MX2008008171A - Uso de dha epa o epa derivado de dha para tratamiento de una patologia asociada al daño celular oxidante. - Google Patents
Uso de dha epa o epa derivado de dha para tratamiento de una patologia asociada al daño celular oxidante.Info
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Abstract
La presente invención se refiere al uso de un ácido enriquecido con ácido docosahexaenoico (DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA) o EPA derivado de DHA para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de procesos que comprenden el daño oxidativo relacionado. En particular, el mismo es para el tratamiento de procesos relacionados con patologías neurodegenerativa, ocular, isquemica e inflamatoria, arterosclerosis con daño oxidativo a ADN y con ejercicio físico.
Description
USO DE DHA, EPA O EPA DERIVADO DE DHA PARA TRATAMIENTO DE UNA PATOLOGIA ASOCIADA AL DAÑO
CELULAR OXIDANTE
Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de un aceite enriquecido en ácido docosahexaenoico (DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA) o EPA derivado de DHA para la fabricación de un medicamento para tratamiento de procesos que llevan asociado un daño oxidante. Antecedentes de la Invención Los ácidos grasos omega-3 son necesarios para mantener la integridad funcional celular, y en general son necesarios en la salud humana. El ácido docosahexaenoico (22:6 n-3, DHA), un componente omega-3 importante del aceite de pescado y de las algas marinas, se concentra en el cerebro, en los fotorreceptores y en la sinapsis de la retina. Dietas enriquecidas en DHA son metabolizadas inicialmente por el hígado y después distribuidas a través de las lipoproteínas de la sangre para resolver las necesidades de los diferentes órganos. La administración de DHA se traduce en un aumento de su concentración a nivel tisular, induciendo además un incremento en la concentración del ácido omega-3 eicosapentaenoico (EPA) al cual está ligado metabólicamente, mientras que la administración de EPA sólo incrementa su concentración disminuyendo la de DHA a nivel
celular. En general, el DHA se incorpora en los fosfolípidos de la membrana celular y tienen efectos en la composición y en la funcionalidad de la misma, en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), en la oxidación lipídica de la membrana, en la regulación transcripcional, en la biosíntesis de eicosanoides y en la transducción intracelular de la señal. Además, en el sistema nervioso central, el DHA está implicado en el desarrollo de la capacidad de aprendizaje relacionada con la memoria, en las funciones excitables de la membrana, en la biogénesis de las células fotorreceptoras y en la transducción de la señal dependiente de proteína quinasa. Una terapia dietética potencial estaría basada en la corrección de los niveles óptimos de ácidos grasos omega-3 para evitar que determinadas patologías puedan originarse o progresar, tal como patologías inflamatorias, procesos tumorales, enfermedades cardiovasculares, depresión y enfermedades neurólógicas. En el sistema nervioso central, tanto el cerebro como la retina, exhiben una capacidad inusual de retención del- DHA incluso en situaciones de privación dietética muy prolongada de ácidos grasos omega-3. Varios estudios han descrito el efecto protector del DHA en las neuronas, donde está presente en niveles muy altos. Por ejemplo, está implicado en la protección de las células neuronales de la muerte por apoptosis. Recientemente, se ha demostrado que el DHA, que se encuentra
disminuido en el hipocampo de ratas envejecidas, es capaz de proteger cultivos primarios de las células contra la citotoxicidad inducida por el glutamato. También se ha demostrado que en los fotorreceptores de la retina, el DHA modula los niveles de las proteínas pro- y anti-apoptóticas de la familia Bcl-2. Los segmentos externos del fotorreceptor de la retina contienen rodopsina así como el contenido más alto en DHA que cualquier otro tipo de célula. El DHA se concentra en los fosfolípidos de las membranas externas del disco del segmento del fotorreceptor. Bajo condiciones de reducción de la concentración de DHA óptima se han observado disfunciones retinianas. La célula epitelial pigmentaria de la retina (RPE) es muy activa en la captación, conservación y transporte de DHA. El alto contenido de DHA en el fotorreceptor y en las células RPE está ligado principalmente a dominios en la membrana con unas características físicas que contribuyen a la modulación de receptores, canales iónicos, transportadores, etc., así como también parece regular la concentración de fosfatidilserina. Hasta la fecha no se conoce si estos efectos están totalmente mediados por el propio DHA o por algún derivado metabólico. Se han identificado en la retina. Aunque los enzimas implicados en la síntesis de los derivados no se han identificado con exactitud, hay resultados recientes que sugieren la participación de una fosfolipasa A2 (PLA2) seguida de una
lipoxigenasa (LOX). La PLA2 libera el DHA de los fosfolípidos de membrana y la LOX lo convierte en sus derivados metabólicamente activos. Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se producen durante la función celular normal. Los ROS incluyen el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical oxidrilo. Su alta reactividad química conduce a la oxidación de proteínas, del ADN o de lípidos. La superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutatión-peroxidasa (GPx) son las enzimas antioxidantes primarias que protegen contra el daño molecular y celular causado por la presencia de ROS. El estrés oxidante activa múltiples vías metabólicas; algunas son citoprotectoras, y otras conducen a la muerte de la célula. Estudios recientes indican que el desequilibrio entre la producción y la degradación de los ROS son factores de riesgo importantes en la patogénesis de muchas enfermedades en algunos casos relacionado con un deterioro del sistema antioxidante. El DHA se presenta como una diana de los ROS que provoca daño en la célula del fotorreceptor y en la RPE. La degeneración retiniana inducida por la luz promueve la pérdida de DHA de los fotorreceptores. Por ejemplo, cuando las células RPE están dañadas o mueren, se deteriora la función del fotorreceptor ya que las células RPE son esenciales para su supervivencia. Así, la muerte de la célula RPE por efecto del estrés oxidante deteriora la visión, particularmente cuando las células de la mácula están
afectadas ya que es la responsable de la agudeza visual. La patofisiología de muchas degeneraciones retinianas (e.g., degeneraciones maculares relativas a la edad y enfermedad de Stargardt) implica estrés oxidante que conduce a la apoptosis de las células de RPE. De hecho, la apoptosis de la célula RPE parece ser el factor dominante en la degeneración macular observada con la edad. Estos estudios sugieren que las células' han desarrollado mecanismos antioxidantes muy eficaces para protegerse de su alto contenido en DHA y presentan una notable capacidad adaptativa. Por otra parte, está perfectamente aceptada la relación entre los radicales libres y el envejecimiento, basado en las evidencias que los radicales libres producidos durante la respiración aerobia causan un daño oxidante que se acumula, y provoca una pérdida gradual de los mecanismos homeostáticos, una interferencia en los patrones de expresión génica y una pérdida de la capacidad funcional de la célula, lo que conduce al envejecimiento y a la muerte. Existe una interrelación entre la generación de oxidantes, la protección antioxidante y la reparación del daño oxidante. Se han realizado numerosos estudios para determinar si las defensas antioxidantes declinan con la edad. Entre ellos, el análisis de los principales componentes dé estas: actividad o expresión de las enzimas SOD, CAT, GPx, glutatión reductasa, glutatión-S-transferasa y la concentración de compuestos de bajo peso molecular con
propiedades antioxidantes. Por ejemplo, la sobreexpresión de SOD y CAT en Drosophila melanogaster aumenta la expectativa de vida un 30% y disminuye el daño por oxidación proteico. En este contexto, la exposición del tejido cutáneo in vitro e in vivo a los rayos UV genera radicales libres y otras especies reactivas del oxígeno, provocando estrés oxidante celular, que se ha documentado que contribuye de manera importante al envejecimiento. La exposición excesiva de la piel a la radiación ultravioleta puede dar lugar a un daño agudo o crónico. En condiciones agudas se puede provocar un eritema o quemaduras, mientras que en la sobreexposición crónica aumenta el riesgo de cáncer de piel y de envejecimiento. Además, se sabe que las células cutáneas pueden responder al estrés oxidante agudo o crónico aumentando la expresión de una variedad de proteínas, tales como las enzimas que están implicadas en el mantenimiento de la integridad de la célula y la resistencia al daño oxidante. En la técnica se conoce que los telómeros son regiones de ADN no codificante ubicadas en los extremos de los cromosomas eucarióticos. Están constituidos por secuencias de ADN altamente conservadas, repetidas en tándem (TTAGGG)n y proteínas asociadas, y presentan una estructura especial que impide su unión a los extremos de otros cromosomas, previniendo la fusión telomérica. Cumplen un papel esencial en la preservación de la integridad cromosómica, protegiendo al ADN codificante de la acción enzimática y de su degradación, contribuyendo al
mantenimiento de la estabilidad cromosómica. En contraste con las secuencias codificantes que tienen una replicación semiconservativa, los telómeros sufren pérdidas progresivas de sus secuencias repetitivas durante las sucesivas divisiones celulares. Actualmente, se considera que se requiere un mínimo de longitud telomérica para mantener la función de los telómeros, y que cuando los mismos alcanzan un tamaño crítico tienen dificultades para separarse durante la mitosis, generando asociaciones teloméricas (TAS) e inestabilidad cromosómica. La inestabilidad cromosómica estaría relacionada con un aumento en la probabilidad de producir errores capaces de generar cambios genéticos de importancia. Por otro lado, debido a la multiplicidad de dobles enlaces, los ácidos grasos omega-3 se consideran dianas moleculares para la generación y propagación de los radicales libres durante los procesos de estrés oxidante relacionados con la generación de peróxidos lipidíeos. Hay resultados contradictorios obtenidos en diferentes estudios respecto a la susceptibilidad frente al estrés oxidante debido a la suplementación dietética con ácidos grasos omega-3. En algunos estudios en humanos, se ha observado un incremento de la oxidación de las LDL, mientras que en otros no se observó ningún efecto. En estudios con animales, el tratamiento con ácidos grasos omega-3 provoca un aumento o una disminución de la susceptibilidad a la oxidación de las LDL. Por otra parte, una sobreexpresión de los genes implicados en el
sistema de defensa ántioxidante se ha demostrado en hígado de ratones alimentados con una dieta enriquecida en el aceite de pescados durante 3 meses. Además, diferentes estudios in vitro con una línea celular de origen glial han demostrado que las membranas ricas en ácidos grasos omega-3 son más susceptibles al daño oxidante. La suplementación a largo plazo de estas células con altas concentraciones de DHA dio lugar a niveles incrementados de peróxidos lipidíeos en el medio de cultivo, y un mayor porcentaje de muerte celular por apoptosis inducida por la exposición a peróxido de hidrógeno. Sin embargo, se ha demostrado que la administración intramniótica de docosahexaenoato de etilo reduce la peroxidación lipídica en los cerebros fetales de las ratas. Este comportamiento se ha sugerido que es por un efecto secuestrante de radicales libres vía la activación de enzimas antioxidantes. Un aumento en la capacidad antioxidante del cerebro es importante para la defensa endógena primaria contra el estrés oxidante porque el cerebro es relativamente rico en ácidos grasos poliinsaturados y es relativamente pobre en enzimas antioxidantes. Estos resultados contradictorios sugieren que la hipótesis basada en la premisa de que la oxidación de un ácido graso aumenta como el número de enlaces dobles, no tiene aplicabilidad in vivo ya que otros mecanismos potenciales pueden actuar para la disminución del daño oxidante tales como una
estructura tridimensional de los ácidos grasos omega-3 en los lípidos y en las lipoproteínas de la membrana que hacen los dobles enlaces menos susceptibles al ataque de los ROS, la inhibición de enzimas pro-oxidantes como la PLA2. o la mayor expresión de enzimas antioxidantes. Por otro lado, la idea de asociar ejercicio físico con la producción de radicales libres proviene de comienzos de los años 80 debido a la observación del daño en los lípidos de membrana durante fenómenos de isquemia-reperfusión en tejidos hipóxicos (véase Lovlin y col., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 1987; 56 (3); 313-6). Al mismo tiempo se observó un aumento del cociente GSSG/GSH en las células musculares de rata (véase Lew H y col. FEBS Lett, 1985; 185 (2): 262-6, Sen CK y col., J. Api. Physiol. 1994; 77(5): 2177-87) así como en sangre de humanos (véase MacPhail DB y col., Free Radie Res Commun 1993; 18(3):177-81 , Gohil K. y col. J. Appl Physiol. 1988 Jan; 64(1): 115-9). Los radicales libres afectan también al ADN y el ejercicio físico agudo aumenta el daño en el ADN, tal como se evidencia por el aumento de 8-OhdG. El esfuerzo físico extenuante (correr una maratón) produce daño al ADN evidenciable durante varios días después de la prueba y lesiona células inmunocompetentes (lo que puede estar relacionado con la disminución inmunitaria que se constata en deportistas tras una prueba de este tipo). Sin embargo, otros autores no observaron efectos (salvo
daños menores) tras nadar durante 90 minutos, correr durante 60 minutos o realizar un esfuerzo extenuante remando. Al mismo tiempo, investigaciones realizadas en deportistas entrenados y desentrenados no encontraron diferencias en la excreción urinaria de 8-oxo-dG, incluso, los que encontraron tal daño, consideraron que puede ser secundario a reacciones posteriores al esfuerzo y no a la acción del ejercicio sobre el ADN de forma aguda. El hecho de que el ejercicio físico intenso produce estrés oxidante es algo universalmente aceptado, sin embargo su origen no está bien determinado. Los estudios realizados con ácidos grasos n-3 en relación con el rendimiento deportivo se centraron en el efecto antiinflamatorio y, de hecho, los primeros ensayos buscaron la posible acción de estos nutrientes mejorando la . absorción alveolo-capilar al disminuir la bronconstricción inducida por el ejercicio físico intenso. En este sentido, Mickleborough observó que al suministrar una dieta de 3,2 g de EPA y 2,2 g de DHA se atenuaban las citocinas proinflamatorias disminuyendo la presencia de TNF-a y de I L - 1 ß en atleta de élite, al tiempo que disminuía la broncoconstricción. Walser relacionó los efectos vasculares de los ácidos grasos n-3 con efectos positivos en personas con intolerancia al ejercicio físico. En este mismo sentido van Houten y col. estudiaron que una ingesta alta de ácidos grasos n-3 se asociaban con una mejor recuperación en pacientes que realizaban rehabilitación cardíaca tras un síndrome
coronario. La ausencia de resultados positivos sobre el rendimiento físico en estos estudios analizados se debe a que se ha evaluado a pacientes, no a personas sanas, y que lo que se ha investigado son efectos vasculares y antiinflamatorios. Al mismo tiempo se han realizado investigaciones en base al siguiente concepto teórico: si aumentan los ácidos grasos libres en plasma por encima de 1 mmol/L (lo que ocurre cuando el glucógeno se agota), la competencia con el transporte de triptófano hace que éste aumente con el posterior aumento de serotonina, neurotransmisor relacionado con la llamada "fatiga central" en los deportes de larga duración. En este sentido, se sabe que los ácidos grasos n-3 disminuyen la cantidad de ácidos grasos libres en plasma probablemente regulando al alza la oxidación de ácidos grasos mediante la activación del factor nuclear de transcripción PPARa. Sin embargo, estos ensayos no fueron satisfactorios, así Huffman (2004) utilizando una dosis de 4 g de ácido grasos n-3 (cápsulas de 500 mg conteniendo 300 mg de EPA y 200 mg de DHA) realizó un estudio en corredores populares de ambos sexos no encontrando disminuciones de TRP libre ni menor percepción del esfuerzo, ni aumento del rendimiento de forma estadísticamente significativa, aunque si existía una tendencia estadística a mejorar el rendimiento en los sujetos que consumieron ácidos grasos n-3, dejando los autores la posibilidad de que fuera el bajo número de sujetos estudiados
(5 hombres y 5 mujeres) lo que había disminuido potencia estadística al estudio. Otra investigación posterior en la que se evaluó la eficacia de los ácidos n-3 en relación con el rendimiento no encontró diferencias significativas utilizando aceite de maíz como placebo. Raastad administrando 1,60 g de EPA y 1,04 g de DHA al día durante varias semanas, no encontró mejorías en jugadores de fútbol (véase, Raastad y col. Scand J Med Sci Sports 1997; 7(1): 25-31). Por otro lado, se conoce que los ácidos grasos libres interfieren con la utilización de la glucosa en el músculo, puesto que sus homólogos a nivel intracelular, los acil-CoA en las mitocondrias inhiben la piruvato deshidrogenasa (inhibición por producto), asimismo, estimulan la glucogenolisis y la gluconeogénesis, causando una suave hiperglucemia durante el ayuno, de hecho, la infusión continua de ácidos grasos poliinsaturados durante el ayuno ayuda a mantener la glucemia, quizás activando la glucosa-6-fosfatasa a nivel hepático. También se sabe que la composición de los ácidos grasos en el músculo altera la sensibilidad a la insulina, indicando que un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática mejora la sensibilidad a la insulina y un alto contenido de ácidos grasos saturados produce un efecto contrario. El ejercicio incrementa la captación de glucosa, la perfusión capilar, la velocidad de síntesis de glucógeno y la sensibilidad a
la insulina. Durante la contracción muscular se producen cambios en la temperatura, el pH intracelular, en la relación ATP/ADP, así como en la concentración intracelular del Ca++ y otros metabolitos que podrían actuar como mensajeros en la regulación del funcionamiento celular con el ejercicio. En este sentido, el Ca++, regula numerosas proteínas intracelulares, incluyendo calmodulina kinasa, proteína kinasa C (PKC) y calcineurina que son importantes intermediarios en las señales de transducción intracelular. En el ejercicio aerobio, se inactiva la acetil-CoA carboxilasa por la AMP quinasa (AMPK) lo que conlleva una caída en los niveles de malonil-CoA, desinhibiendo carnitina palmitol transferasa con el consecuente aumento del transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria (favoreciendo así la oxidación de ácidos grasos). Los efectos de la activación de AMPK probablemente incluyen el estímulo de la expresión de GLUT4 y hexoquinasa, así como de enzimas mitocondriales. Sin embargo, sorprendentemente, la activación de AMPK no es la única vía (independiente de la insulina) en la cual el ejercicio aumenta la respuesta a la glucosa en el músculo esquelético. Véase Mora y Pessin, J. Biol. Chem. 2000; 275 (21): 16323-16328, demostraron que el incremento de la respuesta a la glucosa en el músculo, de hecho, existen factores de transcripción como MEF2A y MEF2D que activan el GLUT4, y estos factores se activan con el ejercicio.
El aumento de lípidos intramusculares es común a los
estados de obesidad y entrenamiento físico, pero el resultado es que en los obesos se asocia a la resistencia a la insulina, mientras que en los deportistas la gran actividad de la carnitina palmitoil transferasa hace que los ácidos grasos deriven a la beta oxidación. Existen fuertes evidencias de que una dieta rica en ácidos grasos n-3, aun aumentando la glucemia y la insulinemia (señales de resistencia a la insulina), actúan a nivel del receptor de la insulina manteniendo el nivel de translocación de la proteína GLUT-4, lo cual se ha visto de manera específica con el DHA (véase, Jaescchke H. Proc. Soc Exp Biol. Med 1995; 209: 104-11). Descripción de la Invención La presente invención concierne al hallazgo inesperado de que la administración de ácido docosahexaenoico (de aquí en adelante también referido como DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA) o EPA derivado de DHA ya sea libre o incorporado en un triglicérido, entre otros, actúa como un antioxidante celular. De la misma manera y teniendo en cuenta la relación metabólica entre el DHA y el EPA (retroconversión de DHA a EPA), todos los efectos descritos posteriormente observados para la administración de DHA deben ser aplicables a sistemas mixtos DHA/EPA o incluso a sistemas monocomponentes de EPA, aunque no se nombre específicamente ej EPA. Por lo tanto, es objeto de la presente invención la utilización del ácido docosahexaenoico para la fabricación de una
composición farmacéutica destinada al tratamiento del daño celular oxidante. Otro objeto de la presente invención es la utilización de ácido docosahexaenoico (DHA) en una posición específica del esqueleto de un glicérido, estando las otras dos posiciones del glicérido también especificadas en su composición para el tratamiento del daño celular oxidante. Un objeto adicional de la presente invención es la utilización de ácido docosahexaenoico (DHA) para la fabricación de una composición destinada al tratamiento del daño celular oxidante a nivel de ADN. En particular, la utilización de DHA tiene aplicación como agente protector en el proceso natural de acortamiento de los telómeros, provocando un acortamiento más lento de los telómeros durante la replicación del ADN en una situación de estrés oxidante, y como agente inhibidor de la senescencia prematura, provocada por ROS, en un tratamiento de daño celular oxidante. Es también objeto de la presente invención la utilización de ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición destinada al tratamiento del envejecimiento celular y de patologías hereditarias que llevan asociados desórdenes en la cadena respiratoria mitocondrial, así como una composición destinada al tratamiento del Síndrome de Down. Otro objeto adicional de la presente invención es la utilización de ácido docosahexaenoico (DHA) para la fabricación
de una composición destinada al tratamiento del daño celular oxidante asociado con el ejercicio físico. En particular, la utilización de DHA tiene aplicación como agente potenciador del rendimiento deportivo y regulador de los niveles de glucosa en sangre durante el esfuerzo físico. Es también objeto de la presente invención la utilización de ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición destinada a la mejora del rendimiento deportivo, así como una composición para mantener los niveles de glucosa en sangre (normoglucemia) durante un esfuerzo físico mediante, principalmente, la administración de un alimento, un producto lácteo o cualquiera de las formas de administración adecuadas utilizadas habitualmente por gente que realiza ejercicio físico. En la presente invención, la expresión "daño celular oxidante" significa todo proceso que conlleva un desequilibrio entre la generación y degradación de especies oxidantes celulares con un origen endógeno u exógeno. Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han encontrado que el DHA es capaz de inhibir la producción de especies reactivas al oxígeno (ROS), tanto relacionadas con una inducción dependiente de peróxidos como de superóxidos. Concretamente disminuye la producción de anión superóxido y con ello de todas las especies derivadas que se obtienen en la cascada oxidante, como por ejemplo una disminución muy importante de la peroxidación lipídica. Además, se ha
determinado un incremento en la actividad enzimática antioxidante, lo que sugiere una adaptación de la célula induciendo la expresión de agentes antioxidantes, básicamente enzimas, y reprimiendo la expresión de agentes prooxidantes como la fosfolipasa A2. En una modalidad de la presente invención, el ácido docosahexaenoico está incorporado en un monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fosfolípido, éster etílico o ácido graso libre. Preferiblemente, el ácido docosahexaenoico está incorporado en un triglicérido. En la presente invención por "ácido docosahexaenoico incorporado en un glicérido" se entiende un monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fosfolípido, con al menos una de las tres posiciones esterificadas con un ácido docosahexaenoico, y opcionalmente, con al menos una de las restantes posiciones esterificadas además con un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena corta, media o larga y un ácido fosfórico. Preferiblemente, el glicerol es un triglicérido. La elección del triglicérido como estructura química del DHA se basa en los datos derivados de un estudio en el que se comparaba la biodisponibilidad de cuatro concentrados de ácidos omega-3 en forma de esteres etílicos, fosfolípidos, ácidos grasos libres y triglicéridos después de una administración oral, y que demostraron que los triglicéridos reesterificados presentan una biodisponibilidad superior a las otras preparaciones.
En una modalidad preferida de la presente invención, el ácido docosahexaenoico se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 20 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos, preferiblemente entre el 40 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos y más preferiblemente el ácido docosahexaenoico se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 66 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos. En otra modalidad preferida, el ácido docosahexaenoico está incorporado en por lo menos una posición específica de un glicerol mediante un enlace éster, un lípido estructurado, para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del daño celular oxidante. El glicerol puede comprender, además, por lo menos un ácido graso y/o un ácido fosfórico de manera que estando el ácido docosahexaenoico incorporado en una posición seleccionada entre sn-1, sn-2 y sn-3 puede comprender además, opcionalmente, por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena corta y/o cadena media y un ácido fosfórico, y estando incorporado en la posición sn-2 puede comprender además, opcionalmente, por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso y un ácido fosfórico. En este sentido, cuando se refiere al término "opcionalmente" se entiende que el ácido docosahexaenoico incorporado en una posición seleccionada entre sn-1, sn-2 y sn-3 puede o no comprender además por lo menos un ácido
seleccionado entre un ácido graso de cadena corta y/o cadena media y un ácido fosfórico, o bién que el ácido docosahexadecanoico incorporado en la posición sn-2 puede o no comprender además por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena larga y un ácido fosfórico. Sorprendentemente, los autores de la presente invención han encontrado que la utilización de gliceroles estructurados, donde se ha seleccionado la posición del ácido docosahexaenoico y la composición del resto de compuestos unidos al glicerol, conduce a un incremento inesperado, de por lo menos el doble e incluso el triple, de la eficacia terapéutica de la utilización del ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del daño celular oxidante. La definición común se refiere a grasas que contienen los ácidos grasos situados en posiciones específicas en el esqueleto del glicerol. Por similitud con la biodistribución ¡n vivo de los ácidos grasos, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) de cadena larga se localizan preferencialmente en la posición sn-2 del glicerol y teniendo en cuenta el proceso de absorción intestinal, los triglicéridos son hidrolizados por las lipasas a ácidos grasos libres, di- y monoglicéridos, de los cuales los ácidos grasos y los sn-2 monoglicéridos son absorbidos directamente por las células epiteliales intestinales, llamadas enterocitos. Mediante la utilización de ácido docosahexaenoico
incorporado en una posición específica del esqueleto de un glicerol, mediante un enlace éster, proporciona mayor bioactividad, mayor protección antioxidante a igual porcentaje molar respecto al total de ácidos grasos y menor dependencia de la dosis de administración con respecto al efecto antioxidante del ácido docosahexaenoico en un glicérido. Ventajosamente, los autores de la presente invención han encontrado que la utilización de ácido docosahexaenoico incorporado en una posición del glicerol seleccionada entre sn-1 , sn-2 y sn-3 y, opcionalmente, comprendiendo además el glicerol por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena corta y/o cadena media y un ácido fosfórico, proporciona mayor bioactividad, mayor protección antioxidante a igual porcentaje molar respecto al total de ácidos grasos y menor dependencia de la dosis de administración con respecto al efecto antioxidante del ácido docosahexaenoico en un glicerol. También ventajosamente, los autores de la presente invención han encontrado que la utilización de ácido docosahexaenoico incorporado en la posición sn-2 de un glicerol y, opcionalmente, comprendiendo además el glicerol por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena larga y un ácido fosfórico también proporciona mayor bioactividad, mayor protección antioxidante a igual porcentaje molar respecto al total de ácidos grasos y menor dependencia de la dosis de administración con respecto al efecto antioxidante del ácido
docosahexaenoico en un glicerol. Preferiblemente, los ácidos también presentes en un glicerol con el ácido docosahexaenoico serán ácidos grasos de cadena corta (de 1 a 8 átomos de carbono) o media (de 9 a 14 átomos de carbono) o un ácido fosfórico puesto que éstos no presentan actividad funcional sino sólo energética y por lo tanto no competirán con el ácido docosahexaenoico. Por lo tanto, todavía más preferiblemente, la presente invención se refiere a la utilización de ácido docosahexaenoico incorporado en un glicerol donde una de las posiciones sn-1 y sn-3 están libres o ocupadas por un ácido graso de cadena media (de 9 a 14 átomos de carbono) - o cadena corta (de 1 a 8 átomos de carbono) o un ácido fosfórico y cuya prosición sn-2 está ocupada por el DHA funcional. De esta manera se consigue aumentar todavía más la biodisponibilidad del DHA ya que se absorbe más eficientemente en las células intestinales. Por lo tanto, la síntesis de glicéridos estructurados donde el ácido docosahexaenoico se ha incorporado en cualquier posición del glicerol cuando éste no compite con otros ácidos grasos y donde el ácido docosahexaenoico se ha incorporado en la posición sn-2 del glicérido cuando éste compite con por lo menos un ácido graso presenta mejoras con respecto a su efecto antioxidante y, por lo tanto, es una forma preferible para la fabricación de una composición destinada al tratamiento del daño celular oxidante.
Los inventores de la presente invención han comprobado que una célula enriquecida con una composición con DHA, de acuerdo con la invención, está mejor preparada para hacer frente a una nueva situación de estrés oxidante y minimizar de esta forma los efectos adversos que de ella se puedan derivar. Es decir, la presencia del DHA en las biomembranas induce una respuesta adaptativa celular frente al estrés oxidante. La respuesta adaptativa es un fenómeno celular por el cual la exposición a un agente tóxico (en concentraciones subletales) provoca una respuesta celular que protegerá posteriormente a la célula contra los efectos deletéreos del mismo tóxico a concentraciones letales, el en otras palabras, es un efecto benéfico desencadenado con bajo nivel de exposición a un agente que es dañino a altos niveles. La administración de DHA posee las siguientes ventajas sustanciales: a) Incremento de la actividad antioxidante celular; b) Ausencia de citotoxicidad celular a las dosis administradas; c) Ausencia de modificaciones significativas en el status oxidante celular a las dosis administradas; d) Actividad antioxidante celular adaptativa. Por todo lo anterior, en una modalidad preferida la presente invención se refiere a la utilización del ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al
tratamiento de una patología asociada al daño celular oxidante, siendo la patología una patología neurodegenerativa, preferiblemente seleccionada del grupo que comprende: esclerosis múltiple, Alzheimer, Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular, entre otras. En otra modalidad de la presente invención, la patología asociada a un daño oxidante es una patología ocular, preferiblemente una seleccionada del grupo que comprende retinosis pigmentaria, degeneración macular y cataratas, entre otras. En aún otra modalidad, la patología asociada con un daño oxidante es una patología isquémica, preferiblemente un infarto de miocardio, infarto cerebral, etc. En todavía aún otra modalidad de la presente invención, la patología asociada con un daño oxidante es un proceso inflamatorio, preferiblemente seleccionado del grupo que comprende artritis, vasculitis, glomerulonefritis y lupus eritomatoso, entre otras. ' En otra modalidad preferida, la patología asociada a un daño oxidante es ateroesclerosis. Otro aspecto de la presente invención es la utilización del DHA como agente protector en el proceso natural de acortamiento de los telómeros, y como agente inhibidor de la senescencia prematura. Los mecanismos que producen las asociaciones teloméricas
(TAS) son aún desconocidos pero los autores de la presente invención sugieren que éstos podrían estar asociados al déficit en la actividad de la enzima telomerasa que sintetiza las secuencias repetitivas de ADN características de los telómeros, estabilizando así la longitud de los mismos. La telomerasa es muy activa en células fetales, pero presenta poca actividad en las células de los tejidos de adultos. Las TAS han sido raramente encontradas en células normales, por el contrario, se las ha observado en células infectadas por virus o tumorales. Se ha determinado que existe una reducción progresiva del número de repeticiones teloméricas in vitro, así como en función del envejecimiento celular, in vivo, que lleva asociado una inhibición de la actividad de telomerasa en la senescencia. Así mismo, los autores de la presente invención han estudiado la longitud telomérica en fibroblastos y linfocitos de personas sanas centenarias, encontrando un acortamiento telomérico durante la propagación in vitro de los fibroblastos, así como una correlación inversa entre las longitudes teloméricas y la edad del donante. Aunque el acortamiento de los telómeros ocurre de forma natural con la replicación celular, se ha observado una senescencia prematura y roturas de los telómeros cuando se induce daño oxidante en el ADN. Los telómeros son más sensibles al daño oxidante y sus roturas se reparan menos eficazmente que otras partes del genoma. Esto conduce a una
acumulación del daño telomérico, que produce un acortamiento más rápido durante la replicación del ADN que reduce la esperanza de vida replicativa celular. Las especies reactivas del oxígeno (ROS), particularmente aniones superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales del oxidrilo, pueden acelerar las pérdidas en los telómeros durante la replicación en algunos tipos celulares aunque también inducen senescencia prematura independientemente del acortamiento de los telómeros. Sorprendentemente, los autores de la presente invención han encontrado que la utilización del ácido docosahexaenoico en un tratamiento del daño celular oxidante a nivel de ADN permite disminuir la velocidad de acortamiento de los telómeros y, por tanto, inhibir la senescencia celular. Los presentes inventores han encontrado una correlación inversa entre la velocidad de acortamiento del telómero y la capacidad antioxidante celular en más de 20 cepas humanas de fibroblastos. La mayoría de los parámetros celulares de estos fibroblastos prematuramente envejecidos son idénticos al envejecimiento normal de las células (morfología, acumulación del lipofuscina y cambios en la expresión génica). Los fibroblastos con menor defensa antioxidante acortan sus telómeros más rápidamente y viceversa. La velocidad de acortamiento del telómero es más alta en células con una defensa antioxidante más baja. Además, los secuestrantes de radicales libres disminuyen la velocidad de acortamiento del telómero.
Estos datos están en concordancia con los que demuestran un papel importante de las enzimas antioxidantes, glutation peroxidasa y superóxido dismutasa, en la velocidad de acortamiento de los telómeros en fibroblastos humanos. Estos datos confirman que la longitud de los telómeros está determinada principalmente por la relación entre el estrés oxidante y la capacidad de la defensa antioxidante celular. Así, la longitud de los telómeros dependiente de la edad es una medida acumulativa de la historia del daño oxidante que una célula ha experimentado a lo largo de su vida. Una correlación entre el estrés oxidante y la velocidad en el acortamiento de los telómeros se ha demostrado para patologías hereditarias que llevan asociadas desordenes en la cadena respiratoria mitocondrial y para el Síndrome de Down. Por lo tanto, la relación existente entre el daño celular oxidante en el ADN y el acortamiento de los telómeros y su efecto en la senescencia celular permite utilizar el ácido docosahexanoico como un potente agente protector en el proceso natural de acortamiento de los telómeros e inhibidor de la senescencia prematura. Por otro lado, el uso de enzimas para la producción de aceites enriquecidos en ácidos grasos omega-3 tiene diversas ventajas respecto a otros métodos basados en una síntesis química y posteriores procesos de purificación (separaciones cromatográficas, destilaciones moleculares, etc.). Estos últimos
requieren condiciones extremas de pH y altas temperaturas que pueden parcialmente destruir los dobles enlaces all-cis de los PUFAs omega-3 por oxidación, por isomerización cis-trans o por migración del doble enlace. Las condiciones suaves utilizadas en las síntesis enzimáticas (temperatura inferior a 50°C, pH entre 6-8 y menos reactivos químicos) proporciona una alternativa sintética que preserva la estructura original del PUFA omega-3 con un incremento en su selectividad estructural en los acilgliceroles, considerados como la estructura química más favorable desde un punto de vista nutricional. La composición farmacéutica que comprende DHA se puede encontrar en forma de aceite o emulsión, los cuales se pueden administrar por vía oral, sublingual, intravenosa, intramuscular, tópica, subcutánea, rectal o incluso por simple puesta en contacto con los órganos olfativos situados en la entrada de las vías respiratorias del principio activo de la microemulsión de la invención en forma liquida o de vapor. Así la administración puede realizarse por pulverización, nebulización o atomización de las microemulsiones o también la administración puede ser realizada por inhalación. Opcionalmente, la composición farmacéutica comprende, además, un segundo principio activo. De la misma manera, la composición farmacéutica que comprende DHA se puede utilizar en la industria alimentaria con el fin de enriquecer los productos alimenticios (p.e. productos
lácteos como yogures, leche, etc) con un agente antioxidante natural como el DHA. Por lo tanto, en otra modalidad la presente invención la composición farmacéutica se administra a un paciente que ya está recibiendo un tratamiento contra una patología asociada a un daño oxidante. Otro objetivo de la presente invención es la utilización del DHA como agente potenciador del rendimiento deportivo y regulador de los niveles de glucosa en sangre durante el esfuerzo físico. De esta manera, los autores de la presente invención han encontrado que de manera sorprendente, la utilización del ácido docosahexaenoico durante el ejercicio físico conduce a un aumento del rendimiento deportivo a la vez que mantiene los niveles de glucosa en sangre (glucemia) durante el esfuerzo físico (sin tomar carbohidratos). En este contexto de la presente invención, se entiende por "cicloturista" o "deportista no competitivo", cualquier persona que realiza ejercicio físico de forma espoxádica y no profesionalmente. Y por "deportista competitivo" o "deportista entrenado", cualquier persona que realiza ejercicio físico de forma habitual y/o a nivel profesional. Asimismo, se utilizan los términos "ejercicio físico" y "esfuerzo físico" de manera indistinta y equivalente, al igual que el término "deportista" que se utiliza para hombres y mujeres.
Rendimiento deportivo Con el fin de evaluar el rendimiento deportivo existen una serie de parámetros que permiten dar una valoración de si existe una mejora del rendimiento deportivo. En deportistas que realizan deportes aerobios se considera un aumento del rendimiento el incremento del porcentaje del consumo máximo de oxígeno %V02max en el UV 2 (umbral anaerobio), ya que el V02máx apenas aumenta durante la temporada competitiva en los deportistas muy entrenados. Pequeñas variaciones en el porcentaje del V02max en el umbral es un dato directamente relacionado con un aumento del rendimiento. Los presentes inventores han observado un incremento estadísticamente significativo del consumo de oxígeno (V02) tanto en valores absolutos (p<0.019) como relativos al peso (p<0.036) en el umbral ventilatorio 2 al comparar las pruebas de esfuerzo triangulares básales con las realizadas tras cuatro meses de tratamiento con DHA. El incremento de este parámetro se aprecia tanto en ciclistas que compiten (p<0.047) como en cicloturistas aunque en estos últimos no es estadísticamente significativo, (figura 24) Otro parámetro relacionado con un aumento del rendimiento deportivo es el aumento de la frecuencia cardíaca en la que se establece el UV 2 de la prueba de esfuerzo, ya que en el caso en que la frecuencia cardíaca en el umbral anaerobio aumenta, se
considera que el deportista es capaz de incrementar ligeramente su capacidad de mantener el metabolismo aerobio en intensidades más elevadas. Los presentes inventores han observado un incremento de la frecuencia cardiaca en el UV2 para una p = 0.082 al comparar el parámetro obtenido en la prueba basal con el obtenido en la prueba triangular tras 4 meses de ingesta de DHA. Este dato se observa mucho más marcadamente (p<0.017) en el subgrupo de ciclistas de alto nivel competitivo (Figura 25). En este mismo sentido, existe un aumento del tiempo que se tarda en alcanzar el UV 2 estadísticamente significativo (p<0.072) (Figura 26). Finalmente, la frecuencia cardíaca para un mismo nivel de esfuerzo es menor si el deportista está más entrenado aeróbicamente. Los presentes inventores han observado que en los ciclistas que consumen DHA la frecuencia cardiaca disminuye de forma estadísticamente significativa (p<0.043) cuando comparamos ese dato en ambas pruebas en el instante en que el deportista consume 2000 ml/min de 02 (Figura 27). Como conclusión de estos estudios se puede indicar que en deportistas que han tomado DHA durante 4 meses se ha observado un incremento en el consumo de oxígeno absoluto y relativo en el UV2 (p<0.008 y p<0.015 respectivamente), incremento en la carga correspondiente al UV2 (p<0.063) y descenso en la frecuencia cardiaca que el deportista mantiene
cuando presenta un consumo de oxígeno de 2000 ml/min (p<0.062). Todos estos son parámetros que nos indican un aumento del rendimiento deportivo después de la ingesta de 2,1 g/24 h de DHA (6 cápsulas de 500 mg al 70%), distribuidos en tres tomas diarias durante cuatro meses. Las cantidades se expresan a modo de ejemplo y no pretenden de ningún modo ser limitativas de la presente invención. También se analizaron diversas variables bioquímicas relacionadas con el daño oxidante después de las pruebas de esfuerzo: 1. Capacidad antioxidante total del plasma (CAT). Existe un incremento de la CAT de forma generalizada y estadísticamente significativa (p<0.05) durante la modalidad de las pruebas rectangulares. Estos incrementos. son mayores en los deportistas después de consumir tres semanas DHA, tanto al ser considerados' de forma global como en los ciclistas que compiten, no apareciendo esta diferencia entre la prueba basal y la prueba realizada a las 3 semanas de consumo de DHA por los cicloturistas (Figura 28) 2. Malonildialdehído (MDA). El MDA es el producto mayoritario de los obtenidos al hacer reaccionar los peróxidos lipidíeos producidos por el estrés oxidante con el ácido tiobarbitúrico. Se observa un incremento significativo del daño oxidante a lípidos plasmáticos durante la modalidad de todas las pruebas de esfuerzo (p<0.035). Tras la ingesta de 3 semanas de
DHA, el daño oxidante a lípidos durante la modalidad de la prueba de esfuerzo es menor que el inicial (p<0.05). Esta diferencia es mucho más acusada para deportistas entrenados que para cicloturistas (Figura 29) 3. 8-oxo-7,8-dihidro-2'-deoxiguanosina(8-oxodG). El 8-oxodG es un biomarcador del estrés oxidante. Existe un aumento del daño oxidante al ADN durante la modalidad de las pruebas de esfuerzo rectangular (p<0.011). Este daño oxidante disminuye tras la ingesta de DHA durante 3 semanas (p<0.035). Este descenso del daño oxidante es más acusado en los ciclistas que no compiten que en los ciclistas que compiten, aunque esta última diferencia no es significativa estadísticamemte (Figura 30) Estudios de glucemia Con el fin estudiar los niveles de glucosa en sangre sé realizó una prueba de esfuerzo rectangular en rodillo de bicicleta con carga máxima mantenida equivalente a una velocidad correspondiente al 75% de su V02max calculado en la prueba de esfuerzo triangular maximal, manteniendo constante la pendiente al 2%. La duración de la prueba es de 90 minutos y el consumo de agua durante la misma se realiza ad libitum. Al no ingerir bebidas con carbohidratos, lo esperable era una hipoglucemia. Esta hipoglucemia de la segunda extracción (a los veinte minutos de finalizar la prueba con respecto a la muestra inicial obtenida veinte minutos antes de empezar), se manifiesta en la primera prueba de esfuerzo, tal como era de
esperar. Sin embargo, los datos obtenidos después de un consumo de DHA de cuatro meses presentan un mantenimiento de la glucemia estadísticamente significativo, lo cual no ha sido observado anteriormente y supone un hallazgo sorprendente en la investigación realizada. De forma generalizada, se observa un descenso estadísticamente significativo (p<0.0009) de los niveles de glucosa sérica a lo largo de la prueba de esfuerzo rectangular. Sin embargo, este comportamiento es distinto dependiendo del tipo de deportista a analizar (p<0.003): en el caso de ciclistas que compiten habitualmente, no se aprecia, variación significativa en el descenso de glucemia durante las pruebas pero en el caso de los cicloturistas, el descenso de glucemia durante la prueba basal es mayor que el que ocurre en ciclistas que compiten habitualmente y tras consumo de DHA durante 3 semanas o cuatro meses, el descenso desaparece prácticamente (Figuras 31, 32 y 33) La normoglucemia durante una prueba de esfuerzo al 75% del V02max durante 90 minutos sin la ingesta de una bebida con carbohidratos supone un hallazgo que conecta el comportamiento del DHA durante el esfuerzo físico con el observado y ya comentado previamente en relación con el aumento de la sensibilidad a la insulina. En este sentido, Goodyear y Kahn, en 1998 concluyeron que los mecanismos moleculares subyacentes en la respuesta a la glucosa en el músculo esquelético por la
insulina o el ejercicio, son diferentes después de que en 1997 Winder y Hardie publicaran que la AMPK (AM P-activated protein kinase), estaba elevada en las fibras Ha durante el ejercicio, teniendo en cuenta que AMPK tiene un efecto pleiotrópico inactivando la acetil-CoA carboxilasa y favoreciendo el transporte de la glucosa entre otras acciones. Quizás esto explique el hallazgo de una respuesta glucémica distinta en el deportista a la esperable por los estudios realizados en sedentarios. Como conclusión de los estudios sobre la acción del DHA sobre el rendimiento deportivo y la glucemia se puede indicar lo siguiente: 1) Se ha demostrado que la ingesta continuada de DHA por encima de tres semanas produce un incremento de la Capacidad Antioxidante Total del Plasma (CAT) de forma generalizada y estadísticamente significativa (p<0.05) tanto en ciclistas de nivel competititvo como en amateur. Asimismo, el daño oxidante a lípidos es menor (p<0.05) (diferencia que es mucho más acusada para deportistas entrenados que para los cicloturistas). Finalmente, se ha observado que el daño al ADN medido con un marcador urinario (8-oxodG) disminuye tras la ingesta de DHA durante tres semanas (p<0.035). 2) Se ha demostrado que tras cuatro meses de ingesta continuada de DHA aumenta el rendimiento deportivo (aumenta la carga y frecuencia cardíacas, así como el porcentaje del V02max en el UV2). También se ha observado una normoglucemia
estadísticamente significativa en la prueba de esfuerzo de 90 minutos al 75% del V02max realizada a los cuatro meses de consumo de DHA. La unión de ambos efectos (aumento del rendimiento y normoglucemia durante un esfuerzo de larga duración), es un resultado no esperado ni conocido en la técnica anterior. Debemos concluir que esta asociación de efectos es deseable y puede suponer una ayuda ergogénica aún no conocida. Otro objeto de la presente invención es la utilización de ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición destinada a la mejora del rendimiento deportivo y el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre después de un ejercicio físico, administrado mediante cualquier medio adecuado.
Por otro lado, hay que tener en cuenta que El Comité Científico de la Alimentación de la Unión E.uropea recomienda los siguientes componentes en la composición de las bebidas para tomar durante la práctica deportiva (véase, http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scf/ out64_en.pdf). 80 kcal/1000 mi Energía 350 kcal/1000 mi
20 mmol/l (460 mg/l) Na + 50 mmol/l (1150 mg/l) 200 mOsml/kg agua Osmolalidad 330 mOsml/kg de agua Al menos el 75% de la Energía calórica debe provenir de carbohidratos con alta carga glucémica (glucosa, maltodextrina, sacarosa) Vitamina B1 0,2 mg/100 g de carbohidratos.
En este sentido, el hecho de incluir carbohidratos deriva del mantenimiento de la glucemia con el interés de evitar el rápido agotamiento del glucógeno muscular y hepático. Debe considerarse el inconveniente del vaciamiento gástrico disminuido debido al aumento de la osmolalidad que genera la presencia de concentraciones de carbohidrato, asociado a la sensación de plenitud gástrica que muchos deportistas no desean. Por consiguiente, preparar una bebida con menor concentración de carbohidratos añadiendo DHA podría significar una ventaja ergogénica de indudable interés en el rendimiento deportivo. Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende DHA que se puede utilizar en la industria alimentaria con el fin de enriquecer los productos alimenticios (p.e. productos lácteos como yogures, leche, etc) con un agente antioxidante natural como el DHA, o incluso, incorporado en una forma de administración adecuada seleccionada del grupo que comprende una bebida en todas sus características para antes, durante y después del ejercicio físico; barritas energéticas; barritas ergogénicas; sólidos y preparados para avituallamiento; complementos dietéticos y preparados polivitamínicos (en forma de, por. ejemplo, cápsulas, pastillas, comprimidos, liofilizados, o cualquier medio de administración adecuado); ayudas ergogénicas; textiles con nanocápsulas para absorción dérmica y cualquier otro medio de administración adecuado.
Descripción de las Figuras Figura 1. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la generación intracelular de ROS. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. (A) La detección de ROS se realizó con DHR 123 en células tratadas con 40 ó 60 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. (B) La detección de ROS se realizó con CDCFDA en células tratadas con el sistema xantina/xantina oxidasa durante 180 min. A modo de comparación se incorporan los datos obtenidos con Vitamina E (control) 100 µ?. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. Figura 2. Efecto comparativo de la riqueza en DHA de un triglicérido en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la generación intracelular de ROS. (A) Las células se han cultivado en presencia de cada triglicérido durante tres días antes del experimento. La concentración del eje de las abcisas es la equivalente que obtendría con un triglicérido de una riqueza en DHA del 70% en peso. La detección de ROS se realizó con DHR 123 en células tratadas con 40 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. (B) Representación de la protección antioxidante respecto a la concentración en DHA en el aceite del 20, 50 y 70%. Figura 3. Efecto de la concentración del DHA sobre la
producción de TBARS en células Foreskin. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA .respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento a la concentración indicada. El estrés oxidante se ha inducido con AAPH 40 mM durante 6 h y 24 h de latencia. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. Figura 4. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la generación de aniones superóxido. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La detección de aniones superóxido se realizó por quimioluminiscencia inmediatamente después de la inducción oxidante de las células con AAPH 40 mM y en algunos experimentos en presencia de Tirón 10 mM o de 0,1875 UA/µ? de SOD exógena. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Figura 5A. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la actividad SOD. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento a una concentración de DHA de 0.5 (A), 5 (B) y 50 µ? (C). La actividad SOD se ha evaluado de forma indirecta mediante el análisis del decremento de la
quimioluminiscencia generada por el luminol como consecuencia de la actividad SOD endógena. La inducción oxidante se ha realizado con el sistema xantina 0,1 mM / xantina oxidasa 0.005 U/ml que genera de forma inmediata aniones superóxido. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Figura 5B. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la actividad SOD. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad SOD se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Figura 6. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la actividad GPx. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad GPx se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Figura 7. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la generación intracelular de ROS. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. (A) La detección de ROS se realizó con DHR 123 (A) o con CDCFDA (B) en células tratadas
con 40 ó 60 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. Figura 8. Efecto comparativo de la riqueza en DHA de un triglicérido en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la generación intracelular de ROS. Las células se han cultivado en presencia de cada triglicérido durante tres días antes del experimento. La concentración del eje de las abcisas es la equivalente que se obtendría con un triglicérido de una riqueza en DHA del 70% en peso. La detección de ROS se realizó con DHR 123 en células tratadas con 40 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. (B) Representación de la protección antioxidante respecto a la concentración en DHA en el aceite del 20, 50 y 70%. Figura 9. Efecto de la concentración del DHA sobre la producción de TBARS en células ARPE-19. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento a la concentración indicada. El estrés oxidante se ha inducido con AAPH 40 mM durante 6 h y 24 h de latencia. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. Figura 10: Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la generación de aniones superóxido. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de
ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La detección de aniones superóxido se realizó por quimioluminiscencia inmediatamente después de la inducción oxidante de las células con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Figura 11. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la actividad GPx. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad GPx se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Figura 12. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la actividad SOD. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad SOD se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Figura 13. Efecto de la concentración de DHA obtenido por síntesis química (A y C) o enzimática (B y D) sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidante en células ARPE-19 (A y B) o Foreskin (C y D). Figura 14. Influencia del grado de purificación del aceite
obtenido por síntesis química sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidante inducido por el DHA en células ARPE- 9. Figura 15. Influencia de la estructura química sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidante inducido por el DHA en células ARPE-19. Figura 16. Efecto de la concentración de DHA sobre la concentración intracelular de glutation en células ARPE-19. Influencia de la presencia de BSO. Figura 17. Influencia de la síntesis de novo de glutation sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidante inducido por el DHA en células ARPE-19. Figura 18. Efecto de la concentración de DHA sobre la concentración intracelular de glutation en células Foreskin. Influencia de la presencia de BSO. Figura 19. Influencia del grado de purificación del aceite obtenido por síntesis química sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidante inducido por el EPA en células ARPE-19. Estudio comparativo con DHA. Figura 20. Efecto de la concentración de EPA sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidante en células Foreskin. Estudio comparativo con DHA. Figura 21. Efecto de la concentración de EPA sobre la concentración intracelular de glutation en células Foreskin. Influencia de la presencia de BSO.
Figura 22. Es una gráfica de barras comparativa del efecto del porcentaje de DHA en un triglicérido estructurado y no estructurado a diferentes dosis con respecto al porcentaje de protección de las células. La figura 22 muestra los resultados sorprendentes del objeto de la presente adición al comparar una estructura, química glicérido (triglicérido) no estructurada, respecto a la misma donde las posiciones sn-1 y sn-3 se han substituido por ácido caprílico (estructurada), ambos de origen enzimático con dos niveles iniciales en contenido en DHA del 20 y del 70%. A partir de la figura puede observarse que a la misma concentración el porcentaje de protección del ácido docosahexaenoico incorporado en la posición sn-2 de un glicérido (estructurado), en particular, de un triglicérido, presenta una eficacia de aproximadamente 3 veces superior a la de un glicérido que contiene DHA no estructurado. En la figura 22, el porcentaje de protección indica la relación entre la diferencia en la concentración ¡ntracelular de especies reactivas del oxígeno de las células control y las tratadas con DHA respecto a las control sometidas ambas al mismo estrés oxidante expresado en porcentaje. El de otro forma, la existencia de un porcentaje de protección indica en las células tratadas una menor generación ¡ntracelular de especies reactivas del oxígeno estadísticamente significativa respecto al control.
Figura 23. Es una gráfica comparativa de la longitud media del telómero en fibroblastos humanos cultivados bajo estrés oxidante con o sin DHA incorporado frente al número de pases de las poblaciones celulares. La figura 23 muestra los resultados sorprendentes del objeto de la presente adición al observarse que en presencia de DHA en una situación de estrés oxidante el índide de acortamiento de los telómeros es menor con respecto al control o sin DHA. La Figura 24 es la representación gráfica del consumo de oxígeno absoluto en el "umbral ventilatorio 2" (UV2) para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA. La Figura 25 es la representación gráfica de la frecuencia cardíaca en el UV2 para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA. La Figura 26 es la representación gráfica del tiempo para alcanzar el UV2 para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA. La Figura 27 es la representación gráfica de la frecuencia cardiaca durante el consumo de 2000 ml/min de oxígeno para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA. La Figura 28 es la representación gráfica de la capacidad antioxidante total del plasma para deportistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 3 semanas de
ingestión de DHA. En cada caso se indica la capacidad antioxidante antes (barra izquierda) y la capacidad antioxidante después (barra derecha) de la prueba de esfuerzo. La Figura 29 es la representación gráfica del daño oxidante a lípidos plasmáticos en función de la concentración de MDA para deportistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA. En cada caso se indica el daño oxidante antes (barra izquierda) y el daño oxidante después (barra derecha) de la prueba de esfuerzo. La Figura 30 es la representación gráfica del daño oxidante al ADN utilizando el biomarcador del estrés oxidante 8-oxodG para deportistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 3 semanas de ingestión de DHA. En cada caso se indica el daño oxidante antes (barra izquierda) y el daño oxidante después (barra derecha) de la prueba de esfuerzo. La Figura 31 es la representación gráfica de la glucemia en deportistas que compiten durante un esfuerzo físico que no han tomado DHA o lo han hecho durante 3 semanas o 4 meses. La Figura 32 es la representación gráfica de la glucemia en deportistas que no compiten durante un esfuerzo físico que no han tomado DHA o lo han hecho durante 3 semanas o 4 meses. La Figura 33 es la representación gráfica de la glucemia en deportistas que compiten y no compiten durante un esfuerzo físico que no han tomado DHA o lo han hecho durante 3 semanas o 4 meses.
A continuación se incluyen los siguientes ejemplos a modo ilustrativo y no limitativos de la invención. Ejemplos Materiales y métodos para evaluar la actividad antioxidante Cultivos celulares Como modelos celulares se han utilizado células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, CRL-2076) y células ARPE-19 (células epiteliales pigmentarias de retina, CRL-2302) que se han obtenido de la American Type Culture Collection. Los cultivos celulares se han mantenido en las condiciones adecuadas de crecimiento: temperatura (37°C), concentración de C02 (5%) y humedad (95%) en un incubador especial para esta finalidad. Las células ARPE-19 se mantienen en crecimiento hasta confluencia de 0.3x104 células/cm2 en frascos de cultivo con medio DMEM-F12 (Biological Industries) supplementado con 10% de suero fetal bovino, antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) y glutamina (Biological Industries). Los fibroblastos CRL-2076 se mantienen en crecimiento en frascos de cultivo en medio Dulbecco modificado por Iscove (Biological Industries) supplementado con 10% de suero fetal bovino, antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) y glutamina (Biological Industries). Las células son traspasadas para adherencia al sustrato 24 h a 37°C desde los frascos de 75 mi a placas de 6, 12 ó 96 pozos para poder realizar el experimento (106 células/ml).
Integración del DHA a las células Se añadió el DHA-TG en concentraciones diferentes (0.5-50 µ?) partiendo de DHA-TG con una riqueza del 20, 50 y 70% (densidad del aceite 0.92 g/ mi), disolviendo el aceite en etanol para la solución stock (1:100) y preparando las soluciones de trabajo en medio de cultivo acondicionado con suero. Las células se cultivaron con medio suplementado de DHA-TG durante 3 días a 37°C. Inducción de estrés oxidante Se usaron para estresar de manera oxidante a las células diferentes inductores: a) sistema xantina/xantina oxidasa 0.8 m /10"2 U/ml que cataliza la oxidación de hipoxantina y xantina a ácido úrico, con reducción del 02 a O "2 y H202. b) 2,2'-azobis-(2-amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH) 1-100 mM ampliamente usado como iniciador hidrof ílico de radicales libres por inducción de la peroxidación lipídica y proteico.' El AAPH oxida al ADN, a las proteínas y a los lípidos por acción de los peroxil radicales formados. Además actúa a nivel del sistema de defensa endógeno, ya que inactiva el enzima clave, la SOD, con lo que pierde la capacidad protectora de la CAT y de la GPx. Generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) El nivel de ROS fue medido en cultivos primarios de fibroblastos humanos de piel CRL-2076 y en células epiteliales de
retina ARPE-19 utilizando la técnica fluorimétrica usando como sondas fluorescentes dihidrorodamina 123 (DHR123, Molecular Probes) y diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (H2DCFDA, Molecular Probes) en un sistema continuo midiendo cada 30 min hasta 180 minutos. En ambos casos se trata de una medida inespecífica de la generación de ROS. Las sondas fluorescentes se añadieron a las células (1x106 células/ mi) a una concentración final de 10 µ?. La fluorescencia de las sondas oxidadas (2,7-diclorofluoresceína y rodamina 123) fue medida en un lector de fluorescencia Mithras a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm en función del tiempo. La fluorescencia obtenida se modula con las determinaciones de viabilidad celular por la técnica espectrofotométrica del MTT abajo reseñada. Viabilidad celular Para evaluar el efecto citotóxico de las diferentes muestras se han realizado estudios de viabilidad celular. Este método consiste en la adición del reactivo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2 , 5-difeniltetrazolio , Sigma), soluble en medio acuoso, al medio de incubación. Las células viables metabolizan este compuesto y es convertido en sal de formazán. Esta sal es un compuesto colorimétrico insoluble en medio acuoso, soluble en DMSO y que se puede usar como una medida de la viabilidad celular. El método consiste en la adición de 20 µ? por pozo de una disolución de MTT de 7.5 mg/ml (en exceso). Se incuba durante
una hora a 37°C de forma que las células viables metabolizan el compuesto y produzcan la sal formazán mientras que las no viables no lo metabolizarán. Tras una hora de incubación se precipitan las células y se añaden 100 µ? de DMSO, el cual disolverá la sal formazán. Por último se mide la absorbencia a 550 nm en un lector de placas. Los resultados de viabilidad se expresan como porcentaje de densidad óptica con respecto a los controles considerando que estos últimos poseen un 100% de viabilidad. Se han realizado curvas de viabilidad celular en placas de 96 pozos sembrando unas 20.000 células por pozo (tras un análisis del número de células idóneo en función de su ratio de crecimiento) con un volumen aproximado de 200 µ? de medio por pozo. El estudio de la eficiencia del producto se realiza después de la exposición de las células al producto durante 72 h en un intervalo de concentraciones lo suficientemente amplio para determinar el valor de la IC50. Los resultados experimentales se han ajustado a la ecuación de Hill mediante el software Sigma Plot 8.0 para determinar la IC5o, definida como la concentración de DHA necesaria para disminuir la viabilidad del cultivo al 50% respecto al control. Determinación de proteínas La determinación se basa en la detección colorimétrica y cuantificación total de las proteínas con una formulación ácida bicinconínica optimizada que permite medir proteínas en muestras diluidas en un rango de concentración de 0.5-20 pg/ml. El método
utiliza un detector de Cu + 1, el cual es reducido por las proteínas en medio alcalino a Cu+2. El producto púrpura de reacción se forma por la quelación de dos moléculas de BCA con el ion cuproso. El complejo soluble en agua absorbe a 562 nm.
Mediante una curva de calibración obtenemos una ecuación, obteniendo los resultados expresados en pg/ml de proteínas. El kit comercial utilizado es el icroBCA de Pierce (No.23235). Análisis Directo de la Generación de ROS Medida de generación de hidroperóxidos lipidíeos Se utilizó la medida del malonildialdehído (MDA) en lisados celulares como marcador de peroxidación lipídica por espectrofotometría UV-Vis. El MDA y los 4-h¡droxialquenals (HAE) son productos derivados de la peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados · y ésteres relacionados. La medida directa de estos aldehidos constituye un índice conveniente de la peroxidación lipídica. Se utilizó un reactivo cromogénico (N-metil-2-fenil-indol en acetonitrilo) que reacciona con el MDA a 45°C utilizando el kit comercial de peroxidación lipídica de Calbiochem (No. 437634). La condensación de una molécula de MDA con dos moléculas del reactivo cromogénico da un cromóforo estable con máxima absorbancia a 586 nm siendo el límite de detección de 0.1 µ?. La inducción se realizo durante 6 h con AAPH 40 mM y 24 horas de latencia. Se Usaron las células (107 células/ml) mediante ciclos de congelación y descongelación en N2 líquido. Se fraccionaron las muestras para medir MDA y proteína. Los
resultados se expresaron en µ? de MDA/mg de proteínas. Medida de generación de anión superóxido La medida directa del anión superóxido se realizó mediante la técnica de Quimioluminiscencia en microplaca mediada por luminoi (Calbiochem, No. 574590). La quimioluminiscencia para la detección del anión superóxido es una técnica utilizada debido a su potencial para acceder a todos los sitios intracelulares de generación de superóxido, por la alta especificidad de la reacción con luminol, por la mínima toxicidad intracelular y la sensibilidad incrementada respecto a otras técnicas químicas. Su fundamento es que el anión superóxido oxida al luminol en una reacción que produce fotones de luz que son rápidamente medidos en un luminómetro estándar. En nuestros ensayos utilizamos un lector de quimiolumiscencia en microplaca de ELISA, MITHRAS y además, dado la corta vida media del radical, se utilizó un enhancer para incrementar la sensibilidad del ensayo y amplificar la respuesta. Debido a que este reactivo no es tóxico y no desnaturaliza los componentes de los sistemas subcelulares, puede ser usado en células vivas. También se investigó la capacidad de inhibir la producción de anión superóxido utilizando un secuestrante específico de anión superóxido, el tirón (ácido 4,5-dihidroxi-1 ,3-benceno disulfónico, Sigma) utilizado frecuentemente para ensayos in vitro de bloqueo en la producción de ROS siendo permeable a la membrana celular y por otra parte, se utilizó superóxido dismutasa (SOD, Sigma) como bloqueante
enzimático, que constituye una enzima de primera línea en la defensa antioxidante endógena. La medida de quimioluminiscencia en las células sometidas al tratamiento inductor de estrés oxidante con AAPH se analizó cada 60 segundos durante un tiempo total de medida de 4100 segundos, a una frecuencia de 120 seg/ciclo. Se expresaron los resultados en UA de quimioluminiscencia / mg proteína. Determinación de la Actividad de Enzimas Antioxidantes Medida de la actividad glutatión peroxidasa (GPx) La GPx cataliza la reducción de hidroperóxidos a glutatión reducido y la función es proteger a la célula del daño oxidante. Usa glutatión como último donante de electrones para regenerar la forma reducida de la selenocisteína. La medida indirecta de GPx se obtiene por la reacción acoplada con glutatión reductasa. El glutatión oxidado (GSSG) producido por la reacción con los hidroperóxidos por acción de la GPx es reciclado a su estado reducido por la glutatión reductasa usando como coenzima el NADPH. La oxidación de NADPH a NADP* se acompaña de la disminución de su absorbancia a 340 nm. La tasa de disminución de la absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad GPx de la muestra. Para la detección de la GPx en Usados celulares de cultivos primarios se utilizó el kit espectrofotométrico en microplaca de ELISA de Cayman (No. 703102). Se cultivaron las células por adherencia al sustrato 24 h a 37°C. El Usado celular se obtuvo por sonicación en Tris 50 mM
pH 7.5, EDTA 5 inM y DTT 1 mM. La actividad de la GPx se obtiene determinando el cambio de A340 nm /min (??340) se expresa como nanomoles NADPH/min/mg de proteína de la muestra. Medida de la actividad superóxido dismutasa (SOD) Esta metodología quimioluminiscente se basa en el análisis de la actividad SOD en el sobrenadante celular respecto a un control positivo de SOD (Calbiochem No. 574590). La presencia de SOD en el sistema xantina oxidasa-xantina-luminol provoca una disminución de la quimioluminiscencia producida como consecuencia de la dismutación del anión superóxido proporcional a la actividad SOD.¡ El análisis se realiza en un luminómetro MITHRAS a intervalos de 50 mseg hasta un tiempo de reacción final de 520 seg. También se ha determinado la actividad superóxido dismutasa (SOD) en Usados celulares mediante la reacción que utiliza sales de tetrazolium para la detección de radicales superóxido generados por el sistema xantina oxidasa/hipoxantina. Se utiliza un método espectrofotométrico en microplaca para medir los 3 tipos de SOD (Cu-Zn-SOD; Mn-SOD y Fe-SOD; es decir citosólica y mitocondrial). Una unidad de SOD se define como la cantidad de enzima requerida para dismutar el 50% del anión superóxido generado. Para detección de SOD en Usados celulares de cultivos primarios se ha usado el kit de Cayman (No. 706002) siguiendo el protocolo optimizado por el fabricante. El
rango dinámico del ensayo es 0.025-0.25 unidades SOD/ml. Determinación de la Concentración de Antioxidantes Endógenos Intracelulares Medida de la concentración intracelular de glutation reducido (GSH) Ensayo cinético directo de medida de glutatión reducido (GSH) en Usados celulares. El glutatión se halla presente dentro de las células principalmente en su forma reducida (90-95% del glutatión total), siendo el principal antioxidante en tejidos. Su función es la detoxificación de xenobióticos y la eliminación de hidroperóxidos para mantener el estado redox celular. La técnica utilizada mide glutatión total (GSSG + GSH) en una muestra biológica (lisado celular) previamente desproteinizado con ácido sulfosaNcílico (Kit de Sigma-Aldrich CS0260). El GSH causa una reducción continua del ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) a 5-tio(2-nitrobenzoico) (TNB) y el GSSG formado es reciclado por la glutatión reductasa y NADPH. El TNB es medido espectrofotométricamente a ? de 412 nm. Como inhibidor de la síntesis de GSH se ha utilizado sulfoximina de butionina (BSO) que inhibe específicamente la enzima gamma-glutamilcisteína sintetasa. Evaluación de la actividad antioxidante del dha en un modelo de piel humano En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células Foreskin (fibroblastos de epidermis no
diferenciados, ATCC CRL-2076) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes, además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo normales, y constituye un buen modelo in vitro extrapolable a la respuesta in vivo, para una potencial aplicación cosmética del DHA. Resultados Inicialmente, se han establecido las condiciones necesarias para disponer de un modelo celular activo en todas las condiciones de estudio. Esto quiere decir que los resultados obtenidos hacen referencia a células metabolitamente activas. Estudios previos ya habían demostrado que en células Foreskin concentraciones inferiores a 1000 µ? de DHA no afectaban a la viabilidad celular en estudios a 3 días. Tampoco se ve afectada la viabilidad celular durante los estudios de estrés oxidante con el sistema xantina/xantina oxidasa o con AAPH. También, se ha demostrado que la incorporación de DHA hasta una concentración de 50 µ? en un cultivo de células Foreskin durante 3 días no incrementa de manera significativa el nivel oxidante celular medido como la fluorescencia celular asociada a dos sondas, la dihidrorodamina (DHR 123) y la 2,7-diclorofluoresceína (H2DCFDA), más específica para anión superóxido y para la detección de hidroperóxidos, respectivamente. Una vez establecidas estas condiciones se procedió a evaluar la capacidad antioxidante general del DHA incorporado en la
membrana de las células Foreskin frente al estrés oxidante inducido por xantina/xantina oxidasa o por AAPH. Al inducir un estrés oxidante moderado con AAPH 40 m y usando la DHR123 como detector de ROS, el DHA muestra un efecto inhibidor en la generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0.5 µ? (59% de protección) como a 5 µ? (33% de protección), presentando un menor efecto a 10 µ? (26% de protección) o nulo a 50 µ? de DHA (Fig. 1A). Cuando las células se someten a una inducción severa con AAPH 60 mM, el DHA muestra un efecto protector frente a la generación dé ROS, tanto a la concentración 0.5 µ? (40% de protección) como a 5 µ? (29% de protección) perdiéndolo a concentraciones superiores de DHA (Fig. 1A). También podemos destacar la protección que ejerce el DHA 0.5 µ? contra el estrés oxidante inducido por la xantina/xantina oxidasa (Fig. 1B), lo que muestra un efecto secuestrante de las especies reactivas del oxigeno, tanto anión superóxido como hidroperóxidos generados en el proceso oxidante. Comparando la capacidad antioxidante respecto a un antioxidante lipofílico como es la vitamina E (Fig. 1B), observamos que ejercen una cinética de protección semejante (el DHA inhibe un 33,46% la oxidación celular y la vitamina E un 30%). El comportamiento en la cinética de protección del DHA presenta siempre un máximo efecto antioxidante entre los 60-120 minutos de efectuada la inducción, denotando una saturación en
la capacidad secuestrante de hidroperóxidos y anión superóxido del DHA. El comportamiento antioxidante es dosis dependiente de modo crítico, ya que al aumentar la concentración del mismo pierde la capacidad secuestrante de ROS siendo la concentración de 0.5 µ? la más efectiva en su capacidad antioxidante. En este sentido otro parámetro crítico a nivel de optimización de la eficiencia del sistema es la proporción de DHA respecto al total de ácidos grasos. Como se muestra en la Figura 2, a idénticas concentraciones de triglicérido, la disminución de la proporción de DHA a 50 ó 20% reduce de manera drástica la capacidad antioxidante celular, tornándose pro-oxidante a concentraciones bajas o moderadas. Estos resultados parecen indicar que el efecto antioxidante celular del DHA, no depende exclusivamente de la concentración del mismo, sino que también es un factor decisivo su localización molecular en este caso su distribución en la estructura del triglicérido. En cuanto a la inhibición específica en la producción de ROS se han analizado la generación de peróxidos lipidíeos (TBARS) y de aniones superóxido. Los resultados obtenidos indicaron que las células tratadas con AAPH, generaron una mayor concentración de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) respecto a las células no inducidas, expresado como µ? de DA/mg de proteínas (Fig. 3). Como era de esperar, la incorporación de DHA en la membrana de las células Foreskin incrementa ligeramente de una forma dosis
dependiente (0.5, 5 y 50 µ?) la peroxidación lipídica basal celular (Fig. 3). En las células sometidas a una inducción oxidante con AAPH 40 mM, el DHA presenta una actividad antioxidante protegiendo a los fibroblastos de la generación de hidroperóxidos lipidíeos de membrana siendo su acción del tipo concentración dependiente inversa. La protección con DHA, fue del 87 % para 0.5 µ? DHA; 85 % para 5 µ? y 48 % para DHA-TG 50 µ? (Fig. 3).
Se analizó posteriormente la generación del anión superoxido. Células Foreskin sometidas a un estrés oxidante con AAPH 40 mM generaron una producción de anión superoxido 2,5 veces superior a las células no inducidas, que mantuvieron el nivel de anión superoxido constante (Fig. 4). En ausencia de inducción oxidante, las células con DHA integrado no presentan un nivel superior de anión superoxido intracelular respecto al control (Fig. 4). En condiciones de estrés oxidante (Fig. 4), el DHA inhibe la generación del anión superoxido en un 16,5% a una concentración de 0.5 µ?; en un 10% a una concentración de 5 µ? y en un 9% a una concentración de 50 µ?. Se confirmó la especificidad del método mediante la adición de Tirón (ácido 4,5-dihidroxi-1 ,3-benceno disulfónico, compuesto permeable a la membrana celular que opera como secuestrante altamente específico de anión superoxido intracelular) o de SOD extracelular (bloqueante enzimático de primera línea en la defensa antioxídante endógena vía dismutación del anión superoxido intracelular). La producción del anión superoxido en
células estresadas con AAPH con o sin DHA previamente integrado en presencia de SOD exógena o de Tirón fue totalmente inhibida obteniéndose unos valores básales (Fig. 4). Finalmente se analizó si el DHA ejercía su actividad antioxidante a través de una modificación de la actividad de los enzimas antioxidantes celulares de primera línea. Se analizaron la actividad de la SOD y de la GPx en células Foreskin con o sin DHA integrado. En el primer caso se utilizó el sistema xantina/xantina oxidasa como generador de aniones superoxido instantáneo (tiempo total de medida 520 seg, midiendo cada 50 mseg). De acuerdo con los resultados obtenidos, se logró una buena inducción oxidante con una cinética rápida observándose directamente la dismutación y no la producción de anión superoxido. Se interpreto como medida indirecta y cualitativa de la actividad SOD el máximo de quimioluminiscencia que se alcanzo a los 15 seg de la inducción oxidante (Fig. 5A). Sin DHA integrado, se alcanzaron valores de 310 U.A. quimioluminiscencia /106 células, disminuyendo a 150 U.A. quimioluminis-cencia / 106 células en un sistema preincubado con DHA 0.5 µ? (52% de protección antioxidante) (Fig. 5A). La eficiencia antioxidante se mantuvo en un 52% y en un 42% de protección en células tratadas con 5 y 50 µ? de DHA, respectivamente (Fig. 5A). Además, conociendo que el AAPH, oxida tanto el ADN, las proteínas y los lípidos por difusión de los p.eroxil radicales generados, el DHA como antioxidante podría impedir la
inactivación de la SOD, encargada de la dismutación del anión superóxido, manteniendo en la célula la defensa antioxidante endógena de la catalasa y la glutatión peroxidasa. Este aspecto se ve confirmado en la Figura 5B, donde se puede observar que la actividad SOD no se encuentra incrementada en estado basal en presencia de DHA (-107-15%), pero que la pérdida de actividad de la SOD inherente al proceso de estrés oxidante esta inhibido en presencia de DHA manteniendo o incluso incrementando la actividad de la SOD (10/20%). En cuanto a la actividad GPx (Fig. 6), esta se encuentra incrementada en estado basal celular a concentraciones de DHA modestas (hasta un 17% a 5 µ?), pero desciende a concentraciones altas (-20% a 50 µ?). Este comportamiento se mantiene intacto en estado de estrés oxidante (Fig. -6). Estos resultados sugieren que el DHA colabora con el sistema de defensa antioxidante endógeno en cuanto a la dismutación del anión superóxido; generando SOD en todo el rango de concentraciones ensayado y también es capaz de controlar la generación de hidroperóxidos a concentraciones moderadas ya que incrementa la actividad GPx. Evaluación de la actividad antioxidante del DHA en un modelo celular de retina En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células ARPE-19 (células epiteliales pigmentarias de retina, ATCC CRL-2302) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes,
además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo normales. Además, constituye un buen modelo ocular ya que conserva las propiedades biológicas y funcionales de las células epiteliales pigmentarias de retina. Resultados El estudio realizado con esta línea celular es análogo al descrito para las células Foreskin en el apartado anterior. Los requerimientos básicos han sido los mismos con respecto al mantenimiento de la viabilidad celular en todas las condiciones de trabajo (efecto del DHA, del estrés oxidante). La incorporación del DHA en las dosis analizadas tampoco ha supuesto una alteración significativa en el estado oxidante celular basal. Al inducir un estrés oxidante moderado con AAPH 40 mM y usando la DHR123 como detector de ROS, el DHA muestra un efecto inhibidor en la generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0.5 µ? (43% de protección) como a 5 µ? (32% de protección), presentando un menor efecto a 50 µ? (4% de protección) de DHA (Fig. 7A). Cuando las células se someten a una inducción severa con AAPH 60 mM, el DHA muestra un efecto protector frente a la generación de ROS, tanto a la concentración 0.5 µ? (13% de protección) y menor a concentraciones superiores de DHA (Fig. 7A). Estos resultados son similares a los obtenidos con las células Foreskin, aunque cabe destacar como aspecto diferencial la menor protección
observada frenté a una inducción oxidante severa. Utilizando para la detección de ROS la CDCFDA más específica de peróxidos, también se pone de manifiesto la protección que ejerce el DHA contra el estrés oxidante inducido por AAPH ( Fig . 7B). También la cinética de protección del DHA presenta siempre un máximo efecto antioxidante entre los 60-120 minutos de efectuada la inducción, denotando una saturación en la capacidad secuestrante de hidroperóxidos y anión superóxido del DHA. Cuantitativamente, la capacidad antioxidante es dosis dependiente de modo crítico, ya que al aumentar la concentración del mismo pierde la capacidad secuestrante de ROS siendo la concentración de 0.5 µ? la más efectiva en su capacidad antioxidante (Fig. 7A y 7B). En este sentido otro parámetro crítico a nivel de optimización de la eficiencia del- sistema es la proporción de DHA respecto al total de ácidos grasos. La disminución de la proporción de DHA respecto al total de ácidos grasos del 70% al 50-20% reduce de manera importante y no proporcional su capacidad antioxidante celular a las concentraciones óptimas (0.5-5 µ?), igualándose a concentraciones elevadas (Fig. 8A y 8B), pero 'a diferencia de las células Foreskin en ninguna proporción se torna el DHA prooxidante. Estos resultados confirman que el efecto antioxidante celular del DHA, no depende exclusivamente de la concentración del mismo, sino que también es un factor decisivo su localización molecular en este casó su distribución en la estructura del
triglicérido. En cuanto a la inhibición específica en la producción de ROS se han analizado la generación de peróxidos lipidíeos (TBARS) (Fig. 9) y de aniones superóxido (Fig. 10). Los resultados obtenidos son muy similares a los obtenidos con las células Foreskin. Las células tratadas con AAPH, generan una mayor concentración de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y de aniones superóxido respecto a las células no inducidas. La incorporación de DHA en la membrana de las células ARPE-19 incrementa ligeramente de una forma dosis dependiente (0.5, 5 y 50 µ?) la peroxidación lípídíca basal celular, pero en las células sometidas a una inducción oxidante, el DHA presenta una actividad antioxidante celular inhibiéndolas de la generación de hidroperóxidos lipidíeos de membrana con una relación inversa a su concentración. La protección con DHA, fue del 64 % para 0.5 µ? DHA; 58 % para 5 µ? y 42 % para DHA 50 µ? (Fig. 9). Se analizó posteriormente la generación del. anión superóxido. En ausencia de inducción oxidante, las células con DHA integrado no presentan un nivel superior de anión superóxido intracelular respecto al control (Fig. 10A). Un estrés oxidante con AAPH 40 mM genera una producción de anión superóxido que es inhibido parcialmente por el DHA (20-16% a concentraciones de 0.5- 50 µ?). Esta inhibición es de acuerdo con la actividad SOD en presencia de DHA (Fig. 10B). La actividad SOD no se encuentra incrementada en estado basal en
presencia de DHA (-10/-15%), pero al igual que en las células Foreskin, la pérdida de actividad de la SOD inherente al proceso de es.trés oxidante esta inhibido en presencia de DHA manteniendo la actividad de la SOD basal. Finalmente se analizó si el DHA alteraba la actividad del enzima GPx como antioxidante celular de primera línea (Fig. 11). La actividad GPx se encuentra incrementada en estado basal celular a todas las concentraciones de DHA ensayadas (12-40%) y este comportamiento se mantiene intacto en estado de inducción oxidante que además presenta una actividad GPx 2,5 veces superior (Fig. 11). Al igual que en las células Foreskin, estos resultados sugieren que el DHA ejerce parte de su efecto antioxidante modulando la actividad del sistema enzimático de defensa antioxidante endógeno celular. Influencia del método de sintésis en la actividad antioxidante del DHA incorporado en un triglicerido En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelos celulares, células ARPE-19 (células epiteliales pigmentarias de retina, ATCC CRL-2302) y células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, ATCC CRL-2076) que constituyen líneas celulares adecuadas por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes. Como principio activo se han utilizado triglicéridos dé aceite de atún (DHA20%-TG, 20%" molar en DHA) o derivados de de un aceite enriquecido al 50 o al 70% molar en DHA (DHA 50%-TG y DHA70%-TG) obtenidos por
métodos químicos (CHEM) o enzimáticos (ENZ). Resultados Al inducir un estrés oxidante moderado con AAPH 40 mM en células ARPE-19 y usando DHR123 o H2DCFDA como detectores intracelulares de ROS, el DHA natural (DHA20%-TG) y el incorporado en un triglicérido obtenido químicamente (DHA50%-TG-CHEM y DHA70% -TG-CHEM) muestra un efecto inhibidor en la generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0.5 µ? como a 5 µ?, presentando un menor efecto a 50 µ? de DHA (Fig. 13A). Este efecto es dependiente del contenido en DHA siendo DHA70% -TG-CHEM > DHA50%-TG-CHEM > DHA20%-TG (Fig. 13A). A las mismas concentraciones (0.5, 5 y 50 µ?), aceites obtenidos enzimáticamente muestran una actividad superior a todos los contenidos en DHA (DHA70%-TG-ENZ y DHA50%-TG-ENZ) (Fig. 13B). En un estudio análogo con células Foreskin se obtienen resultados más sorprendentes. La actividad pro-oxidante observada con DHA70%-TG-CHEM y DHA50% -TG-CHEM a altas dosis (Fig. 13C) se torna anti-oxidante a todas las concentraciones con aceites de origen enzimático (DHA70%-TG-ENZ y DHA50%-TG-ENZ) (Fig. 13D). La eliminación de los polímeros intrínsecos de los aceites obtenidos químicamente mediante métodos cromatográficos (DHA70%-TG-BPM) provoca una disminución aún mayor de la actividad antioxidante en células ARPE-19, tornándose ,pro-oxidante a altas concentraciones (5 y 50 µ?) (Fig. 14). La actividad anti-oxidante
del DHA incorporado en un triglicérido obtenido por síntesis enzimática también resulta superior (como mínimo del doble) a la mostrada por el DHA incorporado en otras estructuras químicas como esteres etílicos, ácido graso libre o ácido graso unido a albúmina sérica (Fig. 15). La actividad anti-oxidante celular demostrada con la incorporación de DHA está relacionada con todos los aspectos relacionados anteriormente como el mantenimiento de las actividades enzimáticas de la SOD y de la GPx, pero además con el incremento de la concentración intracelular de glutation (GSH).
En células ARPE-19 (Fig. 16), el DHA induce un aumento de la concentración intracelular de GSH directamente relacionada con la síntesis de novo de GSH ya que la adición de BSO (inhibidor específico de la síntesis de GSH) elimina el efecto protector del
DHA (Fig. 17) en relación directa con el decremento de la concentración intracelular de GSH (Fig. 15). Un comportamiento análogo se ha observado en células Foreskin (Fig. 18). « La mejora obtenida en la actividad anti-oxidante del DHA mediante una síntesis enzimática también es aplicable a otro ácido graso omega-3 como el ácido ecosapentaenoico (EPA). En un estudio con células ARPE-19 se demuestra que el EPA obtenido enzimáticamente (EPA70%-TG-ENZ) muestra una actividad anti-oxidante, aunque muy inferior a la observada con DHA (DHA70%-TG-ENZ), mientras que un EPA obtenido químicamente y libre de polímeros (EPA70%-TG-BPM) se muestra
muy pro-oxidante (Fig. 19). Además el EPA (EPA70%-TG-ENZ) obtenido enzimáticamente muestra en células Foreskin una notable actividad anti-oxidante incluso superior al DHA (DHA70%-TG-ENZ) (Fig. 20), relacionada al igual que en el caso del DHA con el aumento de la concentración intracelular de GSH (Fig.21). Evaluación de la actividad antioxidante del DHA incorporado en un triglicerido estructurado en un modelo celular de retina
En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células ARPE-19 (células epiteliales pigmentarias de retina, ATCC CRL-2302) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes, además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo normales. Además, constituye un buen modelo ocular ya. que conserva las propiedades biológicas y funcionales de las células epiteliales pigmentarias de retina. Como principio activo se han utilizado triglicéridos estructurados derivados de aceite de atún (DHA20%-TG, 20% molar en DHA) o de un aceite enriquecido al 70% en DHA (DHA70%-TG, 70% molar en DHA), en los cuales mediante métodos enzimáticos se les ha sustituido los ácidos grasos de las posiciones sn-1 y sn-3 por ácido octanoico. En estos nuevos compuestos el contenido molar en DHA es del 7% en el DHA20%-TG y del 22% en el DHA70%-TG. Resultados (Ver la figura 22) Al inducir un estrés oxidante moderado con AAPH 40 m y
usando la DHR123 como detector de ROS, el DHA incorporado en un triglicérido normal (DHA20%-TG y DHA70%-TG) muestra un efecto inhibidor en la generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0.5 µ? como a 5 µ?, presentando un menor efecto a 50 µ? de DHA (Fig. 22). Este efecto es dependiente del contenido en DHA siendo DHA70%-TG > DHA20%-TG. A las mismas concentraciones los aceites estructurados, con una concentración real de DHA 2-3 veces inferior, muestran una actividad igual (para la concentración de 0.5 µ?) o superior (para las concentraciones de 5 y 50 µ?) en el caso del DHA20%-TG. En el caso del DHA70%-TG, la eficacia del triglicérido estructurado es ligeramente inferior a las concentraciones óptimas (0.5 y 5 µ?), pero se invierte el comportamiento a altas concentraciones (50 µ?) mostrando globalmente un comportamiento más estable y menos dependiente de la dosis. Evaluación de la actividad del DHA como protector de la longitud del telomero asociado a la edad en un modelo de piel humano En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, ATCC CRL-2076) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes, además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo normales, y constituye un
buen modelo in vitro extrapolable a la respuesta in vivo, para una potencial aplicación cosmética del DHA. Metodología Cultivos celulares Como modelos celulares se han utilizado células Foreskin
(fibroblastos de epidermis no diferenciados, CRL-2076) que se han obtenido de la American Type Culture Collection. Los cultivos celulares se han mantenido en las condiciones adecuadas de crecimiento: temperatura (37°C), concentración de C02 (5%) y humedad (95%) en un incubador especial para esta finalidad. Los fibroblastos CRL-2076 se mantienen en crecimiento en frascos de cultivo en medio Dulbecco modificado por Iscove (Biological Industries) suplementado con 10% de suero fetal bovino, antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) y glutamina (Biological Industries). Integración del DHA a las células Se añadió el DHA-TG 70% sintetizado enzimáticamente a una concentración de 0.5 µ , disolviendo el aceite en etanol para la solución stock (1:100) y preparando las soluciones de trabajo en medio de cultivo acondicionado con suero. Las células se cultivaron con medio suplementado de DHA-TG durante 3 días a 37°C. Inducción de estrés oxidante Se usó para estresar de manera oxidante a las células el compuesto 2,2'-azobis-(2-amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH)
a una concentración de 40 mM ampliamente usado como iniciador hidrofílico de radicales libres por inducción de la peroxidación lipídica y proteica. El AAPH oxida al ADN, a las proteínas y a los lípidos por acción de los radicales peroxil formados. Además actúa a nivel del sistema de defensa endógeno, ya que inactiva el enzima clave, la SOD, con lo que pierde la capacidad protectora de la CAT y de la GPx.
Medida de la longitud del telómero Las regiones teloméricas constituidas por ADN altamente repetitivo pueden evaluarse mediante técnicas de hibridación in situ. El método de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) utilizando sondas complementarias a las secuencias teloméricas permitió detectar la presencia o ausencia de telómeros, así como cuantificar los mismos por célula y por grupo cromosómico. El método denominado flow FISH utiliza la citometría de flujo combinada con la técnica de FI.SH utilizando como sonda un PNA (peptide nucleic acid) pan-telomérico y que permite medir, mediante intensidades de fluorescencia, las longitudes teloméricas promedio de los extremos cromosómicos en células individuales. Para nuestro objetivo, se analizó la intensidad de fluorescencia de los PAN marcados de cromosomas en metafase. Los resultados se expresan como unidades de fluorescencia telomérica (TFU) con cada TFU correspondiente a 1 kb de telómeros repetidos.
Resultados Los cambios en la longitud media de los telómeros en fibroblastos humanos cultivados bajo estrés oxidante con o sin DHA incorporado se analizaron por flow-FISH (Figura 23). Se utilizó una regresión lineal para analizar la relación entre la longitud de los telómeros y el número de pases de las poblaciones celulares. Para todos los cultivos analizados, las pendientes de las regresiones se pueden interpretar directarnente como índices de acortamiento de los telómeros. En fibroblastos humanos, el tratamiento con AAPH, que induce un exceso de radicales libres intrácelulares, acelera perceptiblemente el índice de acortamiento de los telómeros. En cambio, la incorporación de DHA a una concentración de 0.5 µ?, que se ha demostrado que incrementa las defensas antioxidantes celulares, reduce el índice al 50% de su valor sin DHA. Además, la incorporación de DHA es capaz de reducir el índice de acortamiento de los telómeros, incluso respecto al control normal de fibroblastos.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1. Uso del ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA para la fabricación de una composición farmacéutica caracterizada por el hecho de que - el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en un monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fosfolípido o éster etílico, - se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 20 y el 100% respecto al total de ácidos grasos, destinada al tratamiento de una patología asociada al daño celular oxidante 2. Uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 40 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos. 3. Uso de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 66 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos. 4. Uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en un monoglicérido, diglicérido o triglicérido. 5. Uso de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en un triglicérido. 6. Uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado específicamente en por lo menos una posición de un glicerol mediante un enlace éster, lípido estructurado, para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del daño celular oxidante. 7. Uso de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque el glicerol comprende, además, por lo menos un ácido graso y/o un ácido fosfórico. 8. Uso según las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en una posición, seleccionada entre sn-1, sn-2 y sn-3 y, opcionalmente, comprendiendo además el glicerol por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena corta y/o cadena media y un ácido fosfórico. 9. Uso según las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque el ácido docosahexadecanoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en la posición sn-2 y, opcionalmente, comprendiendo además el glicerol por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso y un ácido fosfórico. 10. Uso de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado porque el ácido graso de cadena corta es un ácido graso de 1 a 8 átomos de carbono. 11. Uso de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado porque el ácido graso de cadena media es un ácido graso de 9 a 14 átomos de carbono. 12. Uso de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en un trigl icérido . 13. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se obtiene por vía química. 14. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se obtiene por vía enzimática. 16. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende, además, otro principio activo. 17. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la composición farmacéutica se administra a un paciente que está recibiendo un tratamiento contra el daño celular oxidante. 17. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la patología asociada con un daño oxidante es una patología neurodegenerativa. 18. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la patología asociada con un daño oxidante es una patología ocular. 19. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la patología asociada con un daño oxidante es una patología isquémica. 20. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la patología asociada con un daño oxidante es un proceso inflamatorio. 21. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la patología asociada a un daño oxidante es ateroesclerosis. 22. Uso de acuerdo a la reivindicación 17, caracterizado porque la patología neurodegenerativa es una del grupo que comprende esclerosis múltiple, Alzheimer, Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular. 23. Uso de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizado porque la patología ocular es una del grupo que comprende retinosis pigmentaria, degeneración macular y cataratas. 24. Uso de acuerdo a la reivindicación 19, " caracterizado porque la patología isquémica es infarto de miocardio o infarto cerebral. 25. Uso de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizado porque la patología es una del grupo que comprende artritis, vasculitis, glomerulonefritis y lupus eritomatoso. 26. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque la uso de ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se lleva a cabo para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del daño celular oxidante en el ADN. 27. Uso de acuerdo a la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se utiliza como agente protector en el proceso natural de acortamiento de los telómeros. 28. Uso de acuerdo a la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se utiliza como agente inhibidor de la senescencia prematura. 29. Uso de acuerdo a la reivindicación 26, caracterizado porque el acortamiento de los telómeros está asociado a patologías hereditarias asociadas a desórdenes en la cadena respiratoria mitocondrial. 30. Uso de acuerdo a la reivindicación 27, caracterizado porque el acortamiento de los telómeros está asociado asociado con el Síndrome de Down. 31. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la uso de ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se lleva a cabo en la industria alimentaria. 32. Uso de acuerdo a la reivindicación 31, caracterizado porque se lleva a cabo en productos lácteos. 33. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque la uso de ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se lleva a cabo para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del daño celular oxidante asociado con el ejercicio físico. 34. Uso de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se utiliza como agente potenciador del rendimiento deportivo. 35. Uso de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se utiliza. como agente regulador de los niveles de glucosa en sangre durante el esfuerzo físico. 36. Uso de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizado porque del agente potenciador aumenta el porcentaje máximo del consumo de oxígeno absoluto y relativo en el umbral anaerobio. 37. Uso de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizado porque el agente potenciador aumenta la carga correspondiente al umbral anaerobio. 38. Uso de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizado porque el agente potenciador aumenta el tiempo qu'e se tarda en alcanzar el umbral anaerobio. 39. Uso de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizado porque el agente potenciador disminuye la frecuencia cardiaca para un esfuerzo físico idéntico. 40. Uso de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizado porque el agente potenciador aumenta la capacidad antioxidante total del plasma (CAT). 41. Uso de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizado porque el agente potenciador disminuye el daño al ADN. 42. Uso de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizado porque el agente potenciador disminuye el daño oxidante a lípidos plasmáticos. 43. Uso de acuerdo a la reivindicación 35, caracterizado porque el agente regulador provoca una normoglucemia. 44. Uso de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque el uso de ácido docosahexaenoico . o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA se lleva a cabo en la industria alimentaria. 45. Uso de acuerdo a la reivindicación 44, caracterizado porque se lleva a cabo en productos lácteos. 46. Uso de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en una forma de administración seleccionada del grupo que comprende una bebida en todas sus características para antes, durante y después del ejercicio físico; barritas energéticas; barritas ergogénicas; sólidos y preparados para avituallamiento, complementos dietéticos y preparados polivitamínicos; ayudas ergogénicas; textiles con nanocápsulas para absorción dérmica y cualquier otro medio de administración adecuado. 47. Uso de acuerdo a la reivindicación 46, caracterizados por el hecho de que los complementos dietéticos y preparados polivitamínicos se presentan en forma de cápsulas, pastillas, comprimidos, liofilizados o cualquier medio de administración adecuado.
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