立地選自O、S及NH；
R11為H或R，或在Q為O的情況下為SO3M，其中M為金屬陽離子；
R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且就基團NRR'而言，R及R'視情況連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2，
或化合物為二聚體，其中各單體皆具有式(A)，或其中1個單體具有式(A)且另一單體具有式(B)：
其中R2、R6、R9、R7及R8係根據式(A)化合物所定義，且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代；
且各X為O、S或N(H)；
或其中化合物為各單體皆具有式(A)之二聚體，該等單體之一中之基團R10為封端基團RC或為與細胞結合劑連接之連接子。為避免引起懷疑，細胞結合劑為基團R10之一部分。
本發明亦關於使用共軛物在目標位置處提供式(C)化合物：
及其鹽及溶劑合物，其中：
點線指示視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；
R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況另外選自鹵基或二鹵基；
其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；
R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R及R'獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且就基團NRR'而言，R及R'視情況連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2；
或化合物為各單體皆具有式(C)之二聚體，且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代；
且各X為O、S或N(H)。
本發明亦關於使用共軛物在目標位置處提供式(D)化合物：
及其鹽及溶劑合物，其中：
點線指示視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；
R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況另外選自鹵基或二鹵基；
其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；
R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
Q獨立地選自O、S及NH；
R11為H或R，或在Q為O的情況下為SO3M，其中M為金屬陽離子；
R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且就基團NRR'而言，R及R'視情況連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2；
或化合物為二聚體，其中各單體皆具有式(D)，或其中1個單體具有式(D)且另一單體具有式(C)；
且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代；
且各X為O、S或N(H)；
其中式(C)之單體單元係如上所定義。
本發明亦提供用於製備本發明共軛化合物之式(E)化合物：
及其鹽及溶劑合物，其中：
點線指示視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；
R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況另外選自鹵基或二鹵基；
其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；
R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
RL為用於連接細胞結合劑之連接子；
Q獨立地選自O、S及NH；
R11為H或R，或在Q為O的情況下，R11為SO3M，其中M為金屬陽離子；
R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且就基團NRR'而言，R及R'視情況連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2；
或化合物為二聚體，其中各單體皆具有式(E)，或其中1個單體具有式(E)且另一單體具有式(B)：
其中R2、R6、R9、R7及R8係根據式(A)化合物所定義，且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代；
且各X為O、S或N(H)；
且其中化合物為各單體皆具有式(E)之二聚體，該等單體之一中之基團RL為封端基團RC且為用於連接細胞結合劑之連接子。
或者，在一實施例中，R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代。
或者，新穎共軛化合物可選自如上所述之式(A)化合物以及式(A-I)化合物，
其中(A-I)係選自(A-A)及(A-B)：
及其鹽及溶劑合物，其中：
R6、R9、R10、Q、R11、R及R'係根據式(A)化合物所定義；
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2，
R2與R1或R3之任一者連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環；
V及W各自選自(CH2)n、O、S、NR、CHR及CRR'，其中n為1、2或3，例外為當R1與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，V為C，且當R3與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，W為C；
T係選自CH2、NR、CO、BH、SO及SO2；
U係選自CH2、NR、O及S；
Y為(CH2)n，其中n為1、2、3或4；
例外為T、U及Y不皆為CH2；
或化合物為二聚體，其中各單體皆具有式(A)、各單體皆具有式(A-I)，其中1個單體具有式(A)且另一單體具有如上所述之式(B)或式(B-I)，或其中1個單體具有式(A-I)且另一單體具有式(B)或式(B-I)，
且(B-I)係選自(B-A)及(B-B)：
其中R1、R2、R3、R6、R9、R7及R8係根據式(A-I)化合物所定義，且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代；
且各X為O、S或N(H)；
且其中化合物為各單體皆具有式(A-I)及/或式(A)之二聚體，該等單體之一中之基團R10為封端基團RC或為與細胞結合劑連接之連接子。
為方便起見，所有提及A之處皆可應用於A-I(及A-A及A-B)，且所有提及B之處皆可應用於B-I(及B-A及B-B)。適當時，類似提及C、D及E亦與(C-I)、(D-I)及(E-I)相關。
或者，共軛物可用於在目標位置處提供某一化合物，其中該化合物為如上所述之式(C)化合物或式(C-I)化合物，
其中(C-I)係選自(C-A)及(C-B)：
及其鹽及溶劑合物，其中：
R6、R9、R及R'係根據式(C)化合物所定義；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2，
R2與R1或R3之任一者連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環；
V及W各自選自(CH2)n、O、S、NR、CHR及CRR'，其中n為1、2或3，例外為當R1與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，V為C，且當R3與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，W為C；
T係選自CH2、NR、CO、BH、SO及SO2；
U係選自CH2、NR、O及S；
Y為(CH2)n，其中n為1、2、3或4；
例外為T、U及Y不皆為CH2；
或化合物為二聚體，其中各單體皆具有式(C)、各單體皆具有式(C-I)，或其中1個單體具有式(C)且另一單體具有式(C-I)，且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代；
且各X為O、S或N(H)。
本發明亦關於使用共軛物在目標位置處提供某一化合物，其中該化合物為如上所述之式(D)化合物或式(D-I)化合物；
其中(D-I)係選自(D-A)及(D-B)：
及其鹽及溶劑合物，其中：
R6、R9、R及R'係根據式(D)化合物所定義；
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2，
Q獨立地選自O、S及NH；
R11為H或R，或在Q為O的情況下為SO3M，其中M為金屬陽離子；
R2與R1或R3之任一者連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環；
V及W各自選自(CH2)n、O、S、NR、CHR及CRR'，其中n為1、2或3，例外為當R1與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，V為C，且當R3與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，W為C；
T係選自CH2、NR、CO、BH、SO及SO2；
U係選自CH2、NR、O及S；
Y為(CH2)n，其中n為1、2、3或4；
例外為T、U及Y不皆為CH2；
或化合物為二聚體，其中各單體皆具有式(D)、各單體皆具有式(D-I)，或其中1個單體具有式(D)且另一單體具有式(D-I)，且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代；
且各X為O、S或N(H)。
或者，本發明亦提供用於製備本發明共軛化合物之如上所述之式(E)化合物以及式(E-I)化合物；
其中(E-I)係選自(E-A)及(E-B)：
及其鹽及溶劑合物，其中：
R6、R9、R及R'係根據式(D)化合物所定義；
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
R8獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；
或任一對來自R6至R9之鄰近基團一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2，
RL為用於連接細胞結合劑之連接子；
Q獨立地選自O、S及NH；
R11為H或R，或在Q為O的情況下為SO3M，其中M為金屬陽離子；
R2與R1或R3之任一者連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環；
V及W各自選自(CH2)n、O、S、NR、CHR及CRR'，其中n為1、2或3，例外為當R1與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，V為C，且當R3與R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，W為C；
T係選自CH2、NR、CO、BH、SO及SO2；
U係選自CH2、NR、O及S；
Y為(CH2)n，其中n為1、2、3或4；
例外為T、U及Y不皆為CH2；
或化合物為二聚體，其中各單體皆具有式(E)、各單體皆具有式(E-I)，或其中1個單體具有式(E)或(E-1)且另一單體具有式(E)、(E-I)、(B)或(B-1)；
且各單體之R7基團或R8基團一起形成連接該等單體之具有式-X-R"-X-之二聚體橋；
其中R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代；
且各X為O、S或N(H)。
本發明提供包含PBD化合物經由連接子經由N10位置與細胞結合劑連接之共軛物。在一實施例中，共軛物包含細胞結合劑連至間隔子連接基團、該間隔子連至觸發物、該觸發物連至自我分解型連接子及該自我分解型連接子連至PBD化合物之N10位置。以下說明該種共軛物：
其中CBA為細胞結合劑且PBD為如本文所述之吡咯并苯并二氮呯化合物。該圖展示本發明之某些實施例中對應於R10、A、L1及L2之部分。
本發明適用於向個體中之較佳部位提供PBD化合物。在較佳實施例中，共軛物允許釋放不保留連接子之任何部分之活性PBD化合物。不存在可影響PBD化合物之反應性之殘餘部分(stub)。
在某些實施例中，本發明提供包含連接子與細胞結合劑連接之PBD二聚體基團的共軛物。本發明人在本文中描述能夠藉由使用新穎PBD去對稱化(desymmetrisation)技術製備此等二聚體共軛物之合成方法。
較佳選項
以下較佳選項可適用於如上所述之本發明的所有態樣，或可與單一態樣相關。較佳選項可以任何組合組合在一起。
雙鍵
在一實施例中，在C1與C2、及C2與C3之間不存在雙鍵。
在一實施例中，點線指示視情況在C2與C3之間存在雙鍵，如下所示：
在一實施例中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，在C2與C3之間存在雙鍵。
在一實施例中，點線指示視情況在C1與C2之間存在雙鍵，如下所示：
在一實施例中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，在C1與C2之間存在雙鍵。
R 2
在一實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況另外選自鹵基或二鹵基。
在一實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR。
在一實施例中，R2獨立地選自H、=O、=CH2、R、=CH-RD及=C(RD)2。
在一實施例中，R2獨立地為H。
在一實施例中，R2獨立地為=O。
在一實施例中，R2獨立地為=CH2。
在一實施例中，R2獨立地為=CH-RD。在PBD化合物內，基團=CH-RD可具有以下所示之任一構型：
在一實施例中，構型為構型(I)。
在一實施例中，R2獨立地為=C(RD)2。
在一實施例中，R2獨立地為=CF2。
在一實施例中，R2獨立地為R。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-7芳基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C8-10芳基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之苯基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之萘基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之吡啶基。
在一實施例中，R2獨立地為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。
在一實施例中，R2具有1至3個取代基，其中1及2個取代基更佳，且經單取代之基團最佳。取代基可在任何位置。
當R2為C5-7芳基時，單一取代基較佳位於與化合物其餘部分之鍵不相鄰的環原子上，亦即其較佳位於與化合物其餘部分之鍵的β或γ位。因此，當C5-7芳基為苯基時，取代基較佳處於間位或對位，且更佳處於對位。
在一實施例中，R2係選自：
其中星號指示連接點。
當R2為C8-10芳基，例如喹啉基或異喹啉基時，其可在喹啉或異喹啉環之任何位置處具有任何數目之取代基。在一些實施例中，其具有1、2或3個取代基，且此等取代基可位於近端及遠端環或兩者(若取代基超過1個)上。
在R2視情況經取代之一實施例中，取代基係選自下文取代基章節中指定之彼等取代基。
當R視情況經取代時，取代基較佳選自：
鹵基、羥基、醚、甲醯基、醯基、羧基、酯、醯氧基、胺基、醯胺基、醯基醯胺基、胺基羰氧基、脲基、硝基、氰基及硫醚。
在R或R2視情況經取代之一實施例中，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR'、NO2、鹵基、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR'。
當R2為C1-12烷基時，視情況選用之取代基可另外包括C3-20雜環基及C5-20芳基。
當R2為C3-20雜環基時，視情況選用之取代基可另外包括C1-12烷基及C5-20芳基。
當R2為C5-20芳基時，視情況選用之取代基可另外包括C3-20雜環基及C1-12烷基。
應瞭解術語「烷基」涵蓋子類烯基及炔基以及環烷基。因此，當R2為視情況經取代之C1-12烷基時，應瞭解烷基視情況含有可形成共軛系統之一部分的一或多個碳碳雙鍵或參鍵。在一實施例中，視情況經取代之C1-12烷基含有至少1個碳碳雙鍵或參鍵，且此鍵與存在於C1與C2、或C2與C3之間的雙鍵共軛。在一實施例中，C1-12烷基為選自飽和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基及C3-12環烷基之基團。
若R2上之取代基為鹵基，則其較佳為F或Cl、更佳為Cl。
若R2上之取代基為醚，則在一些實施例中，其可為烷氧基，例如C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)或在一些實施例中，其可為C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。
若R2上之取代基為C1-7烷基，則其較佳可為C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
若R2上之取代基為C3-7雜環基，則在一些實施例中，其可為C6含氮雜環基，例如N-嗎啉基、硫代(N-嗎啉基)、哌啶基、哌嗪基。此等基團可經由氮原子與PBD部分之其餘部分結合。此等基團可進一步經取代，例如經C1-4烷基取代。
若R2上之取代基為雙-氧基-C1-3伸烷基，則此較佳為雙-氧基-亞甲基或雙-氧基-伸乙基。
R2之尤其較佳取代基包括甲氧基、乙氧基、氟基、氯基、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、N-嗎啉基及甲基-噻吩基。
尤其較佳之經取代R2基團包括(但不限於)4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。
在一實施例中，R2為鹵基或二鹵基。在一實施例中，R2為-F或-F2，該等取代基分別以(III)及(IV)說明如下：
R D
在一實施例中，RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基。
在一實施例中，RD獨立地為R。
在一實施例中，RD獨立地為鹵基。
R 6
在一實施例中，R6獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一實施例中，R6獨立地選自H、OH、OR、SH、NH2、NO2及鹵基。
在一實施例中，R6獨立地選自H及鹵基。
在一實施例中，R6獨立地為H。
在一實施例中，R6與R7一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2。
R7
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基。
在一實施例中，R7獨立地為OR。
在一實施例中，R7獨立地為OR7A，其中R7A獨立地為視情況經取代之C1-6烷基。
在一實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之飽和C1-6烷基。
在一實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之C2-4烯基。
在一實施例中，R7A獨立地為Me。
在一實施例中，R7A獨立地為CH2Ph。
在一實施例中，R7A獨立地為烯丙基。
在一實施例中，化合物為二聚體，其中各單體之R7基團一起形成連接該等單體之具有式X-R"-X的二聚體橋。
R 8
在一實施例中，化合物為二聚體，其中各單體之R8基團一起形成連接該等單體之具有式X-R"-X的二聚體橋。
在一實施例中，R8獨立地為OR8A，其中R8A獨立地為視情況經取代之C1-4烷基。
在一實施例中，R8A獨立地為視情況經取代之飽和C1-6烷基或視情況經取代之C2-4烯基。
在一實施例中，R8A獨立地為Me。
在一實施例中，R8A獨立地為CH2Ph。
在一實施例中，R8A獨立地為烯丙基。
在一實施例中，R8與R7一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2。
在一實施例中，R8與R9一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2。
R 9
在一實施例中，R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一實施例中，R9獨立地為H。
在一實施例中，R9獨立地為R或OR。
R 10
為了避免引起懷疑，當R10為與細胞結合劑連接之連接子時，該細胞結合劑為基團R10之一部分。
在共軛物為包含兩個單體A之二聚體之本發明的某些實施例中，1個單體具有作為與細胞結合劑連接之連接子的基團R10，且另一單體具有作為與細胞結合劑連接之連接子或封端基團RC的基團R10。較佳地，另一單體具有作為封端基團RC之基團R10。因此，在此較佳實施例中，與細胞結合劑僅有單一鍵聯。
在一實施例中，基團R10可自PBD部分之N10位置移除而得到N10-C11亞胺鍵、甲醇胺、經取代甲醇胺、其中QR11為OSO3M、亞硫酸氫鹽加合物、硫代甲醇胺、經取代硫代甲醇胺或經取代甲醛胺，如下所說明：
其中R及M係如本發明共軛物所定義。
在一實施例中，基團R10可自PBD部分之N10位置移除而得到N10-C11亞胺鍵。
在一些實施例中，本發明共軛物為包含式(A)單體及式(B)單體之二聚體化合物。在此實施例中，基團R10可無需自N10位置移除，因為單體(B)在N10及C11位置處具有適合達成生物活性之官能基。
然而，較佳地，基團R10可移除，藉此提供在兩個單體單元中之N10及C11位置處具有適合官能基之二聚體。認為此官能基為允許PBD二聚體之交聯活性所必需。
本申請案尤其涉及具有胺基甲酸酯鍵聯至N10位置的彼等R10基團。
連接子使例如抗體之細胞結合劑(CBA)經由共價鍵與PBD藥物部分D連接。連接子為可用於連接一或多個藥物部分(D)與抗體單元(Ab)以形成抗體-藥物共軛物(ADC)之雙官能或多官能部分。連接子(L)在細胞外部(亦即細胞外)可為穩定的，或其可藉由酶促活性、水解或其他代謝條件而分解。抗體-藥物共軛物(ADC)宜使用具有與藥物部分及抗體結合之反應性官能基的連接子製備。抗體(Ab)之半胱胺酸硫醇或胺(例如N端或胺基酸側鏈，諸如離胺酸)可與連接或間隔試劑、PBD藥物部分(D)或藥物-連接試劑(D-L)之官能基形成鍵。
與PBD部分之N10位置連接之連接子上的許多官能基可適用於與細胞結合劑反應。舉例而言，酯、硫酯、醯胺、硫醯胺、胺基甲酸酯、硫代胺基甲酸酯、脲、硫脲、醚、硫醚或二硫鍵可由連接子-PBD藥物中間物與細胞結合劑之反應形成。
ADC之連接子較佳防止ADC分子凝集且保持ADC在水性介質中易溶且呈單體狀態。
ADC之連接子較佳在細胞外具穩定性。在轉運或傳遞入細胞中之前，抗體-藥物共軛物(ADC)較佳具穩定性且保持完整，亦即抗體保持與藥物部分連接。連接子在目標細胞外部為穩定的且在細胞內部可以某一有效速率分解。有效連接子將：(i)維持抗體之特異性結合性質；(ii)允許細胞內傳遞共軛物或藥物部分；(iii)保持穩定及完整，亦即不分解，直至共軛物已傳遞或轉運至其靶點；及(iv)維持PBD藥物部分之細胞毒性、細胞殺傷效應或細胞生長抑制效應。ADC之穩定性可藉由標準分析技術(諸如質譜、HPLC及分離/分析技術LC/MS)量測。
抗體與藥物部分之共價連接要求連接子具有2個反應性官能基，亦即在反應性意義上為二價。已知適用於連接兩個或兩個以上功能或生物活性部分(諸如肽、核酸、藥物、毒素、抗體、半抗原及報導基團)之二價連接試劑，且已描述獲得其共軛物的方法(Hermanson,G.T.(1996)Bioconjugate Techniques;Academic Press: New York，第234-242頁)。
在另一實施例中，連接子可經調節凝集、溶解性或反應性之基團取代。舉例而言，磺酸酯取代基可增加試劑之水溶性且促進連接試劑與抗體或藥物部分之偶合反應，或促進Ab-L與D、或D-L與Ab之偶合反應，視用於製備ADC之合成途徑而定。
在一實施例中，R10為以下基團：
其中星號指示連至N10位置之連接點，CBA為細胞結合劑，L1為連接子，A為連接L1與細胞結合劑之連接基團，L2為共價鍵或連同-OC(=O)-一起形成自我分解型連接子，且L1或L2為可分解之連接子。
L1較佳為可分解之連接子，且可稱為用於活化連接子以達成分解之觸發物。
當存在時，L1及L2之性質可廣泛變化。此等基團係基於其可由共軛物所傳遞至之部位處之條件決定的分解特徵加以選擇。藉由酶之作用分解之彼等連接子較佳，但亦可使用可因pH值(例如酸或鹼不穩定)、溫度之變化或在照射(例如光不穩)時而分解之連接子。可在還原或氧化條件下分解之連接子亦可用於本發明中。
L1可包含鄰接胺基酸序列。該胺基酸序列可為酶促分解之目標受質，藉此允許R10自N10位置釋放。
在一實施例中，L1可藉由酶之作用分解。在一實施例中，酶為酯酶或肽酶。
在一實施例中，存在L2且其連同-C(=O)O-一起形成自我分解型連接子。在一實施例中，L2為酶促活性之受質，藉此允許R10自N10位置釋放。
在L1可藉由酶之作用分解且存在L2之一實施例中，酶使L1與L2之間的鍵分解。
當存在時，L1與L2可藉由選自以下之鍵連接：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，及
-NHC(=O)NH-。
與L2連接之L1的胺基可為胺基酸之N端或可源於胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。
與L2連接之L1的羧基可為胺基酸之C端或可源於胺基酸側鏈(例如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。
與L2連接之L1的羥基可源於胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。
術語「胺基酸側鏈」包括可見於以下中之彼等基團：(i)天然存在之胺基酸，諸如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、***酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii)次要胺基酸(minor amino acid)，諸如鳥胺酸及瓜胺酸；(iii)非天然胺基酸、β-胺基酸、天然存在之胺基酸之合成類似物及衍生物；及(iv)其所有對映異構體、非對映異構體、異構性增濃形式、經同位素標記(例如2H、3H、14C、15N)形式、經保護形式及外消旋混合物。
在一實施例中，-C(=O)O-及L2一起形成以下基團：
其中星號指示連至N10位置之連接點，波形線指示連至連接子L1之連接點，Y為-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，且n為0至3。伸苯基環視情況經1、2或3個如本文所述之取代基取代。在一實施例中，伸苯基視情況經鹵基、NO2、R或OR取代。
在一實施例中，Y為NH。
在一實施例中，n為0或1。較佳地，n為0。
當Y為NH且n為0時，自我分解型連接子可稱為對胺基苯甲基羰基連接子(PABC)。
當遠端位點沿如下所示之線路(針對n=0)進行活化時，自我分解型連接子將允許釋放經保護之化合物：
其中L*為連接子之其餘部分之活化形式。此等基團具有使活化位點自所保護之化合物分離的優點。如上所述，伸苯基可視情況經取代。
在本文所述之一實施例中，基團L*為如本文所述之可包括二肽基團之連接子L1。
在另一實施例中，-C(=O)O-及L2一起形成選自以下之基團：
其中星號、波形線、Y及n係如上所定義。各伸苯基環視情況經1、2或3個如本文所述之取代基取代。在一實施例中，具有Y取代基之伸苯基環視情況經取代且不具有Y取代基之伸苯基環未經取代。在一實施例中，具有Y取代基之伸苯基環視情況經取代且不具有Y取代基之伸苯基環視情況經取代。
在另一實施例中，-C(=O)O-及L2一起形成選自以下之基團：
其中星號、波形線、Y及n係如上所定義，E為O、S或NR，D為N、CH或CR，且F為N、CH或CR。
在一實施例中，D為N。
在一實施例中，D為CH。
在一實施例中，E為O或S。
在一實施例中，F為CH。
在一較佳實施例中，連接子為組織蛋白酶(cathepsin)不穩定連接子。
在一實施例中，L1包含二肽。二肽可表示為-NH-X1-X2-CO-，其中-NH-及-CO-分別表示胺基酸基團X1及X2之N端及C端。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸之任何組合。當連接子為組織蛋白酶不穩定連接子時，二肽可為組織蛋白酶介導之分解的作用位點。
另外，對於具有羧基或胺基側鏈官能基之彼等胺基酸基團(例如分別為Glu及Lys)，CO及NH可表示彼側鏈官能基。
在一實施例中，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-係選自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，
-Trp-Cit-
其中Cit為瓜胺酸。
較佳地，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-係選自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-。
最佳地，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-為-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
可使用其他二肽組合，包括Dubowchik等人，Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869所述之彼等二肽組合，該文獻以引用的方式併入本文中。
在一實施例中，胺基酸側鏈在適當時經衍生化。舉例而言，胺基酸側鏈之胺基或羧基可經衍生化。
在一實施例中，諸如離胺酸之側鏈胺基酸之胺基NH2為選自由NHR及NRR'組成之群之衍生化形式。
在一實施例中，諸如天冬胺酸之側鏈胺基酸之羧基COOH為選自由COOR、CONH2、CONHR及CONRR'組成之群之衍生化形式。
在一實施例中，胺基酸側鏈在適當時經化學保護。側鏈保護基可為如下文就基團RL所論述之基團。本發明人已證實經保護之胺基酸序列可由酶分解。舉例而言，已證實包含側鏈經Boc保護之Lys殘基的二肽序列可由組織蛋白酶分解。
胺基酸側鏈之保護基在此項技術中為熟知的且描述於Novabiochem Catalog中。其他保護基策略闡述於Protective Groups in Organic Synthesis,Greene及Wuts中。
如下所示具有反應性側鏈官能基之彼等胺基酸之可能的側鏈保護基：
Arg：Z、Mtr、Tos；
Asn：Trt、Xan；
Asp：Bzl、t-Bu；
Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；
Glu：Bzl、t-Bu；
Gln：Trt、Xan；
His：Boc、Dnp、Tos、Trt；
Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc；
Ser：Bz1、TBDMS、TBDPS；
Thr：Bz；
Trp：Boc；
Tyr：Bz1、Z、Z-Br。
在一實施例中，選擇在以封端基團(當存在時)或其一部分形式提供之基團的鄰位進行側鏈保護。因此，移除側鏈保護基並不移除封端基團或作為封端基團之一部分之任何保護基官能基。
在本發明之其他實施例中，所選胺基酸為無反應性側鏈官能基之胺基酸。舉例而言，胺基酸可選自：A1a、G1y、I1e、Leu、Met、Phe、Pro 及 Va1。
在一實施例中，二肽與自我分解型連接子組合使用。自我分解型連接子可與-X2-連接。
當存在自我分解型連接子時，-X2-直接與自我分解型連接子連接。較佳地，基團-X2-CO-與Y連接，其中Y為NH，藉此形成基團-X2-CO-NH-。
-NH-X1-直接與A連接。A可包含官能基-CO-，藉此與-X1-形成醯胺鍵。
在一實施例中，L1及L2連同-OC(=O)-一起構成基團NH-X1-X2-CO-PABC-。PABC基團直接與N10位置連接。較佳地，自我分解型連接子及二肽一起形成基團-NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-，其說明如下：
其中星號指示連至N10位置之連接點，且波形線指示連至連接子L1之其餘部分之連接點或連至A之連接點。較佳地，波形線指示連至A之連接點。如上所述，Lys胺基酸之側鏈可經例如Boc、Fmoc或Alloc保護。
或者，自我分解型連接子及二肽一起形成基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其說明如下：
其中星號及波形線係如上所定義。
或者，自我分解型連接子及二肽一起形成基團-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-，其說明如下：
其中星號及波形線係如上所定義。
在本發明之一些實施例中，可為較佳的是，若PBD/藥物部分含有未經保護之亞胺鍵，例如若存在部分B，則連接子不含有游離胺基(H2N-)。因此，若連接子具有結構-A-L1-L2-，則其較佳不含有游離胺基。當連接子含有例如呈L1形式之二肽時，此方案尤其較佳；在此實施例中，較佳的是兩個胺基酸之一不選自離胺酸。
在不欲受理論束縛之情況下，本發明人已發現藥物部分中之未經保護之亞胺鍵與連接子中之游離胺基的組合可導致藥物-連接子部分二聚，其可干擾該種藥物-連接子部分與抗體之共軛。在游離胺基以銨離子(H3N+-)形式存在之情況下，諸如當已使用強酸(例如TFA)脫除游離胺基之保護基時，此等基團之交叉反應可加速。在一實施例中，A為共價鍵。因此，L1與細胞結合劑直接連接。舉例而言，當L1包含鄰接胺基酸序列時，該序列之N端可直接與細胞結合劑連接。
因此，當A為共價鍵時，細胞結合劑與L1之間的連接可選自：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH-，
-C(=O)NHC(=O)-，
-S-，
-S-S-，
-CH2C(=O)-，及
=N-NH-。
與細胞結合劑連接之L1的胺基可為胺基酸之N端或可源於胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。
與細胞結合劑連接之L1的羧基可為胺基酸之C端或可源於胺基酸側鏈(例如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。與細胞結合劑連接之L1的羥基可源於胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。與細胞結合劑連接之L1的硫醇基可源於胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之硫醇基。以上關於L1之胺基、羧基、羥基及硫醇基之評述亦適用於細胞結合劑。
在一實施例中，L2連同-OC(=O)-一起表示：
其中星號指示連至N10位置之連接點，波形線指示連至L1之連接點，n為0至3，Y為共價鍵或官能基，且E為可藉由例如酶促作用或光活化、藉此產生自我分解型單元之基團。伸苯基環視情況進一步經1、2或3個如本文所述之取代基取代。在一實施例中，伸苯基視情況進一步經鹵基、NO2、R或OR取代。較佳地，n為0或1，最佳為0。
E經選擇以使基團易受例如光或酶之作用進行活化。E可為-NO2或葡糖醛酸。前者可易受硝基還原酶(nitroreductase)之作用，後者可易受β-葡糖醛酸酶(β-glucoronidase)之作用。
在此實施例中，當E沿如下所示之線路(針對n=0)進行活化時，自我分解型連接子將允許釋放經保護之化合物：
其中星號指示連至N10位置之連接點，E*為E之活化形式，且Y係如上所述。此等基團具有使活化位點自所保護之化合物分離的優點。如上所述，伸苯基可視情況進一步經取代。
基團Y可為連至L1之共價鍵。
基團Y可為選自以下之官能基：
-C(=O)-
-NH-
-O-
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH，
-C(=O)NHC(=O)-，及
-S-。
當L1為二肽時，較佳地，Y為-NH-或-C(=O)-，藉此在L1與Y之間形成醯胺鍵。在此實施例中，二肽序列無需為酶促活性之受質。
在另一實施例中，A為間隔基團。因此，L1與細胞結合劑間接連接。
L1與A可藉由選自以下之鍵連接：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，及
-NHC(=O)NH-。
較佳地，連接子含有親電子官能基以便與細胞結合劑上之親核官能基反應。抗體上之親核基團包括(但不限於)：
(i)N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺、硫醇及羥基具有親核性且能夠反應以與連接部分及連接試劑上之親電子基團形成共價鍵：該等親電子基團包括：(i)順丁烯二醯亞胺基團；(ii)活化二硫化物；(iii)活性酯，諸如NHS(N-羥基丁二醯亞胺)酯、HOBt(N-羥基苯并***)酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(iv)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(v)醛、酮、羧基，且其中一些例示如下：
某些抗體具有可還原之鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可藉由諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑進行處理而使抗體具有與連接試劑共軛之反應性。因此，理論上每個半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷(特勞特氏試劑(Traut's reagent))之反應使胺轉化成硫醇而將其他親核基團引入抗體中。可藉由引入1、2、3、4或4個以上半胱胺酸殘基(例如製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變抗體)而將反應性硫醇基引入抗體(或其片段)中。US 7521541教示藉由引入反應性半胱胺酸胺基酸對抗體進行工程改造。
在一些實施例中，連接子具有可與存在於抗體上之親電子基團反應的反應性親核基團。抗體上之適用親電子基團包括(但不限於)醛及酮羰基。連接子之親核基團的雜原子可與抗體上之親電子基團反應且形成連至抗體單元的共價鍵。連接子上之適用親核基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、羥基、肼、硫縮胺基脲、羧酸肼及芳基醯肼。抗體上之親電子基團提供便於連至連接子之位點。
在一實施例中，基團A為：
其中星號指示連至L1之連接點，波形線指示連至細胞結合劑之連接點，且n為0至6。在一實施例中，n為5。在一實施例中，基團A為：
其中星號指示連至L1之連接點，波形線指示連至細胞結合劑之連接點，且n為0至6。在一實施例中，n為5。
在一實施例中，基團A為：
其中星號指示連至L1之連接點，波形線指示連至細胞結合劑之連接點，n為0或1，且m為0至30。在一較佳實施例中，n為1且m為0至10、1至8，較佳為4至8，且最佳為4或8。在另一實施例中，m為10至30，且較佳為20至30。或者，m為0至50。在此實施例中，m較佳為10-40且n為1。
在一實施例中，基團A為：
其中星號指示連至L1之連接點，波形線指示連至細胞結合劑之連接點，n為0或1，且m為0至30。在一較佳實施例中，n為1且m為0至10、1至8，較佳為4至8，且最佳為4或8。在另一實施例中，m為10至30，且較佳為20至30。或者，m為0至50。在此實施例中，m較佳為10-40且n為1。在一實施例中，細胞結合劑與A之間的連接係經由細胞結合劑之硫醇殘基及A之順丁烯二醯亞胺基團達成。
在一實施例中，細胞結合劑與A之間的連接為：
其中星號指示連至A之其餘部分之連接點且波形線指示連至細胞結合劑之其餘部分之連接點。在此實施例中，S原子通常來源於細胞結合劑。
在以上各實施例中，可使用替代官能基替代如下所示之順丁烯二醯亞胺衍生性基團：
其中波形線依舊指示連至細胞結合劑之連接點，且星號指示連至A基團之其餘部分之鍵。
在一實施例中，順丁烯二醯亞胺衍生性基團經以下基團置換：
其中波形線指示連至細胞結合劑之連接點，且星號指示連至A基團之其餘部分之鍵。
在一實施例中，順丁烯二醯亞胺衍生性基團視情況連同細胞結合劑一起經選自以下的基團置換：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH，
-C(=O)NHC(=O)-，
-S-，
-S-S-，
-CH2C(=O)-
-C(=O)CH2-，
=N-NH-,及
-NH-N=。
在一實施例中，順丁烯二醯亞胺衍生性基團視情況連同細胞結合劑一起經選自以下的基團置換：
其中波形線指示連至細胞結合劑之連接點或連至A基團之其餘部分之鍵，且星號指示連至細胞結合劑之另一連接點或連至A基團之其餘部分之鍵。適於連接L1與細胞結合劑之其他基團描述於WO 2005/082023中。基團R10可來源於基團RL。基團RL可藉由細胞結合劑與RL之官能基連接而轉化成基團R10。可採用其他步驟將RL轉化成R10。此等步驟可包括移除保護基(當存在時)，或安置適當官能基。
Q
在一實施例中，Q係選自O、S或N(H)。
較佳地，Q為O。
R 11
在一實施例中，R11為H或R，或在Q為O的情況下為SO3M，其中M為金屬陽離子。
在一實施例中，R11為H。在一實施例中，R11為R。在一實施例中，在Q為O的情況下，R11為SO3M，其中M為金屬陽離子。陽離子可為Na+。
R L
在一實施例中，RL為用於連接細胞結合劑之連接子。在一實施例中，連接子具有可與細胞結合劑形成連接之官能基。本申請案尤其涉及具有胺基甲酸酯鍵聯至N10位置的彼等RL基團。以上關於R10中之鍵聯基團之論述在本文中亦與其直接前驅體相關。RL不同於不適於與細胞結合劑反應之RC。然而，在一些實施例中，RC可轉化成基團RL，例如藉由適當操縱保護基及作為Rc或形成Rc之一部分的其他官能基。
在一實施例中，RL為以下基團：
其中星號指示連至N10位置之連接點，G1為可與細胞結合劑形成連接之官能基，L1為連接子，L2為共價鍵或連同-OC(=O)-一起形成自我分解型連接子，且L1或L2為可分解之連接子。
L1及L2係如上關於R10所定義。提及與A之連接在本文中可解釋為提及與G1之連接。
在L1包含胺基酸之一實施例中，彼胺基酸之側鏈可經保護。任何適合保護基皆可加以使用。在一實施例中，可用化合物中之其他保護基(當存在時)移除側鏈保護基。在其他實施例中，保護基可位於分子中之其他保護基(當存在時)的鄰位。
適用於胺基酸側鏈之保護基包括描述於Novabiochem Catalog 2006/2007中之彼等基團。用於組織蛋白酶不穩定連接子中之保護基亦論述於Dubowchik等人中。在本發明之某些實施例中，基團L1包括Lys胺基酸殘基。此胺基酸之側鏈可用經Boc或Alloc保護之基團加以保護。Boc保護基最佳。
官能基G1在與細胞結合劑反應時形成連接基團A。在一實施例中，官能基G1為或包含胺基、羧酸基團、羥基、硫醇基或順丁烯二醯亞胺基團以便與細胞結合劑上之適當基團反應。在一較佳實施例中，G1包含順丁烯二醯亞胺基團。在一實施例中，基團G1為烷基順丁烯二醯亞胺基團。此基團適於與存在於細胞結合劑中(例如存在於抗體中)之硫醇基(尤其半胱胺酸硫醇基)反應。
在一實施例中，基團G1為：
其中星號指示連至L1之連接點且n為0至6。在一實施例中，n為5。
在一實施例中，基團G1為：
其中星號指示連至L1之連接點且n為0至6。在一實施例中，n為5。
在一實施例中，基團G1為：
其中星號指示連至L1之連接點，n為0或1，且m為0至30。在一較佳實施例中，n為1且m為0至10、1至2，較佳為4至8，且最佳為4或8。或者，m為0至50。在此實施例中，m較佳為10-40且n為1。
在一實施例中，基團G1為：
其中星號指示連至L1之連接點，n為0或1，且m為0至30。在一較佳實施例中，n為1且m為0至10、1至8，較佳為4至8，且最佳為4或8。或者，m為0至50。在此實施例中，m較佳為10-40且n為1。
在以上各實施例中，可使用替代官能基替代如下所示之順丁烯二醯亞胺基團：
其中星號指示連至G基團之其餘部分之鍵。
在一實施例中，順丁烯二醯亞胺衍生性基團經以下基團置換：
其中星號指示連至G基團之其餘部分之鍵。
在一實施例中，順丁烯二醯亞胺基團經選自以下之基團置換：
-C(=O)OH，
-OH，
-NH2，
-SH，
-C(=O)CH2D，其中D為Cl、Br或I，
-CHO，
-NHNH2
-C≡CH，及
-N3(疊氮化物)。
在L1存在之一實施例中，G1為-NH2、-NHMe、-COOH、-OH或-SH。
在L1存在之一實施例中，G1為-NH2或-NHMe。任一基團皆可為L1胺基酸序列之N端。
在L1存在之一實施例中，G1為-NH2，且L1為如上關於R10所定義之胺基酸序列-X1-X2-。
在L1存在之一實施例中，G1為COOH。此基團可為L1胺基酸序列之C端。在L1存在之一實施例中，G1為OH。在L1存在之一實施例中，G1為SH。基團G1可自一種官能基轉化成另一種官能基。在L1存在之一實施例中，G1為-NH2。此基團可轉化成包含順丁烯二醯亞胺基團之另一基團G1。舉例而言，可使基團-NH2與包含以上所示順丁烯二醯亞胺之彼等G1基團之酸或經活化的酸(例如N-丁二醯亞胺形式)反應。因此，基團G1可轉化成更適於與細胞結合劑反應之官能基。在其他實施例中，RL為作為具有官能基之連接子之前驅體的基團。如上所述，在L1存在之一實施例中，G1為-NH2、-NHMe、-COOH、-OH或-SH。在另一實施例中，此等基團係以經化學保護之形式提供。因此，經化學保護之形式為具有官能基之連接子的前驅體。在一實施例中，G1為呈經化學保護之形式之-NH2。基團可用胺基甲酸酯保護基加以保護。胺基甲酸酯保護基可選自由以下組成之群：Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Cbz及PNZ。較佳地，當G1為-NH2時，其用Alloc或Fmoc基團加以保護。
在G1為-NH2之一實施例中，其用Fmoc基團加以保護。在一實施例中，保護基與封端基團之胺基甲酸酯保護基相同。在一實施例中，保護基與封端基團之胺基甲酸酯保護基不相同。在此實施例中，較佳地，保護基可在不移除封端基團之胺基甲酸酯保護基之條件下移除。化學保護基可經移除以提供與細胞結合劑形成連接之官能基。視情況，此官能基可接著轉化成如上所述之另一官能基。在一實施例中，活性基團為胺。此胺較佳為肽之N端胺，且可為本發明之較佳二肽之N端胺。活性基團可反應以產生旨在與細胞結合劑形成連接之官能基。在其他實施例中，連接子為具有活性基團之連接子之前驅體。在此實施例中，連接子包含藉由保護基保護之活性基團。保護基可移除以提供具有活性基團之連接子。當活性基團為胺時，保護基可為胺保護基，諸如Green及Wuts中描述之彼等胺保護基。保護基較佳位於基團RL中之其他保護基(當存在時)的鄰位。在一實施例中，保護基位於封端基團之鄰位。因此，可移除活性基團保護基，同時保留封端基團。在其他實施例中，保護基及封端基團可在與用於移除封端基團之條件相同的條件下移除。
在一實施例中，RL為：
其中星號指示連至N10位置之連接點，且波形線指示連至連接子L1之其餘部分之連接點或連至G1之連接點。較佳地，波形線指示連至G1之連接點。
在一實施例中，RL為：
其中星號及波形線係如上所定義。
在一實施例中，RL為：
其中星號及波形線係如上所定義。適用於形成L1與細胞結合劑之間之連接的其他官能基描述於WO 2005/082023中。
連接子可包括蛋白酶可分解之包含一或多個胺基酸單元之肽部分。肽連接試劑可藉由肽化學，包括t-BOC化學(Geiser等人，「Automation of solid-phase peptide synthesis」，Macromolecular Sequencing and Synthesis,Alan R. Liss,Inc.,1988，第199-218頁)及Fmoc/HBTU化學(Fields,G.及Noble,R.(1990)「Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids」，Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)領域中熟知之固相或液相合成方法(E. Schrder及K.Lbke,The Peptides，第1卷，第76-136頁(1965) Academic Press)在諸如Rainin Symphony肽合成器(Protein Technologies,Inc.,Tucson,AZ)或Model 433(Applied Biosystems,Foster City,CA)之自動合成器上製備。
例示性胺基酸連接子包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-***酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。包含胺基酸連接子組分之胺基酸殘基包括彼等天然存在之胺基酸以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可對胺基酸連接子組分進行設計且使其對特定酶(例如腫瘤相關之蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶蛋白酶(plasmin protease))之酶促分解之選擇性最佳。
胺基酸側鏈包括彼等天然存在之胺基酸以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸側鏈包括氫、甲基、異丙基、異丁基、第二丁基、苯甲基、對羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環己基、以及以下結構：
當胺基酸側鏈不包括氫(甘胺酸)時，胺基酸側鏈所連接之碳原子呈對掌性。胺基酸側鏈所連接之各碳原子獨立地呈(S)或(R)構型或外消旋混合物形式。因此，藥物-連接試劑可為對映異構性純、外消旋或非對映異構體試劑。
在例示性實施例中，胺基酸側鏈係選自彼等天然及非天然胺基酸，包括丙胺酸、2-胺基-2-環己基乙酸、2-胺基-2-苯基乙酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、正白胺酸、***酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、γ-胺基丁酸、α,α-二甲基γ-胺基丁酸、β,β-二甲基γ-胺基丁酸、鳥胺酸及瓜胺酸(Cit)。
適用於構築可與細胞結合劑(例如抗體)共軛之連接子-PBD藥物部分中間物之具有對胺基苯甲基胺甲醯基(PAB)自我分解型間隔子的例示性纈胺酸-瓜胺酸(val-cit或vc)二肽連接試劑具有以下結構：
其中Q為C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-NO2或-CN；且m為在0-4範圍內之整數。
具有對胺基苯甲基之例示性phe-lys(Mtr)二肽連接試劑可根據Dubowchik等人，(1997) Tetrahedron Letters,38:5257-60製備，且具有以下結構：
其中Mtr為單4-甲氧基三苯甲基，Q為C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-NO2或-CN；且m為在0-4範圍內之整數。
「自我分解型連接子」PAB(對胺基苯甲氧基羰基)使藥物部分與抗體藥物共軛物中之抗體連接(Carl等人，(1981)J. Med. Chem. 24:479-480；Chakravarty等人，(1983) J. Med. Chem. 26:638-644；US 6214345；US 20030130189；US 20030096743；US 6759509；US 20040052793；US 6218519；US 6835807；US 6268488；US 20040018194；WO 98/13059；US 20040052793；US 6677435；US 5621002；US 20040121940；WO 2004/032828)。除PAB之外之自我分解型間隔子之其他實例包括(但不限於)：(i)電子學類似於PAB基團之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人，(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)、噻唑(US 7375078)、多重伸長PAB單元(de Groot等人，(2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830)；及鄰胺基苯甲基縮醛或對胺基苯甲基縮醛；及(ii)同系化苯乙烯基PAB類似物(US 7223837)。可使用在醯胺鍵水解時經歷環化之間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人，(1995) Chemistry Biology 2:223)；經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人，(1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人，(1990) J. Org. Chem. 55:5867)。去除在甘胺酸處經取代之含胺藥物(Kingsbury等人(1984) J. Med.Chem. 27:1447)亦為適用於ADC中之自我分解型間隔子之實例。
在一實施例中，纈胺酸-瓜胺酸二肽PAB類似物試劑具有2,6-二甲基苯基且具有以下結構：
適用於本發明之抗體藥物共軛物之連接試劑包括(但不限於)：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC及sulfo-SMPB、及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)，且包括雙順丁烯二醯亞胺試劑：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1,8-雙-順丁烯二醯亞胺二乙二醇(BM(PEO)2)及1,11-雙-順丁烯二醯亞胺三乙二醇(BM(PEO)3)，其可自Pierce Biotechnology,Inc.,ThermoScientific,Rockford,IL及其他試劑供應商購得。雙順丁烯二醯亞胺試劑允許抗體之半胱胺酸殘基之游離硫醇基以連續或同時方式與含有硫醇的藥物部分、標記或連接子中間物連接。除順丁烯二醯亞胺之外之可與抗體硫醇基、PBD藥物部分或連接子中間物反應的其他官能基包括碘乙醯胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯及異硫氰酸酯。
連接試劑之其他實施例為：N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP；Carlsson等人，(1978) Biochem. J. 173:723-737)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對二重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。適用連接試劑亦可經由其他商業來源獲得，諸如Molecular Biosciences Inc.(Boulder,CO)，或根據Toki等人，(2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US 2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828中描述之程序加以合成。
連接子可為樹突型連接子以便經由分支性多官能連接部分使1個以上之藥物部分與抗體共價連接(US 2006/116422；US 2005/271615；deGroot等人，(2003)Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494；Amir等人，(2003)Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499；Shamis等人，(2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731；Sun等人，(2002) Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等人，(2003) Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry 11:1761-1768；King等人，(2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990)。樹突狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳比，亦即裝載量，其與ADC之效能相關。因此，當抗體僅具有1個反應性半胱胺酸硫醇基時，眾多藥物部分可經由樹突狀連接子或分支連接子連接。
樹突型連接子之一例示性實施例具有以下結構：
其中星號指示連至PBD部分之N10位置之連接點。
細胞結合劑
細胞結合劑可具有任何種類，且包括肽及非肽。此等細胞結合劑可包括抗體或含有至少1個結合位點之抗體片段、淋巴激素(lymphokine)、激素、生長因子、養分轉運分子、或任何其他細胞結合分子或物質。
本文之術語「抗體」以最廣泛意義使用且特定涵蓋單株抗體、多株抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要生物活性即可(Miller等人，(2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861)。抗體可為鼠類抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或源於其他物種之抗體。抗體為由免疫系統產生之能夠識別且結合特定抗原之蛋白質。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001) Immuno Biology，第5版，Garland Publishing,New York)。目標抗原通常具有眾多由多種抗體上之CDR識別之結合位點，亦稱為抗原決定基。與不同抗原決定基特異性結合之各抗體具有不同結構。因此，1種抗原可具有1種以上之相應抗體。抗體包括全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有免疫特異性結合相關目標之抗原之抗原結合位點的分子或其一部分，此等目標包括(但不限於)癌細胞或產生與自體免疫疾病相關之自體免疫抗體之細胞。免疫球蛋白可具有免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、1gD及IgA)、種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。免疫球蛋白可來源於任何物種，包括人類、鼠類或兔來源。
「抗體片段」包含全長抗體之一部分，通常為其抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；微型雙功能抗體；線抗體；由Fab表現文庫產生之片段、抗個體基因型(抗Id)抗體、CDR(互補決定區)、及以上任一者之免疫特異性結合癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的抗原決定基結合片段、單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體群體獲得之抗體，亦即除可少量存在之可能的天然存在之突變外，構成該群體之個別抗體為相同的。單株抗體具有針對單一抗原位點的高度特異性。此外，與包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑不同，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除其特異性外，單株抗體之優點在於其可在不受其他抗體污染之情況下合成。修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得的特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，(1975) Nature 256:495描述之融合瘤法製備，或可藉由重組DNA法(參見US 4816567)製備。單株抗體亦可使用描述於Clackson等人，(1991) Nature，352: 624-628；Marks等人，(1991) J. Mol. Biol.，222:581-597中之技術自噬菌體抗體文庫分離。
本文之單株抗體特定包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體種類或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(該等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體種類或子類之抗體中的相應序列一致或同源；以及此等抗體之片段，只要其展現所要生物活性即可(US 4816567；及Morrison等人，(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81:6851-6855)。嵌合抗體包括包含來源於非人類靈長類動物(例如舊大陸猴(Old World Monkey)或猿)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列的「靈長類化」抗體。
本文之「完整抗體」為包含VL及VH域以及輕鏈恆定域(CL)及重鏈恆定域CH1、CH2及CH3之抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。完整抗體可具有一或多種「效應功能」，其係指可歸於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)之彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；及細胞表面受體(諸如B細胞受體及BCR)之下調。
視完整抗體重鏈恆定域之胺基酸序列而定，完整抗體可歸為不同「種類」。存在5個主要種類之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等種類中之數種可進一步分成「子類」(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同種類之抗體之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。熟知不同種類之免疫球蛋白之次單元結構及三維構型。
細胞結合劑之實例包括WO 2007/085930中所述之彼等可用藥劑，該專利併入本文中。
細胞結合劑可為或包含多肽。多肽可為環狀多肽。細胞結合劑可為抗體。因此，在一實施例中，本發明提供抗體-藥物共軛物(ADC)。
藥物裝載量
藥物裝載量為每個抗體之平均PBD藥物數目。藥物裝載量可在每個抗體(Ab)1至8個藥物(D)範圍內，亦即其中1、2、3、4、5、6、7及8個藥物部分與抗體共價連接。ADC之組合物包括一組抗體與1至8範圍內之藥物之共軛。由共軛反應獲得之ADC製劑中每個抗體之平均藥物數目可藉由習知手段(諸如質譜、ELISA檢定、電泳及HPLC)表徵。亦可根據p確定ADC之定量分佈。藉由ELISA，可測定特定ADC製劑之平均p值(Hamblett等人，(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070；Sanderson等人，(2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852)。然而，p(藥物)值之分佈因抗體-抗原結合及ELISA之偵測限制而不可辨別。此外，偵測抗體-藥物共軛物之ELISA檢定不能測定藥物部分在何處與抗體(諸如重鏈或輕鏈片段)或特定胺基酸殘基連接。在一些情況下，p為某一值之均質ADC與具有其他藥物裝載量之ADC的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HPLC或電泳之手段達成。對於一些抗體-藥物共軛物，p可受抗體上之連接點數限制。舉例而言，抗體可具有僅1個或若干個半胱胺酸硫醇基，或可具有僅1個或若干個可藉以連接連接子的充足反應性硫醇基。較高藥物裝載量，例如p>5，可能導致某些抗體-藥物共軛物之凝集、不可溶、毒性或細胞通透性喪失。
通常，在共軛反應期間，少於理論最大值之藥物部分與抗體共軛。抗體可含有例如不與藥物-連接子中間物(D-L)或連接試劑反應之許多離胺酸殘基。僅反應性最大之離胺酸基團可與胺反應性連接試劑反應。此外，僅反應性最大之半胱胺酸硫醇基可與硫醇反應性連接試劑反應。一般而言，抗體不含有許多(若存在)可與藥物部分連接之游離及反應性半胱胺酸硫醇基。化合物之抗體中之大多數半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋鍵形式存在且必須在部分或完全還原條件下經諸如二硫蘇糖醇(DTT)或TCEP之還原劑還原。可以若干不同方式控制ADC之裝載量(藥物/抗體比率)，該等方式包括：(i)限制藥物-連接子中間物(D-L)或連接試劑相對於抗體之莫耳濃度過量，(ii)限制共軛反應時間或溫度，及(iii)部分限制或限制修飾半胱胺酸硫醇之還原性條件。
位於抗體中之反應性位點處且不形成鏈內或分子間二硫鍵聯之半胱胺酸胺基酸可經工程改造(Junutula等人，2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等人，(2009) Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO 2009/052249)。經工程改造之半胱胺酸硫醇可與本發明之具有硫醇反應性親電子基團(諸如順丁烯二醯亞胺或α-鹵基醯胺)的連接試劑或藥物-連接試劑反應以形成含有半胱胺酸經工程改造之抗體及PBD藥物部分的ADC。從而可設計、控制及得知藥物部分之位置。藥物裝載量可經控制，因為經工程改造之半胱胺酸硫醇基通常以高產率與硫醇反應性連接試劑或藥物-連接試劑反應。對IgG抗體進行工程改造以藉由在重鏈或輕鏈上之單一位點處進行取代而引入半胱胺酸胺基酸會產生位於對稱抗體上之兩個新半胱胺酸。可達成接近2之藥物裝載量及接近均質之共軛產物ADC。
當抗體之1個以上親核或親電子基團依次與藥物-連接子中間物或連接試劑及藥物部分試劑反應時，則所得產物為藥物部分與抗體連接之分佈為例如1、2、3等之ADC化合物的混合物。諸如聚合逆相(PLRP)及疏水性相互作用(HIC)之液相層析方法可根據藥物裝載量值分離混合物中之化合物。可分離具有單一藥物裝載量值(p)之ADC製劑，然而，此等單一裝載量值ADC可能仍然為異質混合物，因為藥物部分可經由連接子在抗體上之不同位點處連接。因此，本發明之抗體-藥物共軛組合物包括抗體具有一或多個PBD藥物部分且藥物部分可在各種胺基酸殘基處與抗體連接之抗體-藥物共軛化合物的混合物。在一實施例中，每個細胞結合劑之平均單體或二聚體吡咯并苯并二氮呯基團數目在1至20之範圍內。在一些實施例中，該範圍係選自1至8、2至8、2至6、2至4、及4至8。在一些實施例中，每個細胞結合劑有1個單體或二聚體吡咯并苯并二氮呯基團。
肽
在一實施例中，細胞結合劑為包含4-20、較佳6-20個鄰接胺基酸殘基之線性肽或環狀肽。在此實施例中，較佳地，1個細胞結合劑與1個單體或二聚體吡咯并苯并二氮呯化合物連接。
在一實施例中，細胞結合劑包含結合整合素(integrin)ανβ6之肽。該肽對ανβ6之選擇性可超過對XYS之選擇性。在一實施例中，細胞結合劑包含A20FMDV-Cys多肽。A20FMDV-Cys具有序列：NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC。或者，可使用A20FMDV-Cys序列之變異體，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基經另一胺基酸殘基取代。在一實施例中，抗體為單株抗體；嵌合抗體；人類化抗體；完全人類抗體；或單鏈抗體。在一實施例中，抗體為此等抗體之一之具有生物活性的片段。此等片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段。在此等實施例中，各抗體可與1個或若干個單體或二聚體吡咯并苯并二氮呯基團連接。吡咯并苯并二氮呯與細胞結合劑之較佳比率在上文中給出。抗體可為域抗體(DAB)。在一實施例中，抗體為單株抗體。用於本發明中之抗體包括WO 2005/082023中描述之彼等抗體，該專利併入本文中。尤其較佳抗體為針對腫瘤相關性抗原之彼等抗體。此項技術中已知之彼等抗原之實例包括(但不限於)WO 2005/082023中闡述之彼等腫瘤相關性抗原。參見例如第41-55頁。
本發明共軛物經設計以經由腫瘤細胞之細胞表面抗原靶向腫瘤細胞。抗原通常為過度表現或在異常時間表現之正常細胞表面抗原。理想地，目標抗原僅在增殖細胞(較佳腫瘤細胞)上表現，然而，此在實務中很少觀測到。因此，通常基於增生性組織與健康組織之間之差異表現來選擇目標抗原。已產生抗體來靶向特定腫瘤相關性抗原，包括：Cripto、CD30、CD19、CD33、醣蛋白NMB、CanAg、Her2(ErbB2/Neu)、CD56(NCAM)、CD22(Siglec2)、CD33(Siglec3)、CD79、CD138、PSCA、PSMA(***特異性膜抗原)、BCMA、CD20、CD70、E-選擇素(selectin)、EphB2、黑素轉鐵蛋白(Melanotransferin)、Muc16及TMEFF2。腫瘤相關性抗原(TAA)在此項技術中為已知的，且可使用此項技術中熟知之方法及資訊加以製備以用於產生抗體。在欲發現用於癌症診斷及療法之有效細胞目標之努力中，研究者已設法鑑別跨膜或其他腫瘤相關性多肽，相較於一或多種正常非癌性細胞，其特異性表現於一或多種特定類型之癌細胞之表面上。相較於非癌性細胞表面上之表現，此等腫瘤相關性多肽通常更大量表現於癌細胞表面上。鑑別此等腫瘤相關性細胞表面抗原多肽已獲得特異性靶向癌細胞以經由基於抗體之療法進行破壞的能力。
TAA之實例包括(但不限於)以下列出之TAA(1)-(36)。為方便起見，關於此項技術中皆已知之此等抗原的資訊在下文中列出且包括名稱、替代名稱、Genbank寄存編號及主要參考文獻，隨後為國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)之核酸及蛋白質序列鑑別規約。對應於TAA(1)-(36)之核酸及蛋白質序列可在諸如GenBank之公共資料庫中獲得。抗體靶向之腫瘤相關性抗原包括相對於所引用參考文獻中鑑別之序列，具有至少約70%、80%、85%、90%或95%序列一致性，或展現與具有可見於所引用參考文獻中之序列之TAA實質上相同之生物性質或特徵的所有胺基酸序列變異體及同功異型物。舉例而言，具有變異序列之TAA通常能夠特異性結合與具有相應所列序列之TAA特異性結合的抗體。本文中特定敍述之參考文獻中之序列及揭示內容明確以引用的方式併入本文中。
腫瘤相關性抗原(1)-(36)：
(1) BMPR1B(IB型骨形態發生蛋白受體，Genbank寄存編號NM_001203)，ten Dijke,P.等人，Science 264(5155):101-104(1994)；Oncogene 14(11):1377-1382(1997)；WO 2004/063362(請求項2)；WO 2003/042661(請求項12)；US 2003/134790-A1(第38-39頁)；WO 2002/102235(請求項13；第296頁)；WO 2003/055443(第91-92頁)；WO 2002/99122(實例2；第528-530頁)；WO 2003/029421(請求項6)；WO 2003/024392(請求項2；圖112)；WO 2002/98358(請求項1；第183頁)；WO 2002/54940(第100-101頁)；WO 2002/59377(第349-350頁)；WO 2002/30268(請求項27；第376頁)；WO 2001/48204(實例；圖4)；IB型NP_001194骨形態發生蛋白受體/pid=NP_001194.1.交叉引用：MIM:603248；NP_001194.1；AY065994
(2) E16(LAT1，SLC7A5，Genbank寄存編號NM_003486)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 255(2),283-288(1999)；Nature 395(6699):288-291(1998)；Gaugitsch,H.W.等人，(1992) J. Biol. Chem. 267(16):11267-11273；WO 2004/048938(實例2)；WO 2004/032842(實例IV)；WO 2003/042661(請求項12)；WO 2003/016475(請求項1)；WO 2002/78524(實例2)；WO 2002/99074(請求項19；第127-129頁)；WO 2002/86443(請求項27；第222、393頁)；WO 2003/003906(請求項10；第293頁)；WO 2002/64798(請求項33；第93-95頁)；WO 2000/14228(請求項5；第133-136頁)；US 2003/224454(圖3)；WO 2003/025138(請求項12；第150頁)；NP_003477溶質載體家族7(陽離子胺基酸轉運體，y+系統)，成員5/pid=NP_003477.3-智人；交叉引用：MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1
(3) STEAP1(***之6次跨膜上皮抗原，Genbank寄存編號NM_012449)；Cancer Res. 61(15),5857-5860(2001)；Hubert,R.S.等人，(1999) Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 96(25):14523-14528；WO 20041065577(請求項6)；WO 2004/027049(圖1L)；EP1394274(實例11)；WO 2004/016225(請求項2)；WO 2003/042661(請求項12)；US 2003/157089(實例5)；US 2003/185830(實例5)；US 2003/064397(圖2)；WO 2002/89747(實例5；第618-619頁)；WO 2003/022995(實例9；圖13A，實例53；第173頁，實例2；圖2A)；NP_036581***之6次跨膜上皮抗原；交叉引用：MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1
(4) 0772P(CA125，MUC16，Genbank寄存編號AF361486)；J. Biol. Chem. 276(29):27371-27375(2001)；WO 2004/045553(請求項14)；WO 2002/92836(請求項6；圖12)；WO 2002/83866(請求項15；第116-121頁)；US 2003/124140(實例16)；交叉引用：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1
(5) MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核細胞增效因子，間皮素(mesothelin)，Genbank寄存編號NM_005823)，Yamaguchi,N.等人，Biol. Chem. 269(2)，805-808(1994)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(20):11531-11536(1999)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(1):136-140(1996)；J. Biol. Chem. 270(37):21984-21990(1995)；WO 2003/101283(請求項14)；WO 2002/102235(請求項13；第287-288頁)；WO 2002/101075(請求項4；第308-309頁)；WO 2002/71928(第320-321頁)；WO 94/10312(第52-57頁)；交叉引用：MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1
(6) Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶質載體家族34(磷酸鈉)，成員2，第II型鈉依賴性磷酸轉運體3b，Genbank寄存編號NM_006424)，J. Biol. Chem. 277(22):19665-19672(2002)；Genomics 62(2):281-284(1999)；Feild,J.A.等人，(1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258(3):578-582；WO 2004/022778(請求項2)；EP 1394274(實例11)；WO 2002/102235(請求項13；第326頁)；EP 0875569(請求項1；第17-19頁)；WO 2001/57188(請求項20；第329頁)；WO 2004/032842(實例IV)；WO 2001/75177(請求項24；第139-140頁)；交叉引用：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1
(7) Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，信號蛋白(Semaphorin)5b Hlog，sema域，7次血小板反應蛋白(thrombospondin)重複(第1型及類第1型)，跨膜域(TM)及短細胞質域，(信號蛋白)5B，Genbank寄存編號AB040878)；Nagase T.等人，(2000) DNA Res. 7(2):143-150；WO 2004/000997(請求項1)；WO 2003/003984(請求項1)；WO 2002/06339(請求項1；第50頁)；WO 2001/88133(請求項1；第41-43、48-58頁)；WO 2003/054152(請求項20)；WO 2003/101400(請求項11)；寄存編號：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1. Genew；HGNC:10737
(8) PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank寄存編號AY358628)；Ross等人，(2002) Cancer Res. 62:2546-2553；US 2003/129192(請求項2)；US 2004/044180(請求項12)；US 2004/044179(請求項11)；US 2003/096961(請求項11)；US 2003/232056(實例5)；WO 2003/105758(請求項12)；US 2003/206918(實例5)；EP 1347046(請求項1)；WO 2003/025148(請求項20)；交叉引用：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1
(9)　ETBR(內皮素B型受體，Genbank寄存編號AY275463)；Nakamuta M.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 177,34-39,1991；Ogawa Y.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 178,248-255,1991；Arai H.等人，Jpn. Circ. J. 56,1303-1307,1992；Arai H.等人，J. Biol. Chem. 268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,Yanagisawa M.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.等人，J. Biol. Chem. 268，3873-3879,1993；Haendler B.等人，J. Cardiovasc. Pharmacol. 20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.等人，Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99,16899-16903,2002；Bourgeois C.等人，J. Clin. Endocrinol. Metab. 82,3116-3123，1997；Okamoto Y.等人，Biol. Chem. 272,21589-21596,1997；Verheij J.B.等人，Am. J. Med. Genet. 108,223-225，2002；Hofstra R.M.W.等人，Eur. J. Hum. Genet. 5,180-185,1997；Puffenberger E.G.等人，Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.等人，Hum. Mol. Genet. 4,2407-2409,1995；Auricchio A.等人，Hum. Mol. Genet. 5:351-354，1996；Amiel J.等人，Hum. Mol. Genet. 5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.等人，Nat. Genet. 12,445-447,1996；Svensson P.J.等人，Hum. Genet. 103,145-148,1998；Fuchs S.等人，Mol. Med. 7,115-124,2001；Pingault V.等人，(2002) Hum. Genet. 111,198-206；WO 2004/045516(請求項1)；WO 2004/048938(實例2)；WO 2004/040000(請求項151)；WO 2003/087768(請求項1)；WO 2003/016475(請求項1)；WO 2003/016475(請求項1)；WO 2002/61087(圖1)；WO 2003/016494(圖6)；WO 2003/025138(請求項12；第144頁)；WO 2001/98351(請求項1；第124-125頁)；EP 0522868(請求項8；圖2)；WO 2001/77172(請求項1；第297-299頁)；US 2003/109676；US 6518404(圖3)；US 5773223(請求項1a；第31-34欄)；WO 2004/001004
(10)　MSG783(RNF124，假定之蛋白質FLJ20315，Genbank寄存編號NM_017763)；WO 2003/104275(請求項1)；WO 2004/046342(實例2)；WO 2003/042661(請求項12)；WO 2003/083074(請求項14；第61頁)；WO 2003/018621(請求項1)；WO 2003/024392(請求項2；圖93)；WO 2001/66689(實例6)；交叉引用：LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1
(11)　STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相關基因1，***癌相關蛋白1，***之6次跨膜上皮抗原2，6次跨膜***蛋白，Genbank寄存編號AF455138)；Lab. Invest. 82(11):1573-1582(2002)；WO 2003/087306；US 2003/064397(請求項1；圖1)；WO 2002/72596(請求項13；第54-55頁)；WO 2001/72962(請求項1；圖4B)；WO 2003/104270(請求項11)；WO 2003/104270(請求項16)；US 2004/005598(請求項22)；WO 2003/042661(請求項12)；US 2003/060612(請求項12；圖10)；WO 2002/26822(請求項23；圖2)；WO 2002/16429(請求項12；圖10)；交叉引用：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1
(12) TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，短暫受體潛在陽離子通道，次家族M，成員4，Genbank寄存編號NM_017636)；Xu,X.Z.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(19):10692-10697(2001)；Cell 109(3):397-407(2002)，J. Biol. Chem. 278(33):30813-30820(2003)；US 2003/143557(請求項4)；WO 2000/40614(請求項14；第100-103頁)；WO 2002/10382(請求項1；圖9A)；WO 2003/042661(請求項12)；WO 2002/30268(請求項27；第391頁)；US 2003/219806(請求項4)；WO 2001/62794(請求項14；圖1A-D)；交叉引用：MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1
(13) CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎上皮癌(teratocarcinoma)源性生長因子，Genbank寄存編號NP_003203或NM_003212)；Ciccodicola,A.等人，EMBO J. 8(7):1987-1991(1989)；Am. J. Hum. Genet. 49(3):555-565(1991)；US 2003/224411(請求項1)；WO 2003/083041(實例1)；WO 2003/034984(請求項12)；WO 2002/88170(請求項2；第52-53頁)；WO 2003/024392(請求項2；圖58)；WO 2002/16413(請求項1；第94-95、105頁)；WO 2002/22808(請求項2；圖1)；US 5854399(實例2；第17-18欄)；US 5792616(圖2)；交叉引用：MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1
(14)　CD21(CR2(補體受體2)或C3DR(C3d/艾普斯坦巴爾病毒受體(Epstein Barr virus receptor))或Hs.73792 Genbank寄存編號M26004)；Fujisaku等人，(1989) J. Biol. Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.等人，J. Exp. Med.167,1047-1066,1988；Moore M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,9194-9198,1987；Barel M.等人，Mol. Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83,5639-5643,1986；Sinha S.K.等人，(1993) J. Immunol.150,5311-5320；WO 2004/045520(實例4)；US 2004/005538(實例1)；WO 2003/062401(請求項9)；WO 2004/045520(實例4)；WO 91/02536(圖9.1-9.9)；WO 2004/020595(請求項1)；寄存編號：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1
(15)　CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相關β)，B29，Genbank寄存編號NM_000626或11038674)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(2003) 100(7):4126-4131；Blood(2002) 100(9):3068-3076；Muller等人，(1992) Eur. J. Immunol. 22(6):1621-1625；WO 2004/016225(請求項2，圖140)；WO 2003/087768；US 2004/101874(請求項1，第102頁)；WO 2003/062401(請求項9)；WO 2002/78524(實例2)；US 2002/150573(請求項5，第15頁)；US 5644033；WO 2003/048202(請求項1，第306及309頁)；WO 99/58658；US6 534482(請求項13，圖17A/B)；WO 2000/55351(請求項11，第1145-1146頁)；交叉引用：MIM: 147245；NP_000617.1；NM_000626_1
(16) FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含有SH2域之磷酸酶錨定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C，Genbank寄存編號NM_030764、AY358130)；Genome Res. 13(10):2265-2270(2003)；Immunogenetics 54(2):87-95(2002)；Blood 99(8):2662-2669(2002)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(17):9772-9777(2001)；Xu,M.J.等人，(2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280(3):768-775；WO 2004/016225(請求項2)；WO 2003/077836；WO 2001/38490(請求項5；圖18D-1-18D-2)；WO2003/097803(請求項12)；WO 2003/089624(請求項25)；交叉引用：MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1
(17) HER2(ErbB2，Genbank寄存編號M11730)；Coussens L.等人，Science(1985) 230(4730):1132-1139；Yamamoto T.等人，Nature 319,230-234,1986；Semba K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.等人，J. Cell Biol. 165,869-880,2004；Kuhns J.J.等人，J. Biol. Chem. 274,36422-36427,1999；Cho H.-S.等人，Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.等人，(1993) Genomics 15,426-429；WO 2004/048938(實例2)；WO 2004/027049(圖1I)；WO 2004/009622；WO 2003/081210；WO 2003/089904(請求項9)；WO 2003/016475(請求項1)；US 2003/118592；WO 2003/008537(請求項1)；WO 2003/055439(請求項29；圖1A-B)；WO 2003/025228(請求項37；圖5C)；WO 2002/22636(實例13；第95-107頁)；WO 2002/12341(請求項68；圖7)；WO 2002/13847(第71-74頁)；WO 2002/14503(第114-117頁)；WO 2001/53463(請求項2；第41-46頁)；WO 2001/41787(第15頁)；WO 2000/44899(請求項52；圖7)；WO 2000/20579(請求項3；圖2)；US 5869445(請求項3；第31-38欄)；WO 9630514(請求項2；第56-61頁)；EP 1439393(請求項7)；WO 2004/043361(請求項7)；WO 2004/022709；WO 2001/00244(實例3；圖4)；寄存編號：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1. EMBL；M11761；AAA35808.1
(18) NCA(CEACAM6，Genbank寄存編號M18728)；Barnett T.等人，Genomics 3,59-66，1988；Tawaragi Y.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 150,89-96,1988；Strausberg R.L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903,2002；WO 2004/063709；EP 1439393(請求項7)；WO 2004/044178(實例4)；WO 2004/031238；WO 2003/042661(請求項12)；WO 2002/78524(實例2)；WO 2002/86443(請求項27；第427頁)；WO 2002/60317(請求項2)；寄存編號：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728
(19)　MDP(DPEP1，Genbank寄存編號BC017023)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26):16899-16903(2002)；WO 2003/016475(請求項1)；WO 2002/64798(請求項33；第85-87頁)；JP 05003790(圖6-8)；WO 99/46284(圖9)；交叉引用：MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1
(20)　IL20Rα(IL20Ra，ZCYTOR7，Genbank寄存編號AF184971)；Clark H.F.等人，Genome Res. 13,2265-2270,2003；Mungall A.J.等人，Nature 425,805-811,2003；Blumberg H.等人，Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.等人，J. Immunol. 167,3545-3549,2001；Parrish-Novak J.等人，J. Biol. Chem. 277,47517-47523,2002；Pletnev S.等人，(2003) Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.等人，(2004) J. Immunol. 172,2006-2010；EP 1394274(實例11)；US 2004/005320(實例5)；WO 2003/029262(第74-75頁)；WO 2003/002717(請求項2；第63頁)；WO 2002/22153(第45-47頁)；US 2002/042366(第20-21頁)；WO 2001/46261(第57-59頁)；WO 2001/46232(第63-65頁)；WO 98/37193(請求項1；第55-59頁)；寄存編號：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1
(21)短蛋白聚糖(Brevican)(BCAN，BEHAB，Genbank寄存編號AF229053)；Gary S.C.等人，Gene 256,139-147,2000；Clark H.F.等人，Genome Res. 13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99,16899-16903,2002；US 2003/186372(請求項11)；US 2003/186373(請求項11)；US 2003/119131(請求項1；圖52)；US 2003/119122(請求項1；圖52)；US 2003/119126(請求項1)；US 2003/119121(請求項1；圖52)；US 2003/119129(請求項1)；US 2003/119130(請求項1)；US 2003/119128(請求項1；圖52)；US 2003/119125(請求項1)；WO 2003/016475(請求項1)；WO 2002/02634(請求項1)
(22) EphB2R(DRT，ERK，Hek5，EPHT3，Tyro5，Genbank寄存編號NM_004442)；Chan,J.及Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)；Oncogene 10(5):897-905(1995)；Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345(1998)；Int. Rev. Cytol. 196:177-244(2000)；WO 2003042661(請求項12)；WO 200053216(請求項1；第41頁)；WO 2004065576(請求項1)；WO 2004020583(請求項9)；WO 2003004529(第128-132頁)；WO 200053216(請求項1；第42頁)；交叉引用：MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1
(23) ASLG659(B7h，Genbank寄存編號AX092328)；US 2004/0101899(請求項2)；WO 2003104399(請求項11)；WO 2004000221(圖3)；US 2003/165504(請求項1)；US 2003/124140(實例2)；US 2003/065143(圖60)；WO 2002/102235(請求項13；第299頁)；US 2003/091580(實例2)；WO 2002/10187(請求項6；圖10)；WO 2001/94641(請求項12；圖7b)；WO 2002/02624(請求項13；圖1A-1B)；US 2002/034749(請求項54；第45-46頁)；WO 2002/06317(實例2；第320-321頁，請求項34；第321-322頁)；WO 2002/71928(第468-469頁)；WO 2002/02587(實例1；圖1)；WO 2001/40269(實例3；第190-192頁)；WO 2000/36107(實例2；第205-207頁)；WO 2004/053079(請求項12)；WO 2003/004989(請求項1)；WO 2002/71928(第233-234、452-453頁)；WO 01/16318
(24) PSCA(***幹細胞抗原前驅體，Genbank寄存編號AJ297436)；Reiter R.E.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95,1735-1740,1998；Gu Z.等人，Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem. Biophys. Res. Commun.(2000) 275(3):783-788；WO 2004/022709；EP 1394274(實例11)；US 2004/018553(請求項17)；WO 2003/008537(請求項1)；WO 2002/81646(請求項1；第164頁)；WO 2003/003906(請求項10；第288頁)；WO 2001/40309(實例1；圖17)；US 2001/055751(實例1；圖1b)；WO 2000/32752(請求項18；圖1)；WO 98/51805(請求項17；第97頁)；WO 98/51824(請求項10；第94頁)；WO 98/40403(請求項2；圖1B)；寄存編號：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1
(25) GEDA(Genbank寄存編號AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合搭配物樣蛋白/pid=AAP14954.1-智人(人類)；WO 2003/054152(請求項20)；WO 2003/000842(請求項1)；WO 2003/023013(實例3，請求項20)；US 2003/194704(請求項45)；交叉引用：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1
(26) BAFF-R(B細胞活化因子受體，BLyS受體3，BR3，Genbank寄存編號AF116456)；BAFF受體/pid=NP_443177.1-智人：Thompson,J.S.等人，Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO 2004/058309；WO 2004/011611；WO 2003/045422(實例；第32-33頁)；WO 2003/014294(請求項35；圖6B)；WO 2003/035846(請求項70；第615-616頁)；WO 2002/94852(第136-137欄)；WO 2002/38766(請求項3；第133頁)；WO 2002/24909(實例3；圖3)；交叉引用：MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600
(27) CD22(B細胞受體CD22-B同功異型物，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814，Genbank寄存編號AK026467)；Wilson等人，(1991) J. Exp. Med. 173:137-146；WO 2003/072036(請求項1；圖1)；交叉引用：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1
(28) CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關α，一種與Igβ(CD79B)共價相互作用且在表面上與IgM分子形成複合物，轉導涉及B細胞分化之信號的B細胞特異性蛋白質，pI:4.84，MW:25028，TM:2[P]基因染色體：19q13.2，Genbank寄存編號NP_001774.10)；WO 2003/088808；US 2003/0228319；WO 2003/062401(請求項9)；US 2002/150573(請求項4，第13-14頁)；WO 99/58658(請求項13，圖16)；WO 92/07574(圖1)；US 5644033；Ha等人，(1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531；Mller等人，(1992) Eur. J. Immunol.. 22:1621-1625；Hashimoto等人，(1994) Immunogenetics 40(4):287-295；Preud'homme等人，(1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146；Yu等人，(1992) J. Immunol. 148(2) 633-637；Sakaguchi等人，(1988) EMBO J. 7(11):3457-3464
(29) CXCR5(伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)受體1，一種由CXCL13趨化因子活化，在淋巴細胞遷移及體液性防禦中起作用，在HIV-2感染及或許AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤及白血病之發展中起作用的G蛋白偶聯受體；372 aa，pI:8.54，MW:41959，TM:7[P]基因染色體：11q23.3，Genbank寄存編號NP_001707.1)；WO 2004/040000；WO 2004/015426；US 2003/105292(實例2)；US 6555339(實例2)；WO 2002/61087(圖1)；WO 2001/57188(請求項20，第269頁)；WO 2001/72830(第12-13頁)；WO 2000/22129(實例1，第152-153頁，實例2，第254-256頁)；WO 99/28468(請求項1，第38頁)；US 5440021(實例2，第49-52欄)；WO 94/28931(第56-58頁)；WO 92/17497(請求項7，圖5)；Dobner等人，(1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799；Barella等人，(1995) Biochem. J. 309:773-779
(30)　HLA-DOB(結合肽且向CD4+T淋巴細胞呈現肽之第II類MHC分子(Ia抗原)之β次單元；273aa，pI:6.56，MW:30820，TM:1[P]基因染色體：6p21.3，Genbank寄存編號NP_002111.1)；Tonnelle等人，(1985) EMBO J. 4(11):2839-2847；Jonsson等人，(1989) Immunogenetics 29(6):411-413；Beck等人，(1992) J. Mol. Biol. 228:433-441；Strausberg等人，(2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99：16899-16903；Servenius等人，(1987) J. Biol. Chem.262:8759-8766；Beck等人，(1996) J. Mol. Biol. 255:1-13；Naruse等人，(2002) Tissue Antigens 59:512-519；WO 99/58658(請求項13，圖15)；US 6153408(第35-38欄)；US 5976551(第168-170欄)；US 6011146(第145-146欄)；Kasahara等人，(1989) Immunogenetics 30(1):66-68；Larhammar等人，(1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119
(31)　P2X5(嘌呤型受體P2X配位體閘控離子通道5，一種由細胞外ATP閘控之離子通道，可涉及於突觸傳導及神經生成，其不足可造成特發性逼尿肌不穩定之病理生理異常；422 aa，pI:7.63，MW:47206，TM:1[P]基因染色體：17p13.3，Genbank寄存編號NP_002552.2)；Le等人，(1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199；WO 2004/047749；WO 2003/072035(請求項10)；Touchman等人，(2000) Genome Res. 10:165-173；WO 2002/22660(請求項20)；WO 2003/093444(請求項1)；WO 2003/087768(請求項1)；WO2003/029277(第82頁)
(32) CD72(B細胞分化抗原CD72，Lyb-2；359 aa，pI:8.66，MW:40225，TM:1[P]基因染色體：9p13.3，Genbank寄存編號NP_001773.1)；WO 2004042346(請求項65)；WO 2003/026493(第51-52、57-58頁)；WO 2000/75655(第105-106頁)；Von Hoegen等人，(1990)J. Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg等人，(2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903
(33) LY64(淋巴細胞抗原64(RP105)，富含白胺酸重複(LRR)家族之第I型膜蛋白，調控B細胞活化及細胞凋亡，功能喪失與全身性紅斑狼瘡患者中之疾病活性增加相關；661 aa，pI:6.20，MW:74147，TM:1[P]基因染色體:5q12，Genbank寄存編號NP_005573.1)；US 2002/193567；WO 97/07198(請求項11，第39-42頁)；Miura等人，(1996) Genomics 38(3):299-304；Miura等人，(1998) Blood 92:2815-2822；WO 2003/083047；WO 97/44452(請求項8，第57-61頁)；WO 2000/12130(第24-26頁)
(34) FcRH1(Fc受體樣蛋白1，一種免疫球蛋白Fc域之含有C2型Ig樣及ITAM域的推定受體，可在B淋巴細胞分化中具有作用；429 aa，pI:5.28，MW:46925，TM:1[P]基因染色體：1q21-1q22，Genbank寄存編號NP_443170.1)；WO 2003/077836；WO 2001/38490(請求項6，圖18E-1-18-E-2)；Davis等人，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777；WO 2003/089624(請求項8)；EP 1347046(請求項1)；WO 2003/089624(請求項7)
(35)　IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關2，一種可能在B細胞發育及淋巴瘤生成中具有作用之推定免疫受體；在一些B細胞惡性疾病中因易位而發生基因調節異常；977 aa，pI:6.88，MW:106468，TM:1[P]基因染色體：1q21，Genbank寄存編號：人類：AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085；小鼠：AK089756、AY158090、AY506558；NP_112571.1；WO 2003/024392(請求項2，圖97)；Nakayama等人，(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127；WO 2003/077836；WO 2001/38490(請求項3，圖18B-1-18B-2)
(36)　TENB2(TMEFF2，多莫調節素(tomoregulin)，TPEF，HPP1，TR，推定跨膜蛋白多醣，與生長因子之EGF/神經調節素(heregulin)家族及卵泡抑素(follistatin)相關；374 aa，NCBI寄存編號：AAD55776、AAF91397、AAG49451，NCBI RefSeq：NP_057276；NCBI基因：23671；OMIM：605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank寄存編號AF179274；AY358907、CAF85723、CQ782436；WO 2004/074320；JP 2004113151；WO 2003/042661；WO 2003/009814；EP 1295944(第69-70頁)；WO 2002/30268(第329頁)；WO 2001/90304；US 2004/249130；US 2004/022727；WO 2004/063355；US 2004/197325；US 2003/232350；US 2004/005563；US 2003/124579；Horie等人，(2000) Genomics 67:146-152；Uchida等人，(1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602；Liang等人，(2000) Cancer Res. 60:4907-12；Glynne-Jones等人，(2001) Int J Cancer. Oct 15；94(2):178-84。
親本抗體亦可為包含白蛋白結合肽(ABP)序列之融合蛋白(Dennis等人，(2002)「Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins」J Biol Chem. 277:35035-35043；WO 01/45746)。本發明抗體包括以下文獻所教示之具有ABP序列的融合蛋白：(i)Dennis等人，(2002) J Biol Chem. 277:35035-35043，在表III及IV處，第35038頁；(ii)US 2004/0001827，在[0076]處；及(iii)WO 01/45746，在第12-13頁，所有該等文獻皆以引用的方式併入本文中。在一實施例中，已產生抗體來靶向特定腫瘤相關性抗原ανβ6。細胞結合劑與連接子連接。在一實施例中，細胞結合劑與連接子之A(當存在時)連接。在一實施例中，細胞結合劑與連接子之間的連接係經由硫醚鍵達成。在一實施例中，細胞結合劑與連接子之間的連接係經由雙硫鍵達成。在一實施例中，細胞結合劑與連接子之間的連接係經由醯胺鍵達成。
在一實施例中，細胞結合劑與連接子之間的連接係經由酯鍵達成。在一實施例中，細胞結合劑與連接子之間的連接係在細胞結合劑之半胱胺酸殘基之硫醇基與連接子之順丁烯二醯亞胺基團之間形成。細胞結合劑之半胱胺酸殘基可用於與RL之官能基反應以形成連接。在例如細胞結合劑為抗體之其他實施例中，抗體之硫醇基可參與鏈間雙硫鍵。此等鏈間鍵可藉由例如在與RL之官能基反應之前用DTT處理抗體而轉化成游離硫醇基。細胞結合劑可經標記，例如以有助於在以共軛物或共軛物之一部分之形式併入之前偵測或純化藥劑。標記可為生物素標記。在另一實施例中，細胞結合劑可用放射性同位素加以標記。R及R'在一實施例中，R獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基。此等基團各自在下文取代基章節中加以定義。在一實施例中，R獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。在一實施例中，R獨立地為視情況經取代之C3-20雜環基。在一實施例中，R獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。在一實施例中，R獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
以上關於R2之描述為關於較佳烷基及芳基及視情況選用之取代基之身分及數目的各種實施例。適當時，當應用於R時關於R2所述之較佳選項可適用於所有其他基團R，例如當R6、R7、R8或R9為R時。
R之較佳選項亦適用於R'。在本發明之一些實施例中，提供具有取代基-NRR'之化合物。在一實施例中，R及R'連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環。該環可含有另一雜原子，例如N、O或S。在一實施例中，雜環本身經基團R取代。當存在另一N雜原子時，取代基可位於N雜原子上。R"R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代。在一實施例中，R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或芳族環，例如苯或吡啶。在一實施例中，伸烷基視情況雜有一或多個選自O、S及NMe之雜原子及/或芳族環，該等環視情況經取代。在一實施例中，芳族環為C5-20伸芳基，其中伸芳基係關於藉由自芳族化合物之兩個芳族環原子移除兩個氫原子獲得的二價部分，該部分具有5至20個環原子。在一實施例中，R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代。
在一實施例中，R"為C3-12伸烷基。在一實施例中，R"係選自C3、C5、C7、C9及C11伸烷基。在一實施例中，R"係選自C3、C5及C7伸烷基。在一實施例中，R"係選自C3及C5伸烷基。在一實施例中，R"為C3伸烷基。在一實施例中，R"為C5伸烷基。以上所列之伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳族環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代。以上所列之伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳族環，例如苯或吡啶。以上所列之伸烷基可為未經取代之線性脂族伸烷基。X在一實施例中，X係選自O、S或N(H)。較佳地，X為O。
A-A、B-A、C-A、D-A及E-A
式A-A、B-A、C-A、D-A及E-A之化合物具有基團R2，基團R2與R1或R3之任一者連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環。視情況經取代之苯環可視為與吡咯并苯并二氮呯之C環稠合。稠合苯環可稱為D環。以下說明稠合環之結構：
其中D1、D2、D3及D4之各者表示H或取代基。在一實施例中，苯環未經取代。在一實施例中，苯環視情況經1、2、3或4個選自以下之基團取代：OH、CN、R、OR、O-SO2-R、CO2R、COR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基。在一實施例中，苯環經單取代。單取代基可為D1、D2、D3或D4之任一者(其餘為H)。在一實施例中，苯環D2處經取代，且D1、D3及D4皆為H。在一實施例中，苯環D3處經取代，且D1、D2及D4皆為H。在一實施例中，R2與R1連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環。以下闡述V及W之較佳選項。A-B、B-B、C-B、D-B及E-B在一實施例中，當T為NR、BH、SO或SO2時，U為CH2。在一實施例中，當U為NR、O或S時，T為CH2或CO。在一實施例中，T係選自CH2及CO。在一實施例中，U係選自NR、O及S。在一實施例中，Y為(CH2)n，其中n為1或2。
在一實施例中，化合物A-B之C環具有選自如下所示之彼等結構的結構：
V及W
V及W各自選自(CH2)n、O、S、NR、CHR及CRR'，其中n為2、3或4，例外為當R1及R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，V為C，且當R3及R2連同其所連接之C環碳原子一起形成視情況經取代之苯環時，W為C。在一實施例中，當V及W之一為C時，V及W之另一者係選自CH2及NR。在一實施例中，當V及W之一為C時，V及W之另一者為CH2。
二聚體化合物
在一實施例中，本發明之第一態樣之共軛物、化合物C、化合物D及化合物E皆為二聚體。
共軛物
在一實施例中，共軛物為各單體皆具有式(A)之二聚體。
在一實施例中，二聚體化合物為各單體皆具有式(A)之二聚體，且化合物具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"、R10"、X"、Q"及R11"分別根據R2、R6、R7、R9、R10、X及R11所定義。
在一實施例中，共軛物為各單體皆具有式(A)之二聚體，且化合物具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"、X"、Q"及R11"分別根據R2、R6、R7、R9、X及R11所定義，且RC為封端基團。在此實施例中，各基團R10為與細胞結合劑連接之連接子。在一實施例中，共軛物為1個單體具有式(A)且另一單體具有式(B)之二聚體。
在一實施例中，共軛物為1個單體具有式(A)且另一單體具有式(B)之二聚體，且化合物具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"、X"及R11"分別根據R2、R6、R7、R9、X及R11所定義。在一實施例中，共軛物為各單體皆具有式(A)之二聚體，且適當時基團R2、R6、R9、X、R11及R7及R8相同。在一實施例中，化合物為各單體皆具有式(A)之二聚體，且適當時基團R2、R6、R9、X、R11、R10、及R7及R8相同。該種化合物可稱為對稱二聚體。
在一實施例中，共軛物為1個單體具有式(A)且另一單體具有式(B)之二聚體，且適當時(A)之基團R2、R6、R9、及R7及R8與化合物(B)之彼等基團相同。對於以上各二聚體化合物，式(A)或(B)之單體可經如本文所述之式(A-I)或(B-I)的單體置換。
化合物C
在一實施例中，化合物C為二聚體。
在一實施例中，化合物C具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"及X"分別根據R2、R6、R7、R9及X所定義。
化合物D
在一實施例中，化合物D為二聚體。
在一實施例中，化合物D具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"、Q"、R11"及X"分別根據R2、R6、R7、R9、Q、R11及X所定義。
化合物E
在一實施例中，化合物E為二聚體。
在一實施例中，化合物E具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"、R11"、RL"、Q"及X"分別根據R2、R6、R7、R9、R11、RL及X所定義。
在一實施例中，化合物E具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"、R11"、Q"及X"分別根據R2、R6、R7、R9、R11及X所定義。RC為封端基團。
在一實施例中，化合物E具有如下所示之結構：
其中R2"、R6"、R7"、R9"及X"分別根據R2、R6、R7、R9、及X所定義。
單體化合物
在一實施例中，本發明之第一態樣之共軛物、化合物C、化合物D及化合物E為單體。
在一實施例中，式(C)、(D)或(E)之共軛物或化合物可經如本文所述之式(A-I)、(C-I)、(D-I)或(E-I)的單體置換。
R c ，封端基團
本發明之第一態樣之共軛物可在N10位置處具有封端基團RC。化合物E可具有封端基團RC。在共軛物為各單體皆具有式(A)之二聚體的一實施例中，單體單元之一中之基團R10為封端基團RC或為基團R10。在共軛物為各單體皆具有式(A)之二聚體的一實施例中，單體單元之一中之基團R10為封端基團RC。在化合物E為各單體皆具有式(E)之二聚體的一實施例中，單體單元之一中之基團RL為封端基團RC或為用於與細胞結合劑連接的連接子。在化合物E為各單體皆具有式(E)之二聚體的一實施例中，單體單元之一中之基團RL為封端基團RC。基團RC可自PBD部分之N10位置移除而得到N10-C11亞胺鍵、甲醇胺、經取代甲醇胺、其中QR11為OSO3M、亞硫酸氫鹽加合物、硫代甲醇胺、經取代硫代甲醇胺或經取代甲醛胺。
在一實施例中，RC可為可移除而得到N10-C11亞胺鍵、甲醇胺、經取代甲醇胺的保護基、或其中QR11為OSO3M、亞硫酸氫鹽加合物。在一實施例中，RC為可移除而得到N10-C11亞胺鍵之保護基。
基團Rc旨在與移除基團R10所需之條件相同之條件下移除，例如以產生N10-C11亞胺鍵、甲醇胺等。封端基團充當N10位置處之預定官能基之保護基。封端基團不欲與細胞結合劑反應。舉例而言，RC不與RL相同。具有封端基團之化合物可用作合成具有亞胺單體之二聚體的中間物。或者，具有封端基團之化合物可用作共軛物，其中封端基團在目標位置處移除以產生亞胺、甲醇胺、經取代甲醇胺等。因此，在此實施例中，封端基團可稱為治療上可移除之氮保護基，如本發明人之較早申請案WO 00/12507中所定義。在一實施例中，基團RC可在分解基團R10之連接子RL之條件下移除。因此，在一實施例中，封端基團可藉由酶之作用分解。在一替代實施例中，封端基團可在連接子RL與細胞結合劑連接之前移除。在此實施例中，封端基團可在不分解連接子RL之條件下移除。當化合物包括欲與細胞結合劑形成連接之官能基G1時，封端基團可在添加或暴露G1之前移除。封端基團可用作保護基策略之一部分以確保二聚體中僅1個單體單元與細胞結合劑連接。
封端基團可用作N10-C11亞胺鍵之遮蔽物(mask)。封端基團可在諸如化合物中需要亞胺官能基時移除。封端基團亦為如上所述之甲醇胺、經取代甲醇胺及亞硫酸氫鹽加合物之遮蔽物。
RC可為N10保護基，諸如本發明人之較早申請案WO 00/12507中描述之彼等基團。在一實施例中，RC為治療上可移除之氮保護基，如本發明人之較早申請案WO 00/12507中所定義。在一實施例中，RC為胺基甲酸酯保護基。在一實施例中，胺基甲酸酯保護基係選自：Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、PSec、Cbz及PNZ。胺基甲酸酯保護基視情況另外選自Moc。在一實施例中，RC為缺乏與細胞結合劑連接之官能基的連接基團RL。本申請案尤其涉及作為胺基甲酸酯之彼等RC基團。
在一實施例中，RC為以下基團：
其中星號指示連至N10位置之連接點，G2為封端基團，L3為共價鍵或可分解之連接子L1，L2為共價鍵或連同OC(=O)一起形成自我分解型連接子。當L3及L2均為共價鍵時，G2及OC(=O)一起形成如上所定義之胺基甲酸酯保護基。L1係如上關於R10所定義。L2係如上關於R10所定義。
以下描述各種封端基團，包括基於熟知保護基之彼等封端基團。
在一實施例中，L3為可分解之連接子L1，且L2連同OC(=O)一起形成自我分解型連接子。在此實施例中，G2為Ac(乙醯基)或Moc、或選自以下之胺基甲酸酯保護基：Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、PSec、Cbz及PNZ。胺基甲酸酯保護基視情況另外選自Moc。在另一實施例中，G2為醯基-C(=O)G3，其中G3係選自烷基(包括環烷基、烯基及炔基)、雜烷基、雜環基及芳基(包括雜芳基及碳芳基(carboaryl))。此等基團可視情況經取代。適當時，醯基連同L3或L2之胺基一起可形成醯胺鍵。適當時，醯基連同L3或L2之羥基一起可形成酯鍵。在一實施例中，G3為雜烷基。雜烷基可包含聚乙二醇。雜烷基可具有鄰近於醯基之雜原子(諸如O或N)，藉此適當時與基團L3或L2中存在之雜原子(當適當時)形成胺基甲酸酯或碳酸酯基團。在一實施例中，G3係選自NH2、NHR及NRR'。較佳地，G3為NRR'。
在一實施例中，G2為以下基團：
其中星號指示連至L3之連接點，n為0至6且G4係選自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'、NH2、NHR、NRR'、NO2及鹵基。對基團OH、SH、NH2及NHR加以保護。在一實施例中，n為1至6，且n較佳為5。
在一實施例中，G4為OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'及NRR'。在一實施例中，G4為OR、SR及NRR'。較佳地，G4係選自OR及NRR'，最佳地，G4為OR。G4最佳為OMe。
在一實施例中，基團G2為：
其中星號指示連至L3之連接點，且n及G4係如上所定義。
在一實施例中，基團G2為：
其中星號指示連至L3之連接點，n為0或1，m為0至50，且G4係選自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'、NH2、NHR、NRR'、NO2及鹵基。在一較佳實施例中，n為1且m為0至10、1至2，較佳為4至8，且最佳為4或8。在另一實施例中，n為1且m為10至50，較佳為20至40。對基團OH、SH、NH2及NHR加以保護。在一實施例中，G4為OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'及NRR'。在一實施例中，G4為OR、SR及NRR'。較佳地，G4係選自OR及NRR'，最佳地，G4為OR。G4較佳為OMe。
在一實施例中，基團G2為：
其中星號指示連至L3之連接點，且n、m及G4係如上所定義。
在一實施例中，基團G2為：
其中n為1-20，m為0-6，且G4係選自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'、NH2、NHR、NRR'、NO2及鹵基。在一實施例中，n為1-10。在另一實施例中，n為10至50，較佳為20至40。在一實施例中，n為1。在一實施例中，m為1。對基團OH、SH、NH2及NHR加以保護。在一實施例中，G4為OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'及NRR'。在一實施例中，G4為OR、SR及NRR'。較佳地，G4係選自OR及NRR'，最佳地，G4為OR。G4較佳為OMe。
在一實施例中，基團G2為：
其中星號指示連至L3之連接點，且n、m及G4係如上所定義。在以上各實施例中，G4可為OH、SH、NH2及NHR。較佳對此等基團加以保護。在一實施例中，OH用Bzl、TBDMS或TBDPS保護。
在一實施例中，SH用Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me或Trt保護。
在一實施例中，NH2或NHR用Boc、Moc、Z-Cl、Fmoc、Z或Alloc保護。在一實施例中，基團G2與基團L3組合存在，該基團L3為二肽。封端基團不意欲與細胞結合劑連接。因此，存在於二聚體中之另一單體充當經由連接子與細胞結合劑之連接點。因此，較佳地，存在於封端基團中之官能基不可用於與細胞結合劑反應。因此，較佳避免諸如OH、SH、NH2、COOH之反應性官能基。然而，若如上所述加以保護，則此官能基可存在於封端基團中。在本發明化合物之製備中，封端基團可用於製備連接子RL。
抗體-藥物共軛物(ADC)化合物之一例示性實施例包含抗體(Ab)及PBD藥物部分(PBD)，其中該抗體經連接部分(L)與PBD連接；組合物具有下式：
Ab-(L-PBD)p
其中p為1至約8之整數，且表示藥物裝載量。若Ab為半胱胺酸經工程改造之抗體，則可經由硫醇反應性連接部分與抗體分子共軛之藥物部分的數目受藉由本文所述之方法引入之半胱胺酸殘基的數目限制。因此，例示性ADC包含具有1、2、3或4個經工程改造之半胱胺酸胺基酸之抗體。
較佳化合物
在一實施例中，共軛物為各單體皆具有C2亞甲基(亦即各R2為=CH2)的二聚體。較佳地，細胞結合劑為抗體。
在另一實施例中，共軛物為各單體皆具有C2芳基(亦即各R2為視情況經取代之C5-20芳基)的二聚體。較佳地，細胞結合劑為抗體。
C2伸烷基
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1及L2係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1、L2及G2係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。
對於以上各化合物，適當時，以下較佳選項可適用：
n為0；
n為1；
RE為H；
RE為RD，其中RD為視情況經取代之烷基；
RE為RD，其中RD為甲基；
CBA為抗體；
CBA為環狀肽；
L1為或包含二肽；
L1為(H2N)-Val-Ala-(CO)或(H2N)-Phe-Lys-(CO)，其中(H2N)及(CO)指示各別N及C端；
L2為對胺基苯亞甲基；
G2係選自Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz及PNZ。
除以上較佳選項外，以下較佳選項亦可適用：
G2為：
其中星號指示連至L1之N端之連接點；A為：
其中星號指示連至L1之N端之連接點，波形線指示連至細胞結合劑之連接點且m為4或8；
A為
其中星號指示連至L1之N端之連接點，波形線指示連至細胞結合劑之連接點，且m為4或8。
在一尤其較佳實施例中，n為1；RE為H；CBA為抗體；L1為(H2N)-Val-Ala-(CO)或(H2N)-Phe-Lys-(CO)，其中(H2N)及(CO)指示各別N及C端；L2為對胺基苯亞甲基；G2為：
其中星號指示連至L1之N端之連接點；且A為
其中星號指示連至L1之N端之連接點，且波形線指示連至細胞結合劑之連接點。
C2芳基
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1及L2係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。Ar1及Ar2可相同或不同。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1、L2及G2係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。在一實施例中，以上各實施例中之Ar1及Ar2各自獨立地選自視情況經取代之苯基、呋喃基、噻吩基及吡啶基。在一實施例中，以上各實施例中之Ar1及Ar2為視情況經取代之苯基。在一實施例中，以上各實施例中之Ar1及Ar2為視情況經取代之噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一實施例中，以上各實施例中之Ar1及Ar2為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何可用之環位置與PBD核心結合。舉例而言，喹啉基可為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。其中，喹啉-3-基及喹啉-6-基可較佳。異喹啉基可為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4-基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。其中，異喹啉-3-基及異喹啉-6-基可較佳。
C2乙烯基在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1及L2係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1、L2及G2係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。
在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，L1係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。在一實施例中，共軛物為以下化合物：
其中CBA為細胞結合劑，諸如抗體或環狀或線性肽，且n為0或1。L1係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。
在一些以上實施例中，RV1及RV2可獨立地選自H、苯基及4-氟苯基。
較佳中間物
本發明亦提供用於製備本文所述之共軛化合物之中間物。
較佳中間物描述如下，且緊密對應於上述較佳共軛物。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中n為0或1，G1、L1及L2係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中G1、L1及L2係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。Ar1及Ar2可相同或不同。
在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中G1、L1及L2係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中n為0或1，L1係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中L1係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中L1係如先前所定義，且RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中n為0或1，L1係如先前所定義，且RE及RE"各自獨立地選自H或RD。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中n為0或1，L1係如先前所定義，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基，且n為0或1。在一實施例中，中間物為以下化合物：
其中L1係如先前所定義，RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置經氟取代)及C5-6雜環基，且n為0或1。RV1及RV2可相同或不同。
取代基
如本文所用之片語「視情況經取代」係關於可未經取代或可經取代之母基團。除非另有說明，否則如本文所用之術語「經取代」係關於具有一或多個取代基之母基團。術語「取代基」在本文中以習知意義使用且係指與母基團共價連接或適當時稠合之化學部分。熟知廣泛多種取代基，且亦熟知其形成及引入多種母基團中之方法。在一較佳實施例中，本文所述之取代基(包括視情況選用之取代基)限於不與細胞結合劑反應之彼等基團。在本發明情況下，與細胞結合劑之連接係由PBD化合物之N10位置經由連接基團(包含例如L1、L2及A)與細胞結合劑連接形成。位於PBD結構之其他部分處之反應性官能基能夠與細胞結合劑形成額外鍵(此可稱為交聯)。此等額外鍵可改變共軛物之轉運及生物活性。因此，在一些實施例中，額外取代基限於缺乏反應性官能基之彼等取代基。在一實施例中，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR'、NO2、鹵基、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR'。
在一實施例中，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR'、NO2、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR'。
在一實施例中，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR'、NO2及鹵基。在一實施例中，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR'及NO2。以上提及之實施例之任一者皆可應用於本文所述之取代基之任一者。或者，取代基可選自一或多個以下所列群組。以下更詳細描述取代基之實例。C1-12烷基：如本文所用之術語「C1-12烷基」係關於藉由自具有1至12個碳原子之烴化合物之碳原子移除氫原子所獲得的單價部分，其可為脂族或脂環，且其可為飽和或不飽和(例如部分不飽和、完全不飽和)。因此，術語「烷基」包括以下論述之子類烯基、炔基、環烷基等。飽和烷基之實例包括(但不限於)甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)及庚基(C7)。飽和直鏈烷基之實例包括(但不限於)甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)及正庚基(C7)。飽和分支鏈烷基之實例包括異丙基(C3)、異丁基(C4)、第二丁基(C4)、第三丁基(C4)、異戊基(C5)及新戊基(C5)。烷基可視情況雜有一或多個選自O、N(H)及S之雜原子。此等基團可稱為「雜烷基」。
C2-20雜烷基：如本文所用之術語「C2-12雜烷基」係關於藉由自具有2至12個碳原子及一或多個雜原子(選自O、N(H)及S，較佳O及S)之烴化合物之碳原子移除氫原子所獲得的單價部分。雜烷基之實例包括(但不限於)包含一或多個-(OCH2CH2)-型乙二醇單元之彼等雜烷基。雜烷基之未端可為初級形式之雜原子，例如OH、-SH或-NH2。在一較佳實施例中，未端為-CH3。C2-12烯基：如本文所用之術語「C2-12烯基」係關於具有一或多個碳碳雙鍵之烷基。不飽和烯基之實例包括(但不限於)：乙烯基(乙烯基，-CH=CH2)、1-丙烯基(-CH=CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH=CH2)、異丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)=CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)及己烯基(C6)。C2-12炔基：如本文所用之術語「C2-12炔基」係關於具有一或多個碳碳參鍵之烷基。不飽和炔基之實例包括(但不限於)乙炔基(-C≡CH)及2-丙炔基(炔丙基，-CH2-C≡CH)。C3-12環烷基：如本文所用之術語「C3-12環烷基」係關於亦為環基之烷基；亦即藉由自環烴(碳環)化合物之脂環族環原子移除氫原子所獲得的單價部分，該部分具有3至7個碳原子，包括3至7個環原子。
環烷基之實例包括(但不限於)衍生自以下之彼等環烷基：
飽和單環烴化合物：
環丙烷(C3)、環丁烷(C4)、環戊烷(C5)、環己烷(C6)、環庚烷(C7)、甲基環丙烷(C4)、二甲基環丙烷(C5)、甲基環丁烷(C5)、二甲基環丁烷(C6)、甲基環戊烷(C6)、二甲基環戊烷(C7)及甲基環己烷(C7)；不飽和單環烴化合物：環丙烯(C3)、環丁烯(C4)、環戊烯(C5)、環己烯(C6)、甲基環丙烯(C4)、二甲基環丙烯(C5)、甲基環丁烯(C5)、二甲基環丁烯(C6)、甲基環戊烯(C6)、二甲基環戊烯(C7)及甲基環己烯(C7)；及飽和多環烴化合物：降蒈烷(norcarane，C7)、降蒎烷(norpinane，C7)、降冰片烷(norbornane，C7)。C3-20雜環基：如本文所用之術語「C3-20雜環基」係關於藉由自雜環化合物之環原子移除氫原子所獲得的單價部分，該部分具有3至20個環原子，其中1至10個環原子為環雜原子。較佳地，各環具有3至7個環原子，其中1至4個環原子為環雜原子。在此情形中，字首(例如C3-20、C3-7、C5-6等)表示環原子(碳原子或雜原子)數或環原子數之範圍。舉例而言，如本文所用之術語「C5-6雜環基」係關於具有5或6個環原子之雜環基。
單環雜環基之實例包括(但不限於)衍生自以下之彼等單環雜環基：
N1：氮雜環丙烷(C3)、氮雜環丁烷(C4)、吡咯啶(四氫吡咯)(C5)、吡咯啉(例如3-吡咯啉、2,5-二氫吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(異吡咯、異唑)(C5)、哌啶(C6)、二氫吡啶(C6)、四氫吡啶(C6)、氮呯(C7)；O1：環氧乙烷(C3)、氧雜環丁烷(C4)、氧雜環戊烷(四氫呋喃)(C5)、氧雜戊環烯(二氫呋喃)(C5)、噁烷(四氫哌喃)(C6)、二氫哌喃(C6)、哌喃(C6)、氧呯(C7)；S1：硫雜環丙烷(C3)、硫雜環丁烷(C4)、硫雜環戊烷(四氫噻吩)(C5)、硫(四氫硫代哌喃)(C6)、硫雜環庚烷(thiepane)(C7)；O2：二氧雜環戊烷(C5)、二噁烷(C6)及二氧雜環庚烷(dioxepane)(C7)；O3：三噁烷(C6)；N2：咪唑啶(C5)、吡唑啶(二唑啶)(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氫吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；N1O1：四氫噁唑(C5)、二氫噁唑(C5)、四氫異噁唑(C5)、二氫異噁唑(C5)、嗎啉(C6)、四氫噁嗪(C6)、二氫噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑啶(C5)、硫代嗎啉(C6)；N2O1：噁二嗪(C6)；O1S1：氧硫唑(C5)及氧硫(噻噁烷)(C6)；及，N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
經取代單環雜環基之實例包括衍生自呈環狀形式之醣的彼等經取代單環雜環基，該等醣例如呋喃醣(C5)，諸如***呋喃醣(arabinofuranose)、呋喃來蘇糖(lyxofuranose)、呋喃核糖及呋喃木糖；以及哌喃醣(C6)，諸如別哌喃醣(allopyranose)、哌喃阿卓糖(altropyranose)、哌喃葡萄糖、哌喃甘露糖、哌喃古洛糖(gulopyranose)、哌喃艾杜糖(idopyranose)、哌喃半乳糖及哌喃塔羅糖(talopyranose)。
C5-20芳基：如本文所用之術語「C5-20芳基」係關於藉由自芳族化合物之芳族環原子移除氫原子所獲得的單價部分，該部分具有3至20個環原子。較佳地，各環具有5至7個環原子。在此情形中，字首(例如C3-20、C5-7、C5-6等)表示環原子(碳原子或雜原子)數或環原子數之範圍。舉例而言，如本文所用之術語「C5-6芳基」係關於具有5或6個環原子之芳基。環原子可皆為如「碳芳基」中之碳原子。碳芳基之實例包括(但不限於)衍生自以下之彼等碳芳基：苯(亦即苯基)(C6)、萘(C10)、薁(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、并四苯(C18)及芘(C16)。包含其中至少一者為芳族環之稠合環之芳基的實例包括(但不限於)衍生自以下之基團：茚滿(例如2,3-二氫-1H-茚)(C9)、茚(C9)、異茚(isoindene)(C9)、四氫萘(1,2,3,4-四氫萘)(C10)、二氫苊(C12)、茀(C13)、丙烯合萘(C13)、乙烯合菲(C15)及乙烯合蒽(C16)。
或者，環原子可包括如「雜芳基」中之一或多個雜原子。單環雜芳基之實例包括(但不限於)衍生自以下之彼等單環雜芳基：
N1：吡咯(唑)(C5)、吡啶(嗪)(C6)；O1：呋喃(氧雜環戊二烯)(C5)；S1：噻吩(吩)(C5)；N1O1：噁唑(C5)、異噁唑(C5)、異噁嗪(C6)；N2O1：噁二唑(呋呫)(C5)；N3O1：噁***(C5)；N1S1：噻唑(C5)、異噻唑(C5)；N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、噠嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；N3：***(C5)、三嗪(C6)；及，N4：四唑(C5)。
包含稠合環之雜芳基之實例包括(但不限於)：衍生自以下之C9(具有2個稠合環)：苯并呋喃(O1)、異苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、異吲哚(N1)、吲哚嗪(N1)、吲哚啉(N1)、異吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如腺嘌呤、鳥嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并異噁唑(N1O1)、苯并間二氧雜環戊烯(O2)、苯并呋呫(N2O1)、苯并***(N3)、苯并硫代呋喃(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；衍生自以下之C10(具有2個稠合環)：烯(O1)、異烯(O1)、色滿(O1)、異色滿(O1)、苯并二噁烷(O2)、喹啉(N1)、異喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹啉(N2)、喹唑啉(N2)、啉(N2)、酞嗪(N2)、啶(N2)、喋啶(N4)；衍生自苯并二氮呯(N2)之C11(具有2個稠合環)；衍生自以下之C13(具有3個稠合環)：咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、呸啶(N2)、吡啶并吲哚(N2)；及，衍生自以下之C14(具有3個稠合環)：吖啶(N1)、(O1)、噻(S1)、二苯并對二噁英(O2)、氧硫雜蒽(O1S1)、吩嗪(N2)、啡噁嗪(N1O1)、啡噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、啡啶(N1)、啡啉(N2)、吩嗪(N2)。
無論單獨或作為另一取代基之一部分之以上基團可本身視情況經一或多個選自本身及以下所列之其他取代基的基團取代。鹵基：-F、-Cl、-Br及-I。羥基：-OH。醚：-OR，其中R為醚取代基，例如C1-7烷基(亦稱為C1-7烷氧基，以下加以論述)、C3-20雜環基(亦稱為C3-20雜環基氧基)或C5-20芳基(亦稱為C5-20芳氧基)，較佳為C1-7烷基。烷氧基：-OR，其中R為烷基，例如C1-7烷基。C1-7烷氧基之實例包括(但不限於)-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(異丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(第二丁氧基)、-O(iBu)(異丁氧基)及-O(tBu)(第三丁氧基)。
縮醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1及R2獨立地為縮醛取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基，或在「環狀」縮醛基之情況下，R1及R2連同其所連接之兩個氧原子及其所連接之碳原子一起形成具有4至8個環原子的雜環。縮醛基之實例包括(但不限於)-CH(OMe)2、-CH(OEt)2及-CH(OMe)(OEt)。半縮醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1為半縮醛取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。半縮醛基之實例包括(但不限於)-CH(OH)(OMe)及-CH(OH)(OEt)。縮酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1及R2係如關於縮醛所定義，且R為除氫以外之縮酮取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。縮酮基之實例包括(但不限於)-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2及-C(Et)(OMe)(OEt)。半縮酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1係如關於半縮醛所定義，且R為除氫以外之半縮酮取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。半縮醛基之實例包括(但不限於)-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)及-C(Et)(OH)(OEt)。側氧基(酮基，-酮)：=O。硫酮：=S。
亞胺基(亞胺)：=NR，其中R為亞胺基取代基，例如氫、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為氫或C1-7烷基。酯基之實例包括(但不限於)=NH、=NMe、=NEt及=NPh。
甲醯基(甲醛)：-C(=O)H。醯基(酮基)：-C(=O)R，其中R為醯基取代基，例如C1-7烷基(亦稱為C1-7烷基醯基或C1-7烷醯基)、C3-20雜環基(亦稱為C3-20雜環基醯基)或C5-20芳基(亦稱為C5-20芳基醯基)，較佳為C1-7烷基。醯基之實例包括(但不限於)-C(=O)CH3(乙醯基)、-C(=O)CH2CH3(丙醯基)、-C(=O)C(CH3)3(第三丁醯基)及-C(=O)Ph(苯甲醯基，苯酮)。羧基(羧酸)：-C(=O)OH。硫羧基(硫代羧酸)：-C(=S)SH。硫S羧基(Thiolocarboxy)(硫S羧酸(thiolocarboxylic acid))：-C(=O)SH。硫O羧基(Thionocarboxy)(硫O羧酸(thionocarboxylic acid))：-C(=S)OH。亞胺酸：-C(=NH)OH。異羥肟酸：-C(=NOH)OH。酯(羧酸酯、氧基羰基)：-C(=O)OR，其中R為酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。酯基之實例包括(但不限於)-C(=O)OCH3、-C(=O)OCH2CH3，-C(=O)OC(CH3)3及-C(=O)OPh。醯氧基(反向酯)：-OC(=O)R，其中R為醯氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。
醯氧基之實例包括(但不限於)-OC(=O)CH3(乙醯氧基)、-OC(=O)CH2CH3、-OC(=O)C(CH3)3、-OC(=O)Ph及-OC(=O)CH2Ph。氧基羰氧基：-OC(=O)OR，其中R為酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。酯基之實例包括(但不限於)-OC(=O)OCH3、-OC(=O)OCH2CH3、-OC(=O)OC(CH3)3及-OC(=O)OPh。胺基：-NR1R2，其中R1及R2獨立地為胺基取代基，例如氫、C1-7烷基(亦稱為C1-7烷基胺基或二-C1-7烷基胺基)、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為H或C1-7烷基；或在「環」胺基之情況下，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成具有4至8個環原子之雜環。胺基可為一級(-NH2)、二級(-NHR1)或三級(-NHR1R2)，且可為呈陽離子形式之四級(-+NR1R2R3)。胺基之實例包括(但不限於)-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2及-NHPh。環胺基之實例包括(但不限於)氮丙啶基、N-環丁烷基、N-吡咯啶基、N-哌啶基、N-哌嗪基、N-嗎啉基及硫代(N-嗎啉基)。醯胺基(胺甲醯基、胺基羰基、羧醯胺)：-C(=O)NR1R2，其中R1及R2獨立地為如關於胺基所定義之胺基取代基。醯胺基之實例包括(但不限於)-C(=O)NH2、-C(=O)NHCH3、-C(=O)N(CH3)2、-C(=O)NHCH2CH3及-C(=O)N(CH2CH3)2，以及R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成雜環結構(例如N-哌啶基羰基、N-嗎啉基羰基、硫代(N-嗎啉基)羰基及N-哌嗪基羰基)的醯胺基。
硫醯胺基(硫代胺甲醯基)：-C(=S)NR1R2，其中R1及R2獨立地為如關於胺基所定義之胺基取代基。醯胺基之實例包括(但不限於)-C(=S)NH2、-C(=S)NHCH3、-C(=S)N(CH3)2及-C(=S)NHCH2CH3。醯胺基(醯基胺基)：-NR1C(=O)R2，其中R1為醯胺取代基，例如氫、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為氫或C1-7烷基，且R2為醯基取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為氫或C1-7烷基。醯胺基之實例包括(但不限於)-NHC(=O)CH3、-NHC(=O)CH2CH3及-NHC(=O)Ph。R1及R2可一起形成例如丁二醯亞胺基、順丁烯二醯亞胺基及鄰苯二甲醯亞胺基之環狀結構：
胺基羰氧基：-OC(=O)NR1R2，其中R1及R2獨立地為如關於胺基所定義之胺基取代基。胺基羰氧基之實例包括(但不限於)-OC(=O)NH2、-OC(=O)NHMe、-OC(=O)NMe2及-OC(=O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2及R3獨立地為如關於胺基所定義之胺基取代基，且R1為脲基取代基，例如氫、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為氫或C1-7烷基。脲基之實例包括(但不限於)-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2及-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(=NH)NH2。
四唑基：具有4個氮原子及1個碳原子之5員芳族環，
亞胺基：=NR，其中R為亞胺基取代基，例如氫、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為H或C1-7烷基。亞胺基之實例包括(但不限於)=NH、=NMe及=NEt。脒(甲脒基)：-C(=NR)NR2，其中各R為脒取代基，例如氫、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為H或C1-7烷基。脒基團之實例包括(但不限於)-C(=NH)NH2、-C(=NH)NMe2及-C(=NMe)NMe2。硝基：-NO2。亞硝基：-NO。疊氮基：-N3。氰基(腈，甲腈)：-CN。異氰基：-NC。氰氧基：-OCN。異氰氧基：-NCO。硫氰基：-SCN。異硫氰基：-NCS。硫氫基(硫醇，巰基)：-SH。
硫醚(硫化物)：-SR，其中R為硫醚取代基，例如C1-7烷基(亦稱為C1-7烷硫基)、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。C1-7烷硫基之實例包括(但不限於)-SCH3及-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R為二硫化物取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基(在本文中亦稱為C1-7烷基二硫化物)。C1-7烷基二硫化物基團之實例包括(但不限於)-SSCH3及-SSCH2CH3。鋶化物(亞磺醯基，亞碸)：-S(=O)R，其中R為鋶化物取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。鋶化物基團之實例包括(但不限於)-S(=O)CH3及-S(=O)CH2CH3。碸(磺醯基)：-S(=O)2R，其中R為碸取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基，包括例如氟化或全氟化C1-7烷基。碸基團之實例包括(但不限於)-S(=O)2CH3(甲烷磺醯基，甲磺醯基)、-S(=O)2CF3(三氟甲磺醯基)、-S(=O)2CH2CH3(乙磺醯基)、-S(=O)2C4F9(九氟丁磺醯基)、-S(=O)2CH2CF3(三氟乙磺醯基)、-S(=O)2CH2CH2NH2(胺乙磺醯基)、-S(=O)2Ph(苯磺醯基)4-甲基苯基磺醯基(甲苯磺醯基)、4-氯苯基磺醯基(對氯苯磺醯基)、4-溴苯基磺醯基(對溴苯磺醯基)、4-硝基苯基(對硝基苯磺醯基)、2-萘磺酸酯(萘磺醯基)及5-二甲胺基-萘-1-基磺酸酯(丹磺醯基)。亞磺酸(亞磺酸基)：-S(=O)OH、-SO2H。磺酸(磺酸基)：-S(=O)2OH、-SO3H。
亞磺酸酯：-S(=O)OR；其中R為亞磺酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。亞磺酸酯基團之實例包括(但不限於)-S(=O)OCH3(甲氧基亞磺醯基；亞磺酸甲酯)及-S(=O)OCH2CH3(乙氧基亞磺醯基；亞磺酸乙酯)。
磺酸酯：-S(=O)2OR，其中R為磺酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。磺酸酯基團之實例包括(但不限於)-S(=O)2OCH3(甲氧基磺醯基；磺酸甲酯)及-S(=O)2OCH2CH3(乙氧基磺醯基；磺酸乙酯)。亞磺醯基氧基：-OS(=O)R，其中R為亞磺醯基氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。亞磺醯基氧基之實例包括(但不限於)-OS(=O)CH3及-OS(=O)CH2CH3。磺醯基氧基：-OS(=O)2R，其中R為磺醯基氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。磺醯基氧基之實例包括(但不限於)-OS(=O)2CH3(甲磺酸酯)及-OS(=O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。硫酸酯：-OS(=O)2R，其中R為硫酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。硫酸酯基團之實例包括(但不限於)-OS(=O)2OCH3及-SO(=O)2OCH2CH3。
胺磺醯基(亞磺酸醯胺；亞磺醯胺)：-S(=O)NR1R2，其中R1及R2獨立地為如關於胺基所定義之胺基取代基。胺磺醯基之實例包括(但不限於)-S(=O)NH2、-S(=O)NH(CH3)、-S(=O)N(CH3)2、-S(=O)NH(CH2CH3)、-S(=O)N(CH2CH3)2及-S(=O)NHPh。
磺醯胺基(胺亞磺醯基；磺酸醯胺；磺醯胺)：-S(=O)2NR1R2，其中R1及R2獨立地為如關於胺基所定義之胺基取代基。磺醯胺基之實例包括(但不限於)-S(=O)2NH2、-S(=O)2NH(CH3)、-S(=O)2N(CH3)2、-S(=O)2NH(CH2CH3)、-S(=O)2N(CH2CH3)2及-S(=O)2NHPh。磺胺基：-NR1S(=O)2OH，其中R1為如關於胺基所定義之胺基取代基。磺胺基之實例包括(但不限於)-NHS(=O)2OH及-N(CH3)S(=O)2OH。磺醯胺基：-NR1S(=O)2R，其中R1為如關於胺基所定義之胺基取代基，且R為磺醯胺基取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。磺醯胺基之實例包括(但不限於)-NHS(=O)2CH3及-N(CH3)S(=O)2C6H5。亞磺醯胺基：-NR1S(=O)R，其中R1為如關於胺基所定義之胺基取代基，且R為亞磺醯胺基取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基。亞磺醯胺基之實例包括(但不限於)-NHS(=O)CH3及-N(CH3)S(=O)C6H5。膦基(膦)：-PR2，其中R為膦基取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基之實例包括(但不限於)-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2及-P(Ph)2。磷醯基：-P(=O)2。
氧膦基(氧化膦)：-P(=O)R2，其中R為氧膦基取代基，例如C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為C1-7烷基或C5-20芳基。氧膦基之實例包括(但不限於)-P(=O)(CH3)2、-P(=O)(CH2CH3)2、-P(=O)(t-Bu)2及-P(=O)(Ph)2。膦酸(膦酸基)：-P(=O)(OH)2。膦酸酯(膦酸基酯)：-P(=O)(OR)2，其中R為膦酸酯取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯基團之實例包括(但不限於)-P(=O)(OCH3)2、-P(=O)(OCH2CH3)2、-P(=O)(O-t-Bu)2及-P(=O)(OPh)2。磷酸(膦醯氧基)：-OP(=O)(OH)2。磷酸酯(膦醯氧基酯)：-OP(=O)(OR)2，其中R為磷酸酯取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基團之實例包括(但不限於)-OP(=O)(OCH3)2、-OP(=O)(OCH2CH3)2、-OP(=O)(O-t-Bu)2及-OP(=O)(OPh)2。亞磷酸：-OP(OH)2。亞磷酸酯：-OP(OR)2，其中R為亞磷酸酯取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亞磷酸酯基團之實例包括(但不限於)-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2及-OP(OPh)2。
胺基磷酸酯：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1及R2為胺基磷酸酯取代基，例如-H、(視情況經取代之)C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為-H、C1-7烷基或C5-20芳基。胺基磷酸酯基團之實例包括(但不限於)-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2及-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
磷醯胺酸：-OP(=O)(OR1)-NR2 2，其中R1及R2為磷醯胺酸取代基，例如-H、(視情況經取代之)C1-7烷基、C3-20雜環基或C5-20芳基，較佳為-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷醯胺酸之實例包括(但不限於)-OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2及-OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
伸烷基
C3-12伸烷基：如本文所用之術語「C3-12伸烷基」係關於藉由自具有3至12個碳原子之烴化合物移除兩個氫原子(其均來自同一碳原子或分別來自兩個不同碳原子)所獲得的雙牙部分(除非另有說明)，其可為脂族或脂環且其可為飽和、部分不飽和或完全不飽和。因此，術語「伸烷基」包括以下論述之子類伸烯基、伸炔基、伸環烷基等。直鏈飽和C3-12伸烷基之實例包括(但不限於)n為3至12之整數之-(CH2)n-，例如-CH2CH2CH2-(伸丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(伸丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(伸戊基)及-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-(伸庚基)。分支鏈飽和C3-12伸烷基之實例包括(但不限於)-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-及-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
直鏈部分不飽和之C3-12伸烷基(C3-12伸烯基及伸炔基)之實例包括(但不限於)-CH=CH-CH2-、-CH2-CH=CH2-、-CH=CH-CH2-CH2-、-CH=CH-CH2-CH2-CH2-、-CH=CH-CH=CH-、-CH=CH-CH=CH-CH2-、-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-、-CH=CH-CH2-CH=CH-、-CH=CH-CH2-CH2-CH=CH-及-CH2-C≡C-CH2-。分支鏈部分不飽和之C3-12伸烷基(C3-12伸烯基及伸炔基)之實例包括(但不限於)-C(CH3)=CH-、-C(CH3)=CH-CH2-、-CH=CH-CH(CH3)-及-C≡C-CH(CH3)-。脂環飽和C3-12伸烷基(C3-12伸環烷基)之實例包括(但不限於)伸環戊基(例如伸環戊-1,3-基)及伸環己基(例如伸環己-1,4-基)。脂環部分不飽和C3-12伸烷基(C3-12伸環烷基)之實例包括(但不限於)伸環戊烯基(例如4-伸環戊烯-1,3-基)、伸環己烯基(例如2-伸環己烯-1,4-基；3-伸環己烯-1,2-基；2,5-伸環己二烯-1,4-基)。包括其他形式除非另有說明，否則以上包括此等取代基之熟知離子、鹽、溶劑合物及經保護形式。舉例而言，提及羧酸(-COOH)亦包括其陰離子(羧酸根)形式(-COO-)、鹽或溶劑合物以及習知之經保護形式。類似地，提及胺基包括胺基之質子化形式(-N+HR1R2)、鹽或溶劑合物(例如鹽酸鹽)以及胺基之習知經保護形式。類似地，提及羥基亦包括其陰離子形式(-O-)、鹽或溶劑合物以及習知經保護形式。
鹽
製備、純化及/或處理活性化合物之相應鹽(例如醫藥學上可接受之鹽)可能適宜或合乎需要。醫藥學上可接受之鹽之實例論述於Berge等人，J. Pharm. Sci.,66,1-19(1977)中。舉例而言，若化合物為陰離子或具有可為陰離子之官能基(例如，-COOH可為-COO-)，則可與適合陽離子形成鹽。適合無機陽離子之實例包括(但不限於)諸如Na+及K+之鹼金屬離子、諸如Ca2+及Mg2+之鹼土金屬陽離子、及諸如Al+3之其他陽離子。適合有機陽離子之實例包括(但不限於)銨離子(亦即NH4 +)及經取代之銨離子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些適合之經取代銨離子之實例為衍生自以下的彼等銨離子：乙胺、二乙胺、二環己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苯甲基胺、苯基苯甲基胺、膽鹼、葡甲胺及緩血酸胺，以及諸如離胺酸及精胺酸之胺基酸。常見四級銨離子之一實例為N(CH3)4 +。若化合物為陽離子，或具有可為陽離子之官能基(例如-NH2可為-NH3 +)，則可與適合陰離子形成鹽。適合無機陰離子之實例包括(但不限於)衍生自以下無機酸之彼等陰離子：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、磷酸及亞磷酸。
適合有機陰離子之實例包括(但不限於)衍生自以下有機酸之彼等有機陰離子：2-乙醯氧基苯甲酸、乙酸、抗壞血、天冬胺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、依地酸(edetic)、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡糖庚酸、葡糖酸、麩胺酸、乙醇酸、羥基順丁烯二酸、羥基萘甲酸、羥乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、順丁烯二酸、蘋果酸、甲烷磺酸、黏液酸、油酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、丁二酸、對胺基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸及戊酸。適合聚合有機陰離子之實例包括(但不限於)衍生自以下聚合酸之彼等有機陰離子：鞣酸(tannic acid)、羧甲基纖維素。
溶劑合物
製備、純化及/或處理活性化合物之相應溶劑合物可能適宜或合乎需要。在本文中以習知意義使用術語「溶劑合物」來指溶質(例如活性化合物、活性化合物之鹽)及溶劑之錯合物。若溶劑為水，則溶劑合物宜稱為水合物，例如單水合物、二水合物、三水合物等。本發明包括溶劑跨越PBD部分之亞胺鍵加成之化合物，其說明如下，其中溶劑為水或醇(RAOH，其中RA為C1-4烷基)：
此等形式可稱為PBD之甲醇胺及甲醇胺醚形式(如以上關於R10之章節中所述)。此等平衡狀態之平衡視化合物存在之條件以及部分本身之性質而定。
此等特定化合物可以固體形式分離，例如藉由凍乾分離。
異構體
某些本發明化合物可以一或多種特定幾何異構、光學異構、對映異構、非對映異構、差向異構、滯轉異構、立體異構、互變異構、構形異構或向差異構形式存在，包括(但不限於)順式(cis-form)及反式(trans-form)；E及Z形式；c、t及r形式；內接及外掛形式；R、S及內消旋形式；D及L形式；d及l形式；(+)及(-)形式；酮、烯醇及烯醇化物形式；順式(syn-form)及反式(anti-form)；順錯及反錯形式；α及β形式；直立及平伏形式；舟式、椅式、扭曲式、信封式及半椅式；及其組合，下文中總稱為「異構體」(或「異構形式」)。術語「對掌性」係指分子具有不可與鏡像搭配物重疊之性質，而術語「非對掌性」係指分子可與其鏡像搭配物重疊。術語「立體異構體」係指具有相同化學組成，但原子或基團在空間中之排列不同的化合物。「非對映異構體」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且分子不為彼此之鏡像的立體異構體。非對映異構體具有不同物理特性，例如熔點、沸點、光譜性質及反應性。非對映異構體之混合物可在高解析度分析程序(諸如電泳及層析)下分離。
「對映異構體」係指化合物之彼此鏡像不可重疊的兩種立體異構體。本文中使用之立體化學定義及規定通常遵循S. P. Parker編，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984) McGraw-Hill Book Company,New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,「Stereochemistry of Organic Compounds」，John Wiley & Sons,Inc.,New York,1994。本發明化合物可含有不對稱或對掌性中心，且因此以不同立體異構形式存在。希望本發明化合物之所有立體異構形式形成本發明之一部分，該等形式包括(但不限於)非對映異構體、對映異構體及滯轉異構體以及其混合物，諸如外消旋混合物。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其能夠旋轉平面偏光之平面。在描述光學活性化合物時，字首D及L，或R及S用於表示分子圍繞其對掌性中心之絕對構型。字首d及1或(+)及(-)用於表示化合物使平面偏光旋轉之符號，其中(-)或1意謂化合物為左旋。具有字首(+)或d之化合物為右旋。對於既定化學結構，此等立體異構體相同，例外為其為彼此之鏡像。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且此等異構體之混合物常稱為對映異構體混合物。對映異構體之50:50混合物稱為外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或過程中尚無立體選擇性或立體特異性時存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋體」係指兩種對映異構物質之等莫耳混合物，其無光學活性。
應注意，除如下文關於互變異構形式所論述之外，如本文所用之術語「異構體」明確排除結構(或構造)異構體(亦即原子之間的連接不同而非僅原子空間位置不同的異構體)。舉例而言，提及甲氧基(-OCH3)不應解釋為提及其結構異構體羥基甲基(-CH2OH)。類似地，提及鄰氯苯基不應解釋為提及其結構異構體間氯苯基。然而，提及某一種類結構可充分包括屬於彼種類之結構異構形式(例如C1-7烷基包括正丙基及異丙基；丁基包括正丁基、異丁基、第二丁基及第三丁基；甲氧基苯基包括鄰甲氧基苯基、間甲氧基苯基及對甲氧基苯基)。
以上排除不涉及互變異構形式(例如酮、烯醇及烯醇化物形式)，例如以下互變異構體對：酮/烯醇(說明如下)、亞胺/烯胺、醯胺/亞胺基醇、脒/脒、亞硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亞硝基/羥基偶氮基、及硝基/酸式硝基(aci-nitro)。
術語「互變異構體」或「互變異構形式」係指具有不同能量之結構異構體，其可經由低能量障壁相互轉化。舉例而言，質子互變異構體(亦稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子遷移而相互轉化，諸如酮-烯醇及亞胺-烯胺異構化。價鍵互變異構體包括藉由一些鍵結電子重組而相互轉化。
應注意，術語「異構體」中特別包括具有一或多個同位素取代之化合物。舉例而言，H可呈任何同位素形式，包括1H、2H(D)及3H(T)；C可呈任何同位素形式，包括12C、13C及14C；O可呈任何同位素形式，包括16O及18O；及其類似物。
可併入本發明化合物中之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟及氯之同位素，諸如(但不限於)2H(氘，D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl及125I。本發明包括各種經同位素標記之本發明化合物，例如其中併入諸如3H、13C及14C之放射性同位素之化合物。此等經同位素標記之化合物可適用於代謝研究、反應動力學研究、偵測或成像技術，諸如正電子發射斷層攝影術(PET)或單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)(包括藥物或受質組織分佈檢定)，或適用於患者之放射性治療。經氘標記或取代之本發明治療化合物可具有關於分佈、代謝及分泌(ADME)之改良的DMPK(藥物代謝及藥物動力學)性質。經諸如氘之重同位素取代可提供某些由較高代謝穩定性產生之治療優點，例如活體內半衰期增加或劑量需求減少。經18F標記之化合物可適用於PET或SPECT研究。本發明之經同位素標記之化合物及其前藥通常可藉由執行下文所述之流程或實例及製備中所揭示的程序、用可易於獲得之經同位素標記之試劑替代未經同位素標記之試劑來製備。另外，用重同位素(尤其氘(亦即2H或D))進行取代可提供某些由較高代謝穩定性產生的治療優點，例如活體內半衰期增加、或劑量需求減少、或治療指數改良。應瞭解在此情形中氘視為取代基。該種重同位素(尤其氘)之濃度可用同位素增濃係數定義。在本發明化合物中，未明確稱為特定同位素之任何原子意欲表示彼原子之任何穩定同位素。
除非另有說明，否則提及特定化合物包括所有此等異構形式，包括其(完全或部分)外消旋混合物及其他混合物。此等異構形式之製備(例如不對成合成)及分離(例如分步結晶及層析手段)方法為此項技術中已知的或易於藉由以已知方式調適本文教示之方法或已知方法而獲得。
生物活性
活體外細胞增殖檢定
一般而言，如下量測抗體-藥物共軛物(ADC)之細胞毒性或細胞生長抑制活性：使含有受體蛋白(例如HER2)之哺乳動物細胞在細胞培養基中暴露於ADC之抗體；培養細胞約6小時至約5天之時期；及量測細胞存活率。基於細胞之活體外檢定用於量測存活率(增殖)、細胞毒性及本發明ADC之細胞凋亡誘導(卡斯蛋白酶(caspase)活化)。
抗體-藥物共軛物之活體外效能可藉由細胞增殖檢定量測。CellTiter-發光細胞存活率檢定為一種基於鞘翅目(Coleoptera)螢光素酶之重組表現的市售(Promega Corp.,Madison,WI)均質檢定方法(美國專利第5583024號；第5674713號及第5700670號)。此細胞增殖檢定基於定量存在之ATP(其為代謝活性細胞之指標)測定培養物中之活細胞數(Crouch等人，(1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88；US 6602677)。CellTiter-檢定於96孔形式中進行，從而使其可經受自動高產量篩檢(HTS)(Cree等人，(1995) AntiCancer Drugs 6:398-404)。均質檢定程序涉及直接向培養於補充有血清之培養基中之細胞中添加單一試劑(CellTiter-試劑)。不需要細胞洗滌、培養基移除及多次吸液步驟。在添加試劑且混合後10分鐘內，系統在384孔形式中偵測少至每孔15個細胞。細胞可用ADC連續處理，或其可經處理且與ADC分離。一般而言，經短暫(亦即3小時)處理之細胞展示與經連續處理之細胞相同的效能效應。
均質「添加-混合-量測」形式導致細胞溶解且產生與ATP之存在量成比例的發光信號。ATP之量與培養物中存在之細胞數成正比。CellTiter-檢定產生由螢光素酶反應所產生之「輝光型(glow-type)」發光信號，視所用細胞類型及培養基而定，其具有一般大於5小時之半衰期。活細胞係以相對發光單位(RLU)反映。受質甲蟲螢光素由重組螢火蟲螢光素酶氧化脫羧，同時ATP轉化成AMP且產生光子。
活體內功效
本發明之抗體-藥物共軛物(ADC)之活體內功效可藉由小鼠腫瘤異種移植物研究量測。舉例而言，本發明抗HER2 ADC之活體內功效可藉由高量表現HER2之轉殖基因外植體小鼠模型量測。同種異體移植物係由對HERCEPTIN療法無反應或反應不良之Fo5 mmtv轉殖基因小鼠繁殖。個體用某些劑量(mg/kg)及PBD藥物暴露量(μg/m2)之ADC；及安慰劑緩衝對照物(媒劑)處理1次且監測2週或2週以上以量測腫瘤加倍之時間、細胞殺傷對數及腫瘤萎縮。
用途
本發明共軛物可用於在目標位置處提供PBD化合物。目標位置較佳為增殖細胞群。抗體為針對存在於增殖細胞群中之抗原的抗體。在一實施例中，抗原不存在，或存在於非增殖細胞群中的量低於存在於增殖細胞群(例如腫瘤細胞群)中之抗原之量。在目標位置處，連接子可分解以便釋放式(D)化合物。因此，共軛物可用於向目標位置選擇性提供式(D)化合物。連接子可由目標位置處存在之酶分解。目標位置可為活體外、活體內或離體目標位置。本發明之抗體-藥物共軛(ADC)化合物包括具有抗癌活性效用之彼等化合物。特定言之，化合物包括抗體藉由連接子與PBD藥物部分(亦即毒素)共軛，亦即共價連接。當藥物不與抗體共軛時，PBD藥物具有細胞毒性效應。因此，PBD藥物部分之生物活性藉由與抗體共軛而得以調節。本發明之抗體-藥物共軛物(ADC)選擇性傳遞有效劑量之細胞毒性劑至腫瘤組織中，藉此可達成較大選擇性，亦即有效劑量較低。因此，在一態樣中，本發明提供如本文所述之用於療法中的共軛化合物。
在另一態樣中，亦提供如本文所述之用於治療增生性疾病之共軛化合物。本發明之第二態樣提供共軛化合物製造用於治療增生性疾病之藥劑的用途。一般技術者輕易能夠確定候選共軛物是否會治療任何特定細胞類型之增生性病狀。舉例而言，宜用於評估由特定化合物提供之活性之檢定描述於以下實例中。術語「增生性疾病」係關於過量或異常細胞之非所要或不受控制的不良細胞增殖，諸如贅生性或增殖性生長，無論活體外或活體內。增生性病狀之實例包括(但不限於)良性、惡性前及惡性細胞增殖，包括(但不限於)贅瘤及腫瘤(例如組織細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小細胞肺癌、胃腸癌、腸癌、結腸癌、乳癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、胰臟癌、腦癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、黑素瘤)、白血病、牛皮癬、骨病、纖維增生性病症(例如結締組織之纖維增生性病症)、及動脈粥樣硬化。特定相關之癌症包括(但不限於)白血病及卵巢癌。可治療任何類型之細胞，包括(但不限於)肺、胃腸(包括例如腸、結腸)、***(乳腺)、卵巢、***、肝、腎、膀胱、胰臟、腦及皮膚。在一實施例中，治療胰臟癌。在一實施例中，治療在細胞表面上具有ανβ6整合素之腫瘤。
預期本發明之抗體-藥物共軛物(ADC)可用於治療各種疾病或病症，例如特徵為過度表現腫瘤抗原之疾病或病症。例示性病狀或過度增生性病症包括良性或惡性腫瘤、白血病、血液學惡性疾病及淋巴惡性疾病。其他病症包括神經元、膠質、星形膠質細胞、下丘腦、腺體、巨噬細胞、上皮、基質、囊胚腔、發炎性、血管生成及免疫(包括自體免疫)病症。一般而言，欲治療之疾病或病症為過度增生性疾病，諸如癌症。本文中欲治療之癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性疾病。此等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、肺腺癌及肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、***癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌以及頭頸癌。
可使用ADC化合物治療之自體免疫疾病包括風濕病學病症(諸如類風濕性關節炎、休格連氏症候群(Sjgren's syndrome)、硬皮病、狼瘡(諸如SLE及狼瘡腎炎)、多發性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、抗磷脂抗體症候群及牛皮癬性關節炎)、骨關節炎、自體免疫胃腸及肝病症(諸如發炎性腸病(例如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病(Crohn's disease))、自體免疫胃炎及惡性貧血、自體免疫肝炎、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)及乳糜瀉(celiac disease))、血管炎(諸如ANCA相關血管炎(包括徹奇-斯全司血管炎(Churg-Strauss vasculitis))、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)及多動脈炎(polyarteriitis))、自體免疫神經病症(諸如多發性硬化症、斜視眼陣攣肌陣攣症候群(opsoclonus myoclonus syndrome)、重症肌無力(myasthenia gravis)、視神經脊髓炎(neuromyelitis optica)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)及自體免疫多發性神經病)、腎病症(諸如絲球體腎炎、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)及伯格氏病(Berger's disease))、自體免疫皮膚病(諸如牛皮癬、蕁麻疹、水痘、尋常天疱瘡(pemphigus vulgaris)、大皰類天疱瘡(bullous pemphigoid)及皮膚紅斑狼瘡)、血液病(諸如血小板減少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、血栓性血小板減少性紫癜、輸血後紫癜(post-transfusion purpura)及自體免疫溶血性貧血)、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自體免疫聽覺疾病(諸如內耳疾病及聽力喪失)、***(Behcet's disease)、雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、器官移植及自體免疫內分泌病症(諸如糖尿病相關之自體免疫疾病(諸如胰島素依賴性糖尿病(IDDM))、艾迪森氏病(Addison's disease)及自體免疫甲狀腺病(例如葛瑞夫茲氏病(Graves'disease)及甲狀腺炎))。更佳之此等疾病包括例如類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎、ANCA相關之血管炎、狼瘡、多發性硬化症、休格連氏症候群、葛瑞夫茲氏病、IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎及絲球體腎炎。
治療方法
本發明共軛物可用於療法中。亦提供治療方法，其包含向需要治療之個體投與治療有效量之本發明共軛化合物。術語「治療有效量」為足以顯示對患者之益處之量。此益處可為至少改善至少1種症狀。投與之實際量及投藥之速率及時程將視所治療之疾病的性質及嚴重性而定。開立治療處方(例如確定劑量)係在一般從業者及其他醫生之職責範圍內。本發明化合物可單獨投與或與其他治療劑組合同時或依序投與，視欲治療之病狀而定。治療及療法之實例包括(但不限於)化學療法(投與活性劑，包括例如藥物，諸如化學治療劑)；手術；及放射療法。「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物，而無論其作用機制如何。化學治療劑之種類包括(但不限於)：烷基化劑、抗代謝物、紡錘體毒物植物鹼、細胞毒性抗生素/抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、抗體、光敏劑及激酶抑制劑。化學治療劑包括「靶向療法」及習知化學療法中使用之化合物。
化學治療劑之實例包括：埃羅替尼(erlotinib)(TARCEVA，Genentech/OSI Pharm.)、多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE，Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS第51-21-8號)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR，Lilly)、PD-0325901(CAS第391210-10-9號，Pfizer)、順鉑(cisplatin)(順二胺二氯鉑(II)，CAS第15663-27-1號)、卡鉑(CAS第41575-94-4號)、太平洋紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN，Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS第85622-93-1號，TEMODAR，TEMODAL，Schering Plough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，NOLVADEX，ISTUBAL，VALODEX)及阿黴素(doxorubicin)(ADRIAMYCIN)、Akti-1/2、HPPD及雷帕黴素(rapamycin)。
化學治療劑之更多實例包括：奧沙利鉑(oxaliplatin)(ELOXATIN，Sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(VELCADE，Millennium Pharm.)、紓癌特(sutent)(SUNITINIB，SU11248，Pfizer)、來曲唑(letrozole)(FEMARA，Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC，Novartis)、XL-518(MeK抑制劑，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制劑，AZD6244，Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147(PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX，AstraZeneca)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)(醛葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus)，RAPAMUNE，Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB，GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(lonafarnib)(SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR，BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(gefitinib)(IRESSA，AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR，CPT-11，Pfizer)、替吡法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM，Johnson & Johnson)、ABRAXANETM(不含十六醇聚氧乙烯醚(Cremophor-free))、太平洋紫杉醇之經白蛋白工程化奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,I1)、凡德他尼(vandetanib)(rINN，ZD6474，ZACTIMA，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU 5271，Sugen)、坦西莫司(temsirolimus)(TORISEL，Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、坎弗醯胺(canfosfamide)(TELCYTA，Telik)、噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN，NEOSAR)；磺酸烷酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及羥甲基三聚氰胺；乙醯精寧(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、氧化二氯甲基二乙胺鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及拉甯司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如刺孢黴素(calicheamicin)、刺孢黴素γ1I、刺孢黴素Ω1(Angew Chem. Intl. Ed. Engl.(1994) 33:183-186)；達內黴素(dynemicin)、達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、胺茴黴素(authramycin)、重氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carubicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophi1in)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、嗎啉基-阿黴素、氰基嗎啉基-阿黴素、2-吡咯啉基-阿黴素及脫氧阿黴素、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如醛葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；乙炔尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；羅尼達寧(lonidainine)；類美登素，諸如美登素及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；噴那美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足葉草酸(podophyllinic acid)；2-乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHSNatural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、黏液黴素A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及胺癸汀(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；***糖苷(arabinoside)(Ara-C)；環磷醯胺；噻替派；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼(vinblastine)；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；卡培他濱(capecitabine)(XELODA，Roche)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。
「化學治療劑」之定義中亦包括：(i)用以調節或抑制對腫瘤之激素作用的抗激素劑，諸如抗***及選擇性***受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(NOLVADEX；檸檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、鹽酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON(檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate))；(ii)抑制調節腎上腺中之***產生之芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE(乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))、AROMASIN(依西美坦(exemestane)，Pfizer)、福米斯坦(formestane)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR(伏氯唑(vorozole))、FEMARA(來曲唑，Novartis)及ARIMIDEX(阿那曲唑(anastrozole)，AstraZeneca)；(iii)抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；(iv)蛋白激酶抑制劑，諸如MEK抑制劑(WO 2007/044515)；(v)脂質激酶抑制劑；(vi)反義寡核苷酸，尤其為抑制異常細胞增殖中所牽涉之信號傳導路徑中之基因表現的彼等反義寡核苷酸，例如PKC-α，Raf及H-Ras，諸如奧利默森(oblimersen)(GENASENSE，Genta Inc.)；(vii)核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑(例如ANGIOZYME)及HER2表現抑制劑；(viii)疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN、LEUVECTIN及VAXID；PROLEUKIN rIL-2；拓撲異構酶1抑制劑，諸如LURTOTECAN；ABARELIX rmRH；(ix)抗血管生成劑，諸如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN，Genentech)；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。
「化學治療劑」之定義中亦包括治療性抗體，諸如阿侖單抗(alemtuzumab)(卡普斯(Campath))、貝伐單抗(AVASTIN，Genentech)；西妥昔單抗(ERBITUX，Imclone)；盤尼圖單抗(VECTIBIX，Amgen)、利妥昔單抗(RITUXAN，Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠單抗(pertuzumab)(OMNITARGTM，2C4，Genentech)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN，Genentech)、托西莫單抗(tositumomab)(貝克佐(Bexxar)，Corixia)及抗體藥物共軛物吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(MYLOTARG，Wyeth)。
具有作為與本發明共軛物組合之化學治療劑之治療潛力的人類化單株抗體包括：阿侖單抗、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿塞珠單抗(aselizumab)、阿利珠單抗(atlizumab)、巴平新珠單抗(bapineuzumab)、貝伐單抗、比伐珠單抗美坦辛(bivatuzumab mertansine)、坎妥珠單抗美坦辛(cantuzumab mertansine)、西利珠單抗(cedelizumab)、聚乙二醇化塞妥珠單抗(certolizumab pegol)、西弗絲妥珠單抗(cidfusituzumab)、西地妥珠單抗(cidtuzumab)、達利珠單抗(daclizumab)、艾庫組單抗(eculizumab)、依法珠單抗(efalizumab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、厄利珠單抗(erlizumab)、泛維珠單抗(felvizumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、吉妥珠單抗奧唑米星、伊諾妥珠單抗奧唑米星(inotuzumab ozogamicin)、吡利牡單抗(ipilimumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊利珠單抗(mepolizumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、莫托珠單抗(motovizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、諾維珠單抗(nolovizumab)、努維珠單抗(numavizumab)、奧卡利珠單抗(ocrelizumab)、奧馬佐單抗(omalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕考珠單抗(pascolizumab)、派弗西妥珠單抗(pecfuSituzumab)、派妥珠單抗(pectuzumab)、帕妥珠單抗、培克珠單抗(pexelizumab)、來利珠單抗(ralivizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、來絲利維珠單抗(reslivizumab)、來絲利珠單抗(reslizumab)、來西維珠單抗(resyvizumab)、羅維珠單抗(rovelizumab)、盧利珠單抗(ruplizumab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、希普利珠單抗(siplizumab)、索土珠單抗(sontuzumab)、他珠單抗四西坦(tacatuzumab tetraxetan)、他西珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗(talizumab)、特菲巴珠單抗(tefibazumab)、托珠單抗(tocilizumab)、托利珠單抗(toralizumab)、曲妥珠單抗、土考妥珠單抗西莫白介素(tucotuzumab celmoleukin)、土庫西妥珠單抗(tucusituzumab)、恩維珠單抗(umavizumab)、烏珠單抗(urtoxazumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
除活性成分(亦即共軛化合物)外，根據本發明且根據本發明使用之醫藥組合物亦可包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知之其他物質。此等物質應無毒且不應干擾活性成分之功效。載劑或其他物質之準確性質將視投藥途徑而定，其可為口服或藉由注射(例如皮膚、皮下或靜脈內注射)達成。用於經口投藥之醫藥組合物可呈錠劑、膠囊劑、散劑或液體形式。錠劑可包含固體載劑或佐劑。液體醫藥組合物通常包含液體載劑，諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可包括生理鹽水溶液、右旋糖或其他醣溶液或二元醇，諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。膠囊劑可包含固體載劑，諸如明膠。對於靜脈內、皮膚或皮下注射或在罹患部位處之注射，活性成分將呈無熱原質且具有適合pH值、等張性及穩定性之非經腸可接受之水溶液形式。彼等相關技術者完全能夠使用例如等張媒劑(諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's Injection)、乳酸鹽林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection))製備適合溶液。必要時可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。
調配物
儘管有可能單獨使用(例如投與)共軛化合物，但常較佳以組合物或調配物形式提供該共軛化合物。
在一實施例中，組合物為包含如本文所述之共軛化合物以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物(例如調配物、製劑、藥劑)。
在一實施例中，組合物為醫藥組合物，其包含至少一種如本文所述之共軛化合物以及一或多種為熟習此項技術者熟知之其他醫藥學上可接受之成分，包括(但不限於)醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑、填充劑、緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑、滑潤劑、穩定劑、增溶劑、界面活性劑(例如濕潤劑)、掩蔽劑、著色劑、調味劑及甜味劑。在一實施例中，組合物另外包含其他活性劑，例如其他治療性或預防性藥劑。適合載劑、稀釋劑、賦形劑等可見於標準醫藥教科書中。參見例如Handbook of Pharmaceutical Additives，第2版(M. Ash及I. Ash編),2001(Synapse Information Resources,Inc.,Endicott,New York,USA)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第20版，pub. Lippincott,Williams & Wilkins,2000；及Handbook of Pharmaceutical Excipients，第2版，1994。本發明之另一態樣係關於製備醫藥組合物之方法，其包含混合至少一種如本文中定義之經[11C]放射性標記之共軛物或共軛物樣化合物以及一或多種熟習此項技術者熟知之其他醫藥學上可接受之成分，例如載劑、稀釋劑、賦形劑等。若調配成個別單元(例如錠劑等)，則各單元含有預定量(劑量)之活性化合物。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受」係關於在合理醫學判斷之範疇內適用於與所討論個體(例如人類)之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症且與合理效益/風險比相稱的化合物、成分、物質、組合物、劑型等。各載劑、稀釋劑、賦形劑等在與調配物之其他成分相容之意義上亦必須為「可接受」。
調配物可藉由製藥技術中熟知之任何方法製備。此等方法包括使活性化合物與構成一或多種輔助成分之載劑合併的步驟。一般而言，藉由使活性化合物與載劑(例如液體載劑、細粉狀固體載劑等)均勻且緊密合併，且接著必要時，使產物成形來製備調配物。可製備調配物以提供快速或緩慢釋放；即刻、延遲、定時或持續釋放；或其組合。
適於非經腸投藥(例如藉由注射)之調配物包括水性或非水性等張無熱原質無菌液體(例如溶液、懸浮液)，其中溶解有、懸浮有或以其他方式提供(例如含於脂質體或其他微粒中)活性成分。此等液體可另外含有其他醫藥學上可接受之成分，諸如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑及致使調配物與預定接受者之血液(或其他相關體液)等張之溶質。賦形劑之實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油及其類似物。適用於此等調配物中之等張載劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液或乳酸鹽林格氏注射液。通常，液體中之活性成分之濃度為約1 ng/ml至約10 μg/ml，例如約10 ng/ml至約1 μg/ml。調配物可提供於單位劑量或多劑量密封容器(例如安瓿及小瓶)中，且可以冷凍乾燥(凍乾)狀態儲存，從而僅需在使用前即刻添加無菌液體載劑(例如注射用水)。臨時注射溶液及懸浮液可自無菌散劑、顆粒劑及錠劑製備。
劑量
熟習此項技術者應瞭解共軛化合物及包含共軛化合物之組合物之適當劑量可因患者不同而不同。確定最佳劑量通常將涉及相對於任何風險或有害副作用來平衡治療益處之程度。所選劑量將視多種因素而定，該等因素包括(但不限於)特定化合物之活性、投藥途徑、投藥時間、化合物之分泌速率、治療之持續時間、組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、病狀之嚴重性、及患者之人種、性別、年齡、體重、狀況、總體健康及先前病史。化合物之用量及投藥途徑最終將由醫師、獸醫或臨床醫師決定，但一般而言，劑量將經選擇以在作用部位處達成可獲得所要效應而不引起實質性有害或不利副作用的局部濃度。在整個治療過程期間，投藥可以單劑量形式連續或間歇地(例如在適當間隔下分次給藥)實現。確定最有效之投藥手段及劑量之方法為熟習此項技術者所熟知且將隨用於療法之調配物、療法之目的、所治療之目標細胞及所治療之個體而變化。可以治療醫師、獸醫或臨床醫師選擇之劑量及樣式進行單次或多次投藥。
一般而言，活性化合物之適合劑量在每天每公斤體重之個體約100 ng至約25 mg(更通常約1 μg至約10 mg)的範圍內。當活性化合物為鹽、酯、醯胺、前藥或其類似物時，投藥量係基於母體化合物加以計算，因此實際使用重量成比例增加。
在一實施例中，根據以下劑量方案向人類患者投與活性化合物：約100 mg，每日3次。在一實施例中，根據以下劑量方案向人類患者投與活性化合物：約150 mg，每日2次。在一實施例中，根據以下劑量方案向人類患者投與活性化合物：約200 mg，每日2次。然而，在一實施例中，根據以下劑量方案向人類患者投與共軛化合物：約50或約75 mg，每日3或4次。在一實施例中，根據以下劑量方案向人類患者投與共軛化合物：約100或約125 mg，每日2次。上述劑量可適用於共軛物(包括PBD部分及連接子與抗體)或適用作所提供之PBD化合物之有效量，例如可在連接子分解之後釋放之化合物的量。
對於預防或治療疾病，本發明ADC之適當劑量將視以下因素而定：如上定義之欲治療之疾病類型、疾病嚴重性及過程、分子出於預防目的抑或治療目的投與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應、及主治醫師之判斷。分子宜一次性或歷經一系列治療投與患者。視疾病之類型及嚴重性而定，無論例如藉由一或多次各別投藥或藉由連續輸注，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1-20 mg/kg)之分子為投與患者之初始候選劑量。典型每日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍內，視以上提及之因素而定。欲向患者投與之ADC之例示性劑量在每公斤患者體重約0.1至約10 mg之範圍內。對於歷時數天或更長時間之重複投藥，視病狀而定，持續治療直至疾病症狀出現所要抑制。一種例示性給藥方案包含以下過程：投與約4 mg/kg之起始劑量，隨後每週、每兩週、或每三週投與其他劑量之ADC。其他給藥方案可能適用。此療法之進展容易藉由習知技術及檢定加以監測。
治療
如本文在治療病狀之情形下使用之術語「治療」大體上係關於無論人類或動物(例如在獸醫學應用中)之治療及療法，其中達成某一所要治療效應，例如抑制病狀進展，且包括進展速率降低、進展速率停止、病狀消退、病狀改善及病狀治癒。亦包括作為預防措施(亦即防病、預防)之治療。如本文所用之術語「治療有效量」係關於當根據所要治療方案投與時，活性化合物或包含活性化合物之物質、組合物或劑型有效產生某一所要治療效應、與合理效益/風險比相稱的彼量。類似地，如本文所用之術語「預防有效量」係關於當根據所要治療方案投與時，活性化合物或包含活性化合物之物質、組合物或劑型有效產生某一所要預防效應、與合理效益/風險比相稱的彼量。
製備抗體藥物共軛物
抗體藥物共軛物可藉由採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑的若干途徑製備，包括：(1)使抗體之親核基團或親電子基團與二價連接試劑反應以經由共價鍵形成抗體-連接子中間物Ab-L，隨後與活化藥物部分試劑反應；及(2)使藥物部分試劑與連接試劑反應以經由共價鍵形成藥物-連接試劑D-L，隨後與抗體之親核基團或親電子基團反應。共軛方法(1)及(2)可配合多種抗體及連接子使用以製備本發明之抗體-藥物共軛物。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺、硫醇及羥基具有親核性且能夠反應以與連接部分及連接試劑上之親電子基團形成共價鍵：該等親電子基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原之鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(克萊蘭氏試劑(Cleland's reagent)，二硫蘇糖醇)或TCEP(參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽；Getz等人，(1999) Anal. Biochem.第273:73-80卷；Soltec Ventures,Beverly,MA)之還原劑進行處理來使抗體具有反應性以達成與連接試劑共軛。因此，理論上每個半胱胺酸二硫橋鍵將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷(特勞特氏試劑)之反應使胺轉化成硫醇而將其他親核基團引入抗體中。
抗體-藥物共軛物亦可藉由修飾抗體以引入可與連接試劑上之親核取代基反應之親電子部分產生。可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化糖基化抗體之糖以形成可與連接試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如經硼氫化物試劑還原以形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可產生蛋白質中之可與藥物上之適當基團反應的羰基(醛及酮)(Hermanson,G.T.(1996) Bioconjugate Techniques;Academic Press: New York，第234-242頁)。在另一實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛以替代第一胺基酸(Geoghegan & Stroh,(1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。此醛可與藥物部分或連接子親核體反應。
同樣，藥物部分上之親核基團包括(但不限於)：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫縮胺基脲、羧酸肼及芳基醯肼基團，其能夠與連接部分及連接試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。可藉由標準官能基相互轉化在蒽環黴素衍生化合物上引入反應性親核基團。舉例而言，羥基可藉由光延(Mitsunobu)型反應轉化成硫醇基以形成經硫醇修飾之藥物化合物。
個體 / 患者
個體/患者可為動物、哺乳動物、有胎盤之哺乳動物、有袋動物(例如袋鼠、袋熊)、單孔類動物(例如鴨嘴獸)、齧齒動物(例如天竺鼠、倉鼠、大鼠、小鼠)、鼠類(例如小鼠)、兔類動物(例如兔)、禽類(例如鳥)、犬科動物(例如犬)、貓科動物(例如貓)、馬科動物(例如馬)、豬科動物(例如豬)、綿羊科動物(例如綿羊)、牛科動物(例如母牛)、靈長類動物、猴類動物(例如猴或猿)、猴(例如狨猿、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、長臂猿)或人類。此外，個體/患者可為任何其發育形式，例如胎兒。在一較佳實施例中，個體/患者為人類。在一實施例中，患者為群體，其中各患者具有在細胞表面上具有α v β6整合素之腫瘤。
合成
在一實施例中，式VIII之二聚體共軛物可如流程1中所示自之化合物I及II製備。
一般而言，不對稱二聚體可藉由用1當量之市售(或易於製備)之氯甲酸酯試劑處理式IV之雙胺基化合物以破壞分子之對稱性加以製備。其餘游離胺可接著獨立地經官能基化以引入所需治療上不穩定的前基團(RL)。使PBD B環閉合、移除保護基及封端基團及引入抗體連接性官能基(例如G1)之其他官能基操作會產生目標分子。
式IV化合物通常藉由使經適合官能基化之C環片段(I)與式II之含有A環之二聚體核心偶合加以製備。C環片段可自已知經胺基甲酸酯保護之4-側氧基脯胺酸甲酯構築嵌段製備。在維蒂希(Wittig)或霍納爾-埃蒙斯(Horner-Emmons)條件下之烯化可用於提供內不飽和烯或外不飽和烯。或者，串聯三氟甲磺醯化及鈴木偶合反應可用於獲得經4-芳基取代之3,4或4,5-不飽和C環片段。C環及A環片段可在標準條件下在三乙胺存在下，使用A環片段之酸氯化物衍生物進行偶合以產生式III分子。第III型化合物可在不影響內或外C環不飽和度之情況下用鋅於乙酸中還原以產生式IV分子。
第VI型不對稱胺基甲酸酯可藉由用一當量之市售(或易於製備)之氯甲酸酯在吡啶或三乙胺存在下處理第IV型雙胺加以製備。氯甲酸酯可經選擇以產生位於前基團(RL)中所用之封端單元鄰位或同位之胺基甲酸酯封端單元(RC)。同位胺基甲酸酯允許同時移除兩種保護基，從而節省合成步驟。然而，移除封端胺基甲酸酯(RC)需要在敏感性N10-C11亞胺或甲醇胺部分存在下進行抗體連接性官能基之加成。必要時，此情形可藉由使用允許抗體連接性部分加成、同時保持N10-C11甲醇胺部分之被保護狀態之鄰位胺基甲酸酯保護基來避免。在此策略中，N10-C11部分必須在抗體連接性部分存在下加以暴露且所用試劑必須與此部分相容。舉例而言，若N10-C11亞胺欲在順丁烯二醯亞胺基團存在下暴露，則Troc及Teoc為適合的RC基團，因為脫除保護基之試劑Cd/Pb對及TBAF不應影響順丁烯二醯亞胺基團。另一方面，應避免Alloc基團，因為諸如吡咯啶之π-烯丙基清除劑可以1,4-方式與順丁烯二醯亞胺基團加成。RL胺基甲酸酯可藉由將其餘胺基轉化成異氰酸酯且用RL醇將其淬滅來引入。或者，RL醇可轉化成氯甲酸酯或功能等效物(氟甲酸酯、對硝基碳酸酯、五氟碳酸酯或羥基苯并***碳酸酯)。最終，其餘胺基可轉化成反應性對硝基胺基甲酸酯、五氟胺基甲酸酯或羥基苯并***胺基甲酸酯，其可經RL醇置換而產生式VI分子。
式VII分子可藉由用碳酸鉀在甲醇水溶液中，或在RL中之Fmoc基團存在下用三乙基硼氫化鋰移除乙酸酯保護基而自式VI分子製備。用戴斯-馬丁(Dess-Martin)高碘烷(或者TPAP/NMO、PDC或在斯文(Swern)條件下)進行氧化會產生閉環產物。式V共軛物可藉由移除封端基團RC、加工RL以包括可在標準條件下與細胞結合劑(諸如抗體)共軛之抗體連接性部分(例如順丁烯二醯亞胺己醯基)而自式VII分子製備(參見Dubowchik等人，Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869)。RL之加工可包括延伸基團以包括間隔子元件(諸如基團G1)之步驟，該間隔子元件可接著用於連接細胞結合劑(藉此形成基團A)。單體化合物及對稱二聚體可以類似於如上所述之不對稱二聚體的方式製備。在另一實施例中，式XVIII之共軛物可如流程2中所示自化合物IX製備。
化合物II
式(II)化合物之合成描述於本申請人之較早申請案WO 2006/111759中且亦由Gregson等人(J. Med. Chem. 2001,44,1161-1174)描述。如其中所述之化合物(II)之製備以引用的方式明確併入本文中。化合物(IIa)具有3個碳連接子。化合物(IIb)具有5個碳連接子。
在此流程中，基團R2為C5-20芳基。式IX化合物描述於WO 2004/043963中。
式X化合物可由式IX化合物使用例如TCCA及TEMPO；BAIB及TEMPO；TPAP；戴斯-馬丁條件；或斯文條件氧化而合成。
式IX化合物可由以下適當式B與式C化合物或其活化衍生物偶合而合成：
式B及式C化合物通常可購得或可易於合成。若化合物B為二聚體，則此可如WO 00/12508中所述加以合成。式XI化合物可自式X化合物以如下方法製備：包含在-35℃或低於-35℃之溫度下，在惰性氛圍下，於無水有機溶劑中用適當酸酐及無水2,6-二甲基吡啶或無水2,6-tBu-吡啶處理X。XI實質上不含具有C1-C2雙鍵之化合物。應注意，具有C1-C2雙鍵之化合物之製備由Kang等人，Chem. Commun.,2003,1680-1689描述。式XI化合物可轉化成式XII化合物。轉化(鈴木偶合)係藉由XI與適當芳基硼衍生物之鈀催化交叉偶合來進行。鈀催化劑可為任何適合催化劑，例如Pd(PPh3)4、Pd(OCOCH3)2、PdCl2、Pd(dba)3。
式XII化合物可經由化合物XIII轉化成式XIV化合物。轉化係藉由首先使酯還原且以乙酸酯(或在一替代方法中，為矽烷基醚)形式再保護來達成。還原可藉由標準手段，例如用LiAlH4或NaBH4達成。以乙酸酯形式再保護可例如藉由與乙醯氯反應達成(以矽烷基醚形式再保護可例如藉由與適當矽烷基氯化物反應達成)。接著使用例如鋅於乙酸中進行硝基之還原。
式XIV化合物可轉化成式XV化合物。此轉化通常藉由使XIV與三光氣反應以獲得異氰酸酯，隨後與RL-OH反應來達成。此方法描述於WO 2005/023814中。或者，亦可以氯甲酸酯、氟甲酸酯或疊氮甲酸酯形式引入簡單氮保護基。更複雜之氮保護基以及簡單氮保護基可以O-丁二醯胺碳酸酯、碳酸O-五氟苯酯及碳酸O-硝基苯酯形式引入。XV轉化成XVII可藉由初始用碳酸鉀之甲醇水溶液或用三乙基硼氫化鋰移除乙酸酯保護基來達成。用戴斯-馬丁高碘烷(或者TPAP/NMO、TFAA/DMSO、SO3.吡啶錯合物/DMSO、PDC、PCC、BAIB/TEMPO或在斯文條件下)氧化產生閉環產物。若使用矽烷基醚替代乙酸酯，則XV轉化成XVII可藉由初始例如使用TBAF之THF溶液、乙酸之THF水溶液、CsF之DMF溶液或HF之吡啶溶液移除矽烷基醚保護基，隨後如上所述進行氧化來達成。化合物XVIII接著與細胞結合劑連接。XVII至XVIII之步驟順序視RL之性質而定。此基團可經修飾，且接著與細胞結合劑連接以形成本發明共軛物。舉例而言，可移除封端保護基以提供適於與細胞結合劑反應之官能基。在其他步驟中，此相同官能基可用於與另一間隔子元件(諸如基團G1)連接，且彼間隔子元件可接著又與細胞結合劑連接(藉此形成基團A)。
在本發明之一些實施例中，提供式A-I化合物，包括式A-A及式A-B化合物。此類型之化合物可使用與WO 2010/091150中所述類似的方法製備。WO 2010/091150中描述之中間化合物亦可用於上述方法中。舉例而言，展示於段落[164]中之二聚體化合物(15)可用作以上流程I中之化合物(III)。該類型之單體化合物展示為化合物(3)、(6)及(9)。此及其他改適形式將為熟習此項技術者顯而易知。
較佳合成
在一實施例中，共軛物為化合物14，且如流程3中所示加以製備。二肽7a,b及8係如以下實驗章節中所述加以製備。在彼流程中，連接部分L1及L2具有以下結構：
二肽對應於L2之化合物13c可藉由類似方法自12c製備。
在一實施例中，共軛物為化合物16a或16b，且該化合物係如以下流程4中所示加以製備，其中化合物12a可如上所述加以製備：
本發明現參考以下非限定性實例進一步描述。熟習此項技術者將根據此等實例想到本發明之其他實施例。
本文中引用之所有參考文獻之揭示內容因其可由熟習此項技術者用於實施本發明，所以其以交叉引用的方式明確併入本文中。
實驗
一般資訊
藉由使用Merck Kieselgel 60 F254矽膠進行薄層層析(TLC)(在鋁板上具有螢光指示劑)來監測反應進展。除非另有陳述，否則用紫外光或碘蒸汽達成TLC之目測。使用Merck Kieselgel 60 F254矽膠進行急驟層析。自Fisher Scientific,U.K購買萃取及層析溶劑且不經進一步純化即使用。所有化學品皆購自Aldrich,Lancaster或BDH。
LC/MS條件如下：使用水(A)(0.1%甲酸)及乙腈(B)(0.1%甲酸)之移動相操作HPLC(Waters Alliance 2695)。梯度：初始組成5% B，歷時1.0分鐘，接著在3分鐘內自5% B至95% B。組成在95% B下保持0.5分鐘，且接著在0.3分鐘內恢復為5% B。總梯度操作時間等於5分鐘。流速3.0 mL/min，經由零怠體積T形接頭(tee piece)分配400 μL通入質譜儀中。波長偵測範圍：220至400 nm。功能類型：二極體陣列(535掃描)。管柱： Onyx Monolithic C18 50×4.60 mm。
使用以下半製備性HPLC方法：在具有以下尺寸之Zorbax Eclipse XDB C-18管柱上進行逆相高效液相層析(HPLC)：150×4.6 mm用於分析，及250×9.4 mm用於製備性操作。所有HPLC實驗皆用以下梯度條件進行：初始固定組成5% B至50% B，歷時20分鐘，在50% B下保持5分鐘，接著在2分鐘內自50% B至100% B，在100% B下保持3分鐘，在2分鐘內恢復為5% B且保持3分鐘。梯度操作之總持續時間為35分鐘。所用溶離劑為溶劑A(含有0.02% TFA之H2O)及溶劑B(含有0.02% TFA之CH3CN)。所用流速對於分析而言為1.20 ml/min，且對於製備性HPLC而言為5.00 ml/min。化合物2-氯化(S)-2-(甲氧基羰基)-4-亞甲基吡咯啶鎓化合物2亦在WO 2007/085930中描述用於製備PBD化合物。
化合物2可如WO 2007/085930中所述自反4-羥基-脯胺酸製備，該專利以引用的方式併入本文中。特定言之，描述製備化合物2之TFA鹽之實例13尤其相關。
或者，化合物2可如下所述自化合物1製備。
( S )-4-亞甲基吡咯啶-1,2-二甲酸1-第三丁酯2-甲酯
添加碳酸鉀(19.92 g，14 mmol，3當量)至化合物1(10.92 g，48 mmol，1當量)於DMF(270 mL)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌所得白色懸浮液30分鐘，此時添加碘甲烷(21.48 g/9.5 mL，151 mmol，3.15當量)。反應混合物在室溫下攪拌3天。藉由在減壓下旋轉蒸發移除DMF，產生黃色殘餘物，分配於乙酸乙酯與水之間。分離有機層且水相用乙酸乙酯萃取。合併之有機層用水、鹽水洗滌且經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除乙酸乙酯，產生呈黃色油狀之粗產物。粗產物藉由急驟層析[85%正己烷/15%乙酸乙酯]純化，產生呈無色油狀之產物(亦參見F Manfr等人，J. Org. Chem. 1992,57,2060-2065)。
氯化(S)-2-(甲氧基羰基)-4-亞甲基吡咯啶鎓
在室溫下，添加鹽酸之二噁烷溶液(4 M，63 mL，254.4 mmol，4.5當量)至(S)-4-亞甲基吡咯啶-1,2-二甲酸1-第三丁酯2-甲酯(13.67 g，56.6 mmol，1當量)中。觀測到起泡，指示CO2釋放及Boc基團移除。產物以白色固體形式沈澱且添加額外二噁烷以促進攪拌，且反應混合物攪拌1小時並接著用***稀釋。藉由真空過濾收集沈澱產物且用額外***洗滌。風乾產生呈白色粉末狀之所要產物2(9.42 g，94%)(亦參見P Herdwijn等人，Canadian Journal of Chemistry. 1982,60,2903-7)。
化合物 3
化合物3可如WO 2006/111759及Gregson等人中所述加以製備。
化合物 4
化合物4可自化合物3及化合物2製備。
在室溫下，添加催化量之無水DMF(0.5 mL)至乙二醯氯(9.1 g，6.25 mL，71.7 mmol，3當量)及化合物3(11.82 g，23.9 mmol，1當量)於無水DCM(180 mL)中之經攪拌懸浮液中。在添加DMF之後觀測到劇烈起泡且反應混合物於配備有氯化鈣乾燥管之圓底燒瓶中攪拌18小時。所得澄清溶液在減壓下蒸發且固體用***濕磨。藉由真空過濾收集固體產物，用額外***洗滌且在40℃下在真空中乾燥1.5小時。接著逐份添加此固體至化合物2(9.35 g，52.6 mmol，2.2當量)於TEA(12.08 g，119.6 mmol，5當量)及無水DCM(110 mL)中之懸浮液中，藉助於乾冰/乙腈浴維持溫度在-40與-50℃之間。反應混合物在-40℃下攪拌1小時且接著使其升溫至室溫，此時LCMS指示起始物質完全消耗。反應混合物用額外DCM稀釋且依序用鹽酸水溶液(1 M，2×200 mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×250 mL)、水(250 mL)、鹽水(250 mL)洗滌，經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除DCM，產生呈黃色泡沫狀之產物(13.94 g，79%)。分析資料：RT 3.95 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 741([M+1]+,100)。
化合物 5
化合物5可經由雙醇及雙乙酸酯以3步自化合物4製備。
雙醇
在0℃(冰浴)下在氮氣氛圍下，固體硼氫化鋰(0.093 g，4.3 mmol，3當量)以1份添加至酯4(1.05 g，142 mmol，1當量)於無水THF(10 mL)中之溶液中。使反應混合物在0℃下攪拌30分鐘且接著使其升溫至室溫，此時觀測到橙色膠狀沈澱物。反應混合物在室溫下再攪拌2小時且接著於冰浴中冷卻並用水(20 mL)處理，產生黃色懸浮液。小心添加鹽酸(1 M)(劇烈起泡！)直至起泡停止。反應混合物用乙酸乙酯(4×50 mL)萃取且合併之有機層用水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除乙酸乙酯，產生呈黃色泡沫狀之雙醇產物(0.96 g，99%)。在12.4 g規模上重複反應，產生11.06 g產物(96%)。分析資料：RT 3.37 min;MS(ES+) m/z(相對強度)685([M+1]+,100)。
雙乙酸酯
在0℃下在氮氣氛圍下，乙醯氯(3.4 g/3.1 mL，43.5 mmol，2.6當量)於無水DCM(100 mL)中之溶液逐滴添加至雙醇(11.46 g，16.73 mmol，1當量)及三乙胺(5.07 g，6.98 mL，50.2 mmol，3當量)於無水DCM(200 mL)中之經攪拌溶液中。使反應混合物升溫至室溫且繼續攪拌1小時。TLC及LCMS顯示完全反應。反應混合物用鹽水(200 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除DCM產生粗產物。急驟層析[20%正己烷/80%乙酸乙酯至10%正己烷/90%乙酸乙酯梯度溶離]提供呈黃色泡沫狀之純雙乙酸酯(10.8 g，84%)。分析資料：RT 3.35 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 769([M+1]+,100)。
化合物 5
添加鋅粉(14.2 g，2.17 mmol，30當量)至雙乙酸酯(5.56 g，7.24 mmol，1當量)於乙醇(250 mL)及乙酸(65 mL)中之溶液中。經攪拌之反應混合物在回流下加熱，伴有黃色溶液變為無色(亦觀測到鋅聚集，此使得難以攪拌反應物)。繼續反應1小時，此時LCMS指示完全反應。使反應混合物冷卻，經矽藻土過濾且濾墊用DCM洗滌。濾液用水(3×500 mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×250 mL)、鹽水(500 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。在減壓下旋轉蒸發，產生呈灰白色泡沫狀之產物5(4.71 g，92%)。分析資料：RT 3.33 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 709([M+1]+,100)。
化合物 6
化合物6可自化合物5以3步製備。
單Alloc產物
在-78℃(乾冰/丙酮浴)下，氯甲酸烯丙酯(0.634 g/0.56 mL，5.6 mmol，0.9當量)於無水DCM(150 mL)中之溶液逐滴添加至化合物5(4.145 g，5.8 mmol，1當量)及吡啶(0.106 g/0.11 mL，11.1 mmol，1.9當量)於無水DCM(500 mL)中之溶液中。在-78℃下攪拌反應混合物1小時且接著使其達到室溫。反應混合物用飽和硫酸銅水溶液(2×300 mL)、水(400 mL)、鹽水(400 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。在減壓下旋轉蒸發，產生呈深色泡沫狀之粗產物。藉由急驟層析[40%正己烷/60%乙酸乙酯至5%甲醇/95%乙酸乙酯]進行純化，產生雙alloc產物(0.84 g)、所要單alloc產物(1.94 g，44%)及回收之雙苯胺(0.81 g)。
分析資料：RT 3.32 min;MS(ES+) m/z(相對強度)793([M+1]+,100)；MS(ES-) m/z(相對強度)791([M-1])-,100)。
異氰酸酯
在-10℃下在氮氣氛圍下，添加三乙胺(0.018 g/25 μL，0.18 mmol，1.35當量)至單alloc產物(0.106 g，0.134 mmol，1當量)及三光氣(0.015 g，4.8×10-2 mmol，0.36當量)於無水甲苯(5 mL)中之經攪拌溶液中。在1小時之後，IR光譜分析顯示在2268 cm-1處有異氰酸酯展寬且使反應混合物達到室溫。
化合物 6
醇6a(0.106 g，0.15 mmol，1.1當量)及三乙胺(0.018 g，25 μL，0.18 mmol，1.35當量)於無水THF(5 mL)中之溶液逐滴添加至新鮮製備的異氰酸酯中。在回流下加熱反應混合物4小時，此時TLC顯示形成新產物。反應混合物蒸乾且分配於DCM與水之間。分離水層且有機相用鹽水(100 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。在減壓下旋轉蒸發產生呈黃色油狀之粗產物，其藉由急驟層析[梯度溶離：40%正己烷/60%乙酸乙酯至20%正己烷/80%乙酸乙酯，乙酸乙酯以5%遞增]純化，產生呈白色泡沫狀之所要產物(0.092 g，45%產率)。
分析資料：RT 4.05 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1540([M+2]+,30)；1557([M+18])+,50)；MS(ES-) m/z(相對強度) 1585([M-+2Na])-,50)。
化合物 7
化合物7可自化合物6以2步加以製備。
雙去乙醯化產物
在-78℃(乾冰/丙酮)下，superhydrideTM之THF溶液(1 M，0.35 mL，0.35 mmol，4當量)經由注射器逐滴添加至乙酸酯6(0.135 g，8.8×10-2 mmol，1當量)於無水THF(7 mL)中之經攪拌溶液中。反應混合物在-78℃下攪拌1小時，此時LCMS顯示不存在起始物質且形成對應於單去乙醯化產物及雙去乙醯化產物之兩種新化合物。添加superhydrideTM另一等分試樣(1 M，0.35 mL，0.35 mmol，4當量)至反應混合物中且再繼續攪拌1小時。此時，LCMS顯示完全轉化成雙去乙醯化產物。添加檸檬酸(1 M，1 mL)至反應混合物中(劇烈起泡！)，接著使反應混合物達到室溫，此時添加檸檬酸之另一等分試樣(1 M，1 mL)。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑且所得殘餘物分配於乙酸乙酯(25 mL)與水(25 mL)之間。分離水相且乙酸乙酯層用水(25 mL)、鹽水(25 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑，產生呈黃色油狀之粗產物，其經受急驟層析[梯度溶離：乙酸乙酯→1%甲醇/99%乙酸乙酯至2%甲醇/98%乙酸乙酯]，產生呈無色玻璃狀之純產物(0.056 g，44%)。分析資料：RT 3.78 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1456([M+1]+,75)。
化合物 7
在氮氣氛圍下，戴斯-馬丁高碘烷(0.026 g，6.1×10-5 mol，2.1當量)以1份添加至雙去乙醯化產物(0.042 g，2.9×10-5 mol，1當量)於無水DCM(5 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液4小時，此時LCMS指示完全反應。混濁懸浮液用DCM(20 mL)洗濾。濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(25 mL)、水(25 mL)、鹽水(25 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑，產生呈灰白色泡沫狀之產物7(0.035 g，84%)。分析資料：RT 3.70 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1451([M+1]+,30)。
化合物 14
化合物14a或14b可經由化合物8自化合物7製備。化合物7中之Alloc保護基可在適當條件(例如肆(三苯基膦)鈀(0))下在吡咯啶存在下移除。在此等條件下，亦移除Fmoc保護基。或者，Fmoc基團可在移除Alloc基團之前或之後以單獨步驟，使用哌啶之DMF溶液加以移除。脫除保護基步驟之產物為在1個PBD單體之N10-C11位置處具有亞胺官能基且在另一單體之N10-C11位置處具有甲醇胺官能基的亞胺-甲醇胺產物，其中甲醇胺在N10位置處具有連接子-C(=O)-L1-NH2。
可使亞胺-甲醇胺與MC-OSu在鹼存在下反應以產生化合物8。參見例如Dubowchik等人，Bioconjugate Chem. 2002, 13,855-869。
可接著例如在酸性條件下自化合物8移除胺基酸側鏈保護基。所得產物可接著與具有硫醇官能基之適當抗體共軛以產生化合物9。在一實例中，抗體可用DTT處理以還原鏈間雙硫鍵。具有游離硫醇基之所得抗體可接著與衍生自化合物8之含有順丁烯二醯亞胺的化合物反應以產生化合物9。化合物9可例如藉由透濾加以純化。參見例如Dubowchik等人，Bioconjugate Chem. 2002,13,855-869。
化合物 18
在0℃下添加二環己基碳化二亞胺(2.46 g，11.92 mmol，1.05當量)至N-羥基丁二醯亞胺(1.44 g，12.5 mmol，1.1當量)及N-alloc***酸(17)(2.83 g，11.35 mmol，1當量)於無水DCM(120 mL)中之懸浮液中。在0℃下攪拌混合物30分鐘，接著在室溫下攪拌16小時。過濾反應混合物且在減壓下蒸發濾液。殘餘物再溶解於DCM(50 mL)中，靜置1小時且過濾以移除沈澱之二環己基脲。在減壓下蒸發產生呈白色固體狀之產物(3.91 g，99%)。分析資料：RT 2.93 min;MS(ES+) m/z(相對強度)369([M+Na]+,50)。
化合物 20
添加丁二醯亞胺(18)(3.91 g，11.29 mmoL，1當量)於THF(50 mL)中之溶液至H-Lys(Boc)-OH(19)(2.92 g，11.85 mmoL，1.05當量)及NaHCO3(1.04 g，12.42 mmoL，1.1當量)於THF(50 mL)及H2O(100 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌混合物72小時且在減壓下蒸發THF。用檸檬酸調整pH值至pH 3-4以使白色膠狀物沈澱。此用乙酸乙酯(2×250 mL)萃取且合併之萃取物用H2O(200 mL)、鹽水(200 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生呈白色泡沫狀之產物(4.89 g，91%)。分析資料：RT 3.03 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 478([M+1])+,80)。
化合物 7b
添加EEDQ(2.66 g，10.75 mmol，1.05當量)至對胺基苯甲基醇(21)(1.32 g，10.75 mmoL，1.05當量)及Alloc-Phe-Lys(Boc)-OH(4.89 g，10.24 mmol，1.0當量)於無水THF(75 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌混合物18小時。在減壓下蒸發溶劑，產生淺棕色固體。固體用***濕磨且用過量***洗濾。此產生呈白色固體狀之產物(4.54 g，76%)。分析資料：RT 3.08 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 583.8([M+1]+,100)。
7b之合成以下在流程12中加以描述。
化合物 9b
在-10℃下在氮氣氛圍下添加三乙胺(0.18 g，0.25 mL，1.79 mmol，2.3當量)至經單alloc保護之雙苯胺(6)(0.608 g，0.77 mmol，1.06當量)及三光氣(0.088 g，0.3 mmol，0.39當量)於無水THF(5 mL)中之經攪拌溶液中。使反應混合物達到室溫，樣品用甲醇處理，且藉由LCMS分析得知為胺基甲酸甲酯。
苯甲基醇(7b)(0.422 g，0.72 mmol，1.0當量)及三乙胺(0.18 g，0.25 mL，1.79 mmol，2.3當量)於無水THF(20 mL)中之溶液逐滴添加至新鮮製備的異氰酸酯中。在60-65℃下加熱反應混合物4小時，接著使其在室溫下攪拌18小時，此時LCMS顯示形成新產物。反應混合物蒸乾，產生呈黃色油狀之粗產物，其藉由急驟層析[梯度溶離：50%正己烷/50%乙酸乙酯至10%正己烷/90%乙酸乙酯，乙酸乙酯以10%遞增]純化，產生呈白色泡沫狀之所要產物(0.385 g，38%)。分析資料：RT 3.78 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1402.8([M+H]+,15)。
化合物 10b
添加K2CO3(0.158 g，1.15 mmoL，5當量)之H2O(1 mL)溶液至乙酸酯(9b)(0.32 g，0.23 mmoL，1當量)之甲醇(6 mL)溶液中。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。在減壓下蒸發甲醇，殘餘物用H2O(50 mL)稀釋且用乙酸乙酯(3×75 mL)萃取。合併之乙酸乙酯萃取物用H2O(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生呈白色泡沫狀之產物(0.292 g，97%)。分析資料：RT 3.52 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1318.6([M+1]+,15)。
化合物 11b
在氮氣氛圍下，戴斯-馬丁高碘烷(0.197 g，0.465 mmoL，2.1當量)以1份添加至雙去乙醯化產物(10b)(0.292 g，0.22 mmoL，1當量)於無水DCM(15 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液3.5小時，此時LCMS指示完全反應。反應混合物用DCM(50 mL)稀釋且用飽和碳酸氫鈉水溶液(3×100 mL)、水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑，產生粗產物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：80%乙酸乙酯/20%正己烷至100%乙酸乙酯，乙酸乙酯以5%遞增]進行純化，產生呈黃色泡沫狀之產物11b(0.235 g，81%)。分析資料：RT 3.42 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1314.8([M+1]+,8)。
化合物 12a
在氮氣氛圍下，添加Pd(PPh3)4(4 mg，3.5×10-6 moL，0.02當量)至雙alloc化合物(11b)(0.230 g，0.175 mmol，1當量)及吡咯啶(31 mg，36 μL，0.44 mmol，2.5當量)於無水DCM(10 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液3小時，此時LCMS指示有未反應物(11b)殘留。再添加等量之吡咯啶(31 mg，36 μL，0.44 mmoL，2.5當量)及Pd(PPh3)4(4 mg，3.5×10-6 mol，0.02當量)且在室溫下再攪拌反應物18小時。LCMS指示完全反應。反應混合物用DCM(40 mL)稀釋且用飽和氯化銨水溶液(100 mL)、水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生黃色泡沫物。此物用***濕磨，產生產物(0.187 g，95%)，其不經進一步純化即使用。分析資料：RT 2.80 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1128.5([M+1]+,20)。
化合物 23
Alloc-Val-OSu(22)(RT 2.67 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 321.4([M+Na]+,57)，根據製備化合物(16)之方法製備)(11.67 g，39.0 mmoL，1當量)於THF(50 mL)中之溶液添加至H-Ala-OH(3.66 g，41.08 mmoL，1.05當量)及NaHCO3(3.61 g，43.03 mmol，1.1當量)於THF(100 mL)及H2O(100 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌混合物72小時且在減壓下蒸發THF。用檸檬酸調整pH值至pH 3-4以使白色膠狀物沈澱。此物用乙酸乙酯(6×150 mL)萃取且合併之萃取物用H2O(200 mL)、鹽水(200 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生白色固體。用***(過量)濕磨產生呈白色粉末狀之純產物23(7.93 g，74%)。分析資料：RT 2.17 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 295([M+Na]+,63)，273([M+1]+,60)。
化合物 8
添加EEDQ(4.79 g，19.3 mmol，1.05當量)至對胺基苯甲基醇(21)(2.38 g，19.3 mmoL，1.05當量)及Alloc-Val-Ala-OH(5.02 g，18.4 mmol，1.0當量)於無水THF(100 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌混合物72小時。在減壓下蒸發溶劑，產生淺棕色固體。固體用***濕磨且用過量***洗濾。此產生呈白色固體狀之產物(6.2 g，89%)。分析資料：RT 2.50 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 400.6([M+Na]+,50)，378.6([M+1]+,60)。8之合成展示於以下流程13中。
化合物 9c
在室溫下在氮氣氛圍下，添加三乙胺(0.16 g，0.22 mL，1.59 mmol，2.2當量)至經單alloc保護之雙苯胺(6)(0.572 g，0.72 mmol，1當量)及三光氣(0.077 g，0.26 mmol，0.36當量)於無水THF(20 mL)中之經攪拌溶液中。加熱反應混合物至40℃，樣品用甲醇處理且藉由LCMS分析得知為胺基甲酸甲酯。
苯甲基醇(8)(0.4 g，1.06 mmol，1.5當量)及三乙胺(0.109 g，0.15 mL，1.08 mmol，1.5當量)於無水THF(20 mL)中之溶液逐滴添加至新鮮製備的異氰酸酯中。藉由LCMS在30分鐘間隔下監測反應混合物。在3小時之後，LCMS顯示轉化為產物、存在胺基甲酸甲酯及經單alloc保護之雙苯胺(6)。添加另一份三光氣(0.038 g，0.128 mmol，0.18當量)且在40℃下再繼續反應18小時。反應混合物蒸乾，產生呈黃色油狀之粗產物，其藉由急驟層析[梯度溶離：100%氯仿至97%氯仿/3%甲醇，甲醇以0.5%遞增]純化，產生呈白色泡沫狀之所要產物(0.59 g，69%)。分析資料：RT 3.58 min;MS(ES+) m/z(相對強度)1197([M+1]+,60)。
化合物 10c
添加K2CO3(0.195 g，1.41 mmoL，5當量)之H2O(1.4 mL)溶液至乙酸酯(9c)(0.338 g，0.282 mmoL，1當量)之甲醇(8.5 mL)溶液中。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。在減壓下蒸發甲醇，殘餘物用H2O(50 mL)稀釋且用乙酸乙酯(3×75 mL)萃取。合併之乙酸乙酯萃取物用H2O(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生呈白色泡沫狀之產物(0.298 g，95%)。分析資料：RT 3.28 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1113([M+1]+,40)。
化合物 11c
在氮氣氛圍下，戴斯-馬丁高碘烷(0.312 g，0.74 mmoL，2.1當量)以1份添加至雙去乙醯化產物(10c)(0.39 g，0.35 mmol，1當量)於無水DCM(20 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液3.5小時，此時LCMS指示完全反應。反應混合物用DCM(50 mL)稀釋且用飽和碳酸氫鈉水溶液(3×100 mL)、水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌且乾燥(MgSO4)。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑，產生粗產物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿至97%氯仿/3%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈白色固體狀之產物(0.201 g，52%)。分析資料：RT 3.15 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1109([M+1]+,30),MS(ES-) m/z(相對強度)1107([M-1]-,100)。
化合物 12c
在氮氣氛圍下添加Pd(PPh3)4(8 mg，7×10-6 moL，0.04當量)至雙alloc化合物(11c)(0.190 g，0.17 mmoL，1.0當量)及吡咯啶(61 mg，71 μL，0.86 mmoL，5.0當量)於無水DCM(5 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液3小時，產生混濁懸浮液。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物用乙酸乙酯濕磨，產生灰白色固體，其藉由過濾收集，產生產物(0.13 g，82%)，其不經進一步純化即使用。分析資料：RT 2.55 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 922([M+1]+,52)。
化合物 13a
添加EEDQ(18.4 mg，7.45×10-5 mol，2.2當量)至胺二肽(12a)(40 mg，3.5×10-5 mol，1.0當量)及順丁烯二醯亞胺己酸(8.2 mg，3.9×10-5 mol，1.1當量)於DCM(2 mL)及甲醇(1 mL)中之溶液中。在40℃下攪拌溶液72小時。在減壓下蒸發溶劑。將殘餘物溶解於DCM(50 mL)中且用飽和NaHCO3水溶液(2×50 mL)、H2O(50 mL)、鹽水(50 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生白色泡沫物。此物用***濕磨且用過量***洗濾，產生呈白色固體狀之產物(36 mg，78%)。分析資料：RT 3.27 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1320([M+1]+,75)。
化合物 13b
在0℃下添加冷三氟乙酸(13 mL)至順丁烯二醯亞胺衍生物(13a)(65 mg，4.9×10-5 mol)中。在此溫度下攪拌溶液30分鐘且在減壓下蒸發三氟乙酸。將殘餘物再溶解於無水DCM(5 mL)中。蒸發溶劑且殘餘物用***濕磨且所得黃色固體藉由過濾收集且在真空下乾燥(64 mg，97%)。分析資料：RT 2.83 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1222([M+2]+,5)。
順丁烯二醯亞胺-PEG-丁二醯亞胺試劑與12a或12b之偶合得到PBD藥物-連接子15。圖1a展示PBD藥物-連接子MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 15ba、MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 15bb及MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 15d之結構，其中PEG為伸乙基氧基，且PAB為對胺基苯甲氧基羰基。
化合物 15aa
將胺二肽(12a)(83 mg，7.4×10-5 mol，1當量)溶解於無水10% DMF/DCM之混合物(2 mL)中且依次添加順丁烯二醯亞胺-4Peg-丁二醯亞胺(353 μL之250 mmol無水DCM溶液)及N,N-二異丙基乙胺(8.2 mg，11 μL，8.1×10-5 mol，1.1當量)。在室溫下在氮氣氛圍下攪拌溶液72小時。在減壓下蒸發溶劑。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿至92%氯仿/8%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈黃色泡沫狀之產物(85 mg，76%)。分析資料：RT 3.13 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1526([M+1]+,5)。
化合物 15ab
將胺二肽(12a)(70 mg，76.2×10-5 mol，1當量)溶解於無水10% DMF/DCM之混合物(2 mL)中且依次添加順丁烯二醯亞胺-8Peg-丁二醯亞胺(263 μL之250 mmol的無水DCM溶液)及N,N-二異丙基乙胺(6.9 mg，9.5 μL，6.6×10-5 mol，1.06當量)。在室溫下在氮氣氛圍下攪拌溶液72小時。在減壓下蒸發溶劑。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿至92%氯仿/8%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈棕色泡沫狀之產物(44 mg，41.5%)。分析資料：RT 3.20 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1703([M+2]+,5)。
化合物 15ba (MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD；(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(5-((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基氧基)戊氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸4-((2S,5S)-2-(4-胺基丁基)-5-苯甲基-25-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,7,23-三側氧基-10,13,16,19-四氧雜-3,6,22-三氮雜二十五醯胺基)苯甲酯)
在0℃下添加冷三氟乙酸(17 mL)至順丁烯二醯亞胺衍生物(15aa)(85 mg，5.6×10-5 mol)中。在此溫度下攪拌溶液30分鐘且在減壓下蒸發三氟乙酸。將殘餘物再溶解於無水DCM(5 mL)中。蒸發溶劑且殘餘物用***濕磨且所得黃色固體藉由過濾收集且在真空下乾燥(70 mg，81%)。分析資料：RT 2.78 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1444([M+2]+,1)。
化合物 15bb (MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD；(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(5-((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基氧基)戊氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸4-((2S,5S)-2-(5-胺基丁基)-5-苯甲基-37-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,7,35-三側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧雜-3,6,34-三氮雜三十七醯胺基)苯甲酯)
在0℃下添加冷三氟乙酸(9 mL)至順丁烯二醯亞胺衍生物(15ab)(44 mg，2.6×10-5 mol)中。在此溫度下攪拌溶液30分鐘且在減壓下蒸發三氟乙酸。將殘餘物再溶解於無水DCM(5 mL)中。蒸發溶劑且殘餘物用***濕磨且所得黃色固體藉由過濾收集且在真空下乾燥(40 mg，91%)。分析資料：RT 2.80 min;MS(ES+) m/z(相對強度)1603([M+2]+,1)。
化合物 15d (MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD;(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(5-((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基氧基)戊氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸4-((2S,5S)-37-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-異丙基-2-甲基-4,7,35-三側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧雜-3,6,34-三氮雜三十七醯胺基)苯甲酯)
添加EEDQ(12 mg，4.8×10-5 mol，1.1當量)至胺二肽(12c)(40.3 mg，4.4×10-5 mol，1.0當量)及順丁烯二醯亞胺-8Peg-酸(28 mg，4.8×10-5 mol，1.1當量)於無水DCM(5 mL)中之懸浮液中。添加無水二甲基乙醯胺(0.05 mL)，產生淺黃色溶液，其在室溫下攪拌18小時。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物用***濕磨。所得固體產物藉由急驟管柱層析純化。分析資料：RT 2.90 min;MS(ES+) m/z(相對強度)1496([M+H]+,40)。
化合物 15e
添加N,N-二異丙基二乙胺(10.8 μL，8 mg，7.6×10-5 mol，2.2當量)至胺二肽(12c)(32 mg，3.5×10-5 mol，1.0當量)及順丁烯二醯亞胺-dPeg24-NHS酯(58 mg，4.16×10-5 mol，1.2當量)於無水DCM(5 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液96小時。反應混合物用DCM(15 mL)稀釋且用飽和NaHCO3(25 mL)、鹽水(25 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生淺黃色玻璃狀物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿至91%氯仿/9%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈黏稠黃色膠狀之產物(17 mg，22%)。
化合物 16d
選擇對由許多癌症顯著上調之整合素ανβ6具有高度選擇性之肽生物素-A20FMDV-Cys(59)用於PBD-連接子衍生物的共軛。
添加肽(59)(11.3 mg，4.35 μmol，0.98當量)於1/1乙腈/水(2 mL)中之溶液至(15d)(6.91 mg，4.62 μmol，1.0當量)於1/1乙腈/水(3 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液96小時。在減壓下蒸發乙腈且藉由凍乾移除水，產生白色泡沫物。藉由半製備性HPLC進行純化，隨後進行凍乾，產生呈白色泡沫狀之產物(3.8 mg，21%)。分析資料：MS(MaldiTOF) m/z(相對強度) 3991.1([M+H]+，100)。
化合物 24a
化合物24a以WO 2004/043963之化合物3之形式揭示。
化合物 24b
在0℃下逐份添加固體TCCA(18 g，77.4 mmol，1.1當量)至TEMPO(730 mg，4.67 mmol，0.07當量)及醇24a(25 g，70.5 mmol，1當量)於DCM(500 mL)中之溶液中。觀測到輕微放熱。在30分鐘後，反應根據TLC(乙酸乙酯)及LC/MS(2.38 min(ES+) m/z(相對強度) 353.34([M+H]+,100))視為完成。懸浮液經矽藻土過濾且用DCM洗滌。濾液依次用亞硫酸氫鈉水溶液、飽和NaHCO3(注意：劇烈起泡)、鹽水(100 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。過濾及真空蒸發溶劑，產生粗產物，其藉由急驟管柱層析(溶離：20:80 v/v正己烷/EtOAc)純化，產生呈白色固體狀之酮24b(20 g，80%)。分析資料：[α]26 D=15°(c=0.2,CHCl3)；MS(ES+) m/z(相對強度) 353.34([M+H]+,100);IR(ATR,CHCl3) 1748,1642,1518,1425,1335,1222,1176,1063,1032,986,857,785,756 cm-1。
化合物 25
在-45℃(乾冰/乙腈冷卻浴)下在氮氣氛圍下，無水2,6-二甲基吡啶(0.395 mL，365 mg，3.40 mmol)以1份注射至酮24b(200 mg，0.57 mmol)於無水DCM(10 mL)中之劇烈攪拌溶液中。逐滴快速注射取自剛開口之安瓿之無水三氟甲磺酸酐(477 μL，800 mg，2.83 mmol)，同時維持溫度在-40℃或-40℃以下。使反應混合物在-45℃下攪拌1小時，此時TLC(50/50 v/v正己烷/EtOAc)顯示起始物質完全消耗。冷反應混合物即刻用DCM(20 mL)稀釋，且在劇烈振盪下，用水(1×50 mL)、5%檸檬酸溶液(1×50 mL)、飽和NaHCO3(50 mL)、鹽水(30 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。過濾及真空蒸發溶劑，產生粗產物，其藉由急驟管柱層析(梯度溶離：60:40 v/v正己烷/EtOAc至50:50 v/v正己烷/EtOAc)純化，產生呈黃色泡沫狀之三氟甲磺酸酯25(151 mg，55%)。
無相應1,2不飽和化合物可藉由NMR所見。分析資料：[α]28 D=-55°(c=0.2,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.75(s,1H),6.92(s,1H),6.25(t,1H,J=1.84 Hz),5.19(dd,1H,J=5.05,11.93 Hz),4.03(s,6H),3.90(s,3H),3.50(ddd,1H,J=2.29,11.96,16.59 Hz),3.02(ddd,1H,J=1.60,5.05,16.58 Hz);IR(ATR,CHCl3) 1748,1653,1577,1522,1415,1335,1276,1205,1130,1061,1024,933,908,820,783,757,663,cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 485.45([M+H]+,100)。
化合物 26
添加Pd(PPh3)4(860 mg，744 μmol，0.04當量)至烯醇三氟甲磺酸酯25(9.029 g，18.6 mmol，1當量)、4-甲氧基苯基酸(3.67 g，24.1 mmol，1.3當量)、Na2CO3(5.13 g，48.3 mmol，2.6當量)、EtOH(45 mL)、甲苯(90 mL)及水(45 mL)之經攪拌混合物中。反應混合物在氮氣氛圍下攪拌隔夜，隨後，藉由TLC(60/40 EtOAc/己烷)及LC/MS(3.10 min(ES+) m/z(相對強度) 443.38([M+H]+.,100))觀測到起始物質完全消耗。反應混合物用EtOAc(400 mL)稀釋且用H2O(2×300 mL)、鹽水(200 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且在減壓下蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析(梯度溶離：60:40 v/v己烷/EtOAc至40:60 v/v己烷/EtOAc)進行純化，產生呈橙色固體狀之C2-芳基化合物26(7.0 g，85%)。分析資料：[α]25 D=-122°(c=0.2,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.78(s,1H),7.30(d,2H,J=8.81 Hz),6.95(s,1H),6.87(s,1H),6.83(d,2H,J=8.88 Hz),5.03(dd,1H,J=11.71,5.28 Hz),3.95(s,3H),3.93(s,3H),3.76(s,3H),3.73(s,3H),3.48-3.43(m,1H),2.99-2.93(m,1H),13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 170.7,162.5,158.4,153.9,149.1,137.9,126.3,125.6,125.3,122.9,122.3,113.8,110.03,107.6,59.7,57.9,56.5,56.2,55.1,54.9,52.2,33.9,20.7,14..0；IR(ATR,CHCl3) 1736,1624,1575,1516,1424,1326,1253,1178,1069,1031,863,820,803,786,757,653,617 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 443.38([M+H]+,100)。
化合物 27
逐份添加LiBH4(464 mg，21.3 mmol，1.5當量)至酯26(6.28 g，14.2 mmol，1當量)於無水THF(100 mL)及EtOH(120 mL)中之經攪拌溶液中。觀測到伴有劇烈起泡之發熱且藉助於冷卻浴(冰/水)維持溫度在15℃與25℃之間。使反應混合物攪拌1小時，隨後，藉由TLC(乙酸乙酯)觀測到起始物質完全轉化。反應混合物小心用乙酸乙酯(500 mL)稀釋且用冷檸檬酸水溶液淬滅過量之硼氫化物。有機層依次用1 N HCL水溶液(100 mL)、飽和NaHCO3水溶液(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在35℃下在減壓下蒸發，得到中間醇(4.50 g，10.8 mmol，76%中間物產率)，其即刻再溶解於無水DCM(200 mL)中。溶液冷卻至0℃且依次添加TEA(2.26 mL，0.162 mmol，1.5當量)、乙醯氯(1 mL，14.0 mmol，1.3當量)於無水DCM(30 mL)中之溶液。使反應混合物升溫至室溫且反應1小時。藉由TLC(EtOAc)觀測到完全反應。溶液用2 N檸檬酸水溶液(50 mL)、飽和NaHCO3水溶液(50 mL)、鹽水(50 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發。殘餘物藉由急驟層析(50/50直至60/40 EtOAc/己烷梯度)純化，產生2.65 g(歷經兩步，41%)呈橙色固體狀之純產物。分析資料：[α]24 D=-130°(c=0.28,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.74(s,1H),7.12(d,2H,J=8.84 Hz),6.91(br s,1H),6.80(d,2H,J=8.88 Hz),6.15(s,1H),5.04-5.00(m,1H),4.61-4.42(m,2H),4.01(s,6H),3.78(s,3H),3,35-3.25(m,1H),2.85-2.79(m,1H),2.06(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 171.1,159.1,149.5,126.1,126.0,114.1,107.2,56.8,56.6,55.3,33.5,20.9；IR(ATR,CHCl3)1731,1643,1623,1577,1517,1421,1333,1278,1248,1222,1183,1076,1059,1032,864,821,802,787,756,644,619 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 456.81([M+H]+,100。
化合物 28
添加鋅粉(365 mg，5.58 mmol，15當量)至化合物27(170 mg，0.372 mmol，1當量)於乙醇(7.6 mL)及乙酸(1.97 mL)中之溶液中。劇烈攪拌混合物且加熱至回流。TLC監測(乙酸乙酯)及LC/MS(2.97 min(ES+) m/z(相對強度) 427.57([M+H]+,100))顯示反應在5分鐘之後完成。使反應物冷卻，經矽藻土過濾且用DCM(50 mL)洗滌。濾液用水(3×30 mL)、飽和NaHCO3(2×30 mL)、鹽水(30 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發。殘餘物藉由急驟層析(梯度自60/40直至80/20 EtOAc/己烷)純化，產生140 mg(88%)呈白色泡沫狀之純產物。分析資料：[α]24 D=-108°(c=0.20,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.22(d,2H,J=8.80 Hz),6.89(br s,1H),6.86(d,2H,J=8.82 Hz),6.80(s,1H),6.29(s,1H),5.02-4.96(m,1H),4.50-4.40(m,4H),3.89(s,3H),3.82(s,3H),3.81(s,1H),3.30-3.25(m,1H),2.85-2.79(m,1H),2.06(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 194.6,171.1,171.0,170.4,164.0,160.8,155.1,149.5,146.2,143.6,130.5,129.2,125.8,115.5,114.1,107.6,105.4,100.9,63.5,60.4,56.9,56.3,37.4,21.0,20.6,14.2；IR(ATR,CHCl3) 1733,1589,1512,1396,1209,1176,1113,1031,823,791,762 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 427.57([M+H]+,100)。
化合物 29
胺28(400 mg，0.93 mmol，1當量)及TEA(350 μL，2.5 mmol，2.6當量)於無水THF中之溶液在0℃下逐滴添加至三光氣(125 mg，0.42 mmol，0.45當量)於無水THF(4 mL)中之新鮮製備溶液中。白色懸浮液在0℃下攪拌10分鐘。快速添加醇7b(Alloc-Phe-Lys(Boc)-PABOH，546 mg，0.93 mmol，1當量)及TEA(350 μL，2.5 mmol，2.6當量)於無水THF(40 mL)中之溶液。白色懸浮液在室溫下攪拌15分鐘，接著在65℃下加熱2小時，接著使其在室溫下攪拌隔夜。藉由棉絨過濾移除白色TEA鹽。濾液經濃縮且藉由急驟層析(梯度：含1% MeOH之氯仿直至含3% MeOH之氯仿)純化，產生700 mg所要胺基甲酸酯(72%)。分析資料：[α]24 D=-30.2°(c=0.18,CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 8.54(s,1H),8.43(s,1H),7.74(s,1H),7.45(d,2H,J=8.43 Hz),7.23(d,2H,J=8.52 Hz),7.16-7.06(m,7H),6.78-6.72(m,4H),6.46(d,1H,J=7.84 Hz),5.82-5.73(m,1H),5.30(s,1H),5.19-5.06(m,2H),5.03(d,1H,J=1.29 Hz),4.93-4.87(m,1H),4.63(m,1H),4.47-4.28(m,6H),3.87(s,3H),3.76(s,3H),3.72(s,1H),3.16-3.09(m,1H),3.07-2.95(m,4H),2.72-2.67(m,1H),1.95-1.83(m,1H),1.60-1.51(m,1H),1.43-1.39(m,2H),1.35(s,9H),1.28-1.19(m,2H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ171.5,171.1,169.2,165.8,159.1,156.2,153.8,151.6,144.1,137.8,135.8,132.2,131.9,129.1,129.0,128.9,127.3,126.2,125.9,123.5,123.4,119.9,118.2,114.2,111.3,66.5,66.2,64.0,56.5,56.1,55.3,53.8,33.1,30.9,29.4,28.4,22.6,20.8；IR(ATR,CHCl3) 1697,1652,1604,1516,1456,1418,1245,1225,1177,1115,1033,824,750 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 1036.25([M+H]+,100)。
化合物 30
添加碳酸鉀(600 mg，4.34 mmol，5當量)之水溶液(3.3 mL)至乙酸酯29(920 mg，0.89 mmol，1當量)於甲醇(20 mL)中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌50分鐘，此時TLC(氯仿/甲醇，90/10)顯示完成。混合物分配於水(150 mL)與二氯甲烷(200 mL)之間。有機相依次用1 N檸檬酸(50 mL)、鹽水(50 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發，產生所要醇30(700 mg，79%)。分析資料：[α]24 D=-61°(c=0.18,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ8.60(s,1H),8.51(s,1H),7.64(s,1H),7.42(d,2H,J=8.38 Hz),7.24-7.18(m,2H),7.1-7.05(m,7H),6.83-6.66(m,5H),5.81-5.71(m,1H),5.43(s,1H),5.18-5.08(m,2H),4.99(s,2H),4.75-4.69(m,2H),4.48-4.25(m,5H),3.86(s,3H),3.82-3.76(m,2H),3.74(s,3H),3.72(s,3H),3.19-3.12(m,1H),3.05-2.92(m,4H),2.62-2.57(m,1H),1.85-1.75(m,2H),1.59-1.51(m,1H),1.38-1.34(m,11H),1.28-1.18(m,2H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ171.7,169.5,167.0,159.2,156.3,153.9,151.6,144.4,137.8,135.9,132.3,131.9,129.2,128.8,127.2,126.0,124.5,123.3,120.1,118.1,114.2,111.3,66.6,66.1,61.6,56.5,56.1,55.3,53.8,39.9,33.6,31.1,29.4,28.4,22.6；MS(ES+) m/z(相對強度)994.7([M+H]+,100)。
化合物 31
在室溫下將醇30(500 mg，0.503 mmol，1當量)溶解於無水DCM(50 mL)中。添加固體戴斯-馬丁高碘烷(300 mg，0.707 mmol，1.4當量)至混合物中，隨後在1小時時再添加75 mg，接著在2小時時再添加57 mg，從而使戴斯-馬丁高碘烷之總質量達到463 mg(1.09 mmol，2.17當量)。藉由TLC(氯仿/甲醇，95/5，溶離2次)連續監測反應。在6.5小時之後，藉由將反應混合物分配於DCM與飽和NaHSO3水溶液之間來處理反應物。有機層接著用飽和NaHCO3水溶液、鹽水洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發。殘餘物藉由急驟層析(梯度：0/100直至2/98甲醇/氯仿)純化，產生259 mg(52%)純產物31。分析資料：[α]24 D=+106°(c=0.16,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),7.54-7.46(m,2H),7.36(s,1H),7.31-7.16(m,8H),6.89(d,2H,J=8.70 Hz),6.75(bs,1H),6.61(s,1H),5.89-5.84(m,2H),5.45(d,1H,J=4.80 Hz),5.28-5.08(m,3H),4.84-4.76(m,2H),4.58-4.47(m,4H),4.28(bs,1H),4.02-3.95(m,1H),3.92(s,3H),3.83(s,3H),3.74(s,2H),3.41-3.32(m,1H),3.16-3.02(m,5H),2.03-1.83(m,1H),1.68-1.61(m,1H),1.55-1.39(m,11H),1.36-1.28(m,2H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ171.7,169.5,163.2,159.1,156.3,151.1,148.6,138.0,135.9,132.3,129.2,128.8,127.2,126.3,126.2,121.7,120.0,118.2,114.2,112.7,110.7,86.2,79.3,67.6,66.2,59.5,56.4,56.15,56.1,55.3,53.8,39.9,38.1,35.1,31.0,29.4,28.4,22.7；IR(ATR,CHCl3) 3313,2935,2356,1691,1603,1512,1431,1253,1177,1119,1033,824,750,698 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 992.41([M+H]+,100)。
化合物 32
在室溫下在惰性氛圍下，添加固體Pd(PPh3)4(8 mg，6.9 μmol，0.02當量)至起始物質31(346 mg，0.349 mmol，1當量)及吡咯啶(43.3 μL，0.523 mmol，1.5當量)於無水DCM(10 mL)中之新鮮製備溶液中。如藉由TLC(90/10 v/v氯仿/甲醇)及LC/MS(2.93 min(ES+) m/z(相對強度) 908.09([M+H]+,100))所指示，反應在45分鐘之後完成。藉由在減壓下蒸發移除揮發性組分。殘餘物藉由急驟層析(梯度：2/98直至5/95甲醇/氯仿)純化，產生298 mg(94%)純產物32。分析資料：1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 8.87(s,1H),7.86(d,1H,J=8.06 Hz),7.51(d,2H,J=8.42 Hz),7.36-7.11(m,9H),6.89(d,2H,J=8.73 Hz),6.58(bs,1H),5.85(d,1H,J=9.47 Hz),5.32(m,1H),4.83(d,1H,J=11.68 Hz),4.65(m,1H),4.47(q,1H,J=6.14 Hz),4.03-3.97(m,1H),3.94(s,3H),3.84(s,3H),3.74-3.69(m,4H),3.39-3.33(m,1H),3.26(dd,1H,J=13.73 Hz,J=4.00 Hz),3.16-3.03(m,3H),3.26(dd,1H,J=8.91 Hz,J=13.74 Hz),2.05-1.96(m,1H),1.78-1.49(m,3H),1.48-1.42(m,9H),1.42-1.24(m,2H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 175.45,163.2,159.1,156.2,148.6,137.3,129.3,128.8,127.0,126.2,126.2,121.7,119.8,114.2,112.6,56.2,55.3,40.7,35.1,30.5,28.4,22.8；MS(ES+) m/z(相對強度) 908.09([M+H]+,100)。
化合物 33
添加固體EEDQ(108 mg，0.436 mmol，2當量)至胺32(199 mg，0.219 mmol，1當量)及順丁烯二醯亞胺基己酸(57 mg，0.269，1.23當量)於DCM(6 mL)與甲醇(3 mL)之混合物中的溶液中。溶液在室溫下攪拌24小時。藉由LC/MS(3.45 min(ES+) m/z(相對強度) 1101.78([M+H]+,100))發現完全反應。藉由在減壓下蒸發移除揮發性組分。殘餘物分配於DCM與飽和NaHCO3水溶液之間，用鹽水洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發。殘餘物藉由急驟層析(梯度自1/99直至2.5/97.5甲醇/氯仿)純化，產生165 mg(68%)純產物33。分析資料：[α]24 D=+94°(c=0.09,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 8.62(s,1H),7.46-7.39(m,2H),7.27(s,1H),7.22-7.06(m,9H),6.79(d,2H,J=8.65 Hz),6.75(bs,1H),6.57(s,2H),6.52(s,1H),6.28(s,1H),5.77(bs,1H),5.21(s,1H),4.75-4.60(m,2H),4.40(q,1H,J=5.54 Hz),3.93-3.86(m,1H),3.83(s,3H),3.73(s,3H),3.65(s,2H),3.36(t,2H,J=7.16 Hz),3.30-3.23(m,1H),3.08-2.90(m,5H),2.09(t,2H,J=7.14 Hz),1.93-1.75(m,1H),1.62-1.31(m,17H),1.30-1.04(m,6H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 173.5,170.9,170.3,169.6,163.2,159.1,156.3,151.1,148.6,136.1,134.0,129.1,128.7,127.2,126.3,126.2,124.9,123.3,121.7,120.0,114.2,112.7,110.7,86.1,79.3,67.6,59.5,56.2,56.1,55.3,54.6,53.9,53.4,37.8,37.5,36.7,35.2,31.0,29.4,28.5,28.2,26.2,24.8,22.7；MS(ES+) m/z(相對強度) 1101.78([M+H]+,100)。
化合物 34
10% TFA於DCM(12 mL)中之經冷卻溶液添加至33之經冷卻(-20℃)樣品(75 mg，0.068 mmol，1當量)中。藉由LC/MS(2.87 min(ES+) m/z(相對強度) 1001.13([M+H]+,100))監測反應。溫度升高至-10℃而無副反應。4小時之後，反應完成。反應混合物傾至去離子水(50 mL)中且冷凍乾燥隔夜(液氮浴，允許蒸發而無需再裝填)，產生純TFA鹽34(75 mg，99%)。分析資料：1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 9.05(s,1H),7.87-7.62(m,4H),7.35(m,2H),7.24(s,1H),7.16-7.11(m,2H),7.10-6.96(m,8H),6.92(s,1H),6.82-6.66(m,3H),6.63-6.42(m,3H),5.75(d,1H,J=9.54 Hz),5.15-5.03(m,1H),4.77-4.74(m,1H),4.68-4.56(m,1H),4.39(s,1H),3.97-3.84(m,1H),3,80(s,3H),3.72(s,3H),3.65(s,2H),3.33-3.21(m,3H),3.04-2.69(m,5H),2.04(m,2H),1.979-1.64(m,1H),1.63-1.45(m,3H),1.44-1.12(m,6H),1.07-0.95(m,2H)。MS(ES+) m/z(相對強度) 1001.13([M+H]+,100)。
化合物 35
添加胺32(99 mg，0.109 mmol，1當量)至NHS-PEG4-順丁烯二醯亞胺(Thermo Scientific，61.6 mg，0.120 mmol，1.1當量)及TEA(18.2 μL，0.130 mmol，1.2當量)於無水DCM(5 mL)與DMF(1 mL)混合物中的溶液中。反應物在室溫下攪拌隔夜，此時藉由LC/MS(3.27 min(ES+) m/z(相對強度) 1307.55([M+H]+,100))發現幾乎完全反應。藉由在減壓下蒸發移除揮發性組分。殘餘物藉由急驟層析(梯度自3/97直至5/95甲醇/氯仿)純化，產生71 mg(50%)純產物35。分析資料：1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 8.58(s,1H),7.50(d,2H,J=8.47 Hz),7.28(s,1H),7.25-7.20(m,2H),7.18-7.01(m,9H),6.89(d,1H,J=7.58 Hz),6.79(d,2H,J=8.68 Hz),6.59(s,2H),6.51(s,1H),5.77(d,1H,J=6.42 Hz),5.25(d,1H,J=11.43 Hz),4.83-4.64(m,2H),4.63-4.49(m,1H),4.43-4.38(m,1H),4.18(s,1H),3.96-3.85(m,1H),3.84(s,3H),3.76-3.56(m,9H),3.57-3.34(m,15H),3.34-3.20(m,3H),3.15(dd,1H,J=14.22 Hz,J=5.60 Hz),3.07-2.89(m,4H),2.48-2.29(m,4H),1.97-1.90(m,1H),1.61-1.39(m,3H),1.35(s,9H),1.29-1.12(m,4H)。MS(ES+) m/z(相對強度) 1307.55([M+H]+,100)。
化合物 36
10% TFA於DCM(10 mL)中之經冷卻溶液添加至35之經冷卻(-20℃)樣品(70 mg，0.054 mmol，1當量)中。藉由LC/MS(2.77 min(ES+) m/z(相對強度) 1206.94([M+H]+,100))監測反應。在-25℃下18小時之後，反應完成。反應混合物傾至去離子水(50 mL)中且冷凍乾燥隔夜(液氮浴，允許蒸發而無需再裝填)，產生純TFA鹽36(75 mg，99%)。
化合物 37
33(9.5 mg，8.6 μmol，1當量)於甲醇(1.5 mL)中之溶液添加至環狀硫肽c(RGDfC)(5 mg，8.6 μmol，1當量，購自pepnet.com)於甲醇(2 mL)與水(1 mL)混合物中的溶液中。反應混合物攪拌1小時。所得沈澱物藉由過濾收集且用甲醇與水(0.6 mL/0.4 mL)之混合物沖洗且藉由真空抽吸進行乾燥，產生8 mg(55%)純產物，如LC/MS(3.03 min(ES+) m/z(相對強度) 1681.19([M+H]+,10),790.85(100))所示。
化合物 38
在0℃(冰浴)下用含10% TFA之DCM溶液(1 mL)處理化合物37(7 mg)2小時。如LC/MS(2.70 min(ES+) m/z(相對強度) 791.44([(M+2H)/2]+,100))所示，發現完全反應。反應混合物傾至去離子水(10 mL)中且冷凍乾燥隔夜(液氮浴，允許蒸發而無需再裝填)，產生純TFA鹽38(7 mg，定量產率)。
化合物 39a
化合物39a及其合成揭示於WO 00/012508及WO 2006/111759中。
化合物 39b
方法I：添加催化量之DMF(2滴)(起泡！)至硝基酸39a(1.0 g，2.15 mmol)及乙二醯氯(0.95 mL，1.36 g，10.7 mmol)於無水THF(20 mL)中之經攪拌溶液中。反應混合物在室溫下攪拌16小時且藉由真空蒸發移除溶劑。將所得殘餘物再溶解於無水THF(20 mL)中且在-30℃(乾冰/乙二醇)下在氮氣氛圍下，逐滴添加酸氯化物溶液至(2S,4R)-甲基-4-羥基吡咯啶-2-甲酸酯鹽酸鹽(859 mg，4.73 mmol)及TEA(6.6 mL，4.79 g，47.3 mmol)於THF(10 mL)中之經攪拌混合物中。使反應混合物升溫至室溫且再攪拌3小時，隨後，TLC(95:5 v/v CHCl3/MeOH)及LC/MS(2.45 min(ES+) m/z(相對強度) 721([M+H]+,20))顯示形成產物。藉由旋轉蒸發移除過量THF且將所得殘餘物溶解於DCM(50 mL)中。有機層用1 N HCl(2×15 mL)、飽和NaHCO3(2×15 mL)、H2O(20 mL)、鹽水(30 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。過濾及蒸發溶劑，產生呈深色油狀之粗產物。藉由急驟層析(梯度溶離：100% CHCl3至96:4 v/v CHCl3/MeOH)進行純化，分離出呈橙色玻璃狀之純醯胺39b(840 mg，54%)。
方法II：添加乙二醯氯(9.75 mL，14.2 g，111 mmol)至硝基酸39a(17.3 g，37.1 mmol)及DMF(2 mL)於無水DCM(200 mL)中之經攪拌懸浮液中。在初始起泡之後，反應懸浮液變為溶液且混合物在室溫下攪拌16小時。藉由用MeOH處理反應混合物樣品來確認轉化成酸氯化物且藉由LC/MS觀測獲得雙甲酯。大部分溶劑藉由真空蒸發移除，將所得濃縮溶液再溶解於最小量之無水DCM中且用***濕磨。所得黃色沈澱物藉由過濾收集，用冷***洗滌且在40℃下在真空烘箱中乾燥1小時。在-40℃(乾冰/CH3CN)下歷時25分鐘逐份添加固體酸氯化物至(2S,4R)-甲基-4-羥基吡咯啶-2-甲酸酯鹽酸鹽(15.2 g，84.0 mmol)及TEA(25.7 mL，18.7 g，185 mmol)於DCM(150 mL)中之經攪拌懸浮液中。即刻，如藉由LC/MS(2.47 min(ES+) m/z(相對強度)721([M+H]+,100))所判斷，反應完成。混合物用DCM(150 mL)稀釋且用1 N HCl(300 mL)、飽和NaHCO3(300 mL)、鹽水(300 mL)洗滌，過濾(經相分離器)且真空蒸發溶劑，產生呈橙色固體狀之純產物39b(21.8 g，82%)。分析資料：[α]22 D=-46.1°(c=0.47,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3)(旋轉異構體) δ 7.63(s,2H),6.82(s,2H),4.79-4.72(m,2H),4.49-4.28(m,6H),3.96(s,6H),3.79(s,6H),3.46-3.38(m,2H),3.02(d,2H,J=11.1 Hz),2.48-2.30(m,4H),2.29-2.04(m,4H)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)(旋轉異構體) δ 172.4,166.7,154.6,148.4,137.2,127.0,109.7,108.2,69.7,65.1,57.4,57.0,56.7,52.4,37.8,29.0；IR(ATR,CHCl3) 3410(br),3010,2953,1741,1622,1577,1519,1455,1429,1334,1274,1211,1177,1072,1050,1008,871 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 721([M+H]+,47),388(80)；HRMS[M+H]+理論值：C31H36N4O16 m/z 721.2199,實驗值：(ES+) m/z 721.2227。
化合物 39c
在0℃下，逐份添加固體TCCA(32 g，137 mmol，2.2當量)至TEMPO(1 g，6.4 mmol，0.1當量)及雙醇18(45 g，62.5 mmol，1當量)於標準DCM(500 mL)中之溶液中。觀測到輕微放熱。在30分鐘後，反應根據TLC(乙酸乙酯)及LC/MS(2.95 min(ES+) m/z(相對強度) 718.10([M+H]+,100))視為完成。懸浮液經矽藻土過濾且用DCM洗滌。濾液依次用亞硫酸氫鈉水溶液、飽和NaHCO3(注意：劇烈起泡)、鹽水(200 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。過濾及真空蒸發溶劑，產生粗產物，其藉由急驟管柱層析(溶離：20:80 v/v正己烷/EtOAc)純化，產生呈白色固體狀之酮39c(28.23 g，63%)。分析資料：[α]21 D=+18°(c=0.2,CHCl3)；MS(ES+) m/z(相對強度) 718.10([M+H]+,100);1H NMR(400 MHz,CDCl3)旋轉異構體混合物δ 7.70(m,2H),6.79(m,2H),5.27(m,1H),4.44(m,1H),4.30(m,4H),3.93(m,6H),3.81(s,3H),3.75(m,1H),3.63(s,2H),3.58(m,1H),3.09-2.89(m,2H),2.74-2.53(m,2H),2.40(p,2H,J=5.73 Hz)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)旋轉異構體混合物δ 206.5,206.4,206.0,205.9,171.2,171.1,170.6,167.0,166.7,155.0,154.5,148.8,137.7,137.3,126.4,125.4,109.8,109.1,108.6,108.4,108.4,65.7,65.6,65.5,60.4,57.9,56.7,56.7,55.1,53.6,52.9,52.9,51.6,41.2,40.1,28.7,28.6,21.0,14.1；IR(ATR,CHCl3) 1764,1650,1578,1518,1415,1333,1274,1217,1060,870,824 759 cm-1。
化合物 40
在-45℃(乾冰/乙腈冷卻浴)下在氮氣氛圍下，無水2,6-二甲基吡啶(4.26 mL，3.92 g，36.6 mmol)以1份注射至雙酮39c(4.23 g，5.90 mmol)於無水DCM(100 mL)中之劇烈攪拌溶液中。逐滴快速注射取自剛開口之安瓿之無水三氟甲磺酸酐(5.96 mL，10 g，35.4 mmol)，同時維持溫度在-40℃或-40℃以下。反應混合物在-45℃下攪拌1小時，此時TLC(50/50 v/v正己烷/EtOAc)顯示起始物質完全消耗。冷反應混合物即刻用DCM(200 mL)稀釋，且在劇烈振盪下，用水(1×300 mL)、5%檸檬酸溶液(1×200 mL)、飽和NaHCO3(200 mL)、鹽水(150 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。過濾及真空蒸發溶劑，產生粗產物，其藉由急驟管柱層析(梯度溶離：70:30 v/v正己烷/EtOAc至40:60 v/v正己烷/EtOAc)純化，產生呈黃色泡沫狀之雙三氟甲磺酸酯40(1.32 g，23%)。分析資料：[α]25 D=-68°(c=0.2,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.73(s,2H),6.85(s,2H),6.20(t,2H,J=1.81 Hz),5.13(dd,2H,J=5.05,11.93 Hz),4.33(t,4H,J=5.91 Hz),3.95(s,6H),3.84(s,6H),3.43(ddd,2H,J=2.28,11.92,16.59 Hz),2.96(ddd,2H,J=1.60,5.05,16.58 Hz),2.44(p,2H,J=5.79 Hz)；13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 169.4,164.1,154.7,149.2,138.0,135.2,124.4,121.1,120.0,116.8,110.0,108.4,65.7,65.6,57.0,56.8,53.1,33.3,28.6；IR(ATR,CHCl3) 1749,1654,1576,1522,1418,1337,1277,1207,1131,1061,1023,910,821,757 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 981.86([M+H]+,100)。
化合物 41
添加Pd(PPh3)4(660 mg，571 μmol，0.08當量)至雙烯醇三氟甲磺酸酯40(7 g，7.13 mmol，1當量)、4-氟苯基酸(2.6 g，18.5 mmol，2.6當量)、Na2CO3(3.93 g，37.0 mmol，5.2當量)、EtOH(25 mL)、甲苯(50 mL)及水(25 mL)之經攪拌混合物中。反應混合物在氮氣氛圍下攪拌隔夜，隨後，藉由TLC(60/40 EtOAc/己烷)及LC/MS(3.68 min(ES+) m/z(相對強度) 873.90([M+H]+,100))觀測到起始物質完全消耗。反應混合物用EtOAc(300 mL)稀釋且用H2O(2×200 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且在減壓下蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析(梯度溶離：50:50 v/v己烷/EtOAc至80:20 v/v己烷/EtOAc)進行純化，產生呈橙色固體狀之雙C2-芳基化合物41(5.46 g，88%)。分析資料：[α]22 D=-107°(c=0.2,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.76(s,2H),7.14-7.04(m,4H),6.97-6.87(m,6H),6.31(s,2H),5.18(dd,2H,J=11.68,5.03 Hz),4.36(t,4H,J=5.87 Hz),3.97(s,6H),3.84(s,6H),3.53-3.39(m,2H),3.00(ddd,2H,J=1.22,5.01,16.28 Hz),2.46(p,2H,J=5.98 Hz)；13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 171.0,163.3,148.9,138.0,128.1,126.3,126.2,125.8,123.1,122.6,115.7,115.5,110.3,108.5,65.7,58.3,56.8,34.7,28.7；IR(ATR,CHCl3) 1738,1650,1578,1512,1416,1333,1275,1212,1064,1023,869,808,758,654,613 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 873.90([M+H]+,100))。
化合物 42
在0℃下，LiBH4(132 mg，21.3 mmol，3當量)以1份添加至酯41(5.30 g，6.07 mmol，1當量)於無水THF(100 mL)中之經攪拌溶液中。使反應混合物升溫至室溫且攪拌1小時，隨後，藉由LC/MS(3.42 min(ES+) m/z(相對強度)818.35([M+H]+,100))觀測到起始物質直接完全轉化。反應混合物小心用乙酸乙酯(500 mL)稀釋且用冷檸檬酸水溶液淬滅過量之硼氫化物。有機層依次用1 N HCL水溶液(100 mL)、飽和NaHCO3水溶液(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在35℃下在減壓下蒸發，得到中間醇，其即刻再溶解於無水DCM(200 mL)中。冷卻溶液至0℃且依次添加咪唑(3.97 g，58.0 mmol，9.6當量)、TBDMS-Cl(4.390 g，29.1 mmol，4.8當量)。使反應混合物升溫至室溫且反應2小時。藉由TLC(EtOAc/己烷，50/50)及LC/MS(4.23 min(ES+) m/z(相對強度) 1045.99([M+H]÷,100))觀測到完全反應。溶液用2 N檸檬酸水溶液(50 mL)、飽和NaHCO3水溶液(50 mL)、鹽水(50 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發。殘餘物藉由急驟層析(梯度：80/20直至60/40己烷/EtOAc)純化，產生2.45 g(歷經兩步，38.6%)呈橙色固體狀之純產物。分析資料：[α]22 D=-123°(c=0.18,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.76(s,2H),7.17-7.06(m,4H),6.96-6.87(m,4H),6.81(s,2H),6.17(s,2H),4.84-4.72(m,2H),4.35(t,4H,J=5.87 Hz),3.93(s,6H),3.25-3.07(m,2H),3.03-2.91(m,2H)2.45(p,2H,J=5.92 Hz),0.84(s,18H),0.07(s,12H)；13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 163.2,160.7,154.5,148.6,137.9,130.1,130.0,126.7,126.3,126.2,124.3,123.0,115.6,115.4,110.0,108.5,65.7,60.4,59.2,56.7,33.2,28.7,25.8,25.7,21.0,18.2,14.2,-5.3；IR(ATR,CHCl3) 2953,1742,1650,1576,1512,1417,1334,1274,1214,1063,1023,869,808,759,654,612 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 1045.99([M+H]+,100)。
化合物 43
添加甲酸之乙醇溶液(5% v/v，100 mL)至雙硝基化合物42(2.35 g，2.25 mmol，1當量)及鋅粉(8.82 g，0.135 mmol，60當量)於乙醇(35 mL)中之懸浮液中。使反應混合物在室溫下攪拌25分鐘，此時TLC(甲醇/氯仿，2/98)及LC/MS(4.23 min(ES+) m/z(相對強度) 986.3([M+H]+,10)，493.9([(M+2H)/2]+,100))顯示完全反應。過濾懸浮液且濾液分配於乙酸乙酯(400 mL)與飽和NaHCO3水溶液(200 mL)之間。有機物用鹽水(100 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發，產生純雙胺(2.20 g，98%)，其直接用於下一步驟中。
化合物 44
在-78℃下，氯甲酸烯丙酯(0.209 mL，1.97 mmol，0.9當量)於無水DCM(50 mL)中之溶液逐滴添加至雙苯胺基化合物43(2.15 g，2.18 mmol，1當量)及吡啶(0.335 mL，4.14 mmol，1.9當量)於無水DCM(250 mL)中之溶液中。反應混合物在-78℃下攪拌2小時，且使其升溫至室溫。溶液用飽和硫酸銅水溶液(2×50 mL)、水(250 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發。殘餘物藉由急驟層析(梯度自70/30直至30/70己烷/EtOAc)純化，產生668 mg(26.5%)如藉由LC/MS(4.45 min(ES+) m/z(相對強度) 1154.32([M+H]+,100))所指示之經雙Alloc保護之化合物及800 mg略微受污染之所要經單alloc保護之化合物(4.32 min(ES+) m/z(相對強度) 1070.58([M+H]+,100))。此化合物進一步藉由急驟層析(梯度：40/60直至20/80己烷/***)純化，產生700 mg(30%)所要純單alloc化合物。分析資料：[α]22 D=-41°(c=0.16,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 8.72(bs,1H),7.88(s,2H),7.25-7.18(m,4H),7.02-6.93(m,4H),6.93-6.83(m,3H),6.80(s,1H),6.36(s,1H),6.00-5.84(m,1H),5.32(dd,1H,J=1.37,J=17.21 Hz),5.21(dd,1H,J=0.90,J=10.40 Hz),4.85-4.71(m,2H),4.60(dd,2H,J=1.02,J=5.62 Hz),4.46(s,2H),4.31(t,2H,J=5.96 Hz),4.25(t,2H,J=6.31 Hz),3.98(m,2H),3.86(m,2H),3.81(s,3H),3.76(s,3H),3.19-3.05(m,2H),3.05-2.93(m,2H),2.41(p,2H,J=6.16 Hz),0.84(m,18H),0.05(m,12H)；IR(ATR,CHCl3)2952,2359,1732,1652,1601,1507,1472,1406,1225,1119,836,777,668 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 1070.58([M+H]+,100)。
化合物 45
在0℃下，胺44(650 mg，0.607 mmol，1當量)及TEA(220 μL，1.58 mmol，2.6當量)於無水THF中之溶液逐滴添加至三光氣(81 mg，0.273 mmol，0.45當量)於無水THF(4 mL)中之新鮮製備溶液中。白色懸浮液在0℃下攪拌10分鐘。快速添加醇(Alloc-Val-Ala-PABOH，229 mg，0.607 mmol，1當量)及TEA(220 μL，1.58 mmol，2.6當量)於無水THF(30 mL)中之溶液。白色懸浮液在室溫下攪拌15分鐘，接著在65℃下加熱2小時且接著使其在室溫下攪拌隔夜。藉由棉絨過濾移除白色TEA鹽。濾液經濃縮且藉由急驟層析(梯度，含0% MeOH之氯仿直至含3% MeOH之氯仿)純化，產生220 mg所要胺基甲酸酯(25%)。分析資料：[α]24 D=-46.1°(c=0.13,CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 8.70(bs,2H),8.46(s,1H),7.83(s,2H),7.50(m,2H),7.31(d,2H,J=8.50 Hz)7.25-7.15(m,4H),7.03-6.93(m,4H),6.92-6.77(m,4H),6.51(d,1H,J=7.48 Hz),5.99-5.81(m,1H),5.38-5.15(m,5H),5.13-5.03(m,2H),4.77(bs,2H),4.66-4.53(m,5H),4.38-4.22(m,4H),4.08-3.94(m,3H),3.93-3.81(m,2H),3.79(s,6H),3.20-3.05(m,2H),3.05-2.94(m,2H),2.41(p,2H,J=5.95 Hz),2.22-2.08(m,1H),1.45(d,3H,J=7.03 Hz),0.94(dd,6H,J=6.81,14.78 Hz),0.84(m,18H),0.14-0.02(m,12H)；13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 171.7,169.8,165.9,163.1,153.6,151.0,144.3,137.8,132.4,132.3,132.0,130.2,129.2,126.2,126.1,125.3,123.3,123.2,119.8,118.2,118.0,115.7,115.5,112.0,106.0,66.5,66.2,65.8,65.4,62.5,60.4,59.5,56.6,49.6,30.8,28.9,25.7,19.2,18.2,18.1,17.7,17.3,14.2,-5.4；IR(ATR,CHCl3) 2950,2356,1725,1691,1602,1512,1408,1201,1109,1023,832,774,668 cm-1；MS(ES+) m/z(相對強度) 1473.43([M+H]+,100)。
化合物 I2
含19-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)4,7,10,13,16-五氧十九烷-1,19-二酸1-苯甲酯(I1)(100 mg，0.19 mmol，1當量)之無水乙酸乙酯(15 mL)在30磅/平方吋(psi)下，於10%鈀/碳(10 mg，10 wt%)上氫化45分鐘。反應混合物經矽藻土過濾，用無水乙酸乙酯洗滌。在減壓下蒸發產生呈無色油狀之產物I2(74 mg，89%)。分析資料：RT(在LC上不可見)MS(ES+) m/z(相對強度) 458([M+Na]+,55),436([M+H]+,12)。
化合物 I3
添加N,N-二異丙基二乙胺(8.4 μL，6 mg，5.97×10-5 mol，1.1當量)至胺二肽(12c)(50 mg，5.42×10-5 mol，1.0當量)及酸-dPeg5-NHS酯(I2)(28 mg，6.5×10-5 mol，1.2當量)於無水DCM(5 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液24小時。在減壓下蒸發反應混合物，產生淺黃色油狀物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：96%氯仿/4%甲醇至92%氯仿/8%甲醇，甲醇以0.5%遞增]進行純化，產生呈黃色玻璃狀之產物I3(42 mg，64%)。分析資料：RT 2.78 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1242([M+H]+,40)。
化合物 49
在氮氣氛圍下添加1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺(9.1 mg，4.76×10-5 mol，1.6當量)至N-羥基丁二醯亞胺(5.8 mg，5.06×10-5 mol，1.7當量)及酸( I3 )於無水DCM(6 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物48小時。溶液用DCM(10 mL)洗濾。DCM溶液用水(20 mL)、鹽水(20 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發。產物49(32 mg，80%)不經進一步純化即使用。分析資料：RT 2.88 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1339([M+H]+,100)。
化合物 50
在氮氣氛圍下添加Pd(PPh3)4(61 mg，0.053 mmol，0.01當量)至alloc化合物(8)(2.0 g，5.3 mmol，1.0當量)及吡咯啶(0.47 g，0.55 mL，6.63 mmol，1.25當量)於無水DCM中之溶液中。在室溫下攪拌溶液16小時。LCMS指示存在未反應之alloc化合物。添加另外數份之吡咯啶(0.38 g，0.44 mL，5.3 mmol，1.0當量)及Pd(PPh3)4(61 mg，0.053 mmol，0.01當量)且再繼續反應30分鐘。在減壓下蒸發溶劑。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿，接著98%氯仿/2%甲醇至90%氯仿/10%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈白色粉末狀之產物50(1.37 g，88%)。分析資料：RT 0.33 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 294([M+H]+,60),MS(ES-) m/z(相對強度) 292([M-H]-,100)。
化合物 51
添加EEDQ(1.22 g，4.93 mmol，1.05當量)至胺二肽(50)(1.37 g，4.69 mmol，1當量)及m-dPeg2酸(0.73 g，4.93 mmol，1.05當量)於無水THF(60 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液5天。在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由急驟管柱層析[100%氯仿至95%氯仿/5%甲醇，甲醇以1%遞增]純化，產生呈白色固體狀之產物51(1.46 g，74%)。分析資料：RT 2.22 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 446([M+Na]+,80),424([M+H]+,70),MS(ES-) m/z(相對強度) 422([M-H]-,100)。51之合成展示於以下流程14中。
化合物 52
在室溫下在氮氣氛圍下，添加三乙胺(0.47 g，0.65 mL，4.66 mmol，2.2當量)至經單alloc保護之雙苯胺(6)(1.68 g，2.12 mmol，1當量)及三光氣(0.226 g，0.76 mmol，0.36當量)於無水THF(40 mL)中之經攪拌溶液中。加熱反應混合物至40℃，樣品用甲醇處理且藉由LCMS分析得知為胺基甲酸甲酯。
dPeg2-苯甲基-醇(51)(1.35 g，3.18 mmol，1.5當量)及三乙胺(0.32 g，0.44 mL，3.18 mmol，1.5當量)於無水THF(60 mL)中之溶液逐滴添加至新鮮製備之異氰酸酯中。藉由LCMS在30分鐘間隔下監測反應混合物。在3小時之後，LC-MS顯示轉化為產物、存在胺基甲酸甲酯及經單alloc保護之雙苯胺(9)。添加另一份三光氣(0.056 g，0.19 mmol，0.09當量)且在40℃下再繼續反應3小時。反應混合物蒸乾，產生呈黃色油狀之粗產物，其藉由急驟層析[梯度溶離：100%氯仿至95%氯仿/5%甲醇，甲醇以1%遞增]純化，產生呈黃色泡沫狀之所要產物52(1.91 g，73%)。分析資料：RT min 3.42 min MS(ES+) m/z(相對強度) 1243([M+H]+,50),MS(ES-) m/z(相對強度) 1241([M-H])-,100)。
化合物 53
在氮氣氛圍下添加Pd(PPh3)4(35 mg，3.0×10-5 mol，0.02當量)至alloc化合物(52)(1.87 g，1.5 mmol，1.0當量)及吡咯啶(0.27 mg，310 μL，3.8 mmol，2.5當量)於無水DCM(30 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液4小時。在減壓下蒸發溶劑且產物藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿至95%氯仿/5%甲醇，甲醇以1%遞增]純化，產生產物53黃色泡沫物(1.57 g，90%)。分析資料：RT min 3.17 minMS(ES+) m/z(相對強度) 1159([M+H]+,65)。
化合物 54
在室溫下在氮氣氛圍下，添加三乙胺(0.26 g，0.36 mL，2.6 mmol，2.2當量)至經單保護之雙苯胺(53)(1.37 g，1.18 mmol，1當量)及三光氣(0.126 g，0.43 mmol，0.36當量)於無水THF(40 mL)中之經攪拌溶液中。加熱反應混合物至40℃，樣品用甲醇處理且藉由LC-MS分析得知為胺基甲酸甲酯，指示完全形成異氰酸酯。
苯甲基醇(8)(0.67 g，1.8 mmol，1.5當量)及三乙胺(0.18 g，0.25 mL，1.8 mmol，1.5當量)於無水THF(50 mL)中之溶液逐滴添加至新鮮製備的異氰酸酯中。藉由LCMS監測反應混合物且在40℃下18小時之後完全反應。反應混合物蒸乾，產生黃色油狀物，其藉由急驟層析[梯度溶離：95%乙酸乙酯/5%甲醇至93%乙酸乙酯/7%甲醇，甲醇以1%遞增]純化，產生呈白色泡沫狀之所要產物54(1.21 g，66%)。分析資料：RT min 3.42 min MS(ES+) m/z(相對強度) 1562([M+H]+,15)。
化合物 55
K2CO3(0.522 g，3.78 mmoL，5當量)於H2O(5.0 mL)中之溶液添加至乙酸酯(54)(1.18 g，0.756 mmol，1當量)於甲醇(29 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物2小時。在減壓下蒸發甲醇，殘餘物用H2O(50 mL)稀釋且用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取。合併之乙酸乙酯萃取物用H2O(200 mL)、鹽水(200 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生呈白色泡沫狀之產物55(1.052 g，94%)。分析資料：RT min 3.15 min MS(ES+) m/z(相對強度) 1478([M+H]+,5),MS(ES-) m/z(相對強度) 1477([M-H])-,100)。
化合物 56
在氮氣氛圍下，戴斯-馬丁高碘烷(0.152 g，0.36 mmoL，2.1當量)以1份添加至雙去乙醯化產物(55)(0.252 g，0.17 mmol，1當量)於無水DCM(5 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液2小時，此時LCMS指示完全反應。反應混合物用DCM(50 mL)稀釋且用飽和碳酸氫鈉水溶液(3×100 mL)、水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑，產生粗產物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿至92%氯仿/8%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈白色泡沫狀之產物56(0.17，68%)。分析資料：RT min 6.17 min MS(ES+) m/z(相對強度) 1474([M+H]+,5),MS(ES-) m/z(相對強度) 1472([M-H])-,100)。
化合物 57
在氮氣氛圍下添加Pd(PPh3)4(8 mg，6.9 μmol，6.0當量)至alloc化合物(56)(160 mg，0.108 mmol，1.0當量)及0.5 M吡咯啶之DCM溶液(0.27 mL，0.135 mmol，1.25當量)於無水DCM(18 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液30分鐘。在減壓下蒸發溶劑。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%氯仿至91%氯仿/9%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈白色粉末狀之產物57(0.114，74%)。分析資料：RT min 2.60 min MS(ES+) m/z(相對強度)1390([M+H]+,5)。
順丁烯二醯亞胺-PEG-丁二醯亞胺試劑與57之偶合得到PBD藥物-連接子58。圖1b展示PBD藥物-連接子MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 58之結構，其中MP為順丁烯二醯亞胺丙醯胺，PEG為伸乙基氧基，且PAB為對胺基苯甲氧基羰基，且imp為N-10亞胺保護基：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB。
化合物 58 (MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD；(11S,11aS)-11-羥基-8-(5-((11S,11aS)-11-羥基-10-((4-((10S,13S)-10-異丙基-13-甲基-8,11-二側氧基-2,5-二氧雜-9,12-二氮雜十四醯胺基)苯甲氧基)羰基)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,10,11,11a-六氫-吡咯并苯并[2,1-c][1,4]二氮呯-8-基氧基)戊氧基)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-吡咯并苯并[2,1-c][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((2S,5S)-37-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-異丙基-2-甲基-4,7,35-三側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧雜-3,6,34-三氮雜三十七醯胺基)苯甲酯)
添加0.5 M N,N-二異丙基二乙胺之無水DCM溶液(176 μL，8.8×10-5 mol，2.2當量)至胺二肽(57)(55 mg，3.96×10-5 mol，1.0當量)及順丁烯二醯亞胺-dPeg8-NHS酯(33 mg，4.75×10-5 mol，1.2當量)於無水DCM(6 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液24小時。在減壓下蒸發反應混合物，且將殘餘物再溶解於DCM(50 mL)中。DCM溶液用飽和碳酸氫鈉(2×100 mL)、水(100 mL)、鹽水(100 mL)萃取，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生黃色膠狀物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：氯仿至91%氯仿/9%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈白色泡沫狀之產物58(41 mg，52%)。分析資料：RT min 5.8 min. MS(MaldiTOF) m/z(相對強度) 1987.9([M+Na]+,100)。
共軛物 60
選擇對由許多癌症顯著上調之整合素αvβ6具有高度選擇性之肽生物素-A20FMDV-Cys(59)用於PBD-連接子衍生物的共軛。肽(59)(7.7 mg，3.08 μmol，1.2當量)於1/1乙腈/水(1 mL)中之溶液添加至(58)(5.05 mg，2.57 μmol，1.0當量)於1/1乙腈/水(2 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液24小時。在減壓下蒸發乙腈且藉由凍乾移除水，產生呈白色泡沫狀之產物60。藉由半製備性HPLC進行純化，隨後進行凍乾，產生呈白色泡沫狀之產物(3.4 mg，29%)。分析資料：MS(MaldiTOF) m/z(相對強度) 4458.3([M+H]+,100)。
化合物61(MP-PEG24-Val-Ala-PAB-(imp)PBD；(11S,11aS)-11-羥基-8-((5-(((11S,11aS)-11-羥基-10-(((4-((10S,13S)-10-異丙基-13-甲基-8,11-二側氧基-2,5-二氧雜-9,12-二氮雜十四醯胺基)苯甲基)氧基)羰基)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,10,11,11a-六氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸4-((2S,5S)-16-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡 咯-1-基)-5-異丙基-2-甲基-4,7,14-三側氧基-10-氧雜-3,6,13-三氮雜十六醯胺基)苯甲酯)
添加N,N-二異丙基二乙胺(6 μL，4.3×10-5 mol，2.2當量)至胺二肽(57)(27mg，1.94×10-5 mol，1當量)及順丁烯二醯亞胺-dPeg24-NHS酯(30 mg，2.13×10-5 mol，1.1當量)於無水DCM(5 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液24小時。在減壓下蒸發反應混合物，且將殘餘物再溶解於DCM(25 mL)中。DCM溶液用飽和碳酸氫鈉(2×50 mL)、水(50 mL)、鹽水(50 mL)萃取，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生黃色膠狀物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：氯仿至91%氯仿/9%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈無色膠狀之產物(22 mg，42%)。分析資料：MS(MaldiTOF) m/z(相對強度) 2691.8([M+H]+,100)。
(2S,2'S,E)-1,1'-(4,4'-(丙烷-1,3-二基雙(氧基))雙(5-甲氧基-2-硝基苯甲醯基))雙(4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-2-甲酸)二甲酯( 71 )
添加肆(三苯基膦)鈀(0)(21.6 mg)至含三氟甲磺酸酯40(230 mg)、反丙烯基酸(52.3 mg)及碳酸鈉(129 mg)之甲苯(5 mL)、乙醇(2.5 mL)及水(2.5 mL)之混合物中。反應混合物在32℃下在氬氣氛圍下攪拌3小時。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且用水、鹽水洗滌且經硫酸鎂乾燥。在過濾之後，藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量之乙酸乙酯。粗偶合產物藉由急驟管柱層析(矽膠；梯度50%/50%乙酸乙酯/己烷至80%/20%乙酸乙酯/己烷)純化。合併純溶離份且移除過量溶離劑，產生呈橙色固體狀之純產物71(110 mg，61.4%產率，LC/MS 3.52 min，m/z ES+ 764.92)。在更大規模上重複反應，產生7.21 g鈴木偶合產物。1H NMR(400 MHz,CD3OD). δ 7.78(s,2H) 6.92(s,2H),5.98(d,2H),5.89(s,2H),5.46-5.55(m,2H),5.10(dd,2H),4.37(t,4H),3.93-4.00(m,6H),3.86(s,6H),3.19-3.26(m,2H),2.80(dd,2H),2.45-2.51(m,2H),1.77(d,6H OCH3)。
(S,E)-((丙烷-1,3-二基雙(氧基))雙(5-甲氧基-2-硝基-4,1-伸苯基))雙(((S)-2-(羥基甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基)甲酮)( 72 )
在0℃(冰浴)下，呈固體狀之雙酯71(7.21 g)以1份添加至硼氫化鋰(622 mg)於無水四氫呋喃(300 mL)中之溶液中。移除冰浴且使反應混合物達到室溫。在1小時之後，TLC(在用乙酸乙酯水小規模處理之後)顯示反應不完全且因此添加額外硼氫化鋰(0.75當量)。反應混合物再攪拌2.5小時，此時TLC(在小規模處理之後)顯示反應完全。殘留硼氫化鋰用大量過量之乙酸乙酯淬滅(冰浴)且反應混合物攪拌50分鐘。有機相用水、鹽水洗滌且經硫酸鎂乾燥。硫酸鎂藉由真空過濾移除且藉由在減壓下旋轉蒸發移除乙酸乙酯，產生二醇72(5.46 g，82%產率)，其不經進一步純化即用於下一反應中(LC/MS 3.17 min，m/z ES+ 708.84)。1H NMR(400 MHz,CD3OD). δ 7.78(s,2H) 6.85(s,2H),5.97(d,2H),5.77(s,2H),5.61-5.53(m,2H),4.75-4.82(m,2H),4.38(t,4H),3.89-4.00(m,12H),3.01-3.08(m,2H) 2.46-2.51(m,4H),1.77(d,6HOCH3)。
((2S,2'S,E)-1,1'-(4,4'-(丙烷-1,3-二基雙(氧基))雙(5-甲氧基-2-硝基苯甲醯基))雙(4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-2,1-二基))雙(亞甲基)二乙酸酯( 73 )
在0℃下在三乙胺(3.68 mL)存在下，乙醯氯(1.64 mL)於無水二氯甲烷(40 mL)中之溶液逐滴添加至雙醇72(6.2 g)於二氯甲烷(200 mL)中之溶液中。使反應混合物升溫至室溫且藉由TLC及LC/MS監測反應。一旦反應完成，即依序用水、檸檬酸(0.5 N)、飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌有機相。有機層經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量二氯甲烷。殘餘物經受管柱層析(矽膠；梯度，60%乙酸乙酯/40%己烷至70%乙酸乙酯/30%己烷)。合併純溶離份且移除過量溶離劑，產生雙乙酸酯73(2.50 g，36%產率，LC/MS 3.60 min，m/z ES+ 792.63)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.77(d,J=3.4 Hz,2H),6.89(s,2H),5.99(d,J=15.2 Hz,2H),5.78(s,2H),5.65-5.45(m,J=15.4,6.8 Hz,2H),5.02-4.86(m,J=9.7,5.5 Hz,2H),4.57(s,2H),4.37(t,J=5.9 Hz,4H),4.00(s,6H),3.10-2.92(m,J=10.7 Hz,2H),2.60(dd,J=16.3,3.1 Hz,2H),2.52-2.43(m,2H),2.10(s,6H),1.78(d,J=6.7 Hz,4H)。
((2S,2'S,E)-1,1'-(4,4'-(丙烷-1,3-二基雙(氧基))雙(2-胺基-5-甲氧基苯甲醯基))雙(4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-2,1-二基))雙(亞甲基)二乙酸酯( 74 )
添加鋅粉(10 g)至雙硝基化合物73(2.5 g)於乙醇(20 mL)及乙酸乙酯(20 mL)中之溶液中，隨後添加甲酸於乙醇中之溶液(5% v/v；100 mL)。反應為溫度上升至33℃的放熱反應，用冰浴使溫度下降至15℃且攪拌反應混合物，同時藉由TLC及LC/MS密切監測。在30分鐘之後，反應視為完成，因為未偵測到痕量起始物質或中間物之故。傾析混合物且經棉絨過濾。濾液分配於乙酸乙酯(300 mL)與飽和NaHCO3水溶液(300 mL)之間。有機層進一步用鹽水(200 mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑，產生產物74(2.09 g；90%產率，LC/MS 3.35 min，m/z ES+ 732.06)。1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 6.76(s,2H),6.45(s,2H),6.33(s,2H),6.12(d,J=15.3 Hz,2H),5.54(dq,J=13.2,6.6 Hz,2H),4.90(td,J=9.6,4.5 Hz,2H),4.48(s,4H),4.42-4.33(m,4H),4.23(t,J=6.1 Hz,4H),3.79(s,6H),2.95(dd,J=16.0,10.4 Hz,2H),2.55(dd,J=16.2,3.5 Hz,2H),2.42-2.32(m,2H),2.07(s,6H),1.81(d,J=6.6 Hz,6H)。
((S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-(乙醯氧基甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-5-(((烯丙基氧基)羰基)胺基)-2-甲氧基苯氧基)丙氧基)-2-胺基-5-甲氧基苯甲醯基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-2-基)甲基( 75 )
在-78℃下，氯甲酸烯丙酯於無水二氯甲烷中之溶液逐滴添加至雙苯胺74及吡啶於無水二氯甲烷中之溶液中。反應混合物在-78℃下攪拌2小時且接著使其恢復至室溫。反應混合物依序用硫酸銅II水溶液、水、飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌。有機層經硫酸鎂乾燥，在真空下過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量二氯甲烷。TLC及LC/MS顯示存在所要mono Alloc產物75與雙Alloc產物。產物混合物經受管柱層析(矽膠；40%乙酸乙酯/60%己烷至70%乙酸乙酯/40%己烷梯度)。收集且合併含有所要單Alloc產物75之純溶離份，過量溶離劑藉由在減壓下旋轉蒸發移除，產生產物(580 mL，25%產率)。LC/MS 3.58 min,ES+ 817.02 1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 8.60(s,1H),7.85(s,1H),6.80(s,1H),6.72(s,1H),6.42(s,1H),6.37(s,1H),6.33(s,1H),6.08(dd,J=15.4,6.1 Hz,2H),6.00-5.87(m,1H),5.62-5.44(m,2H),5.34(dd,J=17.2,1.4 Hz,1H),5.23(dd,J=10.4,1.2 Hz,1H),4.88(qd,J=9.5,4.5 Hz,2H),4.67-4.57(m,2H),4.50-4.25(m,8H),4.22(t,J=6.3 Hz,2H),3.82(s,3H),3.76(s,3H),3.00-2.85(m,2H),2.58-2.47(m,2H),2.37(p,J=6.1 Hz,2H),2.06(s,6H),1.81-1.73(m,6H)。
乙酸((2S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-(乙醯氧基甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-5-((((4-(2-(2-(((烯丙基氧基)羰基j胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲基)氧基)羰基)胺基)-2-甲氧基苯氧基)丙氧基)-2-(((烯丙基氧基)羰基)胺基)-5-甲氧基苯甲醯基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-2-基)甲酯( 76 )
在惰性氛圍下添加無水三乙胺(0.206 mL)至經單alloc保護之雙苯胺75(560 mg)及三光氣(72 mg)於無水四氫呋喃(20 mL)中之經攪拌溶液中。在40℃下加熱反應混合物且移除樣品並用甲醇處理。LC/MS顯示完全轉化成胺基甲酸甲酯，指示游離胺基已成功轉化成反應性異氰酸酯中間物。在40℃下，alloc-val-ala-PABOH(381 mg)及三乙胺(0.14 mL)於無水四氫呋喃(20 mL)中之溶液快速注射至反應容器中。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，隨後，移除樣品且用甲醇處理。LC/MS顯示無痕量胺基甲酸甲酯，指示所有異氰酸酯皆已消耗。反應混合物蒸乾，產生粗產物，其藉由管柱層析(矽膠；氯仿至2%甲醇/98%氯仿梯度)純化。收集且合併純溶離份且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，產生純產物76(691 mg，84%產率)。LC/MS 3.73 min，ES+1220.21。
((S,E)-(丙烷-1,3-二基雙(氧基))雙(2-((S)-2-(羥基甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基j-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-伸苯基))二胺基甲酸烯丙酯4-(2-(2-(((烯丙基氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲酯( 77 )
在室溫下添加碳酸鉀水溶液(770 mg於4.8 mL水中)至雙乙酸酯76(680 mg)於甲醇(29 mL)中之溶液中。如藉由LC/MS所監測，去乙醯化反應在30分鐘內完成。反應混合物用二氯甲烷(200 mL)稀釋且有機相依序用檸檬酸(0.5 N，100 mL)、水(200 mL)及鹽水(100 mL)洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾(真空過濾)懸浮液且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。殘餘物經受管柱層析(矽膠；1.5%甲醇/98.5%氯仿至3.5%甲醇/96.5%氯仿梯度)。合併純溶離份且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，產生二醇77(530 mg，84%產率)。LC/MS 3.40 min，ES+ 1136.49。
(11S,11aS)-8-(3-(((11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙基氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲基)氧基)羰基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,10,11,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯( 78 )
在室溫下，戴斯-馬丁高碘烷(373 mg，4當量)以1份添加至77(250 mg)及吡啶(0.36 mL，20當量)於無水二氯甲烷(10 mL)中之溶液中。藉由TLC(5%甲醇/氯仿)密切監測顯示在30分鐘之後，起始物質消失。反應物用偏亞硫酸氫鈉及碳酸氫鈉溶液處理，隨後用鹽水處理。二氯甲烷層經硫酸鎂乾燥且真空過濾。接著用催化量之DMAP(約10 mg)處理二氯甲烷溶液，從而使得主要產物點聚結成如藉由TLC/LC/MS所觀測之一點。過濾溶液且藉由在減壓下旋轉蒸發移除二氯甲烷。所得殘餘物經受管柱層析(矽膠；1.5%甲醇/98.5%氯仿至3%甲醇/97%氯仿梯度)。收集純溶離份且藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶離劑，產生所要環化產物78(62 mg，25%產率)。LC/MS 3.35 min，ES+ 1132.19，ES- 1130.25。
(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,11a-二氫-吡咯并[2,1-c][1,4]d 苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲酯( 79 )
在氬氣氛圍下添加Pd(PPh3)4(1.9 mg)至alloc化合物(78)(62 mg)及吡咯啶(22.6 μL)於無水DCM(3 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液1.5小時。在減壓下蒸發溶劑。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：3%甲醇/97%氯仿至90%氯仿/10%甲醇]進行純化，產生呈白色粉末狀之產物(26 mg，50%)。LC/MS: RT 2.70 min MS(ES+) 946.17。
(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,11a-二氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氫-吡咯并苯并[2,1-c][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((2S,5S)-25-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-異丙基-2-甲基-4,7,23-三側氧基-10,13,16,19-四氧雜-3,6,22-三氮雜二十五醯胺基)苯甲酯( 80 )
添加N,N-二異丙基二乙胺i溶液(2.6 μL)至胺二肽79(13 mg)及順丁烯二醯亞胺-dPeg4-NHS酯(8.5 mg)於無水DCM(4 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液24小時。反應混合物在減壓下蒸發且殘餘物經受半製備性TLC(10%甲醇/90%氯仿)，產生所要順丁烯二醯亞胺14之純樣品。LC-MS滯留時間2.87 min ES+ 1344.29。
Boc-Val-Cit-PABOH( 82 )
Boc-Val-OSu(10.0 g，31.8 mmol，1當量)於THF(50 mL)中之溶液添加至H-Cit-OH(5.85 g，33.4 mmol，1.05當量)及NaHCO3(2.94 g，34.9 mmoL，1.1當量)於THF(50 mL)及H2O(100 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌混合物72小時且在減壓下蒸發THF。用檸檬酸調整pH值至3以使白色膠狀物沈澱。此物用10% IPA/乙酸乙酯(8×150 mL)萃取，合併之萃取物用鹽水(300 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。在減壓下蒸發產生白色泡沫物，其在減壓下乾燥18小時。用音波處理使泡沫物懸浮於***中，隨後過濾，產生呈精細白色粉末狀之產物(10.6 g，89%)。在室溫下攪拌含一部分此物質(7.2 g，19.2 mmol，1當量)、對胺基苯甲基醇(2.6 g，21.15 mmol，1.1當量)及EEDQ(9.5 g，38.5 mmol，2.0當量)之DCM/MeOH(100 mL/50 mL)24小時。溶劑在減壓下蒸發且殘餘膠狀物在音波處理下用***濕磨，所得產物藉由過濾收集且在減壓下乾燥，產生呈白色固體狀之產物82(6.6 g，71%)。分析資料：RT 2.42 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 479.8([M+1]+,60)，MS(ES-) m/z(相對強度) 477.6([M-H])-,90)。
化合物82之合成展示於下文流程16中。
乙酸(( S )-1-(4-((5-(4-(( S )-2-(乙醯氧基甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-5-((((4-(( S )-2-(( S )-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲基)氧基)羰基)胺基)-2-甲氧基苯氧基)戊基)氧基)-2-(((烯丙基氧基)羰基)胺基)-5-甲氧基苯甲醯基)-4-亞甲基吡咯啶-2-基)甲酯( 83 )
在室溫下在氬氣氛圍下，添加三乙胺(0.14 g，0.19 mL，1.4 mmol，2.2當量)至經單alloc保護之雙苯胺(6)(0.505 g，0.64 mmol，1當量)及三光氣(0.068 g，0.23 mmol，0.36當量)於無水THF(10 mL)中之經攪拌溶液中。加熱反應混合物至40℃，樣品用甲醇處理且藉由LCMS分析得知為胺基甲酸甲酯。
苯甲基醇(82)(0.46 g，0.96 mmol，1.5當量)及三乙胺(0.096 g，0.13 mL，0.96 mmol，1.5當量)於無水THF/DMF(20 mL/1 mL)中之溶液逐滴添加至新鮮製備的異氰酸酯中。反應混合物藉由LC-MS監測且在40℃下2小時之後完全反應。反應混合物蒸乾且殘餘物分配於10% IPA/DCM與水之間。分離有機部分且用水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生棕色泡沫物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：氯仿至93%氯仿/7%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈白色固體狀之產物(0.5 g，60%)。分析資料：RT 3.42 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1298([M+H]+,100)。
(( S )-(戊烷-1,5-二基雙(氧基))雙(2-(( S )-2-(羥基甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-伸苯基))二胺基甲酸烯 丙酯4-(( S )-2-(( S )-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯( 84 )
K2CO3(0.28 g，2.0 mmoL，5.4當量)於H2O(2 mL)中之溶液添加至乙酸酯(83)(0.49 g，0.4 mmol，1當量)於甲醇(10 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物2小時。在減壓下蒸發甲醇，殘餘物用H2O(10 mL)稀釋且用1 M檸檬酸酸化至pH 3。混合物用DCM(4×50 mL)萃取且合併之萃取物用鹽水(100 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生呈白色泡沫狀之產物(0.43 g，94%)。分析資料：RT 3.12 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1214([M+H]+,100),MS(ES-) m/z(相對強度) 1212([M-H])-,100)。
(11 S ,11a S )-8-((5-(((11 S ,11a S )-10-(3-(4-(( S )-2-(( S )-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯基)丙醯基)-11-羥基-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,10,11,11a-六氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯( 85 )
在氮氣氛圍下，穩定之45 wt% 2-碘醯基苯甲酸(IBX)(0.18 g，0.29 mmol，2.4當量)以1份添加至雙去乙醯化產物(55)(0.147 g，0.12 mmol，1當量)於無水DMSO(4 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液26小時。添加另一份IBX(15 mg，2.4×10-5，0.2當量)且再繼續反應18小時。反應混合物用H2O(10 mL)稀釋，用10% MeOH/DCM(4×25 mL)萃取且合併之萃取物用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100 mL)、水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌，且乾燥(MgSO4)。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑，產生粗產物。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：100%二氯甲烷至94%二氯甲烷/6%甲醇，甲醇以1%遞增]進行純化，產生呈白色固體狀之產物85(77 mg，53%)。分析資料：RT 2.98 min;MS(ES+) m/z(相對強度)1210([M+H]+,100),MS(ES-) m/z(相對強度) 1208([M-H])-,100)。
(11 S ,11a S )-8-((5-(((11 S ,11a S )-10-(((4-(( S )-2-(( S )-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲基)氧基)羰基)-11-羥基-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,10,11,11a-六氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯( 86 )
在0℃下添加冷三氟乙酸(3 mL)至經Boc保護之化合物(85)(72 mg，6.0×10-5 mol)中。在此溫度下攪拌溶液15分鐘。反應混合物傾至冰上且用飽和NaHCO3溶液調整pH值至pH 8。溶液用DCM(4×25 mL)萃取且合併之萃取物用飽和鹽水(100 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)且在減壓下蒸發，產生呈白色固體狀之產物(55 mg，83%)。分析資料：RT 2.53 min;MS(ES+) m/z(相對強度) 1110([M+H]+,100)，MS(ES-) m/z(相對強度) 1108([M-H])-,100)。
(11 S ,11a S )-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-((( S )-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二 氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸4-(( S )-2-(( S )-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯( 86 )
在氮氣氛圍下添加Pd(PPh3)4(2.7 mg，2.3 μmol，0.03當量)至alloc化合物(85)(80 mg，72 μmol，1.0當量)及比咯啶(30 μL，26 mg，0.36 mmol，5當量)於無水DCM(3 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液2小時。在減壓下蒸發溶劑。藉由急驟管柱層析[梯度溶離：90%氯仿/10%甲醇至76%氯仿/24%甲醇]進行純化，產生呈白色粉末狀之產物(62.5 g，86%)。分析資料：RT 2.45 min MS(ES+) m/z(相對強度) 1008([M+H]+,80)。
(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯( 87 )
在氬氣氛圍下添加N,N-二異丙基二乙胺(12 μL，7.1×10-5 mol，5.0當量)至胺二肽(86)(14.2 mg，1.4×10-5 mol，1當量)及6-順丁烯二醯亞胺-己酸-NHS酯(4.8 mg，1.55×10-5 mol，1.1當量)於無水DCM/DMA(2 mL/0.2 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌溶液72小時。在減壓下蒸發反應混合物且殘餘物藉由急驟管柱層析[梯度溶離：氯仿至93%氯仿/7%甲醇，甲醇以1%遞增]純化，產生呈灰白色泡沫狀之產物(5 mg，29%)。分析資料：RT 2.83 min MS(ES+) m/z(相對強度) 1201([M+H]+,100)。
還原/氧化用於共軛之ThioMab
用約20-40倍過量之TCEP(參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)或DTT(二硫蘇糖醇)於含有2 mM EDTA之50 mM Tris(pH 7.5)中還原表現於CHO細胞中之半胱胺酸經工程改造的全長單株抗體(硫代單抗)，在37℃下歷時3小時或在室溫下隔夜。(Getz等人，(1999) Anal. Biochem.第273:73-80卷；Soltec Ventures,Beverly,MA)。用10 mM乙酸鈉(pH 5)稀釋經還原之ThioMab且裝載於HiTrap S管柱上，並用含有0.3 M氯化鈉之PBS溶離。或者，抗體藉由添加1/20體積之10%乙酸加以酸化，用10 mM丁二酸鹽(pH 5)稀釋，裝載於管柱上且接著用10個管柱體積之丁二酸鹽緩衝液洗滌。管柱用50 mM Tris(pH 7.5)、2 mM EDTA溶離。
所溶離之經還原ThioMab用200 nM硫酸銅(CuSO4)水溶液或15倍莫耳過量之DHAA(去氫抗壞血酸)處理。鏈間雙硫鍵之氧化在約3小時或大於3小時內完成。環境空氣氧化亦有效。經再氧化之抗體透析入20 mM丁二酸鈉(pH 5)、150 mM NaCl、2 mM EDTA中且冷凍儲存在-20℃下。
ThioMab與藥物-連接子化合物共軛以製備抗體-藥物共軛物
如上所述之再氧化ThioMab與2.5至10倍過量之藥物-連接子中間物(15ba、15bb、15d、58)組合，混合，且使其在室溫下靜置約1小時以實現共軛且形成表1中之ThioMab抗體-藥物共軛物101-115。共軛混合物藉由凝膠過濾、陽離子交換層析或透析純化以移除過量藥物-連接子中間物及其他雜質。
Tr=硫醇曲妥珠單抗、抗HER2、4D5 HC A118C(依序編號)、A114C(Kabat編號)imp=N-10亞胺保護基：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB-特定言之，將藥物-連接子中間物15d(MW 1496.65)溶解於DMA(二甲基乙醯胺)中獲得20 mM之濃度。解凍經再氧化、半胱胺酸經工程改造之H118C曲妥珠單抗抗體(Tr)且添加3倍莫耳過量之15d。在實驗顯示抗體凝集在較高pH值下增加之後，在pH5下進行反應。藉由LC-MS分析監測藥物共軛程度。在3小時之後另添加1倍當量之15d且使反應在4℃下繼續進行以產生粗ADC 114。
在用丁二酸鹽稀釋之後，抗體-藥物共軛物曲妥珠單抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 114接著施加於陽離子交換管柱，用至少10個管柱體積之丁二酸鹽洗滌且用PBS溶離。使用凝膠過濾管柱將抗體-藥物共軛物114調配於20 mM His/乙酸鹽(pH 5)、240 mM蔗糖中。抗體-藥物共軛物114藉由以下進行表徵：進行紫外光譜分析以測定蛋白質濃度；進行分析SEC(尺寸排阻層析)以達成凝集分析及在還原之前及之後進行LC-MS以確定藥物裝載量。
使用Shodex KW802.5管柱，用含有0.25 mM氯化鉀及15% IPA之0.2 M磷酸鉀(pH 6.2)以0.75 ml/min之流速進行尺寸排阻層析。藉由對280 nm下之溶離峰面積吸光度積分來確定共軛物之凝集狀態。SEC分析顯示以積分面積計，8.08分鐘時之凝集ADC佔4.1%且8.99分鐘時之單體ADC 114佔95.9%。
使用Agilent QTOF 6520 ESI儀器進行LC-MS分析。舉例而言，114曲妥珠單抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD用DTT(二硫蘇糖醇)還原且裝載於1000 ，8 μm PLRP-S管柱(Varian)上，加熱至80℃並用30% B至40% B的梯度在5分鐘內溶離。移動相A為含0.05% TFA之H2O，移動相B為含0.04% TFA之乙腈。流速為0.5 ml/min。藉由在A 280 nm下偵測紫外吸光度來監測蛋白質溶離，隨後進行電噴霧電離及TOF分析。對裸輕鏈、殘餘裸重鏈及藥物化重鏈達成基線層析解析。使用Agilent Mass Hunter(TM)軟體將所得m/z光譜解除重疊(deconvoluted)以計算經還原抗體片段之質量。
MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 58(圖1)之分子量(MW)=1964道爾頓解除重疊之質量觀測值：23440道爾頓對應於裸LC之MW50627道爾頓對應於裸HC之MW52591道爾頓對應於藥物化HC之MW因此，52591道爾頓處之觀測峰對應於具有1個藥物部分之預期重鏈(HC)片段(50627道爾頓)、藥物-連接子中間物58(1964道爾頓)。
當用於與PBD藥物-連接子中間物共軛之抗體不為半胱胺酸經工程改造之抗體時，鏈間雙硫鍵藉由在37℃下添加含約2.2莫耳過量之TCEP之磷酸鹽(pH 7.5)維持2小時而得以部分還原。每當量TCEP理論上產生2個反應性半胱胺酸。通常對於約3.5之目標藥物/抗體比率(DAR)，添加1.8-2莫耳過量之TCEP。還原之後通常無需純化步驟。添加對反應性半胱胺酸而言略微過量(1.2-1.5倍)之藥物-連接子中間物，即對抗體而言約8莫耳當量之藥物-連接子中間物，且在室溫下進行反應約1小時。可藉由透濾、離子交換或凝膠過濾進行純化。DAR可藉由經還原共軛物之疏水性相互作用層析(HIC)或LC-MS，使用紫外A280面積積分來測定。
活體外細胞增殖檢定
藉由採用以下方案之細胞增殖檢定量測ADC之功效
(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay,Promega Corp. Technical Bulletin TB288；Mendoza等人，(2002) Cancer Res. 62:5485-5488)：
1.將100 μl細胞培養物等分試樣置放於96孔不透明壁板的各孔中，該細胞培養物於培養基中含有約104個細胞(例如KPL-4，一種人類乳癌細胞株，Kurebayashi等人，(1999) Brit. Jour. Cancer 79(5-6):707-717)；SKBR-3；BT474；MCF7或MDA-MB-468)。
2.製備含有培養基且無細胞之對照孔。
3.添加ADC至實驗孔中且培育3-5天。
4.板平衡至室溫維持約30分鐘。
5.添加與各孔中存在之細胞培養基體積相等之體積的CellTiter-Glo試劑。
6.在迴轉式振盪器上混合內含物2分鐘以誘導細胞溶解。
7.在室溫下培育板10分鐘以穩定發光信號。
8.記錄發光且於圖中以RLU=相對發光單位報導。
某些細胞以1000-2000/孔或2000-3000/孔接種於96孔板中，50 μL/孔。在1或2天之後，以50 μL體積添加ADC以達到9000、3000、1000、333、111、37、12.4、4.1或1.4 ng/ml之最終濃度，「無ADC」對照孔僅接收培養基。各條件為一式兩份或一式三份。在3-5天之後，每孔添加100μL Cell TiterGlo II(基於螢光素酶之檢定；根據ATP含量量度增殖)且使用照度計測定細胞計數。資料以各組平行測定之發光之平均值形式繪圖，使用標準偏差誤差條圖。方案為CellTiter Glo發光細胞存活率檢定(Promega)之修改形式：
1.將每孔1000個細胞接種於每孔50 μL FBS/麩醯胺酸培養基中。使細胞附著隔夜。
2. ADC以操作濃度18 μg/ml(此產生9 μg/ml之最終濃度)開始3倍連續稀釋於培養基中。添加50 μL稀釋ADC至50 μL已含於孔中之細胞及培養基中。
3.培育72-96小時(標準為72小時，但當細胞有85-95%匯合時監視0 μg/mL濃度以停止檢定)。
4.添加每孔100 μL Promega Cell Titer Glo試劑，振盪3分鐘且在照度計上進行讀取。
結果
圖2展示在5天時SK-BR-3活體外細胞存活率相對於以下之濃度的曲線：Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101(●)、抗CD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102(▲)、Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103(◆)及抗CD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104，其中Tr為抗HER2硫醇曲妥珠單抗4D5 HC A118C，重鏈半胱胺酸經工程改造之抗體突變體係根據依序編號流程加以編號。
表現HER2之SK-BR-3細胞之增殖由抗HER2抗體-藥物共軛物101及103而非由抗CD22抗體藥物共軛物102及104選擇性抑制。此等結果證實PBD抗體-藥物共軛物之活體外目標依賴性選擇性殺傷效應。
圖3展示在5天時KPL-4活體外細胞存活率相對於以下之濃度的曲線：Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101(●)、抗CD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102(▲)、Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103(◆)及抗CD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104(▼)，其中Tr為抗HER2硫醇曲妥珠單抗4D5 HC A118C，重鏈半胱胺酸經工程改造之抗體突變體係根據依序編號流程加以編號。
在5天研究中針對SK-BR-3、KPL-4及MCF-7(Levenson等人，(1997) Cancer Res. 57(15):3071-3078)細胞測試抗體-藥物共軛物曲妥珠單抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 114及曲妥珠單抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 115以量測活體外細胞存活率。114針對SK-BR-3之IC50值(μg/mL)為17.2且針對KPL-4之IC50值為68.1。115針對SK-BR-3之IC50值為12.3且針對KPL-4之IC50值為50.7。114與115對不表現HER2之人類乳腺癌細胞株MCF-7實際上均為非活性。因此，共軛物114及115顯示靶向細胞殺傷效能。
高量表現HER2之轉殖基因外植體小鼠中之腫瘤生長抑制活體內功效
適於轉殖基因實驗之動物可自標準商業來源，諸如Taconic(Germantown,N.Y.)獲得。許多品系為適合的，但FVB雌性小鼠由於其對腫瘤形成之敏感性較高而較佳。FVB雄性用於交配且切除輸精管之CD.1種雄鼠(stud)用於刺激假孕。切除輸精管之小鼠可自任何商業供應商獲得。首建者(founder)與FVB小鼠或129/BL6×FVB p53異種接合小鼠繁殖。在p53對偶基因處具有異種接合性之小鼠用於潛在增加腫瘤形成。然而，此已證明並非必需。因此，一些F1腫瘤具有混合株系。首建者腫瘤僅為FVB。獲得6個具有一些發展中之腫瘤而未產仔的首建者。具有腫瘤(自Fo5 mmtv轉殖基因小鼠繁殖之同種異體移植物)之動物藉由IV注射ADC用單次或多次劑量加以處理。在注射之後之多個時間點評估腫瘤體積。
腫瘤易出現於表現突變活化形式之neu(HER2之大鼠同源物)之轉殖基因小鼠中，但過度表現於人類乳癌中之HER2不突變且過度表現非突變HER2之轉殖基因小鼠中之腫瘤形成的強度小得多(Webster等人，(1994) Semin. Cancer Biol. 5:69-76)。
為了改良非突變HER2情況下之腫瘤形成，使用HER2 cDNA質體產生轉殖基因小鼠，該等質體中缺失上游ATG以免在此等上游ATG密碼子處起始轉譯，否則會降低自HER2之下游真正起始密碼子起始轉譯之頻率(參見例如Child等人，(1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341)。另外，添加嵌合內含子至5'端中，此亦應增強表現量，如早期所報導(Neuberger及Williams(1988) Nucleic Acids Res. 16:6713；Buchman及Berg(1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395；Brinster等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836)。嵌合內含子來源於Promega載體(Pci-neo哺乳動物表現載體(bp 890-1022))。cDNA 3'端由人類生長激素外顯子4及5以及聚腺苷酸化序列側接。此外，使用FVB小鼠，因為此品系對腫瘤形成更敏感。來自MMTV-LTR之啟動子用於確保乳腺中之組織特異性HER2表現。對動物餵食AIN 76A膳食以增加對腫瘤形成之敏感性(Rao等人，(1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158)。
Fo5鼠類乳腺腫瘤模型
Fo5模型為轉殖基因小鼠模型，其中人類HER2基因在鼠類乳腺腫瘤病毒啟動子(MMTV-HER2)之轉錄調控下過度表現於乳腺上皮細胞中。過度表現導致自發形成過度表現人類HER2受體之乳腺腫瘤。1個首建者動物(5號首建者[Fo5])之乳腺腫瘤已藉由連續移植腫瘤片段而在FVB小鼠之後代中繁殖。在用於活體內功效研究之前，MMTV-HER2 Fo5轉殖基因乳腺腫瘤以尺寸約2×2 mm之片段用手術移植入nu/nu小鼠(來自Charles River Laboratories)之第2/3號乳腺脂肪墊中。當腫瘤達到所要體積時，將具有腫瘤之小鼠隨機分組且藉由IV注射ADC給與單次劑量。
結果
圖4展示在第0天單次iv給與以下物之後，接種於CRL nu/nu小鼠中之乳癌模型MMTV-HER2 Fo5乳腺同種異體移植腫瘤中活體內平均腫瘤體積隨時間變化的曲線：(1)媒劑20 mM組胺酸乙酸鹽(pH 5.5)、240 mM蔗糖，(2)抗Steap1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 107，10 mg/kg，(3)抗Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 108，10 mg/kg，(4)Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101，10 mg/kg，及(5)Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103，10 mg/kg。圖中之線條用以下符號指示：
抗HER2共軛物101及103顯示目標特異性腫瘤生長抑制。在用共軛物101處理之10個動物中，有2個顯示部分反應。在用共軛物103處理之10個動物中，有3個顯示部分反應。非靶向對照ADC 107及108對腫瘤生長無影響。
在另一例示性研究中，在第0天單次iv給與以下物之後，量測接種於CRL nu/nu小鼠中之乳癌模型MMTV-HER2 Fo5乳腺同種異體移植腫瘤中活體內平均腫瘤體積隨時間的變化：(1)媒劑20 mM組胺酸乙酸鹽(pH 5.5)、240 mM蔗糖；(2)112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，5 mg/kg(ADC劑量)，300 μg/m2(PBD藥物暴露量)；(3)112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，10 mg/kg，600 μg/m2；(4)114曲妥珠單抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，5 mg/kg，284 μg/m2；(5)114曲妥珠單抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，10 mg/kg，569 μg/m2；(6)113 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD，10 mg/kg，807 μg/m2；及(7)115曲妥珠單抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD，10 mg/kg，790 μg/m2。在0、3、7及10天時量測腫瘤尺寸。在10天之後，(1)給與媒劑之動物顯示在含10個動物之組中，腫瘤尺寸增加且無腫瘤抑制；(2)給與112之動物顯示在含10個動物之組中，無部分或完全反應；(3)給與112之動物顯示在含10個動物之組中，無部分或完全反應；(4)給與114之動物顯示在含10個動物之組中，有9個部分反應；(5)給與114之動物顯示在含10個動物之組中，有10個部分反應；(6)給與113之動物顯示在含10個動物之組中，無部分或完全反應；及(7)給與115之動物顯示在含10個動物之組中，有10個部分反應。因此，抗HER2靶向ADC 114及115顯示靶向腫瘤抑制，而陰性對照媒劑及非靶向ADC 112及113不顯示靶向腫瘤抑制。
LuCap35V人類***腫瘤模型
自華盛頓大學(University of Washington)(Seattle,WA)獲得之LuCap35V為LuCap35人類***外植體腫瘤模型之雄激素非依賴性變異體(Corey E,Quinn JE,Buhler KR等人，LuCap35: a new model of prostate cancer progression to androgen independence. The Prostate 2003;55:239-46)。用於建立LuCap35之組織係自含有轉移性***癌之腹股溝淋巴結活檢體分離且隨後植入小鼠之側腹中(Corey等人，2003)。LuCap35V外植體模型係如下維持：在華盛頓大學連續植入經閹割之雄性C.B-17 Fox Chase SCID小鼠中達38代，隨後在Genentech植入Charles River Laboratories之經閹割之雄性C.B-17 SCID米色小鼠中連續傳代。在用於活體內功效研究之前，LuCap35V腫瘤碎片(約20-30 mm3)皮下植入經閹割之雄性C.B-17 SCID米色小鼠之右側腹中。在腫瘤植入之前2週閹割動物以允許有時間使殘留睪固酮含量達到零。當腫瘤達到所要體積時，將具有腫瘤之小鼠隨機分組且藉由IV注射ADC給與單次劑量。
結果
圖5展示在第0天單次iv給與以下物之後，經閹割之雄性SCID米色小鼠中之***癌模型LuCap35V異種移植腫瘤中活體內平均腫瘤體積隨時間變化的曲線：(1)媒劑20 mM組胺酸乙酸鹽(pH 5.5)、240 mM蔗糖(▲)，(2)抗CD22-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 110，5 mg/kg(●)，及(3)抗Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 109，5 mg/kg(▇)。
圖6展示在第0天單次iv給與以下物之後，經閹割之雄性SCID米色小鼠中之***癌模型LuCap35V異種移植腫瘤中活體內平均腫瘤體積隨時間變化的曲線：(1)媒劑20 mM組胺酸乙酸鹽(pH 5.5)、240 mM蔗糖(▲)，(2)107抗Steap1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD，9.8 mg/kg，60 μg/m2(▇)，(3)107抗Steap1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD，19.5 mg/kg，120 μg/m2(●)，(4)108抗Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD，3.3 mg/kg，60 μg/m2(□)，(5)108抗Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD，6.5 mg/kg，120 μg/m2(○)，(6)105曲妥珠單抗-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD，9.4 mg/kg，120 μg/m2(◆)及(7)106曲妥珠單抗-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD，8.6 mg/kg(ADC劑量)，120 μg/m2(PBD藥物暴露量)(X)。
在另一例示性研究中，在第0天單次iv給與以下物之後，量測經閹割之雄性SCID米色小鼠中之***癌模型LuCap35V異種移植腫瘤中活體內平均腫瘤體積隨時間的變化：(1)媒劑20 mM組胺酸乙酸鹽(pH 5.5)、240 mM蔗糖，(2)112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，3 mg/kg(ADC劑量)，68.3 μg/m2(PBD藥物暴露量)，(3)111抗Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，1 mg/kg，22.15 μg/m2，(4)111抗Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，3 mg/kg，66.4 μg/m2，(5)113 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD，3 mg/kg，70.1 μg/m2，及(6)109抗Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD，3 mg/kg，64.6 μg/m2。每4天量測腫瘤尺寸。在27天之後，(1)給與媒劑之動物顯示在含8個動物之組中，腫瘤尺寸增加且無腫瘤抑制；(2)給與112之動物顯示在含8個動物之組中，有1個部分反應；(3)給與111之動物顯示在含6個動物之組中，有4個部分反應及4個完全反應；(4)給與111之動物顯示在含5個動物之組中，有5個部分反應及3個完全反應；(5)給與113之動物顯示在含8個動物之組中，無部分或完全反應；及(6)給與109之動物顯示在含7個動物之組中，有7個部分反應及1個完全反應。抗Steap1靶向ADC 109及111顯示靶向腫瘤抑制，而陰性對照媒劑及非靶向ADC 112及113不顯示靶向腫瘤抑制。
縮寫
Ac　乙醯基
Acm　乙醯胺基甲基
Alloc　烯丙氧基羰基
Boc　二碳酸二-第三丁酯
t-Bu　第三丁基
Bzl　苯甲基，其中Bzl-OMe為甲氧基苯甲基且Bzl-Me為甲基苯
Cbz或Z　苯甲氧基-羰基，其中Z-Cl及Z-Br分別為氯苯甲氧基羰基及溴苯甲氧基羰基
DMF　N,N-二甲基甲醯胺
Dnp　二硝基苯基
DTT　二硫蘇糖醇
Fmoc　9H-茀-9-基甲氧基羰基
imp　N-10亞胺保護基：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB
MC-Osu　順丁烯二醯亞胺己醯基-O-N-丁二醯亞胺
Moc　甲氧基羰基
MP　順丁烯二醯亞胺丙醯胺
Mtr　4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺醯基
PAB　對胺基苯甲氧基羰基
PEG　伸乙基氧基
PNZ　胺基甲酸對硝基苯甲酯
Psec　2-(苯基磺醯基)乙氧基羰基
TBDMS　第三丁基二甲基矽烷基
TBDPS　第三丁基二苯基矽烷基
Teoc　2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基
Tos　甲苯磺醯基
Troc　2,2,2-三氯乙氧基甲醯氯
Trt　三苯甲基
Xan　黃嘌呤酸基參考文獻
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圖1展示本發明之特定實施例。
圖2至6展示關於本發明之特定實施例之生物測試結果。
(無元件符號說明)

Claims (51)

  1. 一種式(AB)或(AC)之共軛物， 及其鹽，其中：點線指示視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況另外選自鹵基或二鹵基；其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R10為與細胞結合劑連接之連接子，該細胞結合劑係選自抗體、含有至少1個結合位點之抗體片段及環狀多肽，細胞結合劑為R10之一部分； Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或在Q為O的情況下為SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且就基團NRR'而言，R及R'視情況連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子，及/或芳族環，該等環視情況經NH2取代；且各X為O、S或N(H)；及其中R2"、R6"、R7"、R9"、X"、Q"及R11"分別根據R2、R6、R7、R9、X、Q及R11所定義，且RC為封端基團。
  2. 如請求項1之共軛物，其中R10為以下基團： 其中星號指示連至N10位置之連接點，CBA為細胞結合劑，L1為可分解之連接子，A為連接L1與該細胞結合劑之連接基團，L2為共價鍵或連同-OC(=O)-一起形成自我分解型連接子。
  3. 如請求項2之共軛物，其中L1可經酶分解。
  4. 如請求項3之共軛物，其中L1包含二肽且二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-係選自：-Phe-Lys-， -Val-Ala-，-Val-Lys-，-Ala-Lys-，-Val-Cit-，-Phe-Cit-，-Leu-Cit-，-Ile-Cit-，-Phe-Arg-，-Trp-Cit-。
  5. 如請求項4之共軛物，其中二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-為-Phe-Lys-、-Val-Ala-或-Val-Cit-。
  6. 如請求項4之共軛物，其中該基團X2-CO-與L2連接，且該基團NH-X1-與A連接。
  7. 如請求項4之共軛物，其中L2連同OC(=O)一起形成自我分解型連接子。
  8. 如請求項7之共軛物，其中C(=O)O及L2一起形成以下基團： 其中星號指示連至該N10位置之連接點，波形線指示連至該連接子L1之連接點，Y為NH、O、C(=O)NH或C(=O)O，且n為0至3。
  9. 如請求項8之共軛物，其中Y為NH且n為0。
  10. 如請求項2之共軛物，其中L1及L2連同-OC(=O)-一起構成 選自以下之基團： 或 其中星號代表連至該N10位置之連接點，且波形線代表連至A之連接點。
  11. 如請求項2之共軛物，其中A為： 其中星號代表連至L1之連接點，波形線代表連至該細胞結合劑之連接點，且n為0至6；或 其中星號指示連至L1之連接點，波形線指示連至該細胞結合劑之連接點，n為0或1，且m為0至30。
  12. 如請求項2之共軛物，其中該細胞結合劑經由由該細胞結合劑之半胱胺酸硫醇殘基及A之順丁烯二醯亞胺基團形成的硫醚鍵與A連接。
  13. 如請求項1之共軛物，其中R10之該細胞結合劑為抗體或其活性片段。
  14. 如請求項13之共軛物，其中該抗體或抗體片段為針對腫瘤相關性抗原的抗體或抗體片段。
  15. 如請求項1之共軛物，其中R9獨立地為H且R6獨立地為H。
  16. 如請求項1之共軛物，其中R7獨立地為OMe。
  17. 如請求項1之共軛物，其中X為O。
  18. 如請求項1之共軛物，其中R11為H。
  19. 如請求項1之共軛物，其中點線指示視情況在C2與C3之間存在雙鍵。
  20. 如請求項1之共軛物，其中R2獨立地選自H、=O、=CH2、R、=CH-RD及=C(RD)2。
  21. 如請求項20之共軛物，其中R2獨立地為=CH2。
  22. 如請求項20之共軛物，其中R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
  23. 如請求項1之共軛物，其中R"為C3伸烷基或C5伸烷基。
  24. 如請求項1之共軛物，其中RC可自該N10位置移除而得到N10-C11亞胺鍵。
  25. 如請求項24之共軛物，其中RC為選自以下之胺基甲酸酯保護基： Alloc Fmoc Boc Troc Teoc Psec Cbz PNZ。
  26. 如請求項24之共軛物，其中RC為以下基團： 其中星號代表連至該N10位置之連接點，G2為封端基團，L3為共價鍵或可分解之連接子L1，L2為共價鍵或連同OC(=O)一起形成自我分解型連接子。
  27. 如請求項26之共軛物，其中L3為可分解之連接子L1，且如請求項3至6中任一項所定義。
  28. 如請求項26之共軛物，其中L2連同OC(=O)一起形成自我分解型連接子，且該自我分解型連接子係如請求項8或9所定義。
  29. 如請求項26之共軛物，其中G2為Ac或Moc，或為選自以下之胺基甲酸酯保護基：Alloc Fmoc Boc Troc Teoc Psec Cbz PNZ。
  30. 如請求項1之共軛物，其用於療法中。
  31. 如請求項1之共軛物，其用於治療個體之增生性疾病，其中該疾病為癌症。
  32. 如請求項1之共軛物，其中該雜原子為O、S、N(H)、或Nme及該芳族環為苯或吡啶。
  33. 一種共軛物，其具有下式：Ab-(L-D)p其中Ab為經連接部分(L)與式(AB)或(AC)之PBD藥物部分(D)連接之抗體，且p為1至約8之整數，其中該連接部分(L)及該式(AB)或(AC)之PBD藥物部分係如請求項1所定義。
  34. 如請求項33之共軛物，其中Ab為結合至一或多種選自(1)-(36)之腫瘤相關性抗原或細胞表面受體的抗體：(1)BMPR1B(IB型骨形態發生蛋白受體)；(2)E16(LAT1，SLC7A5)；(3)STEAP1(***之6次跨膜上皮抗原)；(4)0772P(CA125，MUC16)；(5)MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核細胞增效因子，間皮素)； (6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶質載體家族34(磷酸鈉)，成員2，第II型鈉依賴性磷酸轉運體3b)；(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，信號蛋白5b Hlog，sema域，7次血小板反應蛋白重複)(第1型及類第1型)，跨膜域(TM)及短細胞質域，(信號蛋白)5B)；(8)PSCA hlg(270005()C12Rik，C530008016Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKEN cDNA 2700050C12基因)；(9)ETBR(內皮素B型受體)；(10)MSG783(RNF124，假定之蛋白質FLJ20315)；(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相關基因1，***癌相關蛋白1，***之6次跨膜上皮抗原2，6次跨膜***蛋白)；(12)TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，短暫受體潛在陽離子通道，次家族M，成員4)；(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎上皮癌源性生長因子)；(14)CD21(CR2(補體受體2)或C3DR(C3d/艾普斯坦巴爾病毒受體(Epstein Barr virus receptor))或Hs 73792)；(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相關 β)，B29)；(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含有SH2域之磷酸酶錨定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)；(17)HER2；(18)NCA；(19)MDP；(20)IL20Rα；(21)短蛋白聚糖(Brevican)；(22)EphB2R；(23)ASLG659；(24)PSCA；(25)GEDA；(26)BAFF-R(B細胞活化因子受體，BLyS受體3，BR3)；(27)CD22(B細胞受體CD22-B同功異型物)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關α)；(29)CXCR5(伯基特氏淋巴瘤受體1(Burkitt's lymphoma receptor 1))；(30)HLA-DOB(II類MHC分子(Ia抗原)之β次單元)；(31)P2X5(嘌呤型受體P2X配位體閘控離子通道5)；(32)CD72(B細胞分化抗原CD72，Lyb-2)；(33)LY64(淋巴細胞抗原64(RP105)，富含白胺酸重複(LRR)家族之第I型膜蛋白)；(34)FcRH1(Fc受體樣蛋白1)； (35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關2)；及(36)TENB2(推定跨膜蛋白多醣)。
  35. 如請求項33之共軛物，其中Ab為半胱胺酸經工程改造之抗體。
  36. 如請求項33之共軛物，其中Ab為結合至ErbB受體之抗體。
  37. 如請求項36之共軛物，其中Ab為曲妥珠單抗(trastuzumab)。
  38. 如請求項33之共軛物，其中Ab為抗HER2、抗Steap1或抗CD22抗體。
  39. 如請求項33之共軛物，其中p為1、2、3或4。
  40. 如請求項33之共軛物，其具有選自以下之式： 及 其中n為1至24之整數。
  41. 如請求項40之共軛物，其中n為1至12之整數。
  42. 如請求項41之共軛物，其中n為4或8。
  43. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之共軛物及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。
  44. 如請求項43之醫藥組合物，其另外包含治療有效量之化學治療劑。
  45. 一種如請求項1之共軛物之用途，其係用於製備供治療個體之增生性疾病的藥劑。
  46. 一種式(EB)或(EC)化合物， 及其鹽，其中：點線代表視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況另外選自鹵基或二鹵基；其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基； R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；RL為連接細胞結合劑之連接子，該細胞結合劑係選自抗體、含有至少1個結合位點之抗體片段及環狀多肽；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或在Q為O的情況下，R11為SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且就基團NRR'而言，R及R'視情況連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子，及/或芳族環，該等環視情況經NH2取代；且各X為O、S或N(H)；及其中R2"、R6"、R7"、R9"、R11"、Q"及X"分別根據R2、R6、R7、R9、R11、Q及X所定義，且RC為封端基團；其中RL與RC相異。
  47. 如請求項46之化合物，其中該雜原子為O、S、N(H)、或NMe及該芳族環為苯或吡啶。
  48. 如請求項46之化合物，其具有以下結構： 其中n為1至24之整數。
  49. 如請求項47之化合物，其中n為1至12之整數。
  50. 如請求項48之化合物，其中n為4或8。
  51. 如請求項46之化合物，其係選自： ；及
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