MX2012005906A - Evento transgenico de maiz mon 87427 y la escala de desarrollo relativo. - Google Patents

Abstract

La invención presenta el evento transgénico de maíz MON 87427 y plantas, células vegetales, semillas, partes de plantas y productos de consumo derivados del evento MON 87427; la invención presenta además nucleótidos específicos para el evento transgénico de maíz MON 87427 y plantas, células vegetales, semillas, parles de plantas y productos de consumo que comprenden nucleótidos específicos para el evento transgénico de maíz MON 87427; la invención presenta además métodos relacionados con el evento transgénico de maíz MON 87427 y con el Sistema de Hibridación Roundup(r) (RHS); la invención presenta además una Escala de Desarrollo Relativo útil para monitorear y determinar el desarrollo reproductivo en el maíz que reconcilia las diferencias de desarrollo entre diversas variedades de maíz; esto es ventajoso para determinar el momento óptimo para un régimen de tratamiento en el cual la etapa de desarrollo de las panojas es un factor importante, incluyendo diversos métodos para la obtención de semilla híbrida.

Description

EVENTO TRANSGÉNICO DE MAÍZ MON 87427 Y LA ESCALA DE DESARROLLO RELATIVO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisoria de los Estados Unidos No. 61/263,526 presentada el 23 de noviembre de 2009, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad y la Solicitud Provisoria de los Estados Unidos No. 61/263,530 presentada el 23 de noviembre de 2009, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

INCORPORACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS El Listado de secuencias contenido en el archivo denominado "56887-0001_seqlisting.txt", que tiene 19.6 kilobytes (tamaño medido en Microsoft Windows®) y que fuera generado el 12 de noviembre de 2010, se presenta junto con la presente mediante presentación electrónica y se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con los campos de la reproducción de plantas, investigación y agricultura. Más específicamente, se relaciona con el evento transgénico de maíz MON 87427 y las moléculas nucleotídicas, plantas, partes de plantas, semillas, células, productos agrícolas y métodos relacionados con el evento transgénico del maíz MON 87427. También se relaciona con la predicción del desarrollo de las panojas y el uso de esto en los métodos de reproducción de plantas, investigación y agricultura y con la semilla híbrida de maíz producida por las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los cultivos con nuevos rasgos ventajosos son útiles para fines de reproducción de plantas, investigación y agricultura. Dichos cultivos se pueden producir empleando métodos de biotecnología. Sin embargo, la producción y selección de un evento transgénico comercialmente adecuado puede requerir investigación, análisis y caracterización extensa de un gran número de eventos individuales de transformación de plantas para seleccionar un evento que tanga tanto el rasgo conveniente como las características fenotipicas y agrícolas necesarias para que sea adecuada para fines comerciales y agrícolas. Este proceso de selección de eventos con frecuencia requiere ensayos de invernadero y de campo con numerosos eventos en el curso de múltiples años, múltiples ubicaciones y en una variedad de condiciones para que se pueda colectar un número significativo de datos agronómicos, fenotípicos y moleculares. A continuación los datos y observaciones obtenidos deben ser analizados por paneles de científicos y agrónomos con la meta de seleccionar un evento comercialmente adecuado. La invención presenta ese tipo de evento comercialmente adecuado que da lugar a nuevos rasgos ventajosos en el maíz.

La determinación precisa de la madurez reproductiva del maíz también es conveniente para fines de reproducción de plantas, investigación y agronómicos, como por ejemplo en la producción de semillas híbridas de maíz. Las herramientas empleadas habitualmente en la técnica para predecir y estimar las etapas de desarrollo del maíz incluyen escalas tales como Etapas V (V-Stages), que se basan en características vegetativas, y Unidades de Grados de Crecimiento (Growing Degree Units), que se basan en el número de días grado de crecimiento. Sin embargo, estas dos herramientas producen cálculos estimativos de las etapas de desarrollo de la panoja que varían significativamente en todos los genotipos de maíz. Contar con estas mediciones puede generar entonces el riesgo de perder tiempo de efectividad óptima para regímenes de tratamiento en los la etapa de desarrollo es un factor importante. La invención da a conocer una Escala de Desarrollo Relativo que se basa en el desarrollo de la panoja y que se concilla en todos los genotipos, que habitualmente es de utilidad para monitorear y predecir el desarrollo de las panojas del maíz en los diversos genotipos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención presenta una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-8. La invención presenta asimismo una molécula de ADN recombinante formada por la empalme de una molécula de ácido nucleico heterólogo insertado y ADN genómico de una planta de maíz, célula vegetal o semilla. La invención presenta además una molécula de ADN recombinante derivada del evento transgénico de maíz MON 87427, habiéndose depositado una muestra representativa de semillas en la American Type Culture Collection (ATCC®) bajo el número de Acceso PTA-7899. La invención presenta además una molécula de ADN recombinante que es un amplicón de diagnóstico para determinar la presencia de ADN derivado del evento transgénico de maíz MON 87427. La invención presenta asimismo una molécula de ADN recombinante que se encuentra en una planta, célula vegetal, semilla, planta de la progenie, parte de una planta de maíz o en un producto de consumo derivado del evento transgénico de maíz MON 87427.

La invención presenta también una molécula de AND que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de un tramo suficiente de la secuencia de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para que funcione como sonda de ADN que se híbrida en condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10 y que no se híbrida en las condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ADN que no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10.

La invención da a conocer además un par de moléculas de ADN que consiste en una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, donde cada una de la primera y la segunda moléculas de ADN comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de un tramo suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para que funcionen como sondas de ADN si se las utiliza juntas en una reacción de amplificación con ADN derivado del evento MON 87427 para producir un amplicón de ADN diagnóstico del evento transgénico de maíz MON 87427 en una muestra.

La invención presenta asimismo un método para detectar la presencia de una molécula de ADN obtenida merced a MON 87427 en una muestra poniendo en contacto a la muestra con la sonda de ADN, someter a la muestra y la sonda dé ADN a condiciones de hibridación rigurosas, y detectar la hibridación de la sonda de ADN a una molécula de ADN en la muestra, donde la hibridación de la sonda de ADN a la molécula de ADN indica la presencia de una molécula de ADN derivada del evento transgénico de maíz MON 87427 en la muestra.

La invención presenta asimismo un método para detectar la presencia de una molécula de ADN obtenida del evento transgénico de maíz MON 87427 en una muestra poniendo en contacto a la muestra con el par de moléculas de ADN, realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10, y detectando la presencia del amplicón de ADN en la reacción, donde la presencia del amplicón de ADN en la reacción indica la presencia de una molécula de ADN derivada de MON 87427 en la muestra.

La invención presenta además un kit de detección de ADN que comprende por lo menos una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de una longitud suficiente de secuencia de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para funcionar como cebador o sonda de ADN específico para detectar la presencia de ADN derivado del evento transgénico de maíz MON 87427, donde la detección del ADN es diagnóstico de la presencia del evento transgénico de maíz MON 87427 DNA en una muestra.

La invención presenta además una planta, semilla, célula de maíz o una parte de dicha planta que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10. La invención presenta además una planta, semilla, célula o parte de una planta de maíz que tiene tolerancia selectiva por tejidos al tratamiento con el herbicida glifosato. La invención presenta además una planta, semilla, célula o parte de una planta de maíz, el genoma de la cual produce un amplicón que comprende una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10 al analizarla en un método de amplificación de ADN.

La invención presenta además una planta o semilla de maíz, donde la planta o semilla de maíz se genera merced al evento transgénico de maíz MON 87427. La invención presenta además una planta o semilla de maíz, donde la planta o semilla de maíz es un híbrido que tiene por lo menos un progenitor derivado del evento transgénico de maíz MON 87427.

La invención presenta además un material vegetal no vivo que comprende una molécula de ADN recombinante seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10.

La invención presenta además un microorganismo que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10. La invención presenta además un microorganismo que es una célula vegetal.

La invención presenta además un producto de consumo producido como consecuencia del evento transgénico de maíz MON 87427 y que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10, donde la detección de una secuencia de nucleótidos en una muestra derivada de un producto de consumo es determinante de que el producto de consumo fuera producido por el evento transgénico de maíz MON 87427. La invención presenta además un producto de consumo seleccionado del grupo que consiste en semillas enteras o procesadas, pienso animal, aceite, sémola, harina, copos, salvado, biomasa y productos combustibles. La invención presenta asimismo un método para producir un producto de consumo mediante la obtención de una planta de maíz o parte de la misma que comprende el evento transgénico de maíz MON 87427y producir un producto de consumo de maíz a partir de la planta de maíz o parte de la misma.

La invención presenta asimismo un método para controlar las malezas en un campo plantando plantas MON 87427 en un campo y aplicando una dosis efectiva del herbicida glifosato para controlar las malezas en el campo sin dañar las plantas del evento transgénico de maíz MON 87427. La invención presenta asimismo un método para combatir malezas en un campo, donde la dosis efectiva del herbicida glifosato es de aproximadamente 0,1 libra a aproximadamente 4 libras por acre (0.11 a 4.48 kg/ha).

La invención presenta asimismo un método para producir una planta de maíz que tolera la aplicación del herbicida glifosato cruzando sexualmente una planta con el evento transgénico de maíz MON 87427 que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10 con una segunda planta de maíz, produciendo de esa manera semillas, recoger las semillas producidas por la cruza, cultivar la semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie, tratar las plantas de la progenie con glifosato y seleccionar una planta de la progenie con tolerancia al glifosato. La invención presenta asimismo un método para producir una planta de maíz que tolera la aplicación del herbicida glifosato autopolinizando una planta con el evento transgénico MON 87427 que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10, para producir asi semilla, colectar la semilla producida por la autopolinización, cultivar la semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie, con glifosato y seleccionar una planta de la progenie con tolerancia al glifosato.

La invención presenta asimismo un método para producir una semilla de maíz híbrido plantando semillas con el evento transgénico de maíz MON 87427 en una zona, cultivando una planta de maíz a partir de la semilla, tratando la planta con una dosis efectiva del herbicida glifosato con anterioridad a la formación del polen para que la planta macho sea estéril sin dañar la planta, fertilizando la plata con polen de una segunda planta progenitora y cosechando semillas de la planta, donde la semilla es una semilla de maíz híbrido producida por la cruza de las planta con el evento transgénico MON 87427 con una segunda planta progenitora. La invención presenta asimismo un método para producir semilla de maíz híbrido, donde la dosis efectiva del herbicida glifosato es de aproximadamente 0.1 libra a aproximadamente 4 libras por acre (0.11 a 4.48 kg/ha). La invención presenta asimismo un método para producir semillas de maíz híbrido, que incluye además plantar la semilla de una segunda planta progenitora en el área y cultivar una planta de maíz a partir de la segunda planta progenitora. La invención presenta asimismo un método para producir semillas de maíz híbrido, en el cual la segunda planta progenitora es tolerante al glifosato.

La invención presenta asimismo un método para predecir la ocasión del desarrollo de panojas del maíz mediante la selección de un rango en una Escala de Desarrollo Relativo, donde el rango indica la maduración hasta una etapa de desarrollo pretendido de la panoja. La invención presenta asimismo un método para predecir el momento del desarrollo de las panojas del maíz, donde la etapa de desarrollo pretendida de las panojas es la etapa de desarrollo óptima de las panojas para la cruza reproductiva, la esterilización de las panojas, el despanojado y/o la administración de un tratamiento modulador del desarrollo a una planta de maíz. La invención presenta asimismo un método para predecir el momento del desarrollo de las panojas del maíz, donde la etapa de desarrollo específica de las flores utilizada para la construcción de la Escala de Desarrollo Relativo es en la diseminación de polen correspondiente a aproximadamente 50 por ciento de una población de plantas de maíz y donde el rango es de aproximadamente 0.62 y aproximadamente 0.75 en la Escala de Desarrollo Relativo. La invención presenta asimismo un método para predecir el momento del desarrollo de las panojas del maíz, que además incluye administrar un tratamiento modulador del desarrollo a una planta de maíz en la etapa de desarrollo pretendido de las panojas.

La invención presenta asimismo un método para producir semillas híbridas de maíz plantando semillas de maíz correspondientes a una primera planta progenitora en una zona, cultivar la primera planta progenitora a partir de la semilla de maíz, determinar el momento del desarrollo de las panojas de la primera planta progenitora mediante la selección de un rango que indica la maduración hasta una etapa de desarrollo pretendida de las panojas en una Escala de Desarrollo Relativo, utilizando la determinación de la etapa de desarrollo de las panojas para administrar en forma oportuna un tratamiento modulador del desarrollo a la primera planta progenitora, previniendo así la auto-fertilización de la primera planta progenitora, la administración del tratamiento modulador del desarrollo a la primera planta progenitora, la fertilización de la primera planta progenitora con polen de una segunda planta progenitora, y la cosecha de la semilla de la primera planta progenitora, donde la semilla es una semilla de maíz híbrida producida por la cruza de la primera planta progenitora con la segunda planta progenitora. La invención presenta además la semilla de maíz híbrido producida utilizando el método. La invención presenta asimismo un método para producir semillas híbridas de maíz, en el cual tratamiento modulador del desarrollo es glifosato y la primera planta progenitora tiene tolerancia al glifosato selectiva de tejidos. La invención presenta asimismo un método para producir semillas híbridas de maíz, en el cual la primera planta progenitora es una planta con el evento transgénico MON 87427. La invención presenta asimismo un método para producir semillas híbridas de maíz, en el cual la segunda planta progenitora es tolerante al glifosato.

Los anteriores y otros aspectos de la invención se pondrán más claramente de manifiesto en la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra la organización del evento transgénico de maíz MON 87427. En la figura, [A1], [A2] y [A3] corresponden a la posición relativa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, respectivamente, que abarcan el ADN genómico del maíz que flanquea el extremo 5' del inserto transgénico y la porción 5' del ADN del inserto transgénico; [B1], [B2] y [B3] corresponden a la posición relativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, que abarcan el ADN genómico del maíz que flanquea el extremo 3' del inserto transgénico y la porción 3' del ADN del inserto transgénico; [C] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 7, que incluye el ADN genómico del maíz que flanquea el extremo 5' del inserto transgénico y una porción del extremo 5' del inserto transgénico; [D] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 8, que incluye el ADN genómico del maíz que flanquea el extremo 3' del inserto transgénico y una porción del extremo 3' del inserto transgénico; [E] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 9 y los diversos elementos del inserto transgénico y [F] representa la secuencia de contiguos de MON 87427 que se presenta como SEQ ID NO: 10 y que comprende SEQ ID NO: 1-9.

La figura 2 ilustra el rendimiento de la semilla de híbridos de MON 87427 al cruzarlos con el evento de maíz NK603 y rociarlos dos veces por temporada con glifosato en una proporción de 2.25 libras por acre (2.52 kg/ha) cada vez.

La figura 3 ilustra las etapas de desarrollo de la panoja utilizadas para la construcción de la Escala de Desarrollo Relativo. El tamaño aproximado está indicado entre paréntesis. En la figura, Vg es el meristema en la etapa vegetativa; TO es el cambio de vegetativa a reproductiva; T1 es el punto de desarrollo reproductivo visible (0.9 mm); 12 representa las primeras ramas laterales visibles (1.8 mm); T3 representa las primeras espiguillas visibles (4.1 mm); T4 es el alargamiento del eje central y el eje lateral (12.9 mm); T5 es el comienzo de la diferenciación de las anteras (41.0 mm); T6 es el comienzo de la diferenciación del polen (175 mm); y T7 es la extrusión de las anteras y la diseminación de polen (285.0 mm).

La figura 4 ilustra la variación del tamaño de las panojas entre tres genotipos de maíz en dos etapas de desarrollo (V8 y V10).

La figura 5 ilustra la correlación entre los requerimientos de GDU para la Etapa T5 y los necesarios para 50% de P y, más específicamente, ilustra la línea de regresión producida utilizando la correlación entre los requisitos de GDU para T5 y P50%. Cada punto representa una endogámica diferente, promediada de todas las ubicaciones.

La figura 6 ilustra un ejemplo de la manera en que la Escala de Desarrollo Relativo revela una ventana óptima de eficacia del agente químico para producir esterilidad de las panojas de maíz medida por el riesgo de extrusión de las anteras (Riesgo AE (%)) que tiene lugar a 0.62 y 0.75 en la Escala de Desarrollo Relativo, donde se obtiene 62% - 75% del requerimiento total de GDU para alcanzar P50 y en la cual se minimiza el Riesgo de AE en todas las endogámicas y grupos de maduración. Cada punto de datos representa valores promediados correspondientes a 1 lote, o dos hileras que totalizan 32 plantas. N=620 La figura 7 ilustra las etapas T en función de GDU y la Escala de Desarrollo Relativo. Cada linea de regresión representa una endogámica diferente.

La figura 8 ilustra el porcentaje de riesgo (y el eje) de extrusión de las anteras medido en diferentes etapas de formación de estigmas (eje x) con respecto a los bloques de MON 87427 y CMS.

La figura 9 ilustra la pureza genética de las semillas y la pureza de rasgos de las semillas de semillas híbridas producidas por MON 87427 con la tecnología de Hibridación Roundup® (RHS) y según CMS en el nivel de significancia de 95%. La línea negra del gráfico representa las normas de calidad pretendidas para la pureza genética de las semillas y la pureza de rasgos de las semillas, respectivamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa la región de junta 5' de un ADN de maíz genómico y un cassette de expresión transgénico integrado.

SEQ ID NO: 2 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa la región de junta 3' de un ADN de maíz genómico y un cassette de expresión transgénico integrado.

SEQ ID NO: 3 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la región de junta 5' de un ADN de maíz genómico y un cassette de expresión transgénico integrado.

SEQ ID NO: 4 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la región de junta 3' de un ADN de maíz genómico y un cassette de expresión transgénico integrado.

SEQ ID NO: 5 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la región de junta 5' de un ADN de maíz genómico y un cassette de expresión transgénico integrado.

SEQ ID NO: 6 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la región de junta 3' de un ADN de maíz genómico y un cassette de expresión transgénico integrado.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia 5' que flanquea al ADN insertado de MON 87427 hasta una región de inserción del ADN del transgén inclusive.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia 3' que flanquea al ADN insertado de MON 87427 hasta una región de inserción del ADN del transgén inclusive..

SEQ ID NO: 9 es la secuencia completamente integrada al ADN genómico del maíz y que contiene el ADN del cassette de expresión.

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos que representa los contiguos de la secuencia 5' que flanquea al ADN insertado de MON 87427 (SEQ ID NO: 7), la secuencia completamente integrada al ADN genómico del maíz y que contiene el cassette de expresión (SEQ ID NO: 9) y la secuencia 3' que flanquea al ADN insertado de (SEQ ID NO: 8) y que incluye SEQ ID NO: 1-6.

SEQ ID NO: 11 Es un Cebador para Eventos de ensayo de transgenes específicos-1 SQ20052 utilizado para identificar MON 87427. Un amplicón de PCR producido con un ensayo TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando la combinación de cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 es un resultado positivo de la presencia del evento MON 87427.

SEQ ID NO: 12 Es un Cebador para Eventos de ensayo de transgenes específicos-1 SQ20053 empleado para identificar MON 87427.

SEQ ID NO: 13 es una Sonda PB10016 para Eventos 6-FAM de transgenes específicos empleada para identificar MON 87427. Esta sonda es un oligonucleótido sintético marcado con 6FAM™. La liberación de una señal fluorescente en una reacción de amplificación utilizando los cebadores SEQ ID NO: 11-12 en combinación con la sonda marcada con 6FAM™ es un diagnóstico del evento MON 87427 en un ensayo TAQMAN®.

SEQ ID NO: 14 es un Cebador Control Interno de ensayo para transgenes específicos-1 SQ1241.

SEQ ID NO: 15 es un Cebador Control Interno de ensayo para transgenes específicos-1 SQ1242.

SEQ ID NO: 16 es un Cebador Control VIC e ensayo para transgenes específicos PB0084.

SEQ ID NO: 17 es un Cebador de ensayo de Eventos para eventos específicos-1 SQ 12763 empleado para la identificación de MON 87427. Un amplicón de PCR producido mediante un ensayo TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando la combinación de cebadores SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 es un resultado positivo que indica la presencia del evento MON 87427.

SEQ ID NO: 18 es un Cebador de ensayo de Eventos para eventos específicos-1 SQ 12886 empleado para la identificación de MON 87427.

SEQ ID NO: 19 es una Sonda de ensayo 6-FAM de eventos específicos PB4352 empleado para la identificación de MON 87427.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se presentan las siguientes definiciones y métodos para definir mejor la invención y para guiar a las personas con capacitación en la técnica en la práctica de la invención. A menos que se indique lo contrario, los términos han de ser interpretados según el uso convencional de las personas con capacitación en la técnica pertinente.

En el presente contexto, el término maíz se refiere a Zea mays e incluye todas las variedades de plantas que se pueden cultivar con el maíz incluyendo especies silvestres de maíz tales como las plantas que pertenecen a Zea que permiten la reproducción entre especies.

"Glifosato" se refiere a N— fosfonometilglicina, que es un herbicida que es un inhibidor de la enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS). El glifosato interfiere con la síntesis de los aminoácidos aromáticos mediante la inhibición de EPSPS. El glifosato se comercializa bajo la denominación comercial herbicida Roundup® (Monsanto Company, St. Louis, Missouri).

La invención presenta el evento transgénico del maíz MON 87427 (al que en la presente se hace referencia también como MON 87427). En el presente contexto, el término "evento" se refiere a un producto generado por la acción de insertar una molécula de ácido nucleico transgénico en el genoma de una planta, es decir por la acción de transformación de plantas para producir una planta transgénica. Por lo tanto, los "eventos" son producidos por las acciones humanas de: (i) transformar una célula vegetal en un laboratorio con una molécula de ácido nucleico que incluye un transgén de interés, es decir insertar en el genoma de la célula vegetal la construcción o molécula de ácido nucleico, (ii) regenerar una población de plantas transgénicas producidas como resultado de la inserción de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la planta y (iii) seleccionar una planta determinada que se caracteriza por la inserción de la molécula de ácido nucleico en una ubicación específica del genoma de la planta. Por lo tanto, se puede describir el evento de manera singular y específica por una secuencia de ácido nucleico que representa por lo menos una porción de la molécula de ADN contiguo producida por el evento mediante la inserción de la molécula de ácido nucleico en la ubicación específica del genoma de la planta y que incluye una porción del propio ADN genómico de la planta, que flanquea y está físicamente conectado a la molécula de ADN insertada y la molécula de ácido nucleico insertada. Un evento es recombinante, producido por acciones humanas y que no se encuentra en las plantas no transgénicas.

El término "evento" se refiere por consiguiente a la planta original transformada ("transformante") que incluye la molécula de ácido nucleico insertada en la ubicación específica del genoma de la planta. El término "evento" se refiere asimismo a toda la progenie que desciende de la transformante que incluye la molécula de ácido nucleico insertada en la ubicación específica del genoma de la planta. Por lo tanto, dicha progenie es transgénica y comprende el evento La progenie se puede producir por cualquier medio, entre los que se incluyen la autofertilización, la cruza con otra planta que comprende el mismo u otro transgén y/o la cruza con una planta no transgénica, como por ejemplo una de una variedad diferente. Aun después de muchas generaciones, en la planta a la que se hace referencia como planta de la progenie de MON 87427, el ADN insertado y el ADN que flanquea a la planta transformada original han de estar presentes y son fácilmente identificables.

El término "evento" se refiere también a la molécula de ADN continuo generado en la transformante original (que comprende el ADN insertado y el ADN genómico flanqueante del maíz inmediatamente adyacente a cada lado del ADN insertado) o cualquier molécula de ADN que comprenda esa secuencia de ácido nucleico. La molécula de ADN contiguo fue generada por la acción de insertar una molécula de ácido nucleico transgénico en el genoma de una planta, es decir por la acción de transformación y es especifica y característica del evento específico. Por consiguiente, la disposición del ADN insertado en MON 87427 con respecto al ADN genómico circundante de la planta de maíz es especifico y distintivo de MON 87427. Esta molécula de ADN es también parte integral del cromosoma de maíz de MON 87427 y por ello es fija en la planta y puede ser heredada por cualquier planta de la progenie.

Las plantas con el evento de maíz transgénico MON 87427 exhiben tolerancia al glifosato selectiva de tejidos aceptable en el comercio. En MON 87427, los tejidos vegetativos del maíz y los tejidos reproductivos femeninos del maíz son tolerantes al glifosato, pero los tejidos reproductivos masculinos clave del maíz críticos para el desarrollo del polen del maíz no son tolerantes al glifosato. Por lo tanto se pueden utilizar las plantas MON 87427 tratadas con glifosato como progenitoras femeninas en la producción de semillas híbridas.

En el presente contexto, el término "recómbinante" se refiere a un ADN y/o proteína y/o un organismo no natural que no se encontraría normalmente en la naturaleza y que ha sido creado por la intervención humana, es decir, por las manos humanas. Dicha intervención humana puede producir una molécula de ADN y/o una planta o semilla. En el presente contexto, una "molécula de ADN recómbinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no se produciría naturalmente y es el resultado de la intervención humana, por ejemplo una molécula de ADN que está compuesta por una combinación de por lo menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí y/o una molécula de ADN que se sintetiza artificialmente y tiene una secuencia de nucleótidos que se aparta de la secuencia de nucleótidos que normalmente existiría en la naturaleza y/o una molécula de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico artificialmente incorporada al ADN genómico de una célula huésped y el ADN flanqueante asociado del genoma de la célula huésped. Un ejemplo de molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN que comprende por lo menos una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 1-10. En el presente contexto, una "planta recombinante" es una planta que normalmente no existiría en la naturaleza y es el resultado de la intervención humana y contiene un transgén y/o una molécula de ADN heteróloga que se incorpora a su genoma. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta recombinante es característicamente diferente de la planta relacionada de tipo salvaje. Un ejemplo de planta recombinante es una planta con el evento transgénico MON 87427.

En el presente contexto, el término "transgén" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se incorpora artificialmente al genoma de un organismo como resultado de la intervención humana. Dicho transgén puede ser heterólogo con respecto a la célula huésped. El término "transgénico" se refiere a que comprende un transgén, por ejemplo una "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende un transgén, es decir, una molécula de ácido nucleico incorporada artificialmente al genoma del organismo como 2 resultado de la intervención humana. En el presente contexto, el término "heterólogo" se refiere a una primera molécula que no se encuentra normalmente en combinación con una segunda molécula en la naturaleza. Por ejemplo, se puede obtener una molécula de una primera especie e insertarla en el genoma de una segunda especie. Por consiguiente, la molécula sería heteróloga, es decir, heteróloga con respecto al organismo e incorporada artificialmente al genoma del organismo.

En el presente contexto, el término "quimérico" se refiere a una única molécula de ADN producida mediante la fusión de una molécula de ADN a una segunda molécula de ADN, donde ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontraría normalmente en esa configuración, es decir fusionadas entre sí. La molécula quimérica de AND es, por consiguiente, una molécula de ADN que de lo contrario no se encontraría normalmente en la naturaleza. Un ejemplo de molécula quimérica de AND es una molécula de ADN que comprende por lo menos una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 1-10.

La invención presenta moléculas de AND y sus correspondientes secuencias de nucleótidos. En el presente contexto, el término "ADN", "molécula de AND", "molécula de ADN", "molécula de ácido nucleico", se refiere a una molécula de ADN bicatenaria de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases desoxiribonucleotídicas o una molécula de nucleótidos, leída desde el extremo 5' (secuencia arriba) hacia el extremo 3' (secuencia abajo). En el presente contexto, el término "secuencia de ADN" o "secuencia de nucleótidos" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada en la presente es la dispuesta por el Título 37 del Código de Reglamentaciones Federales de los Estados Unidos (United States Code of Federal Regulations) § 1.822 y que aparecen en las tablas de la norma WIPO ST.25 (1998), Apéndice 2, Tablas 1 y 3. Por el uso normal y en el presente contexto, las secuencia de nucleótidos de la invención, como por ejemplo las provistas bajo el título SEQ ID NO: 1-10 y fragmentos de las mismas, se presentan con referencia a sólo una cadena de las dos cadenas complementarias de secuencias de nucleótidos, aunque por extensión también las secuencias complementarias (es decir, las secuencias de la cadena complementaria), a las que en la técnica se hace referencia como secuencias complementarias reversas, están dentro del alcance de la invención y se pretende que estén expresamente dentro del alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, en el presente contexto las referencias a SEQ ID NO: 1-10 y fragmentos de las mismas incluyen, y se refieren a, la secuencia de la cadena complementaria y fragmentos de la misma.

En el presente contexto, el término "fragmento" se refiere a una porción o un trozo incompleto más pequeño de un todo. Por ejemplo, los fragmentos de SEQ ID NO: 10 incluirían secuencias que comprende por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, o por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos de la secuencia completa de SEQ ID NO: 10.

La secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos completa del ADN transgénico insertado y segmentos sustanciales del ADN del genoma del maíz que flanquea a cada extremo del ADN transgénico insertado se presenta en la presente con el título SEQ ID NO: 10. Una subsección de ésta es el ADN transgénico insertado (al que en la presente también se hace referencia como inserto del transgén o ADN insertado), provista como SEQ ID NO: 9. La secuencia de nucleótidos del ADN genómico del maíz ligado físicamente por el ligamiento de enlace fosfodiéster al extremo 5' del ADN insertado y que, por lo tanto lo flanquea, y que contiene 10 nt del ADN del transgén insertado, aparece en SEQ ID NO: 7. La secuencia de nucleótidos del ADN genómico del maíz ligado físicamente por el ligamiento de enlace fosfodiéster al extremo 3' del ADN insertado y que, por lo tanto lo flanquea, y que contiene 10 nt del ADN del transgén insertado, aparece en SEQ ID NO: 8.

El MON 87427 comprende además dos regiones a las que se hace referencia como empalmes. Un "empalme" se produce donde un extremo del ADN transgénico insertado ha sido insertado en el ADN genómico y conectado al mismo. Un empalme abarca, es decir se extiende a lo largo de una porción del ADN transgénico y el ADN genómico flanqueante adyacente y, por ello, comprende el punto de conexión de estos dos como única molécula contigua. Un empalme está en el extremo 5' del ADN transgénico insertado y otro esté en el extremo 3' del ADN transgénico insertado, a los que en la presente se hace referencia como empalmes 5' y 3', respectivamente. Una "secuencia de empalme" o "región de empalme" se refiere a la secuencia de ADN y/o la correspondiente molécula de ADN del empalme. Las Secuencias de empalme de MON 87427 pueden ser diseñadas por una persona con capacitación en la técnica utilizando SEQ ID NO: 10. Se presentan ejemplos de secuencias de empalme de MON 87427 como SEQ ID NO: 1-6. SEQ ID NO: 1 es una secuencia de 20 nucleotidos que abarca el empalme entre el ADN genómico del maíz y el extremo 5' del inserto de ADN transgénico; SEQ ID NO: 3 es una secuencia de 60 nucleotidos que abarca el empalme entre el ADN genómico del maíz y el extremo 5' del inserto de ADN transgénico; SEQ ID NO: 5 i es una secuencia de 100 nucleotidos que abarca el empalme entre el ADN genómico del maíz y el extremo 5' del inserto de ADN transgénico. SEQ ID NO: 2 es una secuencia de 20 nucleotidos que abarca el empalme entre el ADN genómico del maíz y el extremo 3' del ADN insertado; SEQ ID NO: 4 es una secuencia de 60 nucleotidos que abarca el empalme entre el ADN genómico del maíz y el extremo 3' del ADN insertado; SEQ ID NO: 6 es una secuencia de 100 nucleotidos que abarca el empalme entre el ADN genómico del maíz y el extremo 3' del ADN insertado. La figura 1 ilustra la disposición física de SEQ ID NO: 1-10 dispuesta de 5' a 3'. Cualquier segmento de AND de MON 87427 transgénico que incluya SEQ ID NO: 1-6 está dentro del alcance de la invención. La invención presenta, por consiguiente, una molécula de ADN que contiene por lo menos una de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO: 1-6.

Las secuencias de empalme del evento MON 87427 están presentes como partes del genoma de una planta, semilla o célula con el evento transgénico MON 87427. La identificación de cualquiera de SEQ ID NO: 1-6 en una muestra derivada de una planta, semilla o parte de planta de maíz es determinante de que el ADN ha sido obtenido de MON 87427 es diagnóstica de la presencia en una muestra de ADN de MON 87427.

La invención presenta moléculas de ADN ilustrativas que se pueden utilizar tanto como cebadores como en calidad de sondas para diagnosticar la presencia de ADN derivado del evento MON 87427 de plantas del maíz en una muestra. Dichos cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico objetivo y, por tal motivo, son útiles para la identificación de las secuencias de ácido nucleico MON 87427 por los métodos de la invención descritos en la presente.

Un "cebador" es una molécula de ácido nucleico que está destinada al uso en métodos de reasociación o hibridación que conllevan la amplificación térmica. Se puede utilizar un par de cebadores con el ADN plantilla, como por ejemplo un ADN genómico del maíz, en una amplificación térmica tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, donde el amplicón producido por dicha reacción tendría una secuencia de ADN que corresponde a una secuencia del ADN plantilla situado entre dos sitios donde los cebadores se hibridaran a la plantilla. En el presente contexto, un "amplicón" es un ADN que se ha sintetizado utilizando técnicas de amplificación. Los amplicones de la invención tienen una secuencia que comprende una o más SEQ ID NO: 1-10 o fragmentos de las mismas. Un cebador está diseñado, por lo general, para hibridarse a una cadena de ADN complementaria objetivo para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN objetivo y la presencia del cebador es un punto de reconocimiento por una polimerasa para comenzar la extensión del cebador (es decir, la polimerización de nucleótidos adicionales para obtener la prolongación de una molécula nucleotidica) utilizando como plantilla la cadena de ADN objetivo. Se pretende que, en el contexto de la invención, pares de cebadores se refieran al uso de dos cebadores que se unen a cadenas opuestas de un segmento de nucleótidos bicatenario con el fin de amplificar linealmente el segmento de nucleótidos entre las posiciones tomadas como objetivo para unirse a los miembros individuales del par de cebadores. Se presentan ejemplos de secuencias de cebadores bajo SEQ ID NO: 11-12, SEQ ID NO: 14-15 y SEQ ID NO: 17-18. El par de cebadores de SEQ ID NO: 14-15 y el par de cebadores de SEQ ID NO: 17-18 tienen, en cada caso, una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN (que es diferente de la primera molécula de ADN) donde cada una de dichas moléculas tienen una longitud suficiente de nucleótidos contiguos para funcionar como cebadores de ADN que, al utilizarlos juntos en una reacción de amplificación de ADN con el ADN plantilla derivado de MON 87427, producen un amplicón que es indicador de la presencia en una muestra de ADN de MON 87427.

Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico que es complementaria de una cadena de un ácido nucleico objetivo para usar en métodos de reasociación o hibridación. Las sondas de acuerdo con la invención incluyen no sólo ácidos desoxiribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y la detección de dicha unión puede ser de utilidad para diagnosticar, discriminar, determinar o confirmar la presencia de la secuencia de ADN objetivo en una muestra determinada. Una sonda puede estar acoplada a un marcador detectable convencional o molécula reportera, por ejemplo un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima, los ejemplos de secuencias útiles como sondas para la detección de MON 87427 son SEQ ID NO: 1-2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19.

Los métodos para diseñar y utilizar cebadores y sondas son muy conocidos en la técnica y han sido descritos, por ejemplo, por Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) y Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Blackwell. Las personas con capacitación en la técnica pueden diseñar con facilidad moléculas de ADN que comprenden fragmentos de SEQ ID NO: 1-10 y que son útiles como cebadores y sondas para detectar MON 87427 para usar como sondas en métodos de detección de hibridación, por ejemplo el método de Southern Blot.

Por lo tanto, las moléculas de ADN y las correspondientes secuencias de nucleótidos correspondientes que aquí se presentan son de utilidad, entre otras cosas, para identificar MON 87427, seleccionar variedades de plantas o híbridas que comprenden MON 87427, detectar la presencia de ADN derivado de MON 87427 transgénico en una muestra y monitorear muestras para determinar la presencia y/o ausencia de MON 87427 o partes de plantas derivadas de MON 87427.

La invención presenta plantas de maíz, progenie, semillas, células vegetales, partes de plantas y productos de consumo. Estas plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de plantas y productos de consumo contienen una cantidad detectable de un nucleótido de la invención, es decir por ejemplo una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una de las secuencias provistas bajo SEQ ID NO: 1-10. Las plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de plantas de la invención pueden contener además uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o molécula de ARN que confiere un rasgo conveniente, que incluye, aunque no a titulo de limitación la resistencia aumentada a los insectos, mayor eficiencia en el uso del agua, eficiencia incrementada del rendimiento, resistencia a las sequías aumentada, calidad mejorada de las semillas, calidad nutricional mejorada y/o tolerancia incrementada a los herbicidas, en la cual se mide el rasgo ventajoso con respecto a una planta de maíz que carece de dicho transgén adicional.

La invención presenta plantas de maíz, progenie, semillas, células vegetales y partes de plantas y hojas derivadas de un evento de plantas transgénicas de maíz MON 87427. Se ha depositado una muestra representativa de MON 87427 de acuerdo con el Tratado de Budapest a fin de habilitar la invención. El depositario seleccionado para recibir el depósito es la American Type Culture Collection (ATCC) cuya dirección es 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia E.E.U.U., Código postal 20110. El depositario ATCC ha asignado el número de acceso No. PTA-7899 a la semilla del evento MON 87427.

La invención presenta un microorganismo que comprende una molécula de ADN que tiene SEQ ID NO: 1-10 presente en su genoma. Un ejemplo de dicho microorganismo es una célula vegetal transgénica. Los microorganismos, como por ejemplo una célula vegetal de la invención, son útiles en numerosas aplicaciones industriales, que incluyen, aunque no a título de limitación: (i) uso como herramienta de investigación para investigación científica o investigación industrial; (ii) uso en cultivos para la producción de carbohidratos, lípidos, ácido nucleico o productos proteicos endógenos o recombinantes o pequeñas moléculas que se puedan utilizar para posteriores investigaciones científicas o como productos industriales y (¡ii) uso con modernas técnicas de cultivo de tejidos vegetales para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales que luego puedan ser utilizados para investigación o producción agrícola. La producción y uso de microorganismos tales como células de plantas transgénicas utilizan modernas técnicas microbiológicas y la intervención humana para producir un microorganismo único, fabricado por el hombre. En este proceso, se inserta el ADN recombinante en el genoma de una célula vegetal para generar una célula de planta transgénica que es diferente y distintiva de las células vegetales de origen natural. Esta célula vegetal transgénica puede ser cultivada posteriormente de manera muy similar a las bacterias y células de levadura utilizando modernas técnicas de microbiología y pueden existir en estado no diferenciado, unicelular. La composición genética de la nueva célula vegetal y su fenotipo es un efecto técnico generado por la integración del ADN heterólogo en el genoma de la célula. Otro aspecto de la invención es un método para utilizar un microorganismo de la invención. Los métodos para utilizar microorganismos de la invención, tales como células vegetales transgénicos, incluyen (i) métodos la producción de células transgénicas mediante la integración del ADN recombinante al genomá de la célula y luego el uso de esta célula para derivar células adicionales que poseen el mismo ADN heterólogo; (ii) métodos para cultivar células que contienen ADN recombinante utilizando modernas técnicas de microbiología; (iii) métodos para producir y purificar productos de carbohidratos, lípidos, ácido nucleico o proteínas a partir de células cultivadas y (iv) métodos para utilizar modernas técnicas de cultivo de tejidos vegetales para producir plantas transgénicas o cultivas de tejidos vegetales transgénicos.

Las plantas de la invención pueden transmitir el ADN del evento, incluyendo el inserto del transgén, a la progenie. En el presente contexto, la "progenie" incluye cualquier planta, semilla, célula vegetal y/o parte regenerable de una planta que comprende el ADN del evento derivado de una planta antecesora y/o de una molécula de ácido nucleico que tiene por lo menos una de las secuencias provistas bajo SEQ ID NO: 1-10. Las plantas, progenie y semillas pueden ser homocigotas o heterocigotas con respecto al transgén. La progenie puede ser cultivada a partir de semillas producidas por una planta MON 87427 y/o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta MON 87427. Las plantas de la invención se pueden producir mediante autopolinización o polinización cruzada y/o se las puede utilizar en métodos de autopolinización o polinización cruzada. Por consiguiente, en una realización, una planta MON 87427 puede ser sometida a polinización cruzada con una planta de maíz diferente para producir un retoño híbrido. Los métodos de reproducción asexual útiles con las plantas de maíz MON 87427 son conocidos en la técnica.

La invención presenta una parte de una planta derivada de MON 87427. En el presente contexto, una "parte de planta" se refiere a cualquier parte de una planta que está compuesta por material derivado de una planta MON 87427. Las partes de plantas incluyen, aunque no a título de limitación, polen, óvulo, vaina, flor, o tejidos radicales, del tallo, fibras y hojas. Las partes de plantas pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.

La invención presenta un producto de consumo producido a partir del evento transgénico de maíz MON 87427 y comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10. En el presente contexto, un "producto de consumo" se refiere a cualquier composición o producto que esté compuesto por material derivado de una planta, semilla, célula vegetal o parte de planta MON 87427. Los productos de consumo pueden ser viables o no viables. Los productos de consumo no viables incluyen, aunque no a título de limitación, semillas y granos no viables, semillas procesadas, partes de semillas y partes de plantas, tejido vegetal deshidratado, tejido vegetal congelado y tejido vegetal procesado, semillas y partes de plantas procesadas para pienso animal para consumo de animales terrestres y/o acuáticos, aceite, sémola, harina, copos, salvado, fibra, leche, queso, papel, crema, vino y cualquier otro alimento para consumo humano, además de biomasas y productos combustibles. Los productos de consumo viables incluyen, aunque no a título de limitación, semillas y células vegetales. Por consiguiente, se puede emplear el evento transgénico de maíz MON 87427 para la elaboración de cualquier producto de consumo típicamente obtenido del maíz. Un producto de consumo derivado del MON 87427 puede contener una cantidad detectable del ADN específico y singular correspondiente a MON 87427 y puede contener específicamente una cantidad detectable de una molécula de ácido nucleico que tiene por lo menos una de las secuencias presentadas como SEQ ID NO: 1-10. La detección de una o más de estas secuencias en una muestra de un producto de consumo derivado, constituido por o que comprende una planta de maíz, una semilla de maíz, una célula de planta de maíz o una parte de una planta de maíz es concluyente y determinante de la presencia de material biológico derivado del evento del maíz MON87427 en ese producto de consumo y la detección de dicha molécula de ácido nucleico se puede utilizar para determinar el contenido y/o la fuente del producto de consumo. Se puede emplear cualquier método habitual para la detección de moléculas de ácido nucleico, incluyendo los métodos de detección aquí descritos.

Por lo tanto, las plantas, progenie, semillas, células vegetales,, partes de plantas y productos de consumo de la invención son útiles, entre otras cosas, para cultivar plantas con el propósito de producir semillas y/o partes de plantas de MON 87427 para fines agrícolas, producir progenie de MON 87427 para la reproducción asexual de plantas y fines de investigación, el uso con técnicas de microbiología para aplicaciones industriales y de investigación y para la venta a los consumidores.

La invención presenta métodos para combatir malezas utilizando el herbicida glifosato y MON 87427. Se presenta un método para combatir malezas en un campo y consiste en plantar plantas varietales o híbridas MON 87427 en un campo y aplicar una dosis efectiva como herbicida de glifosato al campo con el fin de controlar las malezas en el campo sin dañar las plantas MON 87427. Dicha aplicación del herbicida glifosato puede ser previa a la emergencia, es decir en cualquier momento posterior a la plantación de la semilla MON 87427 y antes de la emergencia de las plantas MON 87427, o post-emergencia, es decir en cualquier momento posterior a la emergencia de las plantas MON 87427. Una dosis efectiva para uso como herbicida de glifosato para usar en el campo a fin de combatir malezas debe consistir en un rango de aproximadamente 0.1 libra por acre a aproximadamente 4 libras de glifosato por acre (0.11 a 4.48 kg/ha) durante una estación de cultivo. Se pueden utilizar múltiples aplicaciones de glifosato en una estación de cultivo, por ejemplo dos aplicaciones (tales como una aplicación de pre-plantación y una aplicación post-emergencia o una aplicación pre-emergencia y una aplicación post-emergencia) o tres aplicaciones (como por ejemplo una aplicación de pre-plantación, una aplicación pre-emergencia y una aplicación post-emergencia).

Se dan a conocer métodos para producir una planta tolerante a los herbicidas con el evento transgénico MON 87427. La progenie producida por estos métodos pueden ser plantas varietales o híbridas, pueden ser cultivadas a partir de semillas producidas por una planta MON 87427 y/o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta MON 87427 y pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Seguidamente la progenie puede ser autopolinizada o sometida a polinización cruzada.

Se puede presentar una planta de maíz que tolere la aplicación del herbicida glifosato cruzando sexualmente una planta MON 87427 que comprende una molécula de ácido nucleico que contiene por lo menos una de las secuencias presentadas como SEQ ID NO: 1-10 con otra planta de maíz para producir así semillas, que luego son recolectadas y cultivadas para obtener plantas de la progenie. A continuación se pueden tratar estas plantas de la progenie con el herbicida glifosato y se puede seleccionar la progenie tolerante al herbicida glifosato. Por otro lado, se pueden analizar estas plantas de la progenie utilizando métodos de diagnóstico para seleccionar las plantas de la progenie que contienen el ADN MON 87427.

Al poner en práctica los métodos de la invención, se puede realizar o facilitar el paso de cruzar sexualmente una planta con otra, es decir, la polinización cruzada, mediante la intervención humana, por ejemplo con las manos humanas, colectando el polen de una planta y poniendo en contacto este polen con los estilos o estigmas de una segunda planta y luego, opcionalmente, previniendo la posterior fertilización de la planta fertilizada; por manos y/o acciones humanas eliminando (por ejemplo, por despanojado), destruyendo (por ejemplo mediante el uso de agentes químicos) o cubriendo los estambres o anteras de una planta de manera de impedir la autopolinización natural de la planta por lo que tendría que producirse la polinización cruzada para que se produzca la fertilización; mediante la colocación humana de insectos polinizantes en una posición adecuada para la "polinización dirigida" (por ejemplo, colocando colmenas en huertas o campos o confinando las plantas en jaulas con insectos polinizantes); mediante la apertura o remoción por humanos de partes de la flor para permitir la colocación o contacto del polen extraño en los estilos o estigmas (por ejemplo en el maíz, que naturalmente tiene flores que obstaculizan o previenen la polinización cruzada, haciendo que sean naturalmente autopolinizantes sin la intervención humana); mediante la colocación selectiva de las plantas en una zona específica (por ejemplo, intencionalmente plantando las plantas en proximidad polinizante) y/o mediante la aplicación de sustancias químicas para precipitar la floración o para promover la receptividad (de los estigmas al polen).

Al poner en práctica los métodos de la invención, se puede llevar a cabo o facilitar el paso de fertilizar sexualmente una planta de maíz mediante autopolinización, es decir, autofertilización, mediante intervención humana, por ejemplo mediante las manos del hombre, recogiendo el polen de una planta y poniendo en contacto este polen con los estilos o estigmas de la misma planta y luego, opcionalmente, impidiendo la posterior fertilización de la planta fertilizada; por manos y/o acciones humanas eliminando (por ejemplo, por despanojado), destruyendo (por ejemplo mediante el uso de agentes químicos) o cubriendo los estambres o anteras de una planta de manera de impedir la autopolinización natural de la planta por lo que tendría que producirse la polinización cruzada para que se produzca la fertilización; mediante la colocación humana de insectos polinizantes en una posición adecuada para la "polinización dirigida" (por ejemplo, colocando colmenas en huertas o campos o confinando las plantas en jaulas con insectos polinizantes); mediante manipulación humana de las partes reproductivas de una planta a fin de permitir o potenciar la autopolinización; mediante la colocación selectiva de las plantas en una zona específica (por ejemplo, intencionalmente plantando las plantas en proximidad polinizante) y/o mediante la aplicación de sustancias químicas para precipitar la floración o para promover la receptividad (de los estigmas al polen) La invención presenta plantas y métodos útiles en la producción de semillas de maíz híbrido.

La planta de maíz tiene partes de floración macho y hembra separadas. La panoja es la estructura masculina y la mazorca es la estructura de floración femenina de la planta. La etapa de floración en el maíz conlleva la diseminación del polen y la formación de filamentos. El polen del maíz puede fertilizar la misma planta (autopolinización) o una planta diferente (polinización cruzada). Si no se eliminan las estructuras masculinas de la planta antes de la diseminación del polen, luego la planta de maíz se autopoliniza en cierto grado. Para la producción de semillas híbridas, se somete a las estructuras femeninas de una primera planta de maíz a polinización cruzada con el polen de una segunda planta de maíz. Por consiguiente, la producción eficiente de semillas híbridas requiere imposibilitar que el polen propio de una planta autofertilice la planta. Los métodos para mejorar la producción de semillas híbridas de maíz aquí presentados comprenden el cultivo en un área de una semilla o planta que comprende MON 87427 y una o más plantas de maíz adicionales. A continuación se tratan las plantas con el evento MON 87427 con glifosato con anterioridad a la formación del polen, tornando así a las plantas con el evento MON 87427 masculino estériles e incapaces de autofertilización. Seguidamente se polinizan las plantas con el evento MON 87427 con polen de la otra (u otras) planta de maíz utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente. La otra (u otras) planta de maíz puede o no ser tolerante al glifosato. A continuación se cosecha la semilla de maiz de las plantas con el evento MON 87427, donde la semilla cosechada de las Plantas MON 87427 tratadas tiene un rendimiento más elevado de semillas de maíz híbrido (es decir, un porcentaje más elevado de semillas híbridas cosechadas o una pureza más alta de semillas híbridas) que las semillas de maíz cosechadas de las Plantas con el evento MON 87427 sin tratamiento de otras plantas de maíz en las mismas condiciones. La semilla de maíz cosechada de las plantas con el evento Mon 87427 sin tratamiento en las mismas condiciones tendrían un porcentaje más elevado de semillas no híbridas (es decir, semillas endogámicas producidas por autopolinización) y, por consiguiente, un rendimiento más bajo de semillas de maíz híbrido.

Las plantas y métodos de la invención se pueden utilizar asimismo con fines de reproducción asexual del maíz por métodos conocidos en la técnica, incluyendo el uso de los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos No. 7,314,970, que se incorpora a la presente como referencia y en la Publicación de Patente No. 20090165166, que se incorpora a la presente como referencia.

Las plantas, la progenie y semillas abarcadas por estos métodos y producidas utilizando estos métodos se diferencian de otras plantas de maíz. Por ejemplo las Plantas MON 87427, su progenie y semillas de acuerdo con la invención son transgénicas y recombinantes y por consiguiente han sido generadas por la intervención humana y contienen una cantidad detectable de una molécula de ácido nucleico que tiene por lo menos una de las secuencias provistas bajo SEQ ID NO: 1-10.

Por lo tanto, los métodos de la invención son útiles para, entre otras cosas, controlar las malezas en un campo mientras se cultivan plantas con el propósito de producir semillas y/o partes de plantas de MON 87427 con fines agrícolas o de investigación, seleccionar la progenie de MON 87427 para 4 la reproducción asexual de plantas o para investigación y producir plantas de la progenie y semillas de MON 87427.

Las plantas, progenie, semillas, células vegetales,, partes de plantas y productos de consumo de la invención pueden ser evaluadas con respecto a la composición del ADN, expresión génica y/o expresión de proteínas. Dicha evaluación se puede realizar empleando métodos standard tales como PCR, transferencia northern, análisis southern, western blot, inmunoprecipitación y ELISA o empleando los métodos para detección y/ o los kits de detección aquí presentados.

Se dan a conocer métodos para detectar la presencia de materiales específicos de MON 87427 en una muestra. Es posible detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de la invención utilizando las sondas y cebadores de la invención con cualquier método de detección de ácido nucleico utilizado en la técnica, como por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o hibridación de ADN. Un método conlleva el contacto de una muestra de ADN con un par de cebadores con capacidad para producir un amplicón del ADN del evento MON 87427, ejecutar una reacción de amplificación y de esa manera producir un amplicón de ADN que comprende por lo menos una de las secuencias de nucleótidos presentadas bajo SEQ ID NO: 1-10 y luego detectar la presencia o ausencia de la molécula del amplicón y, opcionalmente, confirmar dentro de la secuencia del amplicón una secuencia que comprende por lo menos una de las secuencias provistas bajo SEQ ID NO: 1-10. La presencia de ese amplicón es determinante y/o diagnóstica de la presencia del ADN especifico de MON 87427 y, por consiguiente, el material biológico MON 87427 en la muestra. Otro método da lugar al contacto de una muestra de ADN con una sonda de ADN, someter a la sonda y la muestra de ADN a condiciones de hibridación rigurosas y luego detectar la hibridación entre la sonda y la muestra de ADN objetivo. La detección de la hibridación es diagnóstico de la presencia del ADN especifico de MON 87427 en la muestra de ADN. La amplificación de ácidos nucleicos, la hibridación de ácidos nucleicos y la secuenciación de ADN se pueden realizar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Una técnica ilustrativa ventajosa en la práctica de la presente invención es TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

La secuencia del inserto de ADN heterólogo, las secuencias de empalme o las secuencias flanqueantes de MON 87427 (cuyas muestras de semillas representativas han sido depositadas bajo el código ATCC PTA-7899) pueden ser verificadas (y corregidas en caso de ser necesaria) mediante la amplificación- de dichas secuencias del evento utilizando cebadores derivados de las secuencias provistas en la presente, seguidas por secuenciación del ADN del amplicón o del ADN clonado.

Se presentan kits de detección de ADN. También se pueden desarrollar variaciones de esos kits empleando las composiciones y métodos descritos en la presente y los métodos muy conocidos en la técnica de detección de ADN. Los kits de detección de ADN son ventajosos para la identificación del ADN de MON 87427 en una muestra y se los puede aplicar a métodos para la reproducción de plantas de maíz que contienen el ADN MON 87427. Los kits pueden contener cebadores o sondas de ADN que son similares o complementarios de SEQ ID NO: 1-10 o fragmentos de los mismos.

Los kits y métodos de detección de la invención son útiles, por lo tanto, entre otras cosas, para identificar MON 87427, seleccionar variedades de plantas o híbridos que comprenden MON 87427, detectar la presencia de ADN derivada del transgénico MON 87427 en una muestra y monitorear las muestras para determinar la presencia y/o ausencia de MON 87427 o partes de plantas derivadas de MON 87427.

La invención presenta una Escala de Desarrollo Relativo que sirve para monitorear y/o determinar el desarrollo reproductivo en el maíz. Esta novedosa Escala de Desarrollo Relativo resuelve las diferencias de maduración del desarrollo y reproductivo en las diversas variedades de maíz y endogámicas produciendo una escala temporal que expresa las etapas de desarrollo de las panojas con respecto a las etapas relativas de floración. La Escala de Desarrollo Relativo reduce las diferencias observadas del desarrollo de las panojas y el crecimiento de las panojas en todos lo genotipos. El desarrollo de las panojas en las diversas etapas de maduración está ilustrado en la figura 3.

Con frecuencia se determina el desarrollo del maíz mediante una escala de etapas basada en eventos vegetativos, comúnmente conocidas como Etapas V. Estas etapas se definen de acuerdo con la hoja de posición más elevada en la cual se visualiza el cuello de la hoja. VE corresponde a la emergencia, V1 corresponde a la primera hoja, V2 corresponde a la segunda hoja, V3 corresponde a la tercera hoja, V(n) corresponde a la enésima hoja. VT tiene lugar cuando la última rama de panojas es visible pero antes de la emergencia de los filamentos. Cuando se establecen las etapas de un campo de maíz, cada etapa V específica se define sólo cuando 50 por ciento o más de las plantas del campo están en esa etapa o la superan. Sin embargo, el uso de esta escala vegetativa para determinar la madurez reproductiva puede ser complicado por el hecho de que el desarrollo vegetativo no se correlaciona necesariamente con el desarrollo reproductivo en todos los genotipos. Además, no todas las endogámicas se diferencian en el mismo número de hojas, los inspectores no siempre son coherentes en su evaluación y las primeras hojas en diferenciarse comienzan a envejecer bastante prematuramente en la estación por lo que, si no se marcan correctamente las hojas durante las primeras etapas, se torna muy difícil identificar correctamente las etapas V más adelante.

Otra herramienta común para predecir y estimar las etapas de crecimiento y desarrollo del maíz son las Unidades de Grado de Crecimiento (GDU). Un factor en el crecimiento y desarrollo del maíz es el calor. El calor se mide por lo general en un solo punto de tiempo y se expresa en términos de temperatura, aunque también se puede medir en el curso de un periodo de tiempo y se expresa en unidades térmicas. Estas unidades térmicas se denominan comúnmente GDU. Las GDU se pueden definir como la diferencia entre la temperatura media diaria y una temperatura seleccionada sujeta a ciertas restricciones. Las GDU se calculan empleando la siguiente ecuación: Unidad de Grados de Crecimiento = { (H + L ) / 2 } - B donde H es la máxima diaria (aunque no superior a 86° F (30°C)), L es la mínima diaria (aunque no inferior a 50° F (10°C) y B es la base de 50° F (10°C). Dado que el crecimiento del maíz es ínfimo cuando las temperaturas son superiores a 86° F (30°C) o inferiores a 50° F (10°C), se fijan límites de las temperaturas diarias máximas y mínimas empleadas en la fórmula. El corte mínimo de temperatura diaria también impide el cálculo de valores negativos. Por lo tanto, si la temperatura máxima diaria es superior a 86° F (30°C), se establecería una temperatura diaria máxima empleada en la fórmula de GDU de 86° F (30°C). A la inversa, si la temperatura mínima diaria cae a menos de 50° F (10°C), se establecería una temperatura diaria mínima utilizada en la fórmula de GDU de 50° F (10°C). Si la temperatura máxima diaria no es superior a 50° F (30°C), luego no se registran GDU correspondientes a ese día. El máximo de GDU que puede acumular una planta de maíz en un día es 36, el mínimo es cero. La madurez de una planta de maíz se identifica por la suma de los valores diarios de GDU en durante un período de tiempo determinado. El período de tiempo que utiliza la mayoría de los productores de semillas de maíz es desde el momento de la plantación a la madurez fisiológica o hasta el punto en el cual el llenado del grano se ha completado virtualmente. En la mayoría de los estados de Estados Unidos, se mantienen las GDU acumuladas correspondientes a la mayor parte de las zonas geográficas y se las puede obtener en el USDA Crop Reporting Service (Servicio de Informes sobre Cultivos del USDA (departamento de agricultura de los Estados Unidos) o en los Servicios de Extensión Estatales. Además, también se describe un instrumento para obtener información sobre GDU en un punto determinado en la Patente de Estados Unidos No. 6,967,656, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Como ocurre con las etapas V, las mediciones de GDU pueden variar considerablemente con respecto a la etapa de desarrollo de las panojas entre los genotipos y puede no ser un indicador confiable del desarrollo de las panojas.

En el presente contexto, se define una "Escala de Desarrollo Relativo" como escala que se genera dividiendo las GDU en una etapa de desarrollo de las panojas dada por las GDU necesarias para obtener una etapa especifica de diseminación del polen. A continuación se traza una linea de regresión con esta información por cada genotipo o variedad endogámica. Se puede construir una Escala de Desarrollo Relativo utilizando los métodos descritos en este documento y se basa en la correlación entre los requisitos de GDU necesarios para obtener una determinada etapa de desarrollo de las flores del maíz con respecto a una etapa dada de desarrollo de las panojas. Por tal motivo, una Escala de Desarrollo Relativo es provechosa para predecir el desarrollo de las panojas del maíz en diversos genotipos y variedades endogámicas y se la puede utilizar como alternativa del uso de Etapas V o GDU en métodos de reproducción asexual de plantas y agrícolas.

En el presente contexto, "la etapa de desarrollo de las flores" se define de acuerdo el grado en el cual una población de plantas está soltando polen, a la que se hace referencia como etapa P. La etapa de desarrollo de las flores se expresa en términos de Px, donde P representa "polen" y "x" indica el porcentaje de plantas dentro de una población que está diseminando polen. La Escala de Desarrollo Relativo de la invención se basa en una regresión derivada dividiendo las GDU en una determinada etapa de desarrollo de las panojas por el número de GDUs necesario para obtener una etapa específica de diseminación de polen. Esto se expresa de la siguiente manera: Escala de Desarrollo Relativo = (GDU para Tn/ GDU para Px) donde "GDU para Tn" es la cantidad de GDU (unidades de grado de desarrollo) necesarias para alcanzar una determinada etapa de desarrollo de las panojas donde n podría estar en el rango de 0 a 7 y donde "GDU para Px" es la cantidad de GDU necesarias para alcanzar una determinada etapa de desarrollo de las flores o la Etapa P, donde x puede estar en el rango de 0 a 100 (un ejemplo de esto es P50 que se define como 50% de las plantas del campo que han comenzado a diseminar el polen).

La regresión se puede basar en la relación correlativa entre cualquier etapa de desarrollo de las panojas y la etapa de desarrollo de las flores o requisitos de GDU para la Etapa P. dicha relación correlativa se expresa dividiendo las GDU necesarias para alcanzar una etapa de desarrollo de las panojas especificada por las GDU necesarias para alcanzar una etapa de desarrollo específica de las flores o Etapa P. En una realización de la invención, la etapa de desarrollo de las flores o Etapa P para la regresión es P50, donde 50% de una población de las plantas de maíz está diseminando polen. En otra realización, la etapa de desarrollo de las flores o Etapa P de diseminación de polen para el cálculo de la regresión puede ser de 1% a 100%, incluyendo aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99%. La etapa de desarrollo de las panojas para la regresión puede ser entre T0 y T7, como por ejemplo T0, T1, T2, T3, T4, T5, T6 y T7. Independientemente de la etapa de desarrollo de las panojas y la etapa de desarrollo de las flores elegidas para crear la regresión, se puede derivar una Escala de Desarrollo Relativo trazando la relación de las GDUs necesarias para alcanzar un etapa específica de diseminación de polen con respecto al número de GDUs requerido para alcanzar una etapa dada de desarrollo de las panojas. Este aspecto está ilustrado en la figura 5.

En el presente contexto, el término "determinar" se refiere al acto de medir, calcular, evaluar, estimar, monitorear y/o predecir. Por ejemplo, "la determinación del desarrollo de las panojas" en el presente contexto incluye la medición de la etapa actual de desarrollo de las panojas, el monitoreo del progreso del desarrollo de las panojas y/o la predicción del advenimiento de una etapa futura de desarrollo de las panojas.

La invención presenta, por lo tanto, un método para producir una Escala de Desarrollo Relativo que comprende medir las Unidades de Grado de Crecimiento necesarios para que una población de plantas de maíz madure hasta una etapa específica de desarrollo de las panojas; medir las Unidades de Grado de Crecimiento necesarios para que una población de plantas de maíz madure hasta una etapa específica de desarrollo de las flores y generar una línea de regresión dividiendo dichas Unidades de Grado de Crecimiento medidas necesarias para que dicha población de plantas de maíz madure hasta dicha etapa específica de desarrollo de las panojas por dichas Unidades de Grado de Crecimiento para que dicha población de plantas de maíz madure hasta dicha etapa especifica de desarrollo de las flores. El paso de medición se puede repetir con respecto a por lo menos dos poblaciones de plantas de maíz. El paso de medición e puede repetir con respecto a múltiples etapas de desarrollo de las panojas y/o múltiples etapas de desarrollo de las flores. La etapa específica de desarrollo de las flores puede ser la diseminación de polen correspondiente a 50 por ciento de la población de plantas de maíz.

La invención presenta asimismo un método para determinar el rango óptimo dentro de la Escala de Desarrollo Relativo para un régimen de tratamiento ligado al desarrollo de las panojas, para permitir así determinar el momento óptimo de un régimen de tratamiento en el cual la etapa de desarrollo es un factor importante. Un ejemplo de esto es la aplicación de un solo plan de tratamiento común con agentes químicos para la máxima eficacia en causar la esterilidad de las panojas de maíz en todos los diversos genotipos parentales en la producción de semillas híbridas de maíz, independientemente del genotipo o del grupo de madurez.

En el presente contexto, el término "semilla híbrida" es semilla producida mediante la polinización cruzada de dos plantas. Las plantas cultivadas a partir de semillas híbridas pueden tener características agrícolas mejoradas tales como rendimiento, uniformidad y/o resistencia a las enfermedades. La semilla híbrida no necesariamente puede ser cierta, es decir que la semilla producida mediante la autofertilización de una planta híbrida (la planta cultivada a partir de una semilla híbrida) no da origen de manera segura en la siguiente generación a una planta híbrida idéntica. Por lo tanto, se deben producir nuevas semillas híbridas a partir de líneas de plantas parentales para cada plantación. Como la mayoría de las plantas de cultivo tienen tanto órganos femeninos como masculinos, sólo se puede producir unas emilla híbrida impidiendo la autopolinización de la progenitora femenina y permitiendo o facilitando la polinización con el polen pretendido. Hay una variedad de métodos para impedir la autopolinización de la progenitora femenina; un método por el cual se impide la autopolinización es la remoción mecánica del órgano productor de polen antes de la diseminación del polen. La producción de semilla de maíz híbrido comercial (maíz, Zea mays) conlleva por lo general plantar las lineas parentales masculinas y femeninas pretendidas, habitualmente en hileras o bloques separados o en campos aislados, tratar la planta progenitora femenina para impedir la diseminación de polen, garantizar la polinización de la hembra sólo por el progenitor macho indicado y cosechar la semilla híbrida sólo de la progenitora femenina. La semilla híbrida puede ser el resultado de una única cruza (por ejemplo, una cruza de primera generación entre dos líneas endogámicas), una cruza única modificada (por ejemplo, una cruza de primera generación entre dos líneas endogámicas, una de las cuales puede haber sido ligeramente modificada mediante el uso de cruzas estrechamente relacionadas) una cruza doble (por ejemplo una cruza de primera generación entre dos cruzas individuales), una cruza triple, (por ejemplo, una cruza de primera generación entre una cruza única y una línea endogámica), una cruza superior (por ejemplo, la primera generación de una cruza entre una línea endogámica y una variedad con polinización abierta, o la primera generación de una cruza entre una cruza única y una variedad con polinización abierta) o una variedad con polinización abierta (por ejemplo, una población de plantas seleccionadas con respecto a un standard que exhibe variación pero que tiene características que diferencien a una variedad de las demás variedades).

En la producción de semillas híbridas, se puede prevenir la producción de polen y/o su diseminación en una planta progenitora femenina a fin de facilitar la polinización de la hembra sólo por el progenitor macho indicado y de esa manera producir semilla híbrida. Dicha prevención se puede obtener por cualquier método o medio conocido en la técnica, incluyendo, aunque no a título de limitación, el despanojado manual o a mano, el despanojado mecánico, el uso de un medio genético de control de la polinización y/o el uso de un agente químico. Cualquiera de estos se puede combinar o utilizar individualmente. El despanojado se puede realizar manualmente o a mano y por lo general lo realiza una persona que separa las panojas de una planta de maíz, habitualmente tirando de la panoja hasta separarla. El despanojado mecánico o a máquina utiliza por lo general una máquina despanojadora denominada "cortadora" que se desplaza a través de las hileras de maíz y corta la porción superior de la planta. A continuación una máquina "extractora" se desplaza por los surcos de maíz unos días más tarde y separa las panojas de la planta atrapándola entre dos rodillos que se mueven a gran velocidad. Las despanojadoras mecánicas útiles para llevar a la práctica los métodos de la invención incluyen las montadas en máquinas de gran altura. La cortadora puede consistir en una hoja o cuchilla rotatoria que opera en diversos planos de la horizontal a la vertical, de altura ajustable, para cortar o cercenar la parte superior de la planta de maíz que incluye la panoja. La extractora puede consistir en dos pequeñas ruedas o rodillos de altura ajustable, que giran en direcciones opuestas y aterran la panoja y las hojas superiores, tirando de ellas en dirección ascendente de manera comparable a una operación de despanojado manual. Las cortadoras y extractoras se pueden utilizar por separado o juntas y/o en combinación con otros métodos de despanojado. La ventana de tiempo para el despanojado es habitualmente el período más crítico y difícil de controlar en la producción de semillas híbridas de maíz. En la técnica, también se utilizan agentes químicos y/o medios genéticos para impedir la formación de polen viable o la diseminación del polen.

La invención presenta un método para determinar el momento del desarrollo de las panojas seleccionando un rango en una Escala de Desarrollo Relativo, en la cual el rango elegido indica la maduración a una etapa de desarrollo pretendida de las panojas. La etapa de desarrollo pretendida de las panojas es de la etapa TO a la T7, por ejemplo, la etapa T5. Las etapas de desarrollo de las panojas de particular interés son la etapa de desarrollo óptimo de las panojas para la cruza reproductiva, la etapa de desarrollo óptimo de las panojas para la esterilización de las panojas y/o la etapa de desarrollo óptimo de las panojas para la administración de un tratamiento modulador del desarrollo a una planta de maíz. En la construcción y uso de una Escala de Desarrollo Relativo, la etapa de desarrollo específica de las flores usada para construir la Escala de Desarrollo Relativo puede ser en la diseminación del polen correspondiente a aproximadamente 50 por ciento de una población de plantas de maíz. Un rango ilustrativo de la Escala de Desarrollo Relativo provechoso para el método de la invención es de aproximadamente 0.62 a aproximadamente 0.75 en una Escala de Desarrollo Relativo.

Las determinaciones de la situación de desarrollo de las panojas puede ser útil para métodos agrícolas que implican la planificación y/o normalización de prácticas que son específicamente para el desarrollo de las plantas. Los ejemplos de esto incluyen: métodos que requieren la aplicación oportuna de un agente químico, tales como la aplicación de un herbicida, fungicida, fertilizante y/o endogámicas reguladoras del crecimiento con madureces contrastantes; métodos que requieren el monitoreo, predicción y/o regulación del desarrollo de las panojas, como por ejemplo el monitoreo de las endogámicas masculinas para un desarrollo precoz de las panojas, que puede dar lugar a una menor diseminación del polen y ofrecer un tratamiento apropiado para afectar el desarrollo de las panojas; métodos que requieren la aplicación oportuna de una hormona y/o regulador del crecimiento para corregir un desequilibrio y/o para producir un resultado agrícola pretendido y/o cualquier método que requiera la administración de un tratamiento modulador del desarrollo a una planta de maíz en dicha etapa de desarrollo pretendida de las panojas. La invención se puede utilizar en trabajos de planificación y/o investigación de campos, como por ejemplo en la predicción de los requerimientos de trabajo asociados con el despanojado o el desarrollo de las plantas, para predecir los requerimientos ligados al desarrollo de las panojas; para determinar de qué manera el estrés afecta el desarrollo de las panojas y/o para usar en la clasificación y evaluación de los rasgos y/o endogámicas o híbridas imponiendo estrés en una o más etapas específicas de desarrollo que se determinan prediciendo la etapa de desarrollo de las panojas.

La invención presenta métodos útiles para determinar en qué momento un tratamiento modulador del desarrollo es óptimamente eficaz utilizando la Escala de Desarrollo Relativo. En el presente contexto, el término "tratamiento modulador del desarrollo" se refiere a la administración de por lo menos un tratamiento físico y/o químico que afecte el desarrollo de una planta. El desarrollo de una planta incluye, aunque no a título de limitación, el desarrollo de las flores, el desarrollo de las raíces, el desarrollo de las hojas, el desarrollo de los tallos, el desarrollo de las panojas, el desarrollo reproductivo, el desarrollo de los gametos, el desarrollo del polen, el desarrollo de las semillas y/o el desarrollo de cualquier otra parte. El tratamiento modulador puede hacer que el desarrollo se detenga, retarde, impida, retarde o potencie. Un tratamiento modulador del desarrollo puede consistir en un tratamiento físico tal como el despanojado, el flameado (uso de un soplete llama para achicharrar las partes superiores de las plantas masculinas como medio para retardar la maduración) y/o la abrasión, fricción, raspado, corte, perforación, ultrasonido, desprendimiento, remoción, trituración, recorte y/o cobertura de cualquier parte de la planta. Un tratamiento modulador del desarrollo puede ser un agente químico tal como compuestos naturales o compuestos sintéticos. Los agentes químicos que pueden ser de utilidad como tratamiento modulador del desarrollo incluyen reguladores del crecimiento de las plantas, inhibidores del crecimiento de las plantas, hormonas vegetales, inhibidores de las hormonas vegetales, estimuladores del crecimiento de las plantas, retardadores del crecimiento de las plantas, fungicidas, insecticidas, herbicidas, auxinas, antiauxinas, citoquininas, defoliantes, inhibidores del etileno, liberadores de etileno, gibberelinas, morfactinas y gametocidas. Un tratamiento físico ejemplificativo para usar en los métodos de la invención es el despanojado y/o el flameado. Un agente químico ilustrativo para usar en los métodos de la invención es el herbicida glifosato. El tratamiento modulador del desarrollo se puede aplicar a una planta de maíz en cualquier etapa, por ejemplo cuando la etapa de desarrollo de las panojas corresponde al rango de 0.62 y 0.75 de la Escala de Desarrollo Relativo, que incluye la etapa de desarrollo de las panojas de T5. La capacidad para identificar el período óptimo eficaz para la aplicación de un tratamiento modulador del desarrollo de las panojas utilizando la Escala de Desarrollo Relativo provisto constituye un aspecto de la invención. Muchos tratamientos moduladores del desarrollo de las panojas, incluyendo agentes químicos con capacidad para impedir el desarrollo del polen o impedir la diseminación del polen, son conocidos en la técnica y serían provechosos al poner en práctica los métodos de la invención.

La invención se puede utilizar para producir semilla híbrida empleando los métodos de la invención. La invención presenta métodos por los cuales se cruza una primera planta de maíz progenitora con una segunda planta de maíz progenitora, donde se inhibe la producción de polen de la primera planta progenitora de maíz mediante la aplicación de un tratamiento modulador del desarrollo. Los métodos de la invención se pueden emplear para determinar una etapa de desarrollo y/o el momento adecuado para la aplicación del tratamiento modulador del desarrollo para que tenga eficacia óptima. La invención puede resultar de particular utilidad en los métodos dados a conocer en la Patente de E.E.U.U. No. 6,762,344 y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2009/0165166. En una realización, la invención es una a semilla híbrida producida mediante el uso de los métodos de la invención, incluyendo plantas y partes de plantas cultivadas a partir de la semilla híbrida y productos de consumo producidos a partir de ellas.

La invención presenta un método para usar plantas con el evento transgénico MON 87427 para la producción de semillas híbridas, donde se utiliza glifosato como tratamiento modulador del desarrollo de las panojas en las Plantas MON 87427 para impedir la formación de polen. Esto se basa en la capacidad para impedir la diseminación del polen en líneas parentales femeninas que comprenden MON 87427 mediante la aplicación oportuna de glifosato, impidiendo así que se produzca la autopolinización. Si se aplica el glifosato con demasiada anterioridad con respecto al desarrollo de las panojas, los cuerpos reproductivos masculinos pueden no tener el desarrollo suficiente para que el tratamiento sea totalmente eficaz. Si se aplica demasiado tarde con respecto al desarrollo de las panojas, ya se puede estar produciendo la extrusión de las anteras y es posible que el tratamiento con glifosato no pueda prevenir el desarrollo del polen. Por consiguiente, la ocasión de la aplicación del glifosato con respecto al desarrollo de las panojas es importante para garantizar una eficacia máxima y, por lo tanto, una pureza máxima de las semillas híbridas producidas. En una realización, el momento óptimo para la aplicación de glifosato para este método puede ser identificado determinando el estado de desarrollo de las panojas de las Plantas MON 87427 empleando una Escala de Desarrollo Relativo and seleccionando un rango de la Escala de Desarrollo Relativo que indique la maduración a una etapa de desarrollo pretendida de las panojas. Se puede utilizar esta determinación del estado de desarrollo de las panojas para identificar el momento indicado para la administración de glifosato como tratamiento modulador del desarrollo a una planta MON 87427, impidiendo así la autofertilización y potenciando la producción de semillas híbridas. Los métodos de la invención revelan que el desarrollo de las panojas en el rango de 0.62 y 0.75 de la Escala de Desarrollo Relativo, o T5, es el rango óptimo para la aplicación de glifosato a las Plantas MON 87427 con el fin de impedir la formación de polen. Por lo tanto, en la técnica de Hibridación Roundup®, por cualquier linea parental femenina de cualquier grupo de madurez dado, se predice el momento óptimo multiplicando las GDU necesarias para obtener P50 para esa línea parental femenina por cualquier valor dentro de ese rango. Cuando el resultado de ese cálculo es equivalente a las GDU de esa estación de cultivo, se ha alcanzado el momento óptimo para la aplicación de glifosato. Se pueden producir Escalas de Desarrollo Relativo empleando otros signos distintivos de la diseminación del polen y signos distintivos de Escalas T que son de similar utilidad, sin apartarse del alcance de la invención.

Otro aspecto adicional de la invención presenta un método que es de utilidad para determinar la etapa de desarrollo de las panojas en la cual la cruza reproductiva es óptima. Al igual que la forma en que las diferencias de desarrollo entre los genotipos impide la predicción confiable de los tratamientos moduladores óptimos basados en las Etapas V o las GDU solas, el momento de la polinización cruzada también se puede beneficiar por la Escala de Desarrollo Relativo. Un estudio sencillo que utiliza la Escala de Desarrollo Relativo puede revelar que la polinización cruzada es óptima dentro de un determinado rango de esa escala. Una vez más, conociendo las GDU necesarias para el P50 de un determinado genotipo ha de ser posible señalar con precisión cuándo se alcanza ese rango sin confiar en signos vegetativos inciertos, o realizar evaluaciones físicas trabajosas del desarrollo de las panojas. Se pueden encontrar descripciones de los métodos de reproducción que se utilizan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos en uno de varios textos de referencia (Allard, "Principies of Plant Breeding," John Wiley & Sons, NY, U. de CA, Davis, CA, 50-98, 1960; Simmonds, "Principies of crop improvement," Longman, Inc., NY, 369-399, 1979; Sneep y Hendriksen, "Plant breeding perspectives," Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation, 1979; Fehr, en: Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2a Edición, Manograph., 16:249, 1987; Fehr, "Principies of variety development," Theory and Technique, (Vol 1) y Crop Species Soybean (Vol 2), lo a State Univ., Macmillian Pub. Co., NY, 360-376, 1987).

Al poner en práctica los métodos de la invención, una o ambas plantas progenitoras de maíz pueden comprender uno o más rasgos convenientes de interés agronómico. Por ejemplo, se puede utilizar una planta progenitora de maíz MON 87427 en la producción de semillas híbridas para la reproducción asexual con una segunda planta progenitora de maíz que comprende por lo menos un gen y/o rasgo de interés agronómico. En esta realización, se puede utilizar la Escala de Desarrollo Relativo para monitorear y/o determinar la etapa de desarrollo reproductivo de la planta de maíz progenitora MON 87427 para determinar con precisión el momento del tratamiento de la planta de maíz progenitora MON 87427 con glifosato con anterioridad a la formación del polen, para prevenir así la autofertilización. Las plantas con el evento MON 87427 serian polinizadas posteriormente por la segunda planta progenitora de maíz y se cosecharía la semilla híbrida de maíz de las plantas con el evento MON 87427, donde la semilla cosechada de las Plantas MON 87427 tratadas tiene un rendimiento más alto de semillas híbridas de maíz (es decir, se cosecha un porcentaje más alto de semillas híbridas o semillas híbridas con una pureza más elevada) que las semillas de maíz cosechadas de plantas con el evento MON 87427 sin tratamiento o con un tratamiento administrado fuera de tiempo o de una o más plantas de maíz en las mismas condiciones.

Los rasgos y genes de interés agronómico son muy conocidos en la técnica e incluyen, aunque no a título de limitación, por ejemplo los de resistencia a los herbicidas, esterilidad masculina, rendimiento incrementado, control de insectos, resistencia a las enfermedades fúngicas, resistencia a los virus, resistencia a los nematodos, resistencia a las enfermedades bacterianas, crecimiento y desarrollo de la planta, producción de almidón, producción de aceite modificada y/o elevada, contenido modificado de ácido graso (o ácidos grasos), alta producción proteica, maduración de los frutos, nutrición animal y/o humana incrementada, biopolímeros, stress ambienta, péptidos farmacéuticas y péptidos secretables, rasgos de procesamiento mejorados, digestibilidad mejorada, baja raffinosa, producción de enzimas industriales, sabor mejorado, fijación de nitrógeno, producción de semillas híbridas, producción de fibra y/o producción de biocombustibles. Los ejemplos de plantas con uno o más rasgos ventajosos son los registrados en el Servicio de Inspecciones de Salud Animal y Vegetal del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (United States Department of Agriculture Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS)) para tolerancia a los herbicidas (por ejemplo, los eventos del maíz MON 88017, NK603, DAS-68416- , HCEM485, DP-098140-6, DP-356043-5, MIR604, 59122, TC-6275, Línea 1507, MON 802, T 4, y/o T25), control de insectos (por ejemplo, los eventos del maíz MON 863, MON 809, MON 810, MON 89034, MON 88017, MON 802, MIR-162, TC-6275, DBT418, B16, TC-1507, DAS 59122-7, MIR604, y/o MON 80100), y/u otros rasgos convenientes (por ejemplo, los eventos del maíz LY038, MON 87460, y/o 3272) (Se puede obtener una lista completa y descripción de dichos rasgos en el sitio web del gobierno de los Estados Unidos http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html).

Al poner en práctica los métodos de la invención, se puede utilizar una endogámica, variedad o híbrida o cualquier otro genotipo. Por ejemplo, una endogámica de élite es una línea de plantas de maíz que es el resultado de la reproducción y selección para obtener una eficiencia agronómica superior. Los genotipos se pueden transformar y/o utilizar en métodos de reproducción de manera que comprendan un gen de interés agronómico tal como la tolerancia al glifosato y se pueden seleccionar eventos para su adecuación como progenitor femenino o masculino en un sistema de producción de semillas híbridas.

Los genotipos de élite del maíz para usar en la práctica de la invención, incluyen, aunque no a titulo de limitación, CI9805 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20030093826); LH321 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20030106086); HOI002 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20030154524); HOI001 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20030172416), 5750 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20030177541); G0502 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20030177543); G1102 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20030177544); HX879 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040068771); 6803 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040088767); 5020 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040088768); G3001 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040098768); LH268 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040111770); LH311 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040111771); LH306 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040111772); LH351 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040 11773); LHE323 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040111774); 402A (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040123352); 366C (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040 39491); NP2315 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040143866); PHOGC (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20040194170); SE8505 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050015834); D201 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050028236); BE1146BMR (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050076402); PHCAM (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050114944); PHCK5 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050114945); PHC77 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050114951); PHCND (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050114952); PHCMV (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050114953); PHB00 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050114955); PHCER (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050114956); PHCJP (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050120437); PHADA (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050120439); PHB8V (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050120443); 6XN442 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050125864); 4XP811 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050125865); PHCCW (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050125866); MN7224 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050132433); BE9514 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050132449); PHCA5 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050138697); PHCPR (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050144687); PHAR1 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050144688); PHACV (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050144689); PHEHG (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050144690); NP2391 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050160487); PH8WD (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050172367); D501 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050177894); D601 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050177896); D603 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050177904); PHCEG (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050223443); W16090 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050273876); M10138 (Publicación de Patente de E.E.U.U.

No. 20050273877); N61060 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20050273878); NP2460 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060048243); BS112 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060070146); PHDWA (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107393); PH8JV (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107394); PHEWW (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107398); PHEDR (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107399); PHE67 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107400); PHE72 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107408); PHF1J (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107410); PHE35 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107412); PHEHR (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107415); PHDPP (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107416); PHEHC (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107418); PHANF (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107419); PHC78 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107420); PH8T0 (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107421); PHDRW (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107422); PHEGV (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 4 20060107423); PHEBA (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060107426); PHENE (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060112463); PHEJW (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060112464); PHAPT (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060112465); PHCND (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060130188); PHCEG (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060130189); PHADA (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060130190); PHEED (Publicación de Patente de E.E.U.U. No. 20060143744); PHHB (Patente de E.E.U.U. No. 5,633,427); LH262 (Patente de E.E.U.U. No. 5,633,428); LH227 (Patente de E.E.U.U. No. 5,633,429); LH226 (Patente de E.E.U.U. No. 5,639,941); LH235 (Patente de E.E.U.U. No. 5,639,942); LH234 (Patente de E.E.U.U. No. 5,639,943); PHDPO (Patente de E.E.U.U. No. 5,639,946); PH06N (Patente de E.E.U.U. No. 5,675,066); LH177 (Patente de E.E.U.U. No. 5,684,227); PH24E (Patente de E.E.U.U. No. 5,689,034); PHP38 (Patente de E.E.U.U. No. 5,708,189); ASG06 (Patente de E.E.U.U. No. 5,714,67.1); CG00685 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,721); PHND1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,722); PH44A (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,723); ZS01591 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,724); ZSO1 101 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,725); ZS01452 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,726); ZS01429 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,727); ZS01819 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,728); ZS01250 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,729); ZS01595 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,730); CG3ND97 (Patente de E.E.U.U. No. 5,728,923); NP938(934) (Patente de E.E.U.U. No. 5,728,924); PHNG2 (Patente de E.E.U.U. No. 5,731 ,491); CG5NA58 (Patente de E.E.U.U.

No. 5,731,502); NP948 (Patente de E.E.U.U. No. 5,731 ,503); LH236 (Patente de E.E.U.U. No. 5,731 ,504); CG00766 (Patente de E.E.U.U. No. 5,731 ,506); PHOAA (Patente de E.E.U.U. No. 5,750,829); PH15A (Patente de E.E.U.U. No. 5,750,830); PH25A (Patente de E.E.U.U. No. 5,750,831); PH44G (Patente de E.E.U.U. No. 5,750,832); PH0CD (Patente de E.E.U.U. No. 6,084,160); ASG25 (Patente de E.E.U.U. No. 6,084,161); 86ISI15 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,084,162); BE4547 (Patente de E.E.U.U. No. 6,084,163); PH21T (Patente de E.E.U.U. No. 6,091 ,007); 01 DHD16 (Patente de E.E.U.U. No. 6,096,952); PH224 (Patente de E.E.U.U. No. 6,096,953); ASG26 (Patente de E.E.U.U. No. 6,103,958); ASG28 (Patente de E.E.U.U. No. 6,103,959); PHOVO (Patente de E.E.U.U. No. 6,107,550); 90LCL6 (Patente de E.E.U.U. No. 6,1 11 ,171); 22DHD11 (Patente de E.E.U.U: No. 6,111 ,172); ASG17 (Patente de E.E.U.U. No. 6,114,606); AR5253bm3 (Patente de E.E.U.U. No. 6,1 4,609); ASG27 (Patente de E.E.U.U. No. 6,1 14,610); WDHQ2 (Patente de E.E.U.U. No. 6,114,61 1); PH3GR (Patente de E.E.U.U. No. 6,114,613); PH1 NF (Patente de E.E.U.U. No. 6,1 18,051); PHOJG (Patente de E.E.U.U.

No. 6,118,053); PH189 (Patente de E.E.U.U. No. 6,118,054); PH12J (Patente de E.E.U.U. No. 6,1 18,055); PH1 EM (Patente de E.E.U.U. No. 6,118,056); 90DJD28 (Patente de E.E.U.U. No. 6,121 ,519); PH12C (Patente de E.E.U.U.

No. 6,121 ,520); PH55C (Patente de E.E.U.U. No. 6,121 ,522); PH3EV (Patente de E.E.U.U. No. 6,121 ,523); ZS4199 (Patente de E.E.U.U. No. 6,121 ,525); PH2V7 (Patente de E.E.U.U. No. 6,124,529); PH4TF (Patente de E.E.U.U. No. 6,124,530); PH3KP (Patente de E.E.U.U. No. 6,124,531); PH2MW (Patente de E.E.U.U. No. 6,124,532); PH2N0 (Patente de E.E.U.U. No. 6,124,533); PH1 K2 (Patente de E.E.U.U. No. 6,124,534); PH226 (Patente de E.E.U.U. No. 6,124,535); PH2VJ (Patente de E.E.U.U. No. 6,127,609); PH1 M8 (Patente de E.E.U.U. No. 6,127,610); WQCD10 (Patente de E.E.U.U. No. 6,130,369); PH1 B8 (Patente de E.E.U.U. No. 6,130,370); 17DHD5 (Patente de E.E.U.U. No. 6,133,512); PH0WD (Patente de E.E.U.U. No. 6,133,513); PH3GK (Patente de E.E.U.U. No. 6,133,514); PH2VK (Patente de E.E.U.U. No. 6,137,036); PH1MD (Patente de E.E.U.U. No. 6,137,037); SM4603 (Patente de E.E.U.U. No. 6,137,038); PH04G (Patente de E.E.U.U. No. 6,140,562); NP2151 (Patente de E.E.U.U. No. 6,140,563); PH5DR (Patente de E.E.U.U. No. 6,727,413); LH254 (Patente de E.E.U.U. No. 6,730,833); PH5WB (Patente de E.E.U.U. No. 6,730,834); PH7CH (Patente de E.E.U.U. No. 6,730,835); PH54M (Patente de E.E.U.U. No. 6,730,836); PH726 (Patente de E.E.U.U. No. 6,730,837); PH48V (Patente de E.E.U.U. No. 6,734,348); PH3PV (Patente de E.E.U.U. No. 6,737,566); PH77V (Patente de E.E.U.U. No. 6,740,795); PH7JB (Patente de E.E.U.U. No. 6,740,796); NP2316 (Patente de E.E.U.U. No. 6,740,797); PH70R (Patente de E.E.U.U. No. 6,740,798); RAA1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,747,194); VMM1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,747,195); PH3RC (Patente de E.E.U.U. No. 6,747,196); MNI1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,753,465); 5750 (Patente de E.E.U.U. No. 6,756,527); PH6KW (Patente de E.E.U.U. No. 6,756,528); PH951 (Patente de E.E.U.U. No. 6,756,530); PH6ME (Patente de E.E.U.U. No. 6,759,578); NP2171 (Patente de E.E.U.U. No. 6,759,579); PH87H (Patente de E.E.U.U. No. 6,759,580); PH26N (Patente de E.E.U.U. No. 6,765,132); RII1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,765,133); PH9AH (Patente de E.E.U.U. No. 6,770,802); PH51H (Patente de E.E.U.U. No. 6,774,289); PH94T (Patente de E.E.U.U. No. 6,774,290); PH7AB (Patente de E.E.U.U. No. 6,777,599); PH5FW (Patente de E.E.U.U. No. 6,781 ,042); PH75K (Patente de E.E.U.U. No. 6,781 ,043); KW7606 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,784,348); PH8CW (Patente de E.E.U.U. No. 6,784,349); PH8PG (Patente de E.E.U.U. No. 6,784,350); RB01 (Patente de E.E.U.U. No. 6,797,869); 9SM990 (Patente de E.E.U.U. No. 6,803,509); PH5TG (Patente de E.E.U.U. No. 6,806,408); 1501150 (Patente de E.E.U.U. No. 6,806,409); 1390186 (Patente de E.E.U.U. No. 6,806,410); PH6JM (Patente de E.E.U.U.

No. 6,809,240); KW4636 (Patente de E.E.U.U. No. 6,809,243); 1363128 (Patente de E.E.U.U. No. 6,809,244); LH246 (Patente de E.E.U.U. No. 6,812,386); 2JK221 (Patente de E.E.U.U. No. 6,812,387); PHN46 (Patente de E.E.U.U. No. 5,567,861); ZS0223 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,813); phajo (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,816); PHJJ3 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,817); phap8 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,818); PHPP8 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,819); ZS1284 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,820); PHT11 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,821); phte4 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,822); ZS0114 (Patente de E.E.U.U. No. 5,569,826); 7054 (Patente de E.E.U.U. No. 5,576,473); ZS0560 (Patente de E.E.U.U. No. 5,585,533); ZS0853 (Patente de E.E.U.U. No. 5,585,534); ZS1791 (Patente de E.E.U.U.

No. 5,585,539); ZS1513 (Patente de E.E.U.U. No. 5,585,541); ZS1679 (Patente de E.E.U.U. No. 5,589,606); ZS1022 (Patente de E.E.U.U. No. 5,602,314); ZS1202 (Patente de E.E.U.U. No. 5,602,315); ZS1783 (Patente de E.E.U.U. No. 5,602,316); PHDG1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,602,318); PHKV1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,608,138), PH05F (Patente de E.E.U.U. No. 5,608,139); PH38B (Patente de E.E.U.U. No. 5,608,140); PH42B (Patente de E.E.U.U. No. 5,618,987); PHDD6 (Patente de E.E.U.U. No. 5,625, 129); ZS0541 (Patente de E.E.U.U. No. 5,625,131); PH08B (Patente de E.E.U.U.

No. 5,625,132); PHOC7 (Patente de E.E.U.U. No. 5,625,133); LH233 (Patente de E.E.U.U. No. 5,625,135); ASG05 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,731); LH281 (Patente de E.E.U.U. No. 5,723,739); PHBF0 (Patente de E.E.U.U. No. 5,728,919); CG5NA01 (Patente de E.E.U.U. No. 5,728,922); AR5651bm3 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,458); LH266 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,459); LH303 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,460); LH301 (Patente de E.E.U.U. No. 5,981 ,855); 4SQ601 (Patente de E.E.U.U. No. 5,986,182); PH1TB (Patente de E.E.U.U. No. 5,986,184); PH24D (Patente de E.E.U.U.

No. 5,986,185); LH229 (Patente de E.E.U.U. No. 5,986,186); LH277 (Patente de E.E.U.U. No. 5,986,187); PH1CN (Patente de E.E.U.U. No. 5,990,393); LH261 (Patente de E.E.U.U. Na 5,990,394); W1498A (Patente de E.E.U.U.

No. 5,990,395); WQDS2 (Patente de E.E.U.U. No. 5,994,631); NL085B (Patente de E.E.U.U. No. 5,998,710); PH09E (Patente de E.E.U.U. No. 5,998,71 1 ); LH284 (Patente de E.E.U.U. No. 6,015,944); PH1 B5 (Patente de E.E.U.U. No. 6,020,543); PH1CA (Patente de E.E.U.U. No. 6,025,547); 70LDL5 (Patente de E.E.U.U. No. 6,031 ,160); GM9215 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,031 ,161); 90LDI1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,031 ,162); 90LDC2 (Patente de E.E.U.U. No. 6,034,304); 90QDD1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,034,305); R398D (Patente de E.E.U.U. No. 6,034,306); RDBQ2 (Patente de E.E.U.U. No. 6,037,531); HX621 (Patente de E.E.U.U. No. 6,040,506); HX622 (Patente de E.E.U.U. No. 6,040,507); 01HG12 (Patente de E.E.U.U. No. 6,040,508); HX740 (Patente de E.E.U.U. No. 6,043,416); 79314N1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,043,417); 17INI20 (Patente de E.E.U.U. No. 6,043,418); 17DHD7 (Patente de E.E.U.U. No. 6,046,387); 83INI8 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,046,388); 83lnl14 (Patente de E.E.U.U. No. 6,046,389); 01 INL1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,046,390); LH286 (Patente de E.E.U.U. No. 6,049,030); ASG29 (Patente de E.E.U.U. No. 6,054,640); ASG07 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,060,649); QH111 (Patente de E.E.U.U. No. 6,069,303); 09DSQ1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,072,108); JCRNR113 (Patente de E.E.U.U. No. 6,072,109); NP2029 (Patente de E.E.U.U. No. 6,072,110); ASG09 (Patente de E.E.U.U. No. 6,077,996); PHOWE (Patente de E.E.U.U. No. 6,077,997); 86AQV2 (Patente de E.E.U.U. No. 6,077,999); PH1 GG (Patente de E.E.U.U.

No. 6,080,919); RPK7346 (Patente de E.E.U.U. No. 6,506,965); NP2044BT (Patente de E.E.U.U. No. 6,573.438); PH8W4 (Patente de E.E.U.U. No. 6,600,095); M42618 (Patente de E.E.U.U. No. 6,617,500); MV7100 (Patente de E.E.U.U. No. 6,624,345); 3JP286 (Patente de E.E.U.U. No. 6,627,800); BE4207 (Patente de E.E.U.U. No. 6,632,986); CI9805 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,632,987); JCR503 (Patente de E.E.U.U. No. 6,635,808); NR401 (Patente de E.E.U.U. No. 6,635,809); 4VP500 (Patente de E.E.U.U. No. 6,635,810); 7SH385 (Patente de E.E.U.U. No. 6,642,440); KW4773 (Patente de E.E.U.U. No. 6,642,441); NP2073 (Patente de E.E.U.U. No. 6,646, 187); PSA104 (Patente de E.E.U.U. No. 6,646,188); 5XH755 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,653,536); 1445-008-1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,653,537); NP2015 (Patente de E.E.U.U. No. 6,657,109); 7SH383 (Patente de E.E.U.U. No. 6,660,916); LH310 (Patente de E.E.U.U. No. 6,664,451 ); I880S (Patente de E.E.U.U. No. 6,670,531); RR728-18 (Patente de E.E.U.U. No. 6,677,509); LH320 (Patente de E.E.U.U. No. 6,683,234); 11084BM (Patente de E.E.U.U.

No. 6,686,519); W60028 (Patente de E.E.U.U. No. 6,686,520); PH1GD (Patente de E.E.U.U. No. 6,693,231); LH295 (Patente de E.E.U.U. No. 6,693,232); PH1 BC (Patente de E.E.U.U. No. 6,700,041); PH4V6 (Patente de E.E.U.U. No. 6,706,954); NP2276 (Patente de E.E.U.U. No. 6,706,955); NP2222 (Patente de E.E.U.U. No. 6,710,233); PhOR8 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,717,036); PH581 (Patente de E.E.U.U. No. 6,717,037); PH6WR (Patente de E.E.U.U. No. 6,717,038); PH5HK (Patente de E.E.U.U. No. 6,717,039); PH5W4 (Patente de E.E.U.U. No. 6,717,040); PHOKT (Patente de E.E.U.U. No. 6,720,486); PH4GP (Patente de E.E.U.U. No. 6,720,487); PHJ8R (Patente de E.E.U.U. No. 6,723,900); NP2052 (Patente de E.E.U.U.

No. 6,723,901); PH7CP (Patente de E.E.U.U. No. 6,723,902); PH6WG (Patente de E.E.U.U. No. 6,723,903); PH54H (Patente de E.E.U.U. No. 6,727,412); 4P33339 (Patente de E.E.U.U. No. 5,489,744); PHKM5 (Patente de E.E.U.U. No. 5,491 ,286); LH225 (Patente de E.E.U.U. No. 5,491 ,293); LH185 (Patente de E.E.U.U. No. 5,491 ,294); LH176 (Patente de E.E.U.U. No. 5,491 ,296); PHW06 (Patente de E.E.U.U. No. 5,495,065); LH252 (Patente de E.E.U.U. No. 5,495,067); LH231 (Patente de E.E.U.U. No. 5,495,068); PHTE4 (Patente de E.E.U.U. No. 5,495,069); PHP38 (Patente de E.E.U.U. No. 5,506,367); PHN82 (Patente de E.E.U.U. No. 5,506,368); PHTD5 (Patente de E.E.U.U. No. 5,527,986); 899 (Patente de E.E.U.U. No. 5,530,181); PHAP1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,530,184); PHKW3 (Patente de E.E.U.U. No. 5,534,661 ); CG00653 (Patente de E.E.U.U. No. 5,536,900); PHRD6 (Patente de E.E.U.U. No. 5,541 ,352); PHK46 (Patente de E.E.U.U. No. 5,543,575); PHBG4 (Patente de E.E.U.U. No. 5,545,809); LH189 (Patente de E.E.U.U. No. 5,545,811 ); PHNJ2 (Patente de E.E.U.U. No. 5,545,812); PHRF5 (Patente de E.E.U.U. No. 5,545,813); PHFR8 (Patente de E.E.U.U. No. 5,545,814); PHN18 (Patente de E.E.U.U. No. 5,557,034); PHTP9 (Patente de E.E.U.U. No. 5,557,038); PH54B (Patente de E.E.U.U. No. 5,563,320); PHGF5 (Patente de E.E.U.U. No. 5,563,321); PHAG6 (Patente de E.E.U.U. No. 5,563,322); PHAP9 (Patente de E.E.U.U. No. 5,563,323); PHBE2 (Patente de E.E.U.U. No. 5,563,325); ZS0510 (Patente de E.E.U.U. No. 5,563,327); PHAAO (Patente de E.E.U.U. No. 5,602,317); LH273 (Patente de E.E.U.U. No. 5,880,348); 7571 (Patente de E.E.U.U. No. 5,880,349); LH237 (Patente de E.E.U.U. No. 5,880,350); PH0B4 (Patente de E.E.U.U. No. 5,889,188); FEBS (Patente de E.E.U.U. No. 5,902,922); 8F286 (Patente de E.E.U.U. No. 5,905,191 ); 3AZA1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,910,625); 91 DFA-5 (Patente de E.E.U.U. No. 5,910,635); ASG20 (Patente de E.E.U.U. No. 5,910,636); ZS03940 (Patente de E.E.U.U. No. 5,912,420); 9 ISI6 (Patente de E.E.U.U.

No. 5,912,421); MF11 13B (Patente de E.E.U.U. No. 5,914,452); PH03D (Patente de E.E.U.U. No. 5,917,125); PHDN7 (Patente de E.E.U.U. No. 5,917,134); 01 DIB2 (Patente de E.E.U.U. No. 5,920,003); 82DHB1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,922,935); 8M222 (Patente de E.E.U.U. No. 5,922,936); PHMJ2 (Patente de E.E.U.U. No. 5,929,313); SBB1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,932,787); 86ISI3 (Patente de E.E.U.U. No. 5,932,788); ZS01231 (Patente de E.E.U.U. No. 5,936,144); 87DIA4 (Patente de E.E.U.U. No. 5,936,145); 79310J2 (Patente de E.E.U.U. No. 5,936,146); PH1GC (Patente de E.E.U.U. No. 5,936,148); 01 DHD10 (Patente de E.E.U.U. No. 5,939,606); PH2CB (Patente de E.E.U.U. No. 5,939,607); PH080 (Patente de E.E.U.U. No. 5,939,608); PH14T (Patente de E.E.U.U. No. 5,942,670); PH185 (Patente de E.E.U.U. No. 5,942,671); PH19V (Patente de E.E.U.U. No. 5,948,957); ZS09247 (Patente de E.E.U.U. No. 5,952,551 ); CRAUGSH2W-89 (Patente de E.E.U.U. No. 5,952,552); 91DHA1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,962,770); LH300 (Patente de E.E.U.U. No. 5,965,798); 91 ISI4 (Patente de E.E.U.U. No. 5,965,799); 79103A1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,969,212); ASG22 (Patente de E.E.U.U. No. 5,969,220); 82IUH1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,969,221); (Patente de E.E.U.U. No. 5,969,222); LH302 (Patente de E.E.U.U. No. 5,973,238); LH265 (Patente de E.E.U.U. No. 5,973,239); PHFW4 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,451); 01 IBH10 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,452); 91CSI-1 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,453); WKBC5 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,455); PH1 M7 (Patente de E.E.U.U. No. 5,977,456); R327H (Patente de E.E.U.U. No. 6,399,860); FR2108 (Patente de E.E.U.U. No. 6,407,320); FR3383 (Patente de E.E.U.U. No. 6,410,830); IT302 (Patente de E.E.U.U. No. 6,414,227); FR3303 (Patente de E.E.U.U. No. 6,414,228); 9034 (Patente de E.E.U.U. No. 6,420,634); G1500 (Patente de E.E.U.U. No. 6,420,635); FR331 1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,420,636); I389972 (Patente de E.E.U.U. No. 6,420,637); PH77C (Patente de E.E.U.U. No. 6,423,888); IT201 (Patente de E.E.U.U. No. 6,426,451); G3000 (Patente de E.E.U.U. No. 6,426,453); 94INK1 B (Patente de E.E.U.U. No. 6,429,363); PH3HH (Patente de E.E.U.U.

No. 6,433,259); 6TR512 (Patente de E.E.U.U. No. 6,433,260); 89AHD12 (Patente de E.E.U.U. No. 6,433,261); 1889291 (Patente de E.E.U.U. No. 6,433,262); 2070BT (Patente de E.E.U.U. No. 6,437,223); 3323 (Patente de E.E.U.U. No. 6,437,224); G1900 (Patente de E.E.U.U. No. 6,441 ,279); 16IUL6 (Patente de E.E.U.U. No. 6,441 ,280); 7RN401 (Patente de E.E.U.U. No. 6,444,881); UBB3 (Patente de E.E.U.U. No. 6,444,882); 6077 (Patente de E.E.U.U. No. 6,444,883); 1014738 (Patente de E.E.U.U. No. 6,444,884); TDC1 (Patente de E.E.U.U. No. 6,452,074); GF6151 (Patente de E.E.U.U. No. 6,452,075); 7180 (Patente de E.E.U.U. No. 6,452,076); WQDS7 (Patente de E.E.U.U. No. 6,455,764); X532Y (Patente de E.E.U.U. No. 6,459,021); I465837 (Patente de E.E.U.U. No. 6,459,022); 1784S (Patente de E.E.U.U.

No. 6,469,232); LH176Bt810 (Patente de E.E.U.U. No. 6,469,233); 6RC172 (Patente de E.E.U.U. No. 6,469,234); 3327 (Patente de E.E.U.U. No. 6,469,235); 7SH382 (Patente de E.E.U.U. No. 6,476,298); 1181664 (Patente de E.E.U.U. No. 6,476,299); NP2010 (Patente de E.E.U.U. No. 6,483,014); FR3361 (Patente de E.E.U.U. No. 6,483,015); 1778S (Patente de E.E.U.U.

No. 6,486,386); 1362697 (Patente de E.E.U.U. No. 6,492,581); RPK7250 (Patente de E.E.U.U. No. 6,506,964) y 6RT321 (Patente de E.E.U.U. No. 6,911 ,588).

En el presente contexto, el término "que comprende" significa "que incluye pero no se limita a".

Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar ejemplos de ciertas realizaciones preferidas de la invención. Las personas con capacitación en la técnica han de apreciar que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan estrategias que los inventores han encontrado que dan buen resultado al poner en práctica la invención y , por consiguiente, se los puede considerar ejemplos de las modalidades preferidas para la misma. Si embargo, las personas con capacitación en la técnica deberían apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden efectuar numerosos cambios a las realizaciones específicas que se describen y obtener, de todas maneras, un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Transformación del maíz y selección de eventos MON 87427 Se produjo la planta de maíz MON 87427 mediante transformación del maíz mediada por Agrobacterium. Se transformaron células de maíz y se las regeneró para obtener plantas de maíz intactas y se seleccionaron plantas individuales de la población de plantas que exhibían integridad del cassette de expresión del transgén y resistencia al glifosato. De esta población se seleccionó el evento de plantas de maíz MON 87427.

La planta de maíz transgénico MON 87427 tolerante al glifosato se desarrolló mediante transformación de embriones inmaduros de maíz mediada por Agrobacterium utilizando el vector de transformación pMON58401. El inserto transgénico y el cassette de expresión de MON 87427 comprende el promotor y la líder del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S que comprende una región potenciadora duplicada (P-e35S); operativamente ligada a una líder de ADN derivada del primer intrón del gen de la proteína termosensible del maíz 70 (I-HSP70); operativamente ligada a una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplastos N-terminal del gen shkG de Arabidopsis thaliana EPSPS (Ts-CTP2); operativamente ligada a una molécula de ADN derivada del gen aroA de la cepa de Agrobacterium sp. CP4 y que codifica la proteína CP4 EPSPS; operativamenta ligado a una molécula de ADN 3' UTR del gen de nopalina sintasa (T-NOS) de Agrobacterium tumefaciens.

Se pueden transformar células de maíz mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, se puede emplear el siguiente método para producir una planta transgénica de maíz que comprende el cassette de expresión en plantas de la invención. Se inician cultivos líquidos de Agrobacterium tumefaciens que contienen el cassette de expresión en plantas a partir de solución madre de glicerol o de una placa recién cultivada y se los cultiva de un día para otro a 26°C-28°C con agitación (aproximadamente 150 revoluciones por minuto, rpm) hasta la fase de crecimiento semilogarítmica en medio LB liquido, pH 7.0, que contiene 50 mg/l (miligramos por litro) de kanamicina y 50 mg/l de estreptomicina o 50 mg/l de espectinomicina y 25 mg/l de cloranfenicol con acetosiringona 200 µ? (AS). Se resuspenden las células de Agrobacteríum en el medio de inoculación (CM4C líquido, de acuerdo con lo descrito en la Tabla 8 de la patente de los Estados Unidos No. 6,573,361) y se ajusta la densidad celular de tal manera que las células resuspendidas tengan una densidad óptica de 1 medida en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 660 nm (es decir, ??ßß?)· Se inoculan embriones inmaduros de maíz recién aislando con Agrobacteríum y se los cocultiva durante 2-3 días en la oscuridad a 23°C. A continuación se transfieren los embriones al medio de retardo (N6 1-100-12; como se describe en la Tabla 1 de la Patente de Estados Unidos 5,424,412) con suplemento de 500 mg/l de Carbenicillina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y AgN03 20 µ?) y se los incuba a 28 °C por espacio de 4 a 5 días. Todos los cultivos subsiguientes se mantienen a esta temperatura.

Se transfieren los embriones al primer medio de selección (N61- 0-12, como se describe en la Tabla 1 de la Patente de Estados Unidos 5,424,412), suplementado con 500 mg/l Carbenicílina y glifosato 0.5 mM. Dos semanas más tarde, se transfieren los tejidos supervivientes al segundo medio de selección (N61-0-12) suplementado con 500mg/l de Carbenicilina y glifosato 1.0 mM. Se subcultiva el callo superviviente cada 2 semanas en aproximadamente 3 subcultivos en glifosato 1.0 mM. Cuando se identifican tejidos tolerantes al glifosato, se pondera el tejido para la regeneración. Para la regeneración, se transfieren los tejidos de callo al medio de regeneración (MSOD, como se describe en Tabla 1 de la Patente de Estados Unidos 5,424,412) suplementado con ácido abscísico 0.1 µ? (ABA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y se los incuba durante dos semanas. Se transfieren los callos en regeneración a un medio con alto contenido de sacarosa y se los incuba por espacio de dos semanas. Se transfieren las plántulas a medios MSOD (sin ABA) en un recipiente de cultivo y se las incuba durante dos semanas. Se seleccionan las plantas enraizadas con características fenotípicas normales y se las transfiere al suelo para su desarrollo y posterior evaluación. Se transfieren las plantas RO generadas por medio de la transformación descrita al suelo para su desarrolló y se las autofecunda para producir semilla R1. Se seleccionan las plantas mediante una combinación de técnicas analíticas, incluyendo TaqMan, análisis de PCR y fumigación con herbicidas.

Se seleccionó el evento MON 87427 de 45 eventos transgénicos individuales basándose en análisis de varios años que demostraban las características moleculares superiores y fenotípicas del evento y su asociación conveniente de haplotipos (Cr 9, 60 cM). El proceso de selección del evento MON 87427 se inició con plantas de maíz transformadas que representaban 45 eventos RO. Se las roció con glifosato (64 oz/acre a V7 (4,4 kg/ha) y luego se las evaluó para determinar la tolerancia vegetativa y la esterilidad post-rocio de glifosato. De los 45 eventos iniciales, 35 eventos RO exhibieron tolerancia vegetativa al glifosato y eran masculino estériles una vez rociadas con la proporción y el momento de aplicación de glifosato analizados. Las plantas de estos 35 Eventos RO pasaron a la mayor caracterización por análisis molecular. Empleando el análisis de PCR Taqman® PCR y análisis de Southern blot, se realizó la caracterización molecular de 35 eventos. De los 35 eventos analizados, se seleccionaron 29 eventos para su posterior avance y análisis de campo. A continuación se analizaron los 29 eventos R1 en ensayos de campo para determinar la eficacia en campo y el rendimiento. Además de esto, se realizó más caracterización molecular, incluyendo la caracterización genómica y de expresión proteica. Se analizaron los datos y del análisis extenso de las plantas R1 y de los resultados de los ensayos de campo se seleccionaron tres eventos principales y se los avanzó a los ensayos de campo R2. El posterior análisis y ensayo de estos 3 eventos principales llevó a la selección del evento MON 87427.

Las clasificaciones adicionales en campo incluyeron el tratamiento del evento MON 87427 con glifosato a razón de 32 oz/acre (2,24 kg/ha) (Roundup Ultra®, Monsanto Co., St. Louis, MO) en la etapa de crecimiento vegetativo 4 (V4) y la etapa de crecimiento vegetativo 10 (V10). Se hicieron conteos de plantas positivas y negativas después de la fumigación V4. Además, las plantas tratadas fueron calificadas con respecto a la clorosis y malformación a los 10-14 días después del tratamiento (DAT) después de las fumigaciones V4 y V10. También se puntuaron las calificaciones de esterilidad de las panojas correspondientes a las plantas rociadas en V4 y V10.

EJEMPLO 2 Caracterización de las secuencias de ADN de MON 87427 Se caracterizó el ADN insertado en el genoma de la planta de maíz MON 87427 y la secuencia genómica flanqueante mediante análisis moleculares detallados. Estos análisis incluyeron: secuenciación del ADN transgénico insertado y el ADN que flanqueaba el inserto transgénico, determinación del número de insertos transgénicos (número de sitios de integración dentro del genoma del maíz), determinación del número de copias del ADN transgénico dentro de un locus), análisis de la integridad del cassette de expresión génica insertado, análisis del ADN genómico que flanqueaba el inserto y la asociación de la inserción a las regiones de haplotipo del genoma del maíz.

Se determinaron las secuencias que flanqueaban la inserción de ADN transgénico en MON 87427 empleando técnicas de PCR. Se aisló ADN genómico de plantas de la línea transgénica del tejido cultivado en condiciones normales de invernadero. Se combinó el tejido vegetal con nitrógeno líquido y se lo molió hasta obtener un polvo fino empleando un mortero. Se extrajo el ADN empleando un kit de extracción de ADN Genómico Nucleón™ PhytoPure™ (RPN8511 , Amersham, Piscataway, NJ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del paso de precipitación final, se resuspendió el ADN en 0.5 mi de TE (Tris-HCI 10mM pH 8.0, EDTA 1 mM). Una persona con capacitación en la técnica puede modificar este método para extraer ADN de cualquier tejido de maíz, incluyendo, aunque no a titulo de limitación, la semilla. Se digirió una alícuota de ADN con endonucleasas de restricción seleccionadas sobre la base del análisis de restricción del ADN transgénico. Después del autoligamiento de los fragmentos de restricción, se ejecutó la PCR empleando cebadores diseñados de la secuencia de ADN del transgén que amplificarían las secuencias que se alejan de los extremos 5' y 3' del ADN transgénico. Se separaron los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y se los purificó utilizando un kit de purificación en gel QIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Se secuenciaron los productos subsiguientes de ADN directamente utilizando protocolos normales de secuenciación de ADN. La secuencia flanqueante 5' que se extiende hasta la secuencia de borde derecho (RB) del ADN transgénico del cassette de expresión se presenta con el nombre SEQ ID NO: 7. La secuencia flanqueante 3' que se extiende hasta la secuencia de borde izquierdo (LB) del ADN transgénico del cassette de expresión se presenta con el nombre SEQ ID NO: 8. La secuencia totalmente integrada al ADN genómico del maíz y que contiene el ADN del cassette de expresión se presenta bajo el título SEQ ID NO: 9.

Se compararon las secuencias de moléculas de ADN aisladas con la secuencia de ADN del transgén para identificar la secuencia flanqueante y el fragmento de ADN transgénico coaislado. La confirmación de la presencia del cassette de expresión se logró por PCR con cebadores diseñados sobre la base de los datos de la secuencia flanqueante deducida y la secuencia conocida del ADN transgénico. Se aisló la secuencia de tipo salvaje que corresponde a la misma región a la cual se integró el ADN del transgén en la línea transformada utilizando cebadores diseñados de las secuencias flanqueantes en MON 87427. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo empleando el sistema de amplificación Elongase® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se analizaron las secuencias de ADN flanqueantes de MON 87427 y la secuencia LH198 de tipo salvaje contra múltiples bases de datos de nucleótidos y proteínas. Se utilizó esta información para examinar la relación del transgén con el genoma de la planta y para buscar la integración del sitio de inserción.

EJEMPLO 3 Métodos útiles para la identificación de MON87427 DNA en una muestra Este ejemplo describe métodos útiles para identificar el ADN del evento MON 87427 en una muestra. Se puede utilizar la secuencia (o secuencias) flanqueantes del evento y/o la secuencia del transgén para diseñar cebadores y sondas para usar en esos métodos. En este ensayo se puede incluir, o no, uno o más cebadores de control interno y sonda(s).

Se describen métodos de amplificación térmica de punto final TAQMAN® para identificar el evento MON 87427 (ensayo para eventos específicos) y/o el gen sintético CP4-EPSPS (también conocido como CP4-Zm) (ensayo para transgenes específicos) del evento MON 87427 en una muestra. Se utilizó la secuencia (o secuencias) flanqueantes del evento, la secuencia genómica del maíz de tipo salvaje y la secuencia del transgén para diseñar cebadores y sondas para usar en estos ensayos (cuadro 1). Los cebadores de ADN utilizados en el ensayo para eventos específicos son los cebadores SQ12763 (SEQ ID NO: 17) y SQ12886 (SEQ ID NO: 18) con la sonda marcada con 6-FAM™ PB4352 (SEQ ID NO: 19). Los cebadores de ADN usados en el ensayo para transgenes específicos son los cebadores SQ20052 (SEQ ID NO: 11) y SQ20053 (SEQ ID NO: 12) con la sonda marcada con 6-FAM™ PB10016 (SEQ ID NO: 13). 6-FAM™ es una tintura fluorescente producto de Applied Biosystems (Foster City, CA) acoplada a la sonda de ADN. Los controles para este análisis deben incluir un control positivo del maíz que contiene ADN del evento MON 87427, un control negativo de maíz no transgénico y un control negativo que no contiene ADN plantilla.

Además, un control opcional para la reacción de PCR puede incluir Cebadores de Control interno y una Sonda de Control interno, específica para un gen de copia única del genoma del maíz. Una persona con capacitación en la técnica ha de saber cómo diseñar cebadores específicos para un gen monocopia del genoma del maíz. Los cebadores de ADN usados en el ensayo especifico para transgenes como controles internos son los cebadores SQ1241 (SEQ ID NO: 14) y SQ1242 (SEQ ID NO: 15) con la sonda marcada con VIC TAMRA PB0084 (SEQ ID NO: 16). Para el ensayo específico para transgenes se pueden emplear cebadores de control interno y sondas con los siguientes pasos opcionales 5-6. Para el ensayo para eventos específicos no se utiliza ningún control interno.

CUADRO 1 Los ejemplos de condiciones útiles con los métodos TAQMAN® de punto final son los siguientes: Paso 1 : agua a 18 megohm ajustada a un volumen final de 10 µ?.

Paso 2: 5.0 µ? de Mezcla Maestra Universal 2X (dNTPs, buffer enzimático) a una concentración final de 1X.

Paso 3: Mezcla de 0.5 µ? de Cebador del evento-1 (SEQ ID NO: 17) y Cebador del evento-2 (SEQ ID NO: 18) (resuspendida en 18 megohm de agua a una concentración de 20 uM por cada cebador) a una concentración final de 1.0 µ? (por ejemplo en un tupo de microcentrífuga, se debe agregar lo siguiente para obtener 500 µ? en una concentración final de 20uM: 100 µ? del Cebador del evento-1 (SEQ ID NO: 17) en una concentración de 100 µ?; 100 µ? del Cebador del evento-2 (SEQ ID NO: 18) en una concentración de 100 µ?; 300 µ? de agua de 18 megohm).

Paso 4: 0.2 µ? de Sonda MGB del Evento 6-FAM™ (SEQ ID NO: 19) (resuspendida en agua a 18 megohm hasta una concentración de 10 µ?) a una concentración final de 0.2 µ?.

Paso 5 (Opcional): 0.5 µ? de la Mezcla del Cebador Control interno-1 y el Cebador Control interno-2 (resuspendida en agua a 18 megohm a una concentración de 20 µ? por cada cebador) a una concentración final de 1.0 µ?.

Paso 6 (Opcional): 0.2 µ? de la Sonda de Control interno VIC™ a una concentración final de 0.2 µ? (resuspendida en agua a 18 megohm hasta una concentración de 10 µ?) Paso 7: 3.0 µ? de ADN Extraído (plantilla) por cada muestra, cada uno con uno de los siguientes, que comprenden 1. Muestras de hojas a analizar; 2. Control negativo (ADN no transgénico); 3. Agua control negativo (sin plantilla); 4. ADN control positivo MON 87427.

Paso 8: Las siguientes Condiciones del Termociclador: Un Ciclo a 50°C por espacio de 2 minutos; Un Ciclo a 95°C durante 10 minutos; Diez Ciclos de (95°C durante 15 segundos, luego 64°C durante 1 minuto con -1 °C/ciclo); Treinta Ciclos d (95°C durante 15 segundos, luego 54°C 1 minuto); ciclo final de 10°C.

Estos ensayos se optimizan para usar con una Disposición de PCR Applied Biosystems GeneAmp® 9700 (corriendo a velocidad máxima) o el ciclador térmico ADN MJ Research DNA Engine PTC-225. Otros métodos y aparatos conocidos por las personas con capacitación en la técnica que producen amplicones que identifican el ADN del evento MON 87427 son de competencia de los técnicos.

Cada una de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, es un ejemplo de un par de moléculas de ADN (un par de cebadores) que consiste en una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, donde cada una de dichas primera y segunda moléculas de ADN comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de un tramo suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para funcionar como cebadores de ADN si se las utiliza juntas en una reacción de amplificación con ADN derivado del evento MON 87427 para producir un amplicón diagnóstico del ADN MON 87427 en una muestra. Estos cebadores se pueden utilizar en otros métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del evento.

EJEMPLO 4 Uso del evento MON 87427 para la producción de semillas híbridas El siguiente ejemplo describe de qué manera se puede utilizar el MON 87427 para fines de reproducción asexual del maíz, incluyendo el uso de los métodos descritos en la Publicación de Patente No. 20090165166 y/o en la Patente de Estados Unidos No. 7,314,970.

En la producción de semillas híbridas, se plantan plantas de maíz que comprenden MON 87427 en una zona tal como un campo abierto. Puede o no haber otras plantas de maíz presentes en la misma zona. Para el control de malezas durante la producción de la semilla y en campos comerciales, se puede aplicar glifosato a las plantas de maíz que comprenden MON 87427 en las etapas vegetativas de acuerdo con las indicaciones de las etiquetas del producto agrícola Roundup®, en las mismas proporciones utilizadas en los eventos de maíz Roundup Ready® NK603 y MON 88017. Para la producción de semillas híbridas, se realizan dos aplicaciones, comenzando inmediatamente antes y/o durante las etapas de desarrollo de las panojas (Las etapas de desarrollo vegetativo del maíz aproximadas en el rango de V8 a V13) a las Plantas MON 87427 para producir un fenotipo masculino estéril por medio de la tolerancia al glifosato selectivo de tejidos. En un sistema de producción de semillas híbridas, las Plantas MON 87427 con aplicación de glifosato en los momentos de desarrollo de las panojas son masculino estériles y, por consiguiente, pueden ser fácilmente polinizadas por otras plantas donadoras de polen (masculinas), para dar lugar a semillas de maíz híbrido viables que acarrean el gen de tolerancia al glifosato selectivo de tejidos. Las plantas donadoras de polen pueden o no estar presentes en la misma zona. La polinización se puede efectuar por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo mediante la colocación en proximidad de las plantas o por polinización manual. Sólo las aplicaciones de glifosato realizadas en momentos específicos comenzando inmediatamente antes y/o durante las etapas de desarrollo de las panojas (etapas de desarrollo vegetativo del maíz aproximadas en el rango de V8 a V13) producen un fenotipo masculino estéril por medio de tolerancia al glifosato selectivo de tejidos, en MON 87427. El glifosato es un herbicida sistémico que se transloca fácilmente a través del floema, se desplaza a áreas de alta actividad meristemática, después de una fuente típica para la distribución en profundidad. El desarrollo del polen en una planta de maíz lleva aproximadamente cuatro semanas para completarse. Las etapas precoces de desarrollo de las panojas se inician aproximadamente en la etapa de crecimiento vegetativo del maíz V9, por lo tanto las aplicaciones de glifosato realizadas aproximadamente en esta etapa y en este momento permiten la translocación máxima del glifosato a los tejidos reproductivos masculinos. Las aplicaciones de glifosato realizadas durante las etapas vegetativas tempranas, que coinciden con el momento de aplicación especificado en la etiqueta del producto agrícola actual Roundup®con fines de control de malezas no afectan la producción de polen de MON 87427, puesto que los sensibles tejidos reproductivos masculinos no se están desarrollando activamente en ese momento. Se pueden realizar modificaciones de las condiciones de tratamiento con glifosato que son conocidas en la técnica de la aplicación de herbicidas y estas están dentro del alcance de la presente invención.

MON 87427, cuando se lo cruza con otro evento de maíz tolerante al glifosato tal como el evento de maíz NK603 (Patente de Estados Unidos No. 6,825,400) para producir semilla híbrida no exhibe pérdida de rendimiento en comparación con el rendimiento del híbrido convencional NK603 (ver la figura 2). Se trató un campo de plantas híbridas de maíz con glifosato en dos fumigaciones sucesivas a razón de 2.25 Ib a.e./acre (2.52 kg/ha) en cada caso para el control de malezas y no se observó diferencia alguna en cuanto a lesiones o fertilidad masculina entre los diversos híbridos con el evento MON 87427 y el híbrido NK603. Esto demuestra que las plantas híbridas F1 de las cruzas del evento MON 87427 son totalmente tolerantes al glifosato cuando se lo utiliza para el control de malezas.

EJEMPLO 5 Medición de las etapas de desarrollo de las panojas Las etapas de desarrollo de las panojas están ilustradas en la figura 3, donde se muestra el tamaño aproximado en milímetros entre paréntesis. En la figura, Vg es el meristema en la etapa vegetativa; TO es el cambio de vegetativa o reproductiva; T1 es el punto visible de crecimiento reproductivo (0.9 mm); T2 es la aparición de primeras ramas laterales visibles (1.8 mm); T3 es la aparición visible de las espiguillas (4.1 mm); T4 es la elongación del eje central y el eje lateral (12.9 mm); T5 es el comienzo de la diferenciación de las anteras (41.0 mm); T6 es el comienzo de la diferenciación del polen (175 mm) y T7 es la prolongación de las anteras y la diseminación del polen (285.0 mm). La etapa de desarrollo de las panojas de una planta dada se midió examinando la panoja en diversas etapas de maduración. Empleando un bisturí y pinzas finas bajo un visor de disección, se extirpó el meristema de la panoja de las hojas en desarrollo. A continuación se cortó el meristema en su base con el bisturí y se lo evaluó de acuerdo con las etapas de desarrollo de las panojas (ilustradas en la figura 3) observándolo a través de un microscopio.

EJEMPLO 6 Etapa de desarrollo vegetativo (Etapa V) con respecto a la etapa de desarrollo de las panojas Este ejemplo demuestra que el peso seco de las panojas, la longitud de las panojas y la etapa de desarrollo de las panojas varían significativamente en todos los genotipos al medirlas con respecto a las etapas vegetativas de la planta y el crecimiento vegetativo de las plantas.

Se plantaron diez genotipos: Las líneas endogámicas LH198, LH287, 01 DKD2, 19HGZI, 17IDI6 y las híbridas DKC 4^6, DKC 47-10, DKC 52-40, DKC 58-80, DKC 63-81. Se seleccionaron las híbridas para que representen la genética que presentaría un patrón de desarrollo diferente. El estudio se llevó a cabo en Farmer City (IL), Kearney (NE) y Williamsburg (IA). Se plantaron los diez genotipos con un plantador en cono y se las raleó a un grado de establecimiento final de 38,000 plantas por acre (93,860 por ha). La longitud de los lotes era de 20 pies (6,6 m) con pasillos de 3 pies (1 m) por cuatro hileras para garantizar una cantidad suficiente de plantas para todos los tratamientos y reducir los efectos de borde. Se colectaron datos para registrar tanto el desarrollo vegetativo de las plantas como las observaciones de desarrollo de las panojas con relación a las etapas de desarrollo de las panojas.

Se observaron claras diferencias en el desarrollo de las panojas entre los genotipos en idénticas etapas vegetativas respectivas (Etapas V).

Por ejemplo, las diferencias de tamaño de las panojas entre los genotipos se evidenciaron en todas las etapas V. La longitud promedio de las panojas en la etapa V8 fue de 7 mm en el caso de LH 98, 40,2 mm en el caso de LH287 y 47,8 mm en el caso de DKC44-46 (figura 4). Este rango de tamaño de longitud de las panojas en la etapa V8 representa una diferencia de hasta 7 veces entre los genotipos. En la etapa V10, las longitudes promedio de las panojas para estos tres genotipos eran de 70.1 mm, 148.2 mm y 277.3 mm, respectivamente (Figura 4). Esto dio lugar a una diferencia en el rango de casi 4 veces entre los genotipos. La variación genética en cuanto a desarrollo de las panojas con respecto a las etapas V también es evidente al examinar la acumulación de peso seco de las panojas.

En otro estudio, se utilizaron setenta y dos endogámicas para capturar un amplio rango de madureces. Estas endogámicas fueron agrupadas en 6 grupos de madurez para simplificar el proceso de disección (cuadro 2). Se eligieron endogámicas sin tratamiento para evitar la complejidad de llevar a cabo disecciones en campos regulados. Este experimento refleja los datos colectados en cuatro puntos diferentes de campo: Williamsburg (IA), Waterman (IL), Farmer city (IL) y Constantine (MI). Se cultivaron lotes de cuatro hileras por veinte pies de largo (6.66 m). La población final propuesta era de 38,000 plantas por acre (93,860 plantas/ha). Se documentaron las determinaciones de grado de establecimiento en la etapa V3. Se marcaron las hojas quinta y décima de tres plantas representativas por lote para hacer el seguimiento de las etapas V; todas estas hojas fueron contadas incluidos los coleóptilos. Se muestrearon tres plantas representativas de cada grupo a 60, 70 y 80% de las unidades de desarrollo de crecimiento promedio hasta la floración (que se define cuando aproximadamente la mitad de las panojas del grupo están emitiendo polen, lo que se representa en términos de P50) y se realizaron las disecciones de las panojas de la manera antes descrita.

CUADRO 2 Se eligieron plantas de las hileras del medio para evitar las plantas de borde. En el momento del primer muestreo, se marcaron las plantas en una etapa de desarrollo permanente para usarlas para el segundo y tercero muéstreos. Se documentaron las fechas de cada disección, junto con la etapa V en las ocasiones de muestreo. Se identificó la etapa de desarrollo de las panojas siguiendo la Escala de Desarrollo Relativo como se describiera anteriormente. Se continuó monitoreando los lotes durante toda la floración y se registró la fecha del P50. La etapa vegetativa varió a través de las endogámicas con respecto a las etapas de desarrollo de las panojas. Por ejemplo, La etapa V a T5 (el comienzo de la diferenciación de las anteras) estuvo en el rango de más de 6.5 hojas en todas las endogámicas de 7 a 14 hojas. Esto era aproximadamente 64% del promedio general de 10.3 hojas para alcanzar esa etapa.

EJEMPLO 7 GDU promedio con relación a las etapas de desarrollo de las panojas y las flores Este ejemplo demuestra que las GDU promedio necesarias para obtener una determinada etapa de desarrollo de las panojas o etapa de floración puede variar significativamente entre los genotipos y que, por lo tanto, las GDU no son una medida confiable del desarrollo de las panojas. Se tomaron datos de los lotes del campo y las plantas endogámicas antes descritas. Se monitorearon las temperaturas por hora desde la plantación hasta el final de la floración empleando las estaciones climáticas Onset y se utilizaron los datos para calcular las GDU diarias cumulativas siguiendo el método tradicional (es decir, promediando las temperaturas máximas y mínimas diarias). Se representaron los datos obtenidas de las disecciones muestreadas que indicaban la etapa de desarrollo de las panojas contra los requerimientos de GDU. Se espera que las endogámicas con diferenciación de un número mayor de hojas tengan un mayor requerimiento de GDU para alcanzar una etapa específica de desarrollo de las panojas. Sin embargo, la variación observada en las etapas V a T5 antes citada no justificó toda la variación de GDU hasta T5. Esto podría sugerir que el filocrono, que se define como el momento entre la elongación de las hojas sucesivas, podría variar entre endogámicas. Los resultados de este estudio demostraron que las GDU necesarias para obtener la etapa T5 estaba en el rango de más de 400 unidades de calor o grado de crecimiento de una endogámica a otra; aproximadamente 40% del promedio general.

Se observó una fuerte correlación entre los requerimientos de GDU hasta P50 y hasta una determinada etapa de desarrollo de las panojas en todas las variedades endogámicas. Empleando los datos de los lotes de campo y las plantas endogámicas, se registraron los requerimientos de GDU hasta P50 en todas las endogámicas y se los comparó en las determinadas etapas de desarrollo de las panojas. Los requerimientos de GDU hasta P50 variaron entre 1283 y 1645 unidades, de la endogámica de mayor a menor tiempo de madurez, una diferencia ligeramente superior a 360 GDU. Se encontró que estas diferencias se correlacionaban con las diferencias de requerimientos de GDU promedio hasta la etapa T5 dentro de las líneas endogámicas (Figura 5).

EJEMPLO 8 Construcción de una Escala de Desarrollo Relativo Este ejemplo demuestra la construcción de una escala normalizada para monitorear y/o predecir el desarrollo de lasa panojas. Esta Escala de Desarrollo Relativo normalizó con éxito las etapas de desarrollo de las panojas del maíz en todas las endogámicas.

Dada la fuerte correlación entre los requerimientos de GDU para obtener P50 en una determinada etapa de desarrollo de las panojas en todas las variedades endogámicas de acuerdo con lo descrito anteriormente, se desarrolló la Escala de Desarrollo Relativo. Esto se calculó expresando el desarrollo de las panojas de cada genotipo con respecto al tiempo térmico hasta la Diseminación del Polen de la siguiente manera: Escala de Desarrollo Relativo = (GDU hasta Tn/ GDU hasta Px) Se utilizaron los datos de los lotes de campo y las plantas endogámicas antes descritos. Se dividió el valor GDU en una determinada etapa de desarrollo de las panojas (GDU hasta Tn) por el número de GDUs que se sabe necesario para obtener una etapa específica de diseminación del polen (GDU hasta Px) que, en este caso, fue P50 para un genotipo determinado. Esto concilio las diferencias de la etapa de desarrollo de las panojas entre los genotipos. Por ejemplo, los requerimientos de GDU para alcanzar T5 fueron bastante constantes en la Escala de Desarrollo Relativo entre todas las endogámicas y sólo estuvieron en el rango de 69 a 75% de las GDU necesarias para alcanzar P50. La variación de las líneas de regresión de los requerimientos de GDU de diversos genotipos con respecto a la etapa de desarrollo de las panojas en comparación con las lineas de regresión más constantes de esos mismos genotipos usando la escala T normalizada para evaluar la normalización de la escala, independientemente del grupo de madurez (Figura 7).

EJEMPLO 9 Predicción del momento óptimo para el tratamiento modulador del desarrollo Este ejemplo demuestra el uso de la Escala de Desarrollo Relativo para determinar el momento óptimo para un régimen de fumigación con un agente químico a fin de obtener la esterilidad completa de las panojas de maíz. En este ejemplo el agente químico era el herbicida glifosato Roundup® usado en combinación con plantas de maíz MON 87427 en el Sistema de Hibridación Roundup® (RHS). Se correlacionó el momento óptimo para la fumigación con la etapa de desarrollo real de las panojas y se obtuvo la esterilidad completa de las panojas de maíz con sólo una sola dosis efectiva de Roundup®.

Se seleccionaron treinta y dos antecedentes endogámicos que comprendían el evento MON 87427 para el estudio y se los agrupó en dos grupos de madurez. Se plantaron endogámicas en hileras de veinte pies (6.66 m), con pasillos de tres pies (1 m). El espaciamiento entre hileras era de 30 pulgadas (77 cm) entre plantas. Se plantaron las hileras de manera tal que hubiera cuatro hileras de plantas "de ensayo" femeninas seguidas por dos hileras de plantas polinizadoras masculinas. Para este estudio se seleccionaron eventos transgénicos que tenían tolerancia al glifosato pero no tolerancia de los tejidos reproductivos masculinos (es decir, tolerancia al glifosato selectivo de tejidos). Los polinizadores masculinos también fueron tornados tolerantes al glifosato, en tanto que las plantas femeninas receptoras eran masculino-sensibles cuando se las trató con glifosato. Se bloquearon los tratamientos de rociado y se las dividió en dos grupos basándose en la madurez de las endogámicas. Inmediatamente antes de cada fumigación, se seleccionaron tres plantas representativas de cada lote y se las disecó en el campo, se registró la longitud de las panojas, la etapa de desarrollo de las panojas, la fecha y las GDU al momento de la fumigación. Se aplicaron tratamientos de fumigación (SS1) de Roundup PowerMAX™ con un volumen de agua de 15 galones/acre (140.25 l/ha) una vez a cada grupo de madurez del tratamiento utilizando una fumigadora de alto despeje. Se aplicaron tratamientos de Rocío depara Esterilidad en un rango de 50% a 80% inclusive de las GDUs necesarias para obtener P50 (promediadas dentro del grupo de madurez endogámico) como se ilustra en el cuadro 3, donde CM = "Control de malezas"; Rgo. 1 SS1 = 50% de GDU a P50; Rgo. 2 SS1 = 57.5% de GDU a P50; Rgo. 3 SS1 = 65% de GDU a P50; Rgo. 4 SS1 = 72.5% de GDU a P50; Rgo. 5 SS1 = 80% de GDU a P50.

CUADRO 3 Con posterioridad a todos los tratamientos de fumigación, se llevaron a cabo evaluaciones de esterilidad/fertilidad de las panojas evaluando la extrusión de las anteras y el polen diseminado con respecto a la emergencia de los estigmas. Estas evaluaciones se realizaron cuando cada lote se encontraba en etapas específicas de desarrollo: 0% de las plantas de la anotación con estigmas (S10); 50% de las plantas de la anotación con estigmas (S50); 90% de las plantas de la anotación con estigmas (S90); 3 días después de la fecha S90 (S90+3); y 6 días después de la fecha S90 (S90+6). Se observaron las plantas para verificar la extrusión de las anteras (EA) y se midió la esterilidad empleando un índice de Riesgo de Extrusión de las Anteras (Riesgo de EA), que es un promedio ponderado que combina el porcentaje de plantas del lote que exhibía extrusión de las anteras con la intensidad del fenómeno. Por ejemplo, Parcial ligero (PL) es una panoja con extrusión de 10 o menos anteras. Parcial Medio (PM) es una panoja con extrusión de >11 anteras hasta la extrusión del 25% de las anteras. Parcial Pesado (PP) es una panoja con extrusión de > 25% de las anteras. Como se ilustra en la figura 6, la Escala de Desarrollo Relativo revela una ventana óptima de eficacia del agente químico para producir esterilidad de las panojas del maíz de entre 0.62 y 0.75 donde el riesgo de EA se minimiza en todas las endogámicas y grupos de madurez. Este estudio confirma la efectividad de la Escala de Desarrollo Relativo como herramienta para ofrecer recomendaciones de fumigación para la implementación de un sistema de hibridación Roundup® entre endogámicas. Esto sería de particular utilidad con MON 87427.

EJEMPLO 10 Método de Producción de Semilla híbrida con Pureza Mejorada de las Semillas Se midieron métodos para la producción de semilla híbrida y la pureza de las semillas asi obtenidas utilizando bloques de producción de veinticuatro horas en los sitios de Kearney, Nebraska; Williamsburg, lowa; Waterman, Illinois; Farmer City, Illinois; y Constantine, Michigan. Se plantaron cuatro bloques de MON 87427 y dos bloques de esterilidad citoplásmica de las panojas (CMS) en cada localidad. Los bloques de MON 87427 consistían en 01DKD2MON87427-MON89034 femeninas x 80IDM2MON88017 masculinas y los bloques de CMS consistían en 01 DKD2NK603B-CMS femeninas x 80IDM2MON88017 masculinas.

El patrón de plantado era una relación de 4:1 femeninas a masculinas en hileras de 30 pulgadas (76.5 cm). Cada bloque experimental eran diez paneles de de un tamaño de 100 a 150 pies (33.3 a 50 m). Los bloques estaban rodeados por 30 pies (10 m) (12 hileras) de plantas masculinas a cada lado y también delante y detrás. Los bloques estaban alejados a por lo menos 200 pies de distancia (66.6 m) de otras fuentes potenciales de polen y estaban aislados entre sí por 45 pies (15 m). El estudio se plantó en una población de 40,000 y 38,000 en el caso de la tierra irrigada y no irrigada, respectivamente. Se plantaron tanto hileras de femeninas como masculinas al mismo tiempo. Se flamearon las hileras masculinas en la etapa de desarrollo V3 para obtener el crecimiento estancado y retardar la diseminación de polen de las plantas masculinas flameando alternativamente secciones de hileras de 20 pies (6.66 m) de longitud. Se montaron sopletes de propano detrás de un tractor y se los colocó sobre las hileras masculinas y se alternó entre flameado y no flameado a grandes rasgos cada 20 pies (6.6 m). Se utilizó insecticida en el momento de la plantación para minimizar la variabilidad debida a la presión de los insectos. Se destruyeron las hileras masculinas después de la polinización. Se fumigaron todos los bloques con 0.75 Ib e. a/acre (0.89 kg/ha) de Roundup PowerMax™ alrededor de V3 a fin de combatir malezas. Además, se rociaron los bloques de MON 87427 con dos fumigaciones a razón de 0.75 Ib a.e./acre (0.89 kg/ha) de Roundup PowerMax™ aplicado a las 825 y 975 unidades de grado de desarrollo (GDU) desde la plantación. Se mantuvo constante el volumen de fumigación a razón de 15 galones por acre (GPA) (140.25 l/ha).

Se evaluó la esterilidad de las panojas monitoreando las plantas día por medio desde la emergencia de las panojas hasta 6 días inclusive después del final de la aparición de estigmas ((P90 + 6 días). Si se producía la rotura (emisión de polen), se categorizaba además a las plantas individuales como bajo polen (LP; menos de 10 anteras expuestas), mediano polen (MP¡ 11 anteras hasta 25% del área superficial de las panojas en extrusión), o alto polen (HP, más de 25% del área superficial de las panojas en extrusión). Se calculó el riesgo de Extrusión de las Anteras (Riesgo de EA) de la siguiente manera: Riesgo de EA % = ([(LPx0.25)+(MPx0.5)+(HPx1.0)] / recuento de grado de establecimiento) x 100 Después de la madurez fisiológica y alrededor de 30-35% de contenido de humedad de los granos, se cosechó a mano una muestra compuesto de 100 mazorcas por bloque, siguiendo un esquema de muestreo predeterminado que representara todos los paneles del bloque. Se secaron las muestras y se las pesó para ajusfar el rendimiento final. Se trató a mano una primera serie de muestras y se las envió al análisis de calidad (evaluación de la germinación en frío y germinación caliente utilizando dos replicaciones de 100 semillas). Se envió una segunda serie de muestras para el análisis de 1 pureza genética (análisis de polimorfismos de nucleótido único (SNPs)) y el análisis de pureza de rasgos (ELISA del marcador específico masculino). Se utilizó una tercera serie de muestras para documentar la distribución de tamaño de las semillas. Se las cosechó con máquinas combinadas bloques de producción piloto y se ajustó el rendimiento a 15% de humedad en la determinación de bushel por acre.

En general, tanto el bloque CMS como el MON 87427 excedieron los standards de esterilidad de las panojas y pureza de las semillas. El riesgo de extrusión de las anteras estuvo muy por debajo del standard de rendimiento pretendido de 0.5% incluso 6 días después de la aparición de los estigmas en el 90% de la población femenina (Figura 8). Casi no se documentarlo roturas en los bloques MON 87427, aunque se observó una tasa de rotura ligeramente superior en las etapas tardías de formación de estigmas en los bloques de CMS. Se analizaron tanto las plantas progenitoras femeninas como masculinas de maíz correspondientes a CMS y MON 87427 para determinar la pureza genética y los resultados exhibieron 100% de pureza. Los elevados niveles de esterilidad de las panojas de maíz tanto de las plantas progenitoras MON 87427 como las CMS produjeron altos niveles de pureza genética y pureza de rasgos en la semilla híbrida producida merced a estos ensayos (Figura 9). No hubo diferencia estadísticamente significativa de la pureza de rasgos entre MON 87427 y CMS, aunque se registró una diferencia estadísticamente significativa (a p<0.05) respecto de la pureza genética entre MON 87427 y CMS. El nivel de pureza genética de la semilla híbrida producida utilizando MON 87427 y el Sistema de Hibridación Roundup® (RHS) fue de 98.7%, que fue significativamente más elevado que el nivel de pureza genético de la semilla híbrida producida utilizando CMS (98.0%). Esto trajo aparejado que las plantas progenitoras femeninas MON 87427 que producían aproximadamente 0.2% menos autofecundadas y 0.5% menos de "otras" que las plantas progenitoras del sistema CMS, demostrando que se puede emplear MON 87427 con el Sistema de Hibridación Roundup® (RHS) para mejorar la pureza de las semillas de maíz en la producción de semillas híbridas de maíz.

Se ha efectuado el depósito de una muestra representativa de semillas MON 87427 antes descritas y mencionadas en las reivindicaciones de conformidad con el Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110. El número de acceso de la ATCC correspondiente a este depósito es PTA-7899. El depósito se ha de mantener con el depositario durante un período de 30 años, o 5 años después del último pedido, o durante la vida en vigencia de la patente, lo de mayor duración, y será recambiado según la necesidad durante ese período.

Habiendo ilustrado y descrito los principios de la invención, ha de resultar evidente a las personas con capacitación en la técnica que la invención puede ser modificada en disposición y detalle sin apartarse de dichos principios. Reivindicamos todas las modificaciones que estén dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (38)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-8.

2. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ADN recombinante está formada por el empalme de una molécula de ácido nucleico heterólogo insertada y ADN genómico de una planta, célula vegetal o semilla de maíz.

3. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ADN se obtiene del evento transgénico de maíz MON 87427, del cual se ha depositado una muestra representativa bajo el acceso ATCC PTA-7899.

4. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicha molécula de ADN es un amplicón diagnóstico de la presencia de ADN derivado del evento transgénico de maíz MON 87427.

5. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ADN se encuentra en una planta, célula vegetal, semilla, planta de la progenie, parte de la planta de maíz, o producto de consumo derivado del evento transgénico de maíz MON 87427, del cual se ha depositado una muestra representativa bajo el acceso ATCC PTA-7899.

6. Una molécula de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de un tramo suficiente de la secuencia de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para que funcione como sonda de ADN que se híbrida en condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10 y que no se híbrida en las condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ADN que no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10.

7. Un par de moléculas de ADN que consiste en una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, donde cada una de dichas primera y segunda moléculas de ADN comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de un tramo suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para que funcione como cebadores de ADN cuando se las utiliza juntas en una reacción de amplificación con ADN derivado del evento MON 87427 para producir un amplicón indicador de la presencia del evento transgénico de maíz MON 87427 DNA en una muestra.

8. Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN obtenida merced a MON 87427 en una muestra, dicho método comprende: a. poner en contacto una muestra con la sonda de ADN de conformidad con la reivindicación 6; b. someter a dicha muestra y a dicha sonda de ADN a condiciones de hibridación rigurosas y c. detectar la hibridación de dicha sonda de ADN a una molécula de ADN de dicha muestra, donde la hibridación de dicha sonda de ADN a dicha molécula de ADN indica la presencia de una molécula de ADN derivada del evento transgénico de maíz MON 87427 en dicha muestra.

9. Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN obtenida del evento transgénico de maíz MON 87427 en una muestra, dicho método comprende: a. poner en contacto una muestra con el par de moléculas de ADN de conformidad con la reivindicación 7; b. realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10; y c. detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción, donde la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción indica la presencia de una molécula de ADN derivada de MON 87427 en dicha muestra.

10. Un kit de detección de ADN que comprende por lo menos una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de una longitud suficiente de secuencia de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para que funcione como cebador de ADN o sonda especifica para detectar la presencia de ADN derivado del evento transgénico de maíz MON 87427, donde la detección de dicho ADN es diagnóstico de la presencia de dicho evento transgénico de maíz MON 87427 DNA en una muestra.

1 1. Una planta, semilla, célula de maíz recombinante o una parte de dicha planta que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10.

12. La planta, semilla, célula de maíz recombinante o parte de dicha planta de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dicha planta, semilla, célula, o parte de planta de la misma tiene tolerancia selectiva de tejidos al tratamiento con el herbicida glifosato.

13. La planta, semilla, célula de maíz recombinante o parte de dicha planta de conformidad con la reivindicación 11 .caracterizada además porque cuyo genoma produce un amplicón que comprende una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10 al analizarla en un método de amplificación de ADN.

14. Una planta o semilla de maíz, donde dicha planta o semilla de maíz deriva del evento transgénico de maíz MON 87427, del cual se ha depositado una muestra representativa bajo el No. de acceso ATCC No. PTA-7899.

15. La planta o semilla de maíz de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha planta o semilla de maíz es una híbrida que tiene por lo menos un progenitor derivado del evento transgénico de maíz MON 87427.

16. Un material de plantas no vivo que comprende una molécula de ADN recombinante seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10.

17. Un microorganismo que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10.

18. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho microorganismo es una célula vegetal.

19. Un producto de consumo producido a partir del evento transgénico de maíz MON 87427 y que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10, en donde la detección de dicha secuencia de nucleótidos en una muestra derivada de dicho producto de consumo es determinante de que dicho producto de consumo ha sido producido a partir de dicho evento transgénico de maíz MON 87427.

20. El producto de consumo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho producto de consumo es seleccionado del grupo que consiste en semillas enteras o procesadas, pienso animal, aceite, sémola, harina, copos, salvado, biomasa y productos combustibles.

21. Un método para producir el producto de consumo de acuerdo con la reivindicación 19, donde dicho método comprende: a. obtener una planta de maíz o parte de la misma que comprende el evento transgénico de maíz MON 87427; y b. producir un producto de consumo de maíz a partir de la planta de maíz o parte de la misma.

22. Un método para combatir malezas en un campo que comprende plantar Plantas MON 87427 en un campo y aplicar una dosis efectiva del herbicida glifosato para combatir las malezas en dicho campo sin dañar dicha planta con el evento transgénico MON 87427.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha dosis efectiva del herbicida glifosato es de aproximadamente 0.1 libra a aproximadamente 4 libras por acre (de 0.11 kg/ha) a 4.48 kg/ha).

24. Un método para producir una planta de maíz que tolera la aplicación del herbicida glifosato que comprende: a. cruzar sexualmente una planta con el evento transgénico MON 87427 que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10 con una segunda planta de maíz, para producir así semillas; b. recolectar dicha semilla producida por dicha cruza; c. cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie; d. tratar dichas plantas de la progenie con glifosato y e. seleccionar una planta de la progenie tolerante al glifosato.

25. Un método para producir una planta de maíz que tolera la aplicación del herbicida glifosato, que comprende: a. autofecundar una planta con el evento transgénico MON 87427 que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-10, para producir así semilla; b. recolectar dicha semilla producida por dicha autofecundación; c. cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie; d. tratar dichas plantas de la progenie con glifosato y e. seleccionar una planta de la progenie tolerante al glifosato.

26. Un método para producir semillas híbridas de maíz, que comprende: a. plantar semillas con el evento transgénico de maíz MON 87427 en un área; b. cultivar una planta de maíz a partir de dicha semilla; c. tratar dicha planta con una dosis efectiva del herbicida glifosato con anterioridad a la formación del polen para que dicha planta se torne estéril masculino sin dañar dicha planta; d. fertilizar dicha planta con polen de una segunda planta progenitora y e. cosechar la semilla de dicha planta, donde dicha semilla es semilla de maíz híbrido producida por la cruza de una planta con el evento transgénico MON 87427s con una segunda planta progenitora.

27. El método de conformidad con la reivindicación reivindicación 26, caracterizado además porque dicha dosis efectiva del herbicida glifosato es de aproximadamente 0.1 libra a aproximadamente 4 libras por acre (de 0.11 a 4.48 kg/ha).

28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque comprende también plantar la semilla de una segunda planta progenitora en dicha área y cultivar una planta de maíz a partir de dicha segunda planta progenitora.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicha segunda planta progenitora es tolerante al glifosato.

30. Un método para predecir el momento del desarrollo de las panojas de maíz que comprende seleccionar un rango de una Escala de Desarrollo Relativo, endonde dicho rango indica la maduración hasta una etapa de desarrollo pretendida de las panojas.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha etapa de desarrollo pretendida de las panojas es la etapa de desarrollo óptima de las panojas para la cruza reproductiva, la esterilización de las panojas, el despanojado o la administración de un tratamiento modulador del desarrollo a una planta de maíz.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la etapa especifica de desarrollo de las flores utilizada para construir dicha Escala de Desarrollo Relativo es la del polen diseminado correspondiente a aproximadamente 50 por ciento de una población de plantas de maíz y donde dicho rango es de aproximadamente 0.62 y aproximadamente 0.75 en dicha Escala de Desarrollo Relativo.

33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque también comprende la administración de un tratamiento modulador del desarrollo a una planta de maíz en dicha etapa de desarrollo pretendida de las panojas.

34. Un método para producir semilla híbrida de maíz que comprende: a. plantar semillas de maíz correspondiente a una primera planta progenitora en un zona; b. cultivar dicha primera planta progenitora a partir de dicha semilla de maíz; c. determinar el momento del desarrollo de las panojas correspondiente a dicha primera planta progenitora mediante la selección de un rango que indica la maduración hasta una etapa de desarrollo pretendida de las panojas en una Escala de Desarrollo Relativo; d. usar dicha determinación del momento del desarrollo de las panojas para administrar de manera oportuna un tratamiento modulador del desarrollo a dicha primera planta progenitora, previniendo así la autofertilización de dicha primera planta progenitora; e. administrar dicho tratamiento modulador del desarrollo a dicha primera planta progenitora; f. fertilizar dicha primera planta progenitora con polen de una segunda planta progenitora; y g. cosechar la semilla de dicha primera planta progenitora, donde dicha semilla es semilla híbrida de maíz producida por la cruza de dicha primera planta progenitora con dicha segunda planta progenitora.

35. La semilla de maíz híbrido producida utilizando el método de conformidad con la reivindicación 34.

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque dicho tratamiento modulador del desarrollo es glifosato y dicha primera planta progenitora tiene tolerancia al glifosato selectiva de los tejidos.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque dicha primera planta progenitora es una planta con el evento transgénico MON 87427.

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicha segunda planta progenitora es tolerante al glifosato.