CN105848671B - 位点特异性抗体缀合方法和组合物 - Google Patents

位点特异性抗体缀合方法和组合物 Download PDF

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Abstract

提供了抗体药物缀合物(ADC)，以及使用这种ADC以治疗增殖性病症的方法。在一些方面，本公开提供了改造抗体，其免疫特异性地与肿瘤起始细胞的决定簇(如DLL3、SEZ6、或CD324)进行反应。包括一个或多个未配对的半胱氨酸残基的抗体为与治疗剂或诊断剂的选择性和受控的缀合提供了位点。

Description

位点特异性抗体缀合方法和组合物
交叉引用的申请
本申请要求于2013年8月28日提交的美国临时申请号61/871173、于2013年8月28日提交的美国临时申请号61/871289，2014年8月27日提交的PCT国际申请号PCT/US2014/053014的权益，在此通过引用将前述各个申请整体并入本文。
序列表
本申请包含已经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且在此通过引用将其整体并入。所述ASCII副本是2014年8月28日创建的，被命名为“sc0003pct_S69697_1190WO_SEQL_082814.txt”，并且大小是538KB(551,262字节)。
发明领域
本申请总体涉及包含具有一个或多个缀合至细胞毒素的未配对的半胱氨酸残基的抗体或其免疫反应性片段的新型化合物，并涉及所述新化合物用于治疗或预防癌症和癌症的任何复发或转移的用途。
发明背景
许多常用的癌症治疗剂往往因没有选择性地靶向正在增殖的肿瘤细胞的能力而导致实质性的毒性。相反，这些传统的化疗剂非特异性地发挥作用，并且经常破坏或消除正常正在增殖的健康组织连同肿瘤细胞。往往这种意外的细胞毒性限制了患者可以忍受的剂量或方案，从而有效地限制了药剂的治疗指数。其结果是，已经进行许多尝试以使得细胞毒性治疗剂靶向肿瘤位点，其伴有不同程度的成功。一个有希望的研究领域已涉及使用抗体以将细胞毒性剂导向至肿瘤，以便提供治疗有效的局部药物浓度。
在这方面，早已认识到，使用缀合到所选细胞毒性剂的靶向单克隆抗体(“mAbs”)提供了，将相对较高水平的这种细胞毒性有效载荷直接递送至肿瘤位点，同时减少正常组织对这种细胞毒性有效载荷的暴露。虽然已在实验室或临床前环境中对使用这样的抗体药物缀合物(“ADCs”)进行了广泛探索，但这样的抗体药物缀合物在临床上的实际应用却受限得多。在某些情况下，这些限制是弱或无效的毒素与肿瘤靶向分子联合的结果，肿瘤靶向分子不足以选择性与肿瘤结合或未能有效地与肿瘤结合。在其他情况下，分子构建体被证明是在施用后不稳定或太快被从血流清除，以致于不能在肿瘤位点以治疗显著浓度积累。虽然这种不稳定性可能是连接体选择或缀合方法的结果，但它也可以是采用毒性的有效载荷过载靶向抗体(即，该药物与抗体的比率或“DAR”太高)、从而在药物制剂中产生不稳定的缀合物质种类的结果。在一些情况下，不论是来自设计或来自不稳定DAR物质种类，构建体不稳定，由于有效的细胞毒性有效载荷过早从药物缀合物中浸出，已经导致不可接受的非特异性毒性，并且由于身体试图清除未靶向的有效载荷，在注射位点或在关键器官中积累。这样，虽然几种这类化合物目前正处于临床试验阶段，但是迄今为止相对较少的ADCs已经由联邦药物管理局批准。因此，仍然需要表现出有利的治疗指数的稳定、相对均质的抗体药物缀合物制剂。
发明概述
本发明提供了这些和其他的目的，本发明，在广义上，涉及提供表现出有利的药代动力学和药效学性质的改进的位点特异性抗体和缀合物的新型方法、化合物、组合物和制品。本发明所提供的益处是广泛适用于抗体治疗学和诊断学领域，并且可以结合与各种靶反应的抗体一起使用。如将在下面详细讨论，所公开的位点特异性缀合物包含改造的抗体构建体，所述构建体具有一个或多个未配对的半胱氨酸，可使用新型选择性还原技术，优先地将所述半胱氨酸缀合于治疗剂或诊断剂有效载荷。当与常规的缀合制剂比较时，这样的位点特异性缀合物制剂是相对稳定的，并且平均DAR分布和载荷位置是基本上均匀的。如在所附实施例中所示，所公开的抗-DLL3位点特异性缀合物制剂(关于平均DAR分布和载荷定位)的稳定性和均质性提供了，有助于改善的治疗指数的有利毒性特征。
在一个实施方案中，本发明涉及包含一个或多个未配对的半胱氨酸残基的位点特异性改造抗体。本领域技术人员将认识到，未配对的链间半胱氨酸残基提供用于药学活性部分的选择性和受控的缀合，以产生根据本文的教导的改造缀合物。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含一个或多个未配对的半胱氨酸残基的改造抗体，其中所述改造抗体免疫特异性地与选自DLL3，SEZ6和CD324的决定簇反应。
在相关实施方案中，位点特异性抗体用于制造在相关实施方案中，位点特异性抗体用于制造改造的缀合物，其中游离的半胱氨酸缀合至治疗剂或诊断剂。在这方面，本发明包括下式的抗体药物缀合物：
Ab-[L-D]n或其药学上可接受的盐，其中
Ab包含抗体，所述抗体含有一个或多个未配对的半胱氨酸；
L包含任选的连接体；
D包含药物；和
n为约1至约8的整数。
除了前述的抗体药物缀合物，本发明还提供了通常包含所公开的ADC的药物组合物和使用这样的ADC在患者中诊断或治疗病症(包括癌症)的方法。在特别优选的实施方案中，改造抗体或缀合物将与选自DLL3、SEZ6和CD324的决定簇相缔合。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含至少一个未配对的半胱氨酸残基的位点特异性改造的IgG1同种型抗体。在一些实施方案中，未配对的半胱氨酸残基将包含重链/轻链的链间残基，而不是重链/重链的链间残基。在其他实施方案中，未配对的半胱氨酸残基由链内二硫键产生。
在另一个实施方案中，本发明提供一种改造抗体，其中在另一个实施方案中，本发明提供一种改造抗体，其中组成所述位点特异性改造抗体的轻链的C214残基(根据KabatEU索引编号)被置换成其他残基或删除。在进一步的实施方案中，本发明提供一种改造抗体，其中组成改造抗体的重链的C220残基(根据Kabat EU索引编号)被置换成其他残基或删除。
在一个相关实施方案中，本发明涉及杀死肿瘤细胞或致瘤性细胞，减少肿瘤细胞或致瘤性细胞的增殖频率或抑制肿瘤细胞或致瘤性细胞的增殖的方法，其包括用本发明的位点特异性的ADC处理所述肿瘤细胞或致瘤性细胞。在一个相关实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，包括向受试者施用包含本发明的位点特异性缀合物的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明包括制备本发明的抗体药物缀合物的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含未配对的半胱氨酸的改造抗体；
b)选择性还原改造抗体；和
c)将选择性还原的改造抗体缀合至药物。
在相关的优选实施方案中，选择性还原抗体的步骤包括将抗体与稳定剂接触的步骤。在又一个实施方案中，所述方法可进一步包括用温和的还原剂接触抗体的步骤。
如所指出的，这样的缀合物可用于增殖性病症或它们的复发或进展的治疗，管理，改善或预防。本发明的选择的实施方案提供了，这种位点特异性缀合物用于恶性肿瘤的免疫治疗的用途，所述免疫治疗优选包括在肿瘤起始细胞频率降低。所公开的ADC可以单独使用或与多种抗癌化合物如化学治疗剂或免疫治疗剂(例如，治疗性抗体)或生物反应调节剂组合使用。在其它选择的实施方案中，两种或更多种分开的位点特异性抗体药物缀合物可联合使用以提供增强的抗肿瘤作用。
在上面讨论的治疗用途之外，还可以理解的是，本发明的改造缀合物可被用于检测、诊断或分类病症，尤其，增殖性病症。它们也可以在此类病症的预后和/或治疗诊断中被使用。在一些实施方案中，位点特异性缀合物可以施用给受试者，并被体内检测或监测。本领域的技术人员将理解，这样的调节剂可以采用如下文所公开的效应物、标记物或报道分子标记或与之相缔合，并且可以使用多种标准技术(例如，MRI，CAT扫描，PET扫描等)中的任何一个检测。
因此，在一些实施方案中，本发明将包括体内诊断、检测或监测有需要的受试者中增殖性病症的方法，包括施用改造的缀合物的步骤。
在其他情况下，可以在使用本领域公认的方法(例如，免疫组织化学或IHC)的体外诊断环境下，使用缀合物。这样，优选的实施方案包括在有需要的受试者中诊断增殖性病症的方法，包括以下步骤：
a.从所述受试者获得组织样本；
b.使组织样品接触至少一种位点特异性缀合物；和
c.检测或定量与样品相缔合的位点特异性缀合物。
所述方法可以结合本申请容易地识别，并且可以使用一般市售的技术如自动板读取器、专用报道分子***等容易地进行。在选择的实施方案中，改造缀合物将与存在于样品中的肿瘤永生细胞(即，癌症干细胞)相缔合。在其他优选的实施方案中，检测或定量的步骤将包括减少癌干细胞的频率，这可如本文所述进行监测。
本发明还提供了采用如本文所公开的位点特异性缀合物的试剂盒或装置和相关联的方法，并且提供了本文所公开的改造缀合物的药物组合物，其可用于增殖性病症如癌症的治疗。为此，本发明优选提供了，用于治疗此类病症的制品，其包括含有位点特异性抗体药物缀合物的容器和使用缀合物来治疗、改善或预防增殖性病症或其进展或复发的指导材料。在选择的实施方案中，所述装置和相关方法将包括接触至少一种循环肿瘤细胞的步骤。
前述内容是概述，因此必然包含简化、概括和细节的省略；因此，本领域的技术人员将理解，所述概述仅是说明性的并且无意以任何方式进行限制。基于在本文所阐述的教导，本文所描述的方法、组合物、和/或装置和/或其他主题的其他方面、特征和益处将变得显而易见。提供本概述以通过简化形式介绍构思的选择，所述构思在下文详述部分被进一步描述。本概述并不旨在标识要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在被用于确定所要求保护的主题的范围。
附图简述
图1是示出链内和链间二硫键的人类IgG1抗体的结构的描述。
图2A和2B以表格形式提供许多人源化的示例性DLL3抗体的轻链和重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NO：519-528，奇数)，所述示例性DLL3抗体与如本文实施例中所述分离、克隆和改造的所公开的抗体药物缀合物相容。
图3A和3B以表格的形式提供，若干人源化的示例性SEZ6抗体轻链和重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NO：170-199)，所述SEZ6抗体与如本文实施例中所描述分离、克隆和改造的所公开的抗体药物缀合物是相容的。
图4以表格形式描绘了，鼠和人源化的示例性CD324抗体轻链和重链可变区的连续的氨基酸序列(SEQ ID NO：529-532)，所述鼠和人源化的示例性CD324抗体与如本文实施例中所描述分离、克隆和改造的所公开的抗体药物缀合物是相容的。
图5A和5B提供按照本发明教导制备的示例性位点特异性抗-DLL3抗体的轻链和重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：507-512)。
图6A和6B提供按照本发明教导制造的示例性位点特异性抗SEZ6抗体轻链和重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：513-518)。
图7描绘了按照本发明教导制造的示例性CD324ss3位点特异性抗体轻链和重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：543-544)。
图8示出天然的构建体和如本文所述制备的位点特异性构建体的结合特性。
图9是示意性表示，其描绘将改造抗体缀合至细胞毒素的过程。
图10A和10B是图形表示，其显示使用还原剂缀合的位点特异性抗体轻链和重链的缀合百分比，如使用RP-HPLC所确定。
图11A和11B是图形表示，其显示使用还原剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布，如使用HIC所测定。
图12A和12B示出使用稳定剂或还原剂缀合的位点特异性抗体轻链和重链的缀合率，如使用RP-HPLC所确定。
图13A和13B是图形表示，其示出使用稳定剂或还原剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布，如使用HIC所测定。
图14A和14B示出使用稳定剂和/或温和的还原剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布，如使用HIC所测定。
图15描绘了使用各种稳定剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布，如使用HIC所测定。
发明详述
I.简介
虽然本发明可以多种不同形式实施，但本文中公开的是例示本发明的原理的本发明的特定说明性实施方案。应强调的是，本发明不限于所说明的特定实施方案。此外，本文中所使用的任何章节标题是仅用于组织目的且不应视为限制所描述的主题。最终，为达成本发明的目的，除非另有说明，否则所有鉴别序列登录号可见于NCBI参考序列(RefSeq)数据库及/或NCBI GenBank存档序列数据库。
最初，重要的是注意，本发明的位点特异性的抗体和位点特异性缀合物不限于任何特定的靶或抗原。相反，因为任何现有的抗体或可如本文所述产生的任何抗体可转化为位点特异性抗体，本发明所赋予的优点是广泛适用的，并且可以结合任何靶抗原(或决定簇)使用。更具体地说，通过使用未配对的半胱氨酸缀合位点和未配对的半胱氨酸的选择性还原赋予的有益性质(例如，增强的缀合物稳定性和减少的非特异性毒性)是广泛地适用于治疗抗体和诊断抗体而与不论特定的靶。因此，虽然某些非限制性决定簇已被用于解释和示范本发明的益处的目的，它们不以任何方式限制本发明的范围。
在任何情况下，本发明的位点特异性抗体缀合物已被发现显示出良好的特性，使得它们特别适合于用作治疗性化合物和组合物。在这方面，缀合物免疫特异性地与决定簇反应，所述决定簇已经被发现与各种增殖性病症相关且显示出是良好的治疗目标。此外，本发明的构建体提供衍生自通过分子改造技术得到的断裂的一个或多个天然二硫键的特定半胱氨酸位置的选择性缀合。抗体的这种改造提供了调节的化学计量的缀合，所述缀合使药物与抗体比率(“DAR”)很大程度上被精确固定，导致大量DAR均质制剂的产生。此外，所公开的位点特异性构建体进一步提供，在抗体上有效载荷的位置方面基本上均质的制剂。使用如本文所述的稳定剂的改造构建体的选择性缀合，增加期望的DAR物质种类的百分比，并且连同所制造的未配对的半胱氨酸位点，赋予缀合物稳定性和均质性，所述稳定性和均质性降低由细胞毒素的无意浸出引起的非特异性毒性。制剂的未配对的半胱氨酸的选择性缀合和相对均质性(在缀合位置和DAR两者中)提供的这种减少的毒性，还提供了增强的治疗指数，其允许在肿瘤位点的增加的细胞毒素有效载荷水平。此外，可任选地使用各种色谱方法纯化所得到的位点特异性缀合物，以提供高度均质的位点特异性缀合物制剂，其包含大于75％，80％，85％，90％或甚至95％的期望DAR物质种类(例如，DAR＝2)。这样的缀合物均质性可通过限制不期望的可以增加毒性的较高DAR缀合物杂质(其可以是相对不稳定的)，进一步提高所公开的制剂的治疗指数。
应该理解的是，通过所公开的改造缀合物制剂表现出的有利特性至少部分地基于特异性导向缀合和在缀合位置和绝对DAR方面很大程度上限制所制造的缀合物的能力。不同于大多数常规的ADC制剂，本发明不完全依赖于抗体的部分或全部还原以提供随机的缀合位点和DAR物质种类的相对不可控产生。相反，本发明通过改造靶向抗体以破坏天然存在的(即，“天然”)链间或者链内二硫键中的一个或多个而提供了一个或多个预定未配对(或游离)的半胱氨酸位点。因此，如本文所使用，术语“游离半胱氨酸”或“未配对的半胱氨酸”可以互换使用，除非上下文另有规定，并且应意指抗体的任何半胱氨酸成分，所述抗体的天然二硫键配偶体被置换、消除或以其他方式改变以在生理条件下破坏天然存在的二硫键，从而使得未配对的半胱氨酸适于位点特异性缀合。应当理解的是，缀合之前，游离的或未配对的半胱氨酸可以存在作为硫醇(还原的半胱氨酸)，作为封端的半胱氨酸(氧化的)或作为与相同抗体上的另一个游离半胱氨酸的非天然分子内二硫键(氧化的)，这取决于***的氧化状态。如下面更详细讨论，该抗体构建体的温和还原将提供可用于位点特异性缀合的硫醇。
更具体地，然后可以使用本文公开的新型技术选择性还原所得的游离半胱氨酸，同时基本上不破坏完整的天然二硫键，以在选定位点主要提供反应性硫醇。这些制造的硫醇然后经历采用所公开的药物连接体化合物的定向缀合，没有大量的非特异性结合。即，改造构建体和任选的本文公开的选择性还原技术在很大程度上消除了毒素有效载荷的非特异性的随机缀合。这显著提供了在DAR物质种类分布和靶向抗体上的缀合位置两者方面基本上均质的制剂。如下所讨论，相对高的DAR污染物的消除，本质上和本身，减少非特异性毒性和扩大制剂的治疗指数。此外，这样的选择性使得有效载荷主要被放置在特别有利的预定位置(诸如轻链恒定区的末端区域)，其中有效载荷是以某种程度被保护的，直到它到达肿瘤，但一旦它到达目标就被适当地呈递并处理。因此，也可以使用用于促进特定有效载荷定位的改造抗体的设计，以减少所公开的制剂的非特异性毒性。
如以下所讨论和实施例中所示，可以使用本领域公认除去、改变或替代二硫键的构成半胱氨酸残基之一的分子改造技术来实现这些预定的游离半胱氨酸位点的生成。使用这些技术，本领域技术人员将理解，任何抗体类别或同工型都可以被改造以选择性地显示一个或多个能够根据本发明进行选择性缀合的游离半胱氨酸。此外，所选择的抗体可被改造以特异性呈现1、2、3、4、5、6、7或甚至8个游离半胱氨酸，这取决于期望的DAR。更优选的是，所选择的抗体将被改造成含有2个或4个游离半胱氨酸和甚至更优选含有2个游离半胱氨酸。还应当理解的是，游离半胱氨酸可以被定位在改造抗体中，以便于将选择的细胞毒素递送到目标，同时减少非特异性毒性。在这方面，本发明包含IgG1抗体的所选实施方案将有效载荷定位在CH1结构域上和更优选在结构域的C末端上。在其他优选的实施方案中，构建体将被改造为将有效载荷定位在轻链恒定区和更优选地在恒定区的C末端。
也可以通过使用下述新型稳定剂选择性还原构建体，促进限制有效载荷定位至改造游离半胱氨酸。如本文所使用的“选择性还原”意指将改造构建体暴露于还原条件，所述还原条件还原游离半胱氨酸(由此提供反应性硫醇)，而基本上不破坏完整的天然二硫键。通常，可利用任何还原剂或其组合来实现选择性还原，所述还原剂或其组合提供期望的硫醇而不破坏完整二硫键。在某些优选的实施方案中，并且如以下实施例中所阐述，可使用用于制备用于缀合的改造构建体的稳定剂和温和还原条件来实现选择性还原。如在下面更详细地讨论，相容的稳定剂将通常促进游离半胱氨酸的还原，并允许在较不严格的还原条件下进行所期望的缀合。这允许基本上大多数天然二硫键保持完整且明显降低非特异性缀合的量，从而限制不期望的污染物和可能的毒性。相对温和的还原条件可以通过使用多个***获得，但优选包括使用含硫醇化合物。本领域技术人员鉴于本公开内容可容易地推导出相容还原***。
II.决定簇
本领域技术人员将理解，可以由特异性识别任何相关的决定簇或与任何相关的决定簇相缔合的任何抗体，生成改造抗体或缀合物。本文所用的“决定簇”是指任何可检测的性状、特性、标记物或因子，所述性状、特性、标记物或因子可识别地与特定细胞、细胞群或组织相关联，或特异性发现于特定细胞、细胞群或组织之中或之上。决定簇在本质上可以是形态性、功能性或生化性的，并且通常是表型性的。在某些优选的实施方案中，决定簇是物理结构和/或化学组成被差异修饰的蛋白质，或者是由特定的细胞类型或通过在一定条件下的细胞(例如，在特定生态位中细胞周期或细胞的特定点的期间)差异表达(上调或下调)的蛋白质。对于本发明的目的，决定簇优选地包括细胞表面抗原，或由异常细胞差异表达的蛋白质，所述差异表达通过化学修饰、呈现形式(例如，剪接变体)、时序或量而显示。在某些实施方案中，决定簇可以包括SEZ6，DLL3或CD324蛋白质，或者它们的变体，同工型或家族成员，以及特定结构域，区域或表位中的任何一种。“免疫原决定簇”或“抗原决定簇”或“免疫原”或“抗原”是指多肽的任何片段、区域或结构域，所述片段、区域或结构域在被引入到免疫活性动物时能够刺激免疫应答，并由免疫应答产生的抗体所识别。本文所考虑的决定簇可以由它们的存在(阳性决定簇)或不存在(阴性决定簇)鉴定细胞、细胞亚群或组织(例如，肿瘤)。
如本文所讨论和下面实施例中所述的，本发明的选择的实施方案可包括免疫特异性结合选定的决定簇并可以被认为是“源”抗体的鼠抗体的完整或部分可变区。在这样的实施方案中，由本发明设想的抗体可通过源抗体的恒定区或表位结合氨基酸序列的可选修饰从这样的“源”抗体衍生而得。在一个实施方案中，如果在源抗体中所选氨基酸通过缺失，突变，置换，整合或组合而被改变，则抗体是从源抗体“衍生的”。在另一个实施方案中，“衍生的”抗体是一种这样的抗体，其中源抗体的片段(例如，一个或多个CDR或整个可变区)与受体抗体序列相结合或掺入受体抗体序列以提供衍生抗体(例如嵌合的、CDR移植的或人源化抗体)。显著的是，这些衍生抗体可包含本发明的位点特异性抗体，其中，例如，供体抗体的抗原结合区与包含一个或多个未配对的半胱氨酸的恒定区相缔合。可以基于各种原因使用标准分子生物学技术产生这些“衍生的”(例如嵌合的，人源化或位点特异性构建体)抗体，所述原因诸如，例如，为了提供游离半胱氨酸；改进对决定簇的亲和力；改善在细胞培养物中的生产和产量；减少体内免疫原性；减少毒性；促进活性结构部分的缀合；或创建多特异性抗体。还可以通过经由化学手段或翻译后修饰的成熟分子的修饰(例如，糖基化模式或聚乙二醇化)从源抗体衍生此类抗体。当然，应该理解的是，源抗体(例如，鼠抗体)可被改造以提供期望的缀合位点而不进行对抗体结构的进一步修改。
再次，必须强调的是，本文阐述的位点特异性缀合技术是普遍适用于抗体治疗学或诊断学领域，并且可以与任何现有的抗体或可不考虑抗体靶而产生的任何抗体一同发挥作用。在这方面，用于证明由本发明提供的益处的某些非限制性决定簇，如下所述：
CD324(也称为E-钙粘蛋白，上皮钙粘蛋白或CDH1)是钙粘蛋白的经典亚家族的成员，并因此是钙依赖性细胞-细胞粘附糖蛋白，其介导同型(即，上皮-上皮)细胞-细胞粘着粘附。CD324的细胞内部分与细胞内的各种蛋白质(包括α-连环蛋白，β-连环蛋白和P120)相互作用，所述各种蛋白质本身与细胞骨架的肌动蛋白丝相互作用(Perez-Moreno等人，2003)。CD324被认为充当细胞粘附结构和细胞骨架之间的桥，并且为细胞提供在组织例如分层上皮中定向细胞的指南针。对于癌症的发展，CD324表达的失调是在肿瘤发生和转移的早期和晚期步骤的主要事件之一。使导致结构改变的CD324蛋白质或CD324表达的完全丧失的CDH1的种系突变失活，已与胃癌，乳腺癌，结肠直肠癌，甲状腺癌，和卵巢癌相关联。早已已知，与不良分化的肿瘤相比，良好分化肿瘤会表现强烈的CD324/连环蛋白染色模式。因此CD324已被病理学家使用作为通过免疫组织化学诊断不同类型癌症的显著预后标志。关于CD324在为细胞提供机械支撑，调节细胞定位和运动表型，及其与细胞分化状态的关联中的功能作用的报告，使CD324成为抗癌疗法开发的非常有趣的目标。CD324基因被转录和剪接成4815bp的成熟mRNA转录物，其具有编码包括信号肽的882个氨基酸的前原蛋白的开放阅读框。CD324同源体在不同物种之间非常保守，并且钙粘蛋白家族的各个成员之间的序列同源性普遍高。CD324蛋白包括大约110个氨基酸的四个细胞外钙粘蛋白重复(序列)(EC1-EC4)，与其它钙粘蛋白重复(序列)不太密切相关的近膜胞外结构域(EC5)，跨膜结构域，和高度保守的细胞内结构域，该细胞内结构域可进一步细分成近膜结构域(JMD)和高度磷酸化β-连环蛋白结合结构域(CBD)。钙离子结合在钙粘蛋白的EC重复(序列)之间的位点，为这些蛋白质的细胞外部分赋予刚性棒状结构。
SEZ6(也称为发作相关6同系物)是I型跨膜蛋白，其最初从采用惊厥剂,戊二烯四唑(pentylentetrazole)(清水西河(Shimizu-Nishikawa)，1995，PMID：7723619)处理过的小鼠大脑皮质衍生的细胞中克隆。SEZ6具有两个同工型，一个具有约4210个碱基(NM_178860)，编码994个氨基酸的蛋白质(NP_849191)，一个具有大约4194个碱基(NM_001098635)，编码993个氨基酸的蛋白(NP_001092105)。这些同工型不同之处仅在其ECD最后十个氨基酸残基。SEZ6还有另外两个家族成员：SEZ6L和SEZ6L2。术语“SEZ6家族”指的是SEZ6，SEZ6L，SEZ6L2和它们的各种同工型。成熟SEZ6蛋白是由一系列结构域组成：胞质结构域，跨膜结构域和胞外结构域，所述胞外结构域包括独特的N-末端结构域、随后是两个交替的Sushi和CUB样结构域，以及另外三个串联的Sushi结构域重复。在人类SEZ6基因中的突变与发热性癫痫发作(在体温上升相关的癫痫，并在儿童癫痫中是最常见的类型(Yu等人，2007，PMID：17086543))相关。通过同源性和序列分析鉴定的SEZ6蛋白质的结构模块的分析表明在信号传导，细胞-细胞通讯，以及神经发育中的可能作用。如下所述，经由已从采用SEZ6抗原免疫的小鼠中分离的抗体，生成抗SEZ6人源化抗体。
如在下面实施例阐述，对于本发明的改造缀合物特别优选的决定簇的包括SEZ6，CD324和DLL3。DLL3(也称为δ样配体3或SCDO1)为刻缺蛋白DSL配体的δ样家族的成员。代表性DLL3蛋白质直系同源物(ortholog)包括(但不限于)人类(登录号NP_058637及NP_982353)、黑猩猩(chimpanzee)(登录号XP_003316395)、小鼠(登录号NP_031892)及大鼠(登录号NP_446118)。在人类中，DLL3基因由位于染色体19q13上的8个外显子(跨度9.5kBp)组成。最后一个外显子内的替代性剪接产生两种经加工的转录物，一种具有2389个碱基(登录号NM_016941)且一种具有2052个碱基(登录号NM_203486)。前一种转录物编码618个氨基酸的蛋白质(登录号NP_058637)，而后一种转录物编码587个氨基酸的蛋白质(登录号NP_982353)。DLL3的此两种蛋白质同工型在其细胞外结构域及其跨膜结构域中共有共100％同一性，不同之处仅在于较长的同工型含有经扩展的细胞质尾区，所述尾区在蛋白质的羧基端含有32个额外残基。
在一般情况下，DSL配体由一系列结构域组成：独特的N-末端结构域，随后是保守的DSL结构域，多个串联表皮生长因子(EGF)样重复，跨膜结构域，和胞质结构域，胞质结构域在配体之间不是高度保守的，但包含多个赖氨酸残基，所述赖氨酸残基是由独特的E3泛素连接酶导致的泛素化的潜在位点。DSL结构域是简并的EGF结构域，其对于与刻缺蛋白(Notch)受体相互作用而言是必要的但非充分的。此外，大多数的DSL配体的前两个EGF样重复包含称为DOS域结构的较小的蛋白质序列基序，当激活刻缺蛋白信号传导时DOS域结构可操作地与DSL结构域相互作用。
DLL3蛋白质的细胞外区域包含六个EGF样结构域、单一DSL结构域及N端结构域。通常，认为EGF结构域存在于约氨基酸残基216-249(结构域1)、274-310(结构域2)、312-351(结构域3)、353-389(结构域4)、391-427(结构域5)及429-465(结构域6)处，且DSL结构域存在于约氨基酸残基176-215及hDLL3的约氨基酸残基27-175的N端结构域处。DSL结构域及N端结构域均包含如由相异氨基酸序列所界定的DLL3蛋白质的部分。需要注意的是，对于本公开内容的目的，各EGF样结构域可以称为EGF1至EGF6，其中EGF1最靠近该蛋白质的N端部分。在考虑到蛋白的结构组成时，本发明的一个显著方面是，可以产生、制造、改造或选择所公开的DLL3抗体，以便与选定的结构域、基序或表位进行反应。在某些情况下，这样的位点特异性抗体可以根据它们的主要作用模式，提供增强的反应性和/或效力。
与本发明相容并且可以用作源抗体的DLL3抗体被公开在PCT申请号US2013/0027391中，通过引用将所述申请并入本文。
可以通过源抗体的表位结合氨基酸序列的任选修饰和引入位点特异性的游离半胱氨酸残基，从“源”抗体得到由本发明所设想的更多的一般性改造的抗体。在一个实施方案中，改造抗体是从源抗体“衍生的”，如果在源抗体中所选氨基酸通过缺失，突变，置换，整合或组合而被改变以产生包含至少一个游离半胱氨酸残基的改造抗体。在另一个实施方案中，“衍生的”抗体是一种这样的抗体，其中源抗体的片段(例如，一个或多个CDR)与包含一个或多个游离的半胱氨酸残基的受体抗体的序列相结合，或并入包含一个或多个游离的半胱氨酸残基的受体抗体的序列，以提供衍生抗体(如嵌合或人源化抗体)。可以基于各种原因产生这些“抗体，所述原因诸如，例如，为了提高对靶的亲和力；改善在细胞培养物中的生产和产量；减少体内免疫原性；减少毒性；促进活性结构部分的缀合；或创建多特异性抗体。最重要的是，它们提供了一种或多种药学活性结构部分的位点特异性缀合。通过经由化学手段或翻译后修饰的成熟分子的修饰(例如，糖基化模式或聚乙二醇化)，或通过氨基酸序列的改变，可以从源抗体获得这种抗体。
虽然本发明一般涉及能够特异性结合决定簇的任何改造抗体，但是改造的抗SEZ6抗体，改造的抗DLL3抗体和改造的抗CD324抗体应当作为本发明实施方案的说明性实例。
III.细胞结合剂
1.抗体结构
如上文所提及，本发明的尤其优选实施方案包含具有呈位点特异性抗体或其免疫反应性片段形式的细胞结合剂的DLL3缀合物，所述细胞结合剂优先与选择的决定簇上的一或多个表位缔合。在此方面，抗体以及其位点特异性变体及衍生物(包括认可的命名法及编号***)已广泛描述于例如Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(第6版),W.B.Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway’s Immunobiology(第8版),Garland Science中。
需要注意的是，对于本申请的目的，可以理解的是，术语“调节剂”和“抗体”可以互换使用，除非上下文另有规定。类似地，为讨论的目的，本发明的实施方案可以根据一个决定簇或其他决定簇来表达。然而，除非上下文另有说明或需要，对于所描述的一般概念或本发明的范围而言，这种指定仅仅是为了解释的目的，而不是限制性的。因此，术语“抗-DLL3缀合物”和“DLL3缀合物”，或简单地“缀合物”，均指本文所阐述的位点特异性缀合物和可以互换使用，除非上下文另有规定。
“抗体”或“完整抗体”典型地是指Y形四聚蛋白，其包含两个重(H)多肽链及两个轻(L)多肽链，所述多肽链由共价二硫键及非共价相互作用结合在一起。人类轻链包含可变结构域(VL)及恒定结构域(CL)，其中恒定结构域可基于氨基酸序列及基因座容易地分类为κ或λ。各重链包含一个可变结构域(VH)及一个恒定区，该恒定区在IgG、IgA及IgD情况下包含三个名为CH1、CH2及CH3的结构域(IgM及IgE具有第四个结构域CH4)。在IgG、IgA及IgD类别中，CH1及CH2结构域是由柔性铰链区分离，该柔性铰链区为具有可变长度(在IgG中通常为约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸及半胱氨酸的区段。轻链及重链中的可变结构域通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区域与恒定结构域接合，且重链亦具有“D”区域，其具有约10个额外氨基酸。各类别的抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间及链内二硫键。
在免疫球蛋白分子中有两种天然二硫键桥或键：链间和链内二硫键。链间二硫键的位置和数量根据免疫球蛋白类别和种类而有所不同。虽然本发明并不限于抗体的任何特定类别或亚类，但所述IgG1免疫球蛋白应仅用于说明的目的。链间二硫键位于免疫球蛋白的表面上，是可接触溶剂的，并且通常相对容易还原。在人IgG1同种型中，有四个链间二硫键，一个从每个重链到轻链之，并且两个在重链之间。链缔合不需要链间二硫键。重链的富含半胱氨酸的IgG1铰链区通常保持为由三部分组成：上部铰链(Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr)，核心铰链(Cys-Pro-Pro-Cys)，和下部铰链(Pro-Ala-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly)。本领域技术人员将理解，该IgG1铰链区含有重链中的半胱氨酸，所述重链包含链间二硫键(两个重链/重链，两个重链/轻链)，其提供有利于Fab运动的结构柔性。
在κ或λ轻链的C214和重链的上部铰链区的C220之间形成IgG1的轻链和重链之间的链间二硫键(图1)。重链之间的链间二硫键在位置C226和C229处。(所有编号都依照根据Kabat等人的EU索引，见下文)。
如本文中所用，术语“抗体”可被广泛解释且包括多无性繁殖系抗体(polyclonalantibody)、多克隆抗体(multiclonal antibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化及灵长类动物化(primatized)抗体、CDR移植抗体、人类抗体、以重组方式产生的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白质及其变体)、免疫特异性抗体片段(诸如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、单链片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修饰，及任何其他免疫应答性分子，只要其呈现与DLL3决定簇的优先缔合或结合即可。此外，除非由上下文约束条件说明，否则该术语进一步包含所有类别的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有亚类(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域典型地分别由相应小写希腊字母α、δ、ε、γ及μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为两种明确相异类型(称为κ及λ)中的一种。
在所选实施方案中并如下面更详细讨论，CL结构域可包含κCL结构域，其表现出游离半胱氨酸。在其他实施方案中，源抗体可包含λCL结构域，其表现出游离半胱氨酸。因为所有人类IgG CL结构域的序列是公知的，本领域技术人员可根据本发明容易地分析λ及κ序列且使用其提供相容抗体构建体。类似地，为了说明及例示的目的，以下论述及随附实施例将主要表征IgG1型抗体。与轻链恒定区相同，来自不同同种型(IgM、IgD、IgE、IgA)及亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)的重链恒定结构域序列是公知的及被表征的。因此，本领域技术人员可容易地开发包含任何同种型或亚类的抗-DLL3抗体(或抗-SEZ6抗体)且如本文中所教导使其中每一者与所公开的药物结合以产生本发明的位点特异性抗体药物缀合物。
在不同抗体中，抗体的可变结构域展示显著的氨基酸组成变化且主要负责抗原识别及结合。各轻链/重链配对的可变区形成抗体结合位点，使得完整IgG抗体具有两个结合位点(即其为二价的)。VH及VL结构域包含三个具有极高可变性的区域，其称为高变区，或更通常称为互补决定区(CDR)，其由四个可变性较低的区域(称为构架区(FR))构架及分离。VH区域与VL区域之间的非共价缔合形成Fv片段(对于“可变片段”)，其含有抗体的两个抗原结合位点中的一个。ScFv片段(对于单链可变片段)，其可由遗传改造获得，在单一多肽链(由肽连接体分离的抗体的VH区及VL区)中缔合。
如本文中所用，除非另有说明，否则将氨基酸指派至各结构域、构架区及CDR可根据由以下文献提供的编号方案中的一种来进行：Kabat等人(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest(第5版),US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版号91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel编,(2007)Handbook ofTherapeutic Antibodies,第3版,Wily-VCH Verlag GmbH and Co.。包含如由Kabat、Chothia及MacCallum定义的CDR的氨基酸残基(如自Abysis网站数据库(见下文)获得)陈述于下文中。
表1
抗体序列中的可变区及CDR可根据在本领域中已开发的一般规则(如上文陈述，例如Kabat编号***)或通过将序列针对已知可变区的数据库比对来鉴别。用于鉴别这些区域的方法描述于Kontermann及Dubel编,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001及Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中。抗体序列的示例性数据库描述于“Abysis”网站,www.bioinf.org.uk/abs(由A.C.Martin,Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England维护)及VBASE2网站,www.vbase2.org(如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(数据库问题):D671-D674(2005)中描述)中且可由前述网站获得。优选序列是使用Abysis数据库分析，其整合来自Kabat、IMGT及Protein Data Bank(PDB)的序列数据与来自PDB.的结构数据。参见Dr.Andrew C.R.Martin's book chapter ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In:AntibodyEngineering Lab Manual(Duebel,S.及Kontermann,R.编,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547,亦可自网站bioinforg.uk/abs获得)。Abysis数据库网站进一步包括已开发用于鉴别可根据本文中的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文中阐述的所有CDR均是根据Abysis数据库网站按照Kabat衍生。
对于本发明中论述的重链恒定区氨基酸位置，编号是根据首先描述于Edelman等人,1969,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85中的Eu索引进行，其描述据称为第一个测序的人类IgG1的骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列。Edelman的Eu索引亦阐述于Kabat等人,1991(见上文)中。因此，重链的上下文中的术语“如Kabat中阐述的EU索引”或“Kabat的EU索引”或“根据Kabat的EU索引”是指基于如Kabat等人,1991(见上文)中阐述的Edelman等人的人类IgG1Eu抗体的残基编号***。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号***类似地阐述于Kabat等人,1991中。
与本发明相容的示例性κCL及IgG1重链恒定区氨基酸序列是如随附序列表中的SEQ ID NO:403及SEQ ID NO:404中所阐述。类似地，示例性的λCL轻链恒定区如随附序列表中的SEQ ID NO：504中所阐述。本领域技术人员应了解，可使用标准分子生物学技术，使如本文公开所改造以提供未配对的半胱氨酸(例如，见SEQ ID NO：502，503，505和506)的所述轻链恒定区序列与所公开的重链及轻链可变区接合以产生全长抗体(例如见SEQ ID NO：513-518)，其可并入本发明的SEZ6缀合物中。
本发明的位点特异性抗体或免疫球蛋白可包含或来源于任何特异性识别任何DLL3决定簇或与任何DLL3决定簇缔合的抗体。如本文中所用，“决定簇”或“目标”意指任何可检测的特性、性质、标记(标记物)目标或因子，其可与特定细胞、细胞群体或组织可鉴别地相关联(缔合)或特定地在特定细胞、细胞群体或组织之中或之上被发现。决定簇或目标在性质上可为形态学、功能性或生物化学且优选为表型。在某些优选实施方案中，决定簇为由特定细胞类型或在某些条件下(例如在特定生态位(niche)中的细胞周期或细胞的特定时间点期间)由细胞不同地表达(过表达或表达不足)的蛋白质。为达成本发明的目的，决定簇优选不同地表达于异常癌细胞上且可包含特定蛋白质(例如CD324,SEZ6或DLL3)或其任一种剪接变体、同工型或家族成员，或其特定结构域、区域或表位。“抗原”、“免疫原性决定簇”、“抗原决定簇”或“免疫原”意指在引入免疫活性动物中且由动物的免疫应答产生的抗体识别时可刺激免疫应答的任何蛋白质或其任何片段、区域、结构域或表位。存在或不存在本文中预期的决定簇可用于鉴别细胞、细胞亚群或组织(例如肿瘤、致瘤细胞或CSC)。
如以下实施例所阐述，本发明的所选实施方案包含免疫特异性结合于SEZ6的鼠抗体，其可视为“源”抗体。在其他实施方案中，本发明涵盖的抗体可经由源抗体的恒定区的任选的修饰(即，以提供位点特异性抗体)或表位结合氨基酸序列的任选的修饰而自所述“源”抗体获得。在一个实施方案中，若源抗体中的所选氨基酸是经由缺失、突变、置换、整合或组合而改变的，则抗体是自源抗体“衍生的”。在另一实施方案中，“衍生的”抗体为其中源抗体的片段(例如一个或多个CDR或整个可变区)与受体抗体序列组合或并入受体抗体序列中以提供衍生物抗体(例如嵌合、CDR移植或人源化抗体)的抗体。出于各种原因(例如改良对决定簇的亲和力；改良细胞培养物中的产量及产率；降低体内免疫原性；降低毒性；促进活性部分的缀合；或产生多特异性抗体)，这些”衍生的”(例如人源化或CDR移植)抗体可使用标准分子生物学技术产生。所述抗体亦可通过化学方法或翻译后修饰经由成熟分子(例如糖基化作用模式或聚乙二醇化作用)的修饰而自源抗体衍生。当然，如本文中广泛讨论的，这些衍生的抗体可以进一步改造以提供包含一个或多个游离半胱氨酸的所需位点特异性抗体。
在本发明的情形中，应了解，任一个来源于在随附序列表(抗SEZ6抗体)中阐述的鼠可变区氨基酸序列的所公开的轻链及重链CDR均可根据本发明的教导与受体抗体组合或重新排列以提供最佳化抗人类SEZ6(例如人源化或嵌合抗hSEZ6)位点特异性抗体。即，可将自随附序列表中阐述的邻接轻链可变区氨基酸序列(共同为SEQ ID NO:20–169，奇数)衍生或获得的一个或多个CDR并入位点特异性构建体中，且尤其在优选实施方案中，并入与一个或多个SEZ6同工型免疫特异性缔合的CDR移植或人源化位点特异性抗体中。所述人源化调节剂的”衍生的”轻链及重链可变区氨基酸序列的实施例亦阐述于图2A和2B(针对抗DLL3抗体(SEQ ID NO：519-528))，图3A和3B(针对抗SEZ6抗体(SEQ ID NO：170-199))和图4(针对抗CD324抗体(SEQ ID NO：531和532))。
在图2A及图2B，3A和3B和4中，经标注的CDR及构架序列是使用专有Abysis数据库根据Kabat定义。然而，如本文中所论述，本领域技术人员可容易地定义、鉴别、衍生及/或枚举随附序列表中阐述的每一个各别重链及轻链序列的CDR，如由Kabat等人、Chothia等人或MacCallum等人所定义。因此，包含由所有所述命名法定义的CDR的每一种主题CDR及抗体均清楚地包括于本发明的范围内。更广泛言之，术语“可变区CDR氨基酸残基”或更简单言之，“CDR”包括如使用以上阐述的任何基于序列或结构的方法鉴别的CDR中的氨基酸。在此情形中，图3A及图3B中的示例性人源化抗体的Kabat CDR是作为SEQ ID NO:405–470提供于随附序列表中。
本发明的另一个方面包含并入获得自或衍生自以下的抗SEZ6抗体的ADC：SC17.1，SC17.2，SC17.3，SC17.4，SC17.8，SC17.9，SC17.10，SC17.11，SC17.14，SC17.15，SC17.16，SC17.17，SC17.18，SC17.19，SC17.22，SC17.24，SC17.27，SC17.28，SC17.29，SC17.30，SC17.32，SC17.34，SC17.35，SC17.36，SC17.38，SC170.39，SC17.40，SC17.41，SC17.42，SC17.45，SC17.46，SC17.47，SC17.49，SC17.50，SC17.53，SC17.54，SC17.56，SC17.57，SC17.59，SC17.61，SC17.63，SC17.71，SC17.72，SC17.74，SC17.76，SC17.77，SC17.79，SC17.81，SC17.82，SC17.84，SC17.85，SC17.87，SC17.89，SC17.90，SC17.91，SC17.93，SC17.95，SC17.97，SC17.99，SC17.102，SC17.114，SC17.115，SC17.120，SC17121，SC17.122，SC17.140，SC17.151，SC17.156，SC17.161，SC17.166，SC17.187，SC17.191，SC17.193，SC17.199和SC17.200；或任何上述鉴定的抗体或其嵌合或人源化的版本。在其他实施方案中，本发明的ADC将包含SEZ6抗体，其具有一个或多个CDR，例如，一个，两个，三个，四个，五个或六个CDR，其来自上述任何调节剂。经标注的序列表为每个上述抗-SEZ6抗体的重链和轻链可变区提供个别的SEQ ID NO。
2.位点特异性抗体
根据本公开内容，本领域技术人员可容易地制造如本文所述的改造的构建体。如本文所使用，“改造的抗体”，“改造的构建体”或“位点特异性抗体”意指抗体或其免疫反应性片段，其中，在重链或轻链中的至少一个氨基酸缺失、改变或置换(优选用另一种氨基酸)，以提供至少一个游离半胱氨酸。类似地，“改造的缀合物”或“位点特异性缀合物”应保持为意指抗体药物缀合物，其包含改造的抗体和至少一个缀合至未配对的一个或多个半胱氨酸的细胞毒素。在某些实施方案中，未配对的半胱氨酸残基将包含未配对链内的残基。在其他优选的实施方案中，游离半胱氨酸残基将包含未配对链间半胱氨酸残基。改造的抗体可以是各种同种型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；且这些种类中，抗体可以是各种亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。关于这样的IgG构建体，抗体轻链可包含κ或λ同种型，每个κ或λ同种型并入C214，在优选的实施方案中，由于在IgG1重链中缺乏C220残基，C214可以是未配对的。
在一个实施方案中，改造的抗体包含至少一个氨基酸缺失或链内或链间半胱氨酸残基的置换。如本文所使用的“链间半胱氨酸残基”意指参与抗体轻链和重链之间或抗体两条重链之间的天然二硫键的半胱氨酸残基，而链内半胱氨酸残基是在相同重链或轻链中与另一个半胱氨酸自然配对的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，缺失或置换的链间半胱氨酸残基参与轻链和重链之间的二硫键的形成。在另一个实施方案中，缺失或置换的半胱氨酸残基参与两个重链之间的二硫键。在一个典型的实施方案中，由于抗体的互补结构(其中所述轻链与重链的VH和CH1结构域配对，并且其中一个重链的CH2和CH3结构域与互补的重链的CH2和CH3结构域配对)，在轻链或重链中的单个半胱氨酸的突变或缺失将导致在该改造抗体中的2个未配对的半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，链间半胱氨酸残基缺失。在其他实施方案中，链间半胱氨酸被置换为另一个氨基酸(例如，天然存在的氨基酸)。例如，所述氨基酸置换可导致将链间半胱氨酸置换为中性(例如丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸)或亲水性(例如甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)残基。在一个特别优选的实施方案中，链间半胱氨酸被置换为丝氨酸。
在通过本发明的设想一些实施方案中，缺失或置换的半胱氨酸残基是在轻链(κ或λ)上，从而留下重链上的游离半胱氨酸。在其他实施方案中，缺失或置换的半胱氨酸残基是在重链上，留下轻链恒定区上的游离半胱氨酸。图1描绘参与示例性IgG1/κ抗体中的链间二硫键的半胱氨酸。如先前在每种情况下表示，恒定区的氨基酸残基基于根据Kabat的EU索引进行编号。如图9所示，在完整抗体的轻链或重链中的单个半胱氨酸的缺失或置换导致具有两个未配对的半胱氨酸残基的改造抗体。
在一个特别优选的实施方案中，在IgG轻链(κ或λ)的位置214(C214)的半胱氨酸缺失或置换。在另一个优选的实施方案中，IgG重链上的位置220(C220)的半胱氨酸缺失或置换。在进一步的实施方案中，在重链上的位置226或位置229的半胱氨酸缺失或置换。在一个实施方案中，重链上的C220被置换为丝氨酸(C220S)，以提供在轻链中的期望的游离半胱氨酸。在另一个实施方案中，轻链中的C214被置换为丝氨酸(C214S)，以提供在重链中的期望的游离半胱氨酸。在图5A和5B(采用示例性抗-DLL3抗体SC16.56，)，图6A和6B(使用示例性抗SEZ6抗体SC17.200)和图7(针对示例性抗CD324抗体SC10.17)中分别显示，按照实施例6–8提供的这种位点改造的构建体。在所附序列表中也提供了对于示例性抗-SEZ6抗体SC17.17的另外的例子(SEQ ID NOS:537-542)。这些优选构建体的概要示于紧随下方的表2，其中所有编号都是根据Kabat中所述的EU索引，且WT代表“野生型”或没有改变的天然恒定区序列。需要注意的是，虽然引用的序列是κ轻链，但如本文所述，也可以使用包含C214的示例性λ轻链。此外，如本文所使用，δ(Δ)应指定氨基酸残基的缺失(例如，C214Δ表明在位置214的半胱氨酸已缺失)。
表2
如本文所公开，用于产生具有药物负荷的确定的位点和化学计量的抗体-药物缀合物的策略广泛适用于其他抗体，因为它主要涉及抗体的保守恒定结构域的改造。因为每个类和亚类的抗体的氨基酸序列和天然二硫键是充分记录的，本领域技术人员无需过度实验就可容易地制造各种抗体的改造构建体，因此，这样的构建体明确地涵盖在本发明范围内。
3.抗体的产生
a.多无性繁殖系抗体
在各种宿主动物(包括兔、小鼠、大鼠等)中产生多无性繁殖系的抗体在本领域中是公知的。在一些实施方案中，含有多无性繁殖系的抗体的血清是通过使动物出血或处死动物而获得。血清可以自动物获得的形式用于研究目的，或在替代例中，抗体可经部分或完全纯化以提供免疫球蛋白级分或均质性抗体制剂。
简言之，用DLL3免疫原(例如可溶性DLL3或sDLL3)(其可例如包含所选同工型、结构域及/或肽)或表达DLL3或其免疫反应性片段的活细胞或细胞制剂使所选动物免疫。视接种的物种而定，本领域中已知的可用于提高免疫学反应的佐剂包括(但不限于)弗氏(Freund's)(完全及不完全)佐剂、矿物质凝胶(诸如氢氧化铝)、表面活性物质(诸如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚及可能有效的人类佐剂，诸如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))及短小棒状杆菌菌苗(corynebacterium parvum)。所述佐剂可保护抗原免于因在局部沉积中螯合而快速分散，或其可含有刺激宿主分泌针对巨噬细胞及免疫***的其他组分具有趋化性的因子的物质。免疫程序优选将涉及经预定时间周期进行的所选免疫原的两次或更多次施用。
以举例的方式，可分析DLL3蛋白质的氨基酸序列以选择用于产生抗体的DLL3蛋白质的特异性区域。例如，使用DLL3氨基酸序列的疏水性及亲水性分析来鉴别DLL3结构中的亲水性区域。DLL3蛋白质中展示免疫原性结构的区域以及其他区域及结构域可使用本领域中已知的各种其他方法容易地鉴别，诸如舒-法斯曼(Chou-Fasman)、加尼尔-罗布森(Garnier-Robson)、凯特-杜立德(Kyte-Doolittle)、埃森伯格(Eisenberg)、卡普拉斯-舒尔茨(Karplus-Schultz)或詹姆士-沃夫(Jameson-Wolf)分析。平均柔性概况可使用Bhaskaran R.,Ponnuswamy P.K.,1988,Int.J.Pept.Protein Res.32:242-255的方法产生。β-转角(Beta-turn)概况可使用Deleage,G.,Roux B.,1987,Protein Engineering 1:289-294的方法产生。因此，由这些程序或方法中的任一者鉴别的各DLL3区域、结构域或基序均在本发明的范围内且可经分离或改造以提供免疫原，从而产生包含期望的性质的调节剂。用于产生DLL3抗体的优选方法进一步由本文中提供的实施例说明。用于制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法在本领域中是公知的。本领域中亦公知用于制备蛋白质与载体(诸如BSA、KLH或其他载体蛋白)的免疫原性缀合物的方法。在一些情况下，使用直接缀合，其使用例如碳化二亚胺试剂；在其他情况下，连接试剂为有效的。如在本领域中理解，DLL3免疫原的施用通常通过经合适时间周期的注射且使用合适佐剂进行。在免疫程序期间，可如以下实施例中所描述获得抗体的滴度以确定抗体形成的适当性。
b.单克隆抗体
此外，本发明涵盖单克隆抗体的应用。如本领域中已知，术语“单克隆抗体”(或mAb)是指自基本上均质性抗体的群体(即组成该群体的个别抗体除可能少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外为相同的)获得的抗体。在某些实施方案中，该单克隆抗体包括包含与抗原结合或缔合的多肽序列的抗体，其中抗原结合多肽序列是通过包括自多个多肽序列选择单一目标结合多肽序列的方法获得。
更一般而言且如本文中的实施例中所阐述，单克隆抗体可使用本领域中已知的多种技术制备，已知的多种技术包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如)或其某些组合。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤及本领域中公认的生物化学及遗传改造技术产生，诸如以下文献中更详细地描述的，其均通过引用整体并入本文中：An,Zhigiang(编)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,John Wiley和Sons,第1版2009；Shire等人(编)Current Trends in Monoclonal AntibodyDevelopment and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC,第1版2010；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版1988；Hammerling等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。应理解，可进一步改变所选结合序列例如以改良对目标的亲和力、人源化目标结合序列、改良其在细胞培养物中的产量、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，且包含经改变的目标结合序列的抗体亦为本发明的抗体。如下面实施例1中所述，提供与本发明相容的鼠单克隆抗体。
c.嵌合及人源化抗体
在另一实施方案中，本发明的抗体可包含来源于共价接合蛋白质区段的嵌合抗体，所述共价接合蛋白质区段是来自至少两个不同物种或类别的抗体。术语“嵌合”抗体涉及关于满足以下条件的构建体：其中一部分重链及/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及所述抗体的片段中的相应序列相同或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人,1984,PMID:6436822)。
在一个实施方案中，嵌合抗体可包含鼠VH及VL氨基酸序列以及来源于人类来源的恒定区，例如如下文描述的人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可为“CDR移植”抗体，其中该抗体包含一个或多个来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的CDR，而抗体链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源。对于在人类中使用，可将所选啮齿动物CDR(例如小鼠CDR)移植至人类抗体中，置换人类抗体中一个或多个天然存在的CDR。这些构建体通常具有提供完全强度抗体功能(例如补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))同时降低个体对抗体的不良免疫应答的优点。
“人源化”抗体与CDR移植抗体类似。如本文中所用，非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含来源于一个或多个非人类免疫球蛋白的氨基酸序列。在一个实施方案中，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体或接受体抗体)，其中来自受体的一个或多个CDR的残基被置换为来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的一个或多个CDR的残基。在某些优选实施方案中，人免疫球蛋白的可变结构域中的一个或多个FR中的残基被置换为来自供体抗体的相应非人类残基，以便帮助保持移植CDR的适当三维构型且由此改良亲和力。此可称为引入“回复突变”。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基以例如进一步改进抗体效能。下面实施例3中提供与本发明相容的人源化抗-DLL3抗体，在图2A和2B中显示所得的人源化轻链和重链氨基酸序列。按照实施例4提供人源化抗SEZ6抗体，其具有示于图3A和3B的所得的人源化轻链和重链氨基酸序列，而按照实施例5提供人源化的抗CD324抗体，其具有图4中所示的对应序列。图5A和5B，图6A和6B和图7分别示出，三种抗原的位点特异性的示例性人源化抗体重链和轻链的带附注(annotated)氨基酸序列。
可使用各种来源以确定在人源化抗体中使用何种人类序列。所述来源包括人类生殖系序列，例如Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today 16:237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14:4628-4638中所公开；V-BASE目录(VBASE2-Retter等人,Nucleic Acid Res.33；671-674,2005)，其提供人免疫球蛋白可变区序列的综合性目录(由Tomlinson,I.A.等人编译,MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)；或共有人类FR，例如U.S.P.N.6,300,064中所描述。
CDR移植及人源化抗体描述于例如U.S.P.N.6,180,370及5,693,762中。关于其他细节，参见例如Jones等人,1986,PMID:3713831；及U.S.P.N.6,982,321及7,087,409。
另一方法称为“人类改造(humaneering)”，其描述于例如U.S.P.N.2005/0008625中。在另一实施方案中，非人类抗体可由人类T细胞表位的特定缺失或通过WO 98/52976及WO 00/34317中公开的方法进行“去免疫”来修饰。
如上文所论述，在所选实施方案中，至少60％、65％、70％、75％或80％人源化或CDR移植抗体重链或轻链可变区氨基酸残基将与受体人类序列的重链或轻链可变区氨基酸残基相对应。在其他实施方案中，至少83％、85％、87％或90％人源化抗体可变区残基将与受体人类序列的可变区残基相对应。在另一优选实施方案中，每一个人源化抗体可变区中的超过95％的部分将与受体人类序列相对应。
人源化抗体可变区与人类受体可变区的序列同一性或同源性可如先前所论述来确定，且当以此方式测量时，优选共有至少60％或65％序列同一性，更优选至少70％、75％、80％、85％或90％序列同一性，甚至更优选至少93％、95％、98％或99％序列同一性。优选的是，不一致的残基位置因保守氨基酸置换而不同。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被置换为具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(R基团)的另一氨基酸残基的置换。一般而言，保守氨基酸置换应实质上不改变蛋白的功能特性。在两个或两个以上氨基酸序列的保守性置换彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似度可上调以校正置换的保守性质。
d.人类抗体
在另一实施方案中，抗体可包含完全人类抗体。术语“人类抗体”是指具有与由人类产生及/或使用任一种用于产生人类抗体的技术产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。
人类抗体可使用本领域中已知的各种技术产生。一种技术为噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(优选人类)抗体的文库，用相关抗原或其抗体结合部分筛选文库，且分离结合抗原的噬菌体，由此可获得免疫反应性片段。用于制备及筛选所述文库的方法在本领域中是公知的，且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如Pharmacia重组型噬菌体抗体***，目录号27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。亦存在其他可用于产生及筛选抗体呈现文库的方法及试剂(参见例如U.S.P.N.5,223,409；PCT公开第WO 92/18619号、第WO 91/17271号、第WO 92/20791号、第WO 92/15679号、第WO 93/01288号、第WO 92/01047号、第WO 92/09690号；及Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991))。
在一个实施方案中，可通过筛选如上制备的重组型组合抗体文库来分离重组型人类抗体。在一个实施方案中，文库为scFv噬菌体展示文库，其是使用人类VL及VH cDNA产生，所述人类VL及VH cDNA是由自B细胞分离的mRNA制备。
由未经处理的文库(天然或合成)产生的抗体可具有中等亲和力(Ka为约106至107M-1)，但如本领域中所描述，亲和力成熟亦可通过自二级文库构筑及重新选择来体外模仿。例如，可通过使用易错聚合酶体外随机引入突变(Leung等人,Technique,1:11-15(1989)中报道)。此外，可通过例如用具有跨越所关注的CDR的随机序列的引物的PCR在所选个别Fv克隆中使一个或多个CDR随机突变且筛选较高亲和力克隆来进行亲和力成熟。WO9607754描述用于诱导免疫球蛋白轻链的CDR中的诱发突变以产生轻链基因的文库的方法。另一有效方法是将通过噬菌体展示所选择的VH结构域或VL结构域与获自未免疫供者的天然存在V结构域变体谱系重组且在若干轮链改组中针对较高亲和力进行筛选，如Marks等人,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术允许产生解离常数KD(koff/kon)为约10-9M或更小的抗体及抗体片段。
在其他实施方案中，可使用包含在表面上表达结合对的真核细胞(例如酵母)的文库来使用类似程序。参见例如U.S.P.N.7,700,302及U.S.S.N.12/404,059。在一个实施方案中，人类抗体是选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人类抗体(Vaughan等人NatureBiotechnology 14:309-314(1996)；Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6157-6162(1998))。在其他实施方案中，人类结合对可自诸如酵母的真核细胞中所产生的组合性抗体文库分离。参见例如U.S.P.N.7,700,302。所述技术有利地允许筛选大量候选调节剂且可相对容易地操作候选序列(例如通过亲和力成熟或重组型改组)。
人类抗体亦可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如小鼠)中来产生，所述转基因动物中的内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活且已引入人免疫球蛋白基因。在攻击时，观察人类抗体产生，其在各方面均密切地类似于人类中所见，包括基因重排、组装及抗体谱系。此方法描述于例如与技术有关的U.S.P.N.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及U.S.P.N.6,075,181及6,150,584；以及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中。或者，人类抗体可经由使产生针对目标抗原的抗体的人类B淋巴细胞(所述B淋巴细胞可自罹患肿瘤性疾病的个体回收或可在体外进行免疫)永生化来制备。参见例如Cole等人,Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)；及U.S.P.N.5,750,373。
4.抗体的重组产生
位点特异性抗体及其片段可使用自产生细胞的抗体获得的遗传物质及重组技术产生或修饰(参见例如Berger及Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Sambrook及Russell(编)(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),NY,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel等人(2002)Short Protocols in MolecularBiology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John&Sons,Inc.(2006年增刊)；及U.S.P.N.7,709,611)。
更具体而言，本发明的另一方面是关于编码本发明的位点特异性抗体的改造核酸分子。核酸可存在于全细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当核酸通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl分带(banding)、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳及本领域中公知的其他技术)自其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)纯化时，所述核酸是“经分离的”或“变成基本上纯的”。本发明的核酸可为例如DNA或RNA，且可能含有或可能不含有内含子序列。更一般而言，如本文中所用的术语“核酸”包括基因组DNA、cDNA、RNA及其人工变体(例如肽核酸)(无论单链或双链)。在优选实施方案中，核酸为cDNA分子。
本发明的核酸可使用标准分子生物学技术获得并操作。对于经杂交瘤(例如下文中进一步描述的由携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，编码由该杂交瘤制备的抗体的轻链及重链的cDNA可经由标准PCR扩增或cDNA克隆技术(例如参见实施例1)获得。对于自免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，编码抗体的核酸可自文库回收。
一旦获得编码VH及VL区段的DNA片段，所述DNA片段可进一步通过标准重组DNA技术操作，例如以使所述可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，使编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段，诸如抗体恒定区或柔性连接体。如上下文中所用的术语“可操作地连接”欲意指接合所述两个DNA片段以便使由两个DNA片段编码的氨基酸序列在框架中保留。
可通过将编码VH的DNA可操作地连接至另一编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子而将编码VH区的经分离DNA转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242)且涵盖所述区域的DNA片段可由标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选为IgG1或IgG4恒定区。如下文更详细论述，与本文中的教导相容的示例性IgG1恒定区作为SEQ ID NO:404阐述于随附序列表中，其具有在SEQ IDNO：500和501中所阐述的相容改造IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可将编码VH的DNA可操作性连接至另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可通过使VL编码DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子可操作地连接，将编码VL区的经分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242)且涵盖这些区域的DNA片段可由标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但最优选为κ恒定区。在此方面，示例性相容κ轻链恒定区作为SEQ ID NO:403阐述于随附序列表中，而相容λ轻链恒定区阐述于SEQ ID NO：504中。κ和λ轻链区的相容改造版本分别示于SEQ ID NO：502，503和505，506。
本发明亦提供包含上文所述核酸的载体，其可操作地连接至启动子(参见例如WO86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N.5,122,464)；以及真核生物的分泌途径的其他转录调节及处理控制元件。本发明亦提供具有所述载体及宿主表达***的宿主细胞。
如本文中所用，术语“宿主表达***”包括任何类型的可经改造以产生本发明的核酸或多肽及抗体的细胞***。所述宿主表达***包括(但不限于)经重组型噬菌体DNA或质体DNA转化或转染的微生物(例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；经重组型酵母表达载体转染的酵母(例如酵母属(Saccharomyces))；或具有重组型表达构建体的哺乳动物细胞(例如COS、CHO-S、HEK-293T、3T3细胞)，所述重组型表达构建体含有来源于哺乳动物细胞或病毒的基因组的启动子(例如腺病毒晚期启动子)。宿主细胞可经两种表达载体共转染，例如第一载体编码重链衍生的多肽且第二载体编码轻链衍生的多肽。
转化哺乳动物细胞的方法在本领域中是公知的。参见例如U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主细胞亦可经改造以允许产生具有各种特征的抗原结合分子(例如经修饰的具有GnTIII活性的糖形或蛋白质)。
为以长期高产率产生重组蛋白质，稳定表达为优选。因此，稳定表达所选抗体的细胞系可使用本领域中认可的标准技术改造且形成本发明的一部分。宿主细胞可经受适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)调控的DNA及可选标记物转化，而非使用含有病毒复制起点的表达载体。可使用本领域中公知的任一种选择***，包括谷氨酰胺合酶基因表达***(GS***)，其提供用于在某些条件下增强表达的有效方法。完全或部分结合U.S.P.N.5,591,639及5,879,936论述GS***。另一种用于开发稳定细胞系的优选表达***为FreedomTMCHO-S试剂盒(Life Technologies)。
一旦通过重组型表达或任何其他所公开的技术产生本发明的抗体，则所述抗体可由本领域中已知的方法纯化或分离，意指所述抗体经鉴别且自其天然环境分离及/或回收且与将妨碍抗体的缀合或诊断或治疗性用途的污染物分离。经分离的抗体包括重组型细胞内的原位抗体。
这些经分离的制剂可使用本领域中认可的各种技术纯化，所述技术诸如离子交换及大小排阻层析法、透析、渗滤及亲和层析法，尤其为蛋白质A或蛋白质G亲和层析法。
5.抗体片段及衍生物
a.片段
无论选择何种形式的位点特异性抗体(例如嵌合、人源化等)实践本发明，应了解，均可根据本文中的教导使用其免疫反应性片段。“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如本文中所用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，且术语“抗原结合片段”是指包含至少一个游离半胱氨酸的免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其免疫特异性结合所选抗原或其免疫原性决定簇或与所选抗原或其免疫原性决定簇反应或与衍生所述片段的完整抗体竞争结合特异性抗原。
示例性位点特异性片段包括：VL、VH、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，活性位点特异性片段包含一部分抗体，该部分抗体保留其与抗原/底物或受体相互作用且以与完整抗体类似的方式(尽管效率可能稍微较低)修饰抗原/底物或受体的能力。
在其他实施方案中，位点特异性抗体片段为包含Fc区域且保留当以完整抗体形式存在时通常与Fc区域相关联的生物功能(诸如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能及补体结合)中的至少一种的片段。在一个实施方案中，位点特异性抗体片段为单价抗体，其具有与完整抗体实质上类似的体内半衰期。例如，所述抗体片段可包含抗原结合臂，所述抗原结合臂连接至包含能够赋予片段体内稳定性的至少一个游离半胱氨酸的Fc序列。
如本领域技术人员将公认，可通过分子改造或经由完整或完全抗体或抗体链的化学或酶促处理(诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)或通过重组型方法获得片段。关于抗体片段的更详细描述，参见例如Fundamental Immunology,W.E.Paul编,Raven Press,N.Y.(1999)。
b.多价抗体
在一个实施方案中，本发明的位点特异性缀合物可为单价或多价(例如二价、三价等)。如本文中所用，术语“效价”是指与抗体相关联的潜在目标结合位点的数目。各目标结合位点特异性结合一个目标分子或目标分子上的特定位置或基因座。当抗体为单价时，分子的各结合位点将特异性缀合于单一抗原位置或表位。当抗体包含一个以上目标结合位点(多价)时，各目标结合位点可特异性结合相同或不同分子(例如可结合于不同配体或不同抗原，或相同抗原上的不同表位或位置)。参见例如U.S.P.N.2009/0130105。在各种情况下，至少一个结合位点将包含与DLL3同工型相关联的表位、基序或结构域。
在一个实施方案中，调节剂为双特异性抗体，其中两个链具有不同特异性，如Millstein等人,1983,Nature,305:537-539中所描述。其他实施方案包括具有其他特异性的抗体，诸如三特异性抗体。其他更复杂的相容多特异性构建体及其制造方法阐述于U.S.P.N.2009/0155255以及WO 94/04690；Suresh等人,1986,Methods in Enzymology,121:210；及WO 96/27011中。
如上文所提及，多价抗体可免疫特异性结合于期望的目标分子的不同表位，或可免疫特异性结合于目标分子以及异源表位，诸如异源多肽或固体支持物质。尽管抗-DLL3抗体的优选实施方案仅结合两种抗原(即双特异性抗体)，但本发明亦涵盖具有其他特异性的抗体(诸如三特异性抗体)。双特异性抗体亦包括交联或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中的抗体中的一者可与抗生物素蛋白偶联，另一者与生物素偶联。例如，已提出所述抗体使免疫***细胞靶向不需要的细胞(U.S.P.N.4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO92/200373及EP 03089)。异缀合物抗体可使用任何便利的交联方法制备。合适交联剂以及多种交联技术在本领域中是公知的，且公开于U.S.P.N.4,676,980中。
在其他实施方案中，使用一般本领域技术人员公知的方法使具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列(诸如包含铰链、CH2及/或CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域)融合。
c.Fc区修饰
除上文阐述的所公开的位点特异性缀合物的可变区或结合区(包括产生游离半胱氨酸的可变区或结合区)的各种修饰、置换、添加或缺失以外，本领域技术人员应了解，本发明的所选实施方案亦可包含恒定区(即Fc区)的置换或修饰。更具体而言，预期本发明的位点特异性抗体可尤其含有一种或多种附加的氨基酸残基置换、突变及/或修饰，其产生具有优选特征的化合物，所述特征包括(但不限于)：药物动力学改变、血清半衰期延长、结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、Fc配体与Fc受体(FcR)的结合改变、增强或降低的“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或“CDC”(补体依赖性细胞毒性)活性、改变的糖基化作用及/或二硫键及经改良的结合特异性。在此方面，应了解，这些Fc变体可有利地用于增强所公开的调节剂的有效抗肿瘤性质。
为此，本发明的某些实施方案可包含除了产生一个游离半胱氨酸所需的置换或修饰以外的Fc区的置换或修饰，例如添加一个或多个氨基酸残基、置换、突变及/或修饰以用于产生具有增强或优选Fc效应子功能的化合物。例如，与Fc结构域与Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之间的相互作用有关的氨基酸残基的变化可引起细胞毒性增加及/或药物动力学改变，诸如血清半衰期延长(参见例如Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；及deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)，其均通过引用并入本文中)。
在所选实施方案中，可通过修饰(例如置换、缺失或添加)经鉴别与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用有关的氨基酸残基来产生体内半衰期延长的抗体(参见例如国际公开第WO 97/34631号；第WO 04/029207号；U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。关于所述实施方案，Fc变体在哺乳动物(优选为人类)中的半衰期可大于5天、大于10天、大于15天、优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。半衰期延长可引起较高血清效价，其因此降低抗体的施用频率及/或降低所施用的抗体的浓度。可在例如转基因小鼠或经转染的表达人类FcRn的人类细胞系中，或在施用具有变异型Fc区的多肽的灵长类动物中分析体内人类FcRn高亲和力结合多肽与人类FcRn的结合及人类FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO2000/42072描述与FcRn的结合改良或减少的抗体变体。亦参见例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在其他实施方案中，Fc变化可引起ADCC或CDC活性增强或降低。如本领域中已知，CDC是指目标细胞在补体存在下的溶解，且ADCC是指细胞毒性的一种形式，其中结合于某些细胞毒素细胞(例如自然杀手细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞)上的FcR上的所分泌的Ig使这些细胞毒素效应细胞能够特异性结合于载荷抗原的目标细胞且接着杀死具有细胞毒素的目标细胞。在本发明的情形中，抗体变体具有“改变”的FcR结合亲和力，其与亲本或未经修饰的抗体或包含天然序列FcR的抗体相比为增强或降低的结合。所述显示降低的结合的变体可具有极少或不具有可感知的结合，例如与FcR的结合为天然序列的0-20％，例如由本领域中公知的技术测定。在其他实施方案中，与天然免疫球蛋白Fc结构域相比，变体将呈现增强的结合。应了解，所述类型的Fc变体可有利地用于增强所公开的抗体的有效抗肿瘤性质。在其他实施方案中，所述变化引起结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、糖基化作用改变及/或二硫键(例如对于缀合点)、改良的结合特异性、吞噬作用增加；及/或细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。
d.糖基化作用改变
还有其他实施方案包含一种或多种经改造的糖形，即包含改变的糖基化作用模式或改变的碳水化合物组成的DLL3位点特异性抗体，其共价连接至蛋白质(例如在Fc结构域中)。参见例如Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740。经改造的糖形可适用于多种目的，包括(但不限于)增强或降低效应子功能、增加调节剂对目标的亲和力或促进调节剂产生。在某些需要降低效应子功能的实施方案中，分子可经改造以表达糖基化形式。已公知可引起消除一个或多个可变区构架糖基化作用位点以由此消除该位点处的糖基化作用的置换(参见例如U.S.P.N.5,714,350及6,350,861)。相反，可通过在一个或多个附加糖基化作用位点处进行改造来赋予含有Fc的分子增强的效应子功能或改良的结合。
其他实施方案包括Fc变体，其具有改变的糖基化组成，诸如具有降低的岩藻糖基残基量的次岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNAc结构的抗体。已证明所述改变的糖基化作用模式可增加抗体的ADCC能力。经改造的糖形可由本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用经改造或变异型表达品系、通过与一种或多种酶(例如N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTI11))共表达、通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子或通过在包含Fc区的分子经表达后修饰碳水化合物(参见例如WO 2012/117002)。
e.其他处理
位点特异性抗体或缀合物可在产生期间或产生后经不同修饰，例如通过糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用、酰胺化作用、由已知保护基/封端基团进行的衍生作用、蛋白水解***、与抗体分子或其他细胞配体连接等。多种化学修饰中的任一种均可通过已知技术进行，包括(但不限于)由溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行的特异性化学裂解；乙酰化作用；甲酰化作用；氧化；还原；在衣霉素存在下的代谢性合成等。
本发明亦涵盖各种翻译后修饰，所述修饰包括例如N-连接或O-连接的碳水化合物链、N端或C端的处理、化学部分与氨基酸主链的连接、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰以及由原核宿主细胞表达引起的N端甲硫氨酸残基的添加或缺失。此外，调节剂亦可经可检测的标记(诸如酶、荧光、放射性同位素或亲和标记)修饰以允许检测及分离调节剂。
6.位点特异性抗体特征
无论位点特异性缀合物是以何种方式获得或其呈上述哪一种形式，所公开的抗体的各种实施方案均可呈现某些特征。在所选实施方案中，可针对有利性质来选择、克隆及进一步筛选抗体产生细胞(例如杂交瘤或酵母群落)，所述有利性质包括例如稳定生长、高抗体产量及如下文更详细论述，期望的位点特异性抗体特征。在其他情况下，可通过针对动物的接种选择特定抗原(例如特异性DLL3同工型)或目标抗原的免疫反应性片段来赋予或影响抗体的特征。在还有其他实施方案中，所选抗体可如上文所描述经改造以增强或改进免疫化学特征，诸如亲和力或药物动力学。
a.中和抗体
在某些实施方案中，缀合物将包含“中和”抗体或其衍生物或片段。即，本发明可包含抗体分子，其结合特定结构域、基序或表位且能够阻断、降低或抑制例如DLL3的生物活性。更一般而言，术语“中和抗体”是指满足以下条件的抗体：其结合于目标分子或配体或与目标分子或配体相互作用且阻止目标分子与结合配偶体(诸如受体或底物)的结合或缔合，由此中断生物反应，否则该生物反应将由分子的相互作用引起。
应了解，可使用本领域中已知的竞争性结合分析法评估抗体或其免疫功能性片段或衍生物的结合及特异性。在本发明中，当过量的抗体使结合于DLL3的结合配偶体的量降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多时(如例如由刻缺蛋白受体活性或在体外竞争性结合分析法中测量)，本发明抗体或片段将保持抑制或降低DLL3与结合配偶体或底物的结合。在例如针对DLL3的抗体的情况下，中和抗体或拮抗剂将优选使刻缺蛋白受体的活性改变达至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。应了解，此改良的活性可使用本领域中认可的技术直接测量或可由活性改变对下游的影响(例如肿瘤发生、细胞存活或刻缺蛋白反应基因的活化或抑制)来测量。抗体中和DLL3活性的能力优选是通过抑制DLL3与刻缺蛋白受体的结合来评估或通过抗体缓解DLL3介导的刻缺蛋白信号传导的抑制的能力来评估。
b.内化抗体
有证据表明大部分经表达的DLL3蛋白质保持与致瘤细胞表面缔合，由此允许所公开的位点特异性缀合物的局部化及内化作用。在优选实施方案中，所述调节剂将通过改造的游离的半胱氨酸位点与一种或多种药物相缔合，或缀合，这在内化后杀死细胞。在尤其优选实施方案中，位点特异性缀合物将包含内化ADC。
如本文中所用，“内化”调节剂为在与相关抗原或受体结合时由细胞吸收(以及任何有效载荷)的调节剂。如将了解，在所选实施方案中，内化抗体可包含抗体片段及其衍生物以及包含约2的DAR的抗体缀合物。内化作用可在体外或体内发生。对于治疗性应用，内化作用将优选在有需要的个体中在体内发生。内化的位点特异性抗体缀合物的数目可充分或足以杀死表达抗原的细胞，尤其表达抗原的癌症干细胞。视作为整体的位点特异性抗体缀合物的有效载荷或效能而定，在一些情况下，细胞中吸收单一改造抗体分子足以杀死抗体结合的目标细胞。例如，某些药物的有效性很高，使得少量的与抗体缀合的毒素的分子的内化作用足以杀死肿瘤细胞。可通过本领域中认可的分析法(包括以下实施例中描述的分析法)确定抗体在与哺乳动物细胞结合时是否内化。检测抗体是否内化于细胞中的方法亦描述于U.S.P.N.7,619,068中，其通过引用整体并入本文中。
c.消耗抗体
在其他实施方案中，位点特异性缀合将包含消耗抗体或其衍生物或片段。术语“消耗”抗体是指优选与细胞表面上或附近的抗原结合或缔合且诱导、促进或引起细胞的死亡或消除(例如通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)的抗体。在一些实施方案中，所选消耗抗体将与药物缔合或缀合。
优选消耗抗体将能够移除、消除或杀死定义细胞群体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的表达DLL3的细胞或使定义细胞群体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的表达DLL3的细胞失能。在一些实施方案中，细胞群体可包含经浓缩、切分、纯化或分离的肿瘤永存细胞。在其他实施方案中，细胞群体可包含完全肿瘤样品或异源肿瘤提取物，其包含癌干细胞。本领域技术人员应了解，标准生物化学技术可用于根据本文中的教导监测及定量致瘤细胞或肿瘤永存细胞的消耗。
d.分仓及表位作图
应进一步了解，所公开的位点特异性抗体缀合物将与由所选目标或其片段呈现的离散表位或免疫原性决定簇缔合或结合。在某些实施方案中，表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特征及/或比电荷特征。因此，如本文中所用，术语“表位”包括任何能够特异性结合于免疫球蛋白或T细胞受体或以其他方式与分子相互作用的蛋白质决定簇。在某些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质及/或巨分子的复杂混合物中的其目标抗原时，则认为抗体与抗原特异性缀合(或免疫特异性缀合或反应)。在优选实施方案中，当平衡解离常数(KD)小于或等于10-6M或小于或等于10-7M，更优选当平衡解离常数小于或等于10-8M，且甚至更优选当解离常数小于或等于10-9M时，认为抗体与抗原特异性缀合。
更直接的是，术语“表位”是以其常用生物化学含义使用且是指目标抗原中能够由特定抗体调节剂识别及特异性结合的部分。当抗原为多肽(诸如DLL3)时，表位通常可由邻接氨基酸及由于蛋白质的三级折叠而相邻的非接触氨基酸形成(“构象表位”)。在所述构象表位中，存在跨越蛋白质上氨基酸残基的相互作用点，所述相互作用点彼此线性分离。由邻接氨基酸形成的表位(有时称为“线状”或“连续”表位)通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时损失。在任何情况下，抗体表位在唯一空间构象中典型地包括至少3个、且更通常至少5个或8-10个氨基酸。
在此方面，应了解，在某些实施方案中，表位可与例如DLL3蛋白质的一个或多个区域、结构域或基序缔合或驻留于其中。如本文中更详细论述，DLL3蛋白质的细胞外区域包含一系列通常经识别的结构域，包括六个EGF样结构域及DSL结构域。为达成本发明的目的，术语“结构域”将根据其公认含义使用且将始终指蛋白质内的可识别或可定义的保守性结构实体，其呈现独特的二级结构含量。在许多情况下，具有共同功能的同源结构域将通常展示序列相似性且可在多种不同蛋白质中发现(例如EGF样结构域据称可在至少471种不同蛋白质中发现)。类似地，本领域中认可的术语“基序”将根据其常用含义使用且应通常指蛋白质的短的、保守性区域，其典型地具有十至二十个邻接氨基酸残基。如本文中所论述，所选实施方案包含位点特异性抗体，其与DLL3的特定区域、结构域或基序内的表位缔合或结合。
如在PCT/US14/17810中更详细地讨论，由示例性的位点特异性标记抗体结合的人DLL3的特别优选的表位列于正下方的表3。
表3
抗体克隆 表位 SEQ ID NO:
SC16.23 Q93,P94,G95,A96,P97 3
SC16.34 G203,R205,P206 4
SC16.56 G203,R205,P206 4
按照类似的推理，针对选定的抗体来确定SEZ6抗原的表位。在这方面，并且如PCT/US2013/027476(为了相关内容将所述申请并入本文)中所阐述，本发明位点特异性的抗SEZ6缀合物可包含特异性结合SEZ6蛋白质上的表位的抗体，其中所述表位包括选自下列的氨基酸残基：(ⅰ)残基R762，L764，Q777，I779，D781和Q782；(ii)残基R342和K389，以及(iii)残基T352，S353和H375。
在任何情况下，一旦确定抗原上的期望的表位，则可产生针对该表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含表位的肽进行免疫。或者，在发现过程期间，抗体的产生及表征可说明与位于特定结构域或基序中的期望的表位有关的信息。由此信息，则可针对与相同表位的结合来以竞争方式筛选出抗体。一种实现此目的的方法为进行竞争研究，从而发现彼此竞争性结合的抗体，即竞争结合抗原的抗体。用于基于抗体的交叉竞争而对抗体进行分仓的高通量过程描述于WO 03/48731中。其他分仓或结构域含量或表位定位的方法(包含抗体竞争或酵母上的抗原片段表达)是本领域中公知的。
如本文中所用，术语“分仓(binning)”是指用于基于抗体的抗原结合特征及竞争而将抗体分组或分类的方法。尽管所述技术适用于对本发明的调节剂进行定义及分类，但分仓并非始终与表位直接相关且所述表位结合的初始测定可由本文中所描述的本领域中认可的其他方法改进及证实。然而，可以理解的是，凭经验将抗体调节剂分配至各个仓室可提供可指示所公开的调节剂的治疗潜力的信息。
更具体而言，可使用本领域中已知及本文中的实施例中阐述的方法确定所选参考抗体(或其片段)是否结合于相同表位或交叉竞争结合第二测试抗体(即处于相同仓室)。在一个实施方案中，参考抗体调节剂与DLL3抗原在饱和条件下缔合，且接着使用标准免疫化学技术测定二级或测试抗体调节剂结合于DLL3的能力。若测试抗体能够实质上与参考抗-DLL3抗体同时结合于DLL3，则与初级或参考抗体相比，二级或测试抗体结合于不同表位。然而，若测试抗体不能实质上同时结合于DLL3，则测试抗体结合于相同表位、重叠表位或与由初级抗体结合的表位紧邻(至少位阻上)的表位。即，测试抗体就抗原结合进行竞争且与参考抗体处于同一仓室。
当在所公开的抗体的情形中使用时，术语“竞争”或“竞争抗体”意指抗体之间的竞争，如由其中测试抗体或所测试的免疫功能性片段阻止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性缀合的分析法所测定。通常，所述分析法涉及使用经纯化的结合于固体表面或载有这些物质中的任一者的抗原(例如DLL3或其结构域或片段)、未经标记的测试免疫球蛋白及经标记的参考免疫球蛋白。通过在测试免疫球蛋白存在下测定结合于固体表面或细胞的标记量来测量竞争性抑制。通常，测试免疫球蛋白是以过量存在及/或允许首先结合。由竞争分析法鉴别的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合于同一抗体表位的抗体，及与由参考抗体结合的抗体表位足够近的相邻抗体表位结合从而发生位阻的抗体。关于测定竞争性结合的方法的其他细节提供于本文实施例中。通常，当竞争抗体以过量存在时，其将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合达至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些实施例中，结合受抑制达至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。
相反，当参考抗体被结合时，其优选抑制随后添加的测试抗体(即DLL3调节剂)的结合达至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些实施例中，测试抗体的结合受抑制达至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。
关于本发明，且如在PCT/US14/17810中所述(针对抗-DLL3抗体仓室其被并入本文)中所阐述，已测定(经由表面等离振子共振或生物层干涉测量术)DLL3的细胞外结构域由竞争性结合定义至少九个仓室，本文中称为“仓室A”至“仓室I”。鉴于由调节剂分仓技术提供的解析，相信该九个仓室包含DLL3蛋白质的细胞外区域中的大部分仓室。
在此方面，且如本领域中已知，期望的分仓或竞争性结合数据可使用以下获得：固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA或ELISA)、夹心竞争分析法、BiacoreTM2000***(即表面等离振子共振-GE Healthcare)、Analyzer(即生物层干涉测量术-ForteBio,Inc.)或流动式细胞测量方法。如本文中所用的术语“表面等离振子共振”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析即时特定相互作用的光学现象。术语“生物层干涉测量术”是指光学分析技术，其分析自两个表面反射的白光的干涉图案：生物传感器尖端上固定的蛋白质的层，及内部参考层。结合于生物传感器尖端的分子数目的任何变化均引起干涉图案偏移，该偏移可即时测量。在尤其优选实施方案中，分析(无论表面等离振子共振、生物层干涉测量术或流动式细胞测量术)是使用Biacore或ForteBio器具或流式细胞仪(例如FACSAria II)进行，如本领域中已知。
为了进一步表征与所公开的DLL3抗体调节剂缔合或结合的表位，可使用由Cochran等人(J Immunol Methods.287(1-2):147-158(2004)(其通过引用并入本文中)描述的方案的改良版本进行结构域水平表位作图。简言之，DLL3中包含特定氨基酸序列的个别结构域表达于酵母表面上且经由流动式细胞测量术测定与各DLL3抗体的结合。
其他相容表位定位技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹法(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)(本文中特定地通过引用整体并入)或肽裂解分析。此外，可使用诸如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science9:487-496)(本文中特定地通过引用整体并入)。在其他实施方案中，修饰辅助探测(Modification-Assisted Profiling；MAP)，亦称为基于抗原结构的抗体探测(AntigenStructure-based Antibody Profiling；ASAP)提供根据各抗体与经化学或酶促修饰的抗原表面的结合概况的相似性来将大量针对相同抗原的单克隆抗体(mAb)归类的方法(U.S.P.N.2004/0101920，其特定地通过引用整体并入本文中)。各类别可反映独特表位，其与由另一类别表示的表位明显不同或部分重叠。此技术允许快速过滤遗传一致抗体，使得表征可集中于遗传相异抗体。应了解，MAP可用于将本发明的hDLL3抗体调节剂分选至结合不同表位的抗体群。
可用于改变固定的抗原的结构的试剂包括酶，诸如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胞内蛋白酶Glu-C、胞内蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)。适用于改变固定的抗原的结构的试剂亦可为化学试剂，诸如丁二酰亚氨基酯及其衍生物、含有一级胺的化合物、肼及碳肼、游离氨基酸等。
抗原蛋白质可固定在生物传感器晶片表面或聚苯乙烯珠上。后者可经例如分析法处理，该分析法为诸如多工LUMINEXTM检测分析法(Luminex Corp.)。由于LUMINEX用至多100种不同类型的珠操作多工分析的能力，LUMINEX提供几乎无限的具有各种修饰的抗原表面，引起生物传感器分析法中抗体表位探测的改良的解析。
e.结合亲和力
除了表位特异性以外，所公开的位点特异性抗体可使用物理特征(诸如结合亲和力)表征。在此方面，本发明进一步涵盖抗体的用途，所述抗体对一种或多种DLL3同工型或在泛抗体情况下，对DLL家族中一个以上成员具有高结合亲和力。如本文中所用，术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对目标抗原的KD为10-8M或低于10-8M，更优选为10-9M或低于10-9M，且甚至更优选为10-10M或低于10-10M。然而，“高亲和力”结合可针对其他抗体同种型而变化。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体的KD为10-7M或低于10-7M，更优选为10-8M或低于10-8M，甚至更优选为10-9M或低于10-9M。
如本文中所用，术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。据称本发明的抗体在解离常数KD(koff/kon)≤10-7M时免疫特异性缀合其目标抗原。当KD≤5×10-9M时，抗体以高亲和力特异性结合抗原，且当KD≤5×10-10M时，以极高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施方案中，抗体的KD≤10-9M且解离速率为约1×10-4/秒。在本发明的一个实施方案中，解离速率<1×10-5/秒。在本发明的其他实施方案中，抗体将以介于约10-7M与10-10M之间的KD结合于DLL3，且在另一实施方案中，其将以KD≤2×10-10M结合。本发明的其他所选实施方案包含解离常数或KD(koff/kon)满足以下条件的抗体：小于10-2M、小于5×10-2M、小于10-3M、小于5×10-3M、小于10-4M、小于5×10-4M、小于10-5M、小于5×10-5M、小于10-6M、小于5×10-6M、小于10-7M、小于5×10-7M、小于10-8M、小于5×10-8M、小于10-9M、小于5×10-9M、小于10-10M、小于5×10-10M、小于10-11M、小于5×10-11M、小于10-12M、小于5×10-12M、小于10-13M、小于5×10-13M、小于10-14M、小于5×10-14M、小于10-15M或小于5×10-15M。
在特定实施方案中，免疫特异性结合于DLL3的本发明的抗体的缔合速率常数或kon(或ka)速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为至少105M-ls-l、至少2×105M-ls-l、至少5×105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5×106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5×107M-ls-l或至少108M-ls-l。
在另一实施方案中，免疫特异性结合于DLL3的本发明的抗体的解离速率常数或koff(或kd)速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)小于10-ls-1、小于5×10-ls-1、小于10-2s-1、小于5×10-2s-l、小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-l。
在本发明的其他所选实施方案中，抗-DLL3抗体的亲合力常数或Ka(kon/koff)为至少102M-1、至少5×102M-1、至少103M-1、至少5×103M-1、至少104M-1、至少5×104M-1、至少105M-1、至少5×105M-1、至少106M-1、至少5×106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、至少5×1012M-1、至少1013M-1、至少5×1013M-1、至少1014M-1、至少5×1014M-1、至少1015M-1或至少5×1015M-1。
除上述调节剂特征以外，本发明的抗体可使用其他物理特征进一步表征，包括例如热稳定性(即熔融温度；Tm)及等电点(参见例如Bjellqvist等人,1993,Electrophoresis14:1023；Vermeer等人,2000,Biophys.J.78:394-404；Vermeer等人,2000,Biophys.J.79:2150-2154，其均通过引用并入本文中)。
IV.位点特异性缀合物
应该理解的是，本发明的位点特异性缀合物包含经由未配对的半胱氨酸共价连接(优选通过连接体结构部分)至一种或多种药物有效载荷的位点特异性的抗体(例如，抗DLL3，抗SEZ6，抗CD324)抗体。如本文中所讨论，本发明的位点特异性缀合物可被用来提供在目标位置(例如，致瘤性细胞)的细胞毒素或其他有效载荷。这有利地通过所公开的位点特异性ADC来实现，所述位点特异性ADC在释放并激活药物有效载荷之前将结合的有效载荷以相对非活性、无毒状态导向至目标位点。如本文中所讨论，这种有效载荷的靶向的释放主要通过以下来实现：经由一个或多个游离半胱氨酸的有效载荷的稳定的位点特异性缀合和最小化过度缀合的毒性物质种类的ADC制剂相对均匀的组成。再加上被设计为一旦药物连接体被递送到肿瘤位点、则大量释放有效载荷的药物连接体，本发明的缀合物可以大大减少不期望的非特异性毒性。当与常规药物缀合物相比时，这有利地提供了在肿瘤位点的相对高水平的活性细胞毒素，同时最小化非靶向细胞和组织的暴露，从而提供增强的治疗指数。
将可以理解的是，虽然本发明的优选实施方案包括治疗性结构部分(例如，细胞毒素)的有效载荷，其他有效载荷诸如诊断剂和生物相容的改性剂可以从由所公开的缀合物提供的靶向释放中获益。因此，涉及示例性的治疗有效载荷的任何公开内容也适用于包括如本文所讨论的诊断剂或生物相容性改性剂的有效载荷，除非上下文另有规定。在这方面，术语“改造缀合物”或“位点特异性缀合物”或简单的“缀合物”将被广义地使用，并保持表示任何位点特异性构建体，其包含经由一个或多个游离半胱氨酸与所公开的靶向部分相缔合的生物活性或可检测的分子或药物。如本文中所使用的术语“药物”或“有效载荷”可以互换使用，除非上下文另有规定，并且将意味着生物活性或可检测分子或药物。在这方面，可以理解的是，这样的缀合物除了具体公开的改造缀合物还可以包括肽，多肽，蛋白，在体内代谢为活性剂的前药，聚合物，核酸分子，小分子，结合剂，模拟剂，合成药物，无机分子，有机分子和放射性同位素。此外，如以上所述所选择的有效载荷可以是与调节剂共价或非共价缔合，或连接，并且显示多种化学计量摩尔比，这取决于，至少部分地取决于用于实现缀合的方法。基本上，可采用本文所公开的新技术，将可使用本领域公认的技术连接到常规抗体半胱氨酸残基的任何有效负载与本发明改造构建体的未配对的半胱氨酸相缔合。
更具体地，一旦本发明的公开的位点特异性抗体已经根据本文的教导生成和/或制造和选定，则它们可与一种或多种药物活性或诊断结构部分或生物相容性改性剂相连接，融合，缀合，或以其他方式缔合，如下所述。在这方面，应当理解的是，除非上下文另有规定，本发明的位点特异性缀合物可通过下式表示：
Ab-[L-D]n或其药学上可接受的盐，其中
a)Ab包含抗体，所述抗体包含一个或多个未配对的半胱氨酸；
b)L包含任选的连接体；
c)D包含药物；且
d)n为约1至约8的整数。
本领域技术人员将理解，可以使用许多不同的连接体和药物来制造根据上式的位点特异性缀合物，以及制造或缀合方法将取决于组分的选择而变化。因此，与在位点特异性抗体的一个或多个反应性半胱氨酸上的巯基反应的任何药物或药物-连接体化合物与本文的教导相容。同样地，允许所选的药物与改造抗体的位点特异性缀合的任何反应条件都在本发明的范围之内。尽管如此，本发明的特别优选的实施方案包括使用与温和的还原剂组合的稳定剂选择缀合药物或药物-连接体，如本文所述并在下面的实施例中阐述。这样的反应条件趋于提具有较少的非特异性缀合和污染物和相应较少毒性的更均匀的制剂。
与本文相容的示例性有效载荷如下列出：
1.治疗剂
正如所指出的，本发明的位点特异性抗体可以缀合至，连接至或融合至药学活性结构部分(其是治疗结构部分)，或以其他方式与药学活性结构部分(其是治疗结构部分)或药物相缔合，药物如抗癌剂，包括但不限于细胞毒性剂，细胞生长抑制剂，抗血管生成剂，减积剂，化疗剂，放射治疗剂，靶向抗癌剂，生物应答调节剂，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，抗肿瘤转移剂和免疫治疗剂。
优选的示例性抗癌剂(包括其同系物和衍生物)包括1-去氢睾酮，氨茴霉素，放线菌素D，博莱霉素，秋水仙碱，环磷酰胺，细胞松弛素B，放线菌素D(以前称为放线菌素)，二羟基炭疽菌素，二酮，吐根碱，表柔比星，溴化乙锭，依托泊苷，糖皮质激素，短杆菌肽D，利多卡因，美登素(美登木素生物碱)(maytansinoid)例如DM-1和DM-4(免疫原)，光神霉素，丝裂霉素，米托蒽醌，紫杉醇，普鲁卡因，***，嘌呤霉素，替尼泊苷，丁卡因，和上述物质的任何一种的药学上可接受的盐或溶剂化物，酸或衍生物。
额外的相容性细胞毒素包括多拉司他汀类和阿里他汀(auristatin)类，包括单甲基阿里他汀E(MMAE)和单甲基阿里他汀F(MMAF)(西雅图遗传学(Seattle Genetics))，鹅膏蕈碱例如α-鹅膏蕈碱，β-鹅膏蕈碱，γ-鹅膏蕈碱或ε-鹅膏蕈碱(海德堡制药(HeidelbergPharma))，DNA小沟结合剂，如多卡米星衍生物(Syntarga)，烷化剂，氮芥，乙硫磷胺(thioepa)，苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲霉素，丝裂霉素C和顺式-二氨二氯铂(II)(DDP)顺铂，剪接抑制剂如meayamycin类似物或衍生物(例如，如U.S.P.N.7825267中所述的FR901464)，管(微管)结合剂(tubular binding agent)如埃博霉素(爱波喜龙)类似物和紫杉醇和DNA损伤剂如刺孢霉素和埃斯波霉素，抗代谢物，如甲氨蝶呤，6-巯嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，和5-氟尿嘧啶达卡巴，抗有丝***剂，例如长春碱和长春新碱和蒽环类如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星，及上述物质中任何一种的药学上可接受的盐或溶剂化物，酸或衍生物。
此外，在一个实施方案中，本发明的抗体可与抗CD3结合分子相缔合以招募细胞毒性T细胞，并让它们靶向致瘤性细胞(BiTE技术；参见，例如，福尔曼(Fuhrmann)等人(2010年)5625号AACR年会摘要公报)。
在进一步的实施方案中，本发明的ADC可以包括使用适当的连接体缀合的治疗放射性同位素。可与这样的实施方案相容的示例性放射性同位素包括，但不限于，碘(131I，125I，123I，121I，)，碳(14C)，铜(62Cu，64Cu，67Cu)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115In，113In，112In，111In，)，铋(212Bi，213Bi)，锝(99Tc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn，117Sn，225Ac，76Br和211At。其它放射性核素也可用作诊断和治疗剂，尤其是那些能量范围为60至4000千电子伏(keV)的放射性核素。
本发明的抗体也可缀合至生物应答调节剂。例如，在特别优选的实施方案中，药物结构部分可以是具有所需生物活性的多肽。这样的蛋白质可包括，例如，毒素例如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，豹蛙酶(Onconase)(或其它的细胞毒性核糖核酸酶)，假单胞菌外毒素，霍乱毒素，白喉毒素；细胞凋亡剂，如肿瘤坏死因子例如TNF-α或TNF-β，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，组织纤维蛋白溶酶原活化剂，AIM I(WO 97/33899)，AIM II(WO 97/34911)，Fas配体(Takahashi等，1994，PMID：7826947)，和VEGI(WO99/23105)，血栓形成剂，抗血管生成剂，例如血管抑素或内皮抑素，淋巴因子，例如白介素-1(IL-1)，白介素-2(IL-2)，白介素-6(IL-6)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或生长因子例如，生长激素(GH)。
2.诊断或检测试剂
在其它优选的实施方案中，本发明位点特异性的抗体，或者其片段或衍生物，缀合至诊断试剂或可检测试剂，标记物或报道分子，试剂，其可以是，例如，生物分子(例如，肽或核苷酸)，小分子，荧光团或放射性同位素。标记的抗体可以用于监测过度增殖性病症的发展或进展或作为临床测试方法的一部分，以确定包括所公开的抗体(即，治疗诊断剂(theragnostics))的特定治疗的效力或确定治疗的未来进程。这样的标记物或报道分子也可以用于纯化选择的抗体，用于抗体分析(例如，表位结合或抗体分仓(binning))，分离或隔离致瘤性细胞或在临床前程序或毒理学研究中。
这样的诊断分析和/或检测可以通过将调节剂与可检测的物质相偶联来实现，可检测的物质包括，但不限于，例如包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶的各种酶；辅基，例如但不限于链菌素生物素(streptavidinlbiotin)和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如但不限于鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于，荧光素酶，萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(131I，125I，123I，121I，)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115In，113In，112In，111In，)，和锝(99Tc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn和117Tin；使用各种正电子发射体层摄影术的正电子发射金属，去放射性(noradioactive)顺磁金属离子，和放射性标记的或缀合至特定放射性同位素的分子。在这样的实施方案中，合适的检测方法是本领域中众所周知的，并且可容易地从许多商业来源获得。
如上所述，在其他实施方案中，位点特异性抗体或其片段可融合或缀合至标记序列或化合物，如肽或荧光团，以促进纯化或诊断或分析程序，例如免疫组织化学，生物层干涉测量，表面等离子体共振，流式细胞术，竞争性ELISA，FACs等。在优选的实施方案中，标记物包括组氨酸标签(his-tag)诸如由pQE载体(Qiagen)提供的，尤其是，其中许多可商购。用于纯化的其它肽标签包括，但不限于，血细胞凝集素“HA”标签，其对应于衍生自流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson等，1984，细胞(Cell)37：767)和“标记”标签(美国专利号4703004)。
3.生物相容性改性剂
在选定的实施方案中，本发明的改造抗体可以与生物相容性改性剂缀合，所述生物相容性改性剂可用于根据需要调整，改变，提高或减轻抗体特征。例如，可以通过连接相对高的分子量的聚合物分子，如可商购的聚乙二醇(PEG)或类似的生物相容的聚合物，产生具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。本领域技术人员将理解，PEG可以许多不同的分子量和分子构型来获得，分子量和分子构型可以被选择以赋予抗体特定性质(例如，半衰期可以被调节)。在具有或不具有多功能连接体的情况下，通过将PEG位点特异性缀合至所述抗体或抗体片段的N-或C-末端，或通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基，可以将PEG附着到抗体或抗体片段或衍生物。也可以使用线性或分支聚合物衍生化，其导致生物活性的最小损失。可以通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合程度，以确保PEG分子与抗体分子的最佳缀合。通过例如尺寸排阻或离子交换层析法(色谱法)，可以从抗体-PEG缀合物分离未反应的PEG。以类似的方式，所公开的抗体可缀合至白蛋白，以使所述抗体或抗体片段在体内更稳定或体内具有更长的半衰期。该技术在本领域中是公知的，参见例如，WO 93/15199，WO 93/15200，和WO 01/77137；和EP 0 413 622。其他生物相容的缀合物对于普通技术人员而言是明显的，并且可以容易地根据本文的教导来鉴定。
4.连接体化合物
与前述有效载荷类似，众多连接体化合物是与本发明相容的，并且可成功地与本文的教导组合使用，以提供所公开的抗-DLL3位点特异性缀合物。在广义上，连接体仅需要共价结合由游离半胱氨酸提供的反应性巯基和所选择的药物化合物。然而，在其他实施方案中，相容连接体可以在包括任何取代基的任何可及的位点共价结合选定药物。因此，与本文教导相容的是，与该改造抗体的一个或多个游离半胱氨酸反应，并且可以被用来提供本发明的相对稳定的位点特异性缀合物的任何连接体。
关于与选择性还原的游离半胱氨酸的有效结合，许多本领域公认的化合物利用硫醇的良好亲核性，因此可用于用作相容连接体的一部分。游离半胱氨酸缀合反应包括但不限于，硫醇-马来酰亚胺，硫醇-卤代(酰卤)，硫醇-烯，硫醇-炔，硫醇-乙烯基砜，硫醇-二砜，硫醇-硫代磺酸盐(或酯)，硫醇-吡啶基二硫化物和硫醇-对氟(parafluoro)反应。如本文进一步讨论并在以下实施例中所示，硫醇-马来酰亚胺生物缀合是最广泛使用的方法之一，其原因在于硫醇-马来酰亚胺生物缀合的快速反应速率和温和的缀合条件。这种方法的一个问题是，逆向迈克尔反应(retro-Michael reaction)的可能性，和马来酰亚胺基连接的有效载荷从抗体或其他目标蛋白损失或转移至血浆中的其他蛋白质，诸如例如，人血清白蛋白。然而，，如本文阐述的选择性还原和位点特异性抗体的使用可用于稳定缀合物并降低这种不希望的转移。硫醇-酰卤反应提供不能经受逆向迈克尔反应，因此更稳定的生物缀合物。然而，与基于马来酰亚胺的缀合相比，硫醇-卤化物反应一般具有较慢的反应速率，因而效率不高。硫醇-吡啶基二硫化物反应是另一种流行的生物缀合路线。吡啶基二硫化物经历与游离硫醇的快速交换，产生混合二硫化物和释放吡啶-2-硫酮。混合二硫化物可在还原性细胞环境中裂解，释放所述有效载荷。在生物缀合中获得更多关注的其他方法是硫醇-乙烯基砜和硫醇-二砜反应，其各自都与本文教导相容且明确地包括在本发明的范围之内。
关于相容连接体，并入所公开的ADC的化合物优选在细胞外是稳定的，防止ADC分子的聚集，并保持在ADC易溶于在含水介质中游离可溶，并处于单体状态。在运输转运或递送到细胞中之前，抗体-药物缀合物优选是的稳定的和保持不变完整，即，抗体保持连接到药物结构部分。尽管连接体在目标细胞以外是稳定的，但是它们被设计为在细胞内以某些一定有效的速率被裂解或降解。因此，有效的连接体将：(i)保持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物结构部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即不裂解或降解，直至缀合物已被递送或转运转移至其目标位点；和(iv)维持药物结构部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞抑制效果。如在所附实施例中更详细地讨论，ADC的稳定性可通过标准分析技术进行测定，所述标准分析技术如质谱法、疏水性相互作用色谱法(HIC)、HPLC，和分离/分析技术LC/MS。如上面所阐述，抗体和药物结构部分的共价结合需要连接体具有两个反应性官能基团，即在反应意义上是二价的。可用于连接两个或更多个官能或生物活性结构部分(如MMAE和位点特异性抗体)的二价连接体试剂是已知的，并且已描述了用于提供其所得缀合物的方法。
与本发明相容的连接体可以广义地被分类为可裂解和不可裂解的连接体。可裂解的连接体(其可以包括酸不稳定连接体、蛋白酶可裂解的连接体和二硫化物连接体)利用目标细胞的内化和内体-溶酶体途径中的裂解。细胞毒素的释放和活化依赖于内体/溶酶体酸性隔室，所述内体/溶酶体酸性隔室促进酸不稳定的化学键诸如腙或肟的断裂。如果溶酶体特异性蛋白酶裂解位点被改造为进入连接体，那么细胞毒素将在它们的细胞内目标附近释放。或者，包含混合二硫化物的连接体提供一种方法，通过前述方法，细胞毒性有效载荷在细胞内释放(因为它们在细胞的还原环境中是选择性裂解的)，但不能在血流中的富氧环境中释放。通过比较的方式，含有酰胺连接的聚乙二醇或烷基间隔基的相容性非可裂解连接体在目标细胞内抗体-药物缀合物的溶酶体降解期间释放毒性的有效载荷。在一些方面，连接体的选择将取决于位点特异性的缀合物中使用的特定药物。
因此，本发明的某些实施方案包含通过细胞内环境(例如，在溶酶体或内体或胞膜窖)中存在的裂解剂可裂解的连接体。所述连接体可以是，例如，由细胞内肽酶或蛋白酶(包括，但不限于，溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽基连接体。在一些实施方案中，所述肽基连接体是至少两个氨基酸长，或至少三个氨基酸长。裂解剂可包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知其各自水解二肽药物衍生物，导致活性药物在目标细胞内的释放。可通过硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B裂解的示例性肽基连接体是包含Phe-Leu的肽，因为已经发现组织蛋白酶-B在癌组织中高度表达。此类连接体的其他实例描述于，例如，U.S.P.N.6,214,345中，其针对此类连接体通过引用并入本文。在一个特定优选的实施方案中，可由细胞内蛋白酶裂解的肽基连接体是Val-Cit连接体、Val-Ala连接体或Phe-Lys连接体，如U.S.P.N.6,214,345中所述。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是，所述药剂当缀合时通常减弱，且所述缀合物的血清稳定性通常高。
在其他实施方案中，可裂解的连接体是pH敏感的，即，在特定pH值对水解是敏感的。通常，pH敏感的连接体在酸性条件下是可水解的。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定连接体(例如，腙，肟，缩氨基脲，缩氨基硫脲，顺式乌头酰胺，原酸酯，缩醛，缩酮，等)(例如，见U.S.P.N.5,122,368；5,824,805；5,622,929)。此类连接体在中性pH条件(诸如在血液中的条件)下是相对稳定的，但在低于pH 5.5或5.0，溶酶体的近似pH是不稳定的。
在还有其他实施方案中，连接体在还原条件下是可裂解的(例如，二硫化物连接体)。多种二硫化物连接体在本领域中是已知的，包括，例如，可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)，SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)，SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)来形成的二硫化物连接体。在还有其他具体实施方案中，连接体是丙二酸酯连接体(Johnson等人，1995，Anticancer Res.15：1387-93)，马来酰亚胺基苯甲酰基连接体(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)，或3'-N-酰胺类似物(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在特别优选的实施方案中(如在U.S.P.N.2011/0256157中所述，关于连接体，其并入本文)，相容的肽基连接体将包含：
其中星号表示与细胞毒性药物的连接点，CBA是位点特异性抗体，L1是连接体，A是将L1连接到位点特异性抗体上未配对的半胱氨酸的连接基团，L2是共价键或与-OC(＝O)-一起形成自脱落(self-immolative)连接体，并且L1或L2是可裂解的连接体。
L1优选为可裂解的连接体，并且可以被称为用于针对裂解活化连接体的触发器。
L1和L2(当存在时)的性质可以广泛地变化。这些基团基于它们的裂解特性进行选择，这可以通过在被递送缀合物的位点的条件来决定。通过酶的作用裂解的那些连接体是优选的，虽然也可以使用通过pH(例如，酸或碱不稳定的)、温度或照射时(例如光不稳定的)的变化可裂解的连接体。在还原或氧化条件下可裂解的连接体也可以用于本发明。
L1可以包含氨基酸的连续序列。氨基酸序列可以是用于酶促裂解的目标底物，从而允许释放药物。
在一个实施方案中，L1是通过酶的作用可裂解的。在一个实施方案中，酶是酯酶或肽酶。
在一个实施方案中，L1包含二肽。二肽可以被表示为-NH-X1-X2-CO-，其中-NH-和-CO-分别表示氨基酸基团X1和X2的N-和C-末端。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。当连接体是组织蛋白酶不稳定的连接体时，二肽可以是组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。
另外，对于具有羧基或氨基侧链官能团的那些氨基酸基团，分别例如Glu和Lys，CO和NH可表示侧链官能团。
在一个实施方案中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，-Val-Ala-，-Val-Lys-，-Ala-Lys-，-Val-Cit-，-Phe-Cit-，-Leu-Cit-，-Ile-Cit-，-Phe-Arg-和-Trp-Cit-，其中Cit为瓜氨酸。
优选的是，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，-Val-Ala-，-Val-Lys-，-Ala-Lys-和-Val-Cit-。
最优选的是，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
在一个实施方案中，L2存在并与-C(＝O)O-一起形成自脱落连接体。在一个实施方案中，L2是酶促活性的底物，从而允许释放药物。
在一个实施方案中，当L1是通过酶的作用可裂解并且L2存在时，酶裂解L1和L2之间的键。
L1和L2，当存在时，可以通过选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-，-C(＝O)O-，-NHC(＝O)-，-OC(＝O)-，-O-C(＝O)O-，-NHC(＝O)O-，-OC(＝O)NH-和-NHC(＝O)NH-。
连接到L2的L1的氨基可以是氨基酸的N-末端，或者可以从氨基酸侧链，例如赖氨酸氨基酸侧链的氨基衍生。
连接到L2的L1的羧基可以是氨基酸的C-末端，或者可以从氨基酸侧链，例如谷氨酸氨基酸侧链的羧基衍生。
连接到L2的L1的羟基可以由氨基酸侧链，例如丝氨酸氨基酸侧链的羟基衍生。
术语“氨基酸侧链”包括在以下中发现的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，诸如丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，和缬氨酸；(ii)次要氨基酸诸如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸，β-氨基酸，天然存在的氨基酸的合成的类似物和衍生物；和(iv)前述物质的所有对映体，非对映体，异构体富集的，同位素标记的(例如2H，3H，14C，15N)，受保护的形式，以及外消旋混合物。
在一个实施方案中，-C(＝O)O-和L2一起形成以下基团：
其中星号表示与药物或细胞毒剂位置的连接点，波浪线表示与连接体L1的连接点，Y为-N(H)-，-O-，-C(＝O)N(H)-或-C(＝O)O-，并且n为0至3。亚苯基环任选被一个，两个或三个如本文中所描述的取代基取代。在一个实施方案中，亚苯基任选被卤代，NO2，R或OR取代。
在一个实施方案中，Y是NH。
在一个实施方案中，n是0或1。优选的是，n为0。
当Y是NH且n是0时，自脱落连接体可被称为对氨基苄基羰基连接体(PABC)。
在另一特别优选的实施方案中，连接体可以包括自脱落连接体，且二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其如下所示：
其中星号表示与所选择的细胞毒性结构部分的连接点，且波浪线表示与可被缀合至抗体的连接体(例如，间隔基-抗体结合片段)的剩余部分的连接点。在二肽的酶促裂解后，当远程位点被活化时，自脱落连接体将允许受保护的化合物(即，细胞毒素)的彻底释放，这沿着下面所示的路线进行：
其中L*是连接体的剩余部分的活化形式，所述连接体包含现在已经裂解的肽基单元。药物的彻底释放确保它们将保持期望的毒性活性。
在一个实施方案中，A为共价键。因此，L1与细胞结合剂直接相连。例如，当L1包含连续氨基酸序列时，该序列的N-末端可以直接连接到游离半胱氨酸。
在另一个实施方案中，A是间隔基团。因此，L1与细胞结合剂间接地连接。
L1和A可以通过选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-，-C(＝O)O-，-NHC(＝O)-，-OC(＝O)-，-OC(＝O)O-，-NHC(＝O)O-，-OC(＝O)NH-和-NHC(＝O)NH-。
如将在下面更详细地讨论和在下面实施例10-13中所阐述，本发明的药物连接体将连接到游离半胱氨酸上的反应性硫醇亲核体。为此，通过用诸如DTT或TCEP的各种还原剂或如本文所述温和的还原剂的处理，可以使位点特异性抗体游离半胱氨酸具有与连接体试剂缀合的反应性。
优选的是，连接体含有亲电官能团，其用于与在调节剂上的亲核官能团反应。抗体上的亲核基团包括，但不限于：(i)N末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，和(iv)当抗体被糖基化时的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基基团是亲核的，并且能够反应以便与包括以下的连接体结构部分和连接体试剂上的亲电基团形成共价键：(i)马来酰亚胺基团，(ii)活化的二硫化物，(iii)活性酯，诸如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯，HOBt(N-羟基苯并***)酯，卤代甲酸酯，和酰卤；(iv)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；及(v)醛类，酮类，羧基，且，其中的一些示例如下：
在特别优选的实施方案中，位点特异性抗体和药物-连接体结构部分之间的连接是通过改造抗体的游离半胱氨酸的硫醇残基和存在于连接体上的末端马来酰亚胺基团。在这样的实施方案中，细胞结合剂和药物-连接体之间的连接是：
其中星号表示与药物-连接体的剩余部分的连接点，并且波浪线表示与改造抗体的剩余部分的连接点。在本实施方案中，S原子优选衍生自游离半胱氨酸抗体。关于上述其他相容连接体，结合部分包含可与活化的硫醇反应以提供期望的位点特异性缀合的末端碘乙酰胺。此连接体的优选的缀合方法与马来酰亚胺结合基团的优选的缀合方法稍有不同，所述马来酰亚胺结合基团的优选的缀合方法包括在其他实施方案中发现和在下面的实施例中阐述的选择性还原。在任何情况下，鉴于本公开内容，本领域技术人员可容易地将所公开的药物-连接体化合物各自与相容抗-DLL3位点特异性抗体相缀合。
5.缀合
如上所讨论，由本发明提供的缀合物制剂显示出增强的稳定性和实质均质性，这至少部分由于，提供本文所阐述的改造的一个或多个游离半胱氨酸位点和/或新型缀合方法。不同于完全或部分地还原每个链内或链间抗体二硫键以提供缀合位点的常规的缀合方法，本发明有利地提供了某些制备的游离半胱氨酸位点的选择性还原和将药物-连接体导向至某些制备的游离半胱氨酸位点。由改造的位点和伴随的选择性还原促进的缀合特异性允许在所希望的位置的位点定向缀合的高百分比。显著的是，这些缀合位点中的一些，诸如存在于轻链恒定区的末端区域中的缀合位点，通常难以有效地缀合，因为它们与其他游离半胱氨酸发生交叉反应。然而，通过分子改造和选择性还原所得游离半胱氨酸，可以得到有效缀合率，这大大减少了不希望的高DAR污染物和非特异性毒性。更一般地，改造构建体和包括选择性还原的公开的新型缀合方法显然提供具有改善的药代动力学和/或药效学和潜在地改善的治疗指数的ADC制剂。
在这方面，位点特异性构建体呈现一个或多个游离半胱氨酸，其当还原时包含硫醇基团，其是亲核的并且能够反应以与连接体结构部分上的亲电基团(诸如上面刚刚公开的那些)形成共价键。本发明的优选的抗体将具有可还原的非配对链间或链内半胱氨酸，即提供这种亲核基团的半胱氨酸。因此，在某些实施方案中，还原的未配对的半胱氨酸的游离巯基与所公开的药物-连接体的末端马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基的反应将提供期望的缀合。在这样的情况下，并且如以下实施例10和11中所述，可以通过用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或(三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理，使得抗体的游离半胱氨酸对与连接体试剂的缀合具有反应性。因此每个游离半胱氨酸将理论上呈现反应性硫醇亲核体。虽然这样的试剂是相容的，但将可以理解的是，可以使用本领域技术人员已知的各种反应、条件和试剂，实现位点特异性抗体的缀合。
相反地，本发明的发明人已经发现，可以选择性还原所述改造抗体的游离半胱氨酸可被以提供增强的位点定向缀合并减少不希望的、潜在毒性的污染物。更具体地，已经发现“稳定剂”诸如精氨酸的“稳定剂”已经被发现在蛋白质中调节蛋白质中的分子内和分子间的相互作用，并且可以用于与选择的还原剂(优选相对温和的)结合使用的缀合，以选择性还原游离半胱氨酸并便于如本文所述的位点特异性缀合。如本文所使用的术语“选择性还原(selective reduction)”或“有选择性地还原(selectively reducing)”可以互换使用，并应意指游离的一个或多个游离半胱氨酸的还原，而同时基本上不断裂存在于改造抗体中的天然二硫键。在选定的实施方案中，这可以通过某些一定的还原剂来实现进行。在其他优选的实施方案中，改造构建体的选择性还原将包括，使用与还原剂(包括温和还原剂)组合的稳定剂。应当理解的是，术语“选择性缀合”应意指是指，如本文所述的已经被选择性还原的改造抗体与细胞毒素的缀合。在这方面，且如实施例12-13中所表明，组合使用这样的稳定剂与还原剂可显著提高位点特异性缀合的效率，如通过在重和轻抗体链上的缀合的程度和制剂的DAR分布所确定。
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但这样的稳定剂可发挥作用以调节静电微环境和/或在期望的缀合位点调节构象变化，由此允许相对温和的还原剂(其不实质上还原完整的天然二硫键)以促进在期望的游离半胱氨酸位点的缀合。已知这样的试剂(例如，某些氨基酸)形成盐桥(通过氢键键合和静电相互作用)，并且可以使得赋予稳定效应的方式调节蛋白质-蛋白质相互作用，所述稳定效应可导致有利的构象变化和/或可减少不利的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，这样的试剂可以发挥作用以在还原后抑制不希望的分子内(和分子间)半胱氨酸-半胱氨酸键的形成，因此促进期望的缀合反应，其中所述改造的位点特异性半胱氨酸(优选通过连接体)结合至药物。由于反应条件不提供完整的天然二硫键的显著还原，缀合反应被自然地驱动到游离半胱氨酸上相对少的反应性硫醇(例如，优选2个游离硫醇)。如所提到，这大大降低如本文所述制成的缀合制剂中的非特异性缀合和相应杂质的水平。
在选择的实施方案中，与本发明相容的稳定剂将通常包含至少一个胺结构部分具有碱性pKa的化合物。在某些实施方案中，胺结构部分将包含伯胺，而在其他优选实施方案中，胺结构部分将包含仲胺。在还有其他优选实施方案中，胺结构部分将包含叔胺。在其他选择的实施方案中，胺结构部分将包含氨基酸，而在其他相容的实施方案中，胺结构部分将包含氨基酸侧链。在还有其他实施方案中，胺结构部分将包含蛋白原氨基酸。在仍然其他实施方案中，胺结构部分包含非蛋白原氨基酸。在特别优选的实施方案中，相容的稳定剂可以包含精氨酸，赖氨酸，脯氨酸和半胱氨酸。此外，相容的稳定剂可以包括胍和具有碱性pKa的含氮杂环。
在某些实施方案中，相容的稳定剂包括具有至少一个胺结构部分的化合物，所述胺结构部分具有大于约7.5的pKa，在其他实施方案中，主题胺结构部分将具有大于约8.0的pKa，在还有其他实施方案中，胺结构部分将具有大于约8.5的pKa，且和在还有其他实施方案中，稳定剂将包含括具有大高于约9.0的pKa的胺结构部分。其他优选实施方案将包含括稳定剂，其中胺结构部分将具有大于约9.5的pKa，而某些其他实施方案将包含括稳定剂，其显示出具有大于约10.0的pKa的至少一个胺结构部分。在还有其他优选实施方案中，稳定剂将包含括具有pKa大于约10.5的胺结构部分的化合物，在其他实施方案中，稳定剂将包含括具有pKa大于约11.0的胺结构部分的化合物，而在还有其他实施方案中，稳定剂将包含括pKa大于约11.5的胺结构部分。在还有其他实施方案中，稳定剂将包含括具有pKa大于约12.0的胺结构部分的化合物，而在其他实施方案中，稳定剂将包含括pKa大于约12.5的胺结构部分。本领域的技术人员将理解，可以使用标准技术容易地计算或测定相关的pKa并且将其用来确定使用所选择的化合物作为稳定剂的适用性。
所公开的稳定剂显示在与某些还原剂组合时特别有效地将缀合靶向至游离位点特异性半胱氨酸。对于本发明的目的而言，相容的还原剂可包括，产生用于缀合的还原的游离位点特异性半胱氨酸而不显著破坏改造抗体天然二硫键的任何化合物。在这样的条件下，由选定的稳定剂和还原剂的组合提供，活化的药物连接体主要限于结合于期望的游离位点特异性半胱氨酸位点。相对温和的还原剂或在相对低的浓度使用以提供温和条件的还原剂是特别优选的。如本文所使用的术语“温和的还原剂”或“温和的还原条件”应被保持为意指任何试剂或由还原剂产生的状态(任选地在稳定剂的存在下)，所述试剂或状态提供，在一个或多个游离半胱氨酸位点的硫醇，而基本上不破坏存在于改造抗体中的天然二硫键。即，温和的还原剂或条件能够有效地还原一个或多个游离半胱氨酸(提供硫醇)，而不显著破坏蛋白质的天然二硫键。期望的还原条件可以通过许多基于巯基的化合物来提供，所述基于巯基的化合物建立用于选择性缀合的合适的环境。在优选的实施方案中，温和的还原剂可以包含具有一个或多个游离硫醇的化合物，而在特别优选的实施方案中，温和的还原剂将包含具有单一游离硫醇的化合物。与本发明相容的还原剂的非限制性实例包括谷胱甘肽，n-乙酰基半胱氨酸，半胱氨酸，2-氨基乙烷-1-硫醇和2-羟基乙烷-1-硫醇。
应该理解的是，以上所述选择性还原方法在靶向缀合至游离半胱氨酸中是特别有效的。在这方面，可通过各种本领域公认的技术来确定缀合至位点特异性抗体中的期望的目标位点的程度(本文定义为“缀合效率”)。可以通过评估目标缀合位点(在本发明中，轻链的c-末端上的游离半胱氨酸)上的缀合相对于所有其他缀合位点上的缀合的百分比，确定药物与抗体的位点特异性缀合的效率。在某些实施方案中，本文方法提供了有效地将药物缀合至包含游离半胱氨酸的抗体。在一些实施方案中，缀合效率为至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或更多，如由目标缀合相对于所有其他缀合位点的百分比来测量。
还应该理解的是，能够缀合的改造抗体可以含有游离半胱氨酸残基，所述游离半胱氨酸残基包含巯基，所述巯基在抗体产生或存储时被封闭或加帽。这样的帽包括与巯基相互作用并防止或抑制缀合形成的蛋白质，肽，离子和其他物质。在一些情况下，未缀合的改造抗体可以包含游离半胱氨酸，所述游离半胱氨酸结合在相同或不同的抗体上的其他游离半胱氨酸。如实施例中所讨论，这样的交叉反应性可在制造过程期间导致各种污染物。在一些实施方案中，改造抗体可在缀合反应之前要求脱帽。在具体的实施方案中，本文的抗体是脱帽的，并显示能够缀合的游离巯基。在具体的实施方案中，本文抗体进行脱帽反应，所述脱帽反应不扰乱或重新排列天然存在的二硫键。应当理解，在大多数情况下，在正常的还原反应(还原或选择性还原)过程中发生脱帽反应。
6.DAR分布和纯化
本发明的优点之一是产生包含狭窄定制的DAR分布的相对均匀的缀合物制剂的能力。在这方面，在药物和改造抗体之间的化学计量比方面，所公开的构建体和/或选择性缀合提供样品内的ADC物质种类的均质性。如上面简要讨论的术语“药物抗体比”或“DAR”是指，药物与位点特异性抗体的摩尔比。在一些实施方案中，缀合物制剂在它的DAR分布方面可以是基本上均质的，这意味着在所述制剂中存在具有特定DAR(例如，2或4的DAR)的位点特异性ADC的主要物质种类，其在载荷位点方面(即在游离半胱氨酸上)也是均匀的。在本发明的某些实施方案中，可以通过使用位点特异性抗体或选择性组合，实现期望的均质性。在其他优选的实施方案中，可通过组合使用位点特异性构建体与选择性还原而实现期望的均质性。在还有其他特别优选的实施方案中，可以使用分析或制备色谱技术进一步纯化制剂。在每个这些实施方案中，可以使用本领域已知的各种技术分析ADC样品的均质性进行，所述技术包括但不限于SDS-PAGE，HPLC(例如，大小排阻HPLC，RP-HPLC，HIC-HPLC等)或毛细管电泳。
关于ADC制剂的纯化，可以理解的是，可以采用标准的药物的制备方法，以获得期望的纯度。如在以下实施例中所表现，液相色谱法诸如反相(RP)和疏水性相互作用色谱法(HIC)可以通过药物载荷值分离混合物中的化合物。在一些情况下，混合模式色谱(MMC)也可以用于分离具有特定的药物载荷的物质种类。更一般地，一旦除去不溶性污染物，可以使用标准技术(诸如，例如，羟磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析和亲和色谱法，特别感兴趣的亲和色谱法)进一步纯化调节剂制剂。在这方面，蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体，而蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和用于人IgG3。用于蛋白质纯化的其他技术诸如离子交换柱上的分级，乙醇沉淀，硅胶上的色谱，肝素上的色谱，阴离子或阳离子交换树脂上的琼脂糖凝胶色谱(诸如聚天冬氨酸柱)，色谱聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，这取决于待回收的抗体或缀合物。
在这方面，所公开的位点特异性缀合物及其制剂可以包含各种化学计量摩尔比的药物和抗体结构部分，这取决于改造构建体的构型，并且至少部分地取决于用于实现缀合的方法。取决于多少和哪些链间和链内二硫键被破坏，理论药物载荷可以是相对高的，虽然由于聚集体和其他污染物，实际限制诸如游离半胱氨酸交叉反应性将限制包含这种DAR的均质制剂的产生。即，较高的药物载荷，例如>6，可造成某些抗体-药物缀合物的聚集，不溶性，毒性，或细胞通透性的损失。鉴于这样的顾虑，由本发明提供的实际药物载荷的范围可以是每改造缀合物1至8个药物，即，其中1，2，3，4，5，6，7或8个药物共价连接到每个位点特异性抗体(例如，对于IgG1，其他抗体可以具有不同的载荷能力，这取决于二硫键的数目)。优选地，本发明的组合物的DAR将为约2，4或6，且在特别优选的实施方案中，DAR将包含约2。
尽管本发明提供相对高水平的均质性，但所公开的组合物实际上包含具有一定范围的药物化合物(1至8个(在IgG1的情况下))的改造的缀合物的混合物。因此，所公开的ADC组合物包括缀合物的混合物，其中大部分成分抗体共价连接至一个或多个药物药物结构部分，且(尽管选择性还原具有缀合物特异性)其中药物结构部分可通过各种硫醇基团连接至抗体。即，在缀合后，本发明的ADC组合物将包含具有各种浓度的不同药物载荷(例如每IgG1抗体1至8个药物)的缀合物的混合物(连同主要由游离半胱氨酸交叉反应性引起的某些反应污染物)。使用选择性还原及制造后纯化，可使缀合物组合物达到其主要含有单一主要的期望的ADC物质种类(例如药物载荷为2)及相对低水平的其他ADC物质种类(例如药物载荷为1、4、6等)的点。平均DAR值表示完整组合物(即所有ADC物质种类合起来)的药物载荷的加权平均值。由于所用定量方法的固有不确定性及在商业环境中完全移除非主要ADC物质种类的困难，可接受的DAR值或说明通常呈现为平均值、范围或分布(即平均DAR为2+/-0.5)。医药环境中优选使用包含属于该范围(即1.5至2.5)内的所测量的平均DAR的组合物。
因此，在某些优选实施方案中，本发明将包含平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8(各自+/-0.5)的组合物。在其他优选实施方案中，本发明将包含2、4、6或8+/-0.5的平均DAR。最终，在所选优选实施方案中，本发明将包含2+/-0.5的平均DAR。应了解，在某些优选实施方案中，范围或偏差可小于0.4。因此，在其他实施方案中，组合物将包含1、2、3、4、5、6、7或8(各自+/-0.3)的平均DAR；2、4、6或8+/-0.3的平均DAR或甚至更优选2或4+/-0.3的平均DAR或甚至2+/-0.3的平均DAR。在其他实施方案中，IgG1缀合物组合物将优选包含平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8(各自+/-0.4)的组合物及相对低水平(即小于30％)的非主要ADC物质种类。在其他优选实施方案中，ADC组合物将包含2、4、6或8(各自+/-0.4)的平均DAR及相对低水平(<30％)的非主要ADC物质种类。在尤其优选实施方案中，ADC组合物将包含2+/-0.4的平均DAR及相对低水平(<30％)的非主要ADC物质种类。在还有其他实施方案中，当针对其他DAR物质种类测量时，主要的ADC物质种类(例如，2的DAR)将以下浓度存在：大于70％的浓度，大于75％的浓度，大于80％的浓度，大于85％的浓度，大于90％的浓度，大于93％的浓度，大于95％的浓度，或甚至大于97％的浓度。
如在下面实施例中详述，来自缀合反应的ADC制剂中每抗体中的药物分布可通过常规方法表征，诸如UV-Vis分光光度法、逆相HPLC、HIC、质谱、ELISA及电泳。亦可确定在每抗体中的药物数的方面的ADC的定量分布。通过ELISA，可确定特定ADC制剂中每抗体中药物数的平均值。然而，每抗体中的药物分布值无法由抗体-抗原结合及ELISA的探测限制辨别。同样地，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定法不确定药物结构部分在何处连接至抗体(诸如重链或轻链片段)或特定氨基酸残基。
V.医药制剂及治疗性用途
1.制剂及施用途径
视所选位点特异性缀合物的形式、所欲递送模式、所治疗或监测的疾病及多种其他变量而定，可视需要使用本领域中认可的技术配制本发明的组合物。在一些实施方案中，本发明的治疗性组合物可以纯施用或以含有最少量其他组分的形式施用，而其他组合物可任选经配制以含有合适的在本领域中公知的药学上可接受的载体，其包含赋形剂及助剂(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Factsand Comparisons:Drugfacts Plus,第20版(2003)；Ansel等人,Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems,第7版,Lippencott Williams和Wilkins(2004)；Kibbe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press(2000))。各种药学上可接受的载体(包括媒介物、佐剂及稀释剂)容易购自多种商业来源。此外，多种药学上可接受的辅助物质(诸如pH调节剂及缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂及其类似物)亦可购得。某些非限制性示例性载体包括生理食盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
更具体而言，应了解，在一些实施方案中，本发明的治疗组合物可以纯形式施用或以含有最少量其他组分的形式施用。相反，本发明的位点特异性ADC可任选经配制以含有合适的药学上可接受的载体(包含赋形剂及助剂)，所述载体为本领域中公知且为相对惰性物质，其有助于缀合物的施用或帮助将活性化合物加工成经医药学上最佳化以递送至作用位点的制剂。例如，赋形剂可提供形成或同一性或充当稀释剂以改良ADC的药物动力学或稳定性。合适赋形剂或添加剂包括(但不限于)稳定剂、湿润剂及乳化剂、用于改变摩尔渗透压浓度的盐、囊封剂、缓冲剂及皮肤渗透增强剂。在某些优选实施方案中，药物组合物可以冻干形式提供及在施用之前在例如缓冲盐水中重构。所述重构组合物优选静脉内施用。
所公开的用于全身施用的ADC可经配制以用于经肠、非经肠或局部施用。实际上，所有三种类型的制剂可同时使用以实现活性成分的全身施用。用于非经肠及非注射药物递送的赋形剂以及制剂阐述于Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000)中。适用于非经肠施用的制剂包括呈水可溶形式的活性化合物(例如水可溶盐)的水溶液。此外，可施用活性化合物的悬浮液，如适用于油性注射悬浮液。合适亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，例如经己基取代的聚(丙交酯)、芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三酸甘油酯。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的黏度的物质且所述物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。悬浮液亦可任选含有稳定剂。脂质体亦可用于封装用于递送至细胞中的试剂。
适用于经肠施用的制剂包括硬明胶胶囊或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮液、糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
适用于非经肠施用(例如通过注射)的制剂包括水性或非水性、等张、无热原质、无菌液体(例如溶液、悬浮液)，其中活性成分是以溶解、悬浮或以其他方式提供(例如于脂质体或其他微粒中)。所述液体可额外含有其他药学上可接受的成分，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂，及使制剂与所欲受体的血液(或其他相关体液)等张的溶质。赋形剂的实施例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油及其类似物。适用于所述制剂中的等张载体的实施例包括氯化钠注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)或乳酸盐林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection)。
用于非经肠施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含约10μg/ml至约100mg/ml的ADC浓度。在某些所选实施方案中，ADC浓度将包含20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他优选实施方案中，ADC浓度将包含2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。
通常，本发明的化合物及组合物(包含抗-DLL3位点特异性ADC)可通过各种途径体内施用于有需要的个体，包括(但不限于)经口、静脉内、动脉内、皮下、非经肠、鼻内、肌肉内、颅内、心内、心室内、气管内、经颊、经直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮及鞘内腔施用，或通过植入或吸入以其他方式施用。标的组合物可配制成呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂；包括(但不限于)片剂、胶囊、散剂、粒剂、软膏剂、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂及喷雾剂。适当制剂及施用途径可根据所欲应用及治疗方案来选择。在尤其优选实施方案中，将静脉内递送本发明的化合物。
2.剂量
类似地，特定给药方案(即剂量、时序及重复)将视特定个体及个体的病史以及经验上的考虑因素(诸如药物动力学(例如半衰期、清除率等))而定。施用频率可根据疗程确定及调节，且是基于降低增殖性或致瘤细胞的数目、保持所述赘生性细胞减少、降低赘生性细胞的增殖或延缓转移发生。在其他实施方案中，可调节或降低所施用的剂量以管理潜在副作用及/或毒性。或者，标的治疗性组合物的持续连续释放制剂可适用。
本领域技术人员将了解，缀合物化合物及包含缀合物化合物的组合物的合适剂量可视患者而不同。确定最佳剂量将通常涉及治疗利益程度与任何风险或有害副作用之间的平衡。所选剂量水平将视多种因素而定，所述因素包括(但不限于)特定化合物的活性、施用途径、施用时间、化合物的***速率、治疗持续时间、其他组合使用的药物、化合物及/或材料、病况的严重性以及患者的物种、性别、年龄、体重、条件、一般健康状况及先前病史。化合物量及施用途径将最终由医师、兽医或临床医师决定，但通常将选择剂量以实现在作用位点处实现期望的作用而不引起显著不良或有害副作用的局部浓度。
通常，本发明的位点特异性ADC可以各种范围施用。这些范围包括每剂量每千克体重约5微克至每剂量每千克体重约100毫克；每剂量每千克体重约50微克至每剂量每千克体重约5毫克；每剂量每千克体重约100微克至每剂量每千克体重约10毫克。其他范围包括每剂量每千克体重约100微克至每剂量每千克体重约20毫克及每剂量每千克体重约0.5毫克至每剂量每千克体重约20毫克。在某些实施方案中，剂量为每千克体重至少约100微克、每千克体重至少约250微克、每千克体重至少约750微克、每千克体重至少约3毫克、每千克体重至少约5毫克、每千克体重至少约10毫克。
在所选实施方案中，位点特异性ADC将以每剂量每千克体重约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100微克施用(优选静脉内)。其他实施方案将包括将ADC以每剂量每千克体重约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000微克施用。在其他优选实施方案中，将所公开的缀合物以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.58、9或10mg/kg施用。在其他实施方案中，可以每剂量每千克体重12、14、16、18或20毫克施用缀合物。在其他实施方案中，可以每剂量每千克体重25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100毫克施用缀合物。通过本文中的教导，本领域技术人员可基于临床前动物研究、临床观测以及标准医药及生物化学技术及测量容易地确定各种位点特异性ADC的合适剂量。在尤其优选实施方案中，所述DLL3缀合物剂量将在一段时间内静脉内施用。此外，所述剂量可在预定疗程内分多次施用。
其他给药方案可基于体表面积(Body Surface Area；BSA)计算，如U.S.P.N.7,744,877中所公开。如所公知，使用患者身高及体重计算BSA且BSA提供个体尺寸的量度，如由其身体的表面积表示。在某些实施方案中，缀合物可以1mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2的剂量及以100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量施用。亦应了解，可使用本领域中认可及经验上的技术确定合适剂量。
在任何情况下，DLL3ADC优选视需要施用有需要的个体。施用频率可由本领域技术人员(诸如主治医师)基于所治疗的病况、所治疗的个体的年龄、所治疗的病况的严重性、所治疗的个体的一般健康状况及其类似因素等考虑因素决定。通常，DLL3缀合物的有效剂量是以一或多次施用于个体。更具体而言，ADC的有效剂量是以每月一次、每月一次以上或小于每月一次被施用于个体。在某些实施方案中，DLL3ADC的有效剂量可分多次施用，包括历时至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年或若干年。在其他实施方案中，所公开的调节剂的施用可历时若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干个月(1、2、3、4、5、6、7或8))或甚至一年或若干年。
在某些优选实施方案中，涉及缀合的调节剂的疗程将包含所选药物产品在数周或数月时间内的多次给药。更具体而言，本发明的缀合的调节剂可以每天一次、每两天一次、每四天一次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次或每三个月一次施用。在此方面，应了解，可基于患者反应及临床实践改变剂量或调节时间间隔。
亦可凭经验确定已接受一或多次施用的个体中所公开的治疗性组合物的剂量及方案。例如，可向个体施用增加的剂量的如本文中所描述制备的治疗性组合物。在所选实施方案中，剂量可分别基于凭经验确定或观测的副作用或毒性而逐渐增加或降低或减少。为评估所选组合物的功效，可如先前描述追踪特定疾病、病症或病况的标记。对于癌症，这些标记包括经由触诊或目测直接测量肿瘤尺寸、通过x射线或其他成像技术间接测量肿瘤尺寸；如由直接肿瘤活组织检验及肿瘤样品的显微镜检验评估的改良；根据本文中所描述的方法鉴别的间接肿瘤标记(例如PSA(对于***癌))或致瘤抗原的测量、疼痛或麻痹降低；语言、视觉、呼吸或其他与肿瘤相关的失能得到改良；食欲增加；或生活品质提高，如由经认可的测试或存活期延长所测量。本领域技术人员将显而易见，剂量将视个体、赘生性病况的类型、赘生性病况的阶段、赘生性病况是否开始转移至个体中的其他位置以及曾经使用的治疗及并行治疗而定。
3.组合疗法
根据本发明，组合疗法可尤其有效地降低或抑制不需要的赘生性细胞增殖、降低癌症发生、降低或预防癌症复发或降低或预防癌症的扩散或转移。在所述情况下，本发明的ADC通过移除CSC(否则CSC将支援肿瘤块及使肿瘤块永存)及由此实现现有护理减积或抗癌剂标准的更有效使用而可充当敏化剂或化学敏化剂。即，在某些实施方案中，所公开的ADC可提供增强的作用(例如性质上相加或协同)，其增强另一种所施用的治疗剂的作用模式。在本发明的情形中，“组合疗法”应广泛加以解释且仅是指抗-DLL3位点特异性ADC及一种或多种抗癌剂的施用，所述抗癌剂包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向抗癌剂(包括单克隆抗体及小分子实体)、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、辐射疗法以及抗转移剂及免疫治疗剂，包括特异性及非特异性方法。
组合结果无需为当各治疗(例如ADC及抗癌剂)独立进行时所观测到的作用的累加和。尽管一般需要至少累加作用，但超过多个单一疗法中的一个的任何抗肿瘤作用增加亦为有益的。此外，本发明无需组合治疗呈现协同作用。然而，本领域技术人员应了解，在构成优选实施方案的某些所选组合的情况下，可观测到协同作用。
在实践组合疗法时，可以单一组合物形式或以两种或更多种使用相同或不同施用途经的不同组合物形式，将缀合物及抗癌剂同时施用于个体。或者，可在抗癌剂治疗之前或之后例如数分钟至数周范围内的时间间隔施用ADC。各次递送之间的时间周期使抗癌剂及缀合物能够对肿瘤发挥组合作用。在至少一个实施方案中，抗癌剂及ADC是彼此在约5分钟至约两周内施用。在其他实施方案中，施用ADC与抗癌剂之间可间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干个月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
组合疗法可施用一次、两次或至少一段时间直至病况得到治疗、减轻或治愈。在一些实施方案中，组合疗法是分多次施用，例如每天三次至每六个月一次。可根据诸如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次的时间表进行施用，或可经由微型真空泵连续施用。如上文说明，组合疗法可经由任何途径施用。组合疗法可施用在远离肿瘤位点的位点。
在一个实施方案中，位点特异性ADC是与一种或多种用于短治疗周期的抗癌剂组合而施用于有需要的个体。本发明亦涵盖不连续施用或分成若干部分施用的每日给药。缀合物及抗癌剂可在交替的天或周交替施用；或可进行一系列抗体治疗，接着进行抗癌剂疗法的一种或多种治疗。在任何情况下，如一般本领域技术人员将理解，化学治疗剂及所公开的缀合物的合适剂量将通常与临床疗法(其中化学疗法是单独或与其他化学疗法组合施用)中已使用的剂量类似。
在另一优选实施方案中，本发明的位点特异性缀合物可用于维持疗法中以降低或消除疾病初始呈现后肿瘤复发概率。优选的是，病症将得到治疗且初始肿瘤块得以消除、减少或以其他方式改善，因此患者无症状或得到缓解。此时可向个体施用医药学上有效量的所公开的缀合物一或多次，尽管使用标准诊断程序发现存在极少或不存在疾病的适应症。在一些实施方案中，ADC将在一段时间内按规则时间表施用，诸如每周一次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次。根据本文中的教导，本领域技术人员可容易地确定有利于降低疾病复发可能性的剂量及给药方案。此外，视患者反应及临床与诊断参数而定，所述治疗可持续数周、数月、数年的时段或甚至无限期地持续。
在另一优选实施方案中，本发明的ADC可预防性使用或作为佐剂疗法使用以预防或降低减积过程后肿瘤转移的可能性。如本发明中所使用，“减积过程”广泛定义且应意指消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的任何程序、技术或方法。示例性减积过程包括(但不限于)手术、辐射治疗(即束辐射)、化学疗法、免疫疗法或切除术。鉴于本发明公开内容，在本领域技术人员可容易确定的合适时间，可如临床、诊断或治疗诊断程序所提示，施用所公开的ADC以降低肿瘤转移。缀合物可以医药学上有效剂量(如使用标准技术确定)施用一或多次。优选给药方案将由可对其进行改良的合适诊断或监测技术实现。
本发明的其他实施方案包含向无症状但具有发展增殖性病症的风险的个体施用所公开的缀合物。即，本发明的缀合物可以实际上预防意义使用且施用经检验或测试且具有一种或多种所述风险因素(例如基因组适应症、家族史、体内或体外测试结果等)但未发展赘瘤形成的患者。在所述情况下，本领域技术人员将能够经由经验观测或经由经认可的临床实践确定有效给药方案。
4.抗癌剂
术语“抗癌剂”或“抗增殖性剂(抗增殖剂)”意指任何可用于治疗细胞增殖性病症(诸如癌症)的试剂，且包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、辐射疗法以及抗转移剂及免疫治疗剂。应当理解的是，在如以上所讨论的选定的实施方案，这样的抗癌剂可以包括缀合物，并且可在给药前与所公开的位点特异性抗体相缔合。更具体地说，在某些实施方案中，选定的抗癌剂将被连接到改造抗体的未配对的半胱氨酸，以提供如本文所述的改造缀合物。因此，这种改造缀合物被明确涵盖在本发明的范围之内。在其他实施方案中，将所公开的抗癌剂与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物结合给出。
如本文中所用，术语“细胞毒性剂”意指对细胞具有毒性且可降低或抑制细胞功能及/或引起细胞破坏的物质。在某些实施方案中，该物质为来源于活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实施例包括(但不限于)细菌(例如白喉毒素(Diptheria toxin)、假单胞菌(Pseudomonas)内毒素及外毒素、葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A))、真菌(例如α-帚曲菌素(α-sarcin)、局限曲菌素(restrictocin))、植物(例如相思豆毒素、蓖麻毒素、蒴莲根毒素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、商陆抗病毒蛋白质(pokeweedanti-viral protein)、沙泊宁(saporin)、白树毒素(gelonin)、地肤子皂苷(momoridin)、天花粉蛋白(trichosanthin)、大麦毒素、油桐蛋白质(Aleurites fordii protein)、石竹素蛋白质(dianthin protein)、商陆大蠊蛋白质(Phytolacca Mericana protein)(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂(Momordica charantia inhibitor)、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制剂(saponaria officinalis inhibitor)、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitegellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)及霉菌毒素(tricothecene))或动物(例如细胞毒性RNase，诸如细胞外胰脏RNase；DNase I，包括其片段及/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。
为达成本发明的目的，“化学治疗剂”包含非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖及/或存活的化合物(例如细胞毒性剂或细胞生长抑制剂)。所述化学试剂通常针对细胞生长或***所必需的细胞内过程，且因此对癌性细胞(其通常快速生长及***)尤其有效。例如，长春新碱(vincristine)使微管脱聚合，且因此抑制细胞进入有丝***。通常，化学治疗剂可包括任何抑制或经设计以抑制癌性细胞或可能变为癌性或产生致瘤后代的细胞(例如TIC)的化学试剂。所述试剂通常组合施用且通常在以组合形式时最有效，例如在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。
可与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或在未缀合状态)的实例包括(但不限于)烷化剂、烷基磺酸盐(或酯)、氮丙啶、乙烯亚胺及甲基阿美胺(methylamelamine)、多聚乙酰(acetogenin)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)、双膦酸盐(或酯)、埃斯波霉素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物、埃罗替尼(erlotinib)、威罗菲尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、索拉非尼(sorafenib)、依鲁替尼(ibrutinib)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(诸如弗林酸(frolinic acid))、醋葡醛内酯(aceglatone)、醛磷酰胺醣苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、贝斯布希(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵(elliptiniumacetate)、爱波喜龙(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓、羟基脲、香菇多醣(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他汀(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基肼、丙卡巴肼、多醣复合物(polysaccharide complex)(JHS Natural Products,Eugene,OR)、丙亚胺；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙基胺；单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；卡西托欣(gacytosine)；***糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxoids)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物、长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(或酯)(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；草酸铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A的抑制剂(其降低细胞增殖)及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中亦包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗***及选择性***受体调节剂、抑制调节肾上腺中的***产生的芳香酶的芳香酶抑制剂及抗雄激素；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸；核糖核酸酶，诸如VEGF表达抑制剂及HER2表达抑制剂；疫苗、rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞宾及埃斯波霉素(Esperamicin)，及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
尤其优选抗癌剂包含市售或临床可用化合物，诸如埃罗替尼(erlotinib)(Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(docetaxel)、(Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉西他滨(gemcitabine)(Lilly)、PD-0325901(CAS号391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺二胺，二氯铂(II)，CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、紫杉酚(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1， Schering Plough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺， )及多柔比星(doxorubicin)()。其他市售或临床可用抗癌剂包含草酸铂(Sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(MillenniumPharm.)、索坦(sutent)(SU11248，Pfizer)、来曲唑(letrozole)(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(imatinib Mesylate)(Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，SemaforePharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(fulvestrant)(AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(leucovorin/folinic acid)、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016，Glaxo Smith Kline)、氯那法尼(lonafarnib)(SARASARTM，SCH 66336，ScheringPlough)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11，Pfizer)、替匹法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(无十六醇聚氧乙烯醚(乳浮))、紫杉酚(paclitaxel)的经白蛋白改造的纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡他尼布(vandetanib)(rINN，ZD6474，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、坦罗莫司(temsirolimus)(Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(canfosfamide)(Telik)、噻替派及环磷酰胺()；长春瑞滨()；卡培他滨(capecitabine)(Roche)、他莫昔芬(包括柠檬酸他莫昔芬、(柠檬酸托瑞米芬(托米芬)(toremifine citrate))、(乙酸甲地孕酮)、(依西美坦(exemestane)；Pfizer)、服美坦(formestanie))、法倔唑(fadrozole)、(伏罗唑(vorozole))、(来曲唑(letrozole)；Novartis)及(阿那曲唑(anastrozole)；AstraZeneca)。
在其他实施方案中，本发明的位点特异性缀合物可与当前处于临床试验或市售的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一者组合使用。为此，所公开的DLL3缀合物可与选自由以下组成的组的抗体组合使用：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛图单抗(amatuximab)、阿纳图单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、兰妥莫单抗(blinatumomab)、贝土西单抗(brentuximab)、坎土珠单抗(cantuzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西他珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、西瓦图单抗(clivatuzumab)、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、多兹图单抗(drozitumab)、杜利图单抗(duligotumab)、杜斯图单抗(dusigitumab)、地莫单抗(detumomab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛图单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依洛珠单抗(elotuzumab)、恩斯图单抗(ensituximab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、非拉珠单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、福沃图单抗(flanvotumab)、福图西单抗(futuximab)、盖尼图单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉瑞昔单抗(girentuximab)、吉乐木单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、伊加图单抗(imgatuzumab)、因达西单抗(indatuximab)、依珠单抗(inotuzumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛沃图单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫西图单抗(moxetumomab)、拉纳图单抗(narnatumab)、那图莫单抗(naptumomab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺非图单抗(诺莫单抗)(nofetumomabn)、奥卡拉单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉珠单抗(olaratumab)、奥纳珠单抗(onartuzumab)、奥珀珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕木单抗(panitumumab)、帕撒图单抗(parsatuzumab)、帕瑞图单抗(patritumab)、派图单抗(pemtumomab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、平妥单抗(pintumomab)、普立木单抗(pritumumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、拉德瑞单抗(radretumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗妥木单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、斯图珠单抗(simtuzumab)、索利托单抗(solitomab)、塔卡珠单抗(tacatuzumab)、他普莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、图土珠单抗(tucotuzumab)、乌利昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃瑟珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、CC49、3F8及其组合。
其他尤其优选实施方案将包括使用在测试中或认可用于癌症疗法的抗体，包括(但不限于)利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamcin)、阿仑单抗、替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕木单抗、雷莫芦单抗、奥法木单抗、伊匹木单抗及维汀贝土西单抗(brentuximab vedotin)。本领域技术人员将能够容易地鉴别其他与本文中的教导相容的抗癌剂。
5.放射疗法
本发明亦提供DLL3缀合物与放射疗法(即任何用于诱导肿瘤细胞内局部DNA损害的机制，诸如γ辐射、X射线、UV辐射、微波、电子发射及其类似物)的组合。亦涵盖使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的组合疗法，且所公开的缀合物可与靶向抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法经约1周至约2周的时段以脉冲形式施用。放射疗法可施用于患有头颈癌的个体，持续约6周至7周。任选地，放射疗法可以单次剂量或以多次连续剂量施用。
VI.适应症
应了解，本发明的ADC可用于治疗、预防、管理或抑制任何增殖性病症的发生或复发。因此，无论单独施用或与抗癌剂或放射疗法以组合形式施用，本发明的ADC尤其适用于通常治疗患者或个体中的赘生性病况，其包括良性或恶性肿瘤(例如肾上腺、肝脏、肾、膀胱、乳腺、胃、卵巢、结肠直肠的、***、胰脏、肺、甲状腺、肝、子宫颈、子宫内膜、食道及子宫癌瘤；肉瘤；神经胶母细胞瘤；及各种头颈肿瘤)；白血病及淋巴恶性肿瘤；其他病症，诸如神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑及其他腺、巨噬细胞、上皮、基质及囊胚腔病症；以及发炎性、血管生成、免疫病症及由病原体引起的病症。具体而言，关键治疗目标为赘生性病况，包含实体肿瘤，但本发明的范围涵盖血液恶性肿瘤。
如本文中所用的术语“治疗”在治疗病况的情形中通常涉及治疗及疗法(无论人类或动物(例如在兽医应用中))，其中实现一些期望的治疗作用，例如抑制病况发展，且包括发展速率降低、发展速率停止、病况消退、病况的改善及病况的治愈。亦包括作为预防措施(即防范、预防)的治疗。
如本文中所用的术语“治疗有效量”是关于活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂量的量，其在根据期望的治疗方案施用时可有效产生一些期望的治疗作用，与合理的效益/风险比率相称。
类似地，如本文中所用的术语“预防有效量”是关于活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂量的量，其在根据期望的治疗方案施用时可有效产生一些期望的预防作用，与合理的效益/风险比率相称。
更具体而言，根据本发明经受治疗的赘生性病况可选自包括(但不限于)以下的组：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌及移行细胞癌)、骨癌(釉质瘤、动脉瘤样骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑癌及脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子***、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞型肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维性组织细胞瘤、促***增殖性小圆形细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维生成不良、骨纤维性结构不良、胆囊癌及胆管癌、妊娠期滋养层疾病、生殖细胞肿瘤、头颈癌、胰岛细胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌(肾母细胞瘤、***状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤肿瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤肿瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、神经管母细胞瘤、黑色素瘤、脊膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良综合征、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、***状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周边神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、***癌、后葡萄膜黑色素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见血液病症、转移性肾癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、转移性甲状腺癌及子宫癌(子***、子宫内膜癌及平滑肌瘤)。
在某些优选实施方案中，增殖性病症将包含实体肿瘤，包括(但不限于)肾上腺、肝脏、肾、膀胱、***、胃、卵巢、子宫颈、子宫、食道、结肠直肠、***、胰脏、肺(小细胞及非小细胞)、甲状腺、癌瘤、肉瘤、神经胶母细胞瘤及各种头颈肿瘤。在其他优选实施方案中，且如以下实施例中所示，所公开的ADC可尤其有效治疗小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)。在一个实施方案中，肺癌为顽抗性、复发性或对以铂为基础的药剂(例如卡铂、顺铂、草酸铂、拓扑替康(topotecan))及/或紫杉烷(例如多西他赛、紫杉酚(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)或卡巴他赛(cabazitaxel))具有抗性。
在尤其优选实施方案中，所公开的ADC可用于治疗小细胞肺癌。关于所述实施方案，缀合的调节剂可施用于呈现局限期(limited stage)疾病的患者。在其他实施方案中，所公开的ADC将施用于呈现扩散期(extensive stage)疾病的患者。在其他优选实施方案中，所公开的ADC将施用于顽抗性患者(即在初始疗程期间或在初始疗程完成之后不久复发的患者)或复发性小细胞肺癌患者。其他实施方案包含向敏感患者(即在基本疗法后超过2-3个月复发的患者)施用所公开的ADC。在各种情况下，应了解，视所选给药方案及临床诊断而定，相容ADC可与其他抗癌剂组合使用。
如上文所论述，所公开的ADC可进一步用于预防、治疗或诊断具有神经内分泌特征的肿瘤或包括神经内分泌肿瘤的表型。由扩散的内分泌***引起的真性或正则(canonical)神经内分泌肿瘤(NET)相对罕见，其发病率为每100,000人中2-5名，但具有高侵袭性。神经内分泌肿瘤在肾、泌尿生殖道(膀胱、***、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(骨髓甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤及大细胞神经内分泌癌瘤)中发生。这些肿瘤可分泌若干种激素，其包括血清素及/或嗜铬粒蛋白A，其可引起衰竭性症状，称为类癌瘤综合征。所述肿瘤可由阳性免疫组织化学标记(诸如神经元特异性烯醇酶(NSE，亦称为γ烯醇酶，基因符号＝ENO2)、CD56(或NCAM1)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)及突触素(SYP))或已知呈现升高的表达的基因(诸如ASCL1)表示。不幸的是，常规化学疗法通常无法尤其有效地治疗NET及肝脏转移。
尽管所公开的ADC可有利地用于治疗神经内分泌肿瘤，但其亦可用于治疗、预防或诊断伪神经内分泌肿瘤(pNET)，所述伪神经内分泌肿瘤以基因型方式或以表型方式模仿、类似或呈现与正则神经内分泌肿瘤的共有特性。伪神经内分泌肿瘤或具有神经内分泌特征的肿瘤为由弥漫性神经内分泌***的细胞或其中神经内分泌分化级联在致癌过程期间异常再活化的细胞引起的肿瘤。所述pNET通常与常规定义的神经内分泌肿瘤共有某些表型或生物化学特征，包括产生生物学活性胺、神经传递素及肽激素的子集的能力。组织学上，所述肿瘤(NET及pNET)共有共同外观，其通常展示密集连接的具有最小细胞质(无刺激细胞病理学(bland cytopathology))及圆形至椭圆形点状细胞核的小细胞。为达成本发明的目的，可用于定义神经内分泌及伪神经内分泌肿瘤的通常表达的组织学标记或遗传标记包括(但不限于)嗜铬粒蛋白A、CD56、突触素、PGP9.5、ASCL1及神经元特异性烯醇酶(NSE)。
因此，本发明的ADC可有利地用于治疗伪神经内分泌肿瘤及正则神经内分泌肿瘤。在此方面，ADC可如本文中所描述用于治疗肾、泌尿生殖道(膀胱、***、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(髓性甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤及大细胞神经内分泌癌瘤)中产生的神经内分泌肿瘤(NET及pNET)。此外，本发明的ADC可用于治疗表达一种或多种选自由NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A、ASCL1及PGP9.5(UCHL1)组成的组的标记的肿瘤。即，本发明可用于治疗罹患肿瘤(其为NSE+或CD56+或PGP9.5+或ASCL1+或SYP+或CHGA+或其一些组合)的个体。
关于血液恶性疾病，应进一步了解，本发明的化合物及方法可尤其有效治疗各种B细胞淋巴瘤，包括低度/NHL滤泡性细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中度/滤泡性NHL、中度弥漫性NHL、高度免疫母细胞性NHL、高度淋巴母细胞性NHL、高度小无核裂细胞NHL、巨瘤性疾病(bulky disease)NHL、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma；BL)、AIDS相关淋巴瘤、单核细胞性B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴腺病、小淋巴细胞性、滤泡性、弥漫性大细胞、弥漫性小核裂细胞、大细胞免疫母细胞性淋巴母细胞瘤、小无核裂性伯基特与非伯基特滤泡性、主要大细胞淋巴瘤；滤泡性、主要小核裂细胞淋巴瘤；及滤泡性、混合小核裂细胞与大细胞淋巴瘤。参见Gaidono等人,“Lymphomas”,INCANCER:PRINCIPLES&PRACTICE OF ONCOLOGY,第2卷:2131-2145(DeVita等人编,第5期增刊1997)。本领域技术人员应了解，由于改变分类***，故这些淋巴瘤通常将具有不同名称，且具有归类为不同名称的淋巴瘤的患者亦可受益于本发明的组合治疗方案。
本发明亦提供呈现良性或癌前肿瘤的个体的预防性或防范性治疗。除DLL3相关病症外，相信使用本发明的治疗亦不应排除任何特定类型的肿瘤或增殖性病症。然而，肿瘤细胞的类型可与本发明与第二治疗剂、尤其化学治疗剂及靶向抗癌剂的组合的使用有关。
所治疗的“个体”或“患者”优选为人类，但如本文中所用，所述术语明确地始终包含任何物种，包括所有哺乳动物。因此个体/患者可为动物、哺乳动物、有胎盘哺乳动物、有袋动物(例如袋鼠、袋熊)、单孔科动物(例如鸭嘴兽(duckbilled platypus))、啮齿动物(例如天竺鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如小鼠)、兔类动物(例如兔)、鸟类动物(例如鸟)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪科动物(例如猪)、羊(例如绵羊)、牛(例如母牛)、灵长类动物、猿类(例如猴或猿)、猴(例如狨猿、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
VII.诊断和筛查
1.诊断
本发明提供了用于检测，诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法和筛选患者细胞以鉴定包括致瘤性细胞的肿瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定患有癌症的个体以治疗或监测癌症的进展，包括使患者或从患者获得的样品接触(体内或体外)本文中所描述的抗体，并检测在样品中存在或不存在结合靶分子的抗体或游离的靶分子，或结合靶分子的抗体或游离的靶分子的缔合水平。在一些实施方案中，抗体将包含如本文所述的可检测的标记物或报道分子。
在一些实施方案中，样品中抗体与特定细胞的缔合可以表示，该样本可以含有致瘤性细胞，从而表明，可以用如本文所述的抗体对患有癌症的个体进行有效治疗。
可以通过许多测定法，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法(例如ELISA)，竞争性结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western印迹分析和流式细胞测定法，对样品进行分析。相容的体内治疗诊断测定法或诊断测定法可包括本领域公认的成像或监测技术，例如，磁共振成像，计算机断层扫描(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如，PET扫描)，放射摄影术，超声等，这将是本领域技术人员已知的。
在一个特别优选的实施方案中，可以使用本发明的抗体，以检测和定量患者样品(例如，血浆或血液)中的特定决定簇(例如，SEZ6，DLL3或CD324)的水平，其可以反过来用于检测，诊断或监测与该相关决定簇相关的增殖性病症。在相关的实施方案中，可以使用本发明的抗体来体内或体外检测，监测和/或定量循环肿瘤细胞(WO 2012/0128801)。在仍然其他实施方案中，循环肿瘤细胞可以包括致瘤性细胞。
在本发明的某些实施方案中，治疗或进行给药方案之前，使用所公开的抗体，可以对受试者中致瘤性细胞或来自受试者的样品进行评估或表征，以建立基线。在其它实施例中，可以对来自样品的致瘤性细胞进行评估，样品源自被治疗的受试者。
2.筛选
在某些实施方案中，抗体可用于筛选样品，以便鉴定通过与决定簇相互作用而改变肿瘤细胞的功能或活性的化合物或试剂(例如，用于治疗增殖性疾病的药物)。在一个实施例方案中，***或方法包括表达某些决定簇(例如SEZ6，DLL3或CD324)的肿瘤细胞，和化合物或试剂(例如，药物)，其中所述细胞与化合物或试剂相互接触。在这样的实施方案中，主题细胞可以已经使用公开的抗体进行了鉴定、监测和/或富集。
在又一个实施方案中，方法包括使肿瘤细胞直接或间接地接触测试试剂或化合物，以及确定所述测试试剂或化合物是否调节决定簇相关的肿瘤细胞的活性或功能，例如，细胞形态或生存能力的变化，标记物的表达，分化或去分化，细胞呼吸，线粒体活性，膜的完整性，成熟，增殖，生存力，细胞凋亡或细胞死亡。直接相互作用的一个例子是物理相互作用，而间接相互作用包括，例如，组合物对中间分子的作用，该中间分子接着作用于所参照的实体(例如，细胞或细胞培养物)。
筛选方法包括高通量筛选，其可包括被定位或放置的，任选在预先确定的位置(例如，在培养皿，试管，烧瓶，滚瓶或板上)被定位或放置的细胞阵列(例如，微阵列)。高通量的机器人或手动处理方法可以探测化学相互作用，并确定在短时间期间内许多基因的表达水平。已被开发的技术例如通过荧光团或微阵列和自动化分析(以非常快的速率处理信息)利用分子信号。可以被筛选的文库包括，例如，小分子文库，噬菌体展示文库，全人抗体酵母展示文库(Adimab，LLC)，siRNA文库和腺病毒转染载体。
VIII.制品
亦提供包含一个或多个容器的医药包装及试剂盒，该一个或多个容器包含一种或多种剂量的位点特异性ADC。在某些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的包含例如抗-DLL3缀合物的组合物(具有或不具有一种或多种其他试剂)。对于其他实施方案，该单位剂量供应于用于注射的单一用途预填充注射器中。在其他实施方案中，单位剂量中所含的组合物可包含生理食盐水、蔗糖或其类似物；缓冲液，诸如磷酸盐或其类似物；及/或配制在稳定且有效的pH值范围内。或者，在某些实施方案中，缀合物组合物可以冻干粉末形式提供，其可在添加合适液体(例如无菌水或生理食盐水溶液)时重构。在某些优选实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，其包括(但不限于)蔗糖及精氨酸。容器上或与容器相关的任何标记均指示密封的缀合物组合物是用于治疗所选赘生性疾病病况。
本发明亦提供用于产生位点特异性缀合物及任选的一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。试剂盒包含容器及容器上或与容器相关的标记或包装插页。合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑胶)形成且含有医药学上有效量的呈缀合或未缀合形式的所公开的缀合物。在其他优选实施方案中，容器包含无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的阻塞物的小瓶)。所述试剂盒将通常在合适容器中含有改造缀合物的药学上可接受的制剂及相同或不同容器中的任选的一种或多种抗癌剂。试剂盒亦可含有用于诊断或组合疗法的其他药学上可接受的制剂。例如，除本发明的DLL3缀合物外，所述试剂盒可含有多种抗癌剂中的任一种或多种，抗癌剂诸如化学疗法或放射治疗药物；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；及/或其他抗癌剂。
更具体而言，试剂盒可具有单一容器，该单一容器含有公开的ADC且具有或不具有其他组分，或其可具有用于各种期望的试剂的不同容器。当提供组合治疗剂进行缀合时，可将单一溶液以摩尔当量组合形式或以一种组分超过其他组分形式预混合。或者，试剂盒中的缀合物及任何任选的抗癌剂可在施用于患者之前在不同容器内单独保存。试剂盒亦可包含用于含有药学上可接受的无菌缓冲液或其他稀释剂的第二/第三容器构件，该缓冲液或稀释剂为诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)、林格氏溶液及右旋糖溶液。
当试剂盒的组分是以一种或多种液体溶液形式提供时，液体溶液优选为水溶液，其中尤其优选为无菌水溶液或生理食盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，该粉末可通过添加合适溶剂来重构。预想该溶剂亦可提供于另一容器中。
如上文简要说明，试剂盒亦可含有用于将抗体缀合物及任何任选的组分施用于动物或患者的构件，例如一种或多种针、静脉内袋或注射器或甚至点眼药器、吸管或其他该类设备，所述设备可用于将制剂注入或引入动物中或施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒亦通常包括用于含有小瓶或诸如此类的构件，及市售的其他密闭组分，例如置放及保存期望的小瓶及其他设备的射出成形或吹塑成形塑料容器。任何标记或包装插页均指示改造缀合物组合物用于治疗癌症，例如小细胞肺癌。
在其他优选实施方案中，本发明的缀合物可与适用于预防或治疗增殖性病症的诊断或治疗性装置结合使用或包含所述装置。例如，在一个优选实施方案中，本发明的化合物及组合物可与某些诊断装置或器具组合，所述诊断装置或器具可用于检测、监测、定量或探测与增殖性病症的病源学或显现有关的细胞或标记化合物。对于所选实施方案，标记化合物可包含NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A及PGP9.5。
在尤其优选实施方案中，装置可用于体内或体外检测、监测及/或定量循环肿瘤细胞(参见例如WO2012/0128801，其通过引用并入本文中)。在其他优选实施方案中且如上文所论述，循环肿瘤细胞可包含癌症干细胞。
IX.其他内容
除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学及技术术语应具有由普通本领域技术人员所通常理解的含义。此外，除非上下文另有所需，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。更具体而言，除非上下文另外明确指示，否则如本说明书及随附权利要求中所使用，单数形式“一”及“该”包括复数个指示物。因此，例如，提及“蛋白质”包括复数个蛋白质；提及“细胞”包括细胞混合物及其类似物。此外，说明书及随附权利要求中所提供的范围包括端点及端点之间的所有点。因此，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0及2.0与3.0之间的所有点。
通常，与本文所述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质及核酸化学及杂交结合使用的命名法及其技术为本领域中公知且常用的命名法及技术。除非另有指示，否则本发明的方法及技术通常根据本领域中公知的常规方法且如本说明书中通篇引用及论述的各种一般及更特定参考文献中所述来进行。参见例如Abbas等人,Cellular和Molecular Immunology,第6版,W.B.Saunders Company(2010)；Sambrook J.及Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow及Lane,Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；及Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书，如本领域中通常所实现或如本文中所述执行。关于本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医药及药物化学使用的命名法及所述学科的实验方法及技术为本领域中公知及常用的。此外，本文中所使用的任何章节标题是仅用于组织目的且不应视为限制所描述的主题。
如本文所使用，肿瘤细胞类型缩写如下：腺癌(腺)，肾上腺(AD)，乳腺癌(BR)，***受体阳性乳腺癌(BR-ER+)，***受体阴性乳腺癌(BR-ER-)，孕激素受体阳性乳腺癌(BR-PR+)，孕激素受体阴性乳腺癌(BR-PR-)，ERb2/Neu阳性乳腺癌(BR-ERB2/Neu+)，Her2阳性乳腺癌(BR-Her2+)，密蛋白低乳腺癌(claudin-low breast)(BR-CLDN-lo)，三阴性乳腺癌(BR-TNBC)，结肠直肠癌(CR)，子宫内膜癌(EM)，胃癌(GA)，头颈癌(HN)，肾癌(KDY)，大细胞神经内分泌癌(LCNEC)，肝癌(LIV)，***癌(LN)，肺癌(LU)，肺类癌(LU-CAR)，肺梭形细胞癌(LU-SPC)，黑色素瘤(MEL)，非小细胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌(OV)，卵巢浆液性癌(OV-S)，卵巢***状浆液性癌(OV-PS)，卵巢恶性混合中胚层瘤(OV-MMMT)，卵巢黏液性癌(OV-MUC)，卵巢透明细胞癌(OV-CC)，神经内分泌肿瘤(NET)，胰腺癌(PA)，***癌(PR)，鳞状细胞癌(SCC)，小细胞肺癌(SCLC)和衍生自皮肤的肿瘤(SK)。
X.参考文献
不管关于特定参考文献是否使用表述“通过引用并入”，本文中引用的所有专利、专利申请及公开文本以及电子可获得材料(包括例如核苷酸序列提交(例如GenBank及RefSeq中的)及氨基酸序列提交(例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的)，以及来自GenBank及RefSeq中的标注的编码区的翻译)均通过引用并入。仅出于清楚理解的目的给出上文详细描述及随后的实施例。不应将其理解为不必要的限制。本发明不限于所展示及所描述的精确细节。对本领域技术人员而言明显的变体将包含在通过权利要求所定义的本发明中。本文所用的任何部分的标题仅用于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
XI.序列表概述
本申请附有包含多种核酸及氨基酸序列的序列表。以下表4提供所包括的序列的概述
表4
实施例
通过参考以下实施例(其通过举例说明的方式提供，并且不意欲限制本发明)，从而一般地描述的本发明将更容易地被理解。实施例并不旨在表示以下实验是进行的全部或唯一的实验。
实施例1
抗-DLL3抗体的生成
抗-DLL3鼠抗体被如下制造。在第一免疫运动(first immunization campaign)中，采用用等体积或明矾佐剂乳化的人DLL3-Fc蛋白(hDLL3-Fc)接种三只小鼠(下列品系中的每个的一个：Balb/c，CD-1，FVB)。所述hDLL3-Fc融合构建体从AdipogenInternational(目录号AG-40A-0113)购得。对每只小鼠用在TiterMax中的10微克hDLL3-Fc的乳剂进行初始免疫。然后对每只小鼠每两周一次用在明矾佐剂中的5微克hDLL3-Fc加强小鼠。融合之前最后一次注射采用每只小鼠在PBS中的5微克hDLL3-Fc。
在第二免疫运动中，采用用等体积的或明矾佐剂乳化的人DLL3-His蛋白(hDLL3-His)接种六只小鼠(下列品系的各两个：只Balb/c，CD-1，FVB)。从被改造以过表达hDLL3-His的CHO-S细胞上清液中纯化重组hDLL3-His蛋白。初次免疫采用每只小鼠在TiterMax中的10微克hDLL3-His乳液。然后每两周一次用每只小鼠在明矾佐剂中的5微克hDLL3-His加强小鼠。最后一次注射采用被改造以过表达hDLL3的2×105个HEK-293T细胞。
针对特异于人DLL3的小鼠IgG抗体，将固相ELISA测定法用于筛选小鼠血清。高于背景的阳性信号表明特异于DLL3的抗体。简言之，将96孔板(VWR国际，目录#610744)用在ELISA包被缓冲液中的0.5μg/ml重组DLL3-His包被过夜。用含0.02％(体积/体积)吐温20的PBS洗涤后，在室温(RT)用在PBS中的3％(重量/体积)BSA、200μl/孔封闭孔1小时。小鼠血清被滴定(1：100、1：200、1：400和1：800)，并以50微升/孔将小鼠血清加入到DLL3包被的板，并在室温孵育1小时。将板洗涤，然后在RT用在3％BSA-PBS中或在PBS中的2％FCS中稀释(1：10000)的50微升/孔HRP标记的山羊抗-小鼠IgG孵育1小时。再次洗涤板，并在RT加入40微升/孔的TMB底物溶液(Thermo Scientific 34028)，持续15分钟。显色后，加入等体积的2NH2SO4以停止底物显色并通过分光光度计在OD 450分析板。
血清阳性免疫的小鼠被处死并对引流***(腘，腹股沟，和内侧髂)进行解剖并将其用作抗体产生细胞的来源。通过使用模型BTX Hybrimmune***(BTX哈佛仪器)的电细胞融合，将B细胞(来自hDLL3-Fc免疫的小鼠的大约229x106个细胞，并来自hDLL3-His免疫的小鼠的大约510x106个细胞)的细胞悬浮液与非分泌P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以1:1的比例融合。细胞重悬浮在杂交瘤选择培养基中，所述杂交瘤选择培养基由补充有重氮丝氨酸的DMEM培养基、15％胎克隆I血清、10％BM CondiMed(罗氏应用科学)、1mM非必需氨基酸、1mM HEPES、100IU青霉素-链霉素和50μM 2-巯基乙醇组成，并将细胞在4个T225烧瓶中在每烧瓶100mL选择培养基中培养。将烧瓶置于含有5％CO2和95％空气的加湿37℃培养箱中六至七天。
在融合后的第六或七天，从烧瓶收集杂交瘤文库细胞，并以每孔一个细胞(使用FACSAria I细胞分选仪)在200μL补充的杂交瘤选择培养基中将细胞铺板(如上所述)入64块Falcon 96孔板，和48块96孔板以用于hDLL3-His免疫运动。文库的剩余部分被储存在液氮中。
将杂交瘤培养10天，并用如下进行的流式细胞术，针对特异于hDLL3的抗体，筛选上清液。将每孔1×105个被改造以过表达人DLL3，小鼠DLL3(采用染料预染色)，或食蟹猴(cynomolgus)DLL3(采用Dylight800预染色的)的HEK-293T细胞与25微升杂交瘤上清液孵育30分钟。用PBS/2％FCS洗涤细胞，然后将细胞与每样品25微升DyeLight 649标记的山羊抗小鼠IgG(Fc片段特异性二抗，在PBS/2％FCS中稀释(1：300))孵育。15分钟孵育后，将细胞用PBS/2％FCS洗涤两次，并且将细胞再悬浮在含DAPI的PBS/2％FCS中，并通过流式细胞术，对强于采用同种型对照抗体染色的细胞荧光的荧光进行分析。剩余未使用的杂交瘤文库细胞在液氮中被冷冻以供将来文库测试和筛选。
hDLL3-His免疫运动产生约50个鼠抗-hDLL3抗体，并且hDLL3-Fc免疫运动产生约90个鼠抗-hDLL3抗体。
实施例2
抗-DLL3抗体的测序
基于前述，选择以明显高亲和性结合固定化的人DLL3或h293-hDLL3细胞的多个示例性不同的单克隆抗体，以用于测序和进一步分析。来自实施例1中产生的选择的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的序列分析证实，许多具有新型互补决定区且经常显示新型VDJ排列。
表达期望的抗体的最初选择的杂交瘤细胞在试剂(Plus RNA纯化***，Life Technologies)中被裂解，以制备编码抗体的RNA。104至105个细胞重新悬浮于1mL Trizol试剂并在加入200微升氯仿后剧烈摇动。然后将样品在4℃离心10分钟，并将水相转移到新的微量离心管中，加入等体积的70％乙醇。将样品上样在RNeasy Mini旋转(spin)柱上，将其放置在2毫升收集管中，并且根据制造商的说明进行处理。通过洗脱用100微升不含RNA酶的水将总RNA直接提取至旋转柱膜。通过在1％琼脂糖凝胶中分离3微升而确定所述RNA制剂的质量，然后将其储存在-80℃，直至使用。
使用5'引物混合物组合3’小鼠Cγ引物扩增每个杂交瘤的Ig重链的可变区，5'引物混合物包含32个小鼠特定前导序列引物，所述前导序列引物被设计为靶向完整小鼠VH所有组成成分，所述3’小鼠Cγ引物对所有小鼠Ig同种型特异。同样地，将包含32个被设计以用于扩增每个Vκ小鼠家族的5’Vκ前导序列的引物混合物与特异于小鼠κ恒定区的单个反向引物组合使用，以扩增和测序κ轻链。对于包含λ轻链的抗体，结合使用3个5'VL前导序列与特异于小鼠λ恒定区的一个反向引物进行扩增。如下使用Qiagen一步(One Step)RT-PCR试剂盒，从100ng的总RNA扩增VH和VL转录物。针对每个杂交瘤运行共八个RT-PCR反应，四个用于Vκ轻链和四个用于Vγ重链。PCR反应混合物包含，3微升的RNA，0.5微升的100μM的重链或κ轻链引物(由Integrated Data Technologies定制合成)，5微升5×RT-PCR缓冲液，1微升的dNTPs，含有逆转录酶和DNA聚合酶的1微升的酶混合物，和0.4微升的核糖核酸酶抑制剂RNasin(1单位)。热循环仪程序是RT步骤50℃30分钟，95℃15分钟，接着30个循环的(95℃30秒，48℃30秒，72℃1分钟)。然后有在72℃的最终孵育10分钟。
如上文中对可变区的扩增描述，使用相同的特异性可变区引物，对提取的PCR产物进行测序。为了制备用于直接DNA测序的PCR产物，根据制造商的方案使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。用50微升无菌水从旋转柱中洗脱DNA，然后从两条链直接测序(MCLAB)。
使用IMGT序列分析工具(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_ analysis.html)来分析选择的核苷酸序列，以鉴定具有最高的序列同源性的种系V、D和J基因成员。通过使用专有抗体序列数据库比对VH和VL基因与小鼠种系数据库，将这些衍生的序列与Ig V-和J-区域的已知种系DNA序列进行了比较。
在所附序列表中并且标注形式PCT/US14/17810(其就此类序列而言在此通过引用并入)中提供鼠重链和轻链可变区的衍生序列。
实施例3
人源化抗-DLL3抗体的产生
按照实施例1产生的特定鼠抗体(称为SC16.13，SC16.15，SC16.25，SC16.34和SC16.56)被用来衍生包含移植入人受体抗体的鼠CDR的人源化的抗体。在优选的实施方案中，本实施例中描述的人源化重链和轻链可变区可以被并入所公开的位点特异性缀合物，如下所述。
在这方面，借助专有计算机辅助CDR移植法(Abysis数据库，UCL Business)和标准分子改造技术将鼠抗体人源化，如下所述。从杂交瘤中提取总RNA并扩增，如实施例2中所述。关于鼠抗体的VH和VL链的V、D和J基因区段的数据获自所衍生的核酸序列。基于人种系抗体序列的构架序列和CDR规范结构，以及所选鼠抗体的构架序列和CDR之间的最高同源性，选择和/或设计人框架区。为分析的目的，依照Kabat等人编号，将氨基酸分配至每个CDR结构域。一旦人受体可变区框架被选择并与鼠CDR相组合，则通过合成(Integrated DNATechnologies)产生包含适当的限制性位点的整合重链和轻链可变区序列。
然后人源化的可变区表达为改造的全长重链和轻链的组分以提供如本文所述的位点特异性抗体。更具体地，如下使用本领域公认的技术生成人源化抗-DLL3改造抗体。用以下限制性位点，设计了特异于抗体的VH和VL链的前导序列的引物组：用于VH片段的AgeI和XhoI，以及用于VL片段的XmaI和DraIII。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，然后用限制性酶AgeI和XhoI进行针对VH片段的消化，和用限制性酶XmaI和DraIII进行针对VL片段的消化。对VH和VL消化的PCR产物分别进行纯化并连接入人IgG1重链恒定区表达载体或κCL人轻链恒定区表达载体。如下面详细讨论，重和/或轻链恒定区可以被改造以呈现在组装抗体上的位点特异性缀合位点。
如下在10μL的总体积中用200U T4-DNA连接酶(New England Biolabs)，7.5微升的消化和纯化的基因特异性PCR产物和25纳克线性化的载体DNA，进行连接反应。42℃下用3微升连接产物通过热休克转化感受态大肠杆菌DH10B细菌(Life Technologies)，并以100微克/毫升的浓度将感受态大肠杆菌DH10B细菌铺板于氨苄青霉素平板上。在扩增的连接产物的纯化和消化之后，VH片段被克隆入pEE6.4HuIgG1表达载体(Lonza)的AgeI-XhoI限制性位点且VL片段被克隆入pEE12.4Hu-κ表达载体(Lonza)的XmaI-DraIII限制性位点，其中HuIgG1和/或Hu-κ表达载体可以包含天然的或改造的恒定区。
通过采用pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ表达载体共转染HEK-293T细胞而表达人源化抗体。转染前，在标准条件下，在150mm板中，在Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)(其补充有10％热灭活的FCS，100微克/毫升链霉素和100U/mL青霉素G)中培养HEK-293T细胞。为了瞬时转染，细胞生长至80％汇合。12.5微克每个pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ载体DNA加入到1.5mL的Opti-MEM中的50μL HEK-293T转染试剂。将该混合物在室温下孵育30分钟，并铺板。在转染后3至6天收获上清液。通过以800×g离心10分钟从细胞碎片使含有重组人源化抗体的培养上清液澄清并将其保存在4℃。重组人源化抗体是由MabSelect SuRe蛋白A亲和层析法(GE Life Sciences)纯化的。为了较大规模的抗体表达，CHO-S细胞以1L体积被瞬时转染，以每毫升2.2e6个细胞接种，聚乙烯亚胺(PEI)用作转染试剂。抗体表达7-10天后，通过离心从细胞碎片使含有重组抗体的培养上清液澄清，并通过MabSelect SuRe蛋白A亲和层析法纯化。
针对每个人源化DLL3抗体，所选人受体可变区的遗传组成示于紧随下面的表5中。在表5描绘的序列对应于图2A和2B中针对主题克隆阐述的标注的重链和轻链序列。注意的是，使用Abysis数据库的专有版本(Abysis数据库，UCL Business)，按照Kabat等人(见上文)定义在图2A和2B中阐述的互补决定区和框架区。
更具体地，在下表5中的条目对应于SEQ ID NO：519和524(hSC16.13)，SEQ ID NO：520和525(hSC16.15)，SEQ ID NO：521和526(hSC16.25)，SEQ ID NO：522和527(hSC16.34)和SEQ ID NO：523和528(hSC16.56)所述的连续可变区序列。除了遗传组成，表5还表明，在这些选定的实施方案中，无框架的变化或回复突变是保持选定的抗体的有利结合特性所必要的。当然，在其他CDR移植构建体中，将被理解的是，这样的框架变化或回复突变可以是期望的，因此，明确涵盖在本发明的范围之内。
表5
虽然在框架区中没有残基变化，但在人源化克隆之一(hSC16.13)中将突变引入重链CDR2以解决稳定性问题。对具有修饰的CDR的抗体的结合亲和力进行评价，以确保它是等效于任一相应的鼠抗体。
在通过CDR移植人源化所有选定的抗体之后，对得到的轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析，以确定它们关于鼠供体和人受体轻链和重链可变区的同源性。紧随下方的表6中所示的结果表明，与用鼠供体序列相比，人源化构建体一致地表现出就人受体序列而言的较高同源性。更具体地，与人源化抗体和供体杂交瘤蛋白序列的同源性(74％-83％)相比，鼠重链和轻链可变区显示出与人种系基因的最接近的匹配类似的总体百分比同源性(85％-93％)。
表6
测试后，每个衍生的人源化构建体显示出有利的结合特性，其大致相当于由鼠亲本抗体所示的结合特性。
实施例4
抗SEZ6抗体的生成和人源化
通过使用标准的分子技术将人类SEZ6蛋白的ECD部分与人类IgG2Fc结构域融合，产生SEZ6抗原。在PCT/US2013/0027391中提供了产生SEZ6抗原的更详细的描述，针对SEZ6抗原的产生，将PCT/US2013/0027391通过引用并入本文。在接种了六只雌性小鼠后，基本上如实施例1所讨论，生成产生抗体的杂交瘤。如前面所讨论的，筛选杂交瘤，并且遗传物质获自这些关注的杂交瘤。基本上如实施例2所述，确定抗SEZ6抗体的重链可变区和轻链可变区的序列。
使用与之前实施例中阐述的类似的技术，人源化诸多抗SEZ6鼠抗体。根据功能性人种系基因的序列和结构相似性，选择用于重链和轻链的人框架。在这方面，通过将小鼠正则CDR结构与具有Chothia等(同上)中描述的相同正则结构的人类候选物进行比较，评价结构相似性。
更具体地说，借助计算机辅助CDR移植分析(Abysis数据库，UCL商业PLc)和标准分子改造技术，人源化11个鼠抗体SC17.16、SC17.17、SC17.24、SC17.28、SC17.34、SC17.46、SC17.151、SC17.155、SC17.156、SC17.161和SC17.200，来提供hSC17.16、hSC17.17、hSC17.24、hSC17.28、hSC17.34、hSC17.46、hSC17.151、hSC17.155、hSC17.156、hSC17.161和hSC17.200调节剂。基于其与对象小鼠框架序列和它的正则结构的最高序列同源性，选择可变区的人框架区。对于人源化分析的目的，每个CDR结构域的氨基酸的分配是根据Kabat等人的编号(同上)。
从核苷酸序列信息，得到关于对象鼠抗体重链和轻链的V、D和J基因片段的数据。基于所述序列数据，设计特异于抗体Ig VH和VK轻链的前导序列的新引物组，用于克隆重组单克隆抗体。随后，将V-(D)-J序列与小鼠Ig种系序列进行比对。十一个人源化构建体中的每个的产生的遗传排列示于紧随其下的表7。
表7
在表7中所列人源化的抗体对应于图3A和3B中所列标注的轻链和重链可变区序列(SEQ ID NO：170-199)。轻链和重链可变区的相应核酸序列在所附序列表中被阐述。表7还表明，保持结合调节剂的有利特性需要极少框架改变。在这方面，只在三个重链可变区中进行框架的改变或回复突变，在轻链可变区只进行两个框架修饰。
需要注意的是，对于一些人源化轻链和重链可变区(例如hSC17.200，hSC17.155和hSC17.161)，保守的氨基酸突变被引入CDR中，来解决稳定性问题，同时保持抗原结合。在每一种情况下，具有改性的CDR的抗体的结合亲和力被发现是等效于相应的嵌合或鼠抗体。九个示例性人源化变体链(轻链和重链)被列于图3A和3B的末尾(SEQ ID NO：192-199)，其中它们保持人源化亲本链的指定，伴有指示它们已被改变的注释(例如hSC17.200vL1，hSC17.155vH1-6和hSC17.161vH1)。
通过CDR移植人源化所有选定的抗体之后，对得到的轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析，以确定关于鼠供体和人受体轻链和重链可变区的所述序列的同源性。结果示于下方表8，表明与鼠供体序列相比，人源化构建体始终表现出与人受体序列较高的同源性。更具体地说，与人源化的可变区序列和供体的杂交瘤蛋白质序列的同源性(74％-89％)相比，人源化重链和轻链可变区通常显示出与人类种系基因最接近的匹配的较高的百分比同源性(84％-95％)。
表8
经过测试，每个人源化构建体表现出良好的结合特性，其大致相当于由鼠亲本抗体所示的结合特性(数据未示出)。
实施例5
人源化抗CD324抗体的产生
基本上如上文实施例1-3所述，生成抗CD324人源化抗体。生产CD324抗原和对应的抗体的更详细描述被提供于PCT/US2013/25356，其关于上述内容的部分通过引用并入本文。在接种六只雌性小鼠后，基本上如实施例1中所阐述，产生生成抗体的杂交瘤。如之前所讨论的，对杂交瘤进行了筛选，并且从目标杂交瘤获得遗传物质。基本上如实施例2所述，确定抗SEZ6抗体的重链可变区和轻链可变区的序列。
图4示出示例性抗CD324鼠抗体SC10.17的轻链(SEQ ID NO：529)和重链(SEQ IDNO：530)可变区的连续氨基酸序列。在所附序列表中提供对应于鼠重链和轻链的核酸序列(SEQ ID NO：531和532)。SC10.17的序列和其它来自抗CD324抗体的相容轻链和重链可变区显示在PCT/US2013/25356中，其关于这些序列的内容被并入本文。
使用标准分子改造技术，基本上如上文实施例3中所述，人源化所述SC10.17抗CD324鼠抗体。使用Kabat编号，图4描述了鼠亲本抗体和衍生的人源化构建体的重链和轻链的CDR区和框架区，如使用Abysis数据库所确定。概览图4，显示，鼠重链和轻链CDR被转移入人受体分子，其在CDR只有轻微改变。更具体地，图4表示示例性人源化抗CD324抗体(称为hSC10.17)的轻链(SEQ ID NO：531)和重链(SEQ ID NO：532)的氨基酸序列。作为与亲本鼠抗体相应的核酸序列示于所附序列表中(SEQ ID NO：535和536)。与鼠供体序列相比，hSC10.17的轻链和重链可变区表现出与人受体序列轻链和重链可变区较高的同源性(数据未显示)。
实施例6
位点特异性抗-DLL3抗体的制造
构建四个改造的人IgG1/κ抗-DLL3位点特异性抗体。四个改造抗体的两个包含天然轻链恒定区且在重链中具有突变，其中在重链的上部铰链区中的半胱氨酸220(C220)(其与轻链中的半胱氨酸214形成链间二硫键)被置换为丝氨酸(C220S)或被移除(C220Δ)。剩下的两个改造抗体包含天然重链恒定区和突变的轻链，其中该轻链的半胱氨酸214被置换为丝氨酸(C214S)或被移除(C214Δ)。当装配时，重链和轻链形成抗体，所述抗体包含两个适合于缀合至治疗剂的游离半胱氨酸。每个示例性hSC16.56构建体的抗体重链和轻链的氨基酸序列显示在图5A和5B，而正下方的表9总结了变化。关于图5A和5B，反应性(或游离的)半胱氨酸加有下划线，在重链的位置220和轻链的位置214的突变的残基(在ss1和ss4中)就是如此。除非另有说明，恒定区残基的所有编号是根据如在Kabat等人所述的EU编号方案。
表9
如下生成改造的抗体。
编码如实施例3所述衍生的人源化抗-DLL3抗体hSC16.56轻链(SEQ ID NO：507)或重链(SEQ ID NO：508)的表达载体被用作PCR扩增和位点定向诱变的模板。根据制造商的说明、使用system(Agilent Technologies)，进行定向诱变。
对于两个重链突变体，在CHO-S细胞中将编码hSC16.56的突变体C220S或C220Δ重链的载体与hSC16.56的天然IgG1κ轻链共转染，并使用哺乳动物瞬时表达***进行表达。含有C220S或C220Δ突变体的改造抗-DLL3位点特异性抗体被分别称为hSC16.56ss1(SEQ IDNO：509和507)或hSC16.56ss2(SEQ ID NO：510和507)。
对于两个轻链突变体，在CHO-S细胞中将编码hSC16.56的突变体C214S或C214Δ轻链的载体与hSC16.56的天然IgG1重链共转染，并使用哺乳动物瞬时表达***进行表达。用蛋白A层析法(MabSelect SuRe)纯化改造抗体，并将所述抗体存储在适当的缓冲液中。含有C214S或C214Δ突变体的改造抗-DLL3位点特异性抗体分别被称为hSC16.56ss3(SEQ IDNO：508和511)或hSC16.56ss4(SEQ ID NO：508和512)。
通过SDS-PAGE表征改造抗-DLL3抗体，以确认正确的突变体已被生成。在还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)的存在和不存在下，在来自生命技术(life technologies)的预制10％Tris-甘氨酸微型凝胶上进行SDS-PAGE。电泳后，用胶体考马斯溶液染色凝胶(数据未显示)。
观察到两个重链(HC)突变体，hSC16.56ss1(C220S)和hSC16.56ss2(C220Δ)和两个轻链(LC)突变体，hSC16.56ss3(C214S)和hSC16.56ss4(C214Δ)的带型。在还原条件下，对于每个抗体，观察到对应于游离LC和游离HC的两个条带。这种带型是在还原条件下的IgG分子的典型带型。在非还原条件下，四个改造抗体(hSC16.56ss1-hSC16.56ss4)表现出不同于天然IgG分子的带型，表示HC和LC之间不存在二硫键。所有四个突变体表现出对应于HC-HC二聚体的约98kD的条带。在LC上具有缺失或突变的突变体(hSC16.56ss3和hSC16.56ss4)表现出对应于游离LC的约24kD的单一条带。在重链上含有缺失或突变的改造抗体(hSC16.56ss1和hSC16.56ss2)具有对应于游离LC的模糊条带和对应于LC-LC二聚体的约48kD的主要条带。由于在每个轻链的c-末端上的游离半胱氨酸，预计ss1和SS2构建体形成一定量的LC-LC物质种类。
实施例7
位点特异性抗SEZ6抗体的制造
使用人源化抗体hSC17.200作为起点，基本上如实施例6中所述，构建四个改造的人IgG1/κ抗SEZ6位点特异性抗体。四个改造抗体中的两个包括天然轻链恒定区并在重链中具有突变，其中重链上部铰链区半胱氨酸220(C220)(其与轻链半胱氨酸214形成链间二硫键)被置换为丝氨酸(C220S)或去除(C220Δ)。剩下的两个改造抗体包含天然重链恒定区和突变的轻链，其中轻链的半胱氨酸214被置换为丝氨酸(C214S)或去除(C214Δ)。当装配时，重链和轻链形成包含两个适合于缀合至治疗剂的游离半胱氨酸的抗体。每个示例性hSC17.200构建体的重链和轻抗体链的氨基酸序列分别显示在图6A和6B，而紧接着的表10总结了改变。关于图6A和6B，反应性半胱氨酸加有下划线，因为其是在重链位置220和轻链位置214的突变的残基(在ss1和ss4中)。除非另有说明，恒定区残基的所有编号是根据如在Kabat等人中所述的EU编号方案。
表10
包含位点特异性改造hSC17.200抗体的重链和轻链的表达载体分别被导入CHO或293细胞，然后将CHO或293细胞用于产生如本文中所描述的位点特异性的抗体。
除了hSC17.200位点特异性抗体之外，可以基本相同的方式产生和表达hSC17.17抗体。示例性hSC17.17位点特异性抗体将是如在紧接着所列的表11中所概述的，具有所指示的包含在所附序列表中的全长重链和轻链氨基酸序列。
表11
实施例8
位点特异性抗CD324抗体的制造
构建四个改造人IgG1/κ抗CD324位点特异性抗体。四个改造抗体中的两个包含天然轻链并在重链中具有突变，其中，重链的上部铰链区的半胱氨酸220(C220)(其与轻链中的半胱氨酸214形成链间二硫键)被置换为丝氨酸(C220S)或去除(C220Δ)。剩下的两个改造化抗体包含天然重链和突变的轻链，其中轻链的半胱氨酸214被置换为丝氨酸(C214S，参见图7)或去除(C214Δ)。生成的改造抗体如下。
编码包含适当的可变区(SEQ ID NO：531和532)的人源化抗CD324hSC17.10抗体轻链或重链的表达载体被用作PCR扩增和定点诱变的模板。根据制造商的说明使用***(Agilent Technologies)进行定点诱变。
对于两个重链突变体，在CHO-S细胞中，共转染编码hSC10.17的突变体C220S或C220Δ重链的载体与hSC10.17天然的IgG1κ轻链，和使用哺乳动物瞬时表达***表达所述载体。含有C220S或C220Δ突变体的改造抗CD324位点特异性抗体分别称为SC10.17ss1或SC10.17ss2。
对于两个轻链突变体，在CHO-S细胞中，共转染编码hSC10.17的突变体C214S或C214Δ轻链的载体与hSC10.17的天然IgG1重链，和使用哺乳动物瞬时表达***表达所述载体。用蛋白A色谱法(MabSelectSure蛋白A树脂)对改造抗体进行纯化，并将其存储在合适的缓冲液中。含有C214S或C214Δ突变体的改造抗CD324位点特异性抗体分别称为SC10.17ss3或SC10.17ss4。
hSC10.17ss3的整个天然重链的氨基酸序列作为SEQ ID NO：543被示于图7，而在同一图中作为SEQ ID NO：544示出了整个改造轻链的氨基酸序列。在κ轻链中的C214S(Kabat编号)位置是由*表示，如在重链(再次以Kabat的EU索引进行编号)位置220的游离半胱氨酸所示。
实施例9
位点特异性构建体保持结合特性
通过ELISA测定法筛选如前面的实施例所述制备的位点特异性抗DLL3抗体，以确定它们是否结合到DLL3纯化蛋白质。亲本天然抗体用作对照，并与位点特异性抗DLL3抗体相比对。采用缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的单克隆抗体(mAb)报道抗体(SouthernBiotech，目录号SB9052-05)(其结合到存在于人类IgG1分子的表位)，对抗体与DLL3的结合进行检测。HRP与其底物四甲基联苯胺(TMB)反应。水解的TMB的量与结合至DLL3的测试抗体的量成正比。
用PBS中的1μg/ml纯化的DLL3包被ELISA板，并将其在4℃孵育过夜。通过洗涤除去过量的蛋白质，并在室温，用在含0.05％吐温20的PBS(PBST)中的2％(重量/体积(w/v))BSA(200μL/孔)封闭孔1小时。洗涤后，在室温，将100μL/孔的连续稀释的抗体或ADC加入PBST，持续1小时。将板再次洗涤，并在室温，将0.5ug/ml的100μL/孔的适当报道抗体加入PBST，持续1小时。另一洗涤后，通过在室温加入100μL/孔的TMB底物溶液(Thermo Scientific)，持续15分钟，对板进行显影。加入等体积的2M的H2SO4以停止底物显影。然后用分光光度计在OD450，对样品进行分析。
ELISA的结果作为结合曲线被示于图8。数据的概览表明，用于提供轻链恒定区的游离半胱氨酸的重链CH1结构域的改造没有对抗体与靶抗原的结合产生不利影响。采用各种位点特异性构建体进行的类似的测定(数据未显示)表明，用于提供游离半胱氨酸的轻链恒定区或CH1区的改造对所得抗体或ADC的结合特性的影响非常小。
实施例10
位点特异性抗SEZ6ADC的缀合
进行位点特异性抗体的缀合，其中改造的抗SEZ6抗体(诸如那些实施例7中所述的抗体)经由val cit连接体被缀合至硫醇反应性单甲基阿里他汀E(vcMMAE，参见例如，U.S.P.N.7659241)。位点特异性缀合产生了ADC的群体，其具有降低的物种的异质性和复杂性。如上文所讨论，含有均匀组分的ADC同源群体可以对稳定性、药物动力学、聚集和最终的安全性具有有利的影响。
更具体地说，构建改造的人IgG1/κ抗SEZ6抗体，其中重链的上部铰链区的半胱氨酸(C220)(其与轻链形成链间二硫键)被置换为丝氨酸(C220S)，产生具有两个可以缀合至细胞毒素的未配对的半胱氨酸的抗体(hSC17.200ss1)。整个改造的重链的氨基酸序列作为SEQ ID NO：515被示于图6A，而整个轻链的氨基酸序列作为SEQ ID NO：513被示于同一图中。重链中C220S(按照Kabat的EU指数)位置被表示为粗体，并被加下划线，如在κ轻链的214位置的游离半胱氨酸所示(再次按照Kabat进行编号)。
在三个不同的阶段将hSC17.200S与vcMMAE缀合；还原步骤，再氧化步骤和缀合步骤。在图9中可见该过程的示意图。
用加入40摩尔当量在水中的10mM DTT，充分还原hSC17.200S。还原反应在室温下进行过夜(>12小时)。然后使用30kd的膜(Millipore Amicon Ultra)和10个透析体积当量的缓冲液交换，经由缓冲液交换，使还原的抗体进入Tris pH 7.5的缓冲液。然后通过加入4.5摩尔当量的在二甲基乙酰胺(DMA)中的10mM脱氢抗坏血酸(DHAA)，重新氧化还原的hSC17.200S。使再氧化反应在室温下进行60分钟。然后通过对每摩尔游离硫醇加入来自在DMA中的vcMMAE的10mM储备液的1.2摩尔vcMMAE，缀合再氧化的抗体。缀合之前加入额外的DMA，使得DMA的反应混合物中的最终浓度为约6％体积/体积(v/v)。使缀合进行最少30分钟，之后通过加入1.2摩尔过量的来自在水中制备的10mM储备液的N-乙酰半胱氨酸(NAC)，结束(quench)反应。20分钟的最小结束时间之后，通过添加4％v/v的0.5M乙酸，将pH调节至5.5±0.3。无菌过滤和最终制剂之前，通过使用10kDa膜和共10个透析体积的缓冲液交换的恒定体积渗滤，将缀合的hSC17.200SvcMMAE渗滤到20mM的pH为6.0的组氨酸氯化物。所得的ADC表现出的与SEZ6抗原的结合，与缀合的天然SC17.200抗体和相对高百分比的DAR＝2的化合物的结合相当。
实施例11
位点特异性抗体的缀合
使用DTT完全还原或使用TCEP(三(2-羧乙基)膦)部分还原如上面实施例6和7中所述制备的位点特异性抗体(hSC16.56ss1和hSC17.200ss1)，然后与包含vcMMAE的连接体-药物缀合，以表明位点特异性缀合。
此外，该方法的示意图在图9中可见。这种构建体的目标缀合位点是在每个轻链恒定区上的未配对的半胱氨酸(C214)。可使用反相HPLC(RP-HPLC)测定法对缀合效率(中靶和脱靶缀合)进行监测，所述反相(RP-HPLC)测定法可以跟踪在轻链上的中靶缀合vs.在重链上的脱靶缀合。疏水性相互作用色谱(HIC)测定法可用于监测药物与抗体的比例物质种类(DAR)的分布。在本实施例中，期望的产物是这样的ADC，其在轻链(中靶)上最大限度缀合(如通过反相色谱法确定)，并且最小化过度缀合的(DAR>2)物质种类，同时最大化DAR＝2物质种类。
用40摩尔当量加入10mM DTT完全还原或者用2.6摩尔当量加入10mM TCEP部分还原hSC16.56ss1或hSC17.200ss1的不同的制剂。
在室温下将用10mM DTT还原的样品还原过夜(>12小时)，然后用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)和缓冲液交换的10个透析体积(diavolume)的当量而使所述样品缓冲液交换入Tris pH 7.5缓冲液。然后采用4.0摩尔当量加入在二甲基乙酰胺(DMA)中的10mM脱氢抗坏血酸(DHAA)，重新氧化所得充分还原的制剂。当样品的游离硫醇浓度(如通过埃尔曼法(Ellman’s method)测定的每个抗体游离硫醇的数目)为1.9至2.3时，在室温，历经最少30分钟，抗体的游离半胱氨酸通过马来酰亚胺连接体缀合至MMAE细胞毒素。然后通过使用在水中制备的10mM储备溶液，加入1.2摩尔过量的N-乙酰-半胱氨酸(NAC)，将反应物猝灭。20分钟的最小猝灭时间之后，通过添加0.5M乙酸，将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜，通过渗滤，经由缓冲液交换使抗体-MMAE的多种缀合制剂进入20mM pH为6.0的组氨酸氯化物。
在室温下将用10mM TCEP部分还原的样品还原最少90分钟。当样品的游离硫醇浓度为1.9至2.3时，在室温下，历经最少30分钟，通过马来酰亚胺连接体再次将部分还原的抗体缀合至MMAE。然后通过加入1.2摩尔过量的来自在水中制备的10mM储备溶液的NAC，将反应物猝灭。20分钟的最小猝灭时间之后，通过添加0.5M乙酸，将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜，通过渗滤，经由缓冲液交换使缀合的抗体-MMAE的制剂进入20mM的pH为6.0的组氨酸氯化物。
用RP-HPLC分析最终的抗体-药物制剂(DTT还原的和TCEP还原的)，来定量重链对比轻链缀合位点，以确定hSC16.56ss1-MMAE(图10A)或hSC17.200ss1-MMAE(图10B)中靶轻链缀合的百分比。该分析采用Aeris WIDEPORE 3.6μm C4柱(Phenomenex)，用水中的0.1％v/v TFA作为流动相A，和使用90％v/v乙腈中的0.1％v/v TFA作为流动相B。分析之前用DTT完全还原样品，然后将样品注射到柱上，其中在10分钟内施加30-50％流动相B的梯度。收集在214nm的UV信号，然后将其用于计算重链和轻链缀合的程度。
更特别的是，使用DTT和TCEP缀合的hSC16.56ss1-MMAE和hSC17.200ss1-MMAE中的重链和轻链之间的有效载荷分布示于图10A和10B。通过积分先前建立的峰(轻链，轻链+1种药物，重链，重链+1种药物，重链+2种药物等)的RP-HPLC曲线下面积，并分别计算每个链的缀合％，得到重链和轻链的百分比缀合。如在整个本说明书中所讨论，本发明的选择的实施方案包括有利于在轻链的有效载荷的放置的缀合方法。
也使用HIC分析相同的制剂，以针对hSC16.56ss1-MMAE(图11A)和hSC17.200ss1-MMAE(图11B)确定DAR＝2物质种类相对于不期望的DAR>2物质种类的量。在这方面，使用PolyPROPYL A3μm柱(PolyLC)进行了HIC，用水中的1.5M硫酸铵和25mM磷酸钾作为流动相A，和水中的0.25％w/v CHAPS和25mM磷酸钾作为流动相B。将样品直接注射到柱上，其中在15分钟内施加0-100％流动相B的梯度。收集在280nm处的UV信号，并且针对未缀合的抗体和更高DAR物质种类进行色谱图分析。通过积分先前建立的峰(DAR＝0，DAR＝1，DAR＝2，DAR＝4等)的HIC曲线下面积，并计算每个峰的％，进行DAR计算。在使用DTT和TCEP缀合的hSC16.56ss1-MMAE和hSC17.200ss1-MMAE中所得DAR分布分别示于图11A和11B。
由hSC16位点特异性缀合制剂的HIC确定的DAR分布表明，DTT/DHAA充分还原和再氧化方法导致～60％DAR＝2物质种类，而典型的部分TCEP还原法导致～50％DAR＝2。充分还原和再氧化方法还导致较高的不希望的DAR>2物质种类(20-25％)，而部分TCEP还原方法导致10-15％DAR>2(图11A和11B)。注意，虽然TCEP部分还原具有较低水平的DAR>2物质种类，但是DAR＝2百分比仅为50％。提高TCEP***中的％DAR＝2物质种类，将导致不希望的DAR>2物质种类的相应增加。如通过RP-HPLC(图10A和10B)显示，DTT/DHAA充分还原样品的高DAR物质种类的增加可以归因于重链上的较高的脱靶缀合，这是由于随着还原驱动力增加的铰链区半胱氨酸残基的非特异性还原。因此，尽管所公开的位点特异性构建体提供相对于天然抗体改进的DAR和更少的不希望的较高DAR杂质，常规的还原方法生成至少一些非特异性缀合物，其在不同于期望的改造位点的半胱氨酸残基上包含细胞毒性剂。
实施例12
使用选择性还原方法缀合改造抗体
为了进一步提高缀合的特异性和最终产物的均质性，使用新方法选择性还原如实施例6和7所述制造的位点特异性抗体，所述新方法包括与包括MMAE的连接体-药物缀合之前的稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)。如上所讨论，选择性的缀合优选缀合游离半胱氨酸上的细胞毒素，伴有少量非特异性缀合。
按照实施例6和7，hSC16.56ss1构建体的目标缀合位点是在每个轻链上的未配对的半胱氨酸。为了将缀合导向至这些改造的位点，在室温下，历经最少1小时，在含有1M L-精氨酸/5mM谷胱甘肽、还原的(GSH)/5mM EDTA的pH为8.0的缓冲液中，部分还原hSC16.56ss1和hSC17.200ss1的制剂。此外，作为对照，每一种抗体制剂分别在1M L-精氨酸/5mM EDTA，pH 8.0和20mM Tris/3.2mM EDTA/5mM谷胱甘肽(GSH)，pH值8.2缓冲液中孵育一小时或更长时间。然后用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)，通过缓冲液交换使所有制剂进入20mM Tris/3.2mM EDTA，pH 8.2的缓冲液。所得部分还原制剂(对于在精氨酸和谷胱甘肽中一起孵育的样品)具有1.9至2.3的游离硫醇浓度，然后在室温下，历经最少30分钟，将所有制剂通过马来酰亚胺连接体缀合至MMAE。然后用在水中制备的10mM储备溶液，加入1.2摩尔过量的NAC，将反应猝灭。20分钟的最小猝灭时间之后，通过添加0.5M乙酸，将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜，通过渗滤，使抗体-MMAE的多种缀合的制剂渗滤进入pH值6.0的20mM组氨酸氯化物。
采用如先前讨论的用于定量重链vs.轻链缀合位点的RP-HPLC对最终的抗体-药物制剂进行分析，以确定中靶轻链缀合的百分比(图12A和12B)。还使用疏水作用色谱法对样品进行分析，以确定DAR＝2物质种类相对于不期望的DAR>2物质种类的量(图13A和13B)。为了比较的目的，对于DTT/DHAA和TCEP还原样品，在前面的实施例中所获得的结果包括在图12和13中。EDTA/GSH对照的HIC分析表示在图14A和14B中，其中紧邻于选择性还原样品显示它们。
图12和13总结了，与标准完全或部分还原法相比，使用选择性还原方法还原的抗体的HIC DAR分布和缀合的轻链％(如实施例10和11中所描述)。与改造构建体组合的选择性缀合方法的好处是显而易见的，其导致期望的轻链缀合位点的优良选择性(图12A和12B)，并提供60-75％的平均DAR＝2水平，同时保持不期望的DAR>2物质种类低于10％(图13A和13B)。在图12和13中所示的结果表明，与标准的部分或完全还原方法相比，选择性还原驱动反应以提供更高水平的DAR＝2和较少的不希望的DAR>2物质种类。在图14A和14B中所示的对照方法表明，温和的还原剂(例如GSH)不能在不存在稳定剂(例如L-精氨酸)的情况下实现期望的缀合。
这些数据表明，相对于常规部分和完全还原缀合方法，选择性还原提供了优点。当新型选择性还原方法与被改造以提供未配对的(或游离)半胱氨酸残基的抗体组合使用时，这是特别真实的。与稳定剂组合的温和还原(即，选择性还原)产生稳定游离硫醇，所述稳定游离硫醇容易地被缀合到各种连接体-药物，而DHAA再氧化是时间敏感的，TCEP还原不那么成功，尤其是对于本文描述的改造构建体。
实施例13
采用不同***的选择性还原
为了进一步证明使用稳定剂和还原剂的各种组合的选择性还原的优点，在缀合前，使用与不同温和的还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸或NAC)组合的不同的稳定剂(例如L-赖氨酸)，选择性还原hSC16.56ss1。
使用三种不同的缓冲***，选择性还原hSC16.56ss1的三种制剂中的每一个：(1)1M L-精氨酸/6mM GSH/5mM EDTA，pH 8.0，(2)1M L-精氨酸/10mM NAC/5mM EDTA，pH 8.0，和(3)1M L-赖氨酸/5mM GSH/5mM EDTA，pH 8.0。此外，作为对照，分别在20mM Tris/5mMEDTA/10mM NAC，pH 8.0和20mM Tris/3.2mM EDTA/5mM GSH，pH 8.2缓冲剂中孵育抗体制剂。在室温下孵育所有制剂最少1小时，然后用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)，通过渗滤，使所有制剂通过缓冲液交换进入20mM Tris/3.2mM EDTA，pH 8.2的缓冲液。然后通过马来酰亚胺连接体，使所得选择性还原制剂(其被发现具有1.7至2.4的游离硫醇浓度)缀合至MMAE。使缀合反应在室温下进行最少30分钟后，使用10mM储备溶液，加入1.2摩尔过量的NAC，将反应猝灭。在20分钟的最小猝灭时间后，通过添加0.5M乙酸，将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜，通过渗滤，使抗体-MMAE的多种缀合的制剂经由缓冲液交换进入20mM pH为6.0的组氨酸氯化物。然后用疏水相互作用色谱法，对最终的抗体-药物制剂进行分析，来确定DAR分布(见图15)。
针对所采用的三种不同的选择性还原***(Arg/GSH，Lys/GSH和Arg/NAC)，如通过HIC测定的DAR分布显示相似的结果。更具体地，不同的制剂的DAR＝2水平是60-65％，并且对于所有选择性还原***和连接体-药物组合，高DAR物质种类(DAR>2)被保持在20％以下，这指示对于轻链恒定区中的改造的半胱氨酸残基的高选择性。再次，如先前实施例12中所示，单独的温和还原剂(例如GSH或NAC)没有提供足够的缀合选择性，而稳定剂的添加导致显著改进。
实施例14
位点特异性缀合物保持结合特性
筛选如前面的实施例所阐述而制备的位点特异性抗-DLL3ADC，以确定它们是否结合到DLL3纯化蛋白质。代表性筛选测定是ELISA测定，基本上如下所述进行所述ELISA测定。所述的ELISA用于选择保留结合特征的改造抗体。
使用缀合和非缀合形式的亲本非改造抗体作为对照，并伴随位点特异性抗-DLL3抗体和抗-DLL3抗体药物缀合物一起运行。用结合存在于人类IgG1分子上的表位的缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的单克隆抗体(mAb)报道抗体(Southern Biotech，目录号SB9052-05)检测抗体与DLL3的结合。用结合ADC上的药物或药物连接体的缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的抗体来检测ADC(位点特异性的或常规的)与DLL3的结合。HRP与其底物四甲基联苯胺(TMB)反应。水解的TMB量与结合至DLL3的试验制品的量成正比。
将ELISA板用PBS中的1μg/ml纯化的DLL3包被，并在4℃孵育过夜。通过洗涤除去过量的蛋白质，并在室温用在含0.05％吐温20的PBS(PBST)中的2％(w/v)BSA(200微升/孔)封闭孔1小时。洗涤后，在室温加入PBST中的100μL/孔的连续稀释的抗体或ADC，持续1小时。将板再次洗涤，并在室温加入在PBST中的0.5ug/ml的100微升/孔的适当报道抗体，持续1小时。另一次洗涤后，在室温下，通过加入100微升/孔的TMB底物溶液(Thermo Scientific)，将板显色，持续15分钟。加入等体积的2M H2SO4以停止底物显色。然后用分光光度计在OD450对样品进行分析。
实施例15
位点特异性缀合物的体外细胞毒性
运行测定法以显示位点特异性缀合物在体外有效杀死表达人DLL3抗原的细胞的能力。例如，所述测定法可以用于测量抗-DLL3位点特异性缀合物杀死被改造以表达人DLL3的HEK293T细胞的能力。在该测定法中，杀死要求ADC(位点特异性或对照)结合至其在细胞表面的DLL3目标，随后是ADC的内化。内化后，连接体(例如Val-Ala蛋白酶可裂解的连接体，如上所述)被裂解并释放导致细胞死亡的细胞内的细胞毒素。使用CellTiter-Glo试剂测量细胞死亡，所述CellTiter-Glo试剂测量ATP含量作为细胞生存力的替代物。
代表性测定基本如下完成。在添加抗体药物缀合物的前一天，在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素(DMEM完全培养基)的DMEM中将每孔500个细胞铺板于96孔组织培养处理的板中。铺板后24小时，采用在DMEM完全培养基中连续稀释SCAb-细胞毒素对照或SCAbss1-细胞毒素处理细胞。处理后，将细胞培养96小时，在这之后，按照生产商的说明书，用Cell Titer(ProMega)计数存活细胞数。
实施例16
位点特异性缀合物在血清中的稳定性
为了说明通过本发明的位点特异性缀合物提供的改进的稳定性，将所选缀合物暴露于体外人血清，持续延长的时间。随时间测量ADC的降解。例如，基本上如下进行代表性测定。
SCAb ADC和SCAbss1ADC(每个都包括相同的细胞毒素)被加入到商购获得的人血清(Bioreclamation)并在37℃，5％CO2被孵育，持续延长的时间。在加入后0，24，48，96和168小时收集样品，和使用夹心ELISA来测量稳定性，以测量总抗体含量和ADC水平。
关于总抗体含量的测量，ELISA被构建为检测缀合和非缀合的SCAb或SCAbss1抗体。该测定采用有或没有缀合细胞毒素的一对抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性捕获并检测SCAb和SCAbss1。利用MSD技术平台(Meso Scale Diagnostics，LLC)机械地运行该测定，所述MSD技术平台采用电化学发光以增加灵敏度和线性度。
为此，在4℃用2ug/mL捕获抗独特型(ID-16)抗体包被MSD高结合板，持续过夜。第二天，将板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤，并采用PBST中的150uL 3％BSA封闭板。25μl血清样品(连同ADC标准曲线)一起被加入到板中，并使其在室温孵育2小时。孵育后，将板用PBST洗涤，并且将25μl磺基标记的检测抗独特型(ID-36)抗体以0.5ug/mL加入到每个孔中，并在室温孵育1小时。然后洗涤板，并在每孔中加入150uL 1×MSD读取缓冲液，并采用MSD读数器读出。将数据作为最初添加到人血清的总的ADC的百分比，进行作图。
除了监测总抗体浓度，针对所收集的样品进行ELISA测定法，以测定剩余的抗体药物缀合物的水平。即，该测定法使用通常如上面刚刚描述的ELISA方法，测量SCAb-细胞毒素和SCAbss1-细胞毒素的水平。然而，不同于先前的ELISA测定法，该ELISA定量缀合至一种或多种细胞毒素分子的SCAb或SCAbss1抗体，但不能确定实际存在于检测的ADC上的细胞毒素分子的数目。与总抗体测定不同的是，该测定法使用抗独特型mAb和抗细胞毒素特异性的mAb组合，并且不检测未缀合的SCAb抗体。
该ELISA测定法使用MSD技术平台，以产生数据，并且基本上如下进行代表性测定法。于4℃用4ug/mL抗细胞毒素特异性mAb包被MSD标准结合板，持续过夜。第二天，将板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤，并采用PBST中的150uL 3％BSA封闭板。25μl血清样品(连同ADC标准曲线)和QC样品一起被加入到板中，并使其在室温孵育2小时。孵育后，采用PBST洗涤板，并且将25μl磺基标记的检测抗独特型抗体(ID-36)以0.5ug/mL加入到每个孔中，并将其在室温孵育1小时。然后洗涤板，并每孔加入150uL 1X MSD读取缓冲液，并采用MSD读数器进行读出。对数据进行分析，以选择ADC，所述ADC示出最小的ADC的退化，以避免由游离细胞毒素产生的非特异性毒性和治疗指数的对应降低。
实施例17
位点特异性缀合物在血清中的白蛋白转移
在采用常规的ADC的情况下，已经注意到，血清中的白蛋白可以浸出缀合的细胞毒素，从而增加非特异性的细胞毒性。为了确定由白蛋白转移介导的位点特异性ADC降解的量，开发ELISA测定法以测量血清中暴露于SCAb-细胞毒素和SCAbss1-细胞毒素细胞毒素细胞毒素的白蛋白-细胞毒素(hAlb-细胞毒素)的量。该ELISA使用抗细胞毒素特异性mAb以捕获hAlb-细胞毒素，并且抗人白蛋白mAb被用作检测抗体。由于游离ADC将与hAlb-细胞毒素竞争，所以在测试之前，血清样品必须耗尽细胞毒素ADC。从hAlb-细胞毒素标准曲线外推定量。连同之前的实施例，该测定法使用MSD技术平台，以产生数据。代表性测定法基本如下完成。
最初，采用SCAb-细胞毒素或SCAbss1-细胞毒素连同相关对照接种血清样品，达到10微克的终浓度。与前面的实施例相同，在加入后0，24，48，96和168小时采样。在4℃用4ug/mL抗PBD特异性mAb包被MSD标准结合板，持续过夜。第二天，将板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤，并在室温下采用25μl MSD稀释剂2+0.05％吐温-20封闭板，持续30分钟。将血清样品在MSD稀释剂2+0.1％吐温-20(10uL血清+90uL稀释剂)中稀释(1:10)，并且将其在旋涡振荡器上用20ul GE的MabSelect SuRe蛋白A树脂孵育1小时。通过抗独特型抗体耗尽完整SCAb-细胞毒素或SCAbss1-细胞毒素后，使用96孔3M滤板将样品从树脂分离。然后连同hAlb-6.5标准曲线将25μl耗尽的血清样品加入封闭的板，并将其在室温孵育1小时。孵育后，将板用PBST洗涤，并且加入在MSD稀释剂3+0.05％吐温20中稀释的25μl的1ug/mL的磺基标记的抗-人白蛋白mAb(Abcam ab10241)。然后将板孵育1小时，用PBST洗涤，并采用150uL1X MSD读出缓冲液对板进行读出。对数据进行分析，以选择显示最小白蛋白转移速率的ADC。
实施例18
位点特异性构建体显示体内的疗效
进行体内实验，以确认本文所述的位点特异性构建体的细胞杀死能力。为此，在携带皮下患者来源的异种移植(PDX)小细胞肺癌(SCLC)肿瘤的免疫功能低下NODSCID小鼠中，检验如先前实施例所述制备的位点特异性DLL3ADC体内治疗效果，基本上如下所述。在三种不同SCLC模型中各自测试抗-DLL3-PBD缀合物(SCAb-ADC)，HIC纯化的抗-DLL3-细胞毒素缀合物(SCAb-ADCD2)和HIC纯化的位点特异性抗-DLL3-细胞毒素缀合物(SCAbss1-ADCD2)。
SCLC-PDX品系，LU129，LU64，和LU117作为离解的细胞接种物被各自注入皮肤下的乳腺脂肪垫区域附近，并每周用卡尺测量(椭球体积＝a x b2/2，其中a是椭圆的长直径，和b是椭圆的短直径)。肿瘤长至200立方毫米(范围是100-300立方毫米)的平均尺寸后，将小鼠随机分为相等肿瘤体积平均值的治疗组(每组n＝5只小鼠)。通过腹膜内注射，以单次剂量(100μL)采用媒介物(在无菌水中的5％葡萄糖)，对照人类IgG1ADC(IgG-ADC；1毫克/千克)，或SCAb-ADC制剂(0.75-1.5毫克/千克)治疗小鼠，由每周肿瘤体积(如上述使用卡尺)和重量测量评估治疗效果。个体小鼠或治疗组的端点标准包括健康评估(疾病的任何体征)，体重减轻(从研究开始超过20％重量损失)，和肿瘤负荷(肿瘤体积>1000立方毫米)。通过每周一次的肿瘤体积测量(立方毫米)监测功效，直到各组达到约800-1000立方毫米的平均值。为治疗组中的所有小鼠计算肿瘤体积，将其表示为具有标准误差平均值的平均值，并且将其相对于自初始治疗起算的时间(天)绘图。治疗的结果被描绘为每个处理组5只小鼠中的具有标准误差平均值(SEM)的平均肿瘤体积。
在携带SCLC PDX-LU129、PDX-LU64或PDX-LU117的小鼠中，评价使用常规(SCAb-细胞毒素或SCAb-ADCD2)或位点特异性策略(SCAbss1-ADCD2)与含有每抗体2个药物分子的分子物质种类的HIC纯化(在两种制剂中)缀合的结合DLL3的ADC。对结果进行分析，以评估DLL3结合ADC的HIC纯化和/或位点特异性缀合对治疗效果的影响。
实施例19
位点特异性缀合物表现出降低的毒性
为了进一步扩大公开的缀合制剂的治疗指数，进行研究以记录他们的毒性概况。具体地说，进行这些研究，以选择具有更好的耐受性(例如，相同数量的剂量无死亡，皮肤毒性的降低的发生率，减少的骨髓毒性，淋巴样组织结果的减少的严重性，等)的抗-DLL3位点特异性缀合物。显著的是，毒性的降低显著地增加治疗指数，因为它提供了显著更高的给药和相应的在肿瘤位点的细胞毒素的更高的局部浓度。代表性试验基本如下完成。
将DAR2纯化的位点特异性ADC(SCAbss1-ADCD2)的毒性与常规缀合物(SCAb-ADC)或其DAR2纯化的版本(SCAb-ADCD2)的毒性相比较。各制剂相同包括细胞毒素。使用食蟹猴(cynomolgus monkey)作为测试***进行所述研究。在这项研究中，将以下记录并进行比较：临床体征、体重、食物消耗、临床病理学(血液学，凝血，临床化学和尿分析)、毒物代谢动力学、大体尸检结果、器官重量和组织病理学检查。
本领域技术人员将进一步理解的是，本发明可以以其他特定形式而不脱离其精神或中心特征的前提下进行实施。因为本发明的前面的描述仅仅公开了其示例性实施方案，所以应当理解的是，考虑其他变型在本发明的范围之内。因此，本发明并不限于已在本文中详细描述的具体实施方案。相反，应该参考所附权利要求书，所附权利要求书指示本发明的内容和范围。

Claims (11)

1.与人SEZ6蛋白结合的改造的IgG1单克隆抗体，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体：
(i)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基缺失，
(ii)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基置换，
(iii)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基缺失，或
(iv)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基置换，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体在重链位置226和229处包含天然半胱氨酸残基；
其中所述半胱氨酸的残基根据Kabat编号；
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
包含SEQ ID NO:190所示的氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR；和
包含SEQ ID NO:191所示的氨基酸序列的重链可变区的三个CDR；且
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
SEQ ID NO:190的残基24～34用于CDR-L1，
SEQ ID NO:190的残基50～56用于CDR-L2，
SEQ ID NO:190的残基89～97用于CDR-L3，
SEQ ID NO:191的残基26～32用于CDR-H1，
SEQ ID NO:191的残基52～56用于CDR-H2，及
SEQ ID NO:191的残基95～102用于CDR-H3，
其中所述CDR的残基根据Chothia编号。
2.与人SEZ6蛋白结合的改造的IgG1单克隆抗体，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体：
(i)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基缺失，
(ii)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基置换，
(iii)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基缺失，或
(iv)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基置换，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体在重链位置226和229处包含天然半胱氨酸残基；
其中所述半胱氨酸的残基根据Kabat编号；
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
包含SEQ ID NO:190所示的氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR；和
包含SEQ ID NO:191所示的氨基酸序列的重链可变区的三个CDR；且
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
SEQ ID NO:190的残基30～36用于CDR-L1，
SEQ ID NO:190的残基46～55用于CDR-L2，
SEQ ID NO:190的残基89～96用于CDR-L3，
SEQ ID NO:191的残基30～35用于CDR-H1，
SEQ ID NO:191的残基47～58用于CDR-H2，及
SEQ ID NO:191的残基93～101用于CDR-H3，
其中所述CDR的残基根据MacCallum编号。
3.权利要求1或2的改造的IgG1单克隆抗体，其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:403所示的氨基酸序列，及
重链恒定区，其包含SEQ ID NO:500所示的氨基酸序列。
4.抗体药物缀合物，其包含改造的IgG1单克隆抗体和细胞毒性剂，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体与人SEZ6蛋白结合，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体：
(i)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基缺失，
(ii)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基置换，
(iii)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基缺失，或
(iv)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基置换，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体在重链位置226和229处包含天然半胱氨酸残基；
其中所述半胱氨酸的残基根据Kabat编号；
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
包含SEQ ID NO:190所示的氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR；和
包含SEQ ID NO:191所示的氨基酸序列的重链可变区的三个CDR；
其中所述改造的IgG1单克隆抗体与细胞毒性剂
经在轻链位置C214处的半胱氨酸残基缀合，或
经在重链位置C220处的半胱氨酸残基缀合；且
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
SEQ ID NO:190的残基24～34用于CDR-L1，
SEQ ID NO:190的残基50～56用于CDR-L2，
SEQ ID NO:190的残基89～97用于CDR-L3，
SEQ ID NO:191的残基26～32用于CDR-H1，
SEQ ID NO:191的残基52～56用于CDR-H2，及
SEQ ID NO:191的残基95～102用于CDR-H3，
其中所述CDR的残基根据Chothia编号。
5.抗体药物缀合物，其包含改造的IgG1单克隆抗体和细胞毒性剂，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体与人SEZ6蛋白结合，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体：
(i)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基缺失，
(ii)在重链位置220处包含半胱氨酸残基、及在轻链位置214处的半胱氨酸残基置换，
(iii)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基缺失，或
(iv)在轻链位置214处包含半胱氨酸残基、及在重链位置220处的半胱氨酸残基置换，
其中所述改造的IgG1单克隆抗体在重链位置226和229处包含天然半胱氨酸残基；
其中所述半胱氨酸的残基根据Kabat编号；
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
包含SEQ ID NO:190所示的氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR；和
包含SEQ ID NO:191所示的氨基酸序列的重链可变区的三个CDR；
其中所述改造的IgG1单克隆抗体与细胞毒性剂
经在轻链位置C214处的半胱氨酸残基缀合，或
经在重链位置C220处的半胱氨酸残基缀合；且
其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
SEQ ID NO:190的残基30～36用于CDR-L1，
SEQ ID NO:190的残基46～55用于CDR-L2，
SEQ ID NO:190的残基89～96用于CDR-L3，
SEQ ID NO:191的残基30～35用于CDR-H1，
SEQ ID NO:191的残基47～58用于CDR-H2，及
SEQ ID NO:191的残基93～101用于CDR-H3，
其中所述CDR的残基根据MacCallum编号。
6.权利要求4或5的抗体药物缀合物，其中所述改造的IgG1单克隆抗体包含：
轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:403所示的氨基酸序列，及
重链恒定区，其包含SEQ ID NO:500所示的氨基酸序列。
7.权利要求6的抗体药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是阿里他汀、美登木素生物碱、刺孢霉素或放射性同位素。
8.权利要求7的抗体药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是刺孢霉素。
9.权利要求8的抗体药物缀合物，其中所述抗体药物缀合物具有2的药物载荷。
10.药物组合物，其包含：
(a)权利要求8的抗体药物缀合物，和
(b)药学上可接受的载体，
其中所述药物组合物包含2+/-0.4的药物与抗体比率(DAR)。
11.药物组合物，其包含：
(a)权利要求8的抗体药物缀合物，和
(b)药学上可接受的载体，
其中主要抗体药物缀合物物质种类以大于70％的浓度存在。
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