SK157498A3 - Isolated and recombinant nucleic acid, bas-1 protein or peptide thereof, and agent, antibody, expression vector, host cell and method of their use - Google Patents

Abstract

The purification and isolation of a gene which encodes a human B-cell antigen. Nucleic acids, proteins, antibodies, and other reagents useful in modulating development of cells, e.g., lymphoid, are provided, along with methods for their use.

Description

Predkladaný vynález sa týka radu biologických látok, ktoré sa používajú na modulovanie ludskej imunitnej odpovede. Predovšetkým je zameraný na použité látky a spôsoby, napríklad pri interakcii B a T buniek.The present invention relates to a variety of biological agents that are used to modulate the human immune response. In particular, it is directed to the substances and methods used, for example in the interaction of B and T cells.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Leukémia, lymfómy, karcinómy a iné zhubné bujnenia sú opísané napríklad vo Wilson a kol. (eds.) Harrison's Principles of Internal medicíne, McGraw-Hill, New York, str. 1599-1612. Jeden z príkladov takých ochorení, malígne lymfómy sú neoplastické transformované bunky, ktoré sa prevažne vyskytujú v lymfoidných tkanivách (napríklad Ňadier L. M. v Harrisonovi). 90 % lymfómov, ktoré nepatria medzi Hodgkinsonove, z ktorých sa v USA vyskytuje približne 30000 nových prípadov ročne, sú B bunkové lymfómy. Menej ako 25 % týchto prípadov sa. lieči. Iným príkladom je leukémia, ktorej sa v USA vyskytuje ročne približne 30000 nových prípadov. Preto je potrebné, aby sa B a T bunkové lymfómy, leukémia, karcinómy a iné zhubné bujnenia liečili efektívnejšie.Leukemia, lymphomas, carcinomas, and other malignancies are described, for example, in Wilson et al. (eds.) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York, p. 1599-1612. One example of such diseases, malignant lymphomas are neoplastic transformed cells that are predominantly found in lymphoid tissues (for example, L. L. M. in Harrison). 90% of non-Hodgkinson lymphomas, of which approximately 30,000 new cases occur annually in the US, are B cell lymphomas. Less than 25% of these cases are. Cures. Another example is leukemia, with approximately 30,000 new cases occurring annually in the United States. Therefore, B and T cell lymphomas, leukemias, carcinomas, and other malignancies need to be treated more effectively.

rr

Rast normálnych kludových B buniek (tiež označovaných ako B lymfocyty) zahŕňa dva rozdielne spôsoby. Prvým kľudové bunky aktivujú prechod z Gq fázy do fázy bunkového cyklu. Viď. napríklad Alberts a kol. (eds. 1989) Molecular Biology of the Celí, Garland Publ., NY a Darnell a kol. (1990) Molecular Celí Biology, Freeman, NY. Ďalej aktivované bunky indukujú proliferáciu. Viď. napríklad Paul, ed. (1989) FundamentalThe growth of normal resting B cells (also referred to as B lymphocytes) involves two different methods. The first resting cells activate the transition from the Gq phase to the cell cycle phase. See. for example, Alberts et al. (eds. 1989) Molecular Biology of the Cell, Garland Publ., NY and Darnell et al. (1990) Molecular Cell Biology, Freeman, NY. Furthermore, activated cells induce proliferation. See. for example, Paul, ed. (1989) Fundamental

Immunology, 2. ed., Raven Press, NY a tretia edícia. Identifikovalo sa niekolko faktorov, ktoré indukujú rast B buniek s obsahom interleukínu-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-10 a IL-13. Okrem toho sa zistilo, že protilátky proti určitým B bunkovým povrchovým molekulám podporujú B bunkovú proliferáciu. U T buniek (tiež označované ako T lymfocyty) tiež indukujú proliferáciu niektoré faktory, ktoré obsahujú fytohemaglutinín, anti-T bunkové receptorové monoklonálne protilátky, anti-CD3 monoklonálne protilátky a iné látky. Rad štúdií zahŕňa molekulu CD40 ako rastový faktorový receptor a dôležitý regulátor ľudskej B bunkovej proliferácie a vývoja. B lymfocyty sú aktivované tak, že príde k interakcii molekuly CD40 na povrchu B lymfocytov s ligandom, čím sa prechodne exprimuje v aktivovanom helperi T buniek.Immunology, 2nd ed., Raven Press, NY and third edition. Several factors have been identified that induce B cell growth containing interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-10, and IL-13. In addition, antibodies against certain B cell surface molecules have been found to promote B cell proliferation. In T cells (also referred to as T lymphocytes), some factors that include phytohemagglutinin, anti-T cell receptor monoclonal antibodies, anti-CD3 monoclonal antibodies and other agents also induce proliferation. A number of studies include the CD40 molecule as a growth factor receptor and an important regulator of human B cell proliferation and development. B lymphocytes are activated by interaction of the CD40 molecule on the surface of B lymphocytes with the ligand, thereby transiently expressing in the activated T cell helper.

CD40 je membránový glykoproteín exprimovaný v normálnych B lymfocytoch a B bunkách zhubných nádorov, intersticiálnych bunkách, folikulárnych dendritických bunkách, tymických epiteliálnych bunkách a iných karcinómoch. Ľudský CD40 bol prvýkrát identifikovaný v roku 1985 ako epitop monoklonálnej protilátky, ktorý sa takmer výhradne exprimoval v B lymfocytoch a preto sa používa ako znak pre B bunky. Ľudský CD40 antigén je 45 až 50 kD glykoproteín. Anti-CD40 protilátky spôsobujú silný kostimulačný signál pre B bunkovú proliferáciu indukovanú acetátom kyseliny forbolmyristovej (PMA), anti-CD20 protilátkami alebo antiimunoglobulínovými protilátkami. Okrem toho anti-ľudské CD40 protilátky s IL-40 na aktivovaných B bunkách tiež spôsobujú rad vplyvov, vrátane krátkodobej replikácie, indukcie syntézy IgE a dlhodobej proliferácie, keď sa kultúry ďalej dopĺňajú CD32 transfektovanými L bunkami.CD40 is a membrane glycoprotein expressed in normal B cells and cancer cells, interstitial cells, follicular dendritic cells, thymic epithelial cells and other carcinomas. Human CD40 was first identified in 1985 as an epitope of a monoclonal antibody that was almost exclusively expressed in B cells and is therefore used as a trait for B cells. The human CD40 antigen is a 45-50 kD glycoprotein. Anti-CD40 antibodies cause a strong costimulatory signal for phorbol myristic acid acetate (PMA) -induced B cell proliferation, anti-CD20 antibodies, or anti-immunoglobulin antibodies. In addition, anti-human CD40 antibodies with IL-40 on activated B cells also cause a variety of effects, including short-term replication, induction of IgE synthesis, and long-term proliferation when cultures are further complemented with CD32 transfected L cells.

B7 (CD80) a B70 (CD86) sú druhou skupinou molekúl, ktoré sprostredkujú pevnú B a T bunkovú interakciu. Tieto molekuly interagujú s ligandami CD28 na B bunkách a CTLA-4 na T bunkách. Tieto interakcie sú hlavnými kostimulačnými signálmi aktivácie B aj T buniek.B7 (CD80) and B70 (CD86) are the second group of molecules that mediate solid B and T cell interaction. These molecules interact with CD28 ligands on B cells and CTLA-4 on T cells. These interactions are the major costimulatory signals of both B and T cell activation.

Počas posledných 15 rokov sa objasnilo, že tieto dvojice povrchových molekúl majú základnú funkciu v aktivácii T a B buniek. Preukázal sa rad in vitro a in vivo pokusov, kde tieto dve dvojice molekúl predstavujú v imunosupresii dôležitú úlohu. Viď. napríklad Banchereau a kol. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12: 881-922, van Kooten a kol. (1996) Adv. Immunol. 61: 1-77Over the past 15 years, it has become clear that these pairs of surface molecules have an essential function in the activation of T and B cells. A number of in vitro and in vivo experiments have been demonstrated where these two pairs of molecules play an important role in immunosuppression. See. for example, Banchereau et al. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12: 881-922, van Kooten et al. (1996) Adv. Immunol. 61: 1-77

Linsley and Ledbetter (1993) Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212.Linsley and Ledbetter (1993) Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212.

Imunosupresia predstavuje velmi dôležitý imunologický zákrok na ochranu a liečenie autoimúnnych chorôb a odmietnutie štepu počas transplantácie. Imunosupresia sa môže dosiahnuť:Immunosuppression is a very important immunological intervention for the protection and treatment of autoimmune diseases and graft rejection during transplantation. Immunosuppression can be achieved by:

a) antiproliferačnými liekmi (cyklofosfamidom, 15-deoxystergualínom atď),(a) antiproliferative medicinal products (cyclophosphamide, 15-deoxystergualin, etc.),

b) glukokortikosteroidmi,(b) glucocorticosteroids;

c) inhibítormi intracelulárnych signalizačných dráh (napríklad cyklosporínom),c) inhibitors of intracellular signaling pathways (e.g. cyclosporine),

d) imunosupresívnymi cytokínmi (napríklad TGF-β, IL-10),d) immunosuppressive cytokines (e.g. TGF-β, IL-10),

e) špecifickou tolerančnou indukciou antigénmi a(e) specific tolerance induction by antigens; and

f) inhibíciou bunkových povrchových molekúl zahrnutých v aktivácii T a B lymfocytov, ako sú CD40/CD40 ligand a B7/B70 s CD28/CTLA-4.f) inhibiting the cell surface molecules involved in the activation of T and B lymphocytes such as CD40 / CD40 ligand and B7 / B70 with CD28 / CTLA-4.

V roku 1995 sa iná molekula, nazvaná ako RP105, klonovala'zo slezinných buniek myši. Napríklad Miyake a kol. (1995) RP105, a novel B celí surface molecule implicated in B celí activation, is a number of the leucine-rich repeat protein family J. Immunol. 154: 3333-3340. Monoklonálna protilátka proti RP105 indukuje silnú proliferáciu myších B buniek a chráni myšie B bunky proti apoptóze indukovanej ožiarením podobným spôsobom ako anti-CD40 protilátka alebo CD40-ligand. Viď. Miyake a kol.In 1995, another molecule, called RP105, was cloned from mouse spleen cells. For example, Miyake et al. (1995) RP105, a novel B cell surface molecule implicated in B cell activation, is a number of the leucine-rich repeat protein family of J. Immunol. 154: 3333-3340. The anti-RP105 monoclonal antibody induces strong proliferation of murine B cells and protects murine B cells from irradiation-induced apoptosis in a manner similar to an anti-CD40 antibody or CD40-ligand. See. Miyake et al.

(1994) Murine B celí proliferation and protection from apoptosis with an antibody againts a 105 kDa molecule: Unresponsiveness of(1994) Murine B cell proliferation and protection from apoptosis with an antibody againts a 105 kDa molecule: Unresponsiveness of

X-linked immunodeficient B cells J. Exp. Med. 180: 1217-1224.X-linked immunodeficient of B cells J. Exp. Med. 180: 1217-1224.

RP105 a jeho údajný ligand môžu byť treťou dvojicou molekúl, ktoré majú dôležitú úlohu v aktivácii T a B buniek. Avšak až dosial nebola ludská sekvencia dostupná a ani jeho štruktúra a aktivity neboli stanovené. Predkladaný vynález poskytuje tento a mnoho iných používaných postupov.RP105 and its alleged ligand may be the third pair of molecules that play an important role in T and B cell activation. However, until now the human sequence has not been available and its structure and activities have not been determined. The present invention provides this and many other methods used.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Predkladaný vynález sa zaoberá zložkami vybranými zo skupiny, ktorá sa skladá: z izolovanej alebo rekombinantnej nukleovej kyseliny, ktoré kódujú ludský BAS-1 proteín alebo jeho fragment, zo značne čistého BAS-1 proteínu alebo jeho peptidu, z fúzneho proteínu, ktorý obsahuje proteínové sekvencie BAS-1 a z protilátky vyvolanej proti rekombinantnému alebo purifikovanému opičiemu BAS-1 proteínu.The present invention relates to components selected from the group consisting of: an isolated or recombinant nucleic acid that encodes a human BAS-1 protein or fragment thereof, a substantially pure BAS-1 protein or peptide thereof, a fusion protein comprising protein sequences BAS-1 and an antibody raised against a recombinant or purified monkey BAS-1 protein.

V prípadoch izolovanej alebo rekombinantnej nukleovej kyseliny, môže táto kyselina obsahovať sekvenciu, ktorá je definovaná v SEKV. ID ČÍS.: 1.In cases of isolated or recombinant nucleic acid, the nucleic acid may comprise a sequence as defined in SEQ. ID NO .: 1.

V prípadoch proteínov, môže byť proteínom značne čistý BAS-1 proteín alebo jeho peptid, môže sa vybrať zo skupiny, ktorá sa skladá z: proteínu alebo peptidu z primátov s obsahom ludského proteínu, proteínu alebo peptidu s obsahom aspoň jedného polypeptidového segmentu definovaného v SEKV. ID ČÍS.: 2, proteínu alebo peptidu, ktorý vykazuje posttranslačný modifikovaný vzor odlišný od prírodného BAS-1 proteínu a proteín, ktorý neobsahuje intracelulárnu doménu BAS-1 a môže to byť látka, ktorá obsahuje proteín a farmaceutický prijatelný nosič.In the case of proteins, the protein may be substantially pure BAS-1 protein or peptide thereof, may be selected from the group consisting of: a protein or peptide from primates containing a human protein, protein or peptide comprising at least one polypeptide segment as defined in SEQ. . SEQ ID NO: 2, a protein or peptide that exhibits a post-translational modified pattern different from the native BAS-1 protein and a protein that does not contain the intracellular domain of BAS-1 and can be a substance that contains a protein and a pharmaceutically acceptable carrier.

V prípadoch protilátky sú zahrnuté tie, kde BAS-1 proteín je opičí proteín, ktorý obsahuje jeden z ľudských proteínov, protilátka je vyvolaná proti peptidu so sekvenciou definovanou v SEKV. ID ČÍS.: 2, protilátka vykazuje Kd aspoň okolo 10 μΜ, protilátkou je monoklonálna protilátka alebo je protilátka značená. Ďalšie prípady zahŕňajú tie, keď protilátka indukuje silnú proliferáciu B buniek alebo chráni B bunky proti apoptóze vyvolanej ožiarením alebo steroidným hormónom.In cases of an antibody, those wherein the BAS-1 protein is a simian protein that contains one of the human proteins are included, the antibody being raised against a peptide of the sequence defined in SEQ. No. 2, the antibody exhibits a Kd of at least about 10 μΜ, the antibody is a monoclonal antibody, or the antibody is labeled. Other cases include those where the antibody induces strong B cell proliferation or protects B cells against radiation or steroid hormone induced apoptosis.

Predkladaný vynález tiež zahŕňa súpravu, ktorá obsahuje napríklad nukleovú kyselinu kódujúcu BAS-1 proteín alebo peptid, značne čistý BAS-1 proteín alebo fragment alebo protilátku alebo receptor, ktorý špecificky viaže BAS-1 proteín. Súprava, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu zahŕňa kódujúcu sekvenciu definovanú v SEKV. ID ČÍS.: 1. Pre súpravu, ktorá obsahuje proteín alebo peptid, sa polypeptid často vyberá zo skupiny, ktorá sa skladá: z proteínu alebo peptidu primáta s obsahom ludského proteínu, proteínu alebo peptidu s obsahom aspoň jedného polypeptidového segmentu definovaného v SEKV. ID ČÍS.: 2 a proteínu alebo peptidu, ktorý vykazuje posttranslačný modifikovaný vzor odlišný od prírodného BAS-1 proteínu.The present invention also encompasses a kit comprising, for example, a nucleic acid encoding a BAS-1 protein or peptide, a substantially pure BAS-1 protein, or a fragment or antibody or receptor that specifically binds a BAS-1 protein. A kit comprising a nucleic acid comprises the coding sequence defined in SEQ. For a kit comprising a protein or peptide, the polypeptide is often selected from the group consisting of: a primate protein or peptide comprising a human protein, protein, or peptide comprising at least one polypeptide segment as defined in SEQ. SEQ ID NO: 2 and a protein or peptide that shows a post-translational modified pattern different from the native BAS-1 protein.

Iná súprava môže zahŕňať protilátku alebo receptor, kde BAS-1 proteín je opičí proteín, ktorý obsahuje jeden z ľudských proteínov. Tvorba protilátky je vyvolaná proti peptidovej sekvencií definovanej v SEKV. ID ČÍS.: 2, protilátka vykazuje Kd aspoň okolo 10 μΜ a je monoklonálnou protilátkou alebo je značená.Another kit may include an antibody or receptor, wherein the BAS-1 protein is a monkey protein that comprises one of the human proteins. Antibody formation is elicited against the peptide sequences defined in SEQ. No. 2, the antibody exhibits a Kd of at least about 10 μΜ and is a monoclonal antibody or is labeled.

Vynález tiež poskytuje spôsob preskúmania vzorky väzbového partnera pre BAS-1 proteín, ktorý zahŕňa postup tvorby purifikovaného alebo rekombinantného BAS-1 proteínu a preskúmania vzorky pre špecifickú väzbu väzbového partnera na BAS-1 proteín. V niektorých prípadoch vzorka obsahuje proteíny z T bunky, dentritickej bunky, ktorá zahŕňa folikulárnu dentritickú bunku alebo obsahuje stromatickú bunku, ktorá zahŕňa väzivovú bunku, endotelovú bunku a epitelovú bunku. V iných prípadoch je väzbovým partnerom protilátka a vzorka je hybridómový supernatant.The invention also provides a method of examining a sample of a binding partner for a BAS-1 protein, which comprises a process for generating purified or recombinant BAS-1 protein and examining a sample for specifically binding a binding partner to a BAS-1 protein. In some instances, the sample comprises proteins from a T cell, a dentritic cell that comprises a follicular dentritic cell, or comprises a stromal cell that includes a connective cell, an endothelial cell, and an epithelial cell. In other cases, the binding partner is an antibody and the sample is a hybridoma supernatant.

Z iného pohľadu predkladaný vynález zahŕňa spôsob modulácie fyziológie alebo vývoja bunky, ktorý obsahuje spojenie bunky s agonistom alebo antagonistom BAS-1 proteínu. Fyziológia je vybraná z: imunosupresie, aktivácie cytotoxickej smrti, modulácie tvorby cytokínu alebo rastu lymfómu. Antagonistom je často protilátka proti opičiemu BAS-1 proteínu. A spôsob môže zahŕňat práve v kombinácii s mediátorom signálu cez antigénový receptor, dráhu ligandu CD40:CD40 alebo dráhu CD28/CTLA-4:B7/B70, napríklad anti-CD3, anti-CD40, ligand anti-CD40, anti-CD28, anti-CTLA-4, anti B7, anti B70 alebo rozpustnú časť vhodne povrchovo značenej molekuly.In another aspect, the present invention encompasses a method of modulating the physiology or development of a cell comprising contacting the cell with an agonist or antagonist of a BAS-1 protein. Physiology is selected from: immunosuppression, activation of cytotoxic death, modulation of cytokine production, or lymphoma growth. Often the antagonist is an antibody against monkey BAS-1 protein. And the method may comprise just in combination with a signal mediator via an antigen receptor, a CD40: CD40 ligand pathway, or a CD28 / CTLA-4: B7 / B70 pathway, e.g., anti-CD3, anti-CD40, anti-CD40 ligand, anti-CD28, anti -CTLA-4, anti B7, anti B70 or a soluble portion of a suitably surface-labeled molecule.

I. VšeobecneI. General

Predkladaný vynález poskytuje aminokyselinovú sekvenciu a sekvenciu DNA ľudského proteínu, ktorý vykazuje vlastnosti aktivovaného antigénu. Tento proteín je označený ako BAS-1 (B celí Activation and Survival antigen-1). Tu opísaná sekvencia primáta bola nájdená až potom, ako bol opísaný myší gén. Viď Miyake a kol. (1995) J. Immunol. 154: 3333-3340. Podobné proteínové sekvencie v iných druhoch primátov by sa tiež mohli použiť. Nižšie uvedené príklady sú, vo vzorových prípadoch, zamerané na opísanú ludskú BAS-1 prírodnú alelu, ale sú rovnako tak aplikovateľné do alelických a/alebo polymorfných variantov, napríklad z iných jedincov, tak ako z variantov upravených zostrihom, napríklad prírodných druhov.The present invention provides an amino acid sequence and a DNA sequence of a human protein having the properties of an activated antigen. This protein is designated BAS-1 (B cell Activation and Survival antigen-1). The primate sequence described herein was found only after the mouse gene had been described. See Miyake et al. (1995) J. Immunol. 154: 3333-3340. Similar protein sequences in other primate species could also be used. The examples below are, in exemplary cases, directed to the described human BAS-1 natural allele, but are equally applicable to allelic and / or polymorphic variants, e.g.

zfrom

Tieto gény umožňujú izoláciu iných opičích génov kódujúcich proteíny podobné tomuto, ďalej rozširujú skupinu mimo opísaných špecifických prípadov. Spôsob je podrobne opísaný nižšie.These genes allow the isolation of other monkey genes encoding proteins similar to this, further extending the group beyond the specific cases described. The method is described in detail below.

Ľudský BAS-1 je takto nazvaný podľa jeho biologickej aktivity. Monoklonálna protilátka proti myšiemu homológu RP105 indukuje silnú proliferáciu myších B buniek a chráni myšieHuman BAS-1 is so named according to its biological activity. Monoclonal antibody against mouse homologue RP105 induces strong proliferation of mouse B cells and protects mice

B bunky proti apoptóze indukovanej ožiarením podobným spôsobom ako anti-CD40 protilátka alebo CD40-ligand.B cells against radiation-induced apoptosis in a similar manner to an anti-CD40 antibody or CD40-ligand.

ľudská BA$-1 cDNA sa izolovala s použitím sekvencie nukleovej kyseliny, založenej na sekvencií myšieho RP105. Analýza príslušného kódovaného proteínu naznačuje, že íudský BAS-1 patrí do skupiny proteínov, ktoré obsahujú úsek bohatý na leucín. Iný zástupcovia tejto skupiny zahŕňajú CD14-LPS receptor, FSN/LH/TSH receptory a neurotropné receptory. Predpokladá sa, že sú tieto receptory zahrnuté v signálnej transdukcii.human BA $ -1 cDNA was isolated using a nucleic acid sequence based on the murine RP105 sequence. Analysis of the respective encoded protein indicates that human BAS-1 belongs to a family of proteins that contain a leucine-rich region. Other representatives of this group include the CD14-LPS receptor, FSN / LH / TSH receptors, and neurotrophic receptors. These receptors are believed to be involved in signal transduction.

ľudská BAS-1 cDNA bola odvodená s použitím sekvencií radu oblastí myšieho RP105. Porovnanie homológie otvorených čítacích rámcov medzi myším a ludským BAS-1 ukazuje priližne 67 % homológiu DNA sekvencie a približne 73 % zhodnosť aminokyselinovej sekvencie s myším RP105. ľudský BAS-1 môže mať značnú úlohu vo vonkajšom imunitnom systéme, napríklad vo bunkách.human BAS-1 cDNA was derived using sequences of a number of murine RP105 regions. Comparison of the open reading frame homology between mouse and human BAS-1 shows approximately 67% DNA sequence homology and approximately 73% amino acid sequence identity to mouse RP105. human BAS-1 may play a significant role in the external immune system, for example, in cells.

vývojovej regulácii v iných (1991) Developmental Biology Sunderland, MA, Browder a kol. ed.), Saunders, Philadelphia,Developmental Biology Sunderland, MA, Browder et al. ed.), Saunders, Philadelphia,

Viď. napríklad Gilbert (3. ed.), Sinauer Associates, (1991) Developmental Biology (3. PA., Russo a kol. (1992)See. e.g. Gilbert (3rd ed.), Sinauer Associates, (1991) Developmental Biology (3rd PA., Russo et al. (1992)

Development: The Molecular Genetic Approach, Springer-Verlag, New York, N.Y. a Wilkins (1993) Genetic Analysis Development (2. ed.) Wiley-Liss, New York, N.Y. Identifikácia ligandu pre íudský BAS-1 môže zodpovedať niektoré otázky, ktoré sa naskytli týmto pozorovaním.Development: The Molecular Genetic Approach, Springer-Verlag, New York, N.Y. and Wilkins (1993) Genetic Analysis Development (2nd ed.) Wiley-Liss, New York, N.Y. The identification of the ligand for human BAS-1 may answer some of the questions raised by this observation.

II. Purifikovaný ludský BAS-1 proteín.II. Purified human BAS-1 protein.

SEKV. ID ČÍS.: 1 opisuje nukleotidovú sekvenciu cDNA a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu. Aminokyselinovú sekvenciu tiež vyjadruje SEKV. ID ČÍS.: 2. Domnievame sa, že signálna sekvencia ide od Met (1) po Val (20), N-koniec, ktorý obsahuje na asparagíne (zvyšok 34, 53) dve potenciálne N-väzbové glykozylované miesta, ide od Cys (28) po Leu (58), tandemové repetície oblasti bohatej na leucín, ktorá obsahuje potenciálnych miest pre N-väzbovú glykozyláciu na asparagíne (zvyšky 70, 78, 201, 234, 244, 394, 402, 451 a 573), ide od Thr (55) po Tyr (592). C-lemovacia oblast ide od Leu (574) po Cys (625), transmembránová oblast je od Ala (629) po Val (650), intracelulárna oblast,¹ ktorá obsahuje dve potenciálne fosforylované miesta na tyrozíne (652 a 658), ide od Lys (651) po Phe (661).SEQ. SEQ ID NO: 1 describes the nucleotide sequence of the cDNA and the corresponding amino acid sequence. The amino acid sequence is also expressed in SEQ. The signal sequence is from Met (1) to Val (20), the N-terminus containing two potential N-linked glycosylated sites on the asparagine (residue 34, 53) from Cys ( 28) after Leu (58), a tandem repeat of the leucine rich region containing potential sites for N-linked glycosylation on asparagine (residues 70, 78, 201, 234, 244, 394, 402, 451 and 573), from Thr (55) to Tyr (592). The C-flanking region extends from Leu (574) to Cys (625), the transmembrane region extends from Ala (629) to Val (650), an intracellular region ¹ containing two potentially phosphorylated sites on tyrosine (652 and 658). Lys (651) after Phe (661).

Nasledujúca tabuľka zobrazuje zoradenie repetícií bohatých na leucín ľudského BAS-1 proteínu opísaného v SEKV. ID ČÍS.: 2.The following table shows the alignment of leucine-rich repeats of the human BAS-1 protein described in SEQ. ID NO .: 2.

Tabuľka 1Table 1

C 1 IC 1 I

LXXLXLXXNXLXXLXXXXXXXLXX konsenzus:LXXLXLXXNXLXXLXXXXXXXLXX Consensus:

1: 1: 55-78 55-78 2: 2: 79-102 79-102 3 : 3: 103-126 103-126 4 : 4: 127-150 127-150 5: 5: 151-174 151-174 6: 6: 175-198 175-198 7: 7: 199-223 199-223 8: 8: 224-246 224-246 9: 9: 247-275 247-275 10 10 276-299 276-299 11 11 300-322 300-322 12 12 323-346 323-346 13 13 347-371 347-371 14 14 372-397 372-397 15 15 398-421 398-421 16 16 422-446 422-446 17 17 447-470 447-470 18 18 471-497 471-497 19 19 498-521 498-521 20 20 522-544 522-544 21 21 545-568 545-568 22 22 569-592 569-592

TEFLEFSFNFLPTIHNRTFSRLMNTEFLEFSFNFLPTIHNRTFSRLMN

LTFLDLTRCQINWIPEDTFQSHHQLTFLDLTRCQINWIPEDTFQSHHQ

LSTLWTGNPLIFMAETSLNGPKSLSTLWTGNPLIFMAETSLNGPKS

LKHLFLIQTGISNLEFIPVHNLENLKHLFLIQTGISNLEFIPVHNLEN

LESLYLGSNHISSIKFPKDFPARNLESLYLGSNHISSIKFPKDFPARN

LKVLDFQNNAIHYISREDMRSLEQLKVLDFQNNAIHYISREDMRSLEQ

AINLSLNFNGNN-ÄZKGIELGAFDSTVAINLSLNFNGNN-ÄZKGIELGAFDSTV

FQSLNFGGTPNL-SVIFNGLQNSTFQSLNFGGTPNL-SVIFNGLQNST

TQSLWLGTFEDIDDEDI SS AMLKGLCEMSTQSLWLGTFEDIDDEDI SS AMLKGLCEMS

VESLNLQEHRFSDISSTTFQCFTQVESLNLQEHRFSDISSTTFQCFTQ

LQELDLTATHLKGLPSGMKG -LNLLQELDLTATHLKGLPSGMKG -LNL

LKKLVLSVNHFDQLCQISAANFPSLKKLVLSVNHFDQLCQISAANFPS

LTHLYIRGN-VKKLHLGVGC -LEKLGNLTHLYIRGN-VKKLHLGVGC -LEKLGN

LQTLDLSHNDJľEASDCCSLQ-LKNLSHLQTLDLSHNDJľEASDCCSLQ-LKNLSH

LQTLŇLSHNEPLGLQSQAFKECPQLQTLŇLSHNEPLGLQSQAFKECPQ

LELLDLAFTRLHINAPQSPFQNLHFLELLDLAFTRLHINAPQSPFQNLHF

LQVLNLTYQFLDTSNQHLLAGLPVLQVLNLTYQFLDTSNQHLLAGLPV

LRHLNLKGNHFQDGTITKTNLLQ'l VG SLRHLNLKGNHFQDGTITKTNLLQ'l VG S

LEVLILSSCGLLSIDQQAFHSLGKLEVLILSSCGLLSIDQQAFHSLGK

MSHVDLSHNSLTCDSIDSLSHLKMSHVDLSHNSLTCDSIDSLSHLK

GIYLNLAANSINIISPRLLPILSQGIYLNLAANSINIISPRLLPILSQ

QSTINLSHNPLDCTCSNIHF-LTWYQSTINLSHNPLDCTCSNIHF-LTWY

V súvislosti s proteínom sa, tu používaný termín ludský BAS-l, odkazuje na proteín s aminokyselinovou sekvenciou opísanou v SEKV. ID ČíS.: 2. Predkladaný vynález tiež zahŕňa proteíny, ktoré obsahujú jeho veíký fragment, napríklad mutanty a polymorfné varianty, spoločne so získaným íudským polypeptidom, ktorý vykazuje zhodné biologické funkcie alebo interakcie s väzbovými zložkami špecifickými k ľudskému BAS-l. Tieto väzbové zložky sa typicky viažu na ludský BAS-l s vysokou afinitou, napríklad aspoň 100 nM, obvykle lepšie ako 30 nM, častejšie lepšie ako 10 nM a najčastejšie lepšie ako 3 nM. Homológne proteíny sa nachádzajú v iných druhoch ako ľudských, napríklad u primátov.In the context of a protein, the term human BAS-1 as used herein refers to a protein having the amino acid sequence described in SEQ. 2. The present invention also encompasses proteins comprising a large fragment thereof, for example, mutants and polymorphic variants, together with the obtained human polypeptide that exhibits identical biological functions or interactions with binding components specific for human BAS-1. These binding components typically bind to human BAS-1 with high affinity, for example at least 100 nM, usually better than 30 nM, more often better than 10 nM, and most often better than 3 nM. Homologous proteins are found in non-human species, for example, primates.

Tu používaný termín polypeptid vyjadruje fragment alebo segment a zahŕňa úsek aminokyselinových zvyškov aspoň 8 aminokyselín, vo všeobecnosti aspoň 10 aminokyselín, najvšeobecnejšie aspoň 12 aminokyselín, často aspoň 14 aminokyselín, častejšie aspoň 16 aminokyselín, typicky aspoň 20 aminokyselín, obvykle aspoň 22 aminokyselín, častejšie aspoň 24 aminokyselín, lepšie aspoň 26 aminokyselín, častejšie aspoň 28 aminokyselín a čiastočne uprednostňované aspoň 30 alebo viac aminokyselín, napríklad 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57 atď.As used herein, a polypeptide refers to a fragment or segment and includes a stretch of amino acid residues of at least 8 amino acids, generally at least 10 amino acids, most generally at least 12 amino acids, often at least 14 amino acids, more often at least 16 amino acids, typically at least 20 amino acids. 24 amino acids, preferably at least 26 amino acids, more often at least 28 amino acids, and partially preferred at least 30 or more amino acids, for example 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, etc.

Termín ligand alebo väzbová zložka sa odkazuje na molekuly, ktoré sa špecificky viažu na BAS-l, napríklad protilátka-antigén. Iné interakcie zahŕňajú napríklad typ ligand-receptor, alebo s látkami, ktoré sa spájajú s BAS-l, napríklad v interakcii proteín-proteín, buď kovalentnou alebo nekovalentnou väzbou. Molekula môže byt polymér alebo chemické činidlo. Žiadny iný náznak pokiaí ide o to, či je BAS-l v interakcii ligand-receptor buď ligand alebo receptor, nie je uvedený, len to, že interakcia vykazuje špecifickú afinitu. Funkčným analógom môže byt ligand so štruktúrnymi modifikáciami alebo úplne iná molekula v takom molekulovom tvare, ktorý reaguje s vhodným ligandovým väzbovým determinantom. Ligandy môžu slúžiť ako agonisty alebo antagonisty, viď. napríklad Goodman a kol.The term ligand or binding moiety refers to molecules that specifically bind to BAS-1, for example, an antibody-antigen. Other interactions include, for example, the ligand-receptor type, or substances that associate with BAS-1, for example, in a protein-protein interaction, either by covalent or non-covalent binding. The molecule may be a polymer or a chemical agent. No other indication as to whether BAS-1 is in the ligand-receptor interaction of either the ligand or the receptor is indicated, merely that the interaction exhibits a specific affinity. The functional analog may be a ligand with structural modifications or a completely different molecule in a molecular shape that reacts with a suitable ligand binding determinant. Ligands can serve as agonists or antagonists, see. for example, Goodman et al.

(eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. ed.), Pergamon Press.(eds.) (1990) Goodman and Gilman ' s: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.), Pergamon Press.

Rozpustnosť polypeptidu a fragmentu záleží na prostredí a polypeptide. Rozpustnosť je ovplyvnená mnohými faktormi, napríklad teplotou, prostredím elektrolytu, velkosťou a molekulárnymi vlastnosťami polypeptidu a pôvodom rozpúšťadla. Bežne je teplota, pri ktorej sa polypeptid používa, v rozsahu od 4 ’C do 65 ’C. Obvykle sa používa teplota vyššia ako 18 ’C a častejšie je vyššia ako 22 ’C. Na diagnostické účely sa obvykle používa izbová teplota alebo teplejšia, ale pri stanovení sa používa teplota nižšia ako je denaturačná teplota zložiek. Na terapeutické účely sa obvykle používa telesná teplota, typická pre ludí je 37 ’C, aj keď za určitých situácií môže byt vyššia alebo nižšia in situ alebo in vitro.The solubility of the polypeptide and fragment depends on the environment and the polypeptide. Solubility is influenced by many factors, such as temperature, electrolyte environment, size and molecular properties of the polypeptide, and solvent origin. Typically, the temperature at which the polypeptide is used ranges from 4 ° C to 65 ° C. Usually a temperature above 18 C is used and more often it is higher than 22 C. C. For diagnostic purposes, usually room temperature or warmer is used, but the assay uses a temperature below the denaturation temperature of the components. For therapeutic purposes, body temperature is typically used, typically about 37 ° C, although in certain situations it may be higher or lower in situ or in vitro.

Elektrolyty sa obvykle blížia in situ k fyziologickým podmienkam, ale môžu sa modifikovať na vyššiu alebo nižšiu iónovú silu, ktorá je výhodná. Konkrétne ióny sa môžu modifikovat, aby sa upravili na štandardné pufre používané vo fyziologických alebo analytických podmienkach. Veľkosť a štruktúra polypeptidu by mala byť obvykle v dostatočne stabilnom stave, v žiadnom prípade v denaturovanej forme. Polypeptid môže byt spojený s inými polypeptidmi za vzniku kvartérnej štruktúry, napríklad na umožnenie rozpustnosti, alebo spojený s lipidmi alebo detergentmi spôsobom, ktorý je podobný prírodnej lipidovej dvojvrstve. Predovšetkým sa zdá, že prírodný proteín je často spojený s lipidom PI väzbou.Electrolytes usually approach in situ physiological conditions, but may be modified to a higher or lower ionic strength, which is preferred. Particular ions may be modified to adjust to standard buffers used under physiological or analytical conditions. The size and structure of the polypeptide should usually be in a sufficiently stable state, in any case in denatured form. The polypeptide may be coupled to other polypeptides to form a quaternary structure, for example, to allow solubility, or coupled to lipids or detergents in a manner similar to a natural lipid bilayer. In particular, it appears that the natural protein is often linked to the lipid by PI binding.

Rozpúšťadlo je obvykle biologicky kompatibilný pufor používaný na zachovanie biologických aktivít a je obvykle upravený fyziologickým rozpúšťadlom. Rozpúšťadlo má bežne neutrálne pH medzi 5a 10, ale lepšie okolo 7,5. V niektorých prípadoch sa pridáva mierny nedenaturovaný detergent, napríklad CHS (cholesteryl hemisukcinát) alebo CHAPS (3-([3-cholamidopropyl]dimetylamonio)-l-propánsulfonát) alebo sa pridá v dostatočne nízkej koncentrácii, aby nenarušil terciárnu štruktúru proteínu.The solvent is usually a biocompatible buffer used to maintain biological activities and is usually treated with a physiological solvent. The solvent typically has a neutral pH between 5 and 10, but preferably about 7.5. In some cases, a mild, non-denatured detergent such as CHS (cholesteryl hemisuccinate) or CHAPS (3 - ([3-cholamidopropyl] dimethylammonio) -1-propanesulfonate) is added or added at a sufficiently low concentration not to disrupt the tertiary structure of the protein.

Rozpustnosť je vyjadrená sedimentáciou meranou v Sedbergových jednotkách, ktoré sú za konkrétnych podmienok mierou sedimentačnej rýchlosti molekuly. Stanovenie sedimentačnej rýchlosti sa klasicky uskutočnilo v analytickej ultracentrifúge, ale teraz sa bežne uskutočňuje v štandardnej centrifúge. Viď. Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2. ed.), W. H. Freeman a Cantor and Schimel (1980) Biophysical Chemistry, časť 1 až 3, W. H. Preeman & Co., San Francisko. Po približnom stanovení sa vzorka, ktorá obsahuje údajne rozpustný polypeptid, stočí v štandardnej ultracentrifúge pri 50 K rpm 10 minút a rozpustné molekuly zostanú v supernatante. Rozpustné častice alebo polypeptid budú menej ako 30 S, bežne menej ako 15 S, obvykle menej ako 10 S, často menej ako 6 S, najmä častejšie menej ako 4 S a najčastejšie menej ako 3 S.Solubility is expressed by sedimentation measured in Sedberg units, which under specific conditions is a measure of the sedimentation rate of a molecule. The determination of sedimentation rate was classically performed in an analytical ultracentrifuge, but is now commonly performed in a standard centrifuge. See. Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2nd ed.), W. H. Freeman and Cantor and Schimel (1980) Biophysical Chemistry, parts 1 to 3, W. H. Preeman & Co., San Francisco. After approximate determination, a sample containing the allegedly soluble polypeptide is centrifuged in a standard ultracentrifuge at 50 K rpm for 10 minutes and the soluble molecules remain in the supernatant. The soluble particles or polypeptide will be less than 30 S, typically less than 15 S, usually less than 10 S, often less than 6 S, particularly more often less than 4 S, and most often less than 3 S.

III. Fyzikálne variantyIII. Physical variants

Tento vynález tiež zahŕňa proteíny alebo peptidy so značne zhodnou aminokyselinovou sekvenciou, ako je aminokyselinová sekvencia ludského BAS-1. Obsahuje napríklad jedno-, dvoja trojvlásenkové konzervatívne substitúcie. Vhodnejšia je substitúcia mimo konzervatívnych cysteínov a občas je mimo oblasť helikálnej štruktúrnej domény. Také varianty sa môžu používať na tvorbu špecifických protilátok a často spolu majú vela alebo všetky biologické vlastnosti. Zhodnosť aminokyselinovej sekvencie je stanovená optimalizovaním zvyškových zodpovedajúcich častí. Tie sa zmenia kedykolvek vzhladom na konzervatívne substitúcie. Konzervatívna substitúcia bežne zahŕňa substitúcie v nasledujúcich skupinách: glycín, alanín; valín, izoleucín, leucín; aspartámová kyselina, glutámová kyselina; asparagín, glutamín; serín, treonín; lyzín, arginín a fenylalanín, tyrozín. Predpokladá sa, že podobné aminokyselinové sekvencie zahŕňajú v jednotlivých proteínových sekvenciách prírodné alelické varianty. Bežné homológne proteíny alebo peptidy môžu mat s aminokyselinovou sekvenciou ľudského BAS-1 85 až 100 % zhodnosť (ak sú uvedené medzery) a do 90 až 100 % (ak je zahrnutá konzervatívna substitúcia). Stupeň zhodnosti je aspoň okolo 85 %, vo všeobecnosti okolo 87 %, často aspoň okolo 89 %, bežne aspoň 91 %, obvykle aspoň okolo 93 %, častejšie aspoň okolo 95 %, lepšie aspoň okolo 97 % a najčastejšie aspoň okolo 98 % a najmä najlepšie aspoň okolo 99 % alebo viac. Viď. tiež Needleham a kol. (1970) 48: 443-453, Sankoff a kol. (1983) kapitola prvá v Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Addison - Wesley, Reading, MA a Software od IntelliGenetics, Mountain View, CA a University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.The invention also encompasses proteins or peptides with a substantially identical amino acid sequence, such as the human BAS-1 amino acid sequence. It contains, for example, one-, two-, three-haired, conservative substitutions. More preferably, the substitution is outside the conserved cysteines and is occasionally outside the region of the helical structural domain. Such variants can be used to generate specific antibodies and often have a lot or all of the biological properties together. The amino acid sequence identity is determined by optimizing the residual corresponding portions. These will change at any time with respect to conservative substitutions. Conservative substitutions commonly include substitutions in the following groups: glycine, alanine; valine, isoleucine, leucine; aspartic acid, glutamic acid; asparagine, glutamine; serine, threonine; lysine, arginine and phenylalanine, tyrosine. Similar amino acid sequences are believed to include natural allelic variants in individual protein sequences. Conventional homologous proteins or peptides may have 85-100% identity (when gaps are indicated) and up to 90-100% (if conservative substitution is included) with the human BAS-1 amino acid sequence. The degree of identity is at least about 85%, generally about 87%, often at least about 89%, typically at least 91%, usually at least about 93%, more often at least about 95%, more preferably at least about 97%, and most often at least about 98%, and especially preferably at least about 99% or more. See. also Needleham et al. (1970) 48: 443-453, Sankoff et al. (1983) Chapter One in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: Theory and Practice of Sequence Comparison Addison - Wesley, Reading, MA and Software from IntelliGenetics, Mountain View, CA and the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

predeterminované proteínu alebopre - determined protein or

Vyizolovaná ludská BAS-1 DNA sa môže ľahko modifikovať substitúciou nukleotidov, nukleotidovou deléciou, inzerciou a inverziou nukleotidového úseku. Výsledkom týchto modifikácií budú nové DNA sekvencie, ktoré kódujú užitočné antigény, ich deriváty alebo proteíny s podobnou alebo opačnou aktivitou. Tieto modifikované sekvencie sa môžu použiť na tvorbu mutantných antigénov alebo zosilňovať expresiu. Zosilnenie expresie môže zahŕňať génovú amplifikáciu, zvýšenú transkripciu, transláciu a ďalšie mechanizmy. Mutantné BAS-1 deriváty obsahujú alebo miestne špecifické mutácie príslušného jeho fragmentov. Mutant BAS-1 obsahuje polypeptid, ktorý inak zahŕňa dôležitú črtu ľudského BAS-1, ako je uvedené vyššie, ale má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši od pôvodného BAS-1, čo je spôsobené deléciou, substitúciou alebo inzerciou. Najmä miestne špecifický mutant BAS-1 je definovaný tak, že je homológny s antigénom opísariym v SEKV. ID ČÍS.: 2 a tak má s týmto antigénom rad biologických aktivít. Podobné poňatia sa vzťahujú na rôzne BAS-1 proteíny, najmä tie, ktoré sú už nájdené v rôznych iných primátoch. Ako bolo skôr uvedené a zdôraznené, príklady vo všeobecnosti uvádzajú ďalšie BAS-1 proteíny, ktoré sa výhradne neobmedzujú na konkrétne diskutované ľudské prípady.The isolated human BAS-1 DNA can be readily modified by nucleotide substitution, nucleotide deletion, insertion, and inversion of the nucleotide region. These modifications will result in new DNA sequences that encode useful antigens, derivatives thereof, or proteins with similar or opposite activity. These modified sequences can be used to generate mutant antigens or enhance expression. Enhancement of expression may include gene amplification, increased transcription, translation, and other mechanisms. Mutant BAS-1 derivatives contain or site specific mutations of the respective fragments thereof. The BAS-1 mutant comprises a polypeptide that otherwise includes an important feature of human BAS-1 as described above, but has an amino acid sequence that differs from the original BAS-1 due to deletion, substitution, or insertion. In particular, the site-specific mutant BAS-1 is defined to be homologous to the antigen described in SEQ. It has a number of biological activities with this antigen. Similar concepts apply to various BAS-1 proteins, especially those already found in various other primates. As mentioned and emphasized above, the examples generally disclose other BAS-1 proteins, which are not exclusively limited to the specific human cases discussed.

Aj keď sú miesta miestne špecifickej mutácie predeterminované, mutanty nemusia byt miestne špecifické. Mutagenézia ľudského BAS-1 môže byt spôsobená inzerciou alebo deléciou aminokyseliny. Substitúcia, delécia, inzercia alebo iné kombinácie môžu byt generované, aby sa dosiahla konečná podoba. Inzercia zahŕňa spojenie N- a C-konca. Náhodná mutagenéza môže viest k cieľovému kodónu a potom sa môže u exprimovaných mutantov skúmat požadovaná aktivita. Spôsoby substituovaných mutácií na vopred určených miestach DNA so známou sekvenciou sú v odbore dobre známe, napríklad mutagenéza M13 priméru. Viď. tiež Sambrook a kol. (1989) a Ausubel a kol. (1987 a doplnok).Although site-specific mutation sites are predetermined, the mutants need not be site-specific. Mutagenesis of human BAS-1 may be due to amino acid insertion or deletion. A substitution, deletion, insertion or other combination may be generated to achieve the final form. The insertion includes the N- and C-terminal junction. Random mutagenesis can result in a target codon and then the desired activity can be examined for the expressed mutants. Methods of substituted mutations at predetermined DNA sites of known sequence are well known in the art, for example, mutagenesis of the M13 primer. See. also Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1987 et al.).

Mutáciou DNA by sa bežne nepremiestnila kódujúca sekvencia mimo čítací rámec a lepšie sa nevytvorí komplementárna oblast, ktorá by mohla hybridizovat za vzniku sekundárnej mRNA štruktúry, ako sú slučky alebo vlásenky.Mutation of the DNA would normally not move the coding sequence out of the reading frame and better create a complementary region that could hybridize to form a secondary mRNA structure, such as loops or hairpins.

Predkladaný vynález tiež zahŕňa rekombinantná proteíny, napríklad heterológnu fúziu proteínmi, ktorá využíva segmenty z týchto proteínov. Heterológna fúzia proteínov je taká fúzia proteínov alebo segmentov, ktoré obvykle nefúzujú rovnakým spôsobom. A tak je produktom fúzie imunoglobulínu s BAS-1 polypeptidom spojená molekula so sekvenciou, ktorá vznikne charakteristickou peptidovou väzbou. Molekula je typicky vytvorená ako jednoduchý translačný produkt a vykazuje vlastnosti, ktoré pochádzajú z obidvoch peptidových zdrojov. Podobné poňatie sa aplikuje aj na heterológne sekvencie nukleovej kyseliny.The present invention also encompasses recombinant proteins, for example, heterologous fusion of proteins that utilizes segments of these proteins. A heterologous protein fusion is a fusion of proteins or segments that usually do not fuse in the same manner. Thus, the fusion product of an immunoglobulin to a BAS-1 polypeptide is linked to a molecule that results from a characteristic peptide bond. The molecule is typically constructed as a simple translation product and exhibits properties that originate from both peptide sources. A similar approach applies to heterologous nucleic acid sequences.

Okrem toho môže nový konštrukt vzniknúť kombináciou podobných funkčných domén z iných proteínov. Napríklad segmenty, ktoré viažu ligand alebo iné segmenty, sa môžu vymeniť s rôznymi novými fúznymi polypeptidmi alebo fragmentárni. Viď. napríklad Cunningham a kol. (1989) Science 243: 1330-1336 a O'Dowd a kol. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. Nové chimerické polypeptidy vykazujú nové kombinácie špecifít, ktoré sú výsledkom funkčnej väzby špecifít, ktoré viažu ligand a iných funkčných domén.In addition, the new construct may be formed by combining similar functional domains from other proteins. For example, segments that bind ligand or other segments may be exchanged with various novel fusion polypeptides or fragmentary. See. for example, Cunningham et al. (1989) Science 243: 1330-1336 and O'Dowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. The novel chimeric polypeptides exhibit novel combinations of specificities that result from functional binding of ligand-binding specificities and other functional domains.

Fosforamiditovým spôsobom opísaným Breaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, vznikajú vhodné syntetické DNA fragmenty. Dvojreťazcový fragment sa často získava buď syntézou komplementárneho reťazca a súčasne za vhodných podmienok teplotnou hybridizáciou reťazca alebo pridaním komplementárneho reťazca k vhodnému priméru s použitím DNA polymerázy.The phosphoramidite method described by Breaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, suitable synthetic DNA fragments are produced. The double stranded fragment is often obtained either by synthesis of the complementary strand and at the same time under appropriate conditions by thermal hybridization of the strand or by adding the complementary strand to a suitable primer using DNA polymerase.

IV. Funkčné variantyIV. Functional variants

Blokácia fyziologickej odpovede na BAS-1 antigény môže vyplývať z inhibície väzby ligandu na BAS-1, pravdepodobne kompetitívnou inhibíciou. Teda pri stanovení in vitro predkladaného vynálezu sa bude často používať izolovaný proteín, membrány z buniek, ktoré exprimujú rekombinantný BAS-1, rozpustné fragmenty, ktoré obsahujú .segmenty viažuce ligand týchto antigénov alebo fragmenty upevnené na tuhej fáze substrátov. Tieto stanovenia budú tiež pripúšťať pri diagnostickom stanovení vplyvy buď mutáciou a modifikáciou väzbového segmentu alebo mutáciou a modifikáciou ligandu, napríklad analógy ligandu.Blocking the physiological response to BAS-1 antigens may result from inhibition of ligand binding to BAS-1, presumably by competitive inhibition. Thus, in vitro assays of the present invention will often use isolated protein, membranes from cells that express recombinant BAS-1, soluble fragments that contain ligand binding segments of these antigens, or fragments attached to solid phase substrates. These assays will also allow for diagnostic determinations of effects either by mutation and modification of the binding segment or by mutation and modification of a ligand, for example, ligand analogs.

Vynález tiež pozoruje použitie preskúmavania kompetitívneho liečiva, kde napríklad neutralizujúce protilátky proti antigénu alebo antigénovým fragmentom súťažia s testovanou látkou o väzbu na proteín. Takto sa môžu použiť protilátky na detekciu prítomnosti niektorých polypeptidov, ktoré majú jedno alebo viacero miest antigénu a tiež sa môžu použiť na obsadenie väzbových miest na proteíne, ktoré môžu byť inak obsadené ligandom.The invention also observes the use of competitive drug screening, where, for example, neutralizing antibodies against antigen or antigenic fragments compete with the test substance for protein binding. Thus, antibodies can be used to detect the presence of certain polypeptides having one or more antigen sites and also can be used to occupy protein binding sites that may otherwise be occupied by a ligand.

Navyše, neutralizačné protilátky proti BAS-1 a jeho rozpustnému fragmentu, ktorý obsahuje vysoko afinitné väzbové miesto, sa môžu použiť na inhibíciu funkcie ligandu v tkanivách, napríklad tkanivách, ktoré podstupujú abnormálnu fyziológiu.In addition, neutralizing antibodies against BAS-1 and a soluble fragment thereof containing a high affinity binding site can be used to inhibit ligand function in tissues, for example, tissues that undergo abnormal physiology.

Deriváty BAS-1 antigénov obsahujú aminokyselinové mutanty, glykozylované varianty a kovalentné konjugáty alebo konjugáty spojené s inými chemickými zložkami. Kovalentné deriváty sa môžu pripraviť väzbou funkčných skupín, ktoré sa nachádzajú na aminokyselinovom mieste reťazcov BAS-1 antigénu alebo na N- alebo C-konci polypeptidu spôsobom, ktorý je v odbore dobre známy. Tieto deriváty môžu zahŕňať bez obmedzenia alifatické estery alebo amidy na C-konci polypeptidov alebo zvyšky, ktoré obsahujú karboxylové miesto reťazcov, O-acylové deriváty hydroxylových skupín, ktoré obsahujú zvyšky, a N-acylové deriváty N-konca aminokyselín alebo aminoskupinu, ktorá obsahuje zvyšky, napríklad lyzín alebo arginín. Acylové skupiny pochádzajú z alkylových skupín, ktoré obsahujú C_g až C_lg alkyl, čím sa tvoria alkanoylaroylové druhy. Najmä sú tu zahrnuté glykozylové úpravy, napríklad modifikácia glykozylového vzoru polypeptidu počas jeho syntézy a postupu alebo iné spôsoby. Mimoriadne vhodným spôsobom na toto uskutočnenie je pôsobenie glykozylačných enzýmov získaných z buniek, ktoré obvykle zabezpečujú tento proces, napríklad ľudské glykozylačné enzýmy. Tiež sa študujú deglykozylačné enzýmy. Vynález tiež zahŕňa variant rovnakej primárnej aminokyselinovej sekvencie, ktorá je trochu modifikovaná a obsahuje fosforylované aminokyselinové zvyšky, napríklad fosfotyrozín, fosfoserín alebo fosfotreonín.Derivatives of BAS-1 antigens include amino acid mutants, glycosylated variants, and covalent conjugates or conjugates associated with other chemical components. Covalent derivatives may be prepared by linking functional groups found at the amino acid site of the BAS-1 antigen chains or at the N- or C-terminus of the polypeptide in a manner well known in the art. These derivatives may include, without limitation, aliphatic esters or amides at the C-terminus of polypeptides or residues that contain a carboxyl site of the chains, O-acyl derivatives of hydroxyl groups that contain residues, and N-acyl derivatives of the N-terminus of amino acids or amino groups that contain residues. , such as lysine or arginine. The acyl groups derived from alkyl groups containing C _g to C _g alkyl, thereby forming alkanoyl aroyl species is. Particularly included herein are glycosyl modifications, for example, modification of the glycosyl pattern of a polypeptide during its synthesis and process, or other methods. A particularly suitable method for this embodiment is the action of glycosylation enzymes derived from cells that usually carry out this process, for example human glycosylation enzymes. Deglycosylation enzymes are also studied. The invention also encompasses a variant of the same primary amino acid sequence that is somewhat modified and contains phosphorylated amino acid residues, for example phosphotyrosine, phosphoserine or phosphotreonine.

Hlavnou skupinou derivátov sú kovalentné konjugáty BAS-1 antigénov alebo jeho fragmentov s inými polypeptidovými proteínmi. Tieto deriváty sa môžu syntetizovať v rekombinantnéj kultúre, ako sú N- a C-koncová fúzia alebo použitím činidiel známych v odbore pre ich užitočnosť v zosieťovaných proteínoch ha reaktívnych miestach skupín. Vhodnejšie miesta na derivatizáciu ligandov so zosietovacími činidlami sú na voľných aminoskupinách, uhľovodíkových častiach a cysteínových zvyškoch.A major group of derivatives are covalent conjugates of BAS-1 antigens or fragments thereof with other polypeptide proteins. These derivatives can be synthesized in recombinant culture, such as N- and C-terminal fusions, or using reagents known in the art for their utility in cross-linked proteins and reactive sites of groups. More suitable sites for derivatizing ligands with crosslinking agents are on the free amino groups, hydrocarbon moieties, and cysteine residues.

Tiež sa uskutočnila fúzia polypeptidov medzi BAS-1 antigénmi a inými homológnymi a heterológnymi proteínmi. Homológne proteíny môžu byť spojené s rôznymi povrchovými vzormi, napríklad hybridný proteín vykazuje ligandovú špecifitu jedného alebo viacerých vzorových proteínov. Podobne sa môže vytvoriť heterológna fúzia, ktorá by vykazovala kombináciu vlastností a aktivít odvodených proteínov. Typickým príkladom je fúzia reportérového polypeptidu, napríklad luciferázy so segmentom alebo doménou antigénu, napríklad segment, ktorý viaže ligand, takto sa môže ľahšie určiť prítomnosť alebo umiestnenie požadovaného ligandu. Viď. napríklad Duli a kol., U. S. Patent No. 4 859 609, ktorý je tu citovaný. Iných génových fúznych partnerov zahŕňa bakteriálna β-galaktozidáza, trpE, proteín A, β-laktamáza, a-amyláza, alkoholdehydrogenáza a kvasnicový a mating faktor. Viď. napríklad Godowski a kol. (1988) Science 241: 812-816.Polypeptides were also fused between BAS-1 antigens and other homologous and heterologous proteins. Homologous proteins may be associated with various surface patterns, for example, a hybrid protein exhibits the ligand specificity of one or more exemplary proteins. Similarly, a heterologous fusion can be generated that exhibits a combination of the properties and activities of the derived proteins. A typical example is the fusion of a reporter polypeptide, for example, luciferase, with a segment or domain of an antigen, for example, a ligand binding segment, thus making it easier to determine the presence or location of the desired ligand. See. See, e.g., Duli et al., U.S. Pat. No. 4,859,609, which is incorporated herein by reference. Other gene fusion partners include bacterial β-galactosidase, trpE, protein A, β-lactamase, α-amylase, alcohol dehydrogenase, and yeast and mating factor. See. for example, Godowski et al. (1988) Science 241: 812-816.

Fosforamiditovým spôsobom opísaným autormi Beaucage a Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1589-1862 vznikajú vhodné syntetické DNA fragmenty. Dvojreťazcový fragment sa často získava buď syntézou komplementárneho reťazca a súčasne za vhodných podmienok teplotnou, hybridizáciou reťazca alebo pridaním komplementárneho reťazca k vhodnému priméru s použitím DNA polymerázy.Phosphoramidite method described by Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1589-1862, suitable synthetic DNA fragments are produced. The double-stranded fragment is often obtained either by synthesis of the complementary strand and at the same time under appropriate conditions by thermal, chain hybridization or addition of the complementary strand to a suitable primer using DNA polymerase.

Také polypeptidy môžu mat zvyšky aminokyselín, ktoré sú chemicky modifikované fosforyláciou, sulfonáciou, biotinyláciou alebo pridaním alebo odstránením iných častí, najmä tých, ktorých tvar molekuly je podobný fosfátovej skupine. V niektorých prípadoch budú modifikáciami vhodné značené látky alebo poslúžia ako purifikačné ciele, napríklad ligandová afinita.Such polypeptides may have amino acid residues that are chemically modified by phosphorylation, sulfonation, biotinylation, or by the addition or removal of other moieties, particularly those whose molecular shape is similar to the phosphate moiety. In some cases, the labeled reagents will be suitable for modification or serve as purification targets, for example, ligand affinity.

Fúzia proteínov môže vo všeobecnosti nastať buď spôsobmi rekombinantných nukleových kyselín alebo syntézou polypeptidov. Spôsoby manipulácií s nukleovou kyselinou a spôsoby expresie sú vo všeobecnosti opísané napríklad v Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Spôsoby syntetizovania polypeptidov sú opísané napríklad v Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, Merrifield (1986) Science 232: 341-347 a Atherton a kol. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford.Protein fusion may generally occur either by recombinant nucleic acid methods or by polypeptide synthesis. Nucleic acid manipulation methods and expression methods are generally described, for example, in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Methods for synthesizing polypeptides are described, for example, in Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, Merrifield (1986) Science 232: 341-347 and Atherton et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: Practical Approach, IRL Press, Oxford.

Tento vynález tiež opisuje použitie derivátov BAS-1 antigénov iných, ako sú varianty v aminokyselinovej sekvencií alebo glykozylácie. Také deriváty môžu byt s chemickými časťami spojené kovalentne alebo nahromadené do zhlukov. Tieto deriváty patria vo všeobecnosti do troch tried: (1) soli, (2) retazcové miesto a koncové časti kovalentných modifikácií a (3) adsorpčné komplexy, napríklad s bunkovými membránami. Také kovalentné a nahromadené deriváty sa používajú ako imunogény, látky pri imunologických stanoveniach alebo purifikačných spôsoboch, ako je afinitná purifikácia ligandov alebo väzbových ligandov. Napríklad BAS-1 antigén sa môže, v odbore dobre známymi spôsobmi, imobilizovat kovalentnou väzbou na tuhý povrch, ako je Sepharoza aktivovaná kyanogénbromidom alebo adsorpciou na polyolefínové povrchy zo zosieťovaným glutaraldehydom alebo bez neho, na stanovenie alebo na purifikáciu anti-BAS-1 protilátok alebo jeho ligandu. Na diagnostické stanovenia sa môžu BAS-1 antigény tiež značiť detegovatelnou skupinou, napríklad rádiojódovaným chlóramínom T, kovalentne viazanou na výnimočné pôdne cheláty alebo sa môžu konjugovat na iné fluoreskujúce časti.The invention also describes the use of derivatives of BAS-1 antigens other than variants in amino acid sequence or glycosylation. Such derivatives may be covalently or clustered to the chemical moieties. These derivatives generally fall into three classes: (1) salts, (2) the chain site and terminal portions of covalent modifications, and (3) adsorption complexes, for example, with cell membranes. Such covalent and accumulated derivatives are used as immunogens, agents in immunoassays or purification methods such as affinity purification of ligands or binding ligands. For example, a BAS-1 antigen can be immobilized by covalent binding to a solid surface, such as cyanogen bromide activated adsorption or adsorption to polyolefin surfaces with or without crosslinked glutaraldehyde, to detect or purify anti-BAS-1 antibodies, or by well known methods in the art. its ligand. For diagnostic assays, BAS-1 antigens may also be labeled with a detectable moiety, for example, radioiodinated chloramine T, covalently bound to exceptional soil chelates, or may be conjugated to other fluorescent moieties.

Rozpustný BAS-1 antigén, v tomto vynáleze, sa môže používať ako imunogén na tvorbu antiséra alebo protilátky špecifickej proti antigénu alebo niektorej jeho časti. Purifikované antigény sa môžu použiť na skúmanie monoklonálnych protilátok alebo fragmentov viažúcich antigén, ktoré sa pripravili imunizáciou rôznych druhov znečistených preparátov s obsahom proteíno'v. Termín protilátky zahŕňa najmä fragmenty prírodných protilátok, ktoré viažu antigén. Purifikovaný BAS-1 antigén sa môže tiež používať ako látka na detekciu protilátok vzniknutých ako odpoveď na prítomnosť zvýšenej hladiny BAS-1 alebo bunkových častí s obsahom antigénu za podmienok abnormálne diagnostických alebo špecificky fyziologických, či pri chorobe. Navyše v predkladanom vynáleze môžu BAS-1 fragmenty slúžiť ako imunogény na tvorbu protilátok, ako je opísané nižšie. Napríklad predkladaný vynález skúma protilátky získané proti aminokyselinovým sekvenciám alebo kódované nukleotidovou sekvenciou opísané v SEKV. ID ČÍS.: 1 alebo ich fragmenty. Tento vynález pozoruje protilátky, ktoré majú väzbovú afinitu k špecifickým fragmentom alebo sú získané proti špecifickým fragmentom, ktoré podlá predpokladov ležia mimo oblasti lipidovej dvojvrstvy. Navyše môže rad konštruktov vzniknúť fúziou membránovo nahromadených segmentov s inak extracelulárne voľnými časťami molekúl.The soluble BAS-1 antigen, in the present invention, can be used as an immunogen to produce an antiserum or an antibody specific to the antigen or a portion thereof. Purified antigens can be used to screen for monoclonal antibodies or antigen-binding fragments that have been prepared by immunizing various types of contaminated protein-containing preparations. In particular, the term antibodies includes fragments of natural antibodies that bind antigen. Purified BAS-1 antigen can also be used as a substance to detect antibodies raised in response to the presence of an elevated level of BAS-1 or antigen-containing cell parts under abnormally diagnostic, or specifically physiological, or disease conditions. In addition, in the present invention, BAS-1 fragments may serve as immunogens for generating antibodies as described below. For example, the present invention investigates antibodies obtained against the amino acid sequences or encoded by the nucleotide sequence described in SEQ. ID NO .: 1 or fragments thereof. The present invention observes antibodies that have binding affinity for specific fragments or are obtained against specific fragments that are believed to lie outside the lipid bilayer region. In addition, a number of constructs may be formed by fusing membrane pools to otherwise extracellular free portions of the molecules.

Predkladaný vynález preskúmava izoláciu ďalších podobných druhov. Je velmi pravdepodobné, že alelické druhy existujú v rôznych jedincoch, napríklad je tu opísaná viac ako 90 až 97 % zhodnosť s prípadom opísaným vyššie.The present invention investigates the isolation of other similar species. It is very likely that allelic species exist in different individuals, for example, greater than 90-97% identity to the case described above is described herein.

Vynález tiež predkladá spôsoby izolácie skupín príbuzných antigénov z rôznou aj podobnou štruktúrou, expresiou a funkciou. Vysvetlenie mnohých fyziologických vplyvov antigénov sa velmi urýchli izoláciou a charakterizáciou odlišných druhov protiľahlých častí antigénov. Predkladaný vynález predkladá najmä použitie nukleotidových sond na identifikáciu ďalších homológnych genetických entít vo rôznych druhoch.The invention also provides methods for isolating groups of related antigens from both different and similar structures, expression and function. The explanation of many physiological effects of antigens is greatly accelerated by the isolation and characterization of different types of opposing portions of the antigens. In particular, the present invention provides the use of nucleotide probes to identify other homologous genetic entities in different species.

Vyizolované gény umožňujú transformáciu buniek bez expresie BAS-1, napríklad iné druhové typy alebo bunky, ktoré nemajú zodpovedajúce antigény a vykazujú negatívnu aktivitu. Expresia transformovaných génov umožňuje izoláciu antigénovo čistých bunkových línií, s definovanými alebo jednodruhovými variantami. Tento prístup umožňuje ovela citlivejšiu detekciu a rozlíšenie fyziologických vplyvov akýchkoľvek ligandov. Subcelulárne fragmenty, napríklad cytoplasty alebo membránové fragmenty sa môžu izolovať a používať.The isolated genes allow transformation of cells without BAS-1 expression, for example, other species types or cells that do not have the corresponding antigens and exhibit negative activity. Expression of the transformed genes allows the isolation of antigen-pure cell lines, with defined or single-species variants. This approach allows for a much more sensitive detection and differentiation of the physiological effects of any ligands. Subcellular fragments, such as cytoplasts or membrane fragments, may be isolated and used.

Rozbor kritických štrukturálnych častí, ktoré ovplyvňujú rad rôznych funkcií zabezpečovaných ligandami, umožňuje používanie štandardných spôsobov modernej molekulárnej biológie, najmä v porovnaní členov podoných tried. Viď. napríklad spôsob mutagenézie, ktorý zaznamenáva homológ, opísaný v Cunnigham a kol. (1989) Science 243: 1339-1336 a postupy používané v O'Dowd a kol. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992 a Lechleiter a kol. (1990) EMBO J. 9: 4381-4390.The analysis of critical structural moieties that affect a variety of different functions provided by ligands allows the use of standard methods of modern molecular biology, especially when comparing members of fraudulent classes. See. for example, a mutagenesis method that records a homologue as described in Cunnigham et al. (1989) Science 243: 1339-1336 and the procedures used in O'Dowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992 and Lechleiter et al. (1990) EMBO J. 9: 4381-4390.

Segmenty, ktoré viažu ligand, sa môžu substituovať druhovými variantami, aby sa určilo, aké štruktúrne črty sú dôležité v obidvoch ligandových väzbových afinitách a špecificitách. Rad rôznych BAS-1 variantov sa použije na sledovanie ligandov vykazujúcich kombinované interakčné vlastnosti s inými druhovými variantami.Ligand-binding segments can be substituted with species variants to determine what structural features are important in both ligand binding affinities and specificities. A variety of different BAS-1 variants are used to screen for ligands showing combined interaction properties with other species variants.

Intracelulárna funkcia by sa zrejme týkala antigénových segmentov, ktoré sú bežne dostupné v cytozole. Avšak antigénová internalizácia môže nastať za istých okolností a môže dôjsť k interakcii medzi intracelulárnymi zložkami a určenými extracelulárnymi segmentami. Špecifické väzbové segmenty BAS-1 antigénu s inými intracelulárnymi zložkami sa môžu identifikovať mutagenézou alebo priamo biochemický, napríklad zosietením alebo afinitnými spôsobmi. Tiež sa bude aplikovať štruktúrna analýza kryštalografiou alebo inými fyzikálnymi spôsobmi. Ďalší výskum mechanizmu signálnej transdukcie môže zahŕňať štúdium nahromadených zložiek, ktoré sa môžu izolovať afinitnými spôsobmi.Intracellular function would probably relate to antigen segments that are commonly available in the cytosol. However, antigenic internalization may occur under certain circumstances and there may be an interaction between intracellular components and designated extracellular segments. Specific binding segments of BAS-1 antigen with other intracellular components can be identified by mutagenesis or directly biochemical, for example by cross-linking or affinity methods. Structural analysis by crystallography or other physical methods will also be applied. Further investigation of the signal transduction mechanism may include the study of accumulated components that can be isolated by affinity methods.

Ďalej sa bude študovať expresia a kontrola BAS-1 antigénov. Kontrolované zložky spojené s antigénmi vykazujú rôzne vývojové, tkanivovo špecifické alebo iné expresné vzory. Predmetom záujmu sú horné a dolné genetické oblasti, napríklad kontrola zložiek.Furthermore, expression and control of BAS-1 antigens will be studied. Controlled antigen-associated components exhibit various developmental, tissue-specific, or other expression patterns. Top and bottom genetic regions, such as component control, are of interest.

Štúdium štruktúry BAS-1 antigénov vedie k zostrojeniu nových ligandov, najmä analógov, ktoré a antagonistické vlastnosti. Toto sa opísanými a sledovanými spôsobmi s požadovaným spektrom aktivít.The study of the structure of BAS-1 antigens leads to the construction of new ligands, in particular analogues, and antagonistic properties. This has been described and followed by methods with the desired spectrum of activities.

vykazujú agonistické môže kombinovať so skôr na izoláciu ligandovhaving agonist can combine with rather to isolate ligands

Expresia v iných bunkových druhoch bude často v konkrétnych antigénoch spôsobovať rozdielnu glykozyláciu. Rad druhov môže mat rozdielne funkcie založené na rôznej štruktúre v porovnaní s aminokyselinovou sekvenciou. Rozdielna modifikácia môže byt zodpovedná za rozdielne funkcie a teraz je možné tieto vplyvy objasniť.Expression in other cell species will often cause different glycosylation in particular antigens. A number of species may have different functions based on a different structure compared to the amino acid sequence. Different modifications may be responsible for different functions and these effects can now be clarified.

V predkladanom vynáleze sú zdôraznené dôležité vývojové antigény a látky na nich závislé. Aj keď sa uvedené príklady zameriavajú predovšetkým na ľudský BAS-1, odborníci v odbore ihneď spoznajú, že vynález obsahuje ďalšie BAS-1 antigény, napríklad primátov a iných cicavcov.In the present invention, important developmental antigens and agents dependent on them are emphasized. Although the above examples are primarily directed to human BAS-1, those skilled in the art will recognize that other BAS-1 antigens, for example primates and other mammals, are readily apparent to the invention.

V. ProtilátkyV. Antibodies

Protilátky môžu byt vytvorené proti radu alelických variantov BAS-l antigénov a ich fragmentov, ako v pôvodne vyskytujúcom sa tvare, tak v ich rekombinantnej podobe. Navyše môžu protilátky vzniknúť proti BAS-1 buď vo svojej aktívnej alebo v inaktívnej forme. Často sú pozorované protilátky antiidiotypové.Antibodies can be raised against a number of allelic variants of BAS-1 antigens and fragments thereof, both in their original form and in their recombinant form. In addition, antibodies can be raised against BAS-1 in either its active or inactive form. Often anti-idiotypic antibodies are observed.

Protilátky, a jednoreťazcové BAS-1 vznikajú väzbové definovaným konjugátmi fragmenty fragmentom fragmentov ktoré obsahujú formy, proti vopred imunizáciou zvierat s imunogénnymi proteínmi. Monoklonálne protilátky sa pripravujú z buniek, ktoré vylučujú požadované protilátky. U týchto protilátok sa môže sledovať väzba na normálny a chybný BAS-1 alebo aktivita ligandu agonistov alebo antagonistov. Tiďto monoklonálne protilátky sú obvykle viazané s K_D aspoň viac ako 1 mM, bežnejšie aspoň viac ako 300 μΜ, typicky viac ako 30 μΜ, vhodnejšie viac ako 10 μΜ a najlepšie viac ako 3 μΜ, napríklad 1 μΜ, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM atď.Antibodies, and single-chain BAS-1, are produced by binding defined conjugate fragments to fragments of fragments that contain the forms against pre-immunization of animals with immunogenic proteins. Monoclonal antibodies are prepared from cells that secrete the desired antibodies. These antibodies can be monitored for binding to normal and defective BAS-1 or agonist or antagonist ligand activity. These monoclonal antibodies are typically bound to a K _{D of} at least more than 1 mM, more typically at least 300 µΜ, typically more than 30 µΜ, more preferably more than 10 µΜ, and most preferably more than 3 µΜ, for example 1 µΜ, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, and so on.

Tieto protilátky, ktoré obsahujú fragmenty viažúce antigén, môžu mať v diagnostike a terapeutike podstatný význam. Môžu byť silnými antagonistami, ktoré viažu BAS-1 a inhibujú väzbu ligandu alebo schopnosť ligandu vyvolať biologickú odpoveď. Tiež sa môžu používať ako protilátky bez neutralizačných účinkov a pripojiť sa na toxíny alebo rádionuklidy tak, že sa protilátka naviaže na antigén a samotná bunka sa zničí. Ďalej sa môžu tieto protilátky konjugovať s liekmi alebo inými terapeutickými činidlami a to buď priamo alebo nepriamo cez spojovník.These antibodies, which contain antigen-binding fragments, can be of significant importance in diagnosis and therapy. They can be potent antagonists that bind BAS-1 and inhibit ligand binding or the ability of a ligand to elicit a biological response. They can also be used as antibodies without neutralizing effects and attached to toxins or radionuclides by binding the antibody to the antigen and destroying the cell itself. Further, these antibodies may be conjugated to drugs or other therapeutic agents, either directly or indirectly via a linker.

Protilátky v tomto vynáleze sa môžu použiť v diagnostike. Ako zachytené alebo protilátky bez neutralizačných účinkov sa môžu viazať na BAS-1 bez inhibičnej ligandovej väzby. Ako neutralizačné protilátky sa môžu použiť pri kompetitívnych väzbových stanoveniach. Tiež sa môžu využiť na detekciu alebo kvantifikáciu BAS-1 alebo jeho ligandov.The antibodies of the invention can be used in diagnostics. As captured or non-neutralizing antibodies, they can bind to BAS-1 without inhibitory ligand binding. They can be used as neutralizing antibodies in competitive binding assays. They can also be used to detect or quantify BAS-1 or its ligands.

BAS-1 fragmenty sa môžu viazať na iné materiály, najmä polypeptidy a tak fúzovať alebo sa kovalentne spojiť s polypeptidmi a použiť sa ako imunogény. BAS-1 a jeho fragmenty sa môžu fúzovať alebo kovalentne spojiť na rad imunogénov, ako sú hemocyanín kužalnatky, hovädzí sérový albumín, tetanus toxoid atď. Viď. Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969, Landsteiner (1962) Specifity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, a Williams a kol. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry Vol. 1, Academic Press, New York, na opis spôsobov prípravy polyklonálneho antiséra. Typický spôsob sa týka hyperimunizácie zvierat antigénmi. Krv zvieraťa sa potom odoberie krátko potom, čo sa zopakuje imunizácia a gama-globulín sa vyizoluje. Alebo sa môžu na tvorbu hybridómov odobrať bunky/BAS-1 fragments can bind to other materials, particularly polypeptides, and thus fuse or covalently link to polypeptides and be used as immunogens. BAS-1 and fragments thereof can be fused or covalently linked to a variety of immunogens such as cone hemocyanin, bovine serum albumin, tetanus toxoid, and the like. See. Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, and Williams et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry Vol. 1, Academic Press, New York, to describe methods for preparing polyclonal antisera. A typical method involves hyperimmunization of animals with antigens. The animal's blood is then collected shortly after immunization is repeated and gamma-globulin is isolated. Or, cells may be taken to form hybridomas /

V niektorých príkladoch sa požaduje príprava monoklonálnych protilátok z iných cicavčích hostiteľov, ako sú myši, krysy, opice, ľudia a pod. Opis spôsobu prípravy monoklonálnych protilátok bol nájdený napríklad v Stites a kol. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4. ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA a citácie tu uvedené, Harlow and Lane (1988)In some examples, it is desired to prepare monoclonal antibodies from other mammalian hosts, such as mice, rats, monkeys, humans, and the like. A description of a method for preparing monoclonal antibodies has been found, for example, in Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, and references cited herein, Harlow and Lane (1988)

Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practise (2. ed.) Academic Press, New York a čiastočne v Kohler and Milstein (1975) v Náture 256: 495-497, kde sa diskutuje jeden spôsob generovania monoklonálnych protilátok. Krátko zhrnuté, tieto spôsoby sa týkajú injektovania zvierat imunogénom. Zviera sa potom obetuje a bunky zo sleziny sa odoberú a spoja sa s myelocytmi. Výsledkom je hybridná bunka alebo hybridom schopný reprodukcie in vitro. Populácia hybridómov sa potom sleduje izoláciou jednotlivých klonov, z ktorých každý vylučuje k imunogénu jeden druh protilátky. Týmto spôsobom získané jednotlivé druhy protilátok sú produkty stále živých a klonovaných jednotlivých B buniek z imúnnych zvierat, ktoré vznikli ako odpoveď na špecifické miesto rozpoznané imunogénnou bunkou.Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York and partly in Kohler and Milstein (1975) in Nature 256: 495-497, where discussed one way to generate monoclonal antibodies. Briefly, these methods relate to injecting animals with an immunogen. The animal is then sacrificed and the spleen cells are harvested and associated with myelocytes. The result is a hybrid cell or hybrid capable of reproducing in vitro. The hybridoma population is then monitored by isolating individual clones, each of which secretes one type of antibody to the immunogen. The individual antibody species thus obtained are the products of still living and cloned single B cells from immune animals that have been generated in response to a specific site recognized by the immunogenic cell.

Iné vhodné techniky sa týkajú in vitro prejavu lymfocytov na antigénne polypeptidy alebo na selekciu protilátkovej knižnice vo fágu alebo podobných vektoroch. Viď. Huse a kol. (1989) Generation of Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246: 1275-1281 a Ward a kol. (1989) Náture 341: 544-546. Polypeptidy a protilátky v predkladanom vynáleze sa môžu použiť ako modifikované alebo nemodifikované, vrátane chimerických alebo humanizovaných protilátok. Polypeptidy a protilátky sú častejšie značené látkou, buď kovalentne alebo nekovalentne viazanou, ktorá vykazuje detegovatelný signál. Je známe široké spektrum značených látok a konjugačných techník a sú početne uvedené vo vedeckej aj Medzi vhodné značené látky patria substráty, kofaktory, inhibítor'y, chemiluminiscenčné skupiny, magnetické patentovej literatúre, rádionuklidy, enzýmy, fluorescenčné skupiny, častice atď. Použitie týchto značených látok obsahujú tieto U. S.Other suitable techniques relate to the in vitro expression of lymphocytes on antigenic polypeptides or for the selection of an antibody library in phage or similar vectors. See. Huse et al. (1989) Generation of the Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246: 1275-1281 and Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546. The polypeptides and antibodies of the present invention can be used as modified or unmodified, including chimeric or humanized antibodies. Polypeptides and antibodies are more often labeled with a substance, either covalently or non-covalently bound, that exhibits a detectable signal. A wide variety of labeled substances and conjugation techniques are known and are enumerated in scientific as well. Suitable labeled substances include substrates, cofactors, inhibitors, chemiluminescent groups, magnetic patent literature, radionuclides, enzymes, fluorescent groups, particles, etc. The use of these labeled substances includes these U. S.

Patenty č.U.S. Pat.

277 437; 4 rekombinantné 4 816 567.277 437; 4 recombinant 4,816,567.

817 837; 3 850 752; 3 939 350;817 837; 3,850,752; 3,939,350;

275 145 a 4 366 241. Tiež sa môžu imunoglobulíny, viď. Cabilly U. S.275 145 and 4,366,241. Immunoglobulins can also be used. Cabilly U. S.

996 345; produkovať Patent č.996 345; to produce Patent No.

Protilátky tohto vynálezu sa môžu tiež použiť na izoláciu proteínov afinitnou chromatografiou. Kolóny sa môžu pripraviť vtedy, keď sú protilátky naviazané na tuhý povrch, napríklad na častice, ako je agaróza, SEPHADEX a pod. Potom ako bunkový lyzát prejde kolónou, kolóna sa premyje, nasleduje zvýšenie koncentrácií mierneho denaturujúceho činidla, čím sa uvolní purifikovaný BAS-1 proteín. Protilátky sa môžu použiť na sledovanie expresie knižníc pre konkrétne expresné produkty. Obvykle sú protilátky použité v takých prípadoch, kde sú značené skupinami, ktoré väzbou na protilátku lahko detegujú prítomnosť antigénu.The antibodies of the invention can also be used to isolate proteins by affinity chromatography. Columns can be prepared when the antibodies are bound to a solid surface, for example, particles such as agarose, SEPHADEX, and the like. After the cell lysate has passed through the column, the column is washed, followed by an increase in the concentration of a mild denaturing agent to release the purified BAS-1 protein. Antibodies can be used to monitor the expression of libraries for particular expression products. Usually, antibodies are used in those cases where they are labeled with groups that readily detect the presence of antigen by binding to the antibody.

Protilátky získané proti BAS-1 antigénu sa tiež použijú na získanie antiidiotypových protilátok. Toto bude užitočné na detegovanie alebo stanovenie rôznych imunologických podmienok, ktoré súvisia s expresiou príslušných antigénov.Antibodies obtained against the BAS-1 antigen are also used to obtain anti-idiotypic antibodies. This will be useful for detecting or determining various immunological conditions related to the expression of the respective antigens.

VI. Nukleové kyselinyVI. Nucleic acids

Sonda ľudského BAS-1 alebo jeho fragmenty budú identifikované alebo budú izolované nukleové kyseliny, ktoré kódujú homológne proteíny z iných druhov alebo iné podobné proteíny z rovnakých alebo iných druhov.The human BAS-1 probe or fragments thereof will be identified or isolated nucleic acids that encode homologous proteins from other species or other similar proteins from the same or other species.

Tento vynález sleduje použitie izolovanej DNA alebo fragmentov, ktoré kódujú biologicky aktívny príslušný BAS-1 polypeptid. Okrem toho sa vynález zaoberá izolovanou alebo rekombinovanou DNA, ktorá kóduje biologicky aktívny proteín alebo polypeptid, ktorý je schopný za vhodných podmienok hybridizovať s DNA sekvenciou tu opísanou. Uvedený biologicky aktívny proteín alebo polypeptid môže mať celý BAS-1 alebo fragment a má aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleovou kyselinou uvedenou v SEKV. ID ČÍS.: 1. Ďalej sa v tomto vynáleze uvádza použitie izolovanej alebo rekombinovanej DNA kódujú proteín, ktorý je homológny alebo fragmentov, ktoré k BAS-1 alebo ktoré sa vyizolovali s použitín cDNA kódujúcej ľudský BAS-1 ako sondy.The present invention pursues the use of isolated DNA or fragments that encode a biologically active respective BAS-1 polypeptide. In addition, the invention provides isolated or recombinant DNA that encodes a biologically active protein or polypeptide that is capable of hybridizing under appropriate conditions to the DNA sequence described herein. Said biologically active protein or polypeptide may have the entire BAS-1 or fragment and has the amino acid sequence encoded by the nucleic acid shown in SEQ. SEQ ID NO: 1. Further disclosed herein is the use of isolated or recombinant DNA to encode a protein that is homologous or fragments that have been isolated to BAS-1 or that have been isolated using cDNA encoding human BAS-1 as probes.

Izolovaná DNA môže mať vlastnú regulátorovú sekvenciu na 5' a 3' koncoch, napríklad promótory, zosilňovače, polyadenylačné signály a ďalšie.The isolated DNA may have its own regulatory sequence at the 5 'and 3' ends, for example, promoters, enhancers, polyadenylation signals, and others.

Izolovaná nukleová kyselina je nukleová kyselina, napríklad RNA, DNA alebo zmiešaný polymér, ktorý je úplne oddelený od iných zložiek, ktoré sa bezprostredne nachádzajú v pôvodnej sekvencií, napríklad ribozómy, polymerázy a lemovacie genómové sekvencie z pôvodných druhov. Vynález zahŕňa nukleovú kyselinu, ktorá je odobratá z prostredia, kde sa pôvodne vyskytovala a obsahuje rekombinantné alebo klonované DNA izoláty a chemicky syntetizované analógy alebo analógy biologicky syntetizované heterológnymi systémami. Značne čistá molekula obsahuje izolované formy molekuly.An isolated nucleic acid is a nucleic acid, for example RNA, DNA or mixed polymer, which is completely separated from other components that are immediately present in the original sequence, for example ribosomes, polymerases, and flanking genomic sequences from native species. The invention encompasses nucleic acid that is taken from the environment where it originally occurred and contains recombinant or cloned DNA isolates and chemically synthesized analogs or analogs biologically synthesized by heterologous systems. A substantially pure molecule contains isolated forms of the molecule.

Izolovaná nukleová kyselina bude vo všeobecnosti homogénna molekula, ale v niektorých prípadoch bude mať menšiu rôznorodosť. Heterogenita sa obvykle nachádza na polymérnych koncoch alebo častiach, ktoré sú náročné na požadovanú biologickú funkciu alebo aktivitu.The isolated nucleic acid will generally be a homogeneous molecule, but in some cases will have less diversity. Heterogeneity is usually found at polymeric ends or moieties that are demanding for the desired biological function or activity.

Rekombinantné nukleová kyselina je definovaná buď spôsobom jej produkcie alebo jej štruktúrou. V citácii pre spôsob produkcie, napríklad produkt sa získal spôsobom, spôsob je použitím techník rekombinantnéj nukleovej kyseliny, napríklad zahŕňa ludský zásah do nukleotidovej sekvencie. Alebo sa môže nukleová kyselina vytvoriť generovaním sekvencie, ktorá obsahuje dva spojené fragmenty, ktoré si pôvodne nie sú navzájom blízke, ale je zaznamenané, že nepripúšťa prírodné produkty, napríkl'ad prírodné sa vyskytujúce mutanty. Teda, napríklad produkty vzniknuté transformáciou buniek s akýmkoľvek neprírodne sa vyskytujúcim vektorom, ako sú nukleové kyseliny s obsahom sekvencie, ktorá vznikla s použitím niektorých syntetických oligonukleotidových spôsobov. To sa často uskutoční, aby sa premiestnil kodón s redundantným kodónom, ktorý kóduje rovnakú alebo konzervatívnu aminokyselinu, zatial čo charakteristicky zavedenie alebo premiestnenie, napríklad reštrikcia alebo sekvencia rozpoznávacieho miesta. Uskutoční sa teda spojenie segmentov nukleovej kyseliny s požadovanými funkciami, aby sa vytvorili jednoduché genetické entity, ktoré obsahujú požadovanú kombináciu funkcií, ktoré sa vo všeobecne dostupných prírodných formách nenašli. Reštrikčné enzýmy rozpoznávacích miest sú často cielom takých umelých manipulácií, s výnimkou iných miest špecifických cielov, napríklad promótory, DNA replikačné miesta, regulačné sekvencie, kontrolné sekvencie alebo iné použité znaky sa môžu zahrnúť do plánu.A recombinant nucleic acid is defined either by its production method or by its structure. In reference to a production method, for example, a product obtained by a method, the method is using recombinant nucleic acid techniques, for example, involving human intervention in the nucleotide sequence. Alternatively, the nucleic acid can be generated by generating a sequence that contains two linked fragments that are not initially close to each other but is noted to be free of natural products, such as naturally occurring mutants. Thus, for example, products resulting from the transformation of cells with any non-naturally occurring vector, such as nucleic acids containing a sequence that has been generated using certain synthetic oligonucleotide methods. This is often done to relocate a codon with a redundant codon that encodes the same or a conserved amino acid, while characteristically introducing or relocating, for example, a restriction or recognition site sequence. Thus, the nucleic acid segments will be linked to the desired functions to create simple genetic entities that contain the desired combination of functions that are not found in generally available natural forms. Restriction enzymes of recognition sites are often the target of such artificial manipulations, with the exception of other sites of specific target, for example, promoters, DNA replication sites, regulatory sequences, control sequences or other traits used may be included in the plan.

Podobné poňatie je určené pre rekombinanty, napríklad fúzie, polypeptid. Konkrétne sú zahrnuté syntetické nukleové kyseliny, ktoré prebytočným genetickým vybavením kódujú podobné polypeptidy na fragmenty týchto antigénov a fúzie sekvencií radu rôznych druhov.A similar concept is intended for recombinants, for example fusions, polypeptides. In particular, synthetic nucleic acids that encode similar polypeptides into fragments of these antigens and sequence fusions of a variety of species are superfluous in genetic engineering.

Fragment v súvislosti s nukleovou kyselinou je príbuzný segment s velkosťou aspoň 17 nukleotidov, obvykle aspoň 20 nukleotidov, častejšie aspoň okolo 23 nukleotidov, bežne aspoň 26 nukleotidov, bežnejšie aspoň 29 nukleotidov, často aspoň 32 nukleotidov, častejšie aspoň okolo 35 nukleotidov, charakteristicky aspoň 38 nukleotidov, charakteristickejšie aspoň 41 nukleotidov, obvykle aspoň 44 nukleotidov, obvyklejšie aspoň 47 nukleotidov, lepšie aspoň 50 nukleotidov, výhodnejšie aspoň 53 nukleotidov a predovšetkým vhodné je aspoň 56 a viac nukleotidov, napríklad 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 atď.A nucleic acid fragment is a related segment of at least 17 nucleotides, usually at least 20 nucleotides, more typically at least about 23 nucleotides, typically at least 26 nucleotides, more typically at least 29 nucleotides, often at least 32 nucleotides, more typically at least about 35 nucleotides, typically at least 38 nucleotides, more typically at least 41 nucleotides, usually at least 44 nucleotides, more typically at least 47 nucleotides, preferably at least 50 nucleotides, more preferably at least 53 nucleotides, and at least 56 or more nucleotides, such as 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 etc.

DNA, ktorá kóduje BAS-1 proteín sa bude používať najmä'na identifikáciu génov, mRNA a homológne antigény, rovnako proteíny z rôznych druhov.In particular, the DNA encoding the BAS-1 protein will be used to identify genes, mRNAs and homologous antigens, as well as proteins from different species.

cDNA, ktoré kódujú podobné alebo ako DNA, ktorá kóduje homológne Rôzne BAS-1 proteíny by mali mať podobné sekvencie a sú tu opísané. Avšak zhodné proteíny, ktoré majú evolučné rozdielny vzťah k BAS-1, sa môžu lahko izolovať použitím týchto sekvencií, pokial vykazujú dostatočnú podobnosť. Opičie BAS-1 proteíny majú konkrétny význam.cDNAs Coding Like or Like DNA That Codes Homologously Various BAS-1 proteins should have similar sequences and are described herein. However, identical proteins having an evolutionary different relationship to BAS-1 can be readily isolated using these sequences as long as they exhibit sufficient similarity. Monkey BAS-1 proteins have particular meaning.

Tento vynález ďalej opisuje rekombinantné DNA molekuly a fragmenty s DNA sekvenciou zhodnou alebo vysoko homológnou s izolovanými DNA, ktoré sú tu uvedené. Najmä sekvencie budú často použiteľné spojené k DNA segmentom, ktoré sú zodpovedné za kontrolu transkripcie, translácie a. DNA replikácie. Alebo rekombinantné klony získané z genómových sekvencií, t.j. s obsahom intrónov, sa budú používať na transgénne štúdiá, ktoré zahŕňajú napríklad transgénne bunky a organizmy a na génovú terapiu. Viď. napríklad Goodnow (1992) Transgenic Animals v Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego, 1502-1504, Tráviš (1992) Science 256: 1392-1394, Kuhn a kol. (1991) Science 254: 707-710, Capecchi (1989) Science 244: 1288, Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford, a Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10: 180-199.The present invention further provides recombinant DNA molecules and fragments having a DNA sequence identical or highly homologous to the isolated DNAs disclosed herein. In particular, sequences will often be usefully linked to DNA segments which are responsible for the control of transcription, translation and translation. DNA replication. Or recombinant clones derived from genomic sequences, i. containing introns will be used for transgenic studies, including, for example, transgenic cells and organisms, and for gene therapy. See. for example, Goodnow (1992) Transgenic Animals in Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego, 1502-1504, Travis (1992) Science 256: 1392-1394, Kuhn et al. (1991) Science 254: 707-710, Capecchi (1989) Science 244: 1288, Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach by IRL Press, Oxford, and Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10: 180-199.

Homológne sekvencie nukleovej kyseliny, ktoré sa porovnávajú, vykazujú významnú sekvenčnú podobnosť. Štandardy pre homológiu v nukleových kyselinách sa merajú buď pre homológiu všeobecne používanú v odbore porovnávaním sekvencie alebo sú založené na hybridizačných podmienkach. Hybridizačné podmienky sú detailne opísané nižšie.The homologous nucleic acid sequences being compared exhibit significant sequence similarity. Standards for nucleic acid homology are measured either for homology generally used in the art by sequence comparison or based on hybridization conditions. Hybridization conditions are described in detail below.

Porovnaním sekvencie nukleovej kyseliny sa zistila značná zhodnosť, čo znamená, že porovnávané segmenty alebo ich komplementárne reťazce sú identické vtedy, keď sú optimálne alebo deléciami všeobecnosti v obyčajnejšie aspoň 65 %, %, typicky aspoň 74 %, obvykle aspoň 80 %, obvyklejšie výhodnejšie aspoň 95 až 98 % alebo viac viac ako 99 % alebo viac nukleotidov. sa vyskytuje, pokiaľ segmenty budú za selektívnych hybridizačných podmienok hybridizovať s reťazcom alebo jeho komplementárnym úsekom, typicky používaná sekvencia je zarovnané vhodnými inzerciami v aspoň 50 % nukleotidov, vo nukleotidov, obyčajne aspoň 62 %, aspoň 68 %, častejšie aspoň 71 typickejšie aspoň 77 %, %, lepšie aspoň 90 %, a niektorých prípadochBy comparing the nucleic acid sequence, considerable identity was found, which means that the compared segments or their complementary strands are identical when they are optimal or deletion in general at least 65%,%, typically at least 74%, usually at least 80%, more usually more preferably at least 95 to 98% or more more than 99% or more nucleotides. occurs when the segments hybridize to the chain or its complementary region under selective hybridization conditions, typically the sequence used is aligned by appropriate insertions in at least 50% of the nucleotides, in nucleotides, usually at least 62%, at least 68%, more often at least 71 ,%, preferably at least 90%, and in some cases

Alebo značná zhodnosť nukleotidov, aspoň 56 % čas'to oveľa aspoň vybraná zo SEKV. ID ČÍS.: 1. Typicky môže hybridizácia nastať, keď je aspoň 55 % homológia oblastí aspoň 14 nukleotidov, lepšie keď je homológia aspoň okolo 65 %, výhodnejšie aspoň okolo 75 % aspoň okolo 90 %. Viď. Kanehisa (1984) Nuc. 203-213. Dĺžka porovnávanej homológie, ako je opísaná, môže byť dlhšia oblasť a v niektorých prípadoch bude oblasť aspoň 17 nukleotidov, obvykle aspoň 20 nukleotidov, 24 nukleotidov, typicky aspoň 28 nukleotidov, aspoň 40 nukleotidov, výhodne aspoň okolo 50 nukleotidov a oveía výhodnejšie aspoň okolo 75 až 100 alebo viac nukleotidov, napríklad 125, 150, 200, 250, 300 atď.Or, a substantial nucleotide identity, at least 56% part much at least selected from SEQ. Typically, hybridization can occur when at least 55% of the homology of the regions is at least 14 nucleotides, preferably when the homology is at least about 65%, more preferably at least about 75%, at least about 90%. See. Kanehisa (1984) Nuc. 203-213. The length of the homology to be compared as described may be a longer region, and in some cases the region will be at least 17 nucleotides, usually at least 20 nucleotides, 24 nucleotides, typically at least 28 nucleotides, at least 40 nucleotides, preferably at least about 50 nucleotides. 100 or more nucleotides, for example 125, 150, 200, 250, 300, etc.

a najvýhodnejšie Acids. Res. 12:and most preferably Acids. Res. 12:

obvyklejšie aspoň oveía typickejšiemore usually at least much more typical

Prísne podmienky, v odkaze na identitu v súvislosti s hybridizáciou, budú prísne kombinované podmienky solí, teploty, organických rozpúšťadiel a iných parametrov typicky kontrolovaných pri hybridizačných reakciách. Prísne teplotné podmienky budú obvykle zahŕňať teploty cez 30 °C, obvykle cez 37 °C, typicky cez 45 C, oveľa typickejšie cez 55 °C, výhodne cez 65 “C a oveľa výhodnejšie cez 70 C. Prísny obsah solí bude obyčajne nižší ako 500 mM, obvykle nižší ako 350 mM, ovela obvyklejšie nižší ako 200 mM, typicky nižší ako 150 mM, vhodnejšie nižší ako 100 mM a oveľa výhodnejšie nižší ako 50 mM. Avšak kombinácia parametrov je oveľa dôležitejšia ako meranie jednotlivých parametrov. Viď. napríklad Wetmur and Davidsom (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370.Stringent conditions, in reference to identity in connection with hybridization, will be strictly combined conditions of salts, temperature, organic solvents, and other parameters typically controlled in hybridization reactions. Stringent temperature conditions will usually include temperatures above 30 ° C, usually over 37 ° C, typically over 45 ° C, much more typically over 55 ° C, preferably over 65 ° C, and much more preferably over 70 ° C. The stringent salt content will usually be less than 500 ° C. mM, usually less than 350 mM, much more usually less than 200 mM, typically less than 150 mM, more preferably less than 100 mM, and much more preferably less than 50 mM. However, the combination of parameters is more important than measuring individual parameters. See. for example, Wetmur and Davids (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370.

BAS-1 proteín z iných ľudských objektov sa môže naklonovat a izolovať hybridizáciou alebo PCR. Alternatívna príprava protilátkového prípravku, ktorý vykazuje nižšiu alelickú špecifitu sa môže použiť pri klonovaní expresie. Alelické varianty sa môžu charakterizovať použitím napríklad kombinácie redundantnej PCR a sekvenčnej analýzy, napríklad použitím definovaných primérov tak, že poskytujú informácie o alelických obmenách v ľudskej populácii.BAS-1 protein from other human objects can be cloned and isolated by hybridization or PCR. An alternative preparation of an antibody preparation that exhibits lower allelic specificity can be used in cloning expression. Allelic variants can be characterized using, for example, a combination of redundant PCR and sequence analysis, for example using defined primers, to provide information about allelic variations in the human population.

VII. Príprava BAS-1, mimetikyVII. Preparation of BAS-1, mimetics

DNA, ktorá kóduje BAS-1 antigén alebo jeho fragmenty, sa môže získať chemickou syntézou, preskúmaním knižníc cDNA alebo preskúmaním génových knižníc pripravených zo širokého výberu bunkových línií alebo vzoriek tkaniva.DNA that encodes a BAS-1 antigen or fragments thereof can be obtained by chemical synthesis, by screening cDNA libraries, or by screening for gene libraries prepared from a wide variety of cell lines or tissue samples.

Táto DNA sa môže exprimovať v širokom výbere hostiteľských buniek na syntézu celého antigénu alebo jeho fragmentov, ktoré sa môžu ďalej napríklad použiť na generovanie polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok, na väzbové štúdie, na konštrukciu a expresiu modifikovaných molekúl a na štúdie, ktoré sa zaoberajú štruktúrou a funkciou. Každý antigén alebo jeho fragment sa môže exprimovať v hostiteľských bunkách, ktoré sú transformované alebo transfektované s vhodnými expresnými vektormi. Tieto molekuly sa môžu úplne purifikôvať, aby neobsahovali žiadne bielkoviny alebo celulárne kontaminanty, napríklad kontaminanty od rekombinantného hostiteľa, a tak sa po zlúčení s farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo rozpúšťadlami využijú najmä vo farmaceutických prostriedkoch. Antigén alebo jeho časti sa môžu exprimovať pri fúziách s inými proteínmi.This DNA can be expressed in a wide variety of host cells for the synthesis of whole antigen or fragments thereof, which can further be used, for example, to generate polyclonal or monoclonal antibodies, binding studies, construction and expression of modified molecules, and studies dealing with structure and function. Each antigen or fragment thereof can be expressed in host cells that are transformed or transfected with suitable expression vectors. These molecules can be completely purified to contain no proteins or cellular contaminants, for example contaminants from a recombinant host, and thus, when combined with pharmaceutically acceptable carriers and / or solvents, are particularly useful in pharmaceutical compositions. The antigen or portions thereof may be expressed in fusions with other proteins.

kontrolné expresie.control expressions.

sekvencie, ktoré kódujú a sekvencie, ktoré zakončujúsequences that encode and sequences that terminate

Expresné vektory sú typicky DNA alebo RNA konštrukty, ktoré obsahujú požadovaný antigénový gén alebo jeho fragmenty, obvykle použiteľné spojené s vhodnými geneticky kontrolovanými prvkami, ktoré sa môžu vo vhodnej hostiteľskej bunke poznať. Tieto prvky sú vo vhodnom hostiteľovi schopné účinnej Špecifické typy kontrolných prvkov nutných na účinnú expresiu závisia na type použitej hostiteľskej bunky. Obyčajne môžu geneticky kontrolované prvky obsahovať prokaryotický promótorový systém alebo eukaryotický promótorový expresný kontrolný systém a typicky zahŕňajú transkripčný promótor, voliteľný operátor na kontrolu začiatku transkripcie, transkripčný zosilňovač na zvýšenie hladiny expresie mRNA, vhodné väzbové miesto ribozómu, transkripciu a transláciu. Expresné vektory tiež obvykle obsahujú začiatok replikácie, čo umožňuje, aby sa vektor replikoval nezávisle na hostiteľskej bunke.Expression vectors are typically DNA or RNA constructs that contain the desired antigen gene or fragments thereof, usually usable in conjunction with suitable genetically engineered elements that may be known in a suitable host cell. These elements are capable of effective in a suitable host. The specific types of control elements required for efficient expression depend on the type of host cell used. Usually, the genetically-controlled elements may comprise a prokaryotic promoter system or a eukaryotic promoter expression control system and typically include a transcriptional promoter, an optional operator to control the start of transcription, a transcriptional enhancer to increase mRNA expression, a suitable ribosome binding site, transcription and translation. Expression vectors also typically contain an origin of replication, allowing the vector to replicate independently of the host cell.

Vektory v tomto vynáleze obsahujú DNA, ktorá kóduje ľudský BAS-1 antigén alebo jeho fragment, ktorý kóduje biologicky aktívny polypeptid. DNA môže byt pod kontrolou vírusového promótora a môže kódovať selekčný vzor. Tento vynález ďalej obsahuje použitie takých expresných vektorov, ktoré sú schopné expresie eukaryotickej cDNA, ktorá kóduje ľudský BAS-1 antigén v prokaryotickom alebo eukaryotickom hostiteľovi, kde je vektor kompatibilný s hostiteľom a kde je eukaryotická cDNA, ktorá kóduje antigén, vložená do vektora tak, že rast hostiteľa, ktorý obsahuje vektor exprimuje príslušnú cDNA. Obvykle sú expresné vektory navrhnuté na stabilnú replikáciu vo svojich hostiteľských bunkách alebo na amplifikáciu, aby došlo k zvýšeniu celkového počtu kópií požadovaného génu na bunku. Nie je vždy nutné požadovať, aby sa expresný vektor replikoval v hostiteľskej bunke, napríklad sa môže uskutočniť prechodná expresia antigénu alebo jeho fragmentov vo rôznych hostiteľoch pomocou vektorov, ktoré neobsahujú začiatok replikácie, ktorý hostiteľská bunka rozpozná. Môžu sa tiež použiť vektory, ktoré spôsobujú integráciu ľudského BAS-1 génu alebo jeho fragmentov do hostiteľskej DNA pomocou rekombinácie.The vectors of the invention comprise DNA which encodes a human BAS-1 antigen or a fragment thereof that encodes a biologically active polypeptide. The DNA may be under the control of a viral promoter and may encode a selection pattern. The invention further encompasses the use of expression vectors capable of expressing a eukaryotic cDNA that encodes a human BAS-1 antigen in a prokaryotic or eukaryotic host, wherein the vector is compatible with the host, and wherein the eukaryotic cDNA that encodes the antigen is inserted into the vector, that the growth of the host containing the vector expresses the corresponding cDNA. Typically, expression vectors are designed for stable replication in their host cells or for amplification to increase the total copy number of the gene of interest per cell. It is not always necessary to require that the expression vector replicate in the host cell, for example, transient expression of the antigen or fragments thereof in different hosts may be performed using vectors that do not contain an origin of replication that the host cell recognizes. Vectors that cause integration of the human BAS-1 gene or fragments thereof into host DNA by recombination can also be used.

Vektory, ktoré sa tu používajú, zahŕňajú plazmidy, vírusy, bakteriofágy, integrovateľné DNA fragmenty a iné, ktoré umožňujú integráciu DNA fragmentov do genómu hostiteľa. Expresné vektory sú špecializované vektory, ktoré obsahujú prvky genetickej kontroly, ktoré spôsobia expresiu použiteľné spojených génov. Plazmidy sú najviac používanou formou vektorov, ale všetky iné formy vektorov, ktoré poskytujú ekvivalentné funkcie a ktoré sú alebo sa stávajú v odbore známe, sú vhodné na to, aby sa tu použili. Viď. napríklad Powels a kol. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y. a Rodriquez a kol. (1988) (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Ventors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.Vectors used herein include plasmids, viruses, bacteriophages, integrable DNA fragments, and others that allow the integration of DNA fragments into the host genome. Expression vectors are specialized vectors that contain genetic control elements that cause expression of usable linked genes. Plasmids are the most commonly used form of vectors, but all other forms of vectors that provide equivalent functions and which are known or are becoming known in the art are suitable for use herein. See. for example, Powels et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., and Rodriquez et al. (1988) (eds.) Vectors: Molecular Cloning Ventors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

- 3Ô- 3Ô

Transformované bunky sú bunky, lepšie cicavčie, ktoré sa transformovali alebo transfektovali s ľudskými BAS-1 vektormi vytvorenými pomocou techník rekombinácie DNA. Transformované hostiteľské bunky obvykle exprimujú antigén alebo jeho fragmenty, ale s cieľom klonovania, amplifikácie a manipulácie DNA nemusia exprimovať proteín. Tento vynález ďalej obsahuje kultiváciu transformovaných buniek v živnom médiu, čo umožňuje akumuláciu proteínu v kultúre. Proteín sa môže získať buď z kultúry alebo z kultivačného média.Transformed cells are cells, preferably mammalian cells, that have been transformed or transfected with human BAS-1 vectors generated using recombinant DNA techniques. The transformed host cells usually express the antigen or fragments thereof, but may not express the protein in order to clone, amplify, and manipulate the DNA. The invention further encompasses culturing the transformed cells in a nutrient medium, allowing the protein to accumulate in culture. The protein can be obtained either from culture or from culture medium.

Kvôli tomuto vynálezu sú DNA sekvencie použiteľné spojené, pokiaľ sú funkčne navzájom podobné. Napríklad DNA je na presekvenciu alebo sekrečné váčiky použiteľné spojená s polypeptidom, ak je exprimovaný ako preproteín alebo sa podiela na zapojení polypeptidu na bunkovú membránu alebo v sekrécii polypeptidu. Promótor je použiteľné pripojený ku kódujúcej sekvencii, ak kontroluje transkripciu polypeptidu. Väzbové miesto ribozómu je použiteľné pripojené ku kódujúcej sekvencii, ak je umiestnený tak, aby mohla prebehnúť translácia. Obvykle použiteľné pripojený znamená susediaci, avšak v čítacom rámci nie sú určité genetické prvky, ako sú represorové gény, priľahlo spojené ale stálo viazané k operátorovým sekvenciám, ktoré zapínajú kontrolovanú expresiu.For the purposes of this invention, DNA sequences usefully linked are functionally similar to each other. For example, DNA is operably linked to a polypeptide for presequence or secretory vesicles when it is expressed as a preprotein or involved in the attachment of the polypeptide to the cell membrane or in the secretion of the polypeptide. A promoter is usefully linked to a coding sequence if it controls the transcription of the polypeptide. A ribosome binding site is usefully linked to a coding sequence when positioned so that translation can occur. Usually, fused means contiguous, but within the reading frame, certain genetic elements, such as repressor genes, are contiguously linked but still linked to operator sequences that turn on controlled expression.

Vhodnými hostiteľskými bunkami sú prokaryotá, nižšie a vyššie eukaryotá. Medzi prokaryotá sú zahrnuté obidve grampozitívne aj gramnegatívne organizmy, napríklad E. coli a B. subtilis. Nižšie eukaryotá sú kvasinky S. cerevisiae a Pichia a druhy rodu Dictyostelium. Vyššie eukaryotá zahŕňajú uvede'né tkanivové bunkové kultúry zo živočíšnych buniek, ako pôvodu necicavčieho, napríklad hmyzu, vtákov, tak cicavčieho, napríklad ludské, opičie a krýs.Suitable host cells are prokaryotes, lower and higher eukaryotes. Both gram-positive and gram-negative organisms, such as E. coli and B. subtilis, are included in prokaryotes. Lower eukaryotes are S. cerevisiae and Pichia yeasts and Dictyostelium species. The higher eukaryotes include said tissue cell cultures from animal cells, both of non-mammalian origin, for example insects, birds, and mammalian for example human, monkey and rat.

Prokaryotické systémy hostiteľských vektorov obsahujú široké spektrum vektorov mnohých rôznych druhov. Ako je tu použité, E. coli a jej vektory budú vo všeobecnosti použité, aby obsahovali ekvivalentné vektory používané v iných prokaryotách. Reprezentatívnym vektorom na amplifikáciu DNA je pBR322 alebo vela jeho derivátov. Vektory, ktoré sa môžu použiť na expresiu ľudských BAS-1 antigénov alebo ich fragmentov, zahŕňajú, ale nie sú napríklad obmedzené na vektory, ktoré obsahujú lac promótor (pUC druhy), trp promótor (pBR322-trp), Ipp promótor (pIN druhy), lambda-pP alebo pR promótory (pOTS) alebo hybridné promótory, ako je ptac (pDR540). Viď. Brosius a kol. (1988) Expresion Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and IPP-derived Promoters v Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, kapitola 10, str. 205 až 236.Prokaryotic host vector systems contain a wide variety of vectors of many different species. As used herein, E. coli and its vectors will generally be used to contain equivalent vectors used in other prokaryotes. A representative vector for DNA amplification is pBR322 or many derivatives thereof. Vectors that can be used to express human BAS-1 antigens or fragments thereof include, but are not limited to, vectors that contain the lac promoter (pUC species), the trp promoter (pBR322-trp), the Ipp promoter (pIN species) , lambda-pP or pR promoters (pOTS) or hybrid promoters such as ptac (pDR540). See. Brosius et al. (1988) Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and IPP-derived Promoters in Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Chapter 10, p. 205 to 236.

Nižšie eukaryotá, napríklad kvasinky a Dictyostelium, sa môžu transformovať s ľudským BAS-1 antigénom, ktorý obsahuje vektory. Cieľom tohto vynálezu je, aby najbežnejším hostiteľom nižších eukaryot bola kvasinka Saccharonyces cerevisae. Tá bude použitá a bude vo všeobecnosti predstavovať nižšie eukaryotá, aj keď je tiež k dispozícií rad iných kmeňov a druhov. Kvasinkové vektory sa prevažne skladajú z replikačného začiatku (podľa možností integratívneho typu), selekčného génu, promótora, DNA, ktorá kóduje požadovaný proteín alebo jeho fragment, a sekvencie na termináciu translácie, polyadenylácie a terminácie transkripcie. Vhodnými expresnými vektormi kvasiniek sú ako konštruktívne promótory, tak 3-fosfoglycerátkináza a rad iných promótorov glykolytických enzýmov alebo ako inducibilné promótory, tak promótor alkoholdehydrogenázy 2 alebo metalotionínový promótor. Vhodné promótory obsahujú deriváty nasledujúcich typov: samoreplikačný nízkokópiový (ako sú druhy YRp), samoreplikačný vysokokópiový (ako sú YEp), integratívne typy (ako sú Yip druhy) alebo minichromozómy (ako sú YCp druhy).Lower eukaryotes, such as yeast and Dictyostelium, can be transformed with human BAS-1 antigen containing vectors. It is an object of the present invention that the most common host of lower eukaryotes is the yeast Saccharonyces cerevisae. This will be used and will generally represent lower eukaryotes, although many other strains and species are also available. The yeast vectors consist predominantly of a replication origin (preferably integrative type), a selection gene, a promoter, DNA that encodes a desired protein or fragment thereof, and sequences for translation termination, polyadenylation, and transcription termination. Suitable yeast expression vectors are both constructive promoters and 3-phosphoglycerate kinase and a variety of other glycolytic enzyme promoters or both inducible promoters and the alcohol dehydrogenase 2 promoter or metallothionine promoter. Suitable promoters include derivatives of the following types: self-replicating low copy (such as YRp species), self-replicating high copy (such as YEp), integrative types (such as Yip species) or minichromosomes (such as YCp species).

Vhodnými hostiteľskými bunkami na expresiu funkčne aktívneho ľudského BAS-1 antigénového proteínu sú tkanivové bunkové kultúry vyšších eukaryot. V podstate funguje veľa tkanivových bunkových kultúr vyšších eukaryot, napríklad expresné systémy hmyzieho baculovírusu, či sú zo stavovcov alebo bezstavovcov. Avšak v kotranslačných aj posttranslačných postupoch sa dáva prednosť bunkám cicavcov.Suitable host cells for the expression of a functionally active human BAS-1 antigen protein are higher eukaryotic tissue cell cultures. Essentially, many higher eukaryotic tissue cell cultures work, for example, insect baculovirus expression systems, whether from vertebrate or invertebrate. However, in both cotranslational and posttranslational processes, mammalian cells are preferred.

Transformácia alebo transfekcia a propagácia takých buniek sa stala rutinným spôsobom. Príkladom používaných bunkových línií sú HeLa bunky, Chinese harmster ovary (CHO) bunková línia, baby rat kidney (BRK) bunková línia, hmyzia bunková línia, vtáčia bunková línia a myšia bunková línia (COS). Expresné vektory pre také bunkové línie obvykle obsahujú začiatok replikácie, promótor, iniciačné miesto translácie, miesto zostrihu RNA (ak sa používa genómová DNA), polyadenylačné miesto a terminačné miesto transkripcie. Tieto vektory tiež obvykle obsahujú selekčný alebo amplifikačný gén. Vhodnými expresnými vektormi môžu byt plazmidy, vírusy alebo retrovírusy, ktoré nesú promótory získané, napríklad z takých zdrojov, ako sú adenovírusy, SV40, parvovírusy, vírus vakcíny alebo cytomegalovírus. Reprezentatívnym príkladom vhodných expresných vektorov sú pCDNAl, pCD viď. Okayama a kol. (1985) Mol. Celí Biol. 5: 1136-1142, pMClneo Poly-A viď Thomas a kol. (1987) Celí 51: 503-512 a vektor baculovírusu, ako je pAC 373 alebo pAC 610.Transformation or transfection and propagation of such cells has become routine. Examples of cell lines used are HeLa cells, Chinese harmster ovary (CHO) cell line, baby rat kidney (BRK) cell line, insect cell line, avian cell line and mouse cell line (COS). Expression vectors for such cell lines typically include an origin of replication, a promoter, a translation initiation site, an RNA splice site (if genomic DNA is used), a polyadenylation site, and a transcription termination site. These vectors also usually contain a selection or amplification gene. Suitable expression vectors may be plasmids, viruses or retroviruses which carry the promoters obtained, for example from sources such as adenoviruses, SV40, parvoviruses, vaccine virus or cytomegalovirus. Representative examples of suitable expression vectors are pCDNA1, pCD see p. Okayama et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136-1142, pMClneo Poly-A see Thomas et al. (1987) Cell 51: 503-512 and a baculovirus vector such as pAC 373 or pAC 610.

Často sa požaduje, aby sa polypeptid ludského BAS-1 antigénu exprimoval v systéme, ktorý dáva špecifický alebo definovaný glykozylačný vzor. V takom prípade bude obvyklý vzor prirodzene vybavený expresným systémom. Avšak vzor bude modifikovatelný tak, že na polypeptid, napríklad neglykozylovanú formu, pôsobia vhodné glykozylačné proteíny uvedené v heterológnom expresnom systéme. Napríklad gény antigénu BAS-1 môžu byť kontransformované jedným alebo viacerými génmi, ktoré kódujú cicavčie alebo iné glykozylačné enzýmy. Použitím tohto prístupu budú určité cicavčie glykozylačné vzory dosiahnuteľné alebo priblížené v prokaryotických alebo iných bunkách.It is often desired that a human BAS-1 antigen polypeptide be expressed in a system that yields a specific or defined glycosylation pattern. In this case, the conventional pattern will naturally be equipped with an expression system. However, the pattern will be modifiable so that the polypeptide, e.g., the non-glycosylated form, is treated with suitable glycosylation proteins listed in a heterologous expression system. For example, BAS-1 antigen genes may be transformed with one or more genes that encode mammalian or other glycosylation enzymes. Using this approach, certain mammalian glycosylation patterns will be achievable or approached in prokaryotic or other cells.

BAS-1 antigén by sa mohol tiež produkovať vo forme, ktorou je viazaný fosfatidylinozitol (PI), ale môže sa odstrániť z membrán použitím enzýmu štiepiaceho fosfatidylinozitol, napríklad fosfatidylinozitol fosfolipáza-C. Tak sa uvolní antigén v biologicky aktívnej forme a umožní purifikáciu štandardnými biochemickými spôsobmi. Viď. napríklad Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988: 427-454, Tse a kol. (1985) Science 230:The BAS-1 antigen could also be produced in a form that is bound to phosphatidylinositol (PI), but it can be removed from the membranes using a phosphatidylinositol-cleaving enzyme, for example phosphatidylinositol phospholipase-C. This releases the antigen in biologically active form and allows purification by standard biochemical methods. See. for example, Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988: 427-454, Tse et al. (1985) Science 230

1003-1008 a Bruner a kol. Alebo sa môžu zostrojiť napríklad na N-konci alebo alebo detekcii proteínového takých segmentov sa tiež štiepiacou miesta.1003-1008 and Bruner et al. Alternatively, they can also be constructed, for example, at the N-terminus or the detection of protein such segments with cleavage sites.

(1991) J. Celí Biol. 114: 1275-1283. purifikované segmenty v sekvencií, C-konci, aby pomáhali pri purifikácii produktu. To znamená, že odstránenie môže zostrojiť., napríklad proteázou(1991) J. Cell Biol. 114: 1275-1283. purified segments in the C-terminus sequence to aid in product purification. That is, removal can be constructed, for example, by a protease

Teraz je známa táto celá sekvencia a tak sa ľudské BAS-1 antigény, fragmenty alebo ich deriváty môžu pripraviť konvenčnými postupmi pre syntézu peptidov. Zahŕňajú tiež postupy, ako sú opísané v Stewart and Young (1984) Solid Phase peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York a Bodanszky (1984) The Principles of peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York. Napríklad sa môžu použiť azidový spôsob, chlorovodíkový spôsob, spôsob anhydridu kyseliny, spôsob miešaného anhydridu, spôsob aktívneho esteru (napríklad p-nitrofenylester, N-hydroxysukcínimidester alebo kyanometylester), karboxyimidazolový spôsob, oxidačno-redukčný spôsob alebo spôsob dicyklohexylkarbodiimid (DCCD)/aditívny. Tuhá fáza a roztok syntéz sú tiež pre skôr uvedené spôsoby aplikovateľné.This entire sequence is now known, and so human BAS-1 antigens, fragments or derivatives thereof can be prepared by conventional methods for peptide synthesis. They also include procedures as described in Stewart and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Bodanszky and Bodanszky (1984), Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, and Bodanszky (1984). ) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York. For example, the azide process, the hydrochloride process, the acid anhydride process, the mixed anhydride process, the active ester process (e.g., p-nitrophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester or cyanomethyl ester), carboxyimidazole process, oxidation reduction process or dicyclohexylcarbodiimide (DCCD) / additive process may be used. The solid phase and the synthesis solution are also applicable to the above methods.

Ľudské BAS-1 antigény, fragmenty alebo deriváty sa vhodne pripravia v súlade s vyššie uvedenými spôsobmi, ktoré sa typicky používajú v syntéze peptidov, vo všeobecnosti ktorýmkoľvek tzv. postupným spôsobom, ktorý zahŕňa kondenzáciu aminokyselín na koncovej aminokyseline v sekvencií alebo párovaním peptidových fragmentov na koncovej aminokyseline. Aminoskupiny, ktoré sa nepoužívajú na párovanie, sa musia chrániť, aby nedošlo k párovaniu v nesprávnej oblasti.Human BAS-1 antigens, fragments or derivatives are conveniently prepared in accordance with the above methods, which are typically used in peptide synthesis, generally by any of the so-called peptide synthesis. in a sequential manner, which comprises condensing the amino acids at the terminal amino acid in the sequence or pairing the peptide fragments at the terminal amino acid. Amino groups that are not used for pairing must be protected to avoid pairing in the wrong region.

Ak sa zvolí syntéza v tuhej fáze, C-koniec aminokyseliny sa naviaže na nerozpustný nosič alebo podklad svojou karboxylovou skupinou. Nerozpustný nosič nie je zvlášt limitovaný pokial má väzbovú kapacitu k reaktívnej karboxylovej skupine. Príkladom takých nerozpustných nosičov sú halogénmetylové živice, ako je chlórmetylová živica alebo brómmetylová živica, hydroxymetylové živice, fenolové živice, terc.-alkylkarbonylhydrazidované živice a pod.When solid phase synthesis is chosen, the C-terminus of the amino acid is attached to the insoluble carrier or support by its carboxyl group. The insoluble carrier is not particularly limited as long as it has a binding capacity to the reactive carboxyl group. Examples of such insoluble carriers are halomethyl resins, such as chloromethyl resins or bromomethyl resins, hydroxymethyl resins, phenolic resins, tert-alkylcarbonylhydrazidated resins, and the like.

Chránená aminoskupina aminokyseliny je viazaná v sekvencií kondenzáciou svojej aktivovanej karboxylovej skupiny a reaktívnej aminokyseliny skôr vzniknutého peptidu alebo reťazca, aby sa postupne syntetizoval peptid. Po syntéze kompletnej sekvencie sa peptid odtrhne od nerozpustného nosiča a vznikne samotný peptid. Získanie tuhej fázy vo všeobecnosti opisuje Merrifield a kol. (1963) v J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156.A protected amino group of an amino acid is linked in sequence by condensing its activated carboxyl group and the reactive amino acid of the previously formed peptide or chain to sequentially synthesize the peptide. After synthesis of the complete sequence, the peptide is detached from the insoluble carrier to form the peptide itself. Solid phase recovery is generally described by Merrifield et al. (1963) in J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156.

Pripravovaný antigén a jeho fragmenty sa môžu izolovať a purifikovat z reakčnej zmesi separáciou peptidov, napríklad extrakciou, precipitáciou, elektroforézou a radom rôznych chromatografii a pod. Ľudské BAS-1 antigény v tomto vynáleze sa čistoty v závislosti na môže dosiahnuť tu objavenými alebo použitím tu opísaných môžu získať v rôznych stupňoch požadovanom použití. Purifikácia sa technikami proteínovej purifikácie protilátok v aminoabsorpčnej afinitnej chromatografii. Táto aminoabsorpčná afinitná chromatografia sa uskutoční najskôr väzbou protilátky na tuhý podklad a potom spojením naviazanej protilátky s rozpustnými lyzátmi malej bunky pľúcnych rakovinových buniek, lyzátmi iných buniek, ktoré exprimujú BA^-1 antigény alebo lyzátmi alebo supernatantmi buniek, ktoré produkujú BAS-1 antigény ako výsledok DNA techník, viď. nižšie.The antigen to be prepared and fragments thereof can be isolated and purified from the reaction mixture by peptide separation, for example, by extraction, precipitation, electrophoresis, and a variety of different chromatographies and the like. The human BAS-1 antigens in the present invention can, depending on the purity, be achieved by the disclosed herein or by the use described herein can be obtained at various stages of the desired use. Purification by protein purification techniques of the antibodies in aminoabsorbent affinity chromatography. This aminoabsorption affinity chromatography is performed by first binding the antibody to a solid support and then coupling the bound antibody to soluble lysates of small cell lung cancer cells, lysates of other cells that express BA ^ -1 antigens or cell lysates or supernatants that produce BAS-1 antigens as result of DNA techniques, see. below.

VIII. PoužitieVIII. The use

Predkladaný vynález poskytuje látky, ktoré nájdu použitie v diagnostike, ako je tu niekde opísané, napríklad všeobecný opis vývojových a fyziologických abnormalít alebo v nižšie uvedenom opise súprav na diagnostiku.The present invention provides substances that find use in diagnostics as described herein, for example, a general description of developmental and physiological abnormalities, or in the description of diagnostic kits below.

Tento vynález tiež poskytuje látky s dôležitým terapeutickým významom. Ľudský BAS-1 (prírodné sa vyskytujúci rekombinant), jeho fragmenty a protilátky spolu s identifikovanými látkami, ktoré majú väzbovú aktivitu k ludskému BAS-1, by sa mohli použiť na liečenie stavu spojeného s abnormálnou B bunkovou odpoveďou, ktorá zahŕňa abnormálnu proliferáciu, napríklad rakovinové stavy alebo degeneratívne stavy. Abnormálna proliferácia, regenerácia, degenerácia a atrofia sa môžu modulovať vhodnou terapeutickou liečbou s použitím zložiek, ktoré sú tu poskytnuté. Napríklad choroba alebo ťažkosti spojené s abnormálnou expresiou alebo abnormálnym pôsobením BAS-1 by mohli byť pravdepodobne cielom agonistov alebo antagonistov antigénu. BAS-1 pravdepodobne hrá úlohu v aktivácii alebo regulácii B buniek, ktoré ovplyvňujú imunologické odpovede, napríklad autoimúnne ťažkosti alebo alergické odpovede.The present invention also provides substances of important therapeutic importance. Human BAS-1 (naturally occurring recombinant), fragments thereof, and antibodies, together with identified substances having binding activity to human BAS-1, could be used to treat a condition associated with an abnormal B cell response that includes abnormal proliferation, e.g. cancerous conditions or degenerative conditions. Abnormal proliferation, regeneration, degeneration, and atrophy can be modulated by appropriate therapeutic treatment using the ingredients provided herein. For example, a disease or difficulty associated with abnormal expression or abnormal action of BAS-1 might be a target for antigen agonists or antagonists. BAS-1 is likely to play a role in the activation or regulation of B cells that affect immunological responses, such as autoimmune disorders or allergic responses.

Okrem iného, interakcia BAS-1:BAS-1 väzbový partner môže byt zahrnutá v T:B bunkovej interakcii, ktorá pripúšťa aktiváciu, proliferáciu a/alebo diferenciáciu jednoduchých B buniek, ako bolo pozorované v hyper-IgM syndróme. Teda liečenie môže spôsobovať druh interferencie s BAS-1:BAS-1 signálnou transdukciou. Blokovanie signálu môže byť spôsobené, napríklad rozpustným BAS-1 alebo protilátkou k BAS-1.Among other things, the BAS-1: BAS-1 binding partner interaction may be involved in a T: B cell interaction that permits activation, proliferation and / or differentiation of single B cells as observed in hyper-IgM syndrome. Thus, treatment may cause a kind of interference with BAS-1: BAS-1 signal transduction. Signal blocking may be due, for example, to soluble BAS-1 or an antibody to BAS-1.

Interakcia BAS-1:BAS-1 väzbového partnera sa môže tiež vyžadovať v iniciácii a/alebo regulácii silnej proliferác'ie B bunkových blastov a centroblastov v tmavej oblasti zádoročných centier. Viď. napríklad Banchereau and Rosset (1992) Adv. Immunol. 125: 868-877. Interakcie bunkového povrchu zahrnuté v signáli, aby iniciovali a/alebo regulovali somatický mutačný proces Ig, môžu tiež vyžadovať BAS-1 a môžu sa regulovať agonistickými alebo antagonistickými zákrokmi.BAS-1: BAS-1 binding partner interaction may also be required to initiate and / or regulate strong proliferation of B cell blasts and centroblasts in the dark region of the posterior centers. See. for example, Banchereau and Rosset (1992) Adv. Immunol. 125: 868-877. Cell surface interactions involved in the signal to initiate and / or regulate the somatic Ig mutation process may also require BAS-1 and may be regulated by agonist or antagonist interventions.

Iné abnormálne vývojové stavy sú známe v každom bunkovom type, analýzou Nothernovho prenosu dokazujú, že majú BAS-l mRNA. Viď. Berkow (ed.) The Merck Manual Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway N. J. a Thorn a kol. Harrison's Principles of Internal Medicíne, McGraw-Hill, N. Y. Napríklad terapeutická imunosupresia sa môže dosiahnuť blokáciou T lymfocytu a interakciou B lymfocytu s touto molekulou. Predstavuje dôležitú terapiu na kontrolu autoimúnnych ochorení a odmietnutia štepu počas transplantácie. Alebo anti-B bunková tumorová terapia sa môže dosiahnuť blokáciou rastu a zostávajúcich vplyvov BAS-l na B bunky. Blokácia sa môže ovplyvniť zložením blokujúcich väzieb, napríklad neutralizačnými protilátkami alebo molekulami, ktoré interferujú s interakciou BAS-l s protireceptorom. Rozpustný BAS-l môže blokovať protireceptorovú väzbu.Other abnormal developmental states are known in each cell type, and by Northern blot analysis show that they have BAS-1 mRNA. See. Berkow (ed.) The Merck Manual Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway N.J. and Thorn et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y. For example, therapeutic immunosuppression can be achieved by blocking a T cell and interacting a B cell with this molecule. It is an important therapy for the control of autoimmune diseases and graft rejection during transplantation. Alternatively, anti-B cell tumor therapy can be achieved by blocking the growth and remaining effects of BAS-1 on B cells. The blocking can be influenced by the composition of the blocking bonds, for example by neutralizing antibodies or molecules that interfere with the interaction of BAS-1 with a counter receptor. Soluble BAS-1 may block the anti-receptor binding.

Rekombinantný purifikovať a potom terapeutické účelyRecombinant purified and then therapeutic purposes

BAS-l alebo BAS-l protilátky sa môžu zaviesť do pacienta. Tieto látky sa môžu na kombinovať s ďalšími aktívnymi zložkami, napríklad konvenčnými farmaceutický prijatelnými nosičmi alebo rozpúšťadlami, napríklad imunogénne adjuvans spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a mastovými základmi. Tieto kombinácie sa môžu sterilizovať filtráciou a nadávkovať do dávkovacích flaštičiek lyofilizáciou alebo uskladniť vo forme stabilizovaného vodného roztoku. Tento vynález tiež opisuje použitie protilátok alebo ich väzbových fragmentov, ktoré nie sú doplnené väzbou.BAS-1 or BAS-1 antibodies can be introduced into a patient. These substances may be combined with other active ingredients, for example conventional pharmaceutically acceptable carriers or solvents, for example an immunogenic adjuvant together with physiologically acceptable stabilizers and ointment bases. These combinations can be sterilized by filtration and dispensed into dispensing vials by lyophilization or stored as a stabilized aqueous solution. The invention also describes the use of antibodies or binding fragments thereof that are not complemented by binding.

Preskúmanie lieku, ktorý používa BAS-l alebo jeho fragmenty, sa môže uskutočniť tak, aby sa identifikovali zlúčeniny s väzbovou afinitou k BAS-l vrátane izolácie spojených zložiek. Potom sa môžu využiť ďalšie biologické stanovenia na určenie, či má látka skutočnú stimulačnú aktivitu a teda spôsobuje blokáciu a/alebo je antagonista, teda blokuje aktivitu ligandu. Rovnako tak môže látka s vlastnou stimulačnou aktivitou aktivovať antigén a je teda agonista tým, že simuluje aktivitu BAS-l. Tento vynález ďalej opisuje terapeutické využitie protilátok proti BAS-l ako antagonistom. Toto zistenie by sa mohlo predovšetkým použiť s ďalšími druhmi BAS-1.Examination of a drug that uses BAS-1 or fragments thereof may be performed to identify compounds with a binding affinity for BAS-1, including isolation of the associated components. Other biological assays can then be used to determine whether the agent has a real stimulatory activity and thus causes blocking and / or is an antagonist, thus blocking ligand activity. Likewise, a substance with intrinsic stimulating activity can activate an antigen and is therefore an agonist by simulating BAS-1 activity. The present invention further describes the therapeutic utility of BAS-1 antibodies as antagonists. This finding could in particular be used with other BAS-1 species.

Množstvo látok nevyhnutných na účinnú terapiu bude závisieť na mnohých rôznych faktoroch, ako sú riadenie, cielové miesto, fyziologický stav pacienta a ďalšie podávané lieky. Liečebné dávky by sa a efektívnosť, užitočnú radu optimálnu bezpečnosť vitro môžu poskytovať in situ podanie týchto zvierat pri liečení teda mali titrovať na Typické dávky použité in o množstve použitom na látok. Testovanie efektívnej dávky u konkrétnych ťažkostí poskytuje ďalšie predbežné indikácie ludskej dávky. Rad prípadov opisujú napríklad Gilman a kol. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases ofThe amount of substances necessary for effective therapy will depend on many different factors such as control, target site, physiological state of the patient and other drugs administered. Treatment dosages and efficacy, useful advice, optimal in vitro safety can provide in situ administration of these animals in treatment therefore titrated to Typical dosages used in in amounts applied to the substances. Testing the effective dose for particular difficulties provides additional preliminary indications of the human dose. A number of cases are described, for example, by Gilman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman ' s: The Pharmacological Bases of

Therapeutics, 8. ed., Pergamon Press a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Spôsoby podávania sú tu aj nižšie diskutované, napríklad na orálne, intravenózne, intraperitoneálne alebo vnútrosvalové, transdermálne difúzie a ďalšie. Farmaceutický vhodnými nosičmi sú voda, solné roztoky, pufre a ďalšie, ktoré uvádza napríklad Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Rozpätie dávok sa bežne predpokladá, že je v množstve koncentrácie menšej ako 1 mM, typicky menšej ako 10 μΜ, obvykle menšej ako 100 nM, lepšie nižšej ako 10 pM (pikomolárne) a najlepšie menšie ako 1 fm (femtomolárne) vo vhodnom nosiči. Pomaly sa uvoľňujúce látky alebo zariadenie na pomalé uvoľňovanie látok sa často používajú na nepretržité podávanie.Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Methods of administration are also discussed herein, for example, for oral, intravenous, intraperitoneal or intramuscular, transdermal diffusions, and others. Pharmaceutically acceptable carriers are water, saline, buffers, and others, such as those disclosed by the Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Dose ranges are commonly believed to be in an amount of less than 1 mM, typically less than 10 µΜ, usually less than 100 nM, preferably less than 10 µM (picomolar) and preferably less than 1 fm (femtomolar) in a suitable carrier. Slow release or slow release devices are often used for continuous administration.

Ľudský BAS-1, jeho fragmenty a protilátky proti nemu alebo jeho fragmentom, antagonisty a agonisty sa môžu zaviesť priamo do hostiteľa, aby ho liečili alebo v závislosti na veľkosti zlúčenín sa požaduje, aby konjugovali na nosičových proteínoch, ako sú ovalbumín, sérový albumín, ešte pred ich podávaním. Terapeutické látky sa môžu podávať v mnohých konvenčných dávkach. Zatiaľ čo sa môže aktívna zložka zavádzať samotná, je vhodnejšie podávať ju ako farmaceutickú látku. Látky skôr obsahujú aspoň jednu aktívnu zložku, ako je definované vyššie, spolu s jedným alebo viacerými prijateľnými nosičmi. Každý nosič by mal byť ako farmaceutický,Human BAS-1, fragments thereof and antibodies thereto or fragments thereof, antagonists and agonists can be introduced directly into the host to treat it or, depending on the size of the compounds, are required to conjugate to carrier proteins such as ovalbumin, serum albumin, before serving. The therapeutic agents can be administered in many conventional doses. While the active ingredient can be introduced by itself, it is preferable to administer it as a pharmaceutical. Rather, the agents comprise at least one active ingredient as defined above together with one or more acceptable carriers. Each carrier should be a pharmaceutical,

- 38 tak fyziologicky prijateľný z hľadiska kompatibility s inými zložkami a nemal by byť pre pacienta škodlivý. Látky sa podávajú miestne, orálne, rektálne, nasálne alebo parenterálne (toto zahŕňa subkutánne, vnútrosvalovo, intravenózne a intradermálne). Látky sa môžu vhodne podávať v jednotkovej dávkovej forme a môžu sa pripraviť spôsobmi v odbore farmácie dobre známymi. Viď. napríklad Gilman a kol. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. ed., Pergamon Press a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Terapia v tomto vynáleze sa môže kombinovať alebo používať v spojení s inými chemoterapeutickými alebo chemopreventívnymi činidlami.Thus, it is physiologically acceptable for compatibility with other ingredients and should not be harmful to the patient. The agents are administered topically, orally, rectally, nasally or parenterally (this includes subcutaneously, intramuscularly, intravenously and intradermally). The agents may conveniently be administered in unit dosage form and may be prepared by methods well known in the art of pharmacy. See. for example, Gilman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. The therapy of the invention may be combined or used in conjunction with other chemotherapeutic or chemopreventive agents.

Obidve formy BAS-1 antigénu, pôvodne sa vyskytujúci a rekombinantný tvar, sa v tomto vynáleze používajú najmä v súpravách a pri spôsoboch stanovenia, ktoré sú schopné preskúmavat väzbovú aktivitu zlúčenín na proteíny. V posledných rokoch sa vyvinuli niektoré spôsoby automatických stanovení, ktoré umožňujú počas krátkeho času preskúmavat desaťtisíce látok. Viď. napríklad Fodor a kol. (1991) Science 251: 767-773, kde je opísané testovanie väzbovej afinity množstvom definovaných polymérov syntetizovaných na tuhom substráte. Vývoj vhodných stanovení sa môže značne ulahčit dostupnosťou velkého množstva purifikovaného, rozpustného BAS-1, ako poskytuje tento vynález.Both baseline and recombinant forms of the BAS-1 antigen are used in this invention in particular in kits and assay methods that are capable of examining the binding activity of compounds to proteins. In recent years, some methods of automatic determination have been developed which allow tens of thousands of substances to be examined in a short time. See. for example, Fodor et al. (1991) Science 251: 767-773, which describes the binding affinity testing of a number of defined polymers synthesized on a solid substrate. The development of suitable assays can be greatly facilitated by the availability of large amounts of purified, soluble BAS-1 as provided by the present invention.

Napríklad, antagonisty sa môžu obvykle zistiť, akonáhle je BAS-1 štruktúrne definovaný. Testovať potencionálne ligandové antagonisty je teraz možné vďaka rozvoju vysoko automatizovaných spôsobov stanovenia, ktoré používajú purifikovaný BAS-1. Použitím tu opísaných techník preskúmavania je najmä možné objaviť nové agonisty a antagonisty. Predovšetkým dôležité sú tie zistené látky, ktoré majú kombinovanú väzbovú aktivitu k početným BAS-1 proteínom, napríklad zlúčeniny, ktoré môžu slúžiť ako antagonisty pre alelické varianty BAS-1.For example, antagonists can usually be detected once BAS-1 is structurally defined. Testing for potential ligand antagonists is now possible due to the development of highly automated assay methods that use purified BAS-1. In particular, novel agonists and antagonists can be discovered using the screening techniques described herein. Of particular importance are those substances found which have combined binding activity to a number of BAS-1 proteins, for example compounds which can serve as antagonists for allelic variants of BAS-1.

Okrem toho, keďže signalizovanie BAS-1:BAS-1 väzbový partner môže fungovať v kombinácii s inými signálmi, napríklad CD28/CTLA-4:B7/B70 a/alebo dráhou CD40:CD40 ligand, kombinácia zložiek alebo kombinácia terapie s takými dráhami sa môže tiež brať do úvahy. Teda sa môže použiť antagonizmus početných signálových dráh alebo stimulácia s mnohými dráhami.In addition, since BAS-1: BAS-1 binding partner signaling may function in combination with other signals, for example, CD28 / CTLA-4: B7 / B70 and / or the CD40: CD40 ligand pathway, a combination of components, or a combination of therapies with such pathways. can also take into account. Thus, antagonism of multiple signaling pathways or multiple pathway stimulation may be used.

Tento vynález je predovšetkým zameraný na preskúmanie zlúčenín pomocou rekombinantných antigénov akýmkoľvek druhom techniky preskúmania liekov. Výhody používania rekombinantných proteínov v preskúmavaní špecifických ligandov sú:In particular, the present invention is directed to the screening of compounds using recombinant antigens by any type of drug screening technique. The advantages of using recombinant proteins in screening specific ligands are:

a) zlepšenie obnovitelného zdroja BAS-1 zo špecifického zdroja,(a) improvement of a BAS-1 renewable resource from a specific source;

b) teoreticky väčší počet molekúl antigénu na bunku s lepším pomerom signálu k šumu v stanovení a(b) theoretically a greater number of antigen molecules per cell with a better signal-to-noise ratio in the assay; and

c) druh variantovej špecificity (teoreticky s väčšou biologickou špecificitou a špecificitou choroby).(c) the type of variant specificity (theoretically with greater biological and disease specificity).

Jedna zo spôsobov preskúmavania liekov využíva eukaryotické a prokaryotické bunky hostitela, ktoré sú stabilne transformované rekombinantnými molekulami DNA, ktoré exprimujú BAS-1. Bunky sa môžu izolovať, pričom sa počas izolácie z iných exprimuje BAS-1. Také bunky sa môžu, buď živé alebo vo fixovanej forme, použiť na štandardné antigén/ligand väzbové stanovenie. Viď. tiež Parce a kol. (1989) Science 246: 243-247 a Owicki a kol. (1990) Proc. Naťl Acad. Sci. USA 87: 4007-4011, kde sa opisujú citlivé spôsoby detekcie bunkových odpovedí. Kompetitívne stanovenia sa používajú najmä, keď sú bunky (zdroj BAS-1) naviazďné a inkubované so značeným ligandom so známou väzbovou afinitou k antigénu, ako je ligand _a testovaná zlúčenina, ktorej väzbová afinita k BAS-1 je zmeraná. Naviazaný a volný ligand sa potom oddelia, aby sa určil stupeň väzby ligandu. Množstvo viazanej testovanej zlúčeniny je nepriamo úmerné množstvu meranej značenej ligandovej väzby. Akákolvek z mnohých techník sa môže použiť na oddelenie väzby z volného ligandu, aby sa určil stupeň ligandovej väzby. Tento separačný krok by mohol vyžadovať postup, ako je adhézia na filter, následné premytie alebo bunky by sa mohli tiež funkcie BAS-1, napríklad následne premytie, adhézia na plast, centrifugácia bunkových membrán. Živé použiť na skúmanie vplyvov liekov na druhá mediátorová hladina, t.j. Ca²⁺, bunková proliferácia, zmeny inozitolfosfátových zásob a ďalšie. Niektoré spôsoby detekcie umožňujú elimináciu separačného kroku, napríklad blízkosť senzitívneho detekčného systému. Farbivo citlivé na vápnik sa môže použiť na detekciu hladiny Ca²⁺ s využitím fluorimetra alebo prístrojom, ktorý rozdeluje bunky podlá fluorescencie.One method of drug discovery utilizes host eukaryotic and prokaryotic cells that are stably transformed with recombinant DNA molecules that express BAS-1. Cells can be isolated, while BAS-1 is expressed from others during isolation. Such cells can be used, either live or in fixed form, for a standard antigen / ligand binding assay. See. also Parce et al. (1989) Science 246: 243-247 and Owicki et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 4007-4011, which discloses sensitive methods for detecting cellular responses. Competition assays are particularly used when cells (source of BAS-1) are bound and incubated with labeled ligand with known antigen binding affinity, such as a ligand, _{and a} test compound whose binding affinity for BAS-1 is measured. The bound and free ligand are then separated to determine the degree of ligand binding. The amount of bound test compound is inversely proportional to the amount of labeled ligand binding measured. Any of a variety of techniques can be used to separate binding from a free ligand to determine the degree of ligand binding. This separation step might require a procedure such as filter adhesion, subsequent washing or cells could also be BAS-1 functions, for example, subsequent washing, plastic adhesion, cell membrane centrifugation. Live used to investigate the effects of drugs on the second mediator level, ie Ca ²⁺ , cell proliferation, changes in inositol phosphate stores and more. Some detection methods allow the elimination of the separation step, for example the proximity of a sensitive detection system. The calcium sensitive dye can be used to detect the Ca ²⁺ level using a fluorimeter or an instrument that divides cells by fluorescence.

Iné spôsoby využívajú membrány transformovaných eukaryotických alebo prokaryotických buniek hostitela ako zdroja ludského BAS-1. Tieto bunky sú stabilne transformované s DNA vektormi, ktoré riadia expresiu ludského BAS-1 antigénu. V podstate by sa membrány pripravili z iných buniek a použili sa v akýchkoľvek receptor/ligand väzbových stanoveniach, ako je kompetitívne stanovenie uvedené vyššie.Other methods use membranes of transformed eukaryotic or prokaryotic host cells as a source of human BAS-1. These cells are stably transformed with DNA vectors that direct expression of the human BAS-1 antigen. Essentially, membranes would be prepared from other cells and used in any receptor / ligand binding assays, such as the competitive assays mentioned above.

Ešte ďalším prístupom je nepurifikovaného alebo rozpustného, z transformovaných eukaryotických a hostitela. Toto umožňuje stanovenie použitie rozpustného, purifikovaného BAS-1 prokaryotických buniek molekulárnej väzby s výhodami zvýšenia špecificity, schopnosti automatizovať a vysokého výkonu testovaného lieku.Yet another approach is unpurified or soluble from transformed eukaryotic and host. This allows the determination of the use of soluble, purified BAS-1 prokaryotic molecular binding cells with the advantages of increased specificity, automation ability, and high throughput of the test drug.

Iná technika skúmania lieku zahŕňa prístup, ktorý zabezpečuje vysoký výkon preskúmavania zlúčenín s vhodrfou väzbovou afinitou k BAS-1 a podrobne ju opisuje Geysen, European Patent Application 84/03564, publikovaná 13. septembra 1984. Najskôr sa na tuhom substráte, napríklad umelohmotné špendlíky alebo niektoré iné vhodné povrchy, viď. Fodor a kol (1991), syntetizuje veľké množstvo rôznych malých peptidových testovaných zlúčenín. Potom všetky špendlíky reagujú s rozpustným, nepurifikovaným alebo rozpustným, purifikovaným BAS-1 a premyjú sa. Ďalším krokom je detekcia viazaného BAS-1.Another drug screening technique involves an approach that provides high performance screening of compounds with appropriate BAS-1 binding affinity and is described in detail in Geysen, European Patent Application 84/03564, published September 13, 1984. First, a solid substrate, such as plastic pins or some other suitable surfaces, see. Fodor et al (1991) synthesizes a large number of different small peptide test compounds. Then, all pins are reacted with soluble, unpurified or soluble, purified BAS-1 and washed. The next step is to detect bound BAS-1.

Racionálna forma lieku môže byt tiež založená na štrukturálnych štúdiách molekulárneho tvaru BAS-1 a iných efektorov alebo ligandov. Efektory môžu byt iné proteíny, ktoré sprostredkujú iné funkcie v odpovedi na ligandovú väzbu alebo iné proteíny, ktoré obvykle interagujú s antigénom. Jedným zo spôsobov, ako určiť miesto interakcie so špecifickými ďalšími proteínmi, je určenie fyzikálnej štruktúry, napríklad štruktúrnej kryštalografie alebo technika dvojrozmernej NMR. Tieto poskytnú informácie o tom, na ktorých aminokyselinových zvyškoch sa tvoria molekulárne spojenia. Podrobnejší opis určenia štruktúry proteínuThe rational form of the drug may also be based on structural studies of the molecular shape of BAS-1 and other effectors or ligands. The effectors may be other proteins that mediate other functions in response to ligand binding or other proteins that usually interact with the antigen. One way to determine the site of interaction with specific other proteins is to determine the physical structure, for example, structural crystallography or a two-dimensional NMR technique. These will provide information on which amino acid residues the molecular linkages are formed at. A more detailed description of protein structure determination

je napríklad v Blundell is in Blundell, for example and and Johnson Johnson (1976) (1976) Protein protein Crystallography, Academic Press, Crystallography, Academic Press, New New York. York. Purifikovaný BAS-1 sa môže Purified BAS-1 may be na on the použitie the use vo vyššie in the above uvedenej that technike skúmania liečiv naliať pour the drug priamo right na misky. on bowls. Avšak however

protilátky, ktoré nie sú neutralizačné proti týmto antigénom, sa môžu použiť ako nosiče protilátok pri imobilizácii príslušného BAS-1 na tuhú fázu.antibodies that are not neutralizing against these antigens can be used as antibody carriers in immobilizing the appropriate BAS-1 to the solid phase.

IX. SúpravyIX. sets

Tento vynález tiež zahŕňa použitie BAS-1 proteínov, jeho fragmentov a ich fúznych produktov v rade diagnostických súprav a spôsoby na detekciu prítomnosti BAS-1 alebo ligandu. Bežne má súprava časť, ktorá obsahuje buď definovaný BAS-1 peptid alebo génový segment alebo látku, ktorá rozpozná jeden alebo druhý.The invention also encompasses the use of BAS-1 proteins, fragments thereof, and fusion products thereof in a variety of diagnostic kits and methods for detecting the presence of BAS-1 or a ligand. Typically, the kit has a moiety that contains either a defined BAS-1 peptide or gene segment or a substance that recognizes one or the other.

ZFROM

Súprava na detekciu väzbovej afinity testovanej zlúčeniny k BAS-1 bežne obsahuje testovanú látku, značenú látku, napríklad ligand alebo protilátku so známou väzbovou afinitou k BAS-1, zdroj BAS-1 (prírodné sa vyskytujúci alebo rekombinantný) a prostriedok na oddelenie väzby z volne značenej látky, ako je tuhá fáza pre imobilizovaný BAS-1. Akonáhle sú zlúčeniny preskúmané, tak tie látky, ktoré majú väzbovú afinitu k BAS-1 sa môžu vyhodnotiť vhodnými v odbore dobre známymi biologickými rozbormi, aby sa určilo, či ide o agonisty alebo antagonisty. Použiteľnosť rekombinantných BAS-1 polypeptidov tiež zabezpečuje dobre definované štandardy na kalibráciu takých stanovení.A kit for detecting the binding affinity of a test compound to BAS-1 typically comprises a test substance, a labeled substance, such as a ligand or antibody with known binding affinity to BAS-1, a BAS-1 source (naturally occurring or recombinant) and a means for separating binding from free a labeled substance, such as a solid phase for immobilized BAS-1. Once the compounds are investigated, those compounds having a binding affinity for BAS-1 can be evaluated by appropriate bioassays well known in the art to determine whether they are agonists or antagonists. The usefulness of recombinant BAS-1 polypeptides also provides well-defined standards for the calibration of such assays.

Vhodnejšia súprava na určenie koncentrácie, napríklad BAS-1 vo vzorke, by mala bežne obsahovať značenú látku, napríklad ligand alebo protilátku, s dobre známou väzbovou afinitou k BAS-1, zdroj BAS-1 (prírodné sa vyskytujúci alebo rekombinantný) a prostriedok na oddelenie väzby z voľne značenej látky, napríklad tuhá fáza pre imobilizovaný BAS-1. Časť, ktorá obsahuje činidlá a inštrukcie sa obvykle poskytne.A more convenient concentration determination kit, for example, BAS-1 in a sample, would normally contain a labeled substance, such as a ligand or antibody, with a well-known BAS-1 binding affinity, a BAS-1 source (naturally occurring or recombinant) and a means for free label linkages, for example, solid phase for immobilized BAS-1. The portion that contains the reagents and instructions is usually provided.

Spôsob na určenie koncentrácie BAS-1 vo vzorke by mal typicky zahŕňať tieto kroky:The method for determining the concentration of BAS-1 in a sample should typically include the following steps:

1) prípravu membrán zo vzorky s obsahom zdroja BAS-1,1) preparing membranes from a sample containing a BAS-1 source;

2) premytie membrány a suspendovanie v pufri,2) washing the membrane and suspending in the buffer,

3) rozpustenie BAS-1 inkubáciou membrány v kultivačnom médiu, do ktorého je pridaný vhodný detergent,3) dissolving BAS-1 by incubating the membrane in culture medium to which a suitable detergent is added,

4) upravenie koncentrácie detergentu rozpusteného BAS-1,4) adjusting the detergent concentration of the dissolved BAS-1;

5) spojenie a inkubáciu uvedeného roztoku s rádioznačeným ligandom do komplexov,5) combining and incubating said solution with radiolabeled ligand into complexes,

6) opätovne získanie komplexov filtráciou cez polyetylénimíňom upravený filter a6) recovering the complexes by filtration through a polyethyleneimine treated filter; and

7) meranie rádioaktivity opätovne získaných komplexov.7) measuring the radioactivity of the recovered complexes.

Prolilátky vrátane špecifické pre ľudský v diagnostike používajú, fragmentov, ktoré viažu antigén, BAS-1 alebo BAS-1 fragmenty sa napríklad na detekciu prítomnosti zvýšenej hladiny BAS-1 a/alebo jeho fragmentov. V takých diagnostických stanoveniach sa môžu používať lyzáty, živé bunky, fixované bunky, imunofluorescencia, bunkové kultúry, telesné tekutiny a ďalšie, ktoré môžu detegovať antigény príbuzné k BAS-1 v sére alebo podobne. Diagnostické rozbory môžu byť homogénne (bez separačného kroku medzi volnou látkou a komplexom antigén-ligand) alebo heterogénne (vrátane separačnho kroku). Existuje vela komerčných stanovení, ako sú rádioimunoanalýza (RIA), enzýmovo spriahnuté imunochemické stanovenia (ELISA), enzýmová analýza (EIA), mnohonásobne enzýmová imunoanalyzačná technika (EMIT), substrátovo značená fluorescenčná imunoanalýza (SLFIA) a podobne. Napríklad neznačené protilátky sa môžu použiť s druhou protilátkou, ktorá je značená a ktorá rozpozná protilátku proti BAS-1 alebo proti jeho konkrétnemu fragmentu. Tieto stanovenia boli v literatúre značne diskutované. Viď. napríklad Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.Antibodies, including human-specific, are used in diagnosis, antigen-binding fragments, BAS-1 or BAS-1 fragments, for example, to detect the presence of elevated levels of BAS-1 and / or fragments thereof. Such diagnostic assays may use lysates, living cells, fixed cells, immunofluorescence, cell cultures, body fluids, and others that can detect antigens related to BAS-1 in serum or the like. The diagnostic assays may be homogeneous (without the separation step between the free substance and the antigen-ligand complex) or heterogeneous (including the separation step). There are many commercial assays, such as radioimmunoassay (RIA), enzyme linked immunochemical assays (ELISA), enzyme analysis (EIA), multiple enzyme immunoassay techniques (EMIT), substrate-labeled fluorescent immunoassays (SLFIA), and the like. For example, unlabeled antibodies can be used with a second antibody that is labeled and which recognizes an antibody against BAS-1 or a particular fragment thereof. These assays have been extensively discussed in the literature. See. for example, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.

Antiidiotypové protilátky sa môžu podobne používať na stanovenie prítomnosti protilátok proti ludskému BAS-1, ako také môžu byť diagnostické pre rôzne abnormálne stavy. Napríklad nadprodukcia BAS-1 môže byť výsledkom produkcie rôznych imunologických reakcií, ktoré môžu byť diagnostické pre abnormálne fyziologické stavy, najmä v rozrastaní bunkových foriem ako je rakovina alebo abnormálna diferenciácia.Similarly, anti-idiotypic antibodies can be used to determine the presence of antibodies against human BAS-1, as such can be diagnosed for various abnormal conditions. For example, BAS-1 overproduction may result from the production of various immunological responses that may be diagnostic of abnormal physiological conditions, particularly in the growth of cellular forms such as cancer or abnormal differentiation.

Často sa činidlá na diagnostické stanovenia dodávajú v súpravách tak, aby sa optimalizovala citlivosť stanovenia. Predmet vynálezu, ktorý závisí na podstate rozboru, protokole a značenej látke, buď značenej alebo neznačenej protilátky BAS-1 je zabezpečený. Obvykle je v spojení s ďalšími prísadami, ako sú pufre, stabilizátory, materiály nevyhnutné na signálnu produkciu, ako sú enzýmové substráty a pod. Je vhodné, keď bude súprava obsahovať inštrukcie pre správne použitie a odstraňovanie obsahu po použití. Súprava má bežné časti pre každé použité činidlo. Činidlá sa vhodne dodávajú vo forme suchého lyofilizovaného prášku, čím sa môžu rozpustiť vo vodnom médiu, ktoré zabezpečuje vhodné koncentrácie činidiel pre funkčné stanovenie.Often reagents for diagnostic assays are provided in kits to optimize assay sensitivity. The subject matter of the invention, which depends on the nature of the assay, protocol and label, either labeled or unlabeled BAS-1 antibody, is provided. It is usually combined with other additives such as buffers, stabilizers, materials necessary for signal production, such as enzyme substrates and the like. Suitably, the kit will include instructions for proper use and removal of contents after use. The kit has common parts for each reagent used. The reagents are conveniently supplied in the form of a dry lyophilized powder, whereby they can be dissolved in an aqueous medium that provides appropriate concentrations of the reagents for the functional assay.

Niektoré z vyššie uvedených základných zložiek skúmania liekov a diagnostických rozborov sa môžu použiť bez modifikácií alebo sa môžu rôznymi spôsobmi modifikovať. Napríklad značenie sa môže dosiahnuť väzbou kovalentnéj alebo nekovalentnej skupiny, ktorá poskytuje priamo alebo nepriamo detegovateľný signál. V niektorých týchto stanoveniach môžu byť ligand, testovaná látka, BAS-1 alebo protilátky značené buď priamo alebo nepriamo. Možnosti priameho značenia zahŕňajú značené skupiny: látka značená rádioaktívne, ako je I, enzýmy (U. S. Patent č. 3 645 090), ako sú peroxidáza a alkalická fosfatáza a látky značené fluorescenčné (U. S. Patent č. 3 940 475) schopné zaznamenávať zmenu vo fluorescenčnej intenzite, posun vlnovej dĺžky alebo fluorescenčná polarizácia. Obidva patenty sú tu uvedené v citáciách. Možnosti nepriameho značenia zahŕňajú biotinyláciu jednej zložky, následnú väzbu na avidinový pár na jednu zo značených skupín.Some of the above-mentioned essential components of drug research and diagnostic assays may be used without modification or may be modified in various ways. For example, labeling may be accomplished by binding a covalent or non-covalent moiety that provides a directly or indirectly detectable signal. In some of these assays, the ligand, test substance, BAS-1, or antibodies may be labeled either directly or indirectly. Direct labeling options include labeled groups: a radiolabelled substance such as I, enzymes (US Patent No. 3,645,090), such as peroxidase and alkaline phosphatase, and fluorescent labeled substances (US Patent No. 3,940,475) capable of recording a change in fluorescent intensity, wavelength shift or fluorescence polarization. Both patents are incorporated herein by reference. Possibilities of indirect labeling include biotinylation of one component, followed by binding to an avidin pair to one of the labeled groups.

Je tiež rad spôsobov, ktoré oddeíujú väzbu z voíného ligandu alebo inak väzbu z voíne testovanej látky. BAS-1 sa môže imobilizovať na rôzne matrice a následne premyť. Vhodnými matricami môže byť plast, ako je ELISA doštička, filtre alebo guíôčky. Spôsob imobilizácie BAS-1 na matrici bez obmedzenia zahŕňa priamu adhéziu na plast, použitie zachytenej protilátky, chemické spriahnutie a biotín-avidín. Posledný krok v poslednom prípade vyžaduje precipitáciu antigén-ligandového komplexu ktorýmkoívek spôsobom vrátane tohto využitia, napríklad organičké rozpúšťadlo, ako je polyetylénglykol alebo soí, ako je síran amónny. Iná vhodná separačná technika bez obmedzenia zahŕňa spôsob fluorescenčnej protilátky, ktorý priťahuje častice a je opísaný v Rattle a kol. (1984) Cli. Chem. 30: 1457-1461 a dvojnásobná separácia protilátky magnetickou časticou, ako je opísané v U. S. Patente č. 4 659 678.There are also a number of methods that separate binding from a free ligand or otherwise binding from a free test substance. BAS-1 can be immobilized to various matrices and subsequently washed. Suitable matrices may be plastic, such as an ELISA plate, filters or beads. The method of immobilizing BAS-1 on a matrix without limitation includes direct adhesion to plastic, use of captured antibody, chemical coupling, and biotin-avidin. The latter step in the latter case requires precipitation of the antigen-ligand complex by any means including this use, for example, an organic solvent such as polyethylene glycol or salts such as ammonium sulfate. Another suitable separation technique includes, without limitation, a fluorescent antibody method that attracts particles and is described in Rattle et al. (1984) Cli. Chem. 30: 1457-1461 and a two-fold separation of the antibody by a magnetic particle as described in U.S. Pat. 4,659,678.

Spôsob väzby proteínov alebo ich fragmentov na rôzne značené látky bol v literatúre značne opísaný. Vela techník sa týka použitia aktivovaných karboxylových skupín buď použitím karbodiimidu alebo aktívneho esteru za vzniku peptidových väzieb, tvorby tioéterov reakciou merkaptovej skupiny s aktivovaným halogénom, ako je chlóracetyl alebo s aktivovaným olefínom, ako je maleimid chemickou väzbou alebo podobne. Fúzia proteínov nachádza v tejto prihláške tiež uplatnenie.The method of binding proteins or fragments thereof to various labeled substances has been extensively described in the literature. Many techniques relate to the use of activated carboxyl groups either by using a carbodiimide or active ester to form peptide bonds, forming thioethers by reacting a mercapto group with an activated halogen such as chloroacetyl or with an activated olefin such as a maleimide chemical bond or the like. Protein fusion also finds application in this application.

v opise a diskutovaná oligonukleótidová sondain the specification and the oligonucleotide probe discussed

Iný diagnostický aspekt tohto vynálezu zahŕňa použitie polynukleotidových alebo oligonukleotidových sekvencií z BAS-1 sekvencie. Tieto sekvencie sa môžu použiť ako sondy na detekčnú hladinu antigénu vo vzorkách pacientov, u ktorých je podozrenie na abnormálny stav, napríklad rakovina alebo vývojový problém. Príprava obidvoch RNA a DNA nukleotidových sekvencií, značenie sekvencií a preferovaná veľkosť sekvencií je bohato obsiahnutá v literatúre. Obvykle by mala mať aspoň 14 nukleotidov, bežne aspoň 18 nukleotidov a polynukleotidové sondy môžu mať najviac niekolko kilobáz. Môže sa použiť rad značených látok, najbežnejšie sú to rádionukleotidy, najma P. Ine techniky sa však môžu tiež použiť, ako sú biotínom modifikované nukleotidy na zavedenie do polynukleotidu. Biotín sa potom podáva ako miesto pre väzbu avidínu alebo protilátok, ktoré sa môžu značiť rôznymi druhmi značených látok, ako sú rádionukleotidy, fluorescenčné značené látky, enzýmy a podobne. Alebo sa môžu použiť protilátky, ktoré rozpoznávajú špecifické dvojskrutkovice vrátane DNA dvojskrutkovice, RNA dvojskrutkovice, hybridnej DNA-RNA dvojskrutkovice alebo DNA-proteínovej dvojskrutkovice. Protilátky môžu byt značené za sebou a stanovenie sa uskutoční vtedy, keď je skrutkovica naviazaná na povrch tak, že po vytvorení dvojskrutkovice na povrchu sa môže detegovať prítomnosť protilátky naviazanej na dvojskrutkovici. Použitie sondy k novej antimediátorovej RNA sa môže uskutočniť akoukoľvek konvenčnou technikou, ako je hybridizácia nukleových kyselín, s a bez preskúmavania, rekombinácia, translácia, ktorá uvoľňuje hybrid (HRT) a translácia, ktorá zadržiava hybrid (HART). Tiež sa môžu zahrnúť techniky amplifikácie, ako je polymerázová retazcová reakcia (PCR).Another diagnostic aspect of the invention involves the use of polynucleotide or oligonucleotide sequences from a BAS-1 sequence. These sequences can be used as probes to detect antigen levels in patient samples suspected of having an abnormal condition, such as a cancer or developmental problem. The preparation of both RNA and DNA nucleotide sequences, sequence labeling, and preferred sequence sizes are abundant in the literature. Typically, it should have at least 14 nucleotides, typically at least 18 nucleotides, and polynucleotide probes may have a maximum of several kilobases. A variety of labeled substances may be used, most commonly they are radionucleotides, in particular P. However, other techniques may also be used, such as biotin modified nucleotides for introduction into a polynucleotide. Biotin is then administered as a site for binding avidin or antibodies that can be labeled with a variety of labeled species, such as radionucleotides, fluorescent labeled enzymes, and the like. Alternatively, antibodies that recognize specific double helices, including DNA double helices, RNA double helices, hybrid DNA-RNA double helices, or DNA-protein double helices, may be used. The antibodies can be labeled in succession and the assay is performed when the helix is bound to the surface such that the presence of the double-helix bound antibody can be detected after formation of the double helix on the surface. Use of the probe to the novel antisense RNA can be accomplished by any conventional technique, such as nucleic acid hybridization, with and without examination, recombination, hybrid release releasing (HRT) and hybrid holding retention (HART). Amplification techniques such as polymerase chain reaction (PCR) may also be included.

Sú tiež opísané diagnostické súpravy, ktoré tiež testujú kvantitu a kvalitu ďalších vzoriek. Diagnóza alebo prognóza sú závislé na kombinácii niekoľkonásobných indikácií používaných ako vzory. Teda súpravy môžu testovať kombinácie vzorov. Viď. napríklad Viallet a kol. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97.Also described are diagnostic kits that also test the quantity and quality of other samples. Diagnosis or prognosis is dependent on a combination of multiple indications used as patterns. Thus, kits can test pattern combinations. See. for example, Viallet et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97.

X. Ligand alebo protireceptorX. Ligand or counter-receptor

BAS-1 s dostatočne poskytujú ďalšieBAS-1 with enough to provide additional

Opis BAS-1 proteínu tu poskytuje prostriedky na identifikáciu protireceptoru alebo ligandu. Taký ligand alebo protireceptor by sa špecificky viazal na vysokou afinitou. Rad konštruktov, ktoré značenie BAS-1, aby sa detegoval jeho partner, sa pripraví tak, aby boli dostupné. Napríklad priame značenie BAS-1, fúzia na znaky na sekundárne značenie, napríklad FLAG alebo iné epitopové nádory, fúzie Ig domény atď., poskytujú detekciu väzbových partnerov. Môže ísť o hystologické, ako afinitný spôsob biochemickej purifikácie, tak značenie alebo selekcia v expresnom klonovaní. Dvojhybridný selekčný systém, ktorý vytvára vhodné konštrukty s dostupnými BAS-1 sekvenciami, sa tiež môže aplikovať. Viď. Fields and Song (1989) Náture 340: 245-246.The BAS-1 protein description herein provides a means for identifying a counter-receptor or ligand. Such a ligand or counter-receptor would specifically bind to high affinity. A variety of constructs that label BAS-1 to detect its partner are prepared to be available. For example, direct labeling of BAS-1, fusion to traits for secondary labeling, such as FLAG or other epitope tumors, Ig domain fusions, etc., provide detection of binding partners. This may be a hystological, both affinity, method of biochemical purification and labeling or selection in expression cloning. A two-hybrid selection system that generates suitable constructs with available BAS-1 sequences can also be applied. See. Fields and Song (1989) Nature 340: 245-246.

Široké poňatie tohto vynálezu sa najlepšie pochopí, ak ide o nasledujúce príklady, ktoré nie sú myslené tak, aby limitovali vynález na špecifické prípady.The broad concept of the invention is best understood by reference to the following examples, which are not intended to limit the invention to specific cases.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1Example 1

Všeobecné spôsobyGeneral methods

Niektoré štandardné spôsoby sú opísané alebo uvedené napríklad v Maniatis a kol. (1982) Molecular Cloning,Some standard methods are described or reported, for example, in Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning

A Laboratory Manual (2.ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY, Ausubel a kol., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY alebo Ausubel a kol. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Spôsoby proteínovej purifikácie zahŕňajú také spôsoby, ako je zrážanie síranom amónnym, kolónová chromatografia, elektroforézy, centrifugácia, kryštalizácia a ďalšie. Viď. napríklad Ausubel a kol. (1987 and periodic Supplements), Deutscher (1990) Guide to Protein Purification v Methods in Enzymology, vol 182 a ďalšie zväzky v tejto sérii a literatúra na použitie proteínových purifikovaných produktov, napríklad Pharmacia, Piscataway N. J. Alebo Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinácia s inými rekombinantnými technikami umožňuje fúziu s vhodnými segmentami, napríklad s FLAG sekvenciou alebo ekvivalentom, ktorý sa môže fúzovať cez proteázou-odstranitelnú-sekvenciu. Viď. napríklad Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70, Hochuli (1990) Purification ofA Laboratory Manual (2nd ed.) Vols. 1-3, CSH Press, NY, Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY or Ausubel et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene, Wiley, New York. Protein purification methods include those such as ammonium sulfate precipitation, column chromatography, electrophoresis, centrifugation, crystallization, and others. See. for example Ausubel et al. (1987 and periodic Supplements), Deutscher (1990) Guide to Protein Purification in Methods in Enzymology, vol 182 and other volumes in this series and literature for the use of protein purified products, for example, Pharmacia, Piscataway N.J. or Bio-Rad, Richmond, CA. The combination with other recombinant techniques allows fusion with appropriate segments, for example, a FLAG sequence or equivalent that can be fused through a protease-removable-sequence. See. See, e.g., Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70, Hochuli (1990) Purification of

Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent v Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plénum Press, N. Y. a Crowe a kol. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification Systen QUIAGEN, Inc. Chatsworth, CA.Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, N.Y., and Crowe et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc. Chatsworth, CA.

Uskutočnila sa počítačová sekvenčná analýza, napríklad použitie dostupných softvárových programov, obsiahnutých v zdrojoch GCG (U. Wisconsion) a GenBank. Tiež sa použila verejná sekvenčná databáza, napríklad GenBank a ďalšie.Computer sequence analysis was performed, for example, using the available software programs contained in the sources of GCG (U. Wisconsion) and GenBank. A public sequence database such as GenBank and others has also been used.

Príklad 2Example 2

Amplifikácia fragmentu ludského BAS-1 spôsobom PCRAmplification of human BAS-1 fragment by PCR method

Podlá myších sekvencií RP105 sa navrhli dva priméry. Viď. Miyake a kol. (1995) J. Immunol. 154: 3333-3340. Poradie nukleotidov sa vypočítalo z CTT sekvencie. 5’-primér A (TTG...) sa zhoduje s 24 nukleotidmi od 162 po 185 a 3'-primér F (...TTC) zodpovedá 24 nukleotidom od 1462 po 1485. Z ludských tonzilárnych B buniek neboli zistené žiadne produkty PCR.Two primers were designed according to the murine RP105 sequences. See. Miyake et al. (1995) J. Immunol. 154: 3333-3340. The nucleotide sequence was calculated from the CTT sequence. The 5'-primer A (TTG ...) matches 24 nucleotides from 162 to 185 and the 3'-primer F (... TTC) corresponds to 24 nucleotides from 1462 to 1485. No PCR products were detected from human tonsillar B cells .

Boli vytvorené tri 5'-priméry: primér B (ACA...) zahŕňa nukleotidy v polohe 321 až 344, primér C (AAG...) obsahuje nukleotidy v polohách 568 až 591 a primér D (TCT...) zahŕňa nukleotidy v polohe 859 až 882. Tiež boli vytvorené ďalšie tri 3'-priméry: primér G (...TTA) s obsahom nukleotidov 1765 až 1788, primér H (...GAA) s obsahom nukleotidov v polohe 2024 až 2047 a primér E (...TGG) s obsahom nukleotidov 1164 až 1187.Three 5'-primers were generated: primer B (ACA ...) comprises nucleotides at positions 321 to 344, primer C (AAG ...) contains nucleotides at positions 568 to 591, and primer D (TCT ...) includes nucleotides at position 859 to 882. Three other 3'-primers were also created: primer G (... TTA) containing nucleotides 1765 to 1788, primer H (... GAA) containing nucleotides at positions 2024 to 2047, and primer E (... TGG) having nucleotides 1164 to 1187.

Na zvýšenie pravdepodobnosti na získanie PCR produktov z ludských tonzilárnych B buniek sa použili PCR reakcie jedného 5'-priméru v kombinácii so štyrmi 3'-primérmi. Zo štyroch skupín PCR reakcií sa získal len jeden čistý 300 bp produkt, ktorý spojil úsek od 5'-priméru D k 3'-priméru E. Tento produkt sa. purifikoval, subklonoval do pCR^X11 vektora (Invitrogen, San Diego CA) a potom sa sekvencoval. Viď. SEKV. ID ČÍS.: 1.To increase the likelihood of obtaining PCR products from human tonsillar B cells, PCR reactions of one 5'-primer were used in combination with four 3'-primers. Of the four groups of PCR reactions, only one pure 300 bp product was obtained, linking the stretch from 5'-primer D to 3'-primer E. This product was. purified, subcloned into the pCR ^X11 vector (Invitrogen, San Diego CA) and then sequenced. See. SEQ. ID NO .: 1.

Podlá 300 bp ludskej sekvencie sa navrhli 3 priméry: 5'-primér K, 3'-priméry la L. Použitím obdobného PCR spôsobu 'sa kombináciou primérov C a I (viď. SEKV. ID ČÍS.: 1) získali ďalšie 300 bp ludské fragmenty.Based on the 300 bp human sequence, 3 primers were designed: 5'-primer K, 3'-primers 1a L. Using a similar PCR method, an additional 300 bp human was obtained by combining primers C and I (see SEQ ID NO: 1). fragments.

Príklad 3Example 3

Tkanivové rozšírenie ludského BAS-1Tissue extension of human BAS-1

Ako sonda (sonda D-E) na štúdium tkanivového rozšírenia BAS-1 v ľudských tkanivách sa použil PCR produkt amplifikovaný dvojicou primérov D-E (viď. SEKV. ID ČÍS.: 1). V ľudskej slezine a vo vyššej hladine v ľudskom srdci sa spôsobom Nothernovho prenosu detegovala 2,6 kb mRNA. Čo nebolo tak ľahko detegované v ľudskom mozgu, detskej žľaze, pľúcach, pečeni, kostrovom svale, obličkách, prostate, varlatách, vaječníku, tenkom čreve, hrubom čreve a periférnych krvných leukocytoch. Okrem toho sa spôsobom Nothernovho prenosu v sIgD⁺ lymfómovej bunkovej línii B104 a vo vyššej hladine v Burkitovej lymfómovej bunkovej línii BL2, detegovala 2,6 kb mRNA. Avšak nebola detegovaná v obličkovej epiteliálnej karcinómovej bunkovej línii CHA, pľúcnej epiteliálnej karcinómovej bunkovej línii MRC-5, EBV bunkovej línii JY alebo monocytnej bunkovej línii U937.A PCR product amplified by a pair of DE primers was used as a probe (DE probe) to study the tissue distribution of BAS-1 in human tissues (see SEQ ID NO: 1). 2.6 kb mRNA was detected in human spleen and at higher levels in the human heart. What has not been so easily detected in the human brain, gland, lungs, liver, skeletal muscle, kidney, prostate, testes, ovary, small intestine, large intestine and peripheral blood leukocytes. In addition, 2.6 kb mRNA was detected by Northern blotting method in sIgD ⁺ lymphoma cell line B104 and at a higher level in Burkit lymphoma cell line BL2. However, it was not detected in the kidney epithelial carcinoma cell line CHA, the lung epithelial carcinoma cell line MRC-5, the EBV cell line JY or the monocyte cell line U937.

Spôsobom PCR bola ľudská BAS-1 mRNA nájdená v sIgD⁺CD38 jednoduchých B bunkách, sIgD⁺CD38⁺ zárodočnom centre B buniek, sIgD^-CD38⁺ zárodočnom centre B buniek, v sIgD^-CD38“ pamäťových B bunkách, v sCD38⁺⁺CD20^nizke plazmatických bunkách, dendritických bunkách generovaných z CD14+ monocytov kultivovaných s GM-CSF a IL-4 a dentritických bunkách generovaných z CD34+ strunových krvných buniek kultivovaných s GM-CSF a TNF-α. Toto nebolo v ľudskej T bunkovej línii MT9 spôsobom PCR detegovateľné.By the PCR method, human BAS-1 mRNA was found in sIgD⁺CD38 single B cells, sIgD⁺CD38⁺ germline B cells, sIgD^-CD38⁺ germline B cells, in sIgD^-CD38 "memory B cells, in sCD38⁺⁺CD20^Low plasma cells, dendritic cells generated from CD14 + monocytes cultured with GM-CSF and IL-4, and dental cells generated from CD34 + string blood cells cultured with GM-CSF and TNF-α. This was not detectable in the human MT9 T cell line by the PCR method.

Príklad 4Example 4

Preskúmavanie plazmidovej knižnice cDNA odvodenej z ľudskej slgDt lymfómovej bunkovej línie B104 'Examination of the plasmid library of cDNA derived from the human slgDt lymphoma cell line B104 '

Z výsledkov analýzy Nothernovho prenosu sa v 6 μg poly-A mRNA bunkovej línie B104 detegovala expresia BAS-1. Podľa toho sa v plazmide pSPORTl (Gibco Life Technologies, Cergy Pontoise, Francúzsko) skonštruovala B104 knižnica cDNA. Po dokončení sledovania 150 000 bakteriálnych kolónií sa s použitím sondy D-E nenašli žiadne pozitívne klony. Čo nasvedčuje tomu, že expresia preskúmanie klonov. TieBAS-1 expression was detected in 6 µg of poly-A mRNA of B104 cell line from the results of Northern blot analysis. Accordingly, a cDNA library was constructed in plasmid pSPORT1 (Gibco Life Technologies, Cergy Pontoise, France). No positive clones were found after D-E probe completion of 150,000 bacterial colonies. Which suggests the expression of the screening clones. Tie

BAS-1 v ludských bunkách môže byť velmi nízka.BAS-1 in human cells can be very low.

Príklad 5Example 5

Preskúmavanie knižnice lambda-gtlO bakteriofágu ludskej slezinyExamination of the lambda-gt10 library of human spleen bacteriophage

Na skúmanie väčšieho množstva klonov sa použila knižnica lambda-gtlO bakteriofágu ludskej sleziny (Clontech). NaThe human spleen bacteriophage lambda-gt10 library (Clontech) was used to examine multiple clones. On the

2,4 x 10θ klonov sa identifikovalo 8 pozitívnych sa izolovali, prečistili a subklonovali do plazmidu pME18S (DNAX, Palo Alto, CA). Po sekvencovaní sa našli dva klony S2 a Ll, ktoré označujú celú dĺžku ludského BAS-1 (viď. SEKV. ID ČÍS.: 1). Celá dĺžka izolovanej ludskej BAS-1 cDNA je asi 2635 bp a kóduje protein s velkosťou asi 661 aminokyselín. Tento proteínový produkt obsahuje okolo 11 potenciálnych glykozylačných miest a okolo 22 repetícií bohatých na leucín. Kódovaná oblasť tejto ludskej BAS-1 cDNA má okolo 72 % homológiu s kódovanou oblasťou myšej RP105 sekvencie a táto úplná BAS-1 cDNA má 67 % homológiu s úplnou myšou cDNA sekvenciou. Aminokyselinová homológia medzi ludskou BAS-1 a myšou RP105 je asi 73,5 %.2.4 x 10θ clones were identified 8 positive were isolated, purified and subcloned into plasmid pME18S (DNAX, Palo Alto, CA). After sequencing, two clones S2 and L1 were found to denote the full length of human BAS-1 (see SEQ ID NO: 1). The full length of the isolated human BAS-1 cDNA is about 2635 bp and encodes a protein of about 661 amino acids. This protein product contains about 11 potential glycosylation sites and about 22 leucine rich repeats. The coding region of this human BAS-1 cDNA has about 72% homology to the coded region of the murine RP105 sequence, and this complete BAS-1 cDNA has 67% homology to the complete mouse cDNA sequence. The amino acid homology between human BAS-1 and mouse RP105 is about 73.5%.

Príklad 6Example 6

Expresia ludského BAS-1 proteínuExpression of human BAS-1 protein

Všetky nekódujúcich Chem. 266: SEKV. ID ČÍS.All Non-Coding Chem. 266: SEQ. ID NO.

konštrukty sa vytvorili odstránením 5' a 3' oblastí a pridaním Marylin Kozák (Ref: J. Biol. 19867, 1991) konsenzusovej sekvencie (ACCATGG, : 3), aby sa zvýšila translačná hladina.constructs were created by removing 5 'and 3' regions and adding Marylin Kozak (Ref: J. Biol. 19867, 1991) consensus sequence (ACCATGG,: 3) to increase translation level.

Rozpustný BAS-l-FLAG protein bol dočasne exprimovaný do Cos-7 buniek. Rekombinantná forma BAS-1 s FLAG peptidom na karboxylovom konci (Hoppe a kol. (1988) Biotechnológie 6: 1205-1210) sa vložila do expresného vektora pME18S a následne sa elektroporáciou transfektovala do Cos-7 buniek. Elektropórované bunky rástli v DMEM médiu doplnenom buď 1 % Nutridoma HU (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) alebo v samotnom DMEM médiu počas 5 dní.Soluble BAS-1-FLAG protein was transiently expressed into Cos-7 cells. The recombinant form of BAS-1 with a FLAG peptide at the carboxy terminus (Hoppe et al. (1988) Biotechnology 6: 1205-1210) was inserted into the expression vector pME18S and subsequently transfected into Cos-7 cells by electroporation. Electroporated cells were grown in DMEM medium supplemented with either 1% Nutridoma HU (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) or in DMEM medium alone for 5 days.

Príklad 7Example 7

Purifikácia rozpustného BAS-1 FLAG proteínuPurification of soluble BAS-1 FLAG protein

Bežne sa 208 ml supernatantu s obsahom rozpustného BAS-1 FLAG dalo na 20 ml kolónu s Cu²⁺ iónmi pripojenými na Chelating Sepharose Fast Flow matricu (Pharmacia, Upsalla, Sweden). Po premytí 16 objemami väzbového pufra (His-Bind Buffer Kit, Novagen, Madison, WI), sa proteíny zachytené na kovové ióny eluovali gradientom 20 až 100 mM imidazolu. Obsah ľudského BAS-1 FLAG v eluátovej frakcii sa stanovil spôsobom bodkového prenosu s použitím anti-FLAG monoklonálnej protilátky M2 (Eastman Kodak, New Haven, CT) a Coomassie modrej a striebrom zafarbenou SDS-PAGE. Frakcie BAS-1 FLAG proteínu sa potom spojili dohromady a dialyzovali proti PBS. Ako sa vopred odhadlo z aminokyselinových sekvencií spôsobom Westernovho prenosu, obohatený ľudský BAS-1 zodpovedá proteínom s veľkosťou okolo 95 a 97 kD.Typically, 208 ml of the supernatant containing soluble BAS-1 FLAG was loaded onto a 20 ml column with Cu ²⁺ ions attached to a Chelating Sepharose Fast Flow matrix (Pharmacia, Upsalla, Sweden). After washing with 16 volumes of binding buffer (His-Bind Buffer Kit, Novagen, Madison, WI), the proteins captured on the metal ions were eluted with a gradient of 20 to 100 mM imidazole. The human BAS-1 FLAG content in the eluate fraction was determined by the dot transfer method using the anti-FLAG monoclonal antibody M2 (Eastman Kodak, New Haven, CT) and Coomassie Blue and silver stained SDS-PAGE. The BAS-1 FLAG protein fractions were then pooled and dialyzed against PBS. As predicted from amino acid sequences by Western blotting, enriched human BAS-1 corresponds to proteins of about 95 and 97 kD in size.

Príklad 8Example 8

Stabilná expresia membránového BAS-1 v NIH-3T3 bunkáchStable expression of membrane BAS-1 in NIH-3T3 cells

Prírodná membránová forma sa subklonovala do expresného vektora pMAMneo (Clontech, Palo Alto, California), ktorý obsahuje RSV-LTR zosilňovač pripojený na dexametazón induktívny MMTV-LTR promótor. Tento konštrukt sa potom elektroporáciou transfektoval do NIH-3T3 buniek. Transfektované NIH-3T3 bunky sa preočkovali na selektívne 0,5 mg/ml Geneticin (G418) (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany) DMEM médium doplnené 10 % Fetal Calf sérom.The natural membrane form was subcloned into the pMAMneo expression vector (Clontech, Palo Alto, California) containing an RSV-LTR enhancer coupled to the dexamethasone-inducible MMTV-LTR promoter. This construct was then transfected into NIH-3T3 cells by electroporation. Transfected NIH-3T3 cells were seeded with selectively 0.5 mg / ml Geneticin (G418) (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany) DMEM medium supplemented with 10% Fetal Calf serum.

Biochemická charakterizácia membránového BAS-1 proteínu v týchto stabilných transfektovaných NIH-3T3 bunkách sa uskutoční metabolickým značením. Bunky sa potom kultivovali 24 hodín v DMEM médiu doplnenom 10 % Fetal Calf sérom a 1 μΜ dexametazónom (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko). Na značenieBiochemical characterization of membrane BAS-1 protein in these stable transfected NIH-3T3 cells is accomplished by metabolic labeling. Cells were then cultured for 24 hours in DMEM medium supplemented with 10% Fetal Calf serum and 1 μΜ dexamethasone (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France). For marking

35, celulárnych proteínov sa potom bunky a 3⁵s-Cys počas posledných 12 hodín, redukčných podmienok na SDS-PAGE predpokladaného 110 kD proteínu v lyzáte transfektovaných NIH-3T3 buniek, ale nie v lyzáte netransfektovaných NIH-3T3 buniek.35, cellular proteins are then cells and ³⁵ s-Cys for the last 12 hours, reducing conditions on SDS-PAGE of the predicted 110 kD protein in the lysate of transfected NIH-3T3 cells, but not in the lysate of non-transfected NIH-3T3 cells.

inkubovali s ^J~’S-Met Analýza proteínov za dokázala prítomnosťincubated with ^J -S-Met Protein analysis showed presence

Príklad 9Example 9

Príprava protilátok špecifických proti BAS-1Preparation of antibodies specific to BAS-1

Inbredné Balb/c myši sa intraperitoneálne imunizovali rekombinantnými formami ľudského proteínu. Najskôr sa získal purifikovaný rozpustný BAS-1 FLAG a ďalej boli stabilné transfektované NIH-3T3 bunky. Zvieratá sa povzbudili vo vhodnom čase proteínom s alebo bez ďalších pomocných látok na ďalšiu stimuláciu tvorby protilátky. Sérum sa získa alebo hybridómy sa produkujú získanými slezinami.Inbred Balb / c mice were immunized intraperitoneally with recombinant forms of human protein. Purified soluble BAS-1 FLAG was first obtained and NIH-3T3 cells were transfected stably. The animals were boosted at the appropriate time with protein with or without additional excipients to further stimulate antibody production. Serum is obtained or hybridomas are produced by the obtained spleens.

Inak sa Balb/c myši imunizujú bunkami transformovanými génmi alebo fragmentárni, buď endogénnych alebo exogénnych buniek, alebo sú imunizované vyizolovanými membránami obohatenými o expresiu antigénu. Sérum sa vhodne získa bežne po rade ďalších aplikácií. Na vyvolanie imunitnej odpovede sa môžu použit rôzne génové terapeutické techniky, napríklad v produkovaní proteínu in sitď.Otherwise, Balb / c mice are immunized with cells transformed with genes or fragmentary, either endogenous or exogenous cells, or immunized with isolated membranes enriched for antigen expression. Serum is conveniently obtained conventionally after a number of other applications. Various gene therapeutic techniques can be used to elicit an immune response, for example, in protein production in situ.

Môžu sa vytvoriť monoklonálne protilátky. Napríklad splenocyty sa spoja s vhodným fúznym partnerom a hydridómy sa selektujú v rastovom médiu štandardnými spôsobmi. Supernatanty hybridómu sa skúmajú na zistenie prítomnosti protilátok, ktoré sa viažu na ľudský BAS-1, napríklad spôsobom ELISA alebo ďalšími stanoveniami. Protilátky, ktoré špecificky rozpoznajú ľudskýMonoclonal antibodies can be generated. For example, splenocytes are coupled to a suitable fusion partner and the hydridomes are selected in the growth medium by standard methods. Hybridoma supernatants are screened for the presence of antibodies that bind to human BAS-1, for example by ELISA or other assays. Antibodies that specifically recognize human

BAS-1, nie však druhové varianty, sa môžu tiež selektovať alebo pripraviť.BAS-1, but not generic variants, can also be selected or prepared.

Iným spôsobom predstavujú syntetizované polypeptidy alebo purifikovaný proteín imunitného monoklonálne alebo polyklonálne Coligan (1991) Current Protocols a Harlow and Lane (1989) Antibodies systému, ktorý vyvoláva protilátky. Viď. napríklad in Immunology Wiley/Greene A Laboratory Manual, ColdAlternatively, the synthesized polypeptides or purified immune monoclonal or polyclonal protein represent Coligan (1991) Current Protocols and Harlow and Lane (1989) Antibodies-inducing system. See. for example, in Immunology Wiley / Greene A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Press. Za vhodných okolností je väzbové činidlo buď značené, ako je uvedené vyššie, napríklad fluorescenčné alebo inak, alebo je imobilizované na substrát pri panning spôsobe. Nukleové kyseliny sa môžu zaviesť do buniek zvierat, aby dochádzalo k produkcii antigénu, ktorý slúži na vyvolanie imunitnej odpovede. Viď. napríklad Wang a kol. (1993) Proc. Naťl. Acad. Sci. 90: 4156-4160, Barry a kol. (1994) BioTechniques 16: 616-619 a Xiang a kol. (1995) Immunity 2: 129-135.Spring Harbor Press. Under appropriate circumstances, the binding agent is either labeled as described above, for example, fluorescent or otherwise, or is immobilized to the substrate in a panning method. Nucleic acids can be introduced into animal cells to produce an antigen that serves to elicit an immune response. See. for example, Wang et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90: 4156-4160, Barry et al. (1994) BioTechniques 16: 616-619 and Xiang et al. (1995) Immunity 2: 129-135.

Príklad 10Example 10

Veľkoobjemová produkcia BAS-1 v NSO bunkáchHigh volume production of BAS-1 in NSO cells

Velké množstvo rozpustného BAS-1 a rozpustného BAS-1 FLAG sa môže produkovať zo stabilných transformantov NSO buniek pripravených napríklad podľa metodológie rozpracovanej v Celltech (Slough, Berkshire, UK, International Patent Applications WO 86/05807, WO 87/04462, WO 89/01036 a WO 89/10404). Obidva BAS-1 a BAS-1 FLAG sa subklonovali do pEE12 a následne sa transfektovali eletroporáciou do NSO buniek. Transfektované NSO bunky sa naočkovali do selektívneho DMEM bez glutamínu doplného 10 % Fetal Calf sérom, ako je opísané v Celltechovom protokole. Supernatanty z najlepšie produkujúcej línie sa použili v biologických analýzach a purifikácii rozpustného BAS-1 a rozpustného BAS-l-FLAG.A large amount of soluble BAS-1 and soluble BAS-1 FLAG can be produced from stable transformants of NSO cells prepared, for example, according to Celltech methodology (Slough, Berkshire, UK, International Patent Applications WO 86/05807, WO 87/04462, WO 89 / 01036 and WO 89/10404). Both BAS-1 and BAS-1 FLAG were subcloned into pEE12 and subsequently transfected by electroporation into NS0 cells. Transfected NS0 cells were seeded in selective glutamine-free DMEM supplemented with 10% Fetal Calf serum as described in the Celltech protocol. Supernatants from the best producing line were used in biological assays and purification of soluble BAS-1 and soluble BAS-1-FLAG.

Na väčšiu produkciu rekombinantných proteínov sa môžu použiť aj ďalšie expresné systémy.Other expression systems may also be used to produce more recombinant proteins.

Príklad 11Example 11

Produkcia fúzie proteínov s BAS-1Production of fusion proteins with BAS-1

Vytvoril sa rad fúznych konštruktov s BAS-1 extracelulárnou doménou. Táto časť génu je pripojená na iný proteín, napríklad FLAG epitopový nádor, Ig doménu alebo na dvojhybridný systémový konštrukt. Viď. napríklad Field and Song (1989) Náture 340: 245-246.A number of fusion constructs with a BAS-1 extracellular domain were generated. This portion of the gene is linked to another protein, for example a FLAG epitope tumor, an Ig domain, or a two-hybrid system construct. See. for example, Field and Song (1989) Nature 340: 245-246.

Epitopový nádor sa môže použiť v expresnom klonovaní s detekciou väzbového partnera anti-FLAG protilátkou, napríklad ligand pre BAS-1. Inak sa Ig domény môžu použiť na purifikáciu použitím látky podobnej antigénu s afinitou k ligandu. Dva hybridné systémy sa môžu tiež použiť na izoláciu proteínov, ktoré sa špecificky viažu na BAS-1.An epitope tumor can be used in expression cloning with detection of a binding partner by an anti-FLAG antibody, for example, a ligand for BAS-1. Alternatively, Ig domains can be used for purification using an antigen-like substance with affinity for a ligand. Two hybrid systems can also be used to isolate proteins that specifically bind to BAS-1.

Príklad 12Example 12

Mapovanie ľudského BAS-1 spôsobom hybridizácie in situMapping of human BAS-1 by in situ hybridization

Pripravil sa chromozóm. Hybridizácia in situ sa uskutočnila na chromozómovom preparáte získanom z ľudských lymfocytov stimulovaných fytohemaglutinínom kultivovaných 72 hodín. Na zabezpečenie dobrej kvality posthybridizačných pásov chromozómov sa na posledných 7 hodín kultivácie pridal 5-brómdeoxyuridín (60 μg/ml média).A chromosome was prepared. In situ hybridization was performed on a chromosome preparation obtained from human lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin cultured for 72 hours. To ensure good quality of chromosome posthybridization bands, 5-bromodeoxyuridine (60 µg / ml medium) was added for the last 7 hours of culture.

655 bp PCR fragment amplifikovaný pomocou primérov, napríklad zodpovedajúci nukleotidom 395 až 411 a 1027 až 1050, na celkovom B bunkovom cDNA templáte, sa klonoval do vhodného vektora. Vektor sa značil ^JH posunom jednoretazcového zlomu. Rádioaktívne značená sonda hybridizovala do metafázy v koncovej koncentrácii 200 ng/ml hybridizačného roztoku, ako je opísané v Mattel a kol. (1985) Hum. Genet. 69: 327-331.The 655 bp PCR fragment amplified by primers, for example, corresponding to nucleotides 395 to 411 and 1027 to 1050, on the total B cell cDNA template was cloned into a suitable vector. The vector was labeled with ^J H by shifting the single chain break. The radiolabeled probe hybridized to metaphase at a final concentration of 200 ng / ml hybridization solution as described in Mattel et al. (1985) Hum. Genet. 69: 327-331.

Po poliatí nukleárnou stopovou emulziou (KODAK NTB₂) sa diapozitívy exponovali 18 dní pri 4 °C. Aby sme sa vyhli akýmkoľvek prúžkom strieborných zrniek počas väzbovej procedúry, polial sa chromozóm pufrovaným roztokom Giemsa a metafáza sa odfotografovala. R-pásy sa potom ukázali spôsobom fluorochrómfotolýzy-Giemsa (FPG) a metafáza sa znova odfotografovala pred analýzou.After spilling with a nuclear trace emulsion (KODAK NTB ₂ ), the slides were exposed for 18 days at 4 ° C. To avoid any strips of silver beads during the binding procedure, chromosome was buffered with Giemsa buffered solution and the metaphase was photographed. The R-bands were then shown by the fluorochrome photolysis-Giemsa (FPG) method and the metaphase was re-photographed before analysis.

V 100 metafázových bunkách testovaných po hybridizácii in situ sa 20 % strieborných zŕn umiestnilo na chromozóme 5. Rozšírenie zŕn nebolo náhodné, 67 % z nich mapovalo v oblasti qll.2-ql3.1 chromozómu 5 dlhé rameno. Toto mapuje ľudský BAS-1 v oblasti 5qll.2-ql3.1 ľudského genómu.In 100 metaphase cells tested after in situ hybridization, 20% of the silver grains were placed on chromosome 5. Grain spread was not random, 67% of them mapped in the q11.2-q13.1 region of chromosome 5 a long arm. This maps human BAS-1 in the 5q11.2-q13.1 region of the human genome.

Príklad 13Example 13

Izolácia receptoru pre ľudský BAS-1Isolation of the human BAS-1 receptor

Ľudský BAS-1 sa môže použiť ako špecifické väzbové činidlo na identifikáciu svojho väzbového partnera, kvôli jeho výhodnej väzbovej špecificite by sa mali použiť radšej protilátky. Väzbové činidlo je buď značené, ako je opísané vyššie, napríklad fluorescenčné alebo inak alebo panning spôsoby.Human BAS-1 can be used as a specific binding agent to identify its binding partner, for its preferred binding specificity, antibodies should be preferred. The binding agent is either labeled as described above, for example by fluorescent or otherwise or panning methods.

imobilizované na substrát pre- immobilized on substrate for

Väzbová zmes sa používa na sledovanie expresnej knižnice, ktorá sa vytvorila z bunkovej línie exprimujúcej väzbového partnera, napríklad receptor. Štandardné farbiace techniky sa použijú na detekciu alebo zaradenie intracelulárneho alebo exprimovaného povrchového receptora alebo sa povrchovo exprimujúce transformované bunky sledujú spôsobom pannig. Sledovanie intracelulárnej expresie sa uskutoční radom farbiacich alebo imunofluorescenčných postupov. Viď. tiež McMahan a kol. (1991) EMBO J. 10: 2821-2832.The binding composition is used to screen an expression library that has been generated from a cell line expressing a binding partner, for example, a receptor. Standard staining techniques are used to detect or incorporate an intracellular or expressed surface receptor, or surface-expressing transformed cells are screened by the pannig method. Monitoring of intracellular expression is accomplished by a variety of staining or immunofluorescence techniques. See. also McMahan et al. (1991) EMBO J. 10: 2821-2832.

Napríklad 0. deň vopred potiahnuť dvojkomorové permanoxové podložné sklíčko fibronektínom 1 ml na komoru, 10 ng/ml v PBS 30 minút pri izbovej teplote. Jedenkrát opláchnuť PBS. Potom zaočkovať COS bunkami na 2-3 x 10⁵ buniek na komoru v 1,5 ml rastového média. Inkubovať cez noc pri 37 ’C.For example, on day 0, pre-coat the bicameral permanox slide with fibronectin 1 ml per chamber, 10 ng / ml in PBS for 30 minutes at room temperature. Rinse once with PBS. Then inoculate with COS cells at 2-3 x 10 ⁵ cells per chamber in 1.5 ml growth medium. Incubate overnight at 37 ° C.

1. deň pre každú vzorku pripraviť 1,5 ml roztoku 66 μg/ml DEAE-dextránu, 66 μΜ chlorquin a 44 μg DNA v sére bez DME. Pre každú sadu sa pripravila pozitívna kontrola, napríklad ľudská BAS-l-FLAG cDNA v riedení 1 a 1/200 a negatívna kontrola. Bunky opláchnuť sérom bez DME. Pridať pri 37 ’C. Odstrániť médium aOn day 1, prepare 1.5 ml of a 66 μg / ml solution of DEAE-dextran, 66 μΜ chlorquin and 44 μg DNA in serum free of DME for each sample. A positive control, such as human BAS-1-FLAG cDNA at 1 and 1/200 dilutions, and a negative control, was prepared for each set. Cells are rinsed with serum without DME. Add at 37 ’C. Remove media a

2,5 minúty. Odstrániť a premyť roztok DNA a inkubovať 5 hodín pridať 0,5 ml 10 % DMSO v DME vodou jedenkrát v DME. Pridať2.5 minutes. Remove and wash the DNA solution and incubate for 5 hours with 0.5 ml of 10% DMSO in DME with water once in DME. Add

1,5 ml rastového média a inkubovať cez noc.1.5 ml growth medium and incubate overnight.

2. deň vymeniť médium. 3. a zafarbia. Bunky opláchnuť Buffered Saline Solution) a paraformaldehyd (PFA)/glukóza.Change media on day 2. 3. and color. The cells are rinsed with Buffered Saline Solution) and paraformaldehyde (PFA) / glucose.

deň alebo 4. deň sa bunky fixujú dvakrát roztokom HBSS (Hank's fixovať 5 minút v 4 % roztoku Omyť trikrát roztokom HBSS. Po odstránení všetkej kvapaliny sa podložné sklíčka uchovali pri teplote -80 ’C. V každej komore sa uskutočnilo 0,5 ml inkubácií nasledujúcim spôsobom. Pridať na 20 minút roztok HBSS/saponín (0,1 %) s 3 2 μΐ/ml 1 M NaN-j. Bunky sa potom jedenkrát premyli roztokom HBSS/saponín. K bunkám pridať ľudský BAS-1 alebo komplex BAS-l/protilátka a inkubovať 30 minút. Bunky premyť dvakrát roztokom HBSS/saponín. Ak je to vhodné, pridať na 30 minút prvú protilátku. Pridať druhú protilátku, napríklad vektor protilátky proti myšiam v riedení 1/200 a inkubovať 30 minút. Pripraviť ELISA roztok, napríklad vektor elitného ABC chrenového peroxidázového roztoku a vopred inkubovať 30 minút. Použiť napríklad 1 kvapku roztoku A (avidín) a roztoku B (biotín) naOn day 4 or day 4, cells are fixed twice with HBSS (Hank's fixed for 5 minutes in 4% solution. Wash three times with HBSS. After removing all liquid, slides were stored at -80 ° C. 0.5 ml incubations were performed in each chamber. Add HBSS / saponin (0.1%) solution with 3 2 μΐ / ml 1 M NaN-j for 20 minutes and then cells were washed once with HBSS / saponin solution. Wash the cells twice with HBSS / saponin, add the first antibody for 30 minutes, if necessary Add a second antibody, for example, a 1/200 dilution anti-mouse vector, and incubate for 30 minutes Prepare ELISA solution , such as an elite ABC horseradish peroxidase solution vector and incubated for 30 minutes in advance.

2,5 ml HBSS/saponín. Bunky premyť dvakrát roztokom HBSS/saponín. Pridať ABC HRP roztok a inkubovať 30 minút. Bunky premyť dvakrát roztokom HBSS, druhýkrát premývať počas 2 minút, čím sa bunky uzavrú. Potom pridať na 5 až 10 minút vektor kyseliny diamínbenzoovej (DAB). Použiť 2 kvapky pufra so 4 kvapkami DAB2.5 ml HBSS / saponin. Wash cells twice with HBSS / saponin solution. Add ABC HRP solution and incubate for 30 minutes. Cells are washed twice with HBSS solution, and washed twice for 2 minutes to seal the cells. Then add the diamino benzoic acid (DAB) vector for 5 to 10 minutes. Use 2 drops of buffer with 4 drops of DAB

- 57 a kvapkami H₂O₂ na 5 ml destilovanej vody. Opatrne odstrániť komoru a omyť sklíčko vodou. Na vzduchu sušiť na niekolko minút, potom pridať 1 kvapku Crystal Mount a prikryť krycím sklíčkom. Sušiť 5 minút pri 85 až 90 ’C.- 57 and drops of H ₂ O ₂ per 5 ml of distilled water. Carefully remove the chamber and wash the slide with water. Air dry for a few minutes, then add 1 drop of Crystal Mount and cover with a coverslip. Dry for 5 minutes at 85-90 ° C.

Vyhodnotiť pozitívne farbenie a postupne subklon na izoláciu jednotlivých génov zodpovedných za väzbu.Evaluate positive staining and gradually subclone to isolate the individual genes responsible for binding.

Alebo sa BAS-1 činidlá používajú na afinitnú purifikáciu alebo na výber buniek exprimujúcich receptor. Viď. napríklad Sambrook a kol. alebo Ausubel a kol.Alternatively, BAS-1 agents are used for affinity purification or for selecting cells expressing a receptor. See. for example, Sambrook et al. or Ausubel et al.

Ďalším spôsobom je sledovanie membránovo viazaného receptora spôsobom panning. Receptor cDNA je skonštruovaný, ako je opísané vyššie. Ligand sa môže imobilizovať a použiť na imobilizáciu exprimujúcich buniek. Imobilizácia sa môže dosiahnuť použitím vhodných protilátok, ktoré rozpoznajú napríklad FLAG sekvenciu BAS-1 fúzneho konštruktu alebo použitím protilátok vybraných proti prvým protilátkam. Znovu použitelné cykly selekcie a amplifikácie vedú k obohateniu vhodných klonov a konečnej izolácii receptorov exprimujúcich klony.Another way is to monitor the membrane bound receptor by panning. The cDNA receptor is constructed as described above. The ligand can be immobilized and used to immobilize the expressing cells. Immobilization can be achieved using suitable antibodies that recognize, for example, the FLAG sequence of a BAS-1 fusion construct, or using antibodies selected against the first antibodies. Reusable selection and amplification cycles result in enrichment of appropriate clones and ultimate isolation of the receptors expressing the clones.

Fágové expresné knižnice sa môžu skúmať ľudským BAS-1. Vhodné techniky značenia, napríklad anti-FLAG protilátky, umožňujú špecifické značenie vhodných klonov.Phage expression libraries can be screened with human BAS-1. Suitable labeling techniques, for example anti-FLAG antibodies, allow specific labeling of suitable clones.

Všetky uvedené citácie sú zahrnuté v referenciách v rovnakom rozsahu, ako by jednotlivé publikácie alebo patentové prihlášky boli konkrétne a jednotlivo uvedené, aby boli zahrnuté v referenciách.All references cited herein are incorporated by reference to the same extent as would individual publications or patent applications be specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

Môže sa vypracovať veľa modifikácií a variácií tohto vynálezu bez odchýlenia sa od jeho podstaty a sféry pôsobnosti, ako bude zrejmé odborníkom v odbore. Špecifické príklady tu opísané sú predložené len vo forme príkladov a vynález môže byt limitovaný termínami doplnenými nárokmi spolu s radom ekvivalentov, na ktoré tieto nároky poukazujú.Many modifications and variations of the present invention may be made without departing from the spirit and scope thereof, as will be apparent to those skilled in the art. The specific examples described herein are presented by way of example only, and the invention may be limited by the terms set forth in the claims, together with a number of equivalents to which such claims refer.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) PRIHLASOVATEĽ: Schering Corporation (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Izolovaná a rekombinantná nukleová kyselina, BAS-1 proteín alebo jeho peptid a prostriedok, protilátka, expresný vektor, hostiteľská bunka a spôsoby ich použitia.LIST OF SEQUENCES (1) GENERAL INFORMATION (i) APPLICANT: Schering Corporation (ii) NAME OF THE INVENTION: Isolated and recombinant nucleic acid, BAS-1 protein or peptide and composition, antibody, expression vector, host cell, and methods for using them.

(iii) POČET SEKVENCÍ: 3 (iv) KONTAKTNÁ ADRESA:(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 3 (iv) CONTACT ADDRESS:

(A) (A) ADRESA : ADDRESS : Schering-Plough Corporation Schering-Plow Corporation (B) (B) ULICA : STREET : 2000 Galloping Hill Road 2000 Galloping Hill Road (C) (C) MESTO : THE CITY : Kenilworth Kenilworth (D) (D) ŠTÁT : STATE: New Jersey New Jersey (E) (E) KRAJINA: COUNTRY: USA USA (F) (F) PSČ: : ZIP: 07033 07033 (v) DRUH (v) TYPE POČÍTAČOVÉHO SPRACOVANIA: COMPUTER PROCESSING: (A) (A) TYP MÉDIA MEDIA TYPE : Disketa : Diskette (B) (B) POČÍTAČ COMPUTER : Macintosh : Macintosh (C) (C) OPERAČNÝ OPERATIONAL SYSTÉM: 7.5.3 SYSTEM: 7.5.3

(vi) SÚČASNÉ ÚDAJE PRIHLÁŠKY:(vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) ČÍSLO (B) DÁTUM(A) NUMBER (B) DATE

PRIHLÁŠKY: PODANIA:APPLICATIONS: SUBMISSIONS:

(vii) PREDOŠLÉ ÚDAJE PRIHLÁŠKY:(vii) PREVIOUS APPLICATION DATA:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:(A) APPLICATION NUMBER:

(B) DÁTUM PODANIA: 17.5.1996 (viii) INFORMÁCIA O PRÁVNOM ZÁSTUPCOVI A AGENTOVI (A) MENO: Cynthia L. Foulke, Esq.(B) filing date: 17.5.1996 (viii) LEGAL REPRESENTATIVE AND AGENT INFORMATION (A) NAME: Cynthia L. Foulke, Esq.

(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 32.364 (C) ČÍSLO POSUDKU: DX0580PCT (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE (A) TELEFÓN: 908-298-2987 (B) FAX: 908-298-5388 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEKV. ID ČÍS.: 1:(B) REGISTRATION NUMBER: 32.364 (C) ASSESSMENT NUMBER: DX0580PCT (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION (A) PHONE: 908-298-2987 (B) FAX: 908-298-5388 (2) SEQ ID NO. ID No .: 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DĹŽKA: 2635 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (ix) ZNAK:(A) LENGTH: 2635 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRING: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: CDNA (ix) SIGN:

(A) NÁZOV/ZNAČKA: CDS (B) POLOHA: 97..2082 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID ČÍS.: 1:(A) NAME / BRAND: CDS (B) POSITION: 97..2082 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ. ID No .: 1:

ATTCCGGCGG CTGCCAAATT GCCAGGGCCT TCACAGTTTG ATTCCATT'rCATTCCGGCGG CTGCCAAATT GCCAGGGCCT TCACAGTTTG ATTCCATT'rC

TCAGCTCCAATCAGCTCCAA

GCATTAGGTA AACCCACCAA GCAATCCTAG CCTGTG ATG GCG TTT GAC GTC AGC 114GCATTAGGTA AACCCACCAA GCAATCCTAG CCTGTG ATG GCG TTT

Met 3 Met 3 Ala Ala Phe Phe Asp Asp > Val 5 Val 5 Ser Ser TGC 162 TGC 162 TTC TTC TTT TTT TGG TGG GTG GTG GTG GTG CTG CTG TTT TTT TCT TCT GCC GCC GGC GGC TGT TGT AAA AAA GTC GTC ATC ATC ACC ACC Cys Cys Phe Phe Phe Phe Trp 10 Trp 10 Val wall Val wall Leu Leu Phe Phe Ser 15 Ser 15 Ala Ala Gly Gly Cys Cys Lys Lys Val 20 wall 20 Ile Ile Thr Thr TCC 210 TCC 210 TGG TGG GAT GAT CAG CAG ATG ATG TGC TGC ATT ATT GAG GAG AAA AAA GAA GAA GCC GCC AAC AAC AAA AAA ACA ACA TAT TAT AAC AAC Ser Ser Trp Trp Asp 25 Asp 25 Gin gin Met Met Cys Cys íle Ile Glu 30 Glu 30 Lys Lys Glu Glu Ala Ala Asn same time Lys 35 Lys 35 Thr Thr Tyr Tyr Asn same time TGT 258 TGT 258 GAA GAA AAT AAT TTA TTA GGT GGT CTC CTC AGT AGT GAA GAA ATC ATC CCT CCT GAC GAC ACT ACT CTA CTA CCA CCA AAC AAC AC/i AC / i Cys Cys Glu 40 Glu 40 Asn same time Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ser 45 Ser 45 Glu Glu Ile Ile Pro for Asp Asp Thr 50 Thr 50 Leu Leu Pro for Asn same time Thr Thr ACA 306 ACA 306 GAA GAA TTT TTT TTG TTG GAA GAA TTC TTC AGC AGC TTT TTT AAT AAT TTT TTT TTG TTG CCT CCT ACA ACA ATT ATT CAC CAC AAT AAT Thr 55 Thr 55 Glu Glu Phe Phe Leu Leu Glu Glu Pli e 60 Pli e 60 Ser Ser Phe Phe Asn same time Phe Phe Leu 65 Leu 65 Pro for Thr Thr Ile Ile His His Asn 7 0 same time 7 0 AGA 354 AGA 354 ACC ACC TTC TTC AGC AGC AGA AGA CTC CTC ATG ATG AAT AAT CTT CTT ACC ACC TTT TTT TTG TTG GAT GAT TTA TTA ACT ACT AGG AGG Arg Arg Thr Thr Phe Phe Ser Ser Arg 7 5 Arg 7 5 Leu Leu Met Met Asn same time Leu Leu Thr 80 Thr 80 Phe Phe Leu Leu Asp Asp Leu Leu Thr 85 Thr 85 Arg Arg TGC 402 TGC 402 CAG CAG ATT ATT AAC AAC TGG TGG ATA ATA CAT CAT GAA GAA GAC GAC ACT ACT TTT TTT CAA CAA AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAA CAA Cys Cys Gin gin Ile Ile Asn 90 same time 90 Trp Trp Ile Ile His His Glu Glu Asp 95 Asp 95 Thr Thr Phe Phe Gin gin Ser Ser His 100 His 100 His His Gin gin TTA 450 TTA 450 AGC AGC ACA ACA CTT CTT GTG GTG TTA TTA ACT ACT GGA GGA AAT AAT CCC CCC CTG CTG ATA ATA TTC TTC ATG ATG GCA GCA GAA GAA Leu Leu Ser Ser Thr 105 Thr 105 Leu Leu Val wall Leu Leu Thr Thr Gly 110 Gly 110 Asn same time Pro for Leu Leu Ile Ile Phe 115 Phe 115 Met Met Ala Ala Glu Glu ACA 498 ACA 498 TCG TCG CTT CTT AAT AAT GGG GGG CCC CCC AAG AAG TCA TCA CTG CTG AAG AAG CAT CAT CTT CTT TTC TTC TTA TTA ATC ATC CAA CAA Thr Thr Ser 120 Ser 120 Leu Leu Asn same time Gly Gly Pro for Lys 125 Lys 125 Ser Ser Leu Leu Lys Lys His His Leu 130 Leu 130 Phe Phe Leu Leu Ile Ile Gin gin ACG 546 ACG 546 GGA GGA ATA ATA TCC TCC AAT AAT CTC CTC GAG GAG TTT TTT ATT ATT CCA CCA GTG GTG CAC CAC AAT AAT CTG CTG GAA GAA AAC AAC Thr 135 Thr 135 Gly Gly Ile Ile Ser Ser Asn same time Leu 140 Leu 140 Glu Glu Phe Phe Ile Ile Pro for Val 145 wall 145 His His Asn same time Leu Leu Glu Glu Asn 150 same time 150 TTG 594 TTG 594 GAA GAA AGC AGC TTG TTG TAT TAT CTT CTT GGA GGA AGC AGC AAC AAC CAT CAT ATT ATT TCC TCC TCC TCC ATT ATT AAG AAG TTC TTC Leu Leu Glu Glu Ser Ser Leu Leu Tyr 155 Tyr 155 Leu Leu Gly Gly Ser Ser Asn same time His 160 His 160 Ile Ile Ser Ser Ser Ser Ile Ile Lys 165 Lys 165 Phe Phe

CCC 642 CCC 642 ZlAA ZlAA GAC GAC TTC TTC CCA CCA GCA GCA CGG CGG AAT AAT CTG CTG AAA AAA GTA GTA CTG CTG GAT GAT TTT TTT CAG CAG AAT AAT Pro for Lys Lys Asp Asp Phe 170 Phe 170 Pro for Ala Ala Arg Arg Asn same time Leu 175 Leu 175 Lys Lys Val wall Leu Leu Asp Asp Phe 180 Phe 180 Gin gin Asn same time AAT 690 AAT 690 GCT GCT ATA ATA CAC CAC TAC TAC ATC ATC TCT TCT AGA AGA GAA GAA GAC GAC ATG ATG AGG AGG TCT TCT CTG CTG GAG GAG CAG CAG Asn same time Ala Ala Ile 185 Ile 185 His His Tyr Tyr Ile Ile Ser Ser Arg 190 Arg 190 Glu Glu Asp Asp Met Met Arg Arg Ser 195 Ser 195 Leu Leu Glu Glu Gin gin

GCC 738 GCC 738 ATC ATC AAC AAC CTA CTA AGC AGC CTG CTG AAC AAC TTC TTC AAT AAT GGC GGC AAT AAT AAT AAT GTT GTT AAA AAA GGT GGT ATT ATT Ala Ala íle 200 Ile 200 Asn same time Leu Leu Ser Ser Leu Leu Asn 2.05 same time 2.5 Phe Phe Asn same time Gly Gly Asn same time Asn 210 same time 210 Val wall Lys Lys Gly Gly íle Ile GAG 786 GAG 786 CTT CTT GGG GGG GCT GCT TTT TTT GAT GAT TCA TCA ACG ACG GTC GTC TTC TTC CAA CAA AGT AGT TTG TTG ZlAC zlac TTT TTT GGA GGA Glu 215 Glu 215 Leu Leu Gly Gly Ala Ala Phe Phe Asp 220 Asp 220 Ser Ser Thr Thr Val wall Phe Phe Gin 225 gin 225 Ser Ser Leu Leu Asn same time Phe Phe Gly 230 Gly 230 GGA 834 GGA 834 ACT ACT CCA CCA AAT AAT TTG TTG TCT TCT GTT GTT ΛΤΛ ΛΤΛ TTC TTC AAT AAT GGT GGT CTG CTG CAG CAG AAC AAC TCT TCT ACT ACT Gly Gly Thr Thr Pro for Asn same time Leu 235 Leu 235 Ser Ser Val wall íle Ile Phe Phe Asn 240 same time 240 Gly Gly Leu Leu Gin gin Asn same time Ser 245 Ser 245 Thr Thr ACT 882 ACT 882 CAG CAG TCT TCT CTC CTC TGG TGG CTG CTG GGA GGA ACA ACA TTT TTT GAG GAG GAC GAC ATT ATT GAT GAT GAC GAC GAA GAA GAT GAT Thr Thr Gin gin Ser Ser Leu 250 Leu 250 Trp Trp Leu Leu Gly Gly Thr Thr Phe 255 Phe 255 Glu Glu Asp Asp íle Ile Asp Asp Asp 260 Asp 260 Glu Glu Asp Asp ATT 930 ATT 930 AGT AGT TCA TCA GCC GCC ATG ATG CTC CTC AAG AAG GGA GGA CTC CTC TGT TGT GAA GAA ATG ATG TCT TCT GTT GTT GAG GAG AGC AGC íle Ile Ser Ser Ser 265 Ser 265 Ala Ala Met Met Leu Leu Lys Lys Gly 270 Gly 270 Leu Leu Cys Cys Glu Glu Met Met Ser 275 Ser 275 Val wall Glu Glu Ser Ser CTC 978 CTC 978 AAC AAC CTG CTG CAG CAG GAA GAA CAC CAC CGC CGC TTC TTC TCT TCT GAC GAC ATC ATC TCA TCA TCC TCC ACC ACC ACA ACA TTT TTT Leu Leu Asn 280 same time 280 Leu Leu Gin gin Glu Glu His His Arg 285 Arg 285 Phe Phe Ser Ser Asp Asp íle Ile Ser 290 Ser 290 Ser Ser Tlir Thr Thr Thr Phe Phe CAG CAG TGC TGC TTC TTC ACC ACC CAA CAA CTC CTC CAA CAA GAA GAA TTG TTG GAT GAT CTG CTG ACA ACA GCA GCA ACT ACT CAC CAC TTG TTG

10261026

Gin Cys Gin Cys Phe Phe Thr Thr Gin gin Leu 300 Leu 300 Gin gin Glu Glu Leu Leu Asp Asp Leu 305 Leu 305 Thr Thr Ala Ala Thr Thr His His Leu 310 Leu 310 295 295 ΛΑΑ GGG 1074 ΛΑΑ GGG 1074 ΤΤΛ ΤΤΛ CCC CCC TCT TCT GGG GGG ATG ATG AAG AAG GGT GGT CTG CTG AAC AAC TTG TTG CTC CTC AAG AAG AAA AAA TTA TTA Lys Gly Lys Gly Leu Leu Pro for Ser 315 Ser 315 Gly Gly Met Met Lys Lys Gly Gly Leu 320 Leu 320 Asn same time Leu Leu Leu Leu Lys Lys Lys 325 Lys 325 Leu Leu GTT CTC 1122 GTT CTC 1122 AGT AGT GTA GTA AAT AAT CAT CAT TTC TTC GAT GAT CAA CAA TTG TTG TGT TGT CAA CAA ATC ATC AGT AGT GCT GCT GCC GCC Val Leu Val Leu Ser Ser Val 330 wall 330 Asn same time His His Phe Phe Asp Asp Gin 335 gin 335 Leu Leu Cys Cys Gin gin íle Ile Ser 340 Ser 340 Ala Ala Ala Ala AAT TTC 1170 AAT TTC 1170 CCC CCC TCC TCC CTT CTT ACA ACA CAC CAC CTC CTC TAC TAC ATC ATC AGA AGA GGC GGC AAC AAC GTG GTG AAG AAG AAA AAA Asn Phe Asn Phe Pro 345 for 345 Ser Ser Leu Leu Thr Thr His His Leu 350 Leu 350 Tyr Tyr íle Ile Arg Arg Gly Gly Asn 355 same time 355 Val wall Lys Lys Lys Lys CTT CAC 1218 CTT CAC 1218 CTT CTT GGT GGT GTT GTT GGC GGC TGC TGC TTG TTG GAG GAG AAA AAA CTA CTA GGA GGA AAC AAC CTT CTT CAG CAG ACA ACA Leu His 360 Leu His 360 Leu Leu Gly Gly Val wall Gly Gly Cys 365 Cys 365 Leu Leu Glu Glu Lys Lys Leu Leu Gly 370 Gly 370 Asn same time Leu Leu Gin gin Thr Thr CTT GAT 1266 CTT GAT 1266 TTA TTA AGC AGC CAT CAT AAT AAT GAC GAC ΛΤΑ ΛΤΑ GAG GAG GCT GCT TCT TCT GAC GAC TGC TGC TGC TGC AGT AGT CTG CTG Leu Asp 375 Leu Asp 375 Leu Leu Ser Ser His His Asn 380 same time 380 Asp Asp íle Ile Glu Glu Ala Ala Ser 385 Ser 385 Asp Asp Cys Cys Cys Cys Ser Ser Leu 390 Leu 390 CAA CTC 1314 CAA CTC 1314 AAA AAA AAC AAC CTG CTG TCC TCC CAC CAC TTG TTG CAA CAA ACC ACC TTA TTA AAC AAC CTG CTG AGC AGC CAC CAC AAT AAT Gin Leu Gin Leu Lys Lys Asn same time Leu Leu Ser Ser His His Leu Leu Gin gin Thr Thr Leu Leu Asn same time Leu Leu Ser Ser His His Asn same time

59 5 59 5 400 400 4 05* 4 05 * GAG CCT 1362 GAG CCT 1362 CTT CTT GGT X GGT X CTC CTC CAG CAG AGT AGT CAG CAG GCA GCA TTC TTC AAA AAA GAA GAA TGT TGT CCT CCT CAG CAG CTA CTA Glu Pro Glu Pro Leu Leu Gly 410 Gly 410 Leu Leu Gin gin Ser Ser Gin gin Ala 415 Ala 415 Phe Phe Lys Lys Glu Glu cys cys Pro 420 for 420 Gin gin Leu Leu GAA CTC 1410 GAA CTC 1410 CTC CTC GAT GAT TTG TTG GCA GCA TTT TTT ACC ACC CGC CGC TTA TTA CAC CAC ATT ATT AAT AAT GCT GCT CCA CCA CAA CAA Glu Leu Glu Leu Leu 425 Leu 425 Asp Asp Leu Leu Ala Ala Phe Phe Thr 430 Thr 430 Arg Arg Leu Leu His His íle Ile Asn 435 same time 435 A] o A] o Pro for Gin gin AGT CCC 1450 AGT CCC 1450 TTC TTC CAA CAA AAC AAC CTC CTC CAT CAT TTC TTC CTT CTT CAG CAG GTT GTT CTG CTG AAT AAT CTC CTC ACT ACT TAC TAC Ser Pro 440 Ser Pro 440 Pli e Pli e Gin gin Asn same time Leu Leu His 445 His 445 Phe Phe Leu Leu Gin gin Val wall Leu 450 Leu 450 Asn same time Leu Leu Thr Thr Tyr Tyr TGC TTC 1506 TGC TTC 1506 CTT CTT GAT GAT ACC ACC AGC AGC AAT AAT CAG CAG CAT CAT CTT CTT CTA CTA GCA GCA GGC GGC CTA CTA CCA CCA GTT GTT Cys Phe 455 Cys Phe Leu Leu Asp Asp Thr Thr Ser 460 Ser 460 Asn same time Gin gin His His Leu Leu Leu 465 Leu 465 Ala Ala Gly Gly Leu Leu Pro for Val 470 wall 470 CTC CGG 1554 CTC CGG 1554 CAT CAT CTC CTC AAC AAC TTA TTA ΛΛΛ ΛΛΛ GGG GGG AAT AAT CAC CAC TTT TTT CAA CAA GAT GAT GGG GGG ACT ACT ATC ATC Leu Arg Leu Arg His His Leu Leu Asn 475 same time 475 Leu Leu Lys Lys Gly Gly Asn same time His 480 His 480 Phe Phe Gin gin Asp Asp Gly Gly Thr 4 85 Thr 4 85 íle Ile ACG AAG 1602 ACG AAG 1602 ACC ACC AAC AAC CTA CTA CTT CTT CAG CAG ACC ACC GTG GTG GGC GGC AGC AGC TTG TTG GAG GAG GTT GTT CTG CTG ATT ATT Thr Lys Thr Lys Thr Thr Asn 490 same time 490 Leu Leu Leu Leu Gin gin Thr . Thr. Val 495 wall 495 Gly Gly Ser Ser Leu Leu Glu Glu Val 500 wall 500 Leu Leu íle Ile TTG TCC 1650 TTG TCC 1650 TCT TCT TGT TGT GGT GGT CTC CTC CTC CTC TCT TCT ATA ATA GAC GAC CAG CAG CAA CAA GCA GCA TTC TTC CAC CAC AGC AGC Leu Ser Leu Ser Ser 505 Ser 505 Cys Cys Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ser 510 Ser 510 íle Ile Asp Asp Gin gin Gin gin Ala 515 Ala 515 Phe Phe His His Ser Ser TTG GGA 1698 TTG GGA 1698 AAA AAA ATG ATG AGC AGC CAT CAT GTA GTA GAC GAC TTA TTA AGC AGC CAC CAC AAC AAC AGC AGC CTG CTG ACA ACA TGC TGC Leu Gly 520 Leu Gly 520 Lys Lys Met Met Ser Ser His His Val 525 wall 525 Asp Asp Leu Leu Ser Ser His His Asn 530 same time 530 Ser Ser Leu Leu Thr Thr Cys Cys GAC AGC 1746 GAC AGC 1746 ATT ATT GAT GAT TCT TCT CTT CTT AGC AGC CAT CAT CTT CTT AAG AAG GGA GGA ATC ATC TAC TAC CTC CTC AAT AAT CTG CTG Asp Ser 535 Asp Ser 536 íle Ile Asp Asp Ser Ser Leu 540 Leu 540 Ser Ser His His Leu Leu Lys Lys Gly 545 Gly 545 íle Ile Tyr Tyr Leu Leu Asn same time Leu 550 Leu 550 GCT GCC 1794 GCT GCC 1794 AAC AAC AGC AGC ATT ATT AAC AAC ATC ATC ATC ATC TCA TCA CCC CCC CGT CGT CTC CTC CTC CTC CCT CCT ATC ATC TTG TTG Ala Ala Ala Ala Asn same time Ser Ser íle 555 Ile 555 Asn same time íle Ile íle Ile Ser Ser Pro 560 for 560 Arg Arg Leu Leu Leu Leu Pro for íle 565 Ile 565 Leu Leu TCC CAG 1842 TCC CAG 1842 CAG CAG AGC AGC ACC ACC ATT ATT AAT AAT TTA TTA AGT AGT CAT CAT AAC AAC CCC CCC CTG CTG GAC GAC TGC TGC ACT ACT Ser Gin Ser Gin Gin gin Ser 570 Ser 570 Thr Thr íle Ile Asn same time Leu Leu Ser 575 Ser 575 His His Asn same time Pro for Leu Leu Asp 580 Asp 580 Cys Cys Thr Thr TGC TCG 1090 TGC TCG 1090 AAT AAT ATT ATT CAT CAT TTC TTC TTA TTA ACA ACA TGG TGG TAC TAC AAA AAA GAA GAA AAC AAC CTG CTG CAC CAC AAA AAA Cys Ser Cys Ser Asn 585 same time 585 íle Ile His His Phe Phe Leu Leu Thr 590 Thr 590 Trp Trp Tyr Tyr Lys Lys Glu Glu Asn 595 same time 595 Leu Leu His His Lys Lys CTT GAA 1938 CTT GAA 1938 GGC GGC TCG TCG GAG GAG GAG GAG ACA ACA CGT CGT GTG GTG CAA CAA AAC AAC CCG CCG CCA CCA TCT TCT CTA CTA AGG AGG

Leu Glu Gly Ser Glu Glu Thr Arg Val Gin Asn Pro Pro Ser Leu Arg 600 605 610Le Glu Glu Ser Glu Glu Thr Arg Val Gin Asn Pro Ser Leu Arg 600 605 610

GGA GTT AAG CTA TCT GAT GTC AAG CTT TCC TGT GGG ATT ACA GCC ATA 1986GGA GTT AAG CTA TCT GAT GTC AAG

Gly Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser Cys Gly Íle Thr Ala HeGly Val Lys Leu Ser Cys Gly Ile Thr Ala He

615 620 625 ~ 630615 620 625 ~ 630

GGC ATT TTC TTT CTC ATA GTA TTT CTA TTA TTG TTG GCT ATT CTG CTAGGC ATT TTC TTT CTC ATA

20342034

Gly íle Phe Phe Leu íle Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala íle Leu Leu 635 640 645Gly White Phe Phe Leu White Phe Leu Leu Leu Leu Leu Ala White Leu Leu 635 640 645

TTT TTT GCA GTT AAA TAC CTT CTC AGG TGG AAA TAC CAA CAC TTT TAG 2082TTT TTT GCA GTT AAA TAC CTT CTC AGG TGG

Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp Lys Tyr Gin His PhePhe Phe Lys Tyr Gin His Phe

650 650 655 655 660 660 TGCTGAAGGT 2142 TGCTGAAGGT 2142 TTCCAGAGAA TTCCAGAGAA AGCAAATAAG AGCAAATAAG TGTGCTTAGC TGTGCTTAGC AAAATTGCTC AAAATTGCTC TAAGTGAAAG TAAGTGAAAG AACTGTCATC 2202 AACTGTCATC 2202 TGCTGGTGAC TGCTGGTGAC CAGACCAGAC CAGACCAGAC TTTTCAGATT TTTTCAGATT GCTTCCTGGA GCTTCCTGGA ACTGGGCAGG ACTGGGCAGG GACTCACTGT 2262 GACTCACTGT 2262 GCTTTTCTGA GCTTTTCTGA GCTTCTTACT GCTTCTTACT CCTGTGAGTC CCTGTGAGTC CCAGAGCTAA CCAGAGCTAA AGAACCTTCT AGAACCTTCT AGGCAAGTAC 2322 AGGCAAGTAC 2322 ACCGAATGAC ACCGAATGAC TCAGTCCAGA TCAGTCCAGA GGGTCAGATG GGGTCAGATG CTGCTGTGAG CTGCTGTGAG AGGCACAGAG AGGCACAGAG CCCTTTCCGC 2382 CCCTTTCCGC 2382 ATGTGGAAGA ATGTGGAAGA GTGGGAGGAA GTGGGAGGAA GCAGAGGGAG GCAGAGGGAG GGACTGGGCA GGACTGGGCA GGGACTGCCG GGGACTGCCG GCCCCGGAGT 2442 GCCCCGGAGT 2442 CTCCCACAGG CTCCCACAGG GAGGCCATTC GAGGCCATTC CCCTTCTACT CCCTTCTACT CACCGACATC CACCGACATC CCTCCCAGCA CCTCCCAGCA CCACACACCC 2502 CCACACACCC 2502 CGCCCCTGAA CGCCCCTGAA AGGAGATCAT AGGAGATCAT CAGCCCCCAC CAGCCCCCAC AATTTGTCAG AATTTGTCAG AGCTGAAGCC AGCTGAAGCC AGCCCACTAC 2562 AGCCCACTAC 2562 CCACCCCCAC CCACCCCCAC TACAGCATTG TACAGCATTG TGCTTGGGTC TGCTTGGGTC TGGGTTCTCA TGGGTTCTCA GTAATGTAGC GTAATGTAGC CATTTGAGAA 2622 CATTTGAGAA 2622 ACTTACTTGG ACTTACTTGG GGACAAAGTC GGACAAAGTC TCAATCCTTA TCAATCCTTA TTTTAAATGA TTTTAAATGA AAAAAGAAAA AAAAAGAAAA GAAAAGCATA 2635 GAAAAGCATA 2635 ATA ATA INFORMÁCIA INFORMATION 0 SEKVENCII SEKV. 0 SEQUENCE SEQ. ID ČÍS.: ID NO .: 2: 2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DĹŽKA: 661 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein(A) LENGTH: 661 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: protein

:i) « : i) « OPIS DESCRIPTION SEKVENCIE: SEKV. SEQUENCE: SEQ. ID ID ČÍS. : NO. : 2: 2: Met 1 Met 1 Ala Ala Phe Asp Val Ser Cys 5 Phe Asp Val Ser Cys 5 Phe Phe Phe Trp ' 10 Phe Trp 10 Val Val Leu Phe Ser Ala 15 Val Val Leu Phe Ser Ala 14 Gly Gly Cys Cys Lys Val He Thr Ser 20 Lys Val He Thr Ser Trp Trp Asp Gin 25 Asp Gin 25 Met Cvs íle Glu l.v« 30 Met Cvs ile Glu lv « 30 Ala Ala Asn same time Lys Thr Tyr Asn Cys 35 Lys Thr Tyr Asn Cys Glu 40 Glu 40 Asn Leu Asn Leu Gly Leu Ser Glu íle Pro 45 Gly Leu Ser Glu White Pro 45 Asp Asp Thr 50 Thr 50 Leu Pro Asn Thr Thr 55 Leu Pro Asn Thr Thr 56 Glu Glu Phe Leu Phe Leu Glu Phe Ser Phe Asn Phe 60 Glu Phe Ser Phe Asn Phe beu 65 Beu 65 Pro for Thr íle His Asn Arg 70 Thr ile His Asn Arg 70 Thr Thr Phe Ser Phe Ser Arg Leu Met Asn Leu Thr ⁷⁵ 80Arg Leu Met Asn Leu Thr ⁷⁵ Phe Phe Leu Leu Asp Leu Thr Arg Cys 85 Asp Leu Thr Arg Cys Gln Gln Ile Asn 90 Ile Asn Trp íle His Glu Asp Thr 95 His Glu Asp Asp Thr 95 Phe Phe Gin gin Ser His His G]n Leu 100 Ser His His Gn Leu 100 Ser Ser Thr Leu 105 Thr Leu Val Leu Thr Gly Asn Pro 110 Val Leu Thr Gly Asn Pro Leu Leu íle Ile Phe Met Ala Glu Thr 115 Phe Met Ala Glu Thr 116 Ser 120 Ser 120 Leu Asn Leu Asn Gly Pro Lys Ser Leu Lys 125 Gly Pro Lys Ser Leu Lys 125 His His Leu 130 Leu 130 Phe Leu íle Gin Thr 135 Phe Leu White Gin Thr 135 Gly Gly íle Ser íle Ser Asn Leu Glu Phe íle Pro 140 Asn Leu Glu Phe White Pro 140 Val 145 wall 145 His His Asn Leu Glu Asn Leu 150 Asn Leu Glu Asn Leu Glu Glu Ser Leu Ser Leu Tyr Leu Gly Ser Asn His 155 160 Tyr Leu Gly Ser Asn His 155 161 íle Ile Ser Ser Ser íle Lys Phe Pro 165 Serys Lys Phe Pro 165 Lys Lys Asp Phe 170 Asp Phe Pro Ala Arg Asn Leu Lys 175 For Ala Arg Asn Leu Lys 175 Val wall Leu Leu Asp Phe Gin Asn Asn 180 Asp Phe Gin Asn Asn Ala Ala íle His 185 ile His 185 Tyr íle Ser Arg Glu Asp 190 Tyr ile Ser Arg Glu Asp 190 Met Met Arg Arg Ser Leu Glu Gin Ala 195 Ser Leu Glu Gin Ala 198 íle 200 Ile 200 Asn Leu Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly 205 Ser Leu Asn Phe Asn Gly Asn same time Asn 210 same time 210 Val Lys Gly íle Glu 215 Val Lys Gly White Glu 215 Leu Leu Gly Ala Gly Ala Phe Asp Ser Thr Val Phe 220 Phe Asp Ser Thr Val Phe 220 Gin 225 gin 225 Ser Ser Leu Asn Phe Gly Gly 230 Leu Asn Phe Gly Gly Thr Thr Pro Asn Pro Asn Leu Ser Val íle Phe Asn 235 240 Leu Ser Val White Phe Asn 235 240 Gly Gly Leu Leu Gin Asn Ser Thr Thr 245 Gin Asn Ser Thr Thr Gin gin Ser Leu 250 Ser Leu 250 Trp Leu Gly Thr Phe Glu 255 Trp Leu Gly Thr Phe Glu 255 Asp Asp íle Ile Asp Asp Glu Asp íle 260 Asp Asp Glu Asp 260 Ser Ser Ser Ala 265 Ser Ala 265 Met Leu Lys Gly Leu Cys 270 Met Leu Lys Gly Leu Cys Glu Glu Met Met Ser Val Glu Ser Leu 275 Ser Val Glu Ser Leu 275 Asn 280 same time 280 Leu Gin Leu Gin Glu His Arg Phe Ser Asp 285 Glu His Arg Phe Ser Asp 285

Ile Ser Ser Thr Thr Phe Gin Cys 290 295Ile Ser Ser Thr Thr Phe Gin Cys 290 295

Leu Thr Ala Thr His Leu Lys Gly 305 310Leu Thr Ala Thr His

Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu 325Asn Leu Leys Lys Leys Val Leu 325

Cys Gin Ile Ser Ala Ala Asn Phe 340Cys Gin Ile Ser Ala Ala Asn Phe 340

Arg Gly Asn Val Lys Lys Leu His 355 360Arg Gly Asn Val Lys His 355 355

Phe Thr Gin Leu Gin Glu Leu Asp 300Phe Thr Gin Glu Glu Leu Asp 300

Leu Pro Ser Gly Met Lys Gly Leu 315 320Leu Pro Ser Gly Met Lys Gly Leu 315 320

Ser Val Asn His Phe Asp Gin Leu 330 335Ser Val Asn His Phe Asp Gin Leu 330

Pro Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile 345 350Pro Ser Leu Thr Leu Tyr Ile 345 350

Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys 365Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys 365

Leu Gly Asn Leu Gin Thr Leu Asp 370 375Leu Gly Asn Leu Asp 370 375

Ser Asp Cys Cys Ser Leu Gin Leu 385 390Ser Asp Cys Cys

Leu Asn Leu Ser His Asn Glu Pro 405Leu Asn Leu Ser His Asn Glu Pro 405

Lys Glu Cys Pro Gin Leu Glu Leu 420Lys Glu Cys Pro Gin Leu

His íle Asn Ala Pro Gin Ser Pro 435 440His Asn Ala Pro Gin Ser Pro 435 440

Val Leu Asn Leu Thr Tyr Cys Phe 450 455Val Leu Asn Leu Thr Tyr Cys Phe 450,455

Leu Ala Gly Leu Pro Val Leu Arg 465 470Leu Ala Gly Leu For Val Leu Arg 465 470

Phe Gin Asp Gly Thr Ile Thr Lys 485Phe Gin Asp Gly Thr

Ser Leu Glu Val Leu Ile Leu Ser 500Glu Val Leu Ile Leu Ser 500

Gin Gin Ala Phe His Ser Leu Gly 515 .. 520Gin Gin Ala Phe 515 .. 520

His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser 530 535His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser 530 535

Gly Ile Tyr Leu Asn Leu Ala Ala 545 550Gly Ile Tyr Leu Asn Leu Ala Ala 545,550

Arg Leu Leu Pro íle Leu Ser Gin 565Arg Leu Leu Pro leu Ser Gin 565

Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala 380Leu Ser His Asn As Ile Glu Ala 380

Lys Asn Leu Ser His Leu Gin Thr 395 400Lys Asn Leu Ser His Leu Gin Thr 395 400

Leu Gly Leu Gin Ser Gin Ala Phe 410 415Leu Gly Le Gin Ser Gin Ala Phe 410 415

Leu Ašp Leu Ala Phe Thr Arg Leu 425 430Leu Asp A Leu Ala Phe Thr Arg Leu 425 430

Phe Gin Asn Leu His Phe Leu GinPhe Gin Asn Leu His Phe Leu Gin

445445

Leu Asp Thr Ser Asn Gin His Leu 460Leu Asp Thr Ser Asn Gin His Leu

His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His 475 480His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His 475,480

Thr Asn Leu Leu Gin Thr Val Gly 490 495Thr Asn Leu Gin Thr Val Gly 490 495

Ser Cys Gly Leu Leu Ser íle Asp 505 510Ser Cys Gly Leu Leu Ser J Asp 505 510

Lys Met Ser His Val Asp Leu Ser 525Lys Met Ser Val Val Leu Ser 525

Ile Asp Ser Leu Ser His Leu Lys 540Ile Asp Ser Leu

Asn Ser Ile Asn Ile Ile Ser Pro 555 560Asn Ser Ile Asn Ser Ile Ser 555 560

Gin Ser Thr Ile Asn Leu Ser His 570 575Gin Ser Thr Ile Asn Leu Ser His 570 575

Asn same time Pro for Leu Leu Asp 580 Asp 580 Cys Cys Thr Thr Cys Cys Ser Ser Asn 585 same time 585 íle Ile His His Phe Phe Leu Leu Thr 590 Thr 590 Trp Trp Tyr Tyr Lys Lys Glu Glu Asn 595 same time 595 Leu Leu His His Lys Lys Leu Leu Glu 600 Glu 600 Gly Gly Ser Ser Glu Glu Glu Glu Thr 605 Thr 605 Arg Arg Val wall Gin gin Asn same time Pro 610 for 610 Pro for Ser Ser Leu Leu Arg Arg Gly 615 Gly 615 Val wall Lys Lys Leu Leu Ser Ser Asp 620 Asp 620 Val wall Lys Lys Leu Leu Ser Ser Cys 625 Cys 625 Gly Gly íle Ile Thr Thr Ala Ala íle 630 Ile 630 Gly Gly íle Ile Phe Phe Phe Phe Leu 635 Leu 635 íle Ile Val wall Phe Phe Leu Leu Leu 640 Leu 640 Leu Leu Leu Leu Ala Ala íle Ile Leu 645 Leu 645 Leu Leu Phe Phe Phe Phe Ala Ala Val 650 wall 650 Lys Lys Tyr Tyr Leu Leu Leu Leu Arg 655 Arg 655 Trp Trp Lys Lys Tyr Tyr Gin gin His 660 His 660 Phe Phe

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEKV. ID ČÍS.: 3:(2) SEQ ID NO. ID NO .: 3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DĹŽKA: 7 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) 'REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID ČÍS.: 3:(A) LENGTH: 7 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) 'STRING: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ. ID NO .: 3:

ACCATGGACCATGG

7/7 /

Claims (25)

1. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina kódujúca ľudský BAS-1 proteín alebo jeho fragment.An isolated or recombinant nucleic acid encoding a human BAS-1 protein or fragment thereof. 2. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina podľa nárokuThe isolated or recombinant nucleic acid of claim 1 1, kde uvedená nukleová kyselina obsahuje sekvenciu definovanú v SEKV. ID ČÍS.: 1.1, wherein said nucleic acid comprises the sequence defined in SEQ. ID NO .: 1. ťť 3. Nukleová kyselina podľa nároku 2, kde uvedená nukleová * kyselina vykazuje aspoň 80 % zhodnosť k prírodnej cDNA kódujúcej uvedený fragment.The nucleic acid of claim 2, wherein said nucleic acid has at least 80% identity to the natural cDNA encoding said fragment. 4. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina podľa nárokuThe isolated or recombinant nucleic acid of claim 1 2, ktorá kóduje aspoň 8 po sebe idúcich zvyškov SEKV. ID ČÍS.: 2.2, which encodes at least 8 consecutive residues of SEQ. ID NO .: 2. 5. Nukleová kyselina podľa nároku 4, ktorá kóduje aspoň 12 po sebe idúcich zvyškov.The nucleic acid of claim 4, which encodes at least 12 consecutive residues. 6. Nukleová kyselina podľa nároku 4, kde uvedená nukleová kyselina vykazuje aspoň 80 % zhodnosť k prírodnej cDNA kódujúcej uvedený segment.The nucleic acid of claim 4, wherein said nucleic acid has at least 80% identity to the natural cDNA encoding said segment. 7. V podstate čistý BAS-1 proteín alebo jeho peptid.A substantially pure BAS-1 protein or peptide thereof. 8. Proteín alebo peptid podľa nároku 7 vybraný zo skupiny, ktorá * sa skladá z:The protein or peptide of claim 7 selected from the group consisting of: Z *FROM * a) proteínu alebo peptidu z opíc, vrátane ľudského,(a) protein or peptide from monkeys, including human; b) proteínu alebo peptidu, ktorý obsahuje aspoň jeden polypeptidový segment definovaný v SEKV. ID ČÍS.: 2,b) a protein or peptide comprising at least one polypeptide segment as defined in SEQ. ID NO .: 2, c) proteínu alebo peptidu, ktorý vykazuje posttranslačný modifikačný profil odlišný od prírodného BAS-1 proteínu ac) a protein or peptide that exhibits a post-translational modification profile different from the native BAS-1 protein; and d) proteínu, ktorému chýba intracelulárna doména BAS-1.d) a protein lacking the intracellular domain of BAS-1. 9. Protein alebo peptid podlá nároku 8, ktorý obsahuje segment, ktorý vykazuje sekvenčnú homológiu k zodpovedajúcej časti ludského BAS-1: ¹ The protein or peptide of claim 8, comprising a segment that exhibits sequence homology to the corresponding portion of human BAS-1: ¹ a) uvedená homológia má aspoň 90 % zhodnosť a uvedená časť je aspoň 9 aminokyselín,(a) said homology has at least 90% identity and said portion is at least 9 amino acids; b) uvedená homológia má aspoň 80 % zhodnosť a uvedená časť je aspoň 17 aminokyselín alebo(b) said homology has at least 80% identity and said portion is at least 17 amino acids; or c) uvedená homológia má aspoň 70 % zhodnosť a uvedená časť je aspoň 25 aminokyselín.c) said homology has at least 70% identity and said portion is at least 25 amino acids. 10. Fúzny protein podlá nároku 7, ktorý obsahuje BAS-1 peptid.The fusion protein of claim 7, comprising a BAS-1 peptide. 11. Prostriedok podlá nároku 7, ktorý obsahuje protein a farmaceutický prijatelný nosič.The composition of claim 7, which comprises a protein and a pharmaceutically acceptable carrier. Protilátka alebo protilátkou špecificky viaže rekombinantný BAS-1 protein alebo jeho fragment viazaný fragment, ktorý alebo purifikovaný opičíThe antibody or antibody specifically binds a recombinant BAS-1 protein, or fragment thereof, a bound fragment that or purified monkey 13. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedený BAS-1 protein je opičí protein vrátane jedného ludského.The antibody of claim 12, wherein said BAS-1 protein is a monkey protein, including one human. 14. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedená protilátka sa získa proti peptidovej sekvencií definovanej v SEKV. ID ČÍS.: 2.The antibody of claim 12, wherein said antibody is obtained against the peptide sequences defined in SEQ. ID NO .: 2. 15. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedená protilátka má Kd aspoň 10 μΜ.The antibody of claim 12, wherein said antibody has a K d of at least 10 µΜ. 16. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedená protilátka je monoklonálna protilátka.The antibody of claim 12, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 17. Protilátka podľa nároku 12, kde uvedená protilátka je značená.The antibody of claim 12, wherein said antibody is labeled. 18. Protilátka podľa nároku 12, ktorá:The antibody of claim 12, wherein: a) indukuje silnú proliferáciu B buniek a/alebo(a) induces strong B cell proliferation; and / or b) chráni B bunky pred apoptózou indukovanou ožiarením.b) protects B cells from radiation-induced apoptosis. 19. Expresný vektor podľa nároku 1, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu.The expression vector of claim 1, which comprises the nucleic acid. 20. Hostiteľská bunka podľa nároku 19, ktorá obsahuje vektor.The host cell of claim 19, which comprises a vector. 21. Spôsob skúmania vyznačujúci sa puri f ikovaného vzorky pre väzbového partnera k BAS-1, tým, že obsahuje kroky produkcie alebo rekombinantného BAS-1 proteínu a sledovanie v uvedenej vzorke pre špecifickú väzbu uvedeného partnera na uvedený BAS-1.21. A method of investigating a purified sample for a BAS-1 binding partner, comprising the steps of producing or recombinant BAS-1 protein and screening in said sample for specifically binding said partner to said BAS-1. 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedená vzorka obsahuje proteíny získané z T buniek, dendritických buniek, vrátane folikulárnych dendritických buniek alebo stromatických buniek vrátane fibroplastických buniek, endoteliálnych a epiteliálnych buniek.22. The method of claim 21, wherein said sample comprises proteins derived from T cells, dendritic cells, including follicular dendritic cells, or stromal cells including fibroplastic cells, endothelial and epithelial cells. 23. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedeným väzbovým partnerom je protilátka a uvedeným príkladom je hybridómový supernatant. «·23. The method of claim 21, wherein said binding partner is an antibody and said example is a hybridoma supernatant. «· 24. Spôsob modulovania fyziológie a vývoja buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa spojenie uvedených buniek s agonistom alebo antagonistom BAS-1 proteínu.24. A method of modulating the physiology and development of cells comprising contacting said cells with an agonist or antagonist of a BAS-1 protein. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedený antagonista je protilátka proti myšiemu BAS-1 proteínu.25. The method of claim 24, wherein said antagonist is an antibody against murine BAS-1 protein. 26. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedené spojenie je v kombinácii s mediátorom signálu cez antigénový receptor, CD40:CD40 ligandová dráha alebo dráha .CD28/CTLA-4:B7/B70.26. The method of claim 24, wherein said linkage is in combination with a signal mediator via an antigen receptor, a CD40: CD40 ligand pathway, or a CD28 / CTLA-4: B7 / B70 pathway.