JPH0242986A - 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents
新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａInfo
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（産業上の利用分野１
本発明は新規生理活性ポリペプチドの遺伝情報を有する
ポリデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと略する）に関する
。 本発明は又、該ＤＮＡを含む複製可能な組ｔＩＡＤＮＡ
及び該複製可能な組１４４ Ｄ Ｎ Ａで形質転換され
た微生物または細胞に関する。更に詳しくは、本発明は
ヒト由来の腫瘍壊死因子（ＴｕＩｌｅｒ Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓＦａｃｔｏｒ） （以下、ヒトＴＮＦと称す）をコ
ードするＩ）ＮΔ、該ＤＮＡを含む複製可能な組換ＤＮ
Δ及び該複製可能な組換ＤＮ八で形質転換された微生物
または細胞に関するものである。 本明細書において、アミノ酸、ペプチドはアイユービー
エーシー−アイニービー生化学命名委員会（ＩＵｒ’屁
−１０ＢＣＩ３Ｎ）で採用された略記法により表示され
、例えば下記の略号が使用される。なお、アミノ酸など
に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。 Ｇｉｎ ：グルタミン残基 ＾Ｓ
ポリデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと略する）に関する
。 本発明は又、該ＤＮＡを含む複製可能な組ｔＩＡＤＮＡ
及び該複製可能な組１４４ Ｄ Ｎ Ａで形質転換され
た微生物または細胞に関する。更に詳しくは、本発明は
ヒト由来の腫瘍壊死因子（ＴｕＩｌｅｒ Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓＦａｃｔｏｒ） （以下、ヒトＴＮＦと称す）をコ
ードするＩ）ＮΔ、該ＤＮＡを含む複製可能な組換ＤＮ
Δ及び該複製可能な組換ＤＮ八で形質転換された微生物
または細胞に関するものである。 本明細書において、アミノ酸、ペプチドはアイユービー
エーシー−アイニービー生化学命名委員会（ＩＵｒ’屁
−１０ＢＣＩ３Ｎ）で採用された略記法により表示され
、例えば下記の略号が使用される。なお、アミノ酸など
に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。 Ｇｉｎ ：グルタミン残基 ＾Ｓ
【）：アスパラギン酸残基
Ｐｒｏ ニブロリン残、！み
Ｔｙｒ ：チロシン残Ｊｌｌｉ
Ｖａｌ ：バリン残基
しｙＳ：リジン残基
Ｇｌｕ ：グルタミン酸残基
Ａｌａ ：アラニン残基
＾Ｓ１１：アスパラギン残基
Ｌｅｕ ：ロイシン残基
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン残基
ｃｔｙ ニゲリシン残基
１１ｉｓ ：ヒスチジン残基
Ｓｅｒ ：セリン残基
ＴＩ＋ｒ ：スレオニン残基
１１ｅ ：イソロイシン残基
Ｔｒｐニトリブトファン残基
Δｒｇ：アルギニン残県
Ｍｅｔ ：メチオニン残基
Ｃｙｓ ニジスティン残基
また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌク
レオチドの配列により表記する。 八 二 ２′ −デオキシアデニル酸残基Ｃ：２°−デ
オキシシチジル酸残基 Ｇ ・ ２′−デオキシグアニル酸残基゛「 チミジ
ル酸残基 特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配列
の左端は５′端である。 【従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 網内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダ
ラム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗腫瘍細
胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多数報告さ
れている。例えばカースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）ら
は、ＣＤ−１スイス（ＳｗｉＳｓ）マウスにバチルス・
カルメッテ・グエリン（ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔ
ｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ （Ｂ ＣＧ ） ）を投与し、そ
の２週間後にエンドトキシンを静脈内注射して得られる
該マウスの血清が、培養し細胞に対して殺細胞作用を有
すること、およびマウス（ｆ３ＡＬＩｌｌ／ｃ Ｘ （
：５７Ｂし／６）Ｆ、に移（１ａシたメスＡザルコーマ
（Ｍｅｔｌ＋ Ａｓａｒｃｏｌ＋ａ ）を出血性壊死に
至らしめる現象を見出し、腫瘍壊死因子（ＴｕｌＩＩｏ
ｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ） （以下、ｌ”
Ｎ Ｆと称す）と名づけた〔ブロク、ナト。 アカド、サイ、アメリカ合衆国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） ７２０ （ｆｆｉ ９ ）３６６
６〜３６７０頁（１９７５年））、その後、ラフ（Ｒｕ
「［）も〔ジエイ、イムツル、 （Ｊ、 １ｍ１ｍ
ｕｎｏ１．） １２５巻（４４）１６７１〜１６７７頁
（１９８０年）Ｊおよびマシューズ（ＭａＬＬｈｅｗｓ
）ら〔プル、ジェイ、キャンサー（［ｌｒ。 Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）、４２巻４１６〜４１２２頁（１９
８０年））は、ｎｉｉ記カ記入−スウェルａｒｓｗ６１
１）らの方法に準じて調製したウサギ血清からＴＮＦの
精製を試みて、それぞれ原血清に比べて約２０００倍お
よび約ｉ ｏｏｏ倍精製されたものを得ている。しかし
、いずれの場合にも精製されたものに関しては動物実験
において抗腫瘍効果を確認していない。 特開昭５７−１４０７２５号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上を哺乳動物（マウス、ウ
サギ、モルモット等）に投与し、次いでグラム陰性菌由
来のエンドトキシンを注射することによって、または哺
乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系に
ダラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによっ
て誘発される制癌作用を有する蛋白性生理活性物質の単
離精製方法を開示している。更に、その物質の分子量は
、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法では３９．０００±５．０００、等電点はｐｌ
＋３．９±０．３（等電点電気泳動法）である、と開示
しているが、その詳細な構造は［ＩＦＪ示されていない
。 一方マシューズ（ＭａＬｔｈｅｗｓ） ［プル、ジェイ
、キャンサー（Ｂｒｊ、Ｃａｎｃｅｒ）、４４巻（３）
４１８〜４２４頁（１９８１年）〕はＢＣＧを注射投与
し２週間を経過したウサギの各種組織から単核倉食細胞
を得、その細胞培ｌｌｌ液へエンドトキシンを添加する
ことによりし細胞障害性物質が得られることを示してい
る。しかし、この物質の詳細な構造は示されておらず、
また血清中に見出されるＴ、Ｎ Ｆと同一物質であると
いう証拠も示されていない。 更に、ＴＮＦ様生物活性即ちＴＮＦの生物活性と同様の
生物活性を有する因子に関する多くの報文がある０例え
ば、リード（Ｒｅｅｄ）らはヒト末梢血中のマクロファ
ージ等の中にそのような因子を見出した［ジェイ、イム
ノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１１５＠３９
５頁（１９７５年）］。マシューズ（ＭａｔＬｂｅｗｓ
）らはヒト末梢血単球由来のまたは骨髄性単球性白血病
患者由来の白血病細胞中にそのような因子を見出した【
マシューズら（ＭａｔＬｈｅｗｓ６ｔ ａｌ、）、イム
ノロジー（１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） ４４１Ｊ１３５頁
（１９８１年）】。また、バーバラ（ｎａｒｌ＋ａｒａ
）らはニブシュタイン・バー・ウィルス（ＥｐｓＬｅｉ
ｎ−ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）により形質転換されたヒト
Ｂ細胞中に〔デイ−、バーバラら（Ｄ、Ｂａｒｂａｒａ
ｅＬａｌ） ＋ブロク、ナト、アカド０ｇイ、アメリカ
合衆国（Ｐｒｏｃ、 ＮａＬ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ）８０巻５３９７頁（１９８３年）］、また、バー
ラット（Ｂｈａｒａｔ）らはリンパ芽球１７８８細胞株
中にそれぞれ゛ｌ’ＮＦ様生理活性物質を見出している
。 上記した様な因子はまた、特開昭５８−１５９２１．５
８−２１６２１．５８−１０７１９７．５８−２２５０
２４号、英国特訂出願公開番号２．１０６．１１７及び
２，１１７，３８５号にも記載されている。しかしなが
ら、このような因子を効率的に生産する細胞または細胞
株は、見出されていない、更に、これらの因子の構造や
物性に関して、はとんど知見が得られていない。 伊東はウサギＴＮＦの構造及び特性、およびウウギＴＮ
Ｆ産生細胞について研究を行なった〔特願昭５８−２５
１８１７号］、その結果、ウサギに網内系賦活化作用を
有する物質を投与後、細菌由来のエンドトキシンを注射
投与することにより、Ｌｆ１４ａ胞障害活性を有する物
質の産生能を有する細胞を得、さらにＬ細胞を用いてそ
の物質を得た。伊東はさらに上記の通り得られた細胞を
用いて得られたし細胞障害活性を有する物質の分子量と
、免疫学的特性がウサギ血清から得られた’ｒ Ｎ Ｆ
のものと一致することを確認した。一方、遺伝子操作技
術の進歩により、ある蛋白質をコードするＤＮＡを単離
できれば、その蛋白質の構造を決定することが可能とな
った。なぜならば、単離されたＤＮＡの構造は決定する
ことができ、次に蛋白質の構造はそのＤＮＡの構造から
演鐸することができるからである。更に、微生物又は培
養細胞を利用しである蛋白質をコードするＤＮＡからそ
の蛋白質を製造することができるようになった。伊東は
上記遺伝子操作技術をＬ細胞障害活性を有する物質を産
生することのできる細胞に応用し、その結果、ウサギ′
ｌ″ＮＦをコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡとウサ
ギＴＮＦの構造を決定し、そして該ＤＮＡを用いてウサ
ギＴＮＦを製造することに成功した。 上述の通り、伊東はウサギｉ’ Ｎ Ｆを製造すること
に大きな成功を納めたが、ＴＮＦの由来する動物とは異
なる動物にＴＮＦを投与するとアナフィラキシ−ショッ
クを起す可能性がある。なぜならば、’ｌ’ Ｎ Ｆは
ポリペプチドであるので、１’ Ｎ Ｆが該ＴＮＦの出
来ではない動物に投与されるとＴＮＦは抗原として働き
、抗体を産生せしめるからである。この理由から、１’
Ｎ Ｉ？を人体に投与しようとするならば、ヒト出来
のＴ Ｎ Ｆの使用が非常に好ましい、しかしながら、
ヒトｒ Ｎ Ｆの構造ずら十分に解明されていなかった
。それ故、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの構造の決定
が強く望まれていた。
レオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌク
レオチドの配列により表記する。 八 二 ２′ −デオキシアデニル酸残基Ｃ：２°−デ
オキシシチジル酸残基 Ｇ ・ ２′−デオキシグアニル酸残基゛「 チミジ
ル酸残基 特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配列
の左端は５′端である。 【従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 網内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダ
ラム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗腫瘍細
胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多数報告さ
れている。例えばカースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）ら
は、ＣＤ−１スイス（ＳｗｉＳｓ）マウスにバチルス・
カルメッテ・グエリン（ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔ
ｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ （Ｂ ＣＧ ） ）を投与し、そ
の２週間後にエンドトキシンを静脈内注射して得られる
該マウスの血清が、培養し細胞に対して殺細胞作用を有
すること、およびマウス（ｆ３ＡＬＩｌｌ／ｃ Ｘ （
：５７Ｂし／６）Ｆ、に移（１ａシたメスＡザルコーマ
（Ｍｅｔｌ＋ Ａｓａｒｃｏｌ＋ａ ）を出血性壊死に
至らしめる現象を見出し、腫瘍壊死因子（ＴｕｌＩＩｏ
ｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ） （以下、ｌ”
Ｎ Ｆと称す）と名づけた〔ブロク、ナト。 アカド、サイ、アメリカ合衆国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） ７２０ （ｆｆｉ ９ ）３６６
６〜３６７０頁（１９７５年））、その後、ラフ（Ｒｕ
「［）も〔ジエイ、イムツル、 （Ｊ、 １ｍ１ｍ
ｕｎｏ１．） １２５巻（４４）１６７１〜１６７７頁
（１９８０年）Ｊおよびマシューズ（ＭａＬＬｈｅｗｓ
）ら〔プル、ジェイ、キャンサー（［ｌｒ。 Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）、４２巻４１６〜４１２２頁（１９
８０年））は、ｎｉｉ記カ記入−スウェルａｒｓｗ６１
１）らの方法に準じて調製したウサギ血清からＴＮＦの
精製を試みて、それぞれ原血清に比べて約２０００倍お
よび約ｉ ｏｏｏ倍精製されたものを得ている。しかし
、いずれの場合にも精製されたものに関しては動物実験
において抗腫瘍効果を確認していない。 特開昭５７−１４０７２５号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上を哺乳動物（マウス、ウ
サギ、モルモット等）に投与し、次いでグラム陰性菌由
来のエンドトキシンを注射することによって、または哺
乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系に
ダラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによっ
て誘発される制癌作用を有する蛋白性生理活性物質の単
離精製方法を開示している。更に、その物質の分子量は
、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法では３９．０００±５．０００、等電点はｐｌ
＋３．９±０．３（等電点電気泳動法）である、と開示
しているが、その詳細な構造は［ＩＦＪ示されていない
。 一方マシューズ（ＭａＬｔｈｅｗｓ） ［プル、ジェイ
、キャンサー（Ｂｒｊ、Ｃａｎｃｅｒ）、４４巻（３）
４１８〜４２４頁（１９８１年）〕はＢＣＧを注射投与
し２週間を経過したウサギの各種組織から単核倉食細胞
を得、その細胞培ｌｌｌ液へエンドトキシンを添加する
ことによりし細胞障害性物質が得られることを示してい
る。しかし、この物質の詳細な構造は示されておらず、
また血清中に見出されるＴ、Ｎ Ｆと同一物質であると
いう証拠も示されていない。 更に、ＴＮＦ様生物活性即ちＴＮＦの生物活性と同様の
生物活性を有する因子に関する多くの報文がある０例え
ば、リード（Ｒｅｅｄ）らはヒト末梢血中のマクロファ
ージ等の中にそのような因子を見出した［ジェイ、イム
ノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１１５＠３９
５頁（１９７５年）］。マシューズ（ＭａｔＬｂｅｗｓ
）らはヒト末梢血単球由来のまたは骨髄性単球性白血病
患者由来の白血病細胞中にそのような因子を見出した【
マシューズら（ＭａｔＬｈｅｗｓ６ｔ ａｌ、）、イム
ノロジー（１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） ４４１Ｊ１３５頁
（１９８１年）】。また、バーバラ（ｎａｒｌ＋ａｒａ
）らはニブシュタイン・バー・ウィルス（ＥｐｓＬｅｉ
ｎ−ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）により形質転換されたヒト
Ｂ細胞中に〔デイ−、バーバラら（Ｄ、Ｂａｒｂａｒａ
ｅＬａｌ） ＋ブロク、ナト、アカド０ｇイ、アメリカ
合衆国（Ｐｒｏｃ、 ＮａＬ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ）８０巻５３９７頁（１９８３年）］、また、バー
ラット（Ｂｈａｒａｔ）らはリンパ芽球１７８８細胞株
中にそれぞれ゛ｌ’ＮＦ様生理活性物質を見出している
。 上記した様な因子はまた、特開昭５８−１５９２１．５
８−２１６２１．５８−１０７１９７．５８−２２５０
２４号、英国特訂出願公開番号２．１０６．１１７及び
２，１１７，３８５号にも記載されている。しかしなが
ら、このような因子を効率的に生産する細胞または細胞
株は、見出されていない、更に、これらの因子の構造や
物性に関して、はとんど知見が得られていない。 伊東はウサギＴＮＦの構造及び特性、およびウウギＴＮ
Ｆ産生細胞について研究を行なった〔特願昭５８−２５
１８１７号］、その結果、ウサギに網内系賦活化作用を
有する物質を投与後、細菌由来のエンドトキシンを注射
投与することにより、Ｌｆ１４ａ胞障害活性を有する物
質の産生能を有する細胞を得、さらにＬ細胞を用いてそ
の物質を得た。伊東はさらに上記の通り得られた細胞を
用いて得られたし細胞障害活性を有する物質の分子量と
、免疫学的特性がウサギ血清から得られた’ｒ Ｎ Ｆ
のものと一致することを確認した。一方、遺伝子操作技
術の進歩により、ある蛋白質をコードするＤＮＡを単離
できれば、その蛋白質の構造を決定することが可能とな
った。なぜならば、単離されたＤＮＡの構造は決定する
ことができ、次に蛋白質の構造はそのＤＮＡの構造から
演鐸することができるからである。更に、微生物又は培
養細胞を利用しである蛋白質をコードするＤＮＡからそ
の蛋白質を製造することができるようになった。伊東は
上記遺伝子操作技術をＬ細胞障害活性を有する物質を産
生することのできる細胞に応用し、その結果、ウサギ′
ｌ″ＮＦをコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡとウサ
ギＴＮＦの構造を決定し、そして該ＤＮＡを用いてウサ
ギＴＮＦを製造することに成功した。 上述の通り、伊東はウサギｉ’ Ｎ Ｆを製造すること
に大きな成功を納めたが、ＴＮＦの由来する動物とは異
なる動物にＴＮＦを投与するとアナフィラキシ−ショッ
クを起す可能性がある。なぜならば、’ｌ’ Ｎ Ｆは
ポリペプチドであるので、１’ Ｎ Ｆが該ＴＮＦの出
来ではない動物に投与されるとＴＮＦは抗原として働き
、抗体を産生せしめるからである。この理由から、１’
Ｎ Ｉ？を人体に投与しようとするならば、ヒト出来
のＴ Ｎ Ｆの使用が非常に好ましい、しかしながら、
ヒトｒ Ｎ Ｆの構造ずら十分に解明されていなかった
。それ故、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの構造の決定
が強く望まれていた。
【問題点をカゲ決するための手段および作用１本発明者
らはヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの溝道について鋭意
研究を行なった。その結果、意外にも、ヒトポリペプチ
ド遺伝子及びウサギＴＮＦ遺伝子をウサギｃＤＮＡをプ
ローブとして利用することによりクローンすることがで
きること、ヒトポリペプチドをコードするＤＮＡを巧く
単離することができ、その構造が塩基配列の相同性に関
してウサギＴＮＦ遺伝子、ヒトポリペプチド遺伝子及び
ウサギｃＤＮＡを比較することにより決定できること、
ヒトポリペプチドをコードする純粋なりＮＡの１１ζ造
も巧く決定することができ、その純粋なりＮＡを得るこ
とができること、およびヒトポリペプチドをコードする
ＤＮＡを用いて得られたヒトポリペプチドがし細胞障害
活性を有することを本発明者らは発見した。 本発明は、これらの新しい知見に基づき完成された６ 即ち、本発明の目的は、ヒｌ−Ｉ’ Ｎ Ｆをコードす
るＤＮＡを提供することにある。 また、本発明の目的は、ヒト１’ Ｎ Ｆをコードする
ＤＮＡと複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な
組換ＤＮＡを提供することにある。 更にまた、本発明の目的は、上述のような組換ＤＮＡで
形質転換された微生物又は細胞をｌｊｌ供することにあ
る。 前述したこと及び本発明の他の諸目的、諸特徴及び諸利
益は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な記載から
明らかとなろう。 木質的には、本発明によれば、次式（１）％式％ （式中、Ｇｌｎはグルタミン残基、Δｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシン残
基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｇｌ＋
はグルタミン酸残基、＾ｌａはアラニン残基、＾ｓｎは
アスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｌ＋ｅは
フェニルアラニン残基、Ｇｚｙはグリシン残基、ｌ１ｉ
ｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、ＴＩ＋ｒは
スレオニン残基、ｌｉｅはイソロイシン残基、Ｔｒｐは
トリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍｅｔ
はメチオニン残基及びＣｙｓはシスティン残基を表わす
）で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性ポリ
ペプチドをコードする塩基配列を含有するデオキシリボ
核酸が提供される。 更にまた、本発明によれば、次式（ＩＩ）で表される塩
基配列 ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣＣ
Ｇ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＧ （：（：Ｔ ＧＴ
ＡＧＣＣＣＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ Ａ
ＡＣＣ（：Ｔ ＣＡＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧ
ＧＧＡＧ ＣＴ（： （：ＡＧ ＴＧＧ ＣＴ
Ｇ ＡＡＧ ＣＧＣ（：ＧＧ ＧＣＣＡＡＴ Ｇ
ＣＣＣＴＣＧＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡ
Ｇ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＧＡＧ ＣＴＧ
ＧＴＧ ＧＴＧ （：（：Ａ ＴＣＡ Ｇ
ＡＧ ＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴ
ＣＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣ： ＴＴＣＡＡＧ ＧＧＣ
ＣＡＡ ＧＧ（：ＴＧ（： （：（：ＣＴＣ（：
ＡＣＣＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣ：ＣＣ
ＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣ（：Ｇ（１： ＡＴＣＧＣＣＧ
ＴＣＴＣ（： ＴＡＣＧＡＧ ＡＣＣ： ＡＡＧＧＴ（
： ＡＡＣＣＴＣＣＴ（： ＴＣＴ ＧＣＣＡＴＣＡＡ
Ｇ ＡＧＣＣＣＣＴＧ（：ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＧ
ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＴ
ＧＡＧ ＧＧＣ＾＾ＧＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ Ｇ
ＡＧ ＣＣＣＡＴＣ丁ＡＴＣ丁Ｇ ＧＧＡ ＧＧ
Ｇ ＧＴＣＴＴ（： ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ＾ＡＧ
ＧＧＴ ＧＡＣ： ＣＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡ
Ｇ ＡＴＣＡＡＴ （：ＧＧ ＣＣＣＧＡＣＴＡ
Ｔ （：ＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣＧＡＧ ＴＣＴ
ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ ＧＧＧ ＡＴ
ＣＡＴＴ ＧＣ（１：ＣＴＣ （式中、Δはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及び゛「は
チミジル酸残基を表わし、式（ｕ）の左端および右端は
それぞれ５゛−水酸基側および３′−水酸基側を表わす
） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有するデオキシリ
ボ核酸が提供される。 本発明のＤＮＡは、微生物や培養細胞によって成熟ヒト
ＴＮＦを生産するために、０１１記塩基配列の５′末端
にＡＴＧ （Ａ、ＴおよびＧはｎｉＪ述の通番月が結合
した塩基配列からなるＤＮＡを包含する。本発明のＤＮ
Ａはまた、ヒト１’ＮＦのシグナルペプチドの部分また
は全部をコードする５′−フランキングＤＮＡを含むＤ
ＮＡも包含する。 自然の変異によりまたは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、ＤＮＡのｔＭ造及びそれから
演鐸されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめるこ
とが可能である。従って本発明のＤＮＡは、ｎ；ｆ述の
すべてのポリペプチドの相同変異体に相当する構造を有
するポリペプチドをコードする塩基配列を含有すること
も可能である。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子の塩基
配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換す
ることができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝
暗号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列を
含有することも可能である。この場合、上記置換により
得られた塩基配列から演鐸されるアミノ酸配列はｎ；１
に定義した式（１）のアミノ酸配列と一致する。 更にまた、本発明によれば、ｎｆ記デオキシリボ核酸と
複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組ｊＡＤ
Ｎ Ａが提供される。該組換ＤＮＡは。 それによって形質転換された微生物または細胞中で、ヒ
ｌ−’ｌ’ Ｎ ［’のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを発現することができる。適したベクタとしては
、例えば、ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ ５−１及びｐＨ’
ｒＮＦ〜ｌａｃ ＵＶ ５−２ ｆＱ ＱＬベクターが
挙げられる。 更に本発明はまた。ヒト′Ｉ″ＮＦのアミノ酸配列を含
有するポリペプチドを発現し得るｔｓｎ可能な組換ＤＮ
Ａで形質転換された微生物または細胞に係る。このよう
な微生物または細胞として、大腸菌、枯草菌、酵１ｕ、
高等動物細胞が挙げられる。 ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡは次のようにして得られ
る。 ■、バクテ１オファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージ入／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは、バーバード大学生化学および分子生物学部
〔アメリカ合衆国、マサチューセッツ０２１３８、ケン
ブリッジ、デイビニティ アベ二′ニー７、（７Ｄｉｖ
ｉｎｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｌｓ ０２１３８．Ｕ、Ｓ、Δ
）〕のティー、マニアティス（ＴｌＭａｎｉａＬｉＳ）
教授により調製されたものを用いる。これらのライブラ
リーは次の方法によって作ることができる。 〔セル（
Ｃｅｌｌ）、 １５１゜６８７頁（１９７８年）参照
〕 （１）ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサギある
いはヒトのすい臓を凍結粉末にし、ＲＮＡと蛋白成分を
分解処理し、沈澱によってウサギあるいはヒトの高分子
ＤＮＡを得る。 （２）この高分子ＤＮＡは遺伝子座位をランダムに切る
ために、部分的に分解する。 （３） ｆｔ）られたＤＮＡ断片から分子量分画によっ
て、１５かも２０キロ塩基対（Ｋｂ）の大きさの断片を
得る。 （４） ］二程３で得られたＤＮＡ断片をλ シャロン
４Δフアージベクターを用いてクローン化する。 （５）得られたベクターを、ｒＤＮ八を含む感染性のフ
ァージ粒子にｉｎ ｖｉｖｒｏで組み入れ、上記のウサ
ギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリを得る。 ２、参考例３で得られたウサギｒＮＦのｃＤＮΔは、ビ
ー、ダブリュー、ジェイ・、リグビー（Ｐ。 Ｗ、 Ｊ、 Ｒｉｇｂｙ）らのニックトランスレーショ
ン法〔ジェイ９モル、パイオル、 （Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、）、１１３９．２３７頁（１９７７年）参照
〕によって°″Ｉ）でラベル化する。 ３、バクテリオファージス／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージλ／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の上に密に
プラークができるように植えつけ、′″Ｐでラベルした
ウサギＴＮＦのｃＤＮＡとハイブリダイズさせてスクリ
ーニングする。 ４、適合するクローンより、対応するＤＮＡを単離し、
制限酵素地図を作り、サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハ
イブリダイズ法〔イー、エム、サザーン（ＥｏＭ。 ５ｏｕｊｈｅｒｎ）、ジェイ１モル、パイオル、 （Ｊ
、 Ｍｏ１゜１１ｉｏ１．）、 ９８巻、５０３頁（１
９７５年）参照〕によって解析する。 ウサギ１’ＮＦとヒト’Ｉ’ Ｎ Ｆの遺伝子を含む制
限酵素分解された断片を、プラスミドベクター中に導入
し、サブクローンした後、塩基配列を解析する。 ５、ウサギ”ｌ’ＮＦのｃＤＮＡとウサギＴＮＦ遺伝子
の塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝子のエクソン
（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコードする塩基配列）
と、イントロン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコード
しない塩基配列）を決°定する。 ６、そして、ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦの遺伝子
を比較して、ヒト”ｒ Ｎ Ｆ遺伝子のエクソンとイン
トロンを決定する。 ７、ウサギＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除しエクソン
を結合することによって得られた塩基配列より決められ
るウサギＴＮＦのアミノ酸配列は、ウサギ１”ＮＦのｃ
ＤＮへの塩基配列より決められるアミノ酸配列と一致す
ることが確認される。 ８、次に、ヒトＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除し、エ
クソンを結合することによって得られた塩基配列よりヒ
トＴＮＦのアミノ酸配列が決められる。ヒト］’ＮＦの
アミノ酸配列は、ウサギＴ Ｎ Ｆ。 のアミノ酸配列と部分的に一致することが＃ｌ認される
。 このようにして得られたヒト’ｒ Ｎ Ｆをコードする
ＤＮＡから以下のようにして、ヒト’ｒ Ｎ Ｆを製造
することができる。 １、ヒトＩ”ＮＦをコードするＤＮＡをｉｎ ｖｔｔｒ
。 で修飾し、適当な発現ベクターに導入し、そのＤＮＡを
含む組換ＤＮＡを作製する０組換ＤＮＡは適当な宿主に
導入し、これを培養液中で増殖せしめて所望のヒトＴＮ
Ｆを発現せしめる。 ２、このようにして得られるヒト’ｒ Ｎ Ｆは成熟形
でセリンかも始まる１５５個のアミノ酸残基かもなる。 それがプレシーケンスにシグナルペプチドを有している
場合、シグナルペプチドは非常に疎水性の性質を有する
。 以上は、ヒトＴＮＦ遺伝子およびヒトＴＮＦをコードす
るＤＮＡの取得方法および該ＤＮＡを用いるヒトＴＮＦ
の製造方法を示したものである。 しかし上記の記載は本発明を限定するものではなく、本
発明の木質的な特徴及び基本概念を変えることなく当業
者によって明らかな変換を行なうことができる。 各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの塩基配列の一部または
全部を、有機化学的に合成された人工のＤＮＡに置換え
ることも可能である。 おそらく、ヒトＴＮＦは、プレペプチド又はプレプロペ
プチドとして未成熟形で細胞内に産生され、プロセシン
グ段階でプロセスされて中間体を経て、成熟ＴＮＦ’を
形成するものと考えられる。 ヒトＩ’ Ｎ Ｆの未成熟形はヒト’「ＮＦ遺伝子の塩
基配列から演鐸される。未成熟又は中間体のＴＮＦをコ
ードするＤＮＡからなるＴＮＦ ＤＮＡは、また天然
又は人工合成のＤＮＡと組換えることができる。 これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ遺
伝子の５′端に導入し、そして３′端に’ｒＡΔもしく
は’ｒ Ａ ＧもしくはＴＧＡの終止コドンと呼ばれる
トリプレットを、少なくとも１個導入することである。 メチオニンコドンが存在することにより、適当なプロモ
ータによって合成される＋ｍＲＮＡから成熟あるいは未
成熟あるいは中間体ＴＮＦが産生される。この様にＴＮ
Ｆの末端に付加されたメチオニン残基は、宿主によって
は自然に除去される。終止コドンを挿入する目的は’Ｉ
’ Ｎ Ｉ＝ Ｄ ＮＡから転写されたｍＲＮΔから
の翻訳を適当な位置〔式（１）のポリペプチドのＣ末端
］で止めることである。 また別の形態としては、゛′シグナル配列”と呼ばれる
疎水性に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の
外またはダラム陰性細菌においては。 ゛′ペリプラズム″と呼ばれる部分へ、分泌させること
も可能である。 また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するペプチドとＴＮＦとの融合ペプチド
を形成するが、この場合は化学的または酵素的に切断す
るか、もしくはＴＮＦの主たる活性に変化がなければ、
そのまま用いることができる。 ヒトｉ’ Ｎ Ｆ遺伝子を、正しく転写し、それによっ
て得られる＋ｏｆｌＮＡからの翻訳が正しく行われるよ
うな配列において、プロモーター等の５′領域の遺伝子
配列に接続し、得られたＴＮＦ ＤＮＡ−プロモータ
ー配列を細菌または高等生物細胞中で複製可能なベクタ
ーと接続した組換遺伝子を得、この組換遺伝子によって
宿主として細菌または高等生物細胞を形質転換し、この
形質転換体を増殖せしめ、ｉ’ Ｎ Ｆ遺伝子を発現せ
しめることにより！’ Ｎ Ｆを得ることができる。 宿主として大腸菌［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｌ＋ｅ
−ｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ） ］ （以下゛′大腸菌
′″と記載する）を用いる場合は好適には大ｎ９菌に１
２株の種々の変異株、例えばＨＢ Ｉ ０１ （ＡＴＣ
Ｃ３３６９４）、Ｃ６００Ｋ（八ｒ［；［；３３０５５
）、 Ｉ） Ｉ ２ １ ０ 、１又 ＲＩ（Ａ丁
ＣＣ３１３４３）、 ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２
（八ＴＣＣ３３５７２） 、 Ｊ Ｍ Ｉ Ｏｌ （
ＡＴＣ（： ３３８７６）、ＪＭ８３、χＩ ７７６
（ＡＴＣＣ３１２４４）などが用いられる。 大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、１口Ｒ３
２２、ｐ＋３１？３２５、 ｐ［ｌＲ３２７、ｐＵｃ８
、 ｒ＋Ｕ（：９、 ｐＭＢ９（ＡＴＣ［： ３７０１
９） 、 ｐＪＩ！８ （ＡＴＣＣ３７０７４）、ｐＫ
Ｃ７（ＡＴ（Ｉ； ３７０８４）等のプラスミドあるい
はλｇｔ。 λＢ、シャロン４Ａのようなλファージ、ＭＩ３ファー
ジなどが用いられる。 大腸α１の菌体中に、該生理活性ポリペプチドを産生さ
せるために、大腸αＪの遺伝子またはファジ遺伝子のプ
ロモーターが使用される。このようなプロモーターとし
て、好適にはラクトース分解酵素（ＬΔＣ）のプロモー
ター及びそのＵＶ５変異、ペニシリナーゼ（［３ＬＡ）
、ｌ−リブトファン合成酵素（ＴＲＩ））のプロモータ
ー、λファージのＰＬプロモーターあるいはトリプトフ
ァン合成酵素と、ラクトース分解酵素の融合プロモータ
ーであるＬａｃプロモーター等が用いられる。 枯草菌［バチルス・サブチリス（３ａ（ｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ） ］ （以下゛′枯草菌パと記載す
る）を宿主とする場合には、ＢＤ１７０株（ＡＴＣＣ３
３６０８）、ＢＲ１５１株（ＡＴＣＧ ３３６７７）、
ＭＩ１１２株（ＡＴＣＣ３３７＋２）などが用いられ、
ベクターとしてはｐｃＩ０４（ＡＴ（１：Ｃ３７０３４
）、ｐＵＢＩＩｏ （ＡＴＣＣ３７０１５） 、 ｐＳ
＾２１００（ＡＴＣ：Ｇ３７０１４）、ｐに１９４など
のプラスミドが用いられる。 枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素（（：ＡＴ）やベニシ
リナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモー
ターが用いられる。 酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ
ｅ ）のｒｌｌ＋２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、５
ＩＩＹ １株（ＡＴＣ（： ４４７６９）、５ＩＩＹ
３株（＾１’ＣＧ ４４７７１）、ＤＩ３１Ａ株、４８
３株、８３０株などが用いられ、そのベクターとしテハ
ＹＩＥｐ ｌ ３ （ＡＴＣＣ３７＋１５）、ＹＥｐ６
、ＹＲｐ ７、Ｙｌｐ ５等のプラスミドが用いられる
。 酵１才を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホ
スファターゼ、アルコールデヒドロゲナゼ（ΔＤｌ−１
１）、１−リプトファン合成酵ｆＡ（ＴＲＰ）、ホスホ
グリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、チトクロームＢ （
ＣＯＢ）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いら
れる。 高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、サル腎細胞、
ＣＯ３細胞、マウスＣ１２７細胞（ＡＴにＣ：＋６１６
）などが用いられ、そのベクターとしては５ｖ４０ウイ
ルス等を用いることができる。 本発明で得られる新規生理活性ポリペプチドの分子量を
レムリ（Ｌａｅｎ＋ｍ１ｉ）の方法［レムリ、ニーケー
、（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｏ，に、）（１９７０）ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２２７巻、６８０頁〜
６８５頁〕に従ってＳＤＳボリアクリルアミド電気泳動
（ＳＤＳ ｒ’ＡＧＥ）で測定すると、約１７０００を
示す、尚、その際にマーカーとしては、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量９４Ｋ）、ウシ血清アルブミン（分子ｆｆ１
６７Ｋ）、オボアルブミン（分子量４３Ｋ）、カルボニ
ックアンヒドラーゼ（分子量３０Ｋ）、大豆トリプシン
インヒビター（分子量２０、ＩＫ）とα−ラクトアルブ
ミン（分子ｊｉ１４．４Ｋ）を用いる。 本発明のＤＮＡから得られる新規生理活性ポリペプチド
は生体の正常組織は傷つけず、腫瘍の壊死を引きおこす
。本発明の活性ポリペプチドは公知の方法によって調剤
して悪性腫瘍細胞増殖のような細胞増殖を阻害するのに
有効な医薬組成物を調製することができる６本発明の活
性ポリペプチドは薬剤として使用可能な担体と混合する
こともできる０本発明の活性ポリペプチドの有効量を適
当な量の７１体と混ぜて、患者に効果的に投与するのに
適した医薬組成物を調製することができる。 本発明のＤＮＡから得られる生理活性ポリペプチドは、
抗腫瘍治療または抗ウイルス治療の必要な患者に注射剤
、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、外用剤、経１コ投与用剤、
直腸投与用剤、膣内投与用剤などにして投与することが
できる。 本発明のポリペプチドの成人１日当りの治療量は、一般
に５０単位〜ｔｏｏ、 ０００．０００単位であり、さ
らに好ましくは局所適用においては５０〜５００．００
０単位、静脈注射、筋肉注射などの全身注射においては
、１，０００〜１，０００，０００単位、経口投与にお
いては、１０．０００〜ｔｏｏ、 ０００．０００単位
であり、用法あるいは症状に応じて適宜増減することが
できる。 （以下余白） 上記において用いた゛ｌ単位″はＬ−Ｍ細胞（Δ１’Ｃ
：ＣＣＣＬ １．２） ｌ Ｘ Ｉ Ｏ’ｆｌｉ２／ｍ
Ｑの５０％を殺す本発明の生理活性物質の量を意味する
。上述の量は次のようにして測定する。培養容器として
９Ｇ穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボト
リー社、米国）を用い、Ｌ−Ｍ細胞を１ ｖ／ｖ％のウ
シ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル
培地（その組成は、たとえば、「組織培養」中外Ｑｊｌ
之助池編集、朝食書店、１９６７年に記載されている）
中で培養する。順次培地で希釈した該生理活性ポリペプ
チド試料０．１ｍＱとｌＯ＠個／ ｍ Ｑの濃度のＬ−
Ｍ細胞の培地懸濁液０．１ｍＡをプレートの各式の中で
混合し、マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空気
中、３７℃で４８時間培養する。培養終了後、２０％グ
ルタルアルデヒド水溶液２０μＣを加え細胞を固定する
。固定後、マイクロプレートを蒸溜水で洗浄、乾燥して
、０．０５％メチレンブルー溶液をＯ，１ｍＱ加え、生
き残った細胞を染色する。余分なメチレンブルーを洗い
流し乾燥した後、残ったメチレンブルーを０．３６Ｎ塩
酸溶液で抽出し、その６６５ｎｍにおける吸光度をタイ
ターチック・マルチスキャン（フロー・ラボラトリ−社
、米国）で測定する。この吸光度は、生き残った細胞数
に比例する。上記の本発明の生理活性ポリペプチドのｌ
×１０°個のＬ−Ｍ細胞の５０％を殺す量は希釈率と吸
光度をグラフ上にプロットすることによって求めること
ができる。 本発明のＤＮＡから得られる生理活性ポリペプチドは、
非経口的に適用することができる。非経口投与用の調剤
にあたっては、アルブミン、ゼラチン、グロブリン、プ
ロタミン、プロタミン塩などの安定化剤、ショ糖、グリ
セリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
スなどの増粘剤、各種無機塩のｐｌ＋調整剤などを添加
剤として加えることができる。また、本発明の生理活性
ポリペプチドは、錠剤の形で投与することもできる。 錠剤の調製の際に用いられる添加物の例としては、上述
の安定化剤に加えて、デンプン、乳塘なとの賦形剤を挙
げることができる。 具体的には、動物実験の結果、マウスの腫瘍も大半か−
、二回の注射投与で完治する。たとえば、マウスの皮膚
に人工の腫瘍（メスＡ細胞）を移植、直径６〜７ミリに
なった段階で本発明の新規生理活性ポリペプチドをわず
か０．６マイクログラム注射すると、−週間後にかさぶ
た状になり、二週間後には再び毛が生え始めて完治、そ
の後、妊娠、出産する。 以下に参考例および実施例によって本発明を詳細に記す
が、本発明はこれに限定されるものではない。 本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断らない限り下記の実験書（１）
〜（４）に従って実施する。 （１）高木康敬編著 遺伝子操作マニュアル、講談社 （２）高木康敬編著 遺伝子操作実験法、講談社（３）
ティー、マニアティス（７０Ｍ６ｎｉａｔｉｓ）、イー
エフ、フリッチ、：Ｌ （Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｃｂ
）、ジェイ、サムプルツク（Ｊ、 Ｓａ＊ｂｒｏｏｋ）
、モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、コールドスプリングハーバ−ラボラト
リ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）刊（１９８２年米国）（４）レイ ウ
（Ｒａｙ Ｗｕ）ら、メソッドインエンザイモロジ−（
ＭｅＬｌ＋ｏｄ ｉｎ ｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１
０１０、アカデミツク プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ ｒ
’ｒｅｓｓ）（米国）刊考例および実施例中で用いられ
る略号 ＭＯＰＳ ：モリフオリノブロバンスルホン酸Ｌ８
培地 ：ルリアーベルタニ培地 ＤＭＳＯニジメチルスルフオキシド ＰＦＵ ・プラーク・フォーミング単位Ｅｌ）Ｔ八
：エチレンジアミン四酢酸 ５ｔ）Ｓ ・ドデシル硫酸すｌ・リウム＋１１？Ｌ
：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、米国 ＤＭＦ ニジメチルホルムアミド １ｉｌａｃ ：ラクトース トリス（Ｔｒｉｓ） ・ｌ・リス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン ＸＡＲ−５＋ Ｘ線フィルム（イーストマン・コダック
社、米国） Ｉ Ｘ５ＳＣ： ０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０Ｉ
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ２ Ｘ５ＳＣ： ０．３０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０３
０Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ３ Ｘ５ＳＣ： ： ０．４５Ｍｍ化ナトナトリウム
＋０．０４５エン酸ナトリウム、ｐｌ（７ ５Ｘ５Ｓ（： ： ０．７５Ｍ塩化ナトリウム＋０．
０７５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ６ ｘＳＳＣ： ０．９０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０９
０Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ＦＤＳＳ ： ５０％脱イオン化フォルムアミド＋
５×デンハルト（ＤｅｎｈａｒｄＬ’ ｓ） ＋ ５
Ｘ ５ＳＰＥ＋ Ｏ，ｌ工ｓＤｓ ＋ Ｉ ＯＯｐｇ／
ｍ Ｑ変性ウシ胸腺ＤＮＡ ５ＳＰＥ ： ０．１８Ｍ塩化ナト’） ラム＋
ｌ Ｏ＋ｍＭＩＪン酸二水素ナトリウム＋１ ｍＭ Ｅ
ＤＴ＾、ｐ１１７．４ ＳＭ ： ｌ １） ｉ’ｌ：塩化ナトリウム５
．８ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２ｇ、１Ｍ トリス−ＣＱ（Ｔｒｉｓ−ＣＱ）（ｐＨ７，５）５０ｍ
ｇと２％ゼラチン５ｍ込を含む ファージ保存培地 ＮＺブロス・ｌｃ中にＮＺアミン（カゼインのタイプΔ
水解物、フムコ・シェフイールド・ ケミカル・デビイジョン・オブ・クラ フト社、米国）ｌｏｇ、塩化ナトリウ ム５ｇと硫酸マグネシウム・７水和物２８を含む培地 １ｒ’ＴＧ ：イソプロビルチオガラクトシドＸ−
ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラ
クトシド ＴＡＥ ：０．０４Ｍ トリス（Ｔｒｉｓ）−
酢酸（ｐｌ＋８、０）−０，００２Ｍ ＩＥＤＴ＾ ５×デンハルト溶液：ｌθ中にフィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）１０００ｍｇ、ポリビニルピロリドン １０００ｍｇ、及びウシ血清アルブミン１０００ｍｇを
含む水溶液 ｂｐ：塩基対 ［実施例１ 参考例ＩＬ細胞障害活性評価 以下の参考例及び実施例においてし細胞を用いる活性３
１価は、ラフ（Ｒｕｒ「等）［リンホカインズ（Ｌｙｍ
ｐｂｏｋｉｎｅｓ） ２ ｕイー、ビック（［シ、Ｐｉ
ｃｋ）編集、アカデミ・ツク ブレス（八ｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｉ’ｒｅｓｓ） ２３５頁（１９８０））あるいは
［ジエイ、イムツル。 （Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、） １２６巻１２７９頁（１９
８１年）］の方法にｉ！Ｉじ、本発明による生理活性物
質がＬ９２９細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１）を殺す効果を測
定するものである。すなわち、順次培地で希釈した試料
０．１ｍαと、１０’個／ ｍ Ｑの濃度のし細胞の培
地ｇ！濁液０．ｌ ｍαを、９６穴の組織培養用マイク
ロプレート（フロー・ラボラトリ社、米国）に加える。 培地はｌｖ／ｖ％のウシ胎児血清及び最終濃度５μｇ、
／ｍＱのアクチノマイシンＤを含むイーグルのミニマム
・エツセンシャル培地（その組成は、たとえば、「組織
培養」中耳１ｉｆｆ之助他編集、朝食書店、１９６７年
に記載されている）を用いる。マイクロプレートを５％
の炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２１時間培養する。 培養終了後、２０％グルタルアルデヒド水溶液２０ Ｉ
ｔ Ｑを加え、細胞を固定する。固定後、マイクロプレ
ートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶液
を０．１ｍ（Ｌ加え、生き残った細胞を染色する６余分
なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残ったメチレ
ンブルーを０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、その６ｆｂ をタイターチック・マルチスキャン（フロー・ラボラド
す〜社、米国）でｉｌｌ’ｌ定する。この吸光度は、生
き残った細胞数に比例する。 Ｌ９２９細胞の５０％
を殺すために必要な生理活性量をＩ単位／ｍＱと定義し
、試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する
試料の希釈率を、グラフあるいは４算によって求め、そ
の希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位／ｍαで表記
する）とする。参考例において用いる”１単位′°は、
１０’個／ｍαのＬ９２９細胞の５０％を殺すウサギＴ
Ｎ Ｆの量を意味する。 一方、蛋白質量は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄ−ｒｏ
ｒｄ）らの方法〔アナル、バイオケム、（Ａｎａｌ、
Ｂｉ。 ｃｂｅｍ、） ７２巻２４８〜２５４頁（１９７６年）
ｊにより、クーマシー・ブリリアント・ブルー６２５０
を用いる色素結合法から算出する。 参考例２ 工程ｌ （ウサギ血γｆｔＴＮＦの取得）雌ウサギ（体
重２．５〜３．０ｋｇ）にホルマリンにて死菌処理した
プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏ ｉｏｎｉ
ｂａｃＬｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ） （コリネバクテ
リウム・パーバム（にｏｒ ｎｅｂａｃＬｅｒｉｕｍ
匹■朋）、ウェルカム社、英国１５０＋ｎｇを耳静脈よ
り注射する。 該ウサギに８日後再度１００μｇのエンドトキシン〔大
腸菌０２６ ： Ｂ６山来のりボボリサッカライド、デ
イフコ社製、米国〕を耳静脈より注射し、２時間後に心
臓より全採血する。採取した血液に１００ｍＱ当り１０
０単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５．ＯＯＯｒ
ｐｍで３０分間冷却遠心操作を行ない、血球および不溶
固型物を除去する。 ４０羽のウサギより、血清ＴＮＦ３ＸＩＯ’単位／ｍα
の活性を有する血漿２．４αが得られる。 工程２（血？ｆｆ ＴＮ Ｆ ｃ７）部分ｉｎンコニ程
１でス；）た血漿２．４Ｃにセライｌ−２４ｇを加え、
１時間撹１゛シた後濾過する。ｌｌｘ液に１．２αの０
．０４Ｍ＋−リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋ ７ 、８ ）
を加えた後、０，１Ｍ塩化すトリウムを含む０．０４Ｍ
トリス−塩酸縁１ｆｌｉ液（ｐｌ＋ ７ 、８ ）で充
分に平衡化した１）［ミ＾ＩミセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社、スウェーチン）のカラムに添加する
。０．０４Ｍトリス−塩酸縁６ｊ液で洗浄後、Ｏ，１８
Ｍ塩化ナトリウムを含む０，０４ＩＶｌリス−塩酸緩衝
液（ｐｌ＋７．２）を用いて溶出する。Ｌ細胞障害活性
を示す両分を、限外濾過により濃縮する０次いで５ｍＭ
リン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（フ
ァルマシア社、スウェーチン）のカラムに該濃縮液を添
加し、同緩征ｉ液にてゲル濾過を行なう、活性画分は限
外濾過により濃縮し３．５×１０＠単位を回収する。比
活性は１８ＸＩＯ＠単位／ｍｇである・ 工程３（抗Ｔ Ｎ ｌ？抗体） 血γ１１ｉより得た’［’ Ｎ Ｆを工程２の如く部分
精製しフロイントの完全アジュバントをｆ、１で混合し
１２週令のｔｌｉ ＢＡＬ［ｌ／ｃマウスの背部皮下に
注射する。２週後、及び４週後にこの操作を繰返し、更
に１週後に全採血し、その血清を取得する。 この血清をＬ細・胞障害活性を測定する培地中に終濃度
５００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得た
ＴＮＦのし細胞障害活性を参考例１に示す方法で測定す
ると、Ｌ細胞障害活性は認められない、ここに得られる
マウス血清は、ウサギ血清’ｒ Ｎ Ｆに対する抗体（
抗ＴＮＦ抗体と称する）を含むものと結論できる。 参考例３ 工程＋（１’ＮＦ産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したプロピオニバク
テリウム・アクネス（Ｐｒｏ ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍａ亜弘）〔コリネバクテリウム・パーバム（如り黒
υｂａｃＬｅｒｉｕｍ 匹■肥）、ウェルカム社、英国
Ｊを静脈内反ケし、７日後に気管切開し、肺を生理食塩
水で洗浄することにより澤遊性細胞を得る。この細胞を
生理食塩水で洗浄後、１０％ウシ胎児血清（フロー・ラ
ボラトリ−社、米国）を含むＲ１）ＭＩ ｌ６４０（フ
ロー・ラボラトり一社、米国）を培地とし、炭酸ガス５
％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベーターに
て、３７℃で培養する。培養器を２コに分け、一方には
大腸菌由来のエンドトキシン〔大腸菌０２６：１３６由
来のりボボリサツカライド、デイフコ社、米国］を１１
０１Ｌ／ｍαとなるように添加し、一方には同量の滅菌
水を添加する。エンドトキシンを添加した培養上清にＬ
細胞障害活性が出現し７時間で最高値に達する。 この活性は抗Ｔ Ｎ Ｆ抗体で消去されるが、正常マウ
ス血清ではｔｌ’ｌ去されない。 一方、エンドトキシンを添加しない細胞培養上清にはＬ
細胞障害活性は認められない。 工程２ （ＴＮＦの分子量） 工程ｌにおける細胞培養においてエンドトキシンと共に
放射性し−〔１”Ｓ］メチオニン（１３００ｃ：ｉ／ｍ
ｍｏ Ｑ ｅ、アマージャム社、英国）をＩ ｍＣ１／
ｍ Ｑとなるように添加して培養を行う、培養上清を
レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）の方法ｒレムリ（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ）英国（１９７０年）ネーチＪＩＦ −（Ｎａｔ
ｕｒｅ） （ロンドン）２２７巻６８０〜６８５頁）に
従ってＳＤｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により解
析する。 ゲル濃度は１２．５％となるようにｌｌ１ｌＩ製する。 泳動後エンハンス（［ＥＮＨＡＮＣＥ ）にニー・イ
ングランド・ヌクレアー社、米国）により処理し、乾燥
後、Ｘ線フィルム（フジＲＸ、富士写真フィルム）に密
着ｎ光せしめる。エンドトキシン存在下に培養した培養
上清に、分子量的１７５００の物質の生成が認められる
。 また工程ｌにおける細胞培養の上清を上記と同様にＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、２．５
％ＮＰ４０ （カルビオケム社、米国）で１時間、水
中で２時間様とう後、各泳動レーンを切断分離し、泳動
方向に直角に２ＩＩＩｌ中にスライスする。各スライス
断片をＬ細胞と共に培養することにより、し細胞障害活
性を調べる。エンドトキシン存在下に培養上清を展開し
たレーンの分子量的１７５００の位置にし細胞障害活性
が認められ、その池の位置には細胞障害活性は認められ
ない。 工程３（ｍｆｌＮＡの取得） 工程ｌと同様な細胞培養においてエンドトキシンを添加
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
浄細胞）を集める。細胞質ＲＮΔおよびその中からのｍ
ＲＮΔの抽出は下記の如くチャーブウィン（Ｃｂｉｒｇ
ｗｉｎ）らの条件［チャーブウィン、ジェイ、エム、（
Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、 Ｊ、 Ｍ、）ら、バイオケミスト
リー（１３ｉｏｃｌ＋ａｍｉｓｔｒｙ） ｌ ８０５２
９４頁（１９７９年）〕に従って行なう。細胞３ＸＩＯ
１個に対して４ｍｆｉの４Ｍグアニジンチオシアネート
溶液を加え、ホモジナイザー（ＡＭ−７、日本精機製作
所）にて破砕する。残査を遠心除去後、２．４ｇの塩化
セシウムを溶解し、あらかじめ２゜５ｍＱの５．７Ｍ塩
化セシウム、０． Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７、５
）を入れであるポリアロマ−チューブへ静かに！■層す
る。 ベックマン３Ｗ４１０−ター（ベックマン社、米国）を
用いて２０℃３ｏｏｏｏｒｐｍにて１２時間、超遠心分
離を行った後、上清を除き、ペレットをｌｏｍＭｈリス
−塩酸縁ｔｆｌｉ？ＩＪＬ（５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｌ
ｗ／Ｖ％ＳＤＳを含有する）１ｍ＋１にて溶解するにの
溶液を１ｍＱ、のクロロホルムと１−ブタノールの混液
（容積比４・ｌ）で抽出し、水層に０．０５容積の２Ｍ
酢酸ナトリウムと、２．５容積のエタノールを加え、−
２０℃で２時間以上放置してＲＮＡを沈澱させる。遠心
にて沈澱を集め、乾燥させたのち滅菌水５００μαに溶
解して、細胞質ＲＮＡ溶液を得る。 上記細胞質ＲＮＡｒＢ液を６８℃、２分間加熱後急冷し
、５００μＱの２倍濃度のｌ領１トリスＥＤＴＡ緩ｔｆ
ｌｉ液ｐＨ７、４（１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０，１ｗ／ｖ
％ ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、
２００ｍｇのオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ピーアール
エル（ＢＲＬ）社、米国）カラムに展開、１倍濃度の上
記バッファー１０ｍＡで洗浄、溶出縁１＃液（ｌＯ州ト
リス−塩酸ｐａ１７ 、４．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０，
１ｗ／ｖ％ｓＤｓを含む）２ｍＱで溶出する。溶出液に
０゜０５容積の酢酸ナトリウム溶液、２．５容積のエタ
ノールを加えて一２０℃に冷却して沈澱せしめる。沈澱
を遠心にて集め、再度同様にオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムに吸着する両分を集める。 紫外吸収スペクＩ・ル分析により、８５ＩＬｇのｍＲＮ
Ａを回収する。 工程４＜ｍＲＮＡのサイズ分画） 工程３と同様にしてｌｊ）られる＋５ＲＮＡ８８０μｇ
を２５０μ０の水に溶解し、５−２５％直線シヨ糖密度
勾配置 ０ｍＡに重層する。ショ糖密度勾配は、５およ
び２５％のショ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭト
リス塩酸ｐｌ＋ ７ 、２．２ ＋ｗＭ ＥＤＴＡ、Ｉ
ｗ／ｖ％ＳＤＳを含有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０
グラジエンター（イスコ社、米国）により作製する。 ベックマンＳＷ４１０−ターを用い、４℃４００００ｒ
ｐｍ、１２時間の超遠心を行ったのち分画回収装置（ベ
ックマン社、米国）により各４００ ／ｌ Ｑの分画を
回収する。各分画はエタノール沈澱し、遠心後滅菌水に
溶解する。 工程５（ｍＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍＲＮＡの翻訳は、
実験８（例えば寺岡宏、五木幹男、田中兼太部、蛋白質
、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９８
１年）に依る。アフリカッメガエルは、浜松生物教材よ
り得る。工程４で得た分画ｍＲＮＡをｌμｇ／μＣにな
るように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり、５０ｎ
ｆｉずつを微量注入し、ｌ ｍ ｇ ／ ｍ Ｑのウシ
血清アルブミンを含有するパース（Ｂａｒｔｈ）溶液（
７，５ｍＭｈリスー塩酸ｐｌ＋ ７ 、６．８８吐塩化
ナトリウム、１ｍＭ塩化カリ、０．３３ｔａＭ硝酸カル
シウム、０．４１ｍＭ塩化カルシウム、０．８２ｍＭ硫
酸マグネシウム、２．４１１口Ｍ重炭酸ナトリウム、１
８０／ｍＱペニシリンＧ、■８μｇ、／ｍＱストレプト
マイシンを含有する）中で２４時間培養する。培養液の
まま卵母細胞をガラス棒でつぶし、遠心後、上清のし細
胞障害活性を測定する。沈降定数１６３ （」近におい
て、Ｌ細胞障害活性が最高値を与える。またこの活性は
参考例２工程３で得た抗ＴＮＦ抗体により消去されるが
正常マウス血γＮでは消去されない。 工程６ （形質転換体の取得） 工程４で得た分画ｎＲＮＡ ５μｇを用い、実験′＃
１（１） ９６頁以降に従って二ｍＩｎＤＮＡを調製す
る。逆転写ｒＩＰ素はライフ倶イエンス社（米国）のも
のを使用する。二重鎖ＤＮＡを３゜５％ゲル濃度のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にて分画し、長さ約１００
０〜２０００ｂｐの画分３３０口ｇを得る。この両分７
ｎｇを用い同上の実験群に従い、ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラゼ［ピーアールエル（Ｂ
ＲＬ）社、米国］を用いてデオキシＣＡＪ１をつなぎ、
同様にＰｓｔ１部位にデオキシＣ鎖をつないだプラスミ
ドｐ１３Ｒ３２２５６１１ｇとアニールせしめる。アニ
ール後の混合物を用いて大腸α１Ｋ−１２株（ＩＩ［３
１０１、ＡＴにＣ３３６９４）を形質転換し、２０００
株の形質転換体を得る。 コニ程７ （ウサギ「ＮＦの部分アミノ酸配列）参考例
２で部分精製する’「Ｎ Ｆを、工程２におけると１４
様にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製
する。一部をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、
分子量的１７０００の位置に対応するバンドをゲルから
切出し、１％重炭酸アンモニウムにより抽出する。５Ｘ
ＩＯ’単位の１’ Ｎ Ｆを使用し、蛋白として約１８
０μｇ回収すこのうち１５０μ区を１％重炭酸アンモニ
ウム７５μＣに溶解、 ＴＰＣＫ トリプシン（ワーシ
ントン・バイオケミカル社、米国）３μｇを添加し、３
７℃、４時間インキュベートする０反応液をコスモシル
５Ｃ８（牛丼化学）を担体とする高速液体クロマトグラ
フィーにより分画し、トリプシン消化断片を得る。 上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトリプシ
ン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカラムで
脱塩し、凍結乾燥する。アール。 エム、ヒユーイック（Ｒ，Ｍ、 ｌｌｅｗｉｃｋ ）ら
の方法［ジェイ、パイオル、ケム、 （Ｊ、Ｂｉｏｌ、
ＣＩ＋ｅ＋ｓ、） ２５６巻７９９０−７９９７頁、１
９８１年〕に準じて、Ｎ末端よりエドマン分解を行なう
、各ステップにおいて遊離してくるフェニルチオヒダン
トインアミノ酸は、高速液体クロマトグラフィー、モデ
ル５Ｐ８１００（スペクトラフィジックス社、米国）を
用い、ゾルパックス○ＤＳ（デュポン社、米国）をカラ
ムとして、常法により分析する。この結果、ＴＮＩ？の
Ｎ末端側からのアミノ酸配列は下記の通りである。 ５ｅｒ−＾１ａ−３ｅｒ−＾ｒｇ−Ａ １ａ−Ｌｅｕ−
５ｅｒ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−ｆ’ｒｏ−Ｌｅｕ−＾１ａ−
１１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−トリプシン消化断片のうちの１つは、そのＮ末端
より下記のアミノ酸配列をもつ。 Ｇｌｕ Ｔｂｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔ八１へ 工程８（オリゴＤＮＡプローブの合成）参考例３工程７
で得た”Ｉ’ＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮ
Ａの塩基配列に対し、相補的な、オリゴＤＮΔを合成す
る０合成方法は、伊東らが既に発表している改良リン酸
トリエステル法（エイチ、イトウ（Ｉｌ、Ｉｔｏ）ら、
ニュークレイックアシッズレス、 （Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） １０巻１７５５〜１７６９
頁、１９８２年）により行う。 アミノ酸配列から推定される１２８種類のオリゴＤＮＡ
を５グループに分け、各々１６、■６．３２．３２．３
２種類の混合物として合成する。 各々を常法に従って脱保護し、セファデックスＧ−５０
（ファルマシア社、スウェーチン）を用いるカラムグロ
マトグラフイー、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び、ＤＥ５２（ワットマン社、米国
）カラムグロマトグラフイーにより精製し、Ｏ，ｌｌ１
１Ｍトリス−ＥＤＴＡ緩１重ｉ液に対し透析する。 各々の精製オリゴＤＮＡを常法によりＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ベセスダリサーチラボラトリーズ社、米
国）およびγ−１２−アデノシントリリン酸を用いて放
射性ラベルし、ＤＥ５２カラム（ワットマン社、米国）
により精製する。各々、約３×ｌＯ°ｃｐｍ ／μｇの
放射能が導入される。 各グループの混合物の形で得られたオリゴＤＮＡプロー
ブを第１表に示すように命名する。 第１表にウサギＴＮＦのアミノ酸配列の一部とウサギＩ
−Ｎ Ｆのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮΔ塩基配
列、およびこれに基づく各グループの合成オリゴＤＮＡ
のプローブの塩基配列を示す。 参考例３工程３に従って得たＴＮＦ産生細胞のｍＲＮＡ
を１Ｍグリオキザール、５０容量％ジメチルスルホキシ
ド及び１０ ｍＭ Ｎａ１ｌ、Ｉ’Ｏ，の存在下に５０
℃６０分間処理したのち、１．１重量％アガロースゲル
電気泳動により分画する０分画後のｍＲＮＡを、ｆ！気
気泳動トランスファープロティング装置（バイオラッド
社、米国）を用いて、メーカーのマニュアルに従い、移
動せしめる９次いで、この膜上のｍＲＮＡと、５ｘＳＳ
Ｃ：及び１５０μｇ／ ｍ Ｑの変性サケ***ＤＮＡを
含む５×デンハルト溶液で６５℃、２時間処理したのち
、放射性標識したオリゴＤＮＡをＩ Ｘ １０’ｃｐｍ
／ｍＱ、 ５ Ｘ５ＳＣ溶液を含む５Ｘデンハルト溶
液で５０℃、２時間処理する。次いでこの膜を６ｘｓｓ
ｃで室温、４０℃、５０℃、６０℃で順次洗浄し、Ｘ線
フィルムＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社、米国
）に対しｎ光せしめる。この結果、ｍＲＮＡと最も強く
ハイブリダイズするオリゴＤＮＡはＭＪであって、ＭＪ
混合物中に＋ａＲＮＡと完全に相補的な配列を有するオ
リゴＤＮＡが含まれていることが判明する。 工程９（ウサギ’ｒ Ｎ Ｆ遺伝子のクローニング）参
考例３工程６で得られる形質転換体を実験口（２）１６
２頁の方法に従ってセルロースフィルター上に移し、そ
のＤＮＡと、参考例３工程８で選択される放射性標識オ
リゴＤＮＡ（ＭＪ）とを参考例３工程８と同様の条件で
ハイブリダイズせしめる（コロニー・ハイブリダイゼー
ション）０強くハイブリダイズする株４９個を選び更に
フィルター上に固定して再度コロニーハイブリダイゼー
ションを実施し、標識オリゴＤＮΔ（プローブＭＪ）に
より強くハイブリダイズする９個を選ぶ。 この９個の株から、実験書（１）の６頁の迅速プラスミ
ド分離法に従って各々約５μｇのプラスミドを取得する
。このプラスミドを制限酵素地図１、Ｔ！ＡＩ 、均翌
１、均世■（いずれも［３ＲＬ社、米国）を用い、メー
カーのマニュアルに従って切断し、１重量％アガロース
ゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長さを比較
する。 この結果、９株すべてが、約５０ｂｐのＩ’ｖｕ ＩＩ
とＲｓａ Ｉによる断片を有し、９株のほとんどがＲｓ
ａ Ｉによる約２００ｂｐの断片を有し、部分的に共通
の配列を有することが示唆される。第１図に制限酵素に
よる解析結果を図示する。 第１図に開示の内容を説明する。 即ち、発現が見られるのは、ｐＢ２−２とｐＲ１２の両
者についてであり、ｐＢ２−７．ｐＲ９゜ｐＲ１７，ｐ
Ｒ１８及・びｐＲ２５についてはいずれも発現はみられ
ない。挿入遺伝子の発現にはβ−ラクタマーゼのプロモ
ーターが使用され、そして該発現の際に生じる蛋白は、
β−ラクタマーゼとの融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｌである。ところで、挿入遺伝子が正しく発現
されるためには、β−ラクタマーゼのプロモーターの転
写方向とが、同じでなければならない。故に、転写方向
が逆であるｐＲ１７，ｐＲ１８及びｐＲ２５が発現しな
いのは当然である。また、β−ラクタマーゼのプロモー
ターの転写方向と挿入遺伝子の読みとり方向が同じでも
β−ラクタマーゼのフレームと、ｃＤＮＡのコードする
蛋白のフレームが合わないと正しく発現されない。因に
ｐＢ２−７とｐＲ９の場合は、β−ラクタマーゼのプロ
モーターの転写方向が同じであるにも拘らず発現がみら
れないことから、フレーム不一致によるものと判断され
る。尚、塩基配列からＴＮＦのコーディング領域は、第
１図のＰｖｕＩＩの上流１３５ｂｐ及び下流３３０ｂｐ
にあることがわかっている。従ってｐＢ２−２とｐＲ１
２の三者の場合は、β−ラクタマーゼのプロモーターの
転写方向が同じであり且つβ−ラクタマーゼのフレーム
と、ｃＤＮＡのコードする蛋白のフレームが合い、更に
ＴＮＦのコーディング領域を含むことから発現がみられ
るものである。また第１図に示す内容から明らかなよう
に、クローニングのために用いたＰｓｔ Ｉサイトを除
き、全てのクローンの制限酵素地図は一致しており、基
本的には全てのクローンは同じ蛋白をコードしている。 したがってＴＮＦのコーディング領域を含むものであれ
ば発現構築のためにはいずれのクローンを用いてもよく
、本例ではｐＲｔ７を発現構築のために用いている。因
に、ｐＲ１７のコーディング領域の塩基配列もｐＲ１２
およびｐＲ１８のそれと一致した。 また、このうち７株を１０μｇ ／ ｍ １２のテトラ
サイクリンを含む２ｍｊ２のＬＢ培地中で吸光度が第２
表に示す値になるまで培養し、遠心にて集めた菌体を２
ｍβの生理食塩水で超音波により破砕し、遠心上溝のし
細胞障害活性を測定すると、第２表に示す如く、Ｌ細胞
障害活性を示す。対照実験としてプラスミドｐＢＲ３２
２を含有する株を用いて同様の操作を繰返して行なう。 結果を第２表に示す。 （以下余白） 第２表 またこの活性は抗ＴＮＦ抗体により消去され、正常マウ
ス血清では消去されない、従ってこの９株すべてがＴＮ
Ｆ遺伝子を含むプラスミドを有していることが示される
。 工程１０（ウサギＴＮＦｉｌｌ伝子の塩基配列の決定） プラスミドｐ［＋２−７、およびｐＲ１８を含有する大
ａｍ株を、ＩＯμｇ／ｍＱのテトラサイクリンを含有す
るＭ９培地〔実験＃Ｊ（３）４４０頁）ＩＱ中で培養し
た後、実験書（３）９０頁の方法に従ってプラスミドを
単離し、各々約１５０μｇを得る。 各々の塩基配列をマキサム−ギルバート（Ｍａｘａ＊−
Ｇｉｌｂｅｒｔ）法〔マキサム（Ｍａｘａ＋ｍ ）も、
メソッドインエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎε
ｎｚｙ蹟ｏ１ｏｇｙ）、５５春４９０頁、１９８０年、
アカデミツクプレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ ｒ’ｒｅｓｓ
））に従って決定する。また、この塩基配列と参考例３
工程７で決定された部分アミノ酸配列の一致により、ウ
サギＴＮＦ蛋白の全溝道が解明される。 工程１１ プラスミドｐＲ１２の組換体を用いて大腸菌内でｌａｃ
をプロモーターとしてＴ’ＮＦを発現させることを目的
にプラスミドの（ａ築を行なう、第２図に示す様にＩＯ
μｇのプラスミドｐｌ？１２をｌＯユニットの±１〔ピ
ーアールエル（Ｉ３ＲＬ）社〕で３７℃で２時間ｔｌ’
ｌ化し、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６
３０ｂｐ断片を単離する。約ｌＩＬｇの断片がゲルから
電気泳動溶出する。参考例３１程８と同様の方法によっ
て第２図に示す２個デオキシオリゴヌクレオチド即ち、
５’ −ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＧＧ
ＧＣＣ−３’と５’−ＣＧＡＧ＾＾Ｇ（：ＴＧＡＣ：＾
ＴＧ−３°とを合成し、実験１Ｊ（３） ｌ ２２頁に
従って約１００μｍｏｌｅの各デオキシオリゴヌグレオ
チドの５′末端を１゛４ポリヌクレオチドキナーゼを用
いてリン酸化する０反応終了後、反応混合物をフェノー
ルを用いて抽出し、さらにクロロフォルムを用いて抽出
した後、オリゴマーを０．５μｇの約６３０塩基対の紐
■断片と合せてエタノール沈澱させる。実験古（１）
ａ ７頁に従って１０ユニツトの１’ 、 Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼで前記の断片を４℃で１夜反応させ結合する。 反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニツトの膣１１
！で３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、約６７０ｂｐの断片を電気泳動溶出
により回収する。１月収のプラスミドｐＵＧ−８（Ｐ−
Ｌバイオケミカル社、カタログ番号４９１６．米国）ｌ
μｇをＩｌａ＊ＩＩＩで消化してフェノール抽出、クロ
ロフォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したべりタ
ー０．５μｇに約６７０ｂｌ）のＴＮＦの構造遺伝子を
含む両端に１３ａｎ＋ＩＩＩサイトを持った断片を’ｌ
’ 、 ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。実験書（４
）、２０頁に従って、大腸菌を形質転換してＩ ＩＩＩ
ＭＩＰＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ）ｘ −ｇａ ｌ
を含む寒天培地で培養して約２００個の白色コロニーを
得る。これらの形質転換体１００個からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、Ｂａ＋ａｌｌ＋で消化したところ、１５個
が目的の約６７０ｂｐのＢａｍ１ｌ Ｉ断片を含んでい
る。さらに、挿入の方向を調べるために、上記１５個の
プラスミドをｐＵｃ−８上に１ケ所しか８μ部位がない
Ｅｃ。 Ｒ１とＰｖｕ ＩＩ （約６７０ｂｐの断片上に認識部
位がある）を用いて消化し、６重量％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて調べることにより、７個のプラ
スミドから目的の約１４０ｂｐの断片が確認され、ｐｕ
ｃ−ｓ上のｌａｃプロモーターから順方向であることが
判明する。 塩基配列の解析により、この７個のプラスミドは同一で
、ｌａｃプロモーター、合成りＮＡ及びｃＤＮＡ間の結
合部に所望のヌクレオチド配列を有することが確認され
る。 プラスミドｐＨ１７を用いて、大１湯菌内で１ａｃＵ
Ｖ ５をプロモーターとしてＴＮＦを直接発現させるこ
とを目的にプラスミドの構築を行なう、第３図に示す様
に１０μｇのプラスミドｐＲ１７をＩＯユニットのＭ副
Ｉ〔ピーアールエル（Ｂ ＲＬ）社Ｊで３７℃２時間消
化し、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６３
０ｂｐの断片を単離する。 約ｌμｇの断片がゲルから電気泳動溶出する。工程８と
同様の方法によって第３図の２個のデオキシオリゴヌク
レオチド川１ち、５′−八＾ＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴ
ＴＣＴ（：ＧＧＧＣ（： −３’と５°−１１；ＧＡＧ
ＡＡＧ（：ＴＧＡＣ，ＡＴＧ−３’とを合成し、実験書
（３） １２２真に従って約１１００ｐ。 ｌｅの上５己２種のデオキシオリゴヌクレオチドの５′
末端を１゛４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化する０反応終了液をフェノールを用いて抽出し、さら
にクロロフォルム抽出した後、先に得たｐ１ン１７の栖
■消化断片（約６３０ｂｐ）０．５１Ａｇと合わせてエ
タノール沈澱する。実験書（Ｉ）３７頁に従って１０ユ
ニツトのＴ、リガーゼで４℃−夜反応させ、結合せしめ
る０反応後、反応液をエタノール沈殿し、２０ユニツト
のＥｃｏＲＩで３７℃３時間消化し、４％のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により約６７０ｂｐの断片を回収
する。 プラスミドｐＯＰ９５−１５は、フラーの方法〔エフ、
フラー（１”、Ｆｕｌｌｅｒ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１９巻４２頁〜５４頁、１９８２年１に従って調製する
。 ｐＯＰ９５−１５のＩμｇをＥｃｏＲＩで消化してフェ
ノール抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈澱をし
てベクターを調製する。ベクター０．５μｇは、上記の
如く合成デオキシオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦをコー
ドするＤＮＡを結合して得られる約６７０ｂｐの断片に
、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて結合される。実験ｗ（４
）、２０頁に従って、大腸菌を形質転換してＩ ｎＭＩ
Ｉ’ＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ）ｘ −ｇ ａ ｌ
を含む寒天培地上に約１５０個の白色コロニーを得る。 これらのコロニー１００個からプラスミドＤＮＡを調製
し、ＩＥｃｏ旧で消化したところ１２個が、目的の約６
７０ｂｐのＥｃｏ旧断旧任片している。 さらに押入の方向を調べるために上記１２個のプラスミ
ドをｒ’ｖｕ ＩＩとｒ’ｓｔｌを用いて消化し、１．
５重量％アガロースゲル電気泳動を用いて調べると４個
のプラスミドから目的の約１２８０ｂｐ及び２６００ｂ
ｐの断片が確認され、１ａｃＵＶ５プロモーターから順
方向にＴＮＦ遺伝子が接続されていることが判明する。 塩基配列の解析により、この４個のプラスミドは同一で
、１ａｃＵＶ５プロモーター、合成デオキシオリゴヌク
レオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていることが
確認される。得られるプラスミドをｐＴＮＦ−１ａｃＵ
Ｖ５−１と命名する。 工程１２（大腸菌が産生ずる’ｒＮＦの精製）工程１１
で得られたプラスミドを含有する大腸菌株をアンピシリ
ンを含有するＬＢ培地に５０ｍΩ中３７℃で！夜培養し
、５Ｑ、の同上の培地に移して更に３時間培養する。イ
ソプロピルβ−ローチオガラクトピラノシド（シグマ社
米国）を終濃度ｌ−になる様に添加し更に、６時間培養
を続けたのち冷却し、遠心分離により菌株を集める。工
程１１におけると同様に菌体を０．０４Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，８） ５ Ｑ、中で超音波破砕し、菌
体蛋白溶液を得る。 この溶液は５Ｘ１０“単位／Ｑのし細胞障害活性を示す
。 この溶液を参考例２工程２と同様に精製し１゜２×１０
°単位のＴＮＦを得る。このものの比活性は６．８Ｘ１
０“単位／ｎ＋ｇである。 工程１３［メスＡザルコーマ（Ｍｅｓｈ Ａ ｓａｒｃ
ｏｍａ）担癌マウスを用いる活性ｆｆ’ｌ’価Ｊ［ＩＡ
ＬＩ３／ Ｃマウスの腹部皮肉に２ＸＩＯ＠ＭのメスＡ
ザルコーマ（Ｎｅｔ、ｂ＾ｓａｒｃｏｍａ） ｍ胞を移
植する。 ７日後、移植した腫瘍の大きさが直径７〜８１ＩＩＩＭ
となり、出血性壊死などがなく良好な直行状態にあるマ
ウスを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した０、５ｍ
Ａの参考例３工程１２で得られる゛「ＮＦ試料を注射し
、２４時間後に次の判定基準により判定を行なう。 （＝）：変化なし く１）：かすかな出血性壊死 （Ｉ）：中程度の出血性壊死（移植底表面の真中から５
０％以上にわたって壊死） （−１＋Ｌ） ：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部
が重度に壊死し、周囲の癌組織がわ ずかに残った状ｆｉ） また、試料投与後２０口目に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率を求める。 以上の方法により８１ｇ定し、大腸菌の生産するＴＮＦ
の活性を第３表に示す。 実験マウス数 第３表 工程Ｉ （プラスミドＩｌｌ目８、Ｉ）Ｂ２−７ 、
ｐ［＋２−２の大腸菌Ｋｌ ２．ＭＣ，１０６１株への
形質転換）参考例３で得られる上記３１１１のプラスミ
ドを常法に従って大腸菌Ｋｌ ２ＭＣ：１０６１株〔カ
サダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）ら、ジャーナルオブバ
クテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ Ｉ３ａｃＬ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ）、＋４３ 春、９７１頁（１９８０
年）に所載〕へ形質転換する。詳しくは大１揚菌に１２
ＭＣ１０６１株のコロニーをＬＢ培地を用いて、５５０
正の吸光度が０．３になるまで培養する。該培養物５０
ｍ８を集め、２５ｍαのＩ ＯｍＭ ＲｂＣＱ、を含む
ｌ Ｏｎ＋ＭＭＯＰｓ （ｐｌ！ ７ 、０ ）溶液で
洗浄し、次いで５０ｍＭ Ｃａ１ｌ、、１０ｍＭ Ｒｂ
ＣＡを含むＯ，ＩＭ ＭＯｒ’Ｓ （ｒ＋Ｉ＋６．５
）に再び懸濁する。 該懸濁液を３０分間氷冷し、遠心後、上清を除去し、３
０μαのＤＭＳＯおよび５０＋ｍＭ Ｇａｅｌ、とｌＯ
ｍＭＲｂｃＱを含む０． Ｉ Ｍ ＭＯＰ Ｓ （ｐｌ
＋６．５）の混合液中に懸濁させる。該懸濁液を２００
ｐＱずつ分注し、Ｉｆｆ述のプラスミドＤＮＡ溶液１０
μ悲をそれぞれに加える。 該混合液をそれぞれ３０分間氷冷した後、４４℃で６０
秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかしめ３７℃
に温めておいた５ｍＱのＩ、［３培地を加える。この溶
液を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心
し、上清を除去し、細胞ベレットを得る。該細胞ベレッ
トにＬＢ培地を加え、撹拌した後、懸濁液とする。該懸
？ｎ液を３０μｇ／ ｍ Ｑのテトラサイクリンを含む
ＬＢ寒天プレートにまき、３７℃で１夜培養を行なう、
その結果、プラスミドｐＲ１８、ｐ［３２−７とｐＨ２
−２からそれぞれテトラサイクリン耐性形質転換菌のコ
ロニが得られる。 工程２（ｐｒ＋２−７とｐＲ１８プラスミドＤＮＡの調
製） 工程ｌで得られるプラスミドｐ［＋２−７とｐＲＩ８の
形質転換体を下記の報文の方法に従って培養し、プラス
ミドを増幅させる６次いで得られる形質転換体を集菌し
、破砕したのち、プラスミドＤＮＡを精製する。〔実験
１１Ｆ（３）、８８−９６頁〕すなわち、３０μｇ／ｍ
Ｑのテトラサイクリンを含有するり、Ｂ培地に、それぞ
れの形質転換体を植菌し、激しく振とうしながら３７℃
で培養する６次いで、この工程をくりかえして形質転換
体を増殖させ、更にプラスミドを増幅させる０次に、得
られる形質転換体の培養液を４℃に冷却しながら、４０
００ｇで１０分間遠心を行ない、上清を除去する。 氷冷ＳＴＥ ［０，１Ｍ塩化ナトリウム、１０＋ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋ ７ 、８ ）と１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ ）の１００ｍＡを用いて洗浄し、続いて１０１
１Ｍトリス−塩酸縁ｔｌｊｎ （ｐＨ８，０）の中に２
０ｍｇ／ｍＱ、のりゾチームを含む水溶液を用いて細胞
を煮沸溶菌する。得られる粘性液体を超遠心チューブに
移し入れ２５，０ＯＯｒｐ＋ｍ ３０分間４℃で遠心を
行なってＤＮＡ溶液を得る。 該ＤＮＡ溶液の容量を測った後、該溶液１ｍＱ当りに、
固体の塩化セシウムＩｇを加え、塩化セシウムが完全に
溶けるまで、ゆっくりと注意深く撹拌する。該塩化セシ
ウム水溶液のＩ ＯｍＱ毎に、１０ｔｍｇ／ｍＱのエチ
ジウムブロマイド水溶ｆｉ０．８ｍＱを加える。この結
果、該溶液の最終比重は１．５５ｇ／ｍＱ、エチジウム
ブロマイドの最終濃度は約６００μｇ／ｍαとなる。 該塩化セシウム水溶液を適当な遠心チューブに移し、空
隙に軽パラフィンオイルを加え、２０℃で３６時間、４
５．ＯＯＯｒｐｍの遠心を続けると上層に鎖状の微生物
由来ＤＮＡとニックの入った環状プラスミドＤＮＡと、
下層に閉環状プラスミドＤＮＡがくる。下部のＤＮＡの
バンドをチューブの横に注射針をさしこんで採取しガラ
スチューブに移す。エチジウムブロマイドを除去し、水
層をＴΔＥ緩衝液に透析する。プラスミドＤＮＡ溶液を
Ｉ？Ｎアーゼ（ＲＮａｓｅ）処理し、等量の飽和フエノ
ルｒＥＩ液で抽出する。水層をあらかじめ０，１％ＳＤ
Ｓを含むＴＡＥ緩衝液（ｐｌ＋ ８ 、０ ）で平衡化
したバイオゲル（［ｔｉｏｇｅｌ） Ａ −１５０に付
す、ＤＮＡを洗い込み、活性画分を取得する為に０．１
％ＳＤＳを含むＴＡＥ緩挿ｉ液で溶出する６分画液をエ
タノールで沈殿させ、精製したプラスミドＤＮＡを得る
。 上記の方法により、精製ｐｎ２−７ブラスミドＤＮＡが
２５０ （ｔｇ、 ｐ１３１８プラスミドＤＮＡが１３
４μｇ得られる。 工程３ （精＊ｐ［３２−７とｐＲ１８プラスミドＤＮ
Ａのニックトランスレーション） 工程２で得られる精製プラスミドＤＮＡ４０μｇを制限
酵素ＰｓＬＩで消化分解し１次いで４％アクリルアミド
ゲル電気泳動にかける。 電気泳動後、染色を行ない目的とするバンドを切出して
Ｐｓｔｌインサートを単離する。５００ｎｇの該Ｐｓｔ
ｌインサートを用いて、ティー、マニアティス（ＴｏＭ
ａｎｉａｔｉｓ）らの方法［ブロク、ナトル。 アカド、サイ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃｉ、）、アメリカ合衆国、７２０．１１８４頁（１
９７４年）Ｊに従ってニックＩ・ランスレージョンを行
なった。 ニックトランスレーションは市販キット〔ピーアールエ
ル（Ｂ ｆｌ Ｌ）社Ｊを用いる。 ２５μＣの反応系中で放射化したｄＣＴＰを８０１’）
Ｉｌｏｌｅ用いる（４００Ｃｉ／ａ＋ ｍｏｌｅの場合
）。 まず下記混合溶液を調製する。 ２．５μα 溶液Ａ（ｄＮＴＰ溶液） ２．５μＱ 溶液Ｂ（５００ｎｇのＤＮＡ、すなわち
ＰｓＬＩインサート） ５ ｐ Ｑ 放射性ｄＣＴＰ （３２００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ ） １．３１ｔＱ ｄｃ：ＴＰ（６５ｐ清ｏｌｅ、５０ｐ
ｍｏｌｅ／μｍ２ ｄＣＴＰ） 工ＬＬ］」」−溶液Ｅ（ｔ５０） 計２２．５／ＬＡ この２２．５μΩの溶液に、２．５μμの溶液Ｃ（ＤＮ
アーゼ（ＤＮａｓｅ） Ｉ 、 ＤＮＡポリメラーゼＩ
）を加え、１５℃６０分反応させる。 次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液）を加え、停止させる。更
に、キャリアーＬＲＮＡを加えエタノル沈澱を２回行な
い、次いで５００μ℃の水に溶解する。 比活性は、９．３ Ｘ １０’ｃｐｍ／μｇＤＮＡであ
る。 工程２で得られるｔ＋’ｌ ！１ＡｐＲｌ ３を用いて
、同様に上記の方法に従ってニックトランスレーション
を行なう。比活性は７ Ｘ Ｉ Ｏ’ｃｐｍ／μｇＤＮ
Ａである。 工程４（Ｉ］ＲＩ８プラスミドＤＮＡのＲｓａ Ｉ断
片数イ（）） ８０μｇのｐＲＩ８プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｒｓａ
Ｉで消化し、４％アクリルアミドゲル電気泳動に付す
、下記の目的とするインサートのバンドを切出し［３Ｎ
Ｄカラムを用いて精製する。 約６４０ｂｐ ３．７７μｇ （回収率５２％）約
１７５ｂｐ １．７７μｇ （回収率５０％）この
約６４０ｂｐのインサートをｐＲｌＢの３′断片（ｐｒ
ｌ１８の３′側の翻訳されない部分を意味する）、約１
７５ｂｐのインサートをｐＲｌ ８−ｃｌｒ（ｐＲ１８
のコード部分）と命名する。 更に上記に於いてＲｓａ Ｉの代わりにＰｓＬＩとＭｓ
ｔ■を用いて消化して、約４５０ｂｐの断片３．６５μ
ｇ（回収率６０％）を得る。このインサートはｐｌ？１
８の５′断片と命名する。 工程５（ヒト染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）実施例１工程
３で得られる゛１Ｐラベル化プラスミドｐ１３２−フィ
ンサートをハイブリダイズ川プローブとして用い、シャ
ロン ４ＡのＥｃｏＲＩ切断サイト［ブラットナ−（Ｂ
ｌａＬｔｎｅｒ）らの方法、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ） １９６巻、１６１頁（１９７７年）Ｊにヒｌ−Ｄ
Ｎ Ａを部分消化しサイズ分画した断片（マニアテイ
ス（ＭａｎｉａＬｉｓ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、１５巻
、６８７頁（１９７８年）１を組込んで作成したバクテ
リオファージシャロン４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラ
リーの１０”コのプラークをスクリーニングする。その
方法として〔ベントン（Ｂｅｎｔ、ｏｎ）及びデイビス
（Ｄａｖｉｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９
６巻、１８０頁（１９７’７年〕〕を用いる。 出発培養液中のバクテリオファージの総てが、該生理活
性物質を作成する為に必要な遺伝子材料を含んでいると
は限らないので、ウサギＴＮＦの遺伝子に相補的な配列
を持つプローブを用いる。 目的とする遺伝子を含むファージプラークは、放射活性
を有するプローブとハイブリダイズし、その放射能活性
により見つけることができる。このようにして９つのハ
イブリダイズプラークが、該ライブラリーから得られる
。 方法と条件は次の通りである。 りプラーク数二〜１ｘｌＯ＠プラーク（〜４×ｌＯ“プ
ラーク／φ１５０ｍｍプレート×２５）２）ニトロセル
ロースフィルターへの転写：〔ベントン（１３ｅｎｔｏ
ｎ）及びデイビス（Ｄａｖｉｓ）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）、１９６巻１８０頁（１９７７年）参照） ３）ハイブリダイズ： １．２５Ｘ Ｉ Ｏｃｐｍ／ｍ
Ｅ＋の実施例１工程３で得たｐＲ２−フィンサートプロ
ーブの添加、４２℃、１９．５時間 ４）洗い：２ＸＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて室温で
１０分間洗いを４回、続いてｌＸ５ｓｃ−０，１％ＳＤ
Ｓを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ５）ｎ光：ＸＡＲ−５、−８０℃、２枚の増感紙、３９
時間 上記スクリーニングで１２の候補株が得られる。 上述と同様の方法で二次スクリーニングを行ない所望の
断片を有する９個の株を得る。これらの株を用いて上述
と同様の方法で三次スクリーニングを行ない所望の断片
を有する９個の株を得る。この９個の株について上述と
同様の方法で４次スクリーニングを行ない、９個の株が
所望の断片を含むことを確認する。所望の断片を含む９
個のバクテリオファージを、それぞれ）−Ｉ Ｇ Ｉ〜
Ｉ−Ｉ Ｇ ９と命名する。 工程６（ウサギ染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）消化ヒトＤ
ＮＡの代りに消化ウサギＤＮＡ〔マニアテイス（Ｍａｎ
ｉａＬｉｓ）ら、セル（（：ｅ Ｉ ｌ ）、ｌ ５９
６８７１’ｆ（１９７８年）］を用いて調製した１０巻
個のバクテリオファージシャロン４Ａ／ウサギ染色体遺
伝子ライブラリーのプラークを用いる以外は実施例１工
程５と実質的に同様の操作を行なう、６．７Ｘ１０’個
のバクテリオファージシャロン４Ａ／ウサギ染色体遺伝
子ライブラリーのプラークを１０“個のバクテリオファ
ージシャロン４Δ／ヒト染色体遺伝子ライブラリーのプ
ラークの代わりに用いる。 ウサギ染色体遺伝子を含む２つのバクテリオファージ（
ＲＧ−１，ＲＧ−２）が得られる。 工程７（ヒト遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程５で得られたＨ Ｇ −３、ＨＧ −６，
１−Ｉ Ｇ −７のバクテリオファージを用いて、それ
ぞれＤＮＡを次の方法に従って得る。 ６×ｌＯ°″個の大腸菌ＬＥ３９２（宿主）を１８ｍＱ
の３Ｍ中に懸濁し、そこにバクテリオファージＨＧ −
３の３×１０”ＰＦＵを加え、３℃で２０分間感染させ
る０次いで得られる混合液を３息のＮＺブロスに加え、
３７℃、２３時間撹拌培養する１次いで６０ｍＡのクロ
ロホルムを該混合液に加えて３０分間撹拌する。最終濃
度ＩＭとなるように混合液中に塩化ナトリウムを加えた
後１５分間放置する０次いで遠心操作を行なって上清を
得る０次いで得られる上清に分子量的６０００のポリエ
チレングリコールをポリエチングリコールの濃度が１０
％（Ｗ／Ｖ）になるように加えて、・１℃、２２時間放
置する０次いでバクテリオファージを遠心操作を行なっ
て採取する。得られるバクテリオファージをＳＭの２８
ｍＱに懸濁し、次いでクロロホルムを等量加える。ポル
テックスミキサーで３０秒１？ＩＪ混合した後、遠心し
て水層を集め、その全量をＳＭで３０ｍＱにする。これ
に２６．４ｇの塩化セシウムを加え、静かに溶解した後
、超遠心（４５０００ｒｐ＋＊、２０時間）でファージ
のバンドを採取する。１０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む５０ｎＭトリス緩衝液（ｐＨ
８、０）に透析した後、それぞれの最終濃度が２０１１
ＩＭ、５０μｇ／ｍＱ、０．５％となるようにＥＤＴＡ
、プロテイナーゼに、ＳＤＳ、を加え６５℃で１時間処
理する０次にフェノール、フェノール：クロロホルム＝
ｉ＝１（容積比）、クロロホルムで各１回ずつ抽出し、
得られる水層をＩ ｎ＋Ｍ Ｅ Ｄ ＴＡを含む１０吐
トリス緩衝液（ｐＨ８，０）で透析する。この溶液の紫
外線吸光度を測定すると、バクテリオファージＩＩＧ−
３の純粋なりＮＡが得られることが確認される。 バクテリオファージＨＧ −３のＤＮＡを調製するため
に用いられる方法と実質的に同じ方法を応用することに
より、バクテリオファーシトＩＧ−６とＪＩＧ−７のＤ
ＮＡを得る。 このようにしてＩＩ Ｇ −３、Ｉ（Ｇ −６、ｔｌ
Ｇ −７のＤＮＡを各々２９２０μｇ、１１００μｇ、
８１９μｇを得る０次いで（Ｓｏｕｔｌ＋ｅｒｎ）法（
イー、エム。 サザーン（ＥｏＭ、５ｏｕｔｈｅｒｎ）、チエ４９モル
、パイオル、 （Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、９８巻、
５０３頁（１９７５年）〕に従って、以下の実験条件で
これらのＤＮＡのサザンブロッテイングを行なう。 １）ＤＮＡ： ＨＧ−３８２５ｎｇ ＨＧ−６９３５ｎｇ ＨＧ−７６８５ｎｇ ２）各種制限酵素による分解： １０単位、 １０単位＋Ｅｃｏ１口 １０単位 ３時間 ｌｌｉｎｄｌ月 １１ｉｎｄ用 １’ｖｕ Ｕ ３７℃ ３）？ｌ気泳ｖＪＪ： ０．８％アガロースゲル １゛ΔＥ ｉｏ小単位 ２８Ｖ、１５．５時間 ４）ニトロセルロースフィルターへの転写：〔イー、エ
ム、サザーン（Ｅ、 Ｍ、 ５ｏｕｔｌ＋ｅｒｎ、 ）
ジエイ０モル、パイオル、（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、）９８０．５０３頁（１９７５年）参照Ｊ ５）ブレハイブリダイズ： ３０ｍＱ ＦＤＳＳ ４２℃ ６時間 ６）ハイブリダイズ： ｐｌ？Ｉ８の５′−断片（Ｉ ｘ Ｉ Ｏ’ｃｐｍ／ｍ
Ｑ、実施例１工程４にて調製したもの）を含む４２℃
、１４時間 ７）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温で１０分間洗
いを４回、続いてｌＸ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて
５０℃で３０分間洗いを２回 ８）ｔｌ光： ＸΔＲ−５（イーストマン・コダック社、米国）−８０
℃、２枚の増感紙 １４時間ハイブリダイズの結果は、第４表に示す。 第４表 （以下余白） 示す。 工程８（ウサギ遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程７において、ＨＧ−３，８Ｇ−６，１１Ｇ
−７のかわりにＲＧ−１，ＲＧ−２のバクテリオファ
ージのそれぞれを用いる以外は、実質的に同様の操作に
よってサザンプロット解析を行なう。その結果、ｐＲ１
８の５′断片はＲＧ−１およびＲＧ−２を埠ｔ＋ｉｌｌ
Ｉ 、以遠Ｒ１，黒［■、カニｄｍおよびＩｌａｍｌ
ｌ Ｉ ＩＥｃｏＲＩのそれぞれで分解して得られる断
片の、単一バンドにハイブリダイズすることがわかる。 工程９（ヒト染色体のＴＮＦｉｆｌ（ｚｉ子を含むバク
テリアクローンの構築） 工程５において得られたＨ Ｇ −３のＤＮＡを、ラン
デイ（Ｌａｎｄｙ）もの方法〔バイオケミストリー（口
１ｏｃｌ＋ｅ翔１ｓｔｒｙ）、 １３巻、 ２ ｌ ３
４頁 （１９７４年）】によって得る。このＮ Ｇ −
３のＤＮＡ３３／ＡｇをＩＥｃｏＲ＋の８０単位によっ
て３７℃で３時間分解する。分解物は１％低融点アガロ
ースゲル（条件：ＩＸＴＡＥ、２０Ｖ、１４．５時間）
にて電気泳動する。２．９ｋｂのバンドをアガロースゲ
ルより、ティー、マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
）（モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｌｏｎｉｎｇ）、コールドスプリングハーバ−ラボラ
トリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔ、ｏｒｙ）、３７７頁（１９８２年月の方
法で単離する。詳しくは。 ２．９ｋｂのバンド部位を切り出したゲルを６５℃で１
５分間加熱する。さらに、この２．９ｋｂの長さを持つ
ＩＥｃｏＲＩ分解ＨＧ −３断片（以降、これをｒＨＧ
−３／ＥｃｏＲＩ ２．９ｋｂ断片」と略することが多
い）を、溶けたゲルよりフェノールで３回、池の抽出溶
媒で３回抽出、酢酸アンモニウムを含むエタノールで沈
澱して回収する。このようにして、６３７μｇ（収率約
３０％）のｌ−Ｉ Ｇ −３／強１？１２．９ｋｂ断片
を得る。 上記断片２５５ｎｇとＥｃｏＲ１分解ｐｕｃｔａ〔ジェ
イ、メッシング（ＪｏＭｅｓｓｉｎｇ）、メソッズイン
エンザイ壬ロジー（ＭｅＬｂｏｄｓ ｉｎ ＩＥｎｚｙ
＋ｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻、２０頁（１９８３年）〕
を、２．５単位の′ｒ、リガーゼを用いて結合する。 大腸菌Ｋ１２ＪＭ８３株を上で得られる結合生成物を用
いて形質転換する。詳しくは、大腸菌に１２ ＪＭ８
３株をＬＩ３培地中で、培養ブロスの５５０ｎｍにおけ
る吸光度が０．３になるまで培養する。５０ｍＱの増殖
した大腸菌Ｋ１２ＪＭ８３株を集め、２５ｍ２の１０ｍ
ＭＭ０ＰＳ（ｐＨ７，０） −１０ｍＭ ＲｂＣ１で洗
い、２５ｍαの０、１ Ｍ ＭＯＰ ５（ｐＨ６、５）
−５０ｍＭ ＣａＣ１，−１０ｍＭ ＲｂＣ１中に懸
濁する。この懸濁液２０３μＱに、１０ｎｇの上記結合
生成物を含むｌＯμαの水溶液を加える。この混合物を
水中にて３０分間冷却し、４０℃で６０秒間加熱する。 その後すぐに、あらかじめ３７℃にしておいたＬＩ３ブ
ロス５ｍ（Ｌに、加熱した混合物を加え、３７℃で１時
間培養する。得られる培養ブロスを遠心し上清を除去す
る。遠沈した細胞にＬＢ培地を加えて、３０１ｔｇ／
ｍＱのアンピシリンと４０μｇ／ｍＱのｘ−ｇａｌを含
むＬ ［３プレートに植菌する。インサートを含むプラ
スミドが導入された大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３株のコロニ
ーは白色であるが、プラスミドのみが導入された株のコ
ロニーは青色である。得られる白色コロニーは再び、３
０μｇ／ｍαのアンピシリンと４０μｇ／ｍＱ、のｘ−
ｇａｌ を含むＬＢプレートに確認のため植菌する。 上で得られる白色コロニーより、１０個のコロニー（バ
クチリアルクローン）を選び、迅速法を用いてスクリー
ニングする。 詳しくは、それぞれのコロニーを３０μｇ／ｍＱのアン
ピシリンを含むＬＩ３培地で一晩培養する。 増殖した細胞を集め、２ ＋ｎｇ／ ｍαリゾチーム−
５０ｍＭグルコース−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２５ｍＭ
＋−リス（Ｔｒｉｓ） −１１ｃ Ｑ （ｐｌ！
８ 、０ ）を含有する溶液中に懸濁する。この懸濁液
を室温で５分間おき、これに２００ｐＱの０．２ Ｎ
Ｎａ０１１−１％ＳＤＳを加える。ゆっくり撹拌したの
ち、この懸濁液を２分間室温におく、続いて、１５０μ
αの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５、２）を加え、１０分
間−２０℃におき、１５分間遠心してその上清を得る。 この上清に９００μαの冷エタノールを加え、５分間遠
心してその沈澱を得る。得られる沈澱を７０％エタノー
ルで洗い乾燥してプラスミドＤＮＡを得る。この方法を
用いて１０個のプラスミドを得る。 それぞれのプラスミドＤＮＡを、ｌ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ
−０，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）に溶かし、
Ｅｃ。 Ｒ１で消化し、制限酵素消化のために電気泳動に供する
。消化と電気泳動の条件は以下の通りである。消化ニブ
ラスミドＤＮＡ溶液＝上で得られたものの５分の目Ｌ
３単位のＥｃｏＲＩ、３７℃、１゜５時間電気泳動：１
％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ、＋２０Ｖ、２時間 上記の制限酵素解析によって、１０種のクローンのうち
８種が目的のものであることが示される。 すなわち、この８？］１のクローンは２，９ｋｂの断片
を持っている。８種の目的のクローンのうち、１つを選
び大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株（ＡＴＣＣ
３９６５６）と命名する。なお、この大腸菌Ｋｌ ２Ｊ
Ｍ８３ （ｐＨＧＥ）株は、ブタペスト条約に基いてＡ
ＴＣＣ３９６５６の寄託番号でΔ′Ｉ″ＣＣに寄託され
ている。 続いて、ｐ［３２−７とｐＲ１８を有する大腸菌のかわ
りに大腸菌ＫＩ２のＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株を用いる
以外は工程２と同じ操作によって、１．８９ｍｇのｐ
Ｉ−Ｉ ＣＥ Ｄ Ｎ Ａを得る。 工程１０ （Ｅｃｏｌ目分解ｆｌＧ−１のサブクローニ
ング） 工程６において得られる３０μｇのＲＧ−１をＥｃｏＲ
Ｉによりｌｌ！Ｉ化する。得られる各種断片の混合物よ
り、上記各種断片の混合物と０．８％の低融点アガロー
スゲルを用いる以外は工程９と実質的に同じ操作によっ
て、約３．５ｋｂの長さを持つ断片を回収し、１．０μ
ｇのＩＥｃｏＲ１分解ＲＧ−１断片（３，５ｋｂ）を得
る。この断片とＥｃｏＲＩで消化したりＵＣｌ３を、
ＩＥｃｏｌ？ Ｉ分解１−Ｉ Ｇ −３断片（２，９ｋ
ｂ）のかわりに上記εｃａｌ？ Ｉ分解所片（３，５ｋ
ｂ）を用いる以外は工程９と実質的に同じ操作によって
、連結する。 大腸菌ＫＩ２ＪＭ８３株への形質転換、バクテリアクロ
ーンのスクリーニング、クローンＤＮＡの分解と電気泳
動は、上記結合ＤＮＡ断片を用いる以外は上記工程９と
実質的に同じ操作によって行なう、得られるクローンは
大腸菌Ｋｌ ２ｌＭ８３ （ｐＲＧＥ）株（ＡＴＣＣ３
９６５５）と命名する。なお、この大Ｊｌ＆１菌Ｋ１２
ＪＭ８３（Ｉ）ＲＧＥ）株は、ブタペスト条約に基いて
ＡＴＣＣ３９６５５の寄託番号でＡＴＣＣに寄託されて
いる。 続いて、大腸菌Ｋｌ ２ｌＭ８３（ｐＲＧＥ）株をｐＢ
２−７とｐＨ−１８のかわりに用いる以外は工程２と実
質的に同じ操作によって、ｐＲＱＥＤＮＡを１．７０ｍ
ｇ調製する。 工程＋ｆ（ｐｉ−ＩＣＥプラスミドＤＮＡの１メ１限酵
素解析） 工程９で得られるｐ ＨＧ Ｅ Ｄ ＮＡの制限酵素
解析を、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の方法〔モ
レキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｌｏ
ｎｉｎｇ）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、 ９ ８ 頁 （１９８２年
）ｊによって行なう。 その方法と条件は以下の通りである。 １ ） Ｅｃｏ１目によるｐＨＧＥＤＮΔの分解：１８
゜Ｇｌｔｇのｐ Ｉ−Ｉ ＣＥ、６４単位の［ＥＣ０Ｉ
？ Ｉ、３７℃２時間 ２）エタノール沈殿：沈殿物 ３）溶解： ＥｃｏＲＩ分解ｐ ＨＧ Ｅがｊμｇ／ｍ
ｇの溶液になるように蒸留水を加える。 ４）各種制限酵素による消化：Ｉμｇの上記ＥｃｏＲ１
分解ｐ Ｉ（Ｇ Ｅ、制限酵素：５単位のＰｖｕ ＩＩ
。 ５単位のＰｖｕｌｌ＋１０単位のＲｓａｌ、１０単位の
Ｒｓａ Ｉ、４単位のＭｓｔＩ＋、３単位Ａｖａ ＋、
９１１ｊ位のＰｓＬ［，３７℃、２時間 ５）電気泳動：２％アガロースゲル、■×゛「ΔＥ２８
Ｖ、１４．５時間 ６）ニトロセルロースフィルターへの転写：〔イ、エム
、サザーン（Ｅ、Ｍ、 ５ｏｕＴ、ｌ＋ｅｒｎ）、ジェ
イ、モル、パイオル、 （Ｊ、Ｍｏ１．ｌ３ｉｏ１．）
、９８巻、５０３頁（１９７５年）参照〕 ７）第一回プレハイブリダイズ： ３０ｍＱＦＤＳＳ、
４２℃、６時間 ８）ｆｆ！−回ハイブリダイズ：ｐＲ１８の５″断片（
工程４で得られるもの、５ＸＩＯ“ｃｐｍ／ｍ８）４２
℃、１４時間 ９）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温
で１０分間洗いを４回、続いてｌＸ５ｓＣ−０，１％Ｓ
ＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 １０） Ｄ光：ＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社
、米国）、−８０℃、２枚の増感紙、１７゜５時間 ＋１）洗い： ０ 、５ Ｍ Ｎａ０Ｉｌ −１、５Ｍ
ＮａＣ１で１分間、０．５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ） −
１、５Ｍ Ｎａ１ｌで１分間、３ＸＳＳＣで１分間 １２）露光＝露光時間を１９時間とする以外は、上記１
０）と同じ操作 １３）ｆＡＺ回プレハイブリダイズ：７）と同じ操作！
４）ｉ２回ハイブリダイズ： ｐＢ２−フィンサート（
工程３で得られるもの）、４２℃、１６゜５時間 ＋５）洗い：９）と同じ操作 １６）露光：露光時間を１９．５時間とした以外は、上
記１０）と同じ操（１’− １７）洗い二Ｉｔ）と同じ操作 １８）ｎ光＝露光時間を２０時間とした以外は、」二記
１０）と同じ操作 ＋９）ｆｆ！３回プレハイブリダイズ＝７）と同じ操作
２０）第３回ハイブリダイズ：ｐＲ１８の３″断片（工
程４で得られるもの、 ４．５ Ｘ Ｉ Ｏ”ｃｐｍ／
ｍα）、４２℃、１５時間 ２１）洗い二〇）と同じ操作 ２２） ｎ＊： １０）と同じ操作 制限酵素地図解析の結果を第４図に示す。 工程１２ （ｐＲＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素解析
） ｐ Ｉｔ Ｇ ＥプラスミドＤＮＡのかわりにｐＲＧＥ
プラスミドＤＮＡを用いる以外は工程１１と実質的に同
じ方法により工程１０で得られるｐＲＧＥプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素解析を行なう、得られるｐＲＧＩＥＤＮ
Ａインサートの制限酵素地図を第５図に示す。 工程＋３（ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦ遺伝子の塩
基配列の決定） 工程９で得られる大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ
）株と工程ｌＯで得られる大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３ （
１）［’（ＧＥ）株をｐＢ２−７を有する大腸菌に１２
ＭＣ１０６１株とｐＲ１８を有する大腸菌に１２ＭＣ１
０６１株の代わりに用いる以外は前記工程２と実質的に
同じ操作を行なう、そして、それぞれ１５０μｇのｐＲ
ＧＥプラスミドＤＮＡとｐ ＨＧ ＥプラスミドＤＮＡ
を得る。 ｐＲＧＥとｐ ＨＧ Ｅの塩基配列はマクサム−ギルバ
ート（Ｍａｘａ＋ａ−Ｇｉｌｂｅｒｔ、）法〔マクサム
（Ｍａｘａ＋＊）ら、メソッズインエンザイモロジ−（
Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、５５巻
４９０頁（１９８０年）アカデミツクプレス（Ａｃａｄ
ｅ＋ｓｉｃ Ｐｒｅｓｓ）］によって決定する。 参考例３で決定したｐａｔ−１８の塩基配列と、上で決
定したｐＲＧＥの塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺
伝子の構造（エクソンとイントロンを含む）を解明する
。ｐｆｌＧＥ ＤＮＡインサートの構造は第５図に示す
。続いて、ｐＲＧＥとｐＨＧ Ｅの塩基配列を比較して
、類似性とイントロン・エクソン境界付近の相同配列を
調べる。このようにしてヒト’ｒＮＦ遺伝子の４１１￥
造（エクソンとイントロンを含む）を解明する。ヒト「
ＮＦ遺伝子の構造を第４図に示す。 このようにして得られるウサギＴＮＦとヒトＴＮＦをコ
ードする塩基配列を下に示す。この塩基配列において、
上の行はウサギＴＮＦをコードする塩基配列（Ｒ）を、
下の行はヒトｉ’ Ｎ Ｆをコードする塩基配列（■（
）を示す。 １？ＴＣＡＧＣ丁 ＴＣＴ ＧＧＧ Ｇ（：（：
ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＡ（： へ人Ｇ （：Ｃ
ＴＩｔ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴにＴ にＧＡ Ａ
にＣＣＣＧ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ＋（ＣＴ
Ａ ＧＣＣＣ７６： ＧＴＡ ＣＴＡ ＧＣＡ
ＡＡＣＧ（：Ｇ ＣＡＡ ＧＴＧＧＴＡ ＧＣ（：
Ｃ：ＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡ
（： ＣＣＴ ＣＡＡ Ｇ（：Ｔ１？ ＧＡＧ
ＧＧＣＣＡＧ ＣＴＣ（：ＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＧＣ（：ＡＧ ＣＧＴＩｔ ＧＡＧ ＧＧＧ （：
ＡＧ ＣＴＣＧＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＡＣＧＧＣ
ＣＧＧＲＧＣＧ ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ （：ＴＧ
ＣＧＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧ 八＾Ｇ ＣＴＣＩＩ
ＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴ（： にＴＧ Ｇ（：Ｃ
ＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡＧ Ｃ’ｒＧ１７ ＡＣ
Ｇ ＧＡＧ ＡＡ（： （：ＡＧ （：ＴＧ ＧＴＧ
ＧＴＧ ＣＣＧ ＧＣＣＧＡ（：Ｉｔ ＡＧＡ
ＧＡＴ ＡＡＣＧＡＧ （１：ＴＧ ＧＴＧ
ＧＴＧ （：ＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧｒｌ Ｇ
ＧＧ ＣＴＧ 丁Ａ（： ＣＴＣ： ＡＴＣＴ
ＡＣＴＩ；ＣＣＡＧ ＧＴＴ ＣＴＧＩＩ Ｇ（
ｉに にＴＧ ＴＡＣＣＴ（： ＡＴＣＴＡに
ＴＣ（： にＡＧ ＧＴＣ： （：Ｔ（：＋ｉ
’ｒＴ（： ＡＧに ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＧ
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ＴＴＣＡＡＧ ＧＧＧ ＋１：ＡＡ ＧＧＣＴＧ
ＣＣＣＣＴＣ：ＣＡ（：Ｃ： ＣＡＴＲＧＴＧ ＣＴ
ＣＣＴＣＡＧＴ ＣＡＣＡＣＴ ＧＴＣＡＧＣにＧＣＴ
ＴＣＩＩ ＧＴＧ ＣＴＣ（：ＴＣＡＣ：ＣＧＡ
Ｃ： Ａｃｅ ＡＴ（： ＡＧＣＣＧＣＡＴ（：
１？ ＧＣＣＧＴＣＴＣ：ＣＴＡＣＣＣＧ ＡＡ（：
ＡＡＧ ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＩＩ ＧＣＣＧＴ（
： ｒＣＣＴＡＣ： ＣＡＧ Ａ（：ＣＡＡＧ
０丁（： ＾＾（： ＣＴＣ１？ （：Ｔ（：
ＴＣＴ ＧＣＣＡＴ（： ＡＡＧ ＡＧＧ Ｃ（：（
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ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ ＡＧＯＣＣＣＴＧＣＣＡＧ Ａ
ＧＧＲＧＡＧ ＡＣＧ ＣＣ（： ＧＡＧ ＧＡＧ
ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＣ（： ＡＴＧ ＧＣＣ口ＧＡＧＡ
ｃｅ（：（：ＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧ
ＣＣ（：１？ ＴＧＧ ＴＡＣ： ＧＡＧ （：ＣＣ
ＡＴＣＴＡ（： ＣＴＧ ＧＧＣＧＧＣＧＴＣｌｌ
丁ＧＧ 丁＾Ｔ ＧＡＧ ＣＣ：ＣＡＴＣＴＡ
Ｔ （：ＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣＲＴＴ
ＣＣＡｃ ＴＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣ
： ＣＧＧ ＣＴＣＡＧ（：ＴＴＣ（：ＡＧ （：ＴＧ
ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＣＧＡ ＣＴＣＡ
ＧＣＲＡ（：ＣＧＡＧ ＧＴＣ： 八ＡＣＧＡＧ
ＣＣＴ ＧＡＧ ＴＡＣ（：ＴＧ ＧＡＣＩＩ
ＧＣＴ ＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴ （：ＧＧ
ＣＣＣＧＡ（： ＴＡＴ ＣＴ（： ＧＡに
Ｒ（１：ＴＴ Ｇ（：（１： ＧＡＧ ＴＣＣＧ
ＧＧ ＣＡＧ ＧＴ（： ＴＡ（： ＴＴＴ
ＧＧＧＩＩ ＴＴＴ Ｇｅｅ ＧＡＧ ＴＣＴ Ｇ
ＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡ（： ＴＴＴ ＧＧＧ１？
ＡＴ（： ＡＴＴ ＧにＣＣＴＧＩＩ ＡＴＣＡＴ
Ｔ ＧＣ：ＣＣＴＣ注）記号゛・・・パは、ウサギＴＮ
ＦをコードするＤＮＡの塩基配列中にこの部分は存在し
ないことを意味し、従ってこの記号の両端に隣接する２
つのコドンは直接つながっている。 工程＋４（オリゴデオキシヌクレオチドの合成）コハク
酸残基を介して２．０μＭのデオキシヌクレオシドが結
合しているボリスヂレン樹脂２０すを、上下にステンレ
ススチール製のフィルターのついた５００μμ容量の反
応容器に装填する。 樹脂は１Ｍ臭化亜鉛ジクロルメタン−イソプロパツール
溶液（８５：１５）で処理してジメトキシトリチル（Ｄ
ＭＴ）保護基を除き、ジクロルメタン−イソプロパツー
ル（８５：１５）、次いでジメチルフォルムアミド、ピ
リジン、更にアセトニトリルで洗浄し、窒素気流で乾燥
する。次いでＤＭＴ−ヌクレオチド（２０７ｚＭ）およ
び、メシチレンスルフォニルニトロトリアゾール（６０
μＭ）の乾燥ピリジン溶液２００μＣを加える６４５℃
で２０分間反応せしめた後、反応液を除去し、乾燥ピリ
ジンで樹脂を洗浄後、ピリジン中の無水酢酸で未反応の
残基を保護する。この、脱保護及び縮合のサイクルを繰
り返して、所望のオリゴデオキシヌクレオチドが樹脂上
に合成される０次に樹脂をとり出し、オリゴヌクレオチ
ドを樹脂から分離して、精製を行う、上記のオリゴデオ
キシヌクレオチドの合成および精製は伊東ら［Ｎｕｃ、
Ａｃ、 Ｒｅｓ、 Ｉ ０巻、１７５５頁（１９８２）
］の方法に従って実施する。このようにして下記の如き
オリゴデオキシヌクレオチドが得られる。 ■ ）５゛−へ＾丁ＴＣＡＴＧＴＣＡＴ（：ＴＴＣＴＣ
ＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＴＧＡ（１：ＡＡ−３’２ ）
３ ’ −ＧＴＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧ
ＧＣＴ（：ＡＣＴＧＴＴＣＧＧ−５’３ ） ５ ’
−ＧＣＣＴＧＴＡＧＣ（１：ＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧ（：
＾＾ＡＧＣＣ：ＴＣＡＡＧＣ−３’４ ）３ ’ −Ａ
Ｃ：ＡＴＣＧＧＧＴＡ（：ＡＡ（：ＡＴＣＧＴＴ丁ＧＧ
ＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴ−５’工程１５（ヒト’ｒ Ｎ
Ｆのミニ遺伝子を含むＭｌ３ ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ
の調製） プラスミドｐｔｌＧＥ （Ｉ Ｏμｇ） をＩＥｃｏＲ
ｌ（２０単位）で消化し、１％の低融点アガロースゲル
電気泳動の後、２．９ｋＬ１のフラグメントを切出し溶
出する。このフラグメントはＭ１３ｍｐ９ファージの複
製型のα冴Ｒ■フラグメント中へ挿入する。 ＥｃｏＲｌフラグメントを押入されたＩ） Ｎ ＡはＢ
ＲＬ社の手引書〔ユーザーマニュアル（Ｕｓｅｒ Ｍａ
ｎｕａｌ）／ＭＩ３ｍｐ７クローニング（Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ） ／ ’デイデオキシ（Ｄｉｄｅｏｘｙ） ’シー
ケンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ）、１９８０年］
に従い、大腸菌ＪＭ１０３（−ニーイングランドバイオ
ラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ １３ｉｏ１ａｂｓ）
、ＮＥＷ ＩＥＮＧＬＡＮＤ １３ｉｏ１ａｂｓ ＣＡ
ＴＡＬＯＧ ＋９８１−１９８２所載〕を形質転換する
。生成物をＭ１３ｍｐ９−ＨＧＥと命名する。 工程＋６ （Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＥ ｍ鎖ＤＮＡとプ
リーターＥ３−４を用いるイントロン３の除去） Ｍｌ ３ｍｐ９−ＨＧＥ−ｍ鎖ＤＮＡはＢＲＬ社の手引
書〔ユーザーマニュアル（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ）
７Ｍ ｌ ３ ｍ ｐ ７クローニング（Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ） ／’デイデオキシ（Ｄｉｄｅｏｘｙ） ’シーケ
ンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、１９８０年］に従
って調製される。 工程１４で調製されたオリゴデオキシヌクレオ−Ｆ−ト
４ ） ３ ’ −ＡＣＡＴＣＧＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴ
ＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴ５′がイントロン
３のプリーターとして用いられる。イントロン３のプリ
ーターは” Ｅ ３−４ ”と命名する。 プリーターＥ３−４は、除去されるべきイントロン３の
０１ｊ方（即ちエクソン３）、及び後方（即ちエクソン
４）に対し相補的な配列を有している。 イントロン３の除去はウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら
の方法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２０９巻１３
９６頁（１９８０年））に従い、次の如く行う。 Ｅ３−４ （１６４ｎｇ１１５ｐ＊ｏｌｅ）は、Ｔ、キ
ナーゼおよびＡ ＴＰ （３ｍＭ）を用いてリン酸化さ
れ、鋳型Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＥ （１，６５／ｊｇ。 ０ 、５ ｐｍｏｌｅ）に加えられる０反応混合物は６
５℃に加熱し、５分間室温に冷却し、更に氷水中で冷却
する。各０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣ：ＴＰ％ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰおよびＡＴＰ溶液に対し、クレノーフラグメ
ント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ） ５単位、Ｔ
ＩリガーゼｌＯ単位を含むヒン（Ｈｉｎ）緩衝液〔ウオ
ーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、ヌク、アク、レス。 （Ｎｕｃ、＾ｃ、 Ｒｅｓ、 ）、９巻３６４７頁（１
９８１年月、即ち１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，２）
、 ２ｍＭ塩化マグネシウム及びＩｍＭβ−メルカプ
トエタノールを含む液、を加える０反応混合物（ｆｆｉ
終容ｆｉｔ ５０ Ｉｔ Ｑ ）は４℃で３０分間及び
室温で３０分間、インキュベートする。オリゴヌクレオ
チドをブライマーとして二ｍｔｔ＜合成されたＤＮＡは
ピーアールエル（Ｂ ＲＬ）社の手引書〔ユーザーマニ
ュアル（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ）／ Ｍ ｌ ３ ｍ
ｐ ７クローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ） ／’デイデ
オキシ（Ｄｉｄｅｏｘｙ） ’シーケンシング（Ｓｅｑ
ｕｅｎｃ ｉｎｇ）、１９８０年〕に従って、大腸菌Ｊ
ＭＩ０３株に感染せしめる。このようにして得られるプ
ラークは、ＹＴブレー１・〔ジェイ、エイチ、ミラー（
Ｊ、Ｉｌ、Ｍｉｌｌｅｒ）、エクスペリメンツィンモレ
キュラージェネティックス（Ｅｘｐｅｒｉ＋＊ｅｐｔｓ
ｘｎ Ｍｏ１ｅｃｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１
９７２年）４３３頁〕に移す。得られるコロニーは、°
”Ｐで標識されたＥ３−４と５５℃２時間の条件でハイ
ブリダイズされる。イントロン除去工程の結果書られる
各種生成物の内から、所望の配列を有するＤＮＡを得る
ためのプローブとして、ここでは、プリーターＥ３−４
それ自身を利用する。かくしてプリーターＥ３−４とハ
イブリダイズするコロニーを得、更にファージを取得す
る。 得られるファージをプレートにまき、得られるプラーク
をＹＴプレートに移す、ここで再び°゛Ｐで放射ラベル
したＥ３−４と５５℃２時間の条件でハイブリダイズせ
しめる０強くハイブリダイズするクローンから、ファー
ジＤＮＡを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が
完全に除去されているファージを選別する。このような
ファージの１つをｍ ｐ ９− ＨＧ ＥΔ３−１と命
名する。 工程１７ （ｐＨＴＮＦ−ＱａｃｌＪＶ５−２の構築） ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ△３−１の複製型をＥｃｏＲｌ
で消化し、電気泳動により単離する。この断片をＥｃｏ
Ｒｌで切断したｐＢＲ３２７に押入し、プラスミドｐ
ＨＧ ＩＥへ３−１を得る。 次にプラスミドｐＨＧＥ△３−１を用い、ＱａｃＵＶ５
をプロモーターとして］’ Ｎ Ｆを大腸菌中で、直接
発現させることのできるプラスミドを（１Ｘ！築する。 この構渠方法は第７図に示される。 まず１１０１ｚのプラスミドｐ ｌ−Ｉ ＣＥへ３−１
をｌＯ弔位の＾ｖａｌとＥｃｏｒｌ Ｉ （Ｂ ＲＬ
社、米国）で３７℃２時間消化し、４ｆｆｉｆｆｉ％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により目的フラグメント
を単離する。約１μｇの断片が電気泳動溶出によりゲル
から回収される。工程１４と同じように第７図に示され
る２種のオリゴデオキシヌクレオチド即ち５゛−＾＾Ｔ
ＴＣ＾ＴＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＣ：ＧＡＡＣＣニー ３
’及び５’−ＴＧＧＧＧＧＴ丁ＣＧＡＧ＾＾ＧＡＴＧ
ＡＣＡＴＧ−３’ を合成する。次いで文献（３）
ｌ ２２真の方法に従いこの２本のオリゴヌクレオチド
（約１００ｐｍｏｌｅ）の５゛端をＴ、ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いてリン酸化する。 反応後、フェノールで次いでクロロホルムで抽出する。 かくして得られる合成オリゴマーと、上記で得られるｐ
ＨＧ ＥΔ３−１の＾ｖａ Ｉ −ＥｃｏＲＩ断片０
．５μｇとを混合し、エタノール沈澱した後、文献（１
）３７頁の方法に従ってｌＯ小単位′「、リガーゼを用
い４℃−夜で結合せしめる０反応終了後、混合物はエタ
ノール沈澱し、４重量％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により目的断片を単離する。 プラスミドｐＯＰ９５−１５はエフ、フラー（Ｆ。 Ｆｕｌｌｏｒ）の方法［ジーン（Ｇｅｎｅ） Ｉ ９０
．４．２−５４頁（１９８２年）ｊにより調製する。 ｐＯＰ９５−１５のｔ／ＡｇをＥｃｏＲＩでン肖化して
フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を
して調製したベクター０．５μｇと、上記の如く＃ｉ）
だ断片を、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。実験
１Ｆ（４）、２０頁に従って、得られるベクターで大腸
菌ＪＭＩＯＩ株（ＡＴＣ：Ｃ３３８７６）を形質転換し
て１ｍＭ ＩＰＴＯ及び０゜００４％（ｗ／ｖ） ｘ
−ｇａｌを含む寒天培地上に約１００個の白色コロニー
を得る。 これらの′形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
ＥｃｏＲＩで消化し、目的の以遠１０断片を有するプラ
スミドを同定する。更にＤＮＡの挿入の方向を調べるた
めにこれらのプラスミドをＰｖｕ Ｕと１’ｓｔｌ消化
して１．５重量％アガロースゲル電気泳動を行った結果
約１２８０ｂｐ及び約２６００ｂｐの断片を有し、１ａ
ｃＵＶ５プロモーターの下流に正しく Ｔ Ｎ Ｆをコ
ードするＤＮＡが接続されているプラスミドを選別する
。 塩基配列を決定すると、２コのプラスミドは同じ塩基配
列を有し、合成オリゴヌクレオチド及び染色体由来のＤ
ＮＡが正しく接続されていることが示される。１１）ら
れるプラスミドをｐＨＴＮＦ−ＩａｃＵＶ５−２と命名
する。 ｐＮＴＮＦ−１ａｃｔＪＶ５−２を含有する大＋１９菌
を、通常の栄４Ａ培地で培養する。生成物のＴＮＴ”活
性を測定すると、ｌａｃプロモーターによって制御され
るウサギｒＮＦ遺伝子を有するｐＴＮＦｌａｃＬＪＶ５
−１を含有する大腸菌の生産物とほとんど同様の活性を
示す。 実施例２ 実施例１における工程１から１４に従ってＦＪ１１！さ
れるプラスミドｐ ＩＩＣＥとオリゴヌクレオチド１）
−４）を用いて、ｐ Ｈ”Ｉ’ Ｎ Ｆ−１ａｃＵ Ｖ
５−１を調製する。その調製方法を第６図に示す。 本発明の一部を１１り成する新規な微生物および培養細
胞はヒトＴ Ｎ Ｆを産生する能ツノがあるために重要
であり新規であることが理解されよう、従って、以」二
の記載に従って調製される形質転換微生物および培養細
胞に加えて、本発明は更に、′ｒＮＦ産生において強い
活性を示すようなそれらの変異株や突然変異体をも包含
するものである。 微生物及び新規プラスミドは、該プラスミドを含有する
微生物の試料を寄託することにより、アメリカ合衆国、
メリーランド、ロックビル（ＲＯｃｋ−ｖｉｌｌｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ、 Ｕ、Ｓ、Ａ）のアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ口Ｔｙ
ｐｅＣｕｌＬｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に１９８
４年４月６日付で寄託されている。微生物大腸菌に一１
２ＪＭ８３（ｐＲＧＥ）株にはＡＴＣＣ寄託番号第３９
６５５号が、大腸菌に−１２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株
にはＡＴＣＣ寄託番号第３９６５６号が与えられている
。 以上本発明について述べたように、本発明は様々な方法
で達成することができる。そのような変化は本発明の精
神と範囲からはずれるものと見なすべきではなく、当業
者にとって明らかであるそのような全ての変化は本願の
特許Ｒ／ｊ求の範囲に含まれるものである。
らはヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの溝道について鋭意
研究を行なった。その結果、意外にも、ヒトポリペプチ
ド遺伝子及びウサギＴＮＦ遺伝子をウサギｃＤＮＡをプ
ローブとして利用することによりクローンすることがで
きること、ヒトポリペプチドをコードするＤＮＡを巧く
単離することができ、その構造が塩基配列の相同性に関
してウサギＴＮＦ遺伝子、ヒトポリペプチド遺伝子及び
ウサギｃＤＮＡを比較することにより決定できること、
ヒトポリペプチドをコードする純粋なりＮＡの１１ζ造
も巧く決定することができ、その純粋なりＮＡを得るこ
とができること、およびヒトポリペプチドをコードする
ＤＮＡを用いて得られたヒトポリペプチドがし細胞障害
活性を有することを本発明者らは発見した。 本発明は、これらの新しい知見に基づき完成された６ 即ち、本発明の目的は、ヒｌ−Ｉ’ Ｎ Ｆをコードす
るＤＮＡを提供することにある。 また、本発明の目的は、ヒト１’ Ｎ Ｆをコードする
ＤＮＡと複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な
組換ＤＮＡを提供することにある。 更にまた、本発明の目的は、上述のような組換ＤＮＡで
形質転換された微生物又は細胞をｌｊｌ供することにあ
る。 前述したこと及び本発明の他の諸目的、諸特徴及び諸利
益は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な記載から
明らかとなろう。 木質的には、本発明によれば、次式（１）％式％ （式中、Ｇｌｎはグルタミン残基、Δｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシン残
基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｇｌ＋
はグルタミン酸残基、＾ｌａはアラニン残基、＾ｓｎは
アスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｌ＋ｅは
フェニルアラニン残基、Ｇｚｙはグリシン残基、ｌ１ｉ
ｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、ＴＩ＋ｒは
スレオニン残基、ｌｉｅはイソロイシン残基、Ｔｒｐは
トリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍｅｔ
はメチオニン残基及びＣｙｓはシスティン残基を表わす
）で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性ポリ
ペプチドをコードする塩基配列を含有するデオキシリボ
核酸が提供される。 更にまた、本発明によれば、次式（ＩＩ）で表される塩
基配列 ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣＣ
Ｇ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＧ （：（：Ｔ ＧＴ
ＡＧＣＣＣＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ Ａ
ＡＣＣ（：Ｔ ＣＡＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧ
ＧＧＡＧ ＣＴ（： （：ＡＧ ＴＧＧ ＣＴ
Ｇ ＡＡＧ ＣＧＣ（：ＧＧ ＧＣＣＡＡＴ Ｇ
ＣＣＣＴＣＧＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡ
Ｇ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＧＡＧ ＣＴＧ
ＧＴＧ ＧＴＧ （：（：Ａ ＴＣＡ Ｇ
ＡＧ ＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴ
ＣＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣ： ＴＴＣＡＡＧ ＧＧＣ
ＣＡＡ ＧＧ（：ＴＧ（： （：（：ＣＴＣ（：
ＡＣＣＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣ：ＣＣ
ＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣ（：Ｇ（１： ＡＴＣＧＣＣＧ
ＴＣＴＣ（： ＴＡＣＧＡＧ ＡＣＣ： ＡＡＧＧＴ（
： ＡＡＣＣＴＣＣＴ（： ＴＣＴ ＧＣＣＡＴＣＡＡ
Ｇ ＡＧＣＣＣＣＴＧ（：ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＧ
ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＴ
ＧＡＧ ＧＧＣ＾＾ＧＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ Ｇ
ＡＧ ＣＣＣＡＴＣ丁ＡＴＣ丁Ｇ ＧＧＡ ＧＧ
Ｇ ＧＴＣＴＴ（： ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ＾ＡＧ
ＧＧＴ ＧＡＣ： ＣＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡ
Ｇ ＡＴＣＡＡＴ （：ＧＧ ＣＣＣＧＡＣＴＡ
Ｔ （：ＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣＧＡＧ ＴＣＴ
ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ ＧＧＧ ＡＴ
ＣＡＴＴ ＧＣ（１：ＣＴＣ （式中、Δはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及び゛「は
チミジル酸残基を表わし、式（ｕ）の左端および右端は
それぞれ５゛−水酸基側および３′−水酸基側を表わす
） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有するデオキシリ
ボ核酸が提供される。 本発明のＤＮＡは、微生物や培養細胞によって成熟ヒト
ＴＮＦを生産するために、０１１記塩基配列の５′末端
にＡＴＧ （Ａ、ＴおよびＧはｎｉＪ述の通番月が結合
した塩基配列からなるＤＮＡを包含する。本発明のＤＮ
Ａはまた、ヒト１’ＮＦのシグナルペプチドの部分また
は全部をコードする５′−フランキングＤＮＡを含むＤ
ＮＡも包含する。 自然の変異によりまたは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、ＤＮＡのｔＭ造及びそれから
演鐸されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめるこ
とが可能である。従って本発明のＤＮＡは、ｎ；ｆ述の
すべてのポリペプチドの相同変異体に相当する構造を有
するポリペプチドをコードする塩基配列を含有すること
も可能である。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子の塩基
配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換す
ることができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝
暗号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列を
含有することも可能である。この場合、上記置換により
得られた塩基配列から演鐸されるアミノ酸配列はｎ；１
に定義した式（１）のアミノ酸配列と一致する。 更にまた、本発明によれば、ｎｆ記デオキシリボ核酸と
複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組ｊＡＤ
Ｎ Ａが提供される。該組換ＤＮＡは。 それによって形質転換された微生物または細胞中で、ヒ
ｌ−’ｌ’ Ｎ ［’のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを発現することができる。適したベクタとしては
、例えば、ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ ５−１及びｐＨ’
ｒＮＦ〜ｌａｃ ＵＶ ５−２ ｆＱ ＱＬベクターが
挙げられる。 更に本発明はまた。ヒト′Ｉ″ＮＦのアミノ酸配列を含
有するポリペプチドを発現し得るｔｓｎ可能な組換ＤＮ
Ａで形質転換された微生物または細胞に係る。このよう
な微生物または細胞として、大腸菌、枯草菌、酵１ｕ、
高等動物細胞が挙げられる。 ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡは次のようにして得られ
る。 ■、バクテ１オファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージ入／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは、バーバード大学生化学および分子生物学部
〔アメリカ合衆国、マサチューセッツ０２１３８、ケン
ブリッジ、デイビニティ アベ二′ニー７、（７Ｄｉｖ
ｉｎｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｌｓ ０２１３８．Ｕ、Ｓ、Δ
）〕のティー、マニアティス（ＴｌＭａｎｉａＬｉＳ）
教授により調製されたものを用いる。これらのライブラ
リーは次の方法によって作ることができる。 〔セル（
Ｃｅｌｌ）、 １５１゜６８７頁（１９７８年）参照
〕 （１）ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサギある
いはヒトのすい臓を凍結粉末にし、ＲＮＡと蛋白成分を
分解処理し、沈澱によってウサギあるいはヒトの高分子
ＤＮＡを得る。 （２）この高分子ＤＮＡは遺伝子座位をランダムに切る
ために、部分的に分解する。 （３） ｆｔ）られたＤＮＡ断片から分子量分画によっ
て、１５かも２０キロ塩基対（Ｋｂ）の大きさの断片を
得る。 （４） ］二程３で得られたＤＮＡ断片をλ シャロン
４Δフアージベクターを用いてクローン化する。 （５）得られたベクターを、ｒＤＮ八を含む感染性のフ
ァージ粒子にｉｎ ｖｉｖｒｏで組み入れ、上記のウサ
ギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリを得る。 ２、参考例３で得られたウサギｒＮＦのｃＤＮΔは、ビ
ー、ダブリュー、ジェイ・、リグビー（Ｐ。 Ｗ、 Ｊ、 Ｒｉｇｂｙ）らのニックトランスレーショ
ン法〔ジェイ９モル、パイオル、 （Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、）、１１３９．２３７頁（１９７７年）参照
〕によって°″Ｉ）でラベル化する。 ３、バクテリオファージス／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージλ／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の上に密に
プラークができるように植えつけ、′″Ｐでラベルした
ウサギＴＮＦのｃＤＮＡとハイブリダイズさせてスクリ
ーニングする。 ４、適合するクローンより、対応するＤＮＡを単離し、
制限酵素地図を作り、サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハ
イブリダイズ法〔イー、エム、サザーン（ＥｏＭ。 ５ｏｕｊｈｅｒｎ）、ジェイ１モル、パイオル、 （Ｊ
、 Ｍｏ１゜１１ｉｏ１．）、 ９８巻、５０３頁（１
９７５年）参照〕によって解析する。 ウサギ１’ＮＦとヒト’Ｉ’ Ｎ Ｆの遺伝子を含む制
限酵素分解された断片を、プラスミドベクター中に導入
し、サブクローンした後、塩基配列を解析する。 ５、ウサギ”ｌ’ＮＦのｃＤＮＡとウサギＴＮＦ遺伝子
の塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝子のエクソン
（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコードする塩基配列）
と、イントロン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコード
しない塩基配列）を決°定する。 ６、そして、ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦの遺伝子
を比較して、ヒト”ｒ Ｎ Ｆ遺伝子のエクソンとイン
トロンを決定する。 ７、ウサギＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除しエクソン
を結合することによって得られた塩基配列より決められ
るウサギＴＮＦのアミノ酸配列は、ウサギ１”ＮＦのｃ
ＤＮへの塩基配列より決められるアミノ酸配列と一致す
ることが確認される。 ８、次に、ヒトＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除し、エ
クソンを結合することによって得られた塩基配列よりヒ
トＴＮＦのアミノ酸配列が決められる。ヒト］’ＮＦの
アミノ酸配列は、ウサギＴ Ｎ Ｆ。 のアミノ酸配列と部分的に一致することが＃ｌ認される
。 このようにして得られたヒト’ｒ Ｎ Ｆをコードする
ＤＮＡから以下のようにして、ヒト’ｒ Ｎ Ｆを製造
することができる。 １、ヒトＩ”ＮＦをコードするＤＮＡをｉｎ ｖｔｔｒ
。 で修飾し、適当な発現ベクターに導入し、そのＤＮＡを
含む組換ＤＮＡを作製する０組換ＤＮＡは適当な宿主に
導入し、これを培養液中で増殖せしめて所望のヒトＴＮ
Ｆを発現せしめる。 ２、このようにして得られるヒト’ｒ Ｎ Ｆは成熟形
でセリンかも始まる１５５個のアミノ酸残基かもなる。 それがプレシーケンスにシグナルペプチドを有している
場合、シグナルペプチドは非常に疎水性の性質を有する
。 以上は、ヒトＴＮＦ遺伝子およびヒトＴＮＦをコードす
るＤＮＡの取得方法および該ＤＮＡを用いるヒトＴＮＦ
の製造方法を示したものである。 しかし上記の記載は本発明を限定するものではなく、本
発明の木質的な特徴及び基本概念を変えることなく当業
者によって明らかな変換を行なうことができる。 各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの塩基配列の一部または
全部を、有機化学的に合成された人工のＤＮＡに置換え
ることも可能である。 おそらく、ヒトＴＮＦは、プレペプチド又はプレプロペ
プチドとして未成熟形で細胞内に産生され、プロセシン
グ段階でプロセスされて中間体を経て、成熟ＴＮＦ’を
形成するものと考えられる。 ヒトＩ’ Ｎ Ｆの未成熟形はヒト’「ＮＦ遺伝子の塩
基配列から演鐸される。未成熟又は中間体のＴＮＦをコ
ードするＤＮＡからなるＴＮＦ ＤＮＡは、また天然
又は人工合成のＤＮＡと組換えることができる。 これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ遺
伝子の５′端に導入し、そして３′端に’ｒＡΔもしく
は’ｒ Ａ ＧもしくはＴＧＡの終止コドンと呼ばれる
トリプレットを、少なくとも１個導入することである。 メチオニンコドンが存在することにより、適当なプロモ
ータによって合成される＋ｍＲＮＡから成熟あるいは未
成熟あるいは中間体ＴＮＦが産生される。この様にＴＮ
Ｆの末端に付加されたメチオニン残基は、宿主によって
は自然に除去される。終止コドンを挿入する目的は’Ｉ
’ Ｎ Ｉ＝ Ｄ ＮＡから転写されたｍＲＮΔから
の翻訳を適当な位置〔式（１）のポリペプチドのＣ末端
］で止めることである。 また別の形態としては、゛′シグナル配列”と呼ばれる
疎水性に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の
外またはダラム陰性細菌においては。 ゛′ペリプラズム″と呼ばれる部分へ、分泌させること
も可能である。 また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するペプチドとＴＮＦとの融合ペプチド
を形成するが、この場合は化学的または酵素的に切断す
るか、もしくはＴＮＦの主たる活性に変化がなければ、
そのまま用いることができる。 ヒトｉ’ Ｎ Ｆ遺伝子を、正しく転写し、それによっ
て得られる＋ｏｆｌＮＡからの翻訳が正しく行われるよ
うな配列において、プロモーター等の５′領域の遺伝子
配列に接続し、得られたＴＮＦ ＤＮＡ−プロモータ
ー配列を細菌または高等生物細胞中で複製可能なベクタ
ーと接続した組換遺伝子を得、この組換遺伝子によって
宿主として細菌または高等生物細胞を形質転換し、この
形質転換体を増殖せしめ、ｉ’ Ｎ Ｆ遺伝子を発現せ
しめることにより！’ Ｎ Ｆを得ることができる。 宿主として大腸菌［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｌ＋ｅ
−ｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ） ］ （以下゛′大腸菌
′″と記載する）を用いる場合は好適には大ｎ９菌に１
２株の種々の変異株、例えばＨＢ Ｉ ０１ （ＡＴＣ
Ｃ３３６９４）、Ｃ６００Ｋ（八ｒ［；［；３３０５５
）、 Ｉ） Ｉ ２ １ ０ 、１又 ＲＩ（Ａ丁
ＣＣ３１３４３）、 ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２
（八ＴＣＣ３３５７２） 、 Ｊ Ｍ Ｉ Ｏｌ （
ＡＴＣ（： ３３８７６）、ＪＭ８３、χＩ ７７６
（ＡＴＣＣ３１２４４）などが用いられる。 大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、１口Ｒ３
２２、ｐ＋３１？３２５、 ｐ［ｌＲ３２７、ｐＵｃ８
、 ｒ＋Ｕ（：９、 ｐＭＢ９（ＡＴＣ［： ３７０１
９） 、 ｐＪＩ！８ （ＡＴＣＣ３７０７４）、ｐＫ
Ｃ７（ＡＴ（Ｉ； ３７０８４）等のプラスミドあるい
はλｇｔ。 λＢ、シャロン４Ａのようなλファージ、ＭＩ３ファー
ジなどが用いられる。 大腸α１の菌体中に、該生理活性ポリペプチドを産生さ
せるために、大腸αＪの遺伝子またはファジ遺伝子のプ
ロモーターが使用される。このようなプロモーターとし
て、好適にはラクトース分解酵素（ＬΔＣ）のプロモー
ター及びそのＵＶ５変異、ペニシリナーゼ（［３ＬＡ）
、ｌ−リブトファン合成酵素（ＴＲＩ））のプロモータ
ー、λファージのＰＬプロモーターあるいはトリプトフ
ァン合成酵素と、ラクトース分解酵素の融合プロモータ
ーであるＬａｃプロモーター等が用いられる。 枯草菌［バチルス・サブチリス（３ａ（ｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ） ］ （以下゛′枯草菌パと記載す
る）を宿主とする場合には、ＢＤ１７０株（ＡＴＣＣ３
３６０８）、ＢＲ１５１株（ＡＴＣＧ ３３６７７）、
ＭＩ１１２株（ＡＴＣＣ３３７＋２）などが用いられ、
ベクターとしてはｐｃＩ０４（ＡＴ（１：Ｃ３７０３４
）、ｐＵＢＩＩｏ （ＡＴＣＣ３７０１５） 、 ｐＳ
＾２１００（ＡＴＣ：Ｇ３７０１４）、ｐに１９４など
のプラスミドが用いられる。 枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素（（：ＡＴ）やベニシ
リナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモー
ターが用いられる。 酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ
ｅ ）のｒｌｌ＋２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、５
ＩＩＹ １株（ＡＴＣ（： ４４７６９）、５ＩＩＹ
３株（＾１’ＣＧ ４４７７１）、ＤＩ３１Ａ株、４８
３株、８３０株などが用いられ、そのベクターとしテハ
ＹＩＥｐ ｌ ３ （ＡＴＣＣ３７＋１５）、ＹＥｐ６
、ＹＲｐ ７、Ｙｌｐ ５等のプラスミドが用いられる
。 酵１才を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホ
スファターゼ、アルコールデヒドロゲナゼ（ΔＤｌ−１
１）、１−リプトファン合成酵ｆＡ（ＴＲＰ）、ホスホ
グリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、チトクロームＢ （
ＣＯＢ）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いら
れる。 高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、サル腎細胞、
ＣＯ３細胞、マウスＣ１２７細胞（ＡＴにＣ：＋６１６
）などが用いられ、そのベクターとしては５ｖ４０ウイ
ルス等を用いることができる。 本発明で得られる新規生理活性ポリペプチドの分子量を
レムリ（Ｌａｅｎ＋ｍ１ｉ）の方法［レムリ、ニーケー
、（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｏ，に、）（１９７０）ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２２７巻、６８０頁〜
６８５頁〕に従ってＳＤＳボリアクリルアミド電気泳動
（ＳＤＳ ｒ’ＡＧＥ）で測定すると、約１７０００を
示す、尚、その際にマーカーとしては、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量９４Ｋ）、ウシ血清アルブミン（分子ｆｆ１
６７Ｋ）、オボアルブミン（分子量４３Ｋ）、カルボニ
ックアンヒドラーゼ（分子量３０Ｋ）、大豆トリプシン
インヒビター（分子量２０、ＩＫ）とα−ラクトアルブ
ミン（分子ｊｉ１４．４Ｋ）を用いる。 本発明のＤＮＡから得られる新規生理活性ポリペプチド
は生体の正常組織は傷つけず、腫瘍の壊死を引きおこす
。本発明の活性ポリペプチドは公知の方法によって調剤
して悪性腫瘍細胞増殖のような細胞増殖を阻害するのに
有効な医薬組成物を調製することができる６本発明の活
性ポリペプチドは薬剤として使用可能な担体と混合する
こともできる０本発明の活性ポリペプチドの有効量を適
当な量の７１体と混ぜて、患者に効果的に投与するのに
適した医薬組成物を調製することができる。 本発明のＤＮＡから得られる生理活性ポリペプチドは、
抗腫瘍治療または抗ウイルス治療の必要な患者に注射剤
、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、外用剤、経１コ投与用剤、
直腸投与用剤、膣内投与用剤などにして投与することが
できる。 本発明のポリペプチドの成人１日当りの治療量は、一般
に５０単位〜ｔｏｏ、 ０００．０００単位であり、さ
らに好ましくは局所適用においては５０〜５００．００
０単位、静脈注射、筋肉注射などの全身注射においては
、１，０００〜１，０００，０００単位、経口投与にお
いては、１０．０００〜ｔｏｏ、 ０００．０００単位
であり、用法あるいは症状に応じて適宜増減することが
できる。 （以下余白） 上記において用いた゛ｌ単位″はＬ−Ｍ細胞（Δ１’Ｃ
：ＣＣＣＬ １．２） ｌ Ｘ Ｉ Ｏ’ｆｌｉ２／ｍ
Ｑの５０％を殺す本発明の生理活性物質の量を意味する
。上述の量は次のようにして測定する。培養容器として
９Ｇ穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボト
リー社、米国）を用い、Ｌ−Ｍ細胞を１ ｖ／ｖ％のウ
シ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル
培地（その組成は、たとえば、「組織培養」中外Ｑｊｌ
之助池編集、朝食書店、１９６７年に記載されている）
中で培養する。順次培地で希釈した該生理活性ポリペプ
チド試料０．１ｍＱとｌＯ＠個／ ｍ Ｑの濃度のＬ−
Ｍ細胞の培地懸濁液０．１ｍＡをプレートの各式の中で
混合し、マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空気
中、３７℃で４８時間培養する。培養終了後、２０％グ
ルタルアルデヒド水溶液２０μＣを加え細胞を固定する
。固定後、マイクロプレートを蒸溜水で洗浄、乾燥して
、０．０５％メチレンブルー溶液をＯ，１ｍＱ加え、生
き残った細胞を染色する。余分なメチレンブルーを洗い
流し乾燥した後、残ったメチレンブルーを０．３６Ｎ塩
酸溶液で抽出し、その６６５ｎｍにおける吸光度をタイ
ターチック・マルチスキャン（フロー・ラボラトリ−社
、米国）で測定する。この吸光度は、生き残った細胞数
に比例する。上記の本発明の生理活性ポリペプチドのｌ
×１０°個のＬ−Ｍ細胞の５０％を殺す量は希釈率と吸
光度をグラフ上にプロットすることによって求めること
ができる。 本発明のＤＮＡから得られる生理活性ポリペプチドは、
非経口的に適用することができる。非経口投与用の調剤
にあたっては、アルブミン、ゼラチン、グロブリン、プ
ロタミン、プロタミン塩などの安定化剤、ショ糖、グリ
セリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
スなどの増粘剤、各種無機塩のｐｌ＋調整剤などを添加
剤として加えることができる。また、本発明の生理活性
ポリペプチドは、錠剤の形で投与することもできる。 錠剤の調製の際に用いられる添加物の例としては、上述
の安定化剤に加えて、デンプン、乳塘なとの賦形剤を挙
げることができる。 具体的には、動物実験の結果、マウスの腫瘍も大半か−
、二回の注射投与で完治する。たとえば、マウスの皮膚
に人工の腫瘍（メスＡ細胞）を移植、直径６〜７ミリに
なった段階で本発明の新規生理活性ポリペプチドをわず
か０．６マイクログラム注射すると、−週間後にかさぶ
た状になり、二週間後には再び毛が生え始めて完治、そ
の後、妊娠、出産する。 以下に参考例および実施例によって本発明を詳細に記す
が、本発明はこれに限定されるものではない。 本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断らない限り下記の実験書（１）
〜（４）に従って実施する。 （１）高木康敬編著 遺伝子操作マニュアル、講談社 （２）高木康敬編著 遺伝子操作実験法、講談社（３）
ティー、マニアティス（７０Ｍ６ｎｉａｔｉｓ）、イー
エフ、フリッチ、：Ｌ （Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｃｂ
）、ジェイ、サムプルツク（Ｊ、 Ｓａ＊ｂｒｏｏｋ）
、モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、コールドスプリングハーバ−ラボラト
リ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）刊（１９８２年米国）（４）レイ ウ
（Ｒａｙ Ｗｕ）ら、メソッドインエンザイモロジ−（
ＭｅＬｌ＋ｏｄ ｉｎ ｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１
０１０、アカデミツク プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ ｒ
’ｒｅｓｓ）（米国）刊考例および実施例中で用いられ
る略号 ＭＯＰＳ ：モリフオリノブロバンスルホン酸Ｌ８
培地 ：ルリアーベルタニ培地 ＤＭＳＯニジメチルスルフオキシド ＰＦＵ ・プラーク・フォーミング単位Ｅｌ）Ｔ八
：エチレンジアミン四酢酸 ５ｔ）Ｓ ・ドデシル硫酸すｌ・リウム＋１１？Ｌ
：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、米国 ＤＭＦ ニジメチルホルムアミド １ｉｌａｃ ：ラクトース トリス（Ｔｒｉｓ） ・ｌ・リス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン ＸＡＲ−５＋ Ｘ線フィルム（イーストマン・コダック
社、米国） Ｉ Ｘ５ＳＣ： ０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０Ｉ
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ２ Ｘ５ＳＣ： ０．３０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０３
０Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ３ Ｘ５ＳＣ： ： ０．４５Ｍｍ化ナトナトリウム
＋０．０４５エン酸ナトリウム、ｐｌ（７ ５Ｘ５Ｓ（： ： ０．７５Ｍ塩化ナトリウム＋０．
０７５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ６ ｘＳＳＣ： ０．９０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０９
０Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ１１７ ＦＤＳＳ ： ５０％脱イオン化フォルムアミド＋
５×デンハルト（ＤｅｎｈａｒｄＬ’ ｓ） ＋ ５
Ｘ ５ＳＰＥ＋ Ｏ，ｌ工ｓＤｓ ＋ Ｉ ＯＯｐｇ／
ｍ Ｑ変性ウシ胸腺ＤＮＡ ５ＳＰＥ ： ０．１８Ｍ塩化ナト’） ラム＋
ｌ Ｏ＋ｍＭＩＪン酸二水素ナトリウム＋１ ｍＭ Ｅ
ＤＴ＾、ｐ１１７．４ ＳＭ ： ｌ １） ｉ’ｌ：塩化ナトリウム５
．８ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２ｇ、１Ｍ トリス−ＣＱ（Ｔｒｉｓ−ＣＱ）（ｐＨ７，５）５０ｍ
ｇと２％ゼラチン５ｍ込を含む ファージ保存培地 ＮＺブロス・ｌｃ中にＮＺアミン（カゼインのタイプΔ
水解物、フムコ・シェフイールド・ ケミカル・デビイジョン・オブ・クラ フト社、米国）ｌｏｇ、塩化ナトリウ ム５ｇと硫酸マグネシウム・７水和物２８を含む培地 １ｒ’ＴＧ ：イソプロビルチオガラクトシドＸ−
ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラ
クトシド ＴＡＥ ：０．０４Ｍ トリス（Ｔｒｉｓ）−
酢酸（ｐｌ＋８、０）−０，００２Ｍ ＩＥＤＴ＾ ５×デンハルト溶液：ｌθ中にフィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）１０００ｍｇ、ポリビニルピロリドン １０００ｍｇ、及びウシ血清アルブミン１０００ｍｇを
含む水溶液 ｂｐ：塩基対 ［実施例１ 参考例ＩＬ細胞障害活性評価 以下の参考例及び実施例においてし細胞を用いる活性３
１価は、ラフ（Ｒｕｒ「等）［リンホカインズ（Ｌｙｍ
ｐｂｏｋｉｎｅｓ） ２ ｕイー、ビック（［シ、Ｐｉ
ｃｋ）編集、アカデミ・ツク ブレス（八ｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｉ’ｒｅｓｓ） ２３５頁（１９８０））あるいは
［ジエイ、イムツル。 （Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、） １２６巻１２７９頁（１９
８１年）］の方法にｉ！Ｉじ、本発明による生理活性物
質がＬ９２９細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１）を殺す効果を測
定するものである。すなわち、順次培地で希釈した試料
０．１ｍαと、１０’個／ ｍ Ｑの濃度のし細胞の培
地ｇ！濁液０．ｌ ｍαを、９６穴の組織培養用マイク
ロプレート（フロー・ラボラトリ社、米国）に加える。 培地はｌｖ／ｖ％のウシ胎児血清及び最終濃度５μｇ、
／ｍＱのアクチノマイシンＤを含むイーグルのミニマム
・エツセンシャル培地（その組成は、たとえば、「組織
培養」中耳１ｉｆｆ之助他編集、朝食書店、１９６７年
に記載されている）を用いる。マイクロプレートを５％
の炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２１時間培養する。 培養終了後、２０％グルタルアルデヒド水溶液２０ Ｉ
ｔ Ｑを加え、細胞を固定する。固定後、マイクロプレ
ートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶液
を０．１ｍ（Ｌ加え、生き残った細胞を染色する６余分
なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残ったメチレ
ンブルーを０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、その６ｆｂ をタイターチック・マルチスキャン（フロー・ラボラド
す〜社、米国）でｉｌｌ’ｌ定する。この吸光度は、生
き残った細胞数に比例する。 Ｌ９２９細胞の５０％
を殺すために必要な生理活性量をＩ単位／ｍＱと定義し
、試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する
試料の希釈率を、グラフあるいは４算によって求め、そ
の希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位／ｍαで表記
する）とする。参考例において用いる”１単位′°は、
１０’個／ｍαのＬ９２９細胞の５０％を殺すウサギＴ
Ｎ Ｆの量を意味する。 一方、蛋白質量は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄ−ｒｏ
ｒｄ）らの方法〔アナル、バイオケム、（Ａｎａｌ、
Ｂｉ。 ｃｂｅｍ、） ７２巻２４８〜２５４頁（１９７６年）
ｊにより、クーマシー・ブリリアント・ブルー６２５０
を用いる色素結合法から算出する。 参考例２ 工程ｌ （ウサギ血γｆｔＴＮＦの取得）雌ウサギ（体
重２．５〜３．０ｋｇ）にホルマリンにて死菌処理した
プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏ ｉｏｎｉ
ｂａｃＬｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ） （コリネバクテ
リウム・パーバム（にｏｒ ｎｅｂａｃＬｅｒｉｕｍ
匹■朋）、ウェルカム社、英国１５０＋ｎｇを耳静脈よ
り注射する。 該ウサギに８日後再度１００μｇのエンドトキシン〔大
腸菌０２６ ： Ｂ６山来のりボボリサッカライド、デ
イフコ社製、米国〕を耳静脈より注射し、２時間後に心
臓より全採血する。採取した血液に１００ｍＱ当り１０
０単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５．ＯＯＯｒ
ｐｍで３０分間冷却遠心操作を行ない、血球および不溶
固型物を除去する。 ４０羽のウサギより、血清ＴＮＦ３ＸＩＯ’単位／ｍα
の活性を有する血漿２．４αが得られる。 工程２（血？ｆｆ ＴＮ Ｆ ｃ７）部分ｉｎンコニ程
１でス；）た血漿２．４Ｃにセライｌ−２４ｇを加え、
１時間撹１゛シた後濾過する。ｌｌｘ液に１．２αの０
．０４Ｍ＋−リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋ ７ 、８ ）
を加えた後、０，１Ｍ塩化すトリウムを含む０．０４Ｍ
トリス−塩酸縁１ｆｌｉ液（ｐｌ＋ ７ 、８ ）で充
分に平衡化した１）［ミ＾ＩミセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社、スウェーチン）のカラムに添加する
。０．０４Ｍトリス−塩酸縁６ｊ液で洗浄後、Ｏ，１８
Ｍ塩化ナトリウムを含む０，０４ＩＶｌリス−塩酸緩衝
液（ｐｌ＋７．２）を用いて溶出する。Ｌ細胞障害活性
を示す両分を、限外濾過により濃縮する０次いで５ｍＭ
リン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（フ
ァルマシア社、スウェーチン）のカラムに該濃縮液を添
加し、同緩征ｉ液にてゲル濾過を行なう、活性画分は限
外濾過により濃縮し３．５×１０＠単位を回収する。比
活性は１８ＸＩＯ＠単位／ｍｇである・ 工程３（抗Ｔ Ｎ ｌ？抗体） 血γ１１ｉより得た’［’ Ｎ Ｆを工程２の如く部分
精製しフロイントの完全アジュバントをｆ、１で混合し
１２週令のｔｌｉ ＢＡＬ［ｌ／ｃマウスの背部皮下に
注射する。２週後、及び４週後にこの操作を繰返し、更
に１週後に全採血し、その血清を取得する。 この血清をＬ細・胞障害活性を測定する培地中に終濃度
５００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得た
ＴＮＦのし細胞障害活性を参考例１に示す方法で測定す
ると、Ｌ細胞障害活性は認められない、ここに得られる
マウス血清は、ウサギ血清’ｒ Ｎ Ｆに対する抗体（
抗ＴＮＦ抗体と称する）を含むものと結論できる。 参考例３ 工程＋（１’ＮＦ産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したプロピオニバク
テリウム・アクネス（Ｐｒｏ ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍａ亜弘）〔コリネバクテリウム・パーバム（如り黒
υｂａｃＬｅｒｉｕｍ 匹■肥）、ウェルカム社、英国
Ｊを静脈内反ケし、７日後に気管切開し、肺を生理食塩
水で洗浄することにより澤遊性細胞を得る。この細胞を
生理食塩水で洗浄後、１０％ウシ胎児血清（フロー・ラ
ボラトリ−社、米国）を含むＲ１）ＭＩ ｌ６４０（フ
ロー・ラボラトり一社、米国）を培地とし、炭酸ガス５
％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベーターに
て、３７℃で培養する。培養器を２コに分け、一方には
大腸菌由来のエンドトキシン〔大腸菌０２６：１３６由
来のりボボリサツカライド、デイフコ社、米国］を１１
０１Ｌ／ｍαとなるように添加し、一方には同量の滅菌
水を添加する。エンドトキシンを添加した培養上清にＬ
細胞障害活性が出現し７時間で最高値に達する。 この活性は抗Ｔ Ｎ Ｆ抗体で消去されるが、正常マウ
ス血清ではｔｌ’ｌ去されない。 一方、エンドトキシンを添加しない細胞培養上清にはＬ
細胞障害活性は認められない。 工程２ （ＴＮＦの分子量） 工程ｌにおける細胞培養においてエンドトキシンと共に
放射性し−〔１”Ｓ］メチオニン（１３００ｃ：ｉ／ｍ
ｍｏ Ｑ ｅ、アマージャム社、英国）をＩ ｍＣ１／
ｍ Ｑとなるように添加して培養を行う、培養上清を
レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）の方法ｒレムリ（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ）英国（１９７０年）ネーチＪＩＦ −（Ｎａｔ
ｕｒｅ） （ロンドン）２２７巻６８０〜６８５頁）に
従ってＳＤｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により解
析する。 ゲル濃度は１２．５％となるようにｌｌ１ｌＩ製する。 泳動後エンハンス（［ＥＮＨＡＮＣＥ ）にニー・イ
ングランド・ヌクレアー社、米国）により処理し、乾燥
後、Ｘ線フィルム（フジＲＸ、富士写真フィルム）に密
着ｎ光せしめる。エンドトキシン存在下に培養した培養
上清に、分子量的１７５００の物質の生成が認められる
。 また工程ｌにおける細胞培養の上清を上記と同様にＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、２．５
％ＮＰ４０ （カルビオケム社、米国）で１時間、水
中で２時間様とう後、各泳動レーンを切断分離し、泳動
方向に直角に２ＩＩＩｌ中にスライスする。各スライス
断片をＬ細胞と共に培養することにより、し細胞障害活
性を調べる。エンドトキシン存在下に培養上清を展開し
たレーンの分子量的１７５００の位置にし細胞障害活性
が認められ、その池の位置には細胞障害活性は認められ
ない。 工程３（ｍｆｌＮＡの取得） 工程ｌと同様な細胞培養においてエンドトキシンを添加
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
浄細胞）を集める。細胞質ＲＮΔおよびその中からのｍ
ＲＮΔの抽出は下記の如くチャーブウィン（Ｃｂｉｒｇ
ｗｉｎ）らの条件［チャーブウィン、ジェイ、エム、（
Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、 Ｊ、 Ｍ、）ら、バイオケミスト
リー（１３ｉｏｃｌ＋ａｍｉｓｔｒｙ） ｌ ８０５２
９４頁（１９７９年）〕に従って行なう。細胞３ＸＩＯ
１個に対して４ｍｆｉの４Ｍグアニジンチオシアネート
溶液を加え、ホモジナイザー（ＡＭ−７、日本精機製作
所）にて破砕する。残査を遠心除去後、２．４ｇの塩化
セシウムを溶解し、あらかじめ２゜５ｍＱの５．７Ｍ塩
化セシウム、０． Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７、５
）を入れであるポリアロマ−チューブへ静かに！■層す
る。 ベックマン３Ｗ４１０−ター（ベックマン社、米国）を
用いて２０℃３ｏｏｏｏｒｐｍにて１２時間、超遠心分
離を行った後、上清を除き、ペレットをｌｏｍＭｈリス
−塩酸縁ｔｆｌｉ？ＩＪＬ（５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｌ
ｗ／Ｖ％ＳＤＳを含有する）１ｍ＋１にて溶解するにの
溶液を１ｍＱ、のクロロホルムと１−ブタノールの混液
（容積比４・ｌ）で抽出し、水層に０．０５容積の２Ｍ
酢酸ナトリウムと、２．５容積のエタノールを加え、−
２０℃で２時間以上放置してＲＮＡを沈澱させる。遠心
にて沈澱を集め、乾燥させたのち滅菌水５００μαに溶
解して、細胞質ＲＮＡ溶液を得る。 上記細胞質ＲＮＡｒＢ液を６８℃、２分間加熱後急冷し
、５００μＱの２倍濃度のｌ領１トリスＥＤＴＡ緩ｔｆ
ｌｉ液ｐＨ７、４（１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０，１ｗ／ｖ
％ ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、
２００ｍｇのオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ピーアール
エル（ＢＲＬ）社、米国）カラムに展開、１倍濃度の上
記バッファー１０ｍＡで洗浄、溶出縁１＃液（ｌＯ州ト
リス−塩酸ｐａ１７ 、４．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０，
１ｗ／ｖ％ｓＤｓを含む）２ｍＱで溶出する。溶出液に
０゜０５容積の酢酸ナトリウム溶液、２．５容積のエタ
ノールを加えて一２０℃に冷却して沈澱せしめる。沈澱
を遠心にて集め、再度同様にオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムに吸着する両分を集める。 紫外吸収スペクＩ・ル分析により、８５ＩＬｇのｍＲＮ
Ａを回収する。 工程４＜ｍＲＮＡのサイズ分画） 工程３と同様にしてｌｊ）られる＋５ＲＮＡ８８０μｇ
を２５０μ０の水に溶解し、５−２５％直線シヨ糖密度
勾配置 ０ｍＡに重層する。ショ糖密度勾配は、５およ
び２５％のショ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭト
リス塩酸ｐｌ＋ ７ 、２．２ ＋ｗＭ ＥＤＴＡ、Ｉ
ｗ／ｖ％ＳＤＳを含有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０
グラジエンター（イスコ社、米国）により作製する。 ベックマンＳＷ４１０−ターを用い、４℃４００００ｒ
ｐｍ、１２時間の超遠心を行ったのち分画回収装置（ベ
ックマン社、米国）により各４００ ／ｌ Ｑの分画を
回収する。各分画はエタノール沈澱し、遠心後滅菌水に
溶解する。 工程５（ｍＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍＲＮＡの翻訳は、
実験８（例えば寺岡宏、五木幹男、田中兼太部、蛋白質
、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９８
１年）に依る。アフリカッメガエルは、浜松生物教材よ
り得る。工程４で得た分画ｍＲＮＡをｌμｇ／μＣにな
るように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり、５０ｎ
ｆｉずつを微量注入し、ｌ ｍ ｇ ／ ｍ Ｑのウシ
血清アルブミンを含有するパース（Ｂａｒｔｈ）溶液（
７，５ｍＭｈリスー塩酸ｐｌ＋ ７ 、６．８８吐塩化
ナトリウム、１ｍＭ塩化カリ、０．３３ｔａＭ硝酸カル
シウム、０．４１ｍＭ塩化カルシウム、０．８２ｍＭ硫
酸マグネシウム、２．４１１口Ｍ重炭酸ナトリウム、１
８０／ｍＱペニシリンＧ、■８μｇ、／ｍＱストレプト
マイシンを含有する）中で２４時間培養する。培養液の
まま卵母細胞をガラス棒でつぶし、遠心後、上清のし細
胞障害活性を測定する。沈降定数１６３ （」近におい
て、Ｌ細胞障害活性が最高値を与える。またこの活性は
参考例２工程３で得た抗ＴＮＦ抗体により消去されるが
正常マウス血γＮでは消去されない。 工程６ （形質転換体の取得） 工程４で得た分画ｎＲＮＡ ５μｇを用い、実験′＃
１（１） ９６頁以降に従って二ｍＩｎＤＮＡを調製す
る。逆転写ｒＩＰ素はライフ倶イエンス社（米国）のも
のを使用する。二重鎖ＤＮＡを３゜５％ゲル濃度のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にて分画し、長さ約１００
０〜２０００ｂｐの画分３３０口ｇを得る。この両分７
ｎｇを用い同上の実験群に従い、ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラゼ［ピーアールエル（Ｂ
ＲＬ）社、米国］を用いてデオキシＣＡＪ１をつなぎ、
同様にＰｓｔ１部位にデオキシＣ鎖をつないだプラスミ
ドｐ１３Ｒ３２２５６１１ｇとアニールせしめる。アニ
ール後の混合物を用いて大腸α１Ｋ−１２株（ＩＩ［３
１０１、ＡＴにＣ３３６９４）を形質転換し、２０００
株の形質転換体を得る。 コニ程７ （ウサギ「ＮＦの部分アミノ酸配列）参考例
２で部分精製する’「Ｎ Ｆを、工程２におけると１４
様にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製
する。一部をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、
分子量的１７０００の位置に対応するバンドをゲルから
切出し、１％重炭酸アンモニウムにより抽出する。５Ｘ
ＩＯ’単位の１’ Ｎ Ｆを使用し、蛋白として約１８
０μｇ回収すこのうち１５０μ区を１％重炭酸アンモニ
ウム７５μＣに溶解、 ＴＰＣＫ トリプシン（ワーシ
ントン・バイオケミカル社、米国）３μｇを添加し、３
７℃、４時間インキュベートする０反応液をコスモシル
５Ｃ８（牛丼化学）を担体とする高速液体クロマトグラ
フィーにより分画し、トリプシン消化断片を得る。 上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトリプシ
ン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカラムで
脱塩し、凍結乾燥する。アール。 エム、ヒユーイック（Ｒ，Ｍ、 ｌｌｅｗｉｃｋ ）ら
の方法［ジェイ、パイオル、ケム、 （Ｊ、Ｂｉｏｌ、
ＣＩ＋ｅ＋ｓ、） ２５６巻７９９０−７９９７頁、１
９８１年〕に準じて、Ｎ末端よりエドマン分解を行なう
、各ステップにおいて遊離してくるフェニルチオヒダン
トインアミノ酸は、高速液体クロマトグラフィー、モデ
ル５Ｐ８１００（スペクトラフィジックス社、米国）を
用い、ゾルパックス○ＤＳ（デュポン社、米国）をカラ
ムとして、常法により分析する。この結果、ＴＮＩ？の
Ｎ末端側からのアミノ酸配列は下記の通りである。 ５ｅｒ−＾１ａ−３ｅｒ−＾ｒｇ−Ａ １ａ−Ｌｅｕ−
５ｅｒ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−ｆ’ｒｏ−Ｌｅｕ−＾１ａ−
１１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−トリプシン消化断片のうちの１つは、そのＮ末端
より下記のアミノ酸配列をもつ。 Ｇｌｕ Ｔｂｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔ八１へ 工程８（オリゴＤＮＡプローブの合成）参考例３工程７
で得た”Ｉ’ＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮ
Ａの塩基配列に対し、相補的な、オリゴＤＮΔを合成す
る０合成方法は、伊東らが既に発表している改良リン酸
トリエステル法（エイチ、イトウ（Ｉｌ、Ｉｔｏ）ら、
ニュークレイックアシッズレス、 （Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） １０巻１７５５〜１７６９
頁、１９８２年）により行う。 アミノ酸配列から推定される１２８種類のオリゴＤＮＡ
を５グループに分け、各々１６、■６．３２．３２．３
２種類の混合物として合成する。 各々を常法に従って脱保護し、セファデックスＧ−５０
（ファルマシア社、スウェーチン）を用いるカラムグロ
マトグラフイー、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び、ＤＥ５２（ワットマン社、米国
）カラムグロマトグラフイーにより精製し、Ｏ，ｌｌ１
１Ｍトリス−ＥＤＴＡ緩１重ｉ液に対し透析する。 各々の精製オリゴＤＮＡを常法によりＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ベセスダリサーチラボラトリーズ社、米
国）およびγ−１２−アデノシントリリン酸を用いて放
射性ラベルし、ＤＥ５２カラム（ワットマン社、米国）
により精製する。各々、約３×ｌＯ°ｃｐｍ ／μｇの
放射能が導入される。 各グループの混合物の形で得られたオリゴＤＮＡプロー
ブを第１表に示すように命名する。 第１表にウサギＴＮＦのアミノ酸配列の一部とウサギＩ
−Ｎ Ｆのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮΔ塩基配
列、およびこれに基づく各グループの合成オリゴＤＮＡ
のプローブの塩基配列を示す。 参考例３工程３に従って得たＴＮＦ産生細胞のｍＲＮＡ
を１Ｍグリオキザール、５０容量％ジメチルスルホキシ
ド及び１０ ｍＭ Ｎａ１ｌ、Ｉ’Ｏ，の存在下に５０
℃６０分間処理したのち、１．１重量％アガロースゲル
電気泳動により分画する０分画後のｍＲＮＡを、ｆ！気
気泳動トランスファープロティング装置（バイオラッド
社、米国）を用いて、メーカーのマニュアルに従い、移
動せしめる９次いで、この膜上のｍＲＮＡと、５ｘＳＳ
Ｃ：及び１５０μｇ／ ｍ Ｑの変性サケ***ＤＮＡを
含む５×デンハルト溶液で６５℃、２時間処理したのち
、放射性標識したオリゴＤＮＡをＩ Ｘ １０’ｃｐｍ
／ｍＱ、 ５ Ｘ５ＳＣ溶液を含む５Ｘデンハルト溶
液で５０℃、２時間処理する。次いでこの膜を６ｘｓｓ
ｃで室温、４０℃、５０℃、６０℃で順次洗浄し、Ｘ線
フィルムＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社、米国
）に対しｎ光せしめる。この結果、ｍＲＮＡと最も強く
ハイブリダイズするオリゴＤＮＡはＭＪであって、ＭＪ
混合物中に＋ａＲＮＡと完全に相補的な配列を有するオ
リゴＤＮＡが含まれていることが判明する。 工程９（ウサギ’ｒ Ｎ Ｆ遺伝子のクローニング）参
考例３工程６で得られる形質転換体を実験口（２）１６
２頁の方法に従ってセルロースフィルター上に移し、そ
のＤＮＡと、参考例３工程８で選択される放射性標識オ
リゴＤＮＡ（ＭＪ）とを参考例３工程８と同様の条件で
ハイブリダイズせしめる（コロニー・ハイブリダイゼー
ション）０強くハイブリダイズする株４９個を選び更に
フィルター上に固定して再度コロニーハイブリダイゼー
ションを実施し、標識オリゴＤＮΔ（プローブＭＪ）に
より強くハイブリダイズする９個を選ぶ。 この９個の株から、実験書（１）の６頁の迅速プラスミ
ド分離法に従って各々約５μｇのプラスミドを取得する
。このプラスミドを制限酵素地図１、Ｔ！ＡＩ 、均翌
１、均世■（いずれも［３ＲＬ社、米国）を用い、メー
カーのマニュアルに従って切断し、１重量％アガロース
ゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長さを比較
する。 この結果、９株すべてが、約５０ｂｐのＩ’ｖｕ ＩＩ
とＲｓａ Ｉによる断片を有し、９株のほとんどがＲｓ
ａ Ｉによる約２００ｂｐの断片を有し、部分的に共通
の配列を有することが示唆される。第１図に制限酵素に
よる解析結果を図示する。 第１図に開示の内容を説明する。 即ち、発現が見られるのは、ｐＢ２−２とｐＲ１２の両
者についてであり、ｐＢ２−７．ｐＲ９゜ｐＲ１７，ｐ
Ｒ１８及・びｐＲ２５についてはいずれも発現はみられ
ない。挿入遺伝子の発現にはβ−ラクタマーゼのプロモ
ーターが使用され、そして該発現の際に生じる蛋白は、
β−ラクタマーゼとの融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｌである。ところで、挿入遺伝子が正しく発現
されるためには、β−ラクタマーゼのプロモーターの転
写方向とが、同じでなければならない。故に、転写方向
が逆であるｐＲ１７，ｐＲ１８及びｐＲ２５が発現しな
いのは当然である。また、β−ラクタマーゼのプロモー
ターの転写方向と挿入遺伝子の読みとり方向が同じでも
β−ラクタマーゼのフレームと、ｃＤＮＡのコードする
蛋白のフレームが合わないと正しく発現されない。因に
ｐＢ２−７とｐＲ９の場合は、β−ラクタマーゼのプロ
モーターの転写方向が同じであるにも拘らず発現がみら
れないことから、フレーム不一致によるものと判断され
る。尚、塩基配列からＴＮＦのコーディング領域は、第
１図のＰｖｕＩＩの上流１３５ｂｐ及び下流３３０ｂｐ
にあることがわかっている。従ってｐＢ２−２とｐＲ１
２の三者の場合は、β−ラクタマーゼのプロモーターの
転写方向が同じであり且つβ−ラクタマーゼのフレーム
と、ｃＤＮＡのコードする蛋白のフレームが合い、更に
ＴＮＦのコーディング領域を含むことから発現がみられ
るものである。また第１図に示す内容から明らかなよう
に、クローニングのために用いたＰｓｔ Ｉサイトを除
き、全てのクローンの制限酵素地図は一致しており、基
本的には全てのクローンは同じ蛋白をコードしている。 したがってＴＮＦのコーディング領域を含むものであれ
ば発現構築のためにはいずれのクローンを用いてもよく
、本例ではｐＲｔ７を発現構築のために用いている。因
に、ｐＲ１７のコーディング領域の塩基配列もｐＲ１２
およびｐＲ１８のそれと一致した。 また、このうち７株を１０μｇ ／ ｍ １２のテトラ
サイクリンを含む２ｍｊ２のＬＢ培地中で吸光度が第２
表に示す値になるまで培養し、遠心にて集めた菌体を２
ｍβの生理食塩水で超音波により破砕し、遠心上溝のし
細胞障害活性を測定すると、第２表に示す如く、Ｌ細胞
障害活性を示す。対照実験としてプラスミドｐＢＲ３２
２を含有する株を用いて同様の操作を繰返して行なう。 結果を第２表に示す。 （以下余白） 第２表 またこの活性は抗ＴＮＦ抗体により消去され、正常マウ
ス血清では消去されない、従ってこの９株すべてがＴＮ
Ｆ遺伝子を含むプラスミドを有していることが示される
。 工程１０（ウサギＴＮＦｉｌｌ伝子の塩基配列の決定） プラスミドｐ［＋２−７、およびｐＲ１８を含有する大
ａｍ株を、ＩＯμｇ／ｍＱのテトラサイクリンを含有す
るＭ９培地〔実験＃Ｊ（３）４４０頁）ＩＱ中で培養し
た後、実験書（３）９０頁の方法に従ってプラスミドを
単離し、各々約１５０μｇを得る。 各々の塩基配列をマキサム−ギルバート（Ｍａｘａ＊−
Ｇｉｌｂｅｒｔ）法〔マキサム（Ｍａｘａ＋ｍ ）も、
メソッドインエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎε
ｎｚｙ蹟ｏ１ｏｇｙ）、５５春４９０頁、１９８０年、
アカデミツクプレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ ｒ’ｒｅｓｓ
））に従って決定する。また、この塩基配列と参考例３
工程７で決定された部分アミノ酸配列の一致により、ウ
サギＴＮＦ蛋白の全溝道が解明される。 工程１１ プラスミドｐＲ１２の組換体を用いて大腸菌内でｌａｃ
をプロモーターとしてＴ’ＮＦを発現させることを目的
にプラスミドの（ａ築を行なう、第２図に示す様にＩＯ
μｇのプラスミドｐｌ？１２をｌＯユニットの±１〔ピ
ーアールエル（Ｉ３ＲＬ）社〕で３７℃で２時間ｔｌ’
ｌ化し、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６
３０ｂｐ断片を単離する。約ｌＩＬｇの断片がゲルから
電気泳動溶出する。参考例３１程８と同様の方法によっ
て第２図に示す２個デオキシオリゴヌクレオチド即ち、
５’ −ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＧＧ
ＧＣＣ−３’と５’−ＣＧＡＧ＾＾Ｇ（：ＴＧＡＣ：＾
ＴＧ−３°とを合成し、実験１Ｊ（３） ｌ ２２頁に
従って約１００μｍｏｌｅの各デオキシオリゴヌグレオ
チドの５′末端を１゛４ポリヌクレオチドキナーゼを用
いてリン酸化する０反応終了後、反応混合物をフェノー
ルを用いて抽出し、さらにクロロフォルムを用いて抽出
した後、オリゴマーを０．５μｇの約６３０塩基対の紐
■断片と合せてエタノール沈澱させる。実験古（１）
ａ ７頁に従って１０ユニツトの１’ 、 Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼで前記の断片を４℃で１夜反応させ結合する。 反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニツトの膣１１
！で３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、約６７０ｂｐの断片を電気泳動溶出
により回収する。１月収のプラスミドｐＵＧ−８（Ｐ−
Ｌバイオケミカル社、カタログ番号４９１６．米国）ｌ
μｇをＩｌａ＊ＩＩＩで消化してフェノール抽出、クロ
ロフォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したべりタ
ー０．５μｇに約６７０ｂｌ）のＴＮＦの構造遺伝子を
含む両端に１３ａｎ＋ＩＩＩサイトを持った断片を’ｌ
’ 、 ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。実験書（４
）、２０頁に従って、大腸菌を形質転換してＩ ＩＩＩ
ＭＩＰＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ）ｘ −ｇａ ｌ
を含む寒天培地で培養して約２００個の白色コロニーを
得る。これらの形質転換体１００個からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、Ｂａ＋ａｌｌ＋で消化したところ、１５個
が目的の約６７０ｂｐのＢａｍ１ｌ Ｉ断片を含んでい
る。さらに、挿入の方向を調べるために、上記１５個の
プラスミドをｐＵｃ−８上に１ケ所しか８μ部位がない
Ｅｃ。 Ｒ１とＰｖｕ ＩＩ （約６７０ｂｐの断片上に認識部
位がある）を用いて消化し、６重量％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて調べることにより、７個のプラ
スミドから目的の約１４０ｂｐの断片が確認され、ｐｕ
ｃ−ｓ上のｌａｃプロモーターから順方向であることが
判明する。 塩基配列の解析により、この７個のプラスミドは同一で
、ｌａｃプロモーター、合成りＮＡ及びｃＤＮＡ間の結
合部に所望のヌクレオチド配列を有することが確認され
る。 プラスミドｐＨ１７を用いて、大１湯菌内で１ａｃＵ
Ｖ ５をプロモーターとしてＴＮＦを直接発現させるこ
とを目的にプラスミドの構築を行なう、第３図に示す様
に１０μｇのプラスミドｐＲ１７をＩＯユニットのＭ副
Ｉ〔ピーアールエル（Ｂ ＲＬ）社Ｊで３７℃２時間消
化し、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６３
０ｂｐの断片を単離する。 約ｌμｇの断片がゲルから電気泳動溶出する。工程８と
同様の方法によって第３図の２個のデオキシオリゴヌク
レオチド川１ち、５′−八＾ＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴ
ＴＣＴ（：ＧＧＧＣ（： −３’と５°−１１；ＧＡＧ
ＡＡＧ（：ＴＧＡＣ，ＡＴＧ−３’とを合成し、実験書
（３） １２２真に従って約１１００ｐ。 ｌｅの上５己２種のデオキシオリゴヌクレオチドの５′
末端を１゛４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化する０反応終了液をフェノールを用いて抽出し、さら
にクロロフォルム抽出した後、先に得たｐ１ン１７の栖
■消化断片（約６３０ｂｐ）０．５１Ａｇと合わせてエ
タノール沈澱する。実験書（Ｉ）３７頁に従って１０ユ
ニツトのＴ、リガーゼで４℃−夜反応させ、結合せしめ
る０反応後、反応液をエタノール沈殿し、２０ユニツト
のＥｃｏＲＩで３７℃３時間消化し、４％のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により約６７０ｂｐの断片を回収
する。 プラスミドｐＯＰ９５−１５は、フラーの方法〔エフ、
フラー（１”、Ｆｕｌｌｅｒ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１９巻４２頁〜５４頁、１９８２年１に従って調製する
。 ｐＯＰ９５−１５のＩμｇをＥｃｏＲＩで消化してフェ
ノール抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈澱をし
てベクターを調製する。ベクター０．５μｇは、上記の
如く合成デオキシオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦをコー
ドするＤＮＡを結合して得られる約６７０ｂｐの断片に
、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて結合される。実験ｗ（４
）、２０頁に従って、大腸菌を形質転換してＩ ｎＭＩ
Ｉ’ＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ）ｘ −ｇ ａ ｌ
を含む寒天培地上に約１５０個の白色コロニーを得る。 これらのコロニー１００個からプラスミドＤＮＡを調製
し、ＩＥｃｏ旧で消化したところ１２個が、目的の約６
７０ｂｐのＥｃｏ旧断旧任片している。 さらに押入の方向を調べるために上記１２個のプラスミ
ドをｒ’ｖｕ ＩＩとｒ’ｓｔｌを用いて消化し、１．
５重量％アガロースゲル電気泳動を用いて調べると４個
のプラスミドから目的の約１２８０ｂｐ及び２６００ｂ
ｐの断片が確認され、１ａｃＵＶ５プロモーターから順
方向にＴＮＦ遺伝子が接続されていることが判明する。 塩基配列の解析により、この４個のプラスミドは同一で
、１ａｃＵＶ５プロモーター、合成デオキシオリゴヌク
レオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていることが
確認される。得られるプラスミドをｐＴＮＦ−１ａｃＵ
Ｖ５−１と命名する。 工程１２（大腸菌が産生ずる’ｒＮＦの精製）工程１１
で得られたプラスミドを含有する大腸菌株をアンピシリ
ンを含有するＬＢ培地に５０ｍΩ中３７℃で！夜培養し
、５Ｑ、の同上の培地に移して更に３時間培養する。イ
ソプロピルβ−ローチオガラクトピラノシド（シグマ社
米国）を終濃度ｌ−になる様に添加し更に、６時間培養
を続けたのち冷却し、遠心分離により菌株を集める。工
程１１におけると同様に菌体を０．０４Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，８） ５ Ｑ、中で超音波破砕し、菌
体蛋白溶液を得る。 この溶液は５Ｘ１０“単位／Ｑのし細胞障害活性を示す
。 この溶液を参考例２工程２と同様に精製し１゜２×１０
°単位のＴＮＦを得る。このものの比活性は６．８Ｘ１
０“単位／ｎ＋ｇである。 工程１３［メスＡザルコーマ（Ｍｅｓｈ Ａ ｓａｒｃ
ｏｍａ）担癌マウスを用いる活性ｆｆ’ｌ’価Ｊ［ＩＡ
ＬＩ３／ Ｃマウスの腹部皮肉に２ＸＩＯ＠ＭのメスＡ
ザルコーマ（Ｎｅｔ、ｂ＾ｓａｒｃｏｍａ） ｍ胞を移
植する。 ７日後、移植した腫瘍の大きさが直径７〜８１ＩＩＩＭ
となり、出血性壊死などがなく良好な直行状態にあるマ
ウスを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した０、５ｍ
Ａの参考例３工程１２で得られる゛「ＮＦ試料を注射し
、２４時間後に次の判定基準により判定を行なう。 （＝）：変化なし く１）：かすかな出血性壊死 （Ｉ）：中程度の出血性壊死（移植底表面の真中から５
０％以上にわたって壊死） （−１＋Ｌ） ：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部
が重度に壊死し、周囲の癌組織がわ ずかに残った状ｆｉ） また、試料投与後２０口目に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率を求める。 以上の方法により８１ｇ定し、大腸菌の生産するＴＮＦ
の活性を第３表に示す。 実験マウス数 第３表 工程Ｉ （プラスミドＩｌｌ目８、Ｉ）Ｂ２−７ 、
ｐ［＋２−２の大腸菌Ｋｌ ２．ＭＣ，１０６１株への
形質転換）参考例３で得られる上記３１１１のプラスミ
ドを常法に従って大腸菌Ｋｌ ２ＭＣ：１０６１株〔カ
サダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）ら、ジャーナルオブバ
クテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ Ｉ３ａｃＬ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ）、＋４３ 春、９７１頁（１９８０
年）に所載〕へ形質転換する。詳しくは大１揚菌に１２
ＭＣ１０６１株のコロニーをＬＢ培地を用いて、５５０
正の吸光度が０．３になるまで培養する。該培養物５０
ｍ８を集め、２５ｍαのＩ ＯｍＭ ＲｂＣＱ、を含む
ｌ Ｏｎ＋ＭＭＯＰｓ （ｐｌ！ ７ 、０ ）溶液で
洗浄し、次いで５０ｍＭ Ｃａ１ｌ、、１０ｍＭ Ｒｂ
ＣＡを含むＯ，ＩＭ ＭＯｒ’Ｓ （ｒ＋Ｉ＋６．５
）に再び懸濁する。 該懸濁液を３０分間氷冷し、遠心後、上清を除去し、３
０μαのＤＭＳＯおよび５０＋ｍＭ Ｇａｅｌ、とｌＯ
ｍＭＲｂｃＱを含む０． Ｉ Ｍ ＭＯＰ Ｓ （ｐｌ
＋６．５）の混合液中に懸濁させる。該懸濁液を２００
ｐＱずつ分注し、Ｉｆｆ述のプラスミドＤＮＡ溶液１０
μ悲をそれぞれに加える。 該混合液をそれぞれ３０分間氷冷した後、４４℃で６０
秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかしめ３７℃
に温めておいた５ｍＱのＩ、［３培地を加える。この溶
液を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心
し、上清を除去し、細胞ベレットを得る。該細胞ベレッ
トにＬＢ培地を加え、撹拌した後、懸濁液とする。該懸
？ｎ液を３０μｇ／ ｍ Ｑのテトラサイクリンを含む
ＬＢ寒天プレートにまき、３７℃で１夜培養を行なう、
その結果、プラスミドｐＲ１８、ｐ［３２−７とｐＨ２
−２からそれぞれテトラサイクリン耐性形質転換菌のコ
ロニが得られる。 工程２（ｐｒ＋２−７とｐＲ１８プラスミドＤＮＡの調
製） 工程ｌで得られるプラスミドｐ［＋２−７とｐＲＩ８の
形質転換体を下記の報文の方法に従って培養し、プラス
ミドを増幅させる６次いで得られる形質転換体を集菌し
、破砕したのち、プラスミドＤＮＡを精製する。〔実験
１１Ｆ（３）、８８−９６頁〕すなわち、３０μｇ／ｍ
Ｑのテトラサイクリンを含有するり、Ｂ培地に、それぞ
れの形質転換体を植菌し、激しく振とうしながら３７℃
で培養する６次いで、この工程をくりかえして形質転換
体を増殖させ、更にプラスミドを増幅させる０次に、得
られる形質転換体の培養液を４℃に冷却しながら、４０
００ｇで１０分間遠心を行ない、上清を除去する。 氷冷ＳＴＥ ［０，１Ｍ塩化ナトリウム、１０＋ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋ ７ 、８ ）と１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ ）の１００ｍＡを用いて洗浄し、続いて１０１
１Ｍトリス−塩酸縁ｔｌｊｎ （ｐＨ８，０）の中に２
０ｍｇ／ｍＱ、のりゾチームを含む水溶液を用いて細胞
を煮沸溶菌する。得られる粘性液体を超遠心チューブに
移し入れ２５，０ＯＯｒｐ＋ｍ ３０分間４℃で遠心を
行なってＤＮＡ溶液を得る。 該ＤＮＡ溶液の容量を測った後、該溶液１ｍＱ当りに、
固体の塩化セシウムＩｇを加え、塩化セシウムが完全に
溶けるまで、ゆっくりと注意深く撹拌する。該塩化セシ
ウム水溶液のＩ ＯｍＱ毎に、１０ｔｍｇ／ｍＱのエチ
ジウムブロマイド水溶ｆｉ０．８ｍＱを加える。この結
果、該溶液の最終比重は１．５５ｇ／ｍＱ、エチジウム
ブロマイドの最終濃度は約６００μｇ／ｍαとなる。 該塩化セシウム水溶液を適当な遠心チューブに移し、空
隙に軽パラフィンオイルを加え、２０℃で３６時間、４
５．ＯＯＯｒｐｍの遠心を続けると上層に鎖状の微生物
由来ＤＮＡとニックの入った環状プラスミドＤＮＡと、
下層に閉環状プラスミドＤＮＡがくる。下部のＤＮＡの
バンドをチューブの横に注射針をさしこんで採取しガラ
スチューブに移す。エチジウムブロマイドを除去し、水
層をＴΔＥ緩衝液に透析する。プラスミドＤＮＡ溶液を
Ｉ？Ｎアーゼ（ＲＮａｓｅ）処理し、等量の飽和フエノ
ルｒＥＩ液で抽出する。水層をあらかじめ０，１％ＳＤ
Ｓを含むＴＡＥ緩衝液（ｐｌ＋ ８ 、０ ）で平衡化
したバイオゲル（［ｔｉｏｇｅｌ） Ａ −１５０に付
す、ＤＮＡを洗い込み、活性画分を取得する為に０．１
％ＳＤＳを含むＴＡＥ緩挿ｉ液で溶出する６分画液をエ
タノールで沈殿させ、精製したプラスミドＤＮＡを得る
。 上記の方法により、精製ｐｎ２−７ブラスミドＤＮＡが
２５０ （ｔｇ、 ｐ１３１８プラスミドＤＮＡが１３
４μｇ得られる。 工程３ （精＊ｐ［３２−７とｐＲ１８プラスミドＤＮ
Ａのニックトランスレーション） 工程２で得られる精製プラスミドＤＮＡ４０μｇを制限
酵素ＰｓＬＩで消化分解し１次いで４％アクリルアミド
ゲル電気泳動にかける。 電気泳動後、染色を行ない目的とするバンドを切出して
Ｐｓｔｌインサートを単離する。５００ｎｇの該Ｐｓｔ
ｌインサートを用いて、ティー、マニアティス（ＴｏＭ
ａｎｉａｔｉｓ）らの方法［ブロク、ナトル。 アカド、サイ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃｉ、）、アメリカ合衆国、７２０．１１８４頁（１
９７４年）Ｊに従ってニックＩ・ランスレージョンを行
なった。 ニックトランスレーションは市販キット〔ピーアールエ
ル（Ｂ ｆｌ Ｌ）社Ｊを用いる。 ２５μＣの反応系中で放射化したｄＣＴＰを８０１’）
Ｉｌｏｌｅ用いる（４００Ｃｉ／ａ＋ ｍｏｌｅの場合
）。 まず下記混合溶液を調製する。 ２．５μα 溶液Ａ（ｄＮＴＰ溶液） ２．５μＱ 溶液Ｂ（５００ｎｇのＤＮＡ、すなわち
ＰｓＬＩインサート） ５ ｐ Ｑ 放射性ｄＣＴＰ （３２００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ ） １．３１ｔＱ ｄｃ：ＴＰ（６５ｐ清ｏｌｅ、５０ｐ
ｍｏｌｅ／μｍ２ ｄＣＴＰ） 工ＬＬ］」」−溶液Ｅ（ｔ５０） 計２２．５／ＬＡ この２２．５μΩの溶液に、２．５μμの溶液Ｃ（ＤＮ
アーゼ（ＤＮａｓｅ） Ｉ 、 ＤＮＡポリメラーゼＩ
）を加え、１５℃６０分反応させる。 次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液）を加え、停止させる。更
に、キャリアーＬＲＮＡを加えエタノル沈澱を２回行な
い、次いで５００μ℃の水に溶解する。 比活性は、９．３ Ｘ １０’ｃｐｍ／μｇＤＮＡであ
る。 工程２で得られるｔ＋’ｌ ！１ＡｐＲｌ ３を用いて
、同様に上記の方法に従ってニックトランスレーション
を行なう。比活性は７ Ｘ Ｉ Ｏ’ｃｐｍ／μｇＤＮ
Ａである。 工程４（Ｉ］ＲＩ８プラスミドＤＮＡのＲｓａ Ｉ断
片数イ（）） ８０μｇのｐＲＩ８プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｒｓａ
Ｉで消化し、４％アクリルアミドゲル電気泳動に付す
、下記の目的とするインサートのバンドを切出し［３Ｎ
Ｄカラムを用いて精製する。 約６４０ｂｐ ３．７７μｇ （回収率５２％）約
１７５ｂｐ １．７７μｇ （回収率５０％）この
約６４０ｂｐのインサートをｐＲｌＢの３′断片（ｐｒ
ｌ１８の３′側の翻訳されない部分を意味する）、約１
７５ｂｐのインサートをｐＲｌ ８−ｃｌｒ（ｐＲ１８
のコード部分）と命名する。 更に上記に於いてＲｓａ Ｉの代わりにＰｓＬＩとＭｓ
ｔ■を用いて消化して、約４５０ｂｐの断片３．６５μ
ｇ（回収率６０％）を得る。このインサートはｐｌ？１
８の５′断片と命名する。 工程５（ヒト染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）実施例１工程
３で得られる゛１Ｐラベル化プラスミドｐ１３２−フィ
ンサートをハイブリダイズ川プローブとして用い、シャ
ロン ４ＡのＥｃｏＲＩ切断サイト［ブラットナ−（Ｂ
ｌａＬｔｎｅｒ）らの方法、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ） １９６巻、１６１頁（１９７７年）Ｊにヒｌ−Ｄ
Ｎ Ａを部分消化しサイズ分画した断片（マニアテイ
ス（ＭａｎｉａＬｉｓ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、１５巻
、６８７頁（１９７８年）１を組込んで作成したバクテ
リオファージシャロン４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラ
リーの１０”コのプラークをスクリーニングする。その
方法として〔ベントン（Ｂｅｎｔ、ｏｎ）及びデイビス
（Ｄａｖｉｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９
６巻、１８０頁（１９７’７年〕〕を用いる。 出発培養液中のバクテリオファージの総てが、該生理活
性物質を作成する為に必要な遺伝子材料を含んでいると
は限らないので、ウサギＴＮＦの遺伝子に相補的な配列
を持つプローブを用いる。 目的とする遺伝子を含むファージプラークは、放射活性
を有するプローブとハイブリダイズし、その放射能活性
により見つけることができる。このようにして９つのハ
イブリダイズプラークが、該ライブラリーから得られる
。 方法と条件は次の通りである。 りプラーク数二〜１ｘｌＯ＠プラーク（〜４×ｌＯ“プ
ラーク／φ１５０ｍｍプレート×２５）２）ニトロセル
ロースフィルターへの転写：〔ベントン（１３ｅｎｔｏ
ｎ）及びデイビス（Ｄａｖｉｓ）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）、１９６巻１８０頁（１９７７年）参照） ３）ハイブリダイズ： １．２５Ｘ Ｉ Ｏｃｐｍ／ｍ
Ｅ＋の実施例１工程３で得たｐＲ２−フィンサートプロ
ーブの添加、４２℃、１９．５時間 ４）洗い：２ＸＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて室温で
１０分間洗いを４回、続いてｌＸ５ｓｃ−０，１％ＳＤ
Ｓを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ５）ｎ光：ＸＡＲ−５、−８０℃、２枚の増感紙、３９
時間 上記スクリーニングで１２の候補株が得られる。 上述と同様の方法で二次スクリーニングを行ない所望の
断片を有する９個の株を得る。これらの株を用いて上述
と同様の方法で三次スクリーニングを行ない所望の断片
を有する９個の株を得る。この９個の株について上述と
同様の方法で４次スクリーニングを行ない、９個の株が
所望の断片を含むことを確認する。所望の断片を含む９
個のバクテリオファージを、それぞれ）−Ｉ Ｇ Ｉ〜
Ｉ−Ｉ Ｇ ９と命名する。 工程６（ウサギ染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）消化ヒトＤ
ＮＡの代りに消化ウサギＤＮＡ〔マニアテイス（Ｍａｎ
ｉａＬｉｓ）ら、セル（（：ｅ Ｉ ｌ ）、ｌ ５９
６８７１’ｆ（１９７８年）］を用いて調製した１０巻
個のバクテリオファージシャロン４Ａ／ウサギ染色体遺
伝子ライブラリーのプラークを用いる以外は実施例１工
程５と実質的に同様の操作を行なう、６．７Ｘ１０’個
のバクテリオファージシャロン４Ａ／ウサギ染色体遺伝
子ライブラリーのプラークを１０“個のバクテリオファ
ージシャロン４Δ／ヒト染色体遺伝子ライブラリーのプ
ラークの代わりに用いる。 ウサギ染色体遺伝子を含む２つのバクテリオファージ（
ＲＧ−１，ＲＧ−２）が得られる。 工程７（ヒト遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程５で得られたＨ Ｇ −３、ＨＧ −６，
１−Ｉ Ｇ −７のバクテリオファージを用いて、それ
ぞれＤＮＡを次の方法に従って得る。 ６×ｌＯ°″個の大腸菌ＬＥ３９２（宿主）を１８ｍＱ
の３Ｍ中に懸濁し、そこにバクテリオファージＨＧ −
３の３×１０”ＰＦＵを加え、３℃で２０分間感染させ
る０次いで得られる混合液を３息のＮＺブロスに加え、
３７℃、２３時間撹拌培養する１次いで６０ｍＡのクロ
ロホルムを該混合液に加えて３０分間撹拌する。最終濃
度ＩＭとなるように混合液中に塩化ナトリウムを加えた
後１５分間放置する０次いで遠心操作を行なって上清を
得る０次いで得られる上清に分子量的６０００のポリエ
チレングリコールをポリエチングリコールの濃度が１０
％（Ｗ／Ｖ）になるように加えて、・１℃、２２時間放
置する０次いでバクテリオファージを遠心操作を行なっ
て採取する。得られるバクテリオファージをＳＭの２８
ｍＱに懸濁し、次いでクロロホルムを等量加える。ポル
テックスミキサーで３０秒１？ＩＪ混合した後、遠心し
て水層を集め、その全量をＳＭで３０ｍＱにする。これ
に２６．４ｇの塩化セシウムを加え、静かに溶解した後
、超遠心（４５０００ｒｐ＋＊、２０時間）でファージ
のバンドを採取する。１０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む５０ｎＭトリス緩衝液（ｐＨ
８、０）に透析した後、それぞれの最終濃度が２０１１
ＩＭ、５０μｇ／ｍＱ、０．５％となるようにＥＤＴＡ
、プロテイナーゼに、ＳＤＳ、を加え６５℃で１時間処
理する０次にフェノール、フェノール：クロロホルム＝
ｉ＝１（容積比）、クロロホルムで各１回ずつ抽出し、
得られる水層をＩ ｎ＋Ｍ Ｅ Ｄ ＴＡを含む１０吐
トリス緩衝液（ｐＨ８，０）で透析する。この溶液の紫
外線吸光度を測定すると、バクテリオファージＩＩＧ−
３の純粋なりＮＡが得られることが確認される。 バクテリオファージＨＧ −３のＤＮＡを調製するため
に用いられる方法と実質的に同じ方法を応用することに
より、バクテリオファーシトＩＧ−６とＪＩＧ−７のＤ
ＮＡを得る。 このようにしてＩＩ Ｇ −３、Ｉ（Ｇ −６、ｔｌ
Ｇ −７のＤＮＡを各々２９２０μｇ、１１００μｇ、
８１９μｇを得る０次いで（Ｓｏｕｔｌ＋ｅｒｎ）法（
イー、エム。 サザーン（ＥｏＭ、５ｏｕｔｈｅｒｎ）、チエ４９モル
、パイオル、 （Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、９８巻、
５０３頁（１９７５年）〕に従って、以下の実験条件で
これらのＤＮＡのサザンブロッテイングを行なう。 １）ＤＮＡ： ＨＧ−３８２５ｎｇ ＨＧ−６９３５ｎｇ ＨＧ−７６８５ｎｇ ２）各種制限酵素による分解： １０単位、 １０単位＋Ｅｃｏ１口 １０単位 ３時間 ｌｌｉｎｄｌ月 １１ｉｎｄ用 １’ｖｕ Ｕ ３７℃ ３）？ｌ気泳ｖＪＪ： ０．８％アガロースゲル １゛ΔＥ ｉｏ小単位 ２８Ｖ、１５．５時間 ４）ニトロセルロースフィルターへの転写：〔イー、エ
ム、サザーン（Ｅ、 Ｍ、 ５ｏｕｔｌ＋ｅｒｎ、 ）
ジエイ０モル、パイオル、（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、）９８０．５０３頁（１９７５年）参照Ｊ ５）ブレハイブリダイズ： ３０ｍＱ ＦＤＳＳ ４２℃ ６時間 ６）ハイブリダイズ： ｐｌ？Ｉ８の５′−断片（Ｉ ｘ Ｉ Ｏ’ｃｐｍ／ｍ
Ｑ、実施例１工程４にて調製したもの）を含む４２℃
、１４時間 ７）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温で１０分間洗
いを４回、続いてｌＸ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて
５０℃で３０分間洗いを２回 ８）ｔｌ光： ＸΔＲ−５（イーストマン・コダック社、米国）−８０
℃、２枚の増感紙 １４時間ハイブリダイズの結果は、第４表に示す。 第４表 （以下余白） 示す。 工程８（ウサギ遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程７において、ＨＧ−３，８Ｇ−６，１１Ｇ
−７のかわりにＲＧ−１，ＲＧ−２のバクテリオファ
ージのそれぞれを用いる以外は、実質的に同様の操作に
よってサザンプロット解析を行なう。その結果、ｐＲ１
８の５′断片はＲＧ−１およびＲＧ−２を埠ｔ＋ｉｌｌ
Ｉ 、以遠Ｒ１，黒［■、カニｄｍおよびＩｌａｍｌ
ｌ Ｉ ＩＥｃｏＲＩのそれぞれで分解して得られる断
片の、単一バンドにハイブリダイズすることがわかる。 工程９（ヒト染色体のＴＮＦｉｆｌ（ｚｉ子を含むバク
テリアクローンの構築） 工程５において得られたＨ Ｇ −３のＤＮＡを、ラン
デイ（Ｌａｎｄｙ）もの方法〔バイオケミストリー（口
１ｏｃｌ＋ｅ翔１ｓｔｒｙ）、 １３巻、 ２ ｌ ３
４頁 （１９７４年）】によって得る。このＮ Ｇ −
３のＤＮＡ３３／ＡｇをＩＥｃｏＲ＋の８０単位によっ
て３７℃で３時間分解する。分解物は１％低融点アガロ
ースゲル（条件：ＩＸＴＡＥ、２０Ｖ、１４．５時間）
にて電気泳動する。２．９ｋｂのバンドをアガロースゲ
ルより、ティー、マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
）（モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｌｏｎｉｎｇ）、コールドスプリングハーバ−ラボラ
トリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔ、ｏｒｙ）、３７７頁（１９８２年月の方
法で単離する。詳しくは。 ２．９ｋｂのバンド部位を切り出したゲルを６５℃で１
５分間加熱する。さらに、この２．９ｋｂの長さを持つ
ＩＥｃｏＲＩ分解ＨＧ −３断片（以降、これをｒＨＧ
−３／ＥｃｏＲＩ ２．９ｋｂ断片」と略することが多
い）を、溶けたゲルよりフェノールで３回、池の抽出溶
媒で３回抽出、酢酸アンモニウムを含むエタノールで沈
澱して回収する。このようにして、６３７μｇ（収率約
３０％）のｌ−Ｉ Ｇ −３／強１？１２．９ｋｂ断片
を得る。 上記断片２５５ｎｇとＥｃｏＲ１分解ｐｕｃｔａ〔ジェ
イ、メッシング（ＪｏＭｅｓｓｉｎｇ）、メソッズイン
エンザイ壬ロジー（ＭｅＬｂｏｄｓ ｉｎ ＩＥｎｚｙ
＋ｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻、２０頁（１９８３年）〕
を、２．５単位の′ｒ、リガーゼを用いて結合する。 大腸菌Ｋ１２ＪＭ８３株を上で得られる結合生成物を用
いて形質転換する。詳しくは、大腸菌に１２ ＪＭ８
３株をＬＩ３培地中で、培養ブロスの５５０ｎｍにおけ
る吸光度が０．３になるまで培養する。５０ｍＱの増殖
した大腸菌Ｋ１２ＪＭ８３株を集め、２５ｍ２の１０ｍ
ＭＭ０ＰＳ（ｐＨ７，０） −１０ｍＭ ＲｂＣ１で洗
い、２５ｍαの０、１ Ｍ ＭＯＰ ５（ｐＨ６、５）
−５０ｍＭ ＣａＣ１，−１０ｍＭ ＲｂＣ１中に懸
濁する。この懸濁液２０３μＱに、１０ｎｇの上記結合
生成物を含むｌＯμαの水溶液を加える。この混合物を
水中にて３０分間冷却し、４０℃で６０秒間加熱する。 その後すぐに、あらかじめ３７℃にしておいたＬＩ３ブ
ロス５ｍ（Ｌに、加熱した混合物を加え、３７℃で１時
間培養する。得られる培養ブロスを遠心し上清を除去す
る。遠沈した細胞にＬＢ培地を加えて、３０１ｔｇ／
ｍＱのアンピシリンと４０μｇ／ｍＱのｘ−ｇａｌを含
むＬ ［３プレートに植菌する。インサートを含むプラ
スミドが導入された大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３株のコロニ
ーは白色であるが、プラスミドのみが導入された株のコ
ロニーは青色である。得られる白色コロニーは再び、３
０μｇ／ｍαのアンピシリンと４０μｇ／ｍＱ、のｘ−
ｇａｌ を含むＬＢプレートに確認のため植菌する。 上で得られる白色コロニーより、１０個のコロニー（バ
クチリアルクローン）を選び、迅速法を用いてスクリー
ニングする。 詳しくは、それぞれのコロニーを３０μｇ／ｍＱのアン
ピシリンを含むＬＩ３培地で一晩培養する。 増殖した細胞を集め、２ ＋ｎｇ／ ｍαリゾチーム−
５０ｍＭグルコース−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２５ｍＭ
＋−リス（Ｔｒｉｓ） −１１ｃ Ｑ （ｐｌ！
８ 、０ ）を含有する溶液中に懸濁する。この懸濁液
を室温で５分間おき、これに２００ｐＱの０．２ Ｎ
Ｎａ０１１−１％ＳＤＳを加える。ゆっくり撹拌したの
ち、この懸濁液を２分間室温におく、続いて、１５０μ
αの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５、２）を加え、１０分
間−２０℃におき、１５分間遠心してその上清を得る。 この上清に９００μαの冷エタノールを加え、５分間遠
心してその沈澱を得る。得られる沈澱を７０％エタノー
ルで洗い乾燥してプラスミドＤＮＡを得る。この方法を
用いて１０個のプラスミドを得る。 それぞれのプラスミドＤＮＡを、ｌ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ
−０，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）に溶かし、
Ｅｃ。 Ｒ１で消化し、制限酵素消化のために電気泳動に供する
。消化と電気泳動の条件は以下の通りである。消化ニブ
ラスミドＤＮＡ溶液＝上で得られたものの５分の目Ｌ
３単位のＥｃｏＲＩ、３７℃、１゜５時間電気泳動：１
％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ、＋２０Ｖ、２時間 上記の制限酵素解析によって、１０種のクローンのうち
８種が目的のものであることが示される。 すなわち、この８？］１のクローンは２，９ｋｂの断片
を持っている。８種の目的のクローンのうち、１つを選
び大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株（ＡＴＣＣ
３９６５６）と命名する。なお、この大腸菌Ｋｌ ２Ｊ
Ｍ８３ （ｐＨＧＥ）株は、ブタペスト条約に基いてＡ
ＴＣＣ３９６５６の寄託番号でΔ′Ｉ″ＣＣに寄託され
ている。 続いて、ｐ［３２−７とｐＲ１８を有する大腸菌のかわ
りに大腸菌ＫＩ２のＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株を用いる
以外は工程２と同じ操作によって、１．８９ｍｇのｐ
Ｉ−Ｉ ＣＥ Ｄ Ｎ Ａを得る。 工程１０ （Ｅｃｏｌ目分解ｆｌＧ−１のサブクローニ
ング） 工程６において得られる３０μｇのＲＧ−１をＥｃｏＲ
Ｉによりｌｌ！Ｉ化する。得られる各種断片の混合物よ
り、上記各種断片の混合物と０．８％の低融点アガロー
スゲルを用いる以外は工程９と実質的に同じ操作によっ
て、約３．５ｋｂの長さを持つ断片を回収し、１．０μ
ｇのＩＥｃｏＲ１分解ＲＧ−１断片（３，５ｋｂ）を得
る。この断片とＥｃｏＲＩで消化したりＵＣｌ３を、
ＩＥｃｏｌ？ Ｉ分解１−Ｉ Ｇ −３断片（２，９ｋ
ｂ）のかわりに上記εｃａｌ？ Ｉ分解所片（３，５ｋ
ｂ）を用いる以外は工程９と実質的に同じ操作によって
、連結する。 大腸菌ＫＩ２ＪＭ８３株への形質転換、バクテリアクロ
ーンのスクリーニング、クローンＤＮＡの分解と電気泳
動は、上記結合ＤＮＡ断片を用いる以外は上記工程９と
実質的に同じ操作によって行なう、得られるクローンは
大腸菌Ｋｌ ２ｌＭ８３ （ｐＲＧＥ）株（ＡＴＣＣ３
９６５５）と命名する。なお、この大Ｊｌ＆１菌Ｋ１２
ＪＭ８３（Ｉ）ＲＧＥ）株は、ブタペスト条約に基いて
ＡＴＣＣ３９６５５の寄託番号でＡＴＣＣに寄託されて
いる。 続いて、大腸菌Ｋｌ ２ｌＭ８３（ｐＲＧＥ）株をｐＢ
２−７とｐＨ−１８のかわりに用いる以外は工程２と実
質的に同じ操作によって、ｐＲＱＥＤＮＡを１．７０ｍ
ｇ調製する。 工程＋ｆ（ｐｉ−ＩＣＥプラスミドＤＮＡの１メ１限酵
素解析） 工程９で得られるｐ ＨＧ Ｅ Ｄ ＮＡの制限酵素
解析を、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の方法〔モ
レキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｌｏ
ｎｉｎｇ）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、 ９ ８ 頁 （１９８２年
）ｊによって行なう。 その方法と条件は以下の通りである。 １ ） Ｅｃｏ１目によるｐＨＧＥＤＮΔの分解：１８
゜Ｇｌｔｇのｐ Ｉ−Ｉ ＣＥ、６４単位の［ＥＣ０Ｉ
？ Ｉ、３７℃２時間 ２）エタノール沈殿：沈殿物 ３）溶解： ＥｃｏＲＩ分解ｐ ＨＧ Ｅがｊμｇ／ｍ
ｇの溶液になるように蒸留水を加える。 ４）各種制限酵素による消化：Ｉμｇの上記ＥｃｏＲ１
分解ｐ Ｉ（Ｇ Ｅ、制限酵素：５単位のＰｖｕ ＩＩ
。 ５単位のＰｖｕｌｌ＋１０単位のＲｓａｌ、１０単位の
Ｒｓａ Ｉ、４単位のＭｓｔＩ＋、３単位Ａｖａ ＋、
９１１ｊ位のＰｓＬ［，３７℃、２時間 ５）電気泳動：２％アガロースゲル、■×゛「ΔＥ２８
Ｖ、１４．５時間 ６）ニトロセルロースフィルターへの転写：〔イ、エム
、サザーン（Ｅ、Ｍ、 ５ｏｕＴ、ｌ＋ｅｒｎ）、ジェ
イ、モル、パイオル、 （Ｊ、Ｍｏ１．ｌ３ｉｏ１．）
、９８巻、５０３頁（１９７５年）参照〕 ７）第一回プレハイブリダイズ： ３０ｍＱＦＤＳＳ、
４２℃、６時間 ８）ｆｆ！−回ハイブリダイズ：ｐＲ１８の５″断片（
工程４で得られるもの、５ＸＩＯ“ｃｐｍ／ｍ８）４２
℃、１４時間 ９）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温
で１０分間洗いを４回、続いてｌＸ５ｓＣ−０，１％Ｓ
ＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 １０） Ｄ光：ＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社
、米国）、−８０℃、２枚の増感紙、１７゜５時間 ＋１）洗い： ０ 、５ Ｍ Ｎａ０Ｉｌ −１、５Ｍ
ＮａＣ１で１分間、０．５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ） −
１、５Ｍ Ｎａ１ｌで１分間、３ＸＳＳＣで１分間 １２）露光＝露光時間を１９時間とする以外は、上記１
０）と同じ操作 １３）ｆＡＺ回プレハイブリダイズ：７）と同じ操作！
４）ｉ２回ハイブリダイズ： ｐＢ２−フィンサート（
工程３で得られるもの）、４２℃、１６゜５時間 ＋５）洗い：９）と同じ操作 １６）露光：露光時間を１９．５時間とした以外は、上
記１０）と同じ操（１’− １７）洗い二Ｉｔ）と同じ操作 １８）ｎ光＝露光時間を２０時間とした以外は、」二記
１０）と同じ操作 ＋９）ｆｆ！３回プレハイブリダイズ＝７）と同じ操作
２０）第３回ハイブリダイズ：ｐＲ１８の３″断片（工
程４で得られるもの、 ４．５ Ｘ Ｉ Ｏ”ｃｐｍ／
ｍα）、４２℃、１５時間 ２１）洗い二〇）と同じ操作 ２２） ｎ＊： １０）と同じ操作 制限酵素地図解析の結果を第４図に示す。 工程１２ （ｐＲＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素解析
） ｐ Ｉｔ Ｇ ＥプラスミドＤＮＡのかわりにｐＲＧＥ
プラスミドＤＮＡを用いる以外は工程１１と実質的に同
じ方法により工程１０で得られるｐＲＧＥプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素解析を行なう、得られるｐＲＧＩＥＤＮ
Ａインサートの制限酵素地図を第５図に示す。 工程＋３（ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦ遺伝子の塩
基配列の決定） 工程９で得られる大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ
）株と工程ｌＯで得られる大腸菌Ｋｌ ２ＪＭ８３ （
１）［’（ＧＥ）株をｐＢ２−７を有する大腸菌に１２
ＭＣ１０６１株とｐＲ１８を有する大腸菌に１２ＭＣ１
０６１株の代わりに用いる以外は前記工程２と実質的に
同じ操作を行なう、そして、それぞれ１５０μｇのｐＲ
ＧＥプラスミドＤＮＡとｐ ＨＧ ＥプラスミドＤＮＡ
を得る。 ｐＲＧＥとｐ ＨＧ Ｅの塩基配列はマクサム−ギルバ
ート（Ｍａｘａ＋ａ−Ｇｉｌｂｅｒｔ、）法〔マクサム
（Ｍａｘａ＋＊）ら、メソッズインエンザイモロジ−（
Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、５５巻
４９０頁（１９８０年）アカデミツクプレス（Ａｃａｄ
ｅ＋ｓｉｃ Ｐｒｅｓｓ）］によって決定する。 参考例３で決定したｐａｔ−１８の塩基配列と、上で決
定したｐＲＧＥの塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺
伝子の構造（エクソンとイントロンを含む）を解明する
。ｐｆｌＧＥ ＤＮＡインサートの構造は第５図に示す
。続いて、ｐＲＧＥとｐＨＧ Ｅの塩基配列を比較して
、類似性とイントロン・エクソン境界付近の相同配列を
調べる。このようにしてヒト’ｒＮＦ遺伝子の４１１￥
造（エクソンとイントロンを含む）を解明する。ヒト「
ＮＦ遺伝子の構造を第４図に示す。 このようにして得られるウサギＴＮＦとヒトＴＮＦをコ
ードする塩基配列を下に示す。この塩基配列において、
上の行はウサギＴＮＦをコードする塩基配列（Ｒ）を、
下の行はヒトｉ’ Ｎ Ｆをコードする塩基配列（■（
）を示す。 １？ＴＣＡＧＣ丁 ＴＣＴ ＧＧＧ Ｇ（：（：
ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＡ（： へ人Ｇ （：Ｃ
ＴＩｔ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴにＴ にＧＡ Ａ
にＣＣＣＧ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ＋（ＣＴ
Ａ ＧＣＣＣ７６： ＧＴＡ ＣＴＡ ＧＣＡ
ＡＡＣＧ（：Ｇ ＣＡＡ ＧＴＧＧＴＡ ＧＣ（：
Ｃ：ＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡ
（： ＣＣＴ ＣＡＡ Ｇ（：Ｔ１？ ＧＡＧ
ＧＧＣＣＡＧ ＣＴＣ（：ＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＧＣ（：ＡＧ ＣＧＴＩｔ ＧＡＧ ＧＧＧ （：
ＡＧ ＣＴＣＧＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＡＣＧＧＣ
ＣＧＧＲＧＣＧ ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ （：ＴＧ
ＣＧＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧ 八＾Ｇ ＣＴＣＩＩ
ＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴ（： にＴＧ Ｇ（：Ｃ
ＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡＧ Ｃ’ｒＧ１７ ＡＣ
Ｇ ＧＡＧ ＡＡ（： （：ＡＧ （：ＴＧ ＧＴＧ
ＧＴＧ ＣＣＧ ＧＣＣＧＡ（：Ｉｔ ＡＧＡ
ＧＡＴ ＡＡＣＧＡＧ （１：ＴＧ ＧＴＧ
ＧＴＧ （：ＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧｒｌ Ｇ
ＧＧ ＣＴＧ 丁Ａ（： ＣＴＣ： ＡＴＣＴ
ＡＣＴＩ；ＣＣＡＧ ＧＴＴ ＣＴＧＩＩ Ｇ（
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ＴＣ（： にＡＧ ＧＴＣ： （：Ｔ（：＋ｉ
’ｒＴ（： ＡＧに ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＧ
（： ’ｒＧ（： ＣＧＧ ＴＣＣ・・−ＴＡに
ＴＴＣＡＡＧ ＧＧＧ ＋１：ＡＡ ＧＧＣＴＧ
ＣＣＣＣＴＣ：ＣＡ（：Ｃ： ＣＡＴＲＧＴＧ ＣＴ
ＣＣＴＣＡＧＴ ＣＡＣＡＣＴ ＧＴＣＡＧＣにＧＣＴ
ＴＣＩＩ ＧＴＧ ＣＴＣ（：ＴＣＡＣ：ＣＧＡ
Ｃ： Ａｃｅ ＡＴ（： ＡＧＣＣＧＣＡＴ（：
１？ ＧＣＣＧＴＣＴＣ：ＣＴＡＣＣＣＧ ＡＡ（：
ＡＡＧ ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＩＩ ＧＣＣＧＴ（
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ＧＧＲＧＡＧ ＡＣＧ ＣＣ（： ＧＡＧ ＧＡＧ
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ｃｅ（：（：ＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧ
ＣＣ（：１？ ＴＧＧ ＴＡＣ： ＧＡＧ （：ＣＣ
ＡＴＣＴＡ（： ＣＴＧ ＧＧＣＧＧＣＧＴＣｌｌ
丁ＧＧ 丁＾Ｔ ＧＡＧ ＣＣ：ＣＡＴＣＴＡ
Ｔ （：ＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣＲＴＴ
ＣＣＡｃ ＴＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣ
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ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＣＧＡ ＣＴＣＡ
ＧＣＲＡ（：ＣＧＡＧ ＧＴＣ： 八ＡＣＧＡＧ
ＣＣＴ ＧＡＧ ＴＡＣ（：ＴＧ ＧＡＣＩＩ
ＧＣＴ ＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴ （：ＧＧ
ＣＣＣＧＡ（： ＴＡＴ ＣＴ（： ＧＡに
Ｒ（１：ＴＴ Ｇ（：（１： ＧＡＧ ＴＣＣＧ
ＧＧ ＣＡＧ ＧＴ（： ＴＡ（： ＴＴＴ
ＧＧＧＩＩ ＴＴＴ Ｇｅｅ ＧＡＧ ＴＣＴ Ｇ
ＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡ（： ＴＴＴ ＧＧＧ１？
ＡＴ（： ＡＴＴ ＧにＣＣＴＧＩＩ ＡＴＣＡＴ
Ｔ ＧＣ：ＣＣＴＣ注）記号゛・・・パは、ウサギＴＮ
ＦをコードするＤＮＡの塩基配列中にこの部分は存在し
ないことを意味し、従ってこの記号の両端に隣接する２
つのコドンは直接つながっている。 工程＋４（オリゴデオキシヌクレオチドの合成）コハク
酸残基を介して２．０μＭのデオキシヌクレオシドが結
合しているボリスヂレン樹脂２０すを、上下にステンレ
ススチール製のフィルターのついた５００μμ容量の反
応容器に装填する。 樹脂は１Ｍ臭化亜鉛ジクロルメタン−イソプロパツール
溶液（８５：１５）で処理してジメトキシトリチル（Ｄ
ＭＴ）保護基を除き、ジクロルメタン−イソプロパツー
ル（８５：１５）、次いでジメチルフォルムアミド、ピ
リジン、更にアセトニトリルで洗浄し、窒素気流で乾燥
する。次いでＤＭＴ−ヌクレオチド（２０７ｚＭ）およ
び、メシチレンスルフォニルニトロトリアゾール（６０
μＭ）の乾燥ピリジン溶液２００μＣを加える６４５℃
で２０分間反応せしめた後、反応液を除去し、乾燥ピリ
ジンで樹脂を洗浄後、ピリジン中の無水酢酸で未反応の
残基を保護する。この、脱保護及び縮合のサイクルを繰
り返して、所望のオリゴデオキシヌクレオチドが樹脂上
に合成される０次に樹脂をとり出し、オリゴヌクレオチ
ドを樹脂から分離して、精製を行う、上記のオリゴデオ
キシヌクレオチドの合成および精製は伊東ら［Ｎｕｃ、
Ａｃ、 Ｒｅｓ、 Ｉ ０巻、１７５５頁（１９８２）
］の方法に従って実施する。このようにして下記の如き
オリゴデオキシヌクレオチドが得られる。 ■ ）５゛−へ＾丁ＴＣＡＴＧＴＣＡＴ（：ＴＴＣＴＣ
ＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＴＧＡ（１：ＡＡ−３’２ ）
３ ’ −ＧＴＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧ
ＧＣＴ（：ＡＣＴＧＴＴＣＧＧ−５’３ ） ５ ’
−ＧＣＣＴＧＴＡＧＣ（１：ＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧ（：
＾＾ＡＧＣＣ：ＴＣＡＡＧＣ−３’４ ）３ ’ −Ａ
Ｃ：ＡＴＣＧＧＧＴＡ（：ＡＡ（：ＡＴＣＧＴＴ丁ＧＧ
ＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴ−５’工程１５（ヒト’ｒ Ｎ
Ｆのミニ遺伝子を含むＭｌ３ ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ
の調製） プラスミドｐｔｌＧＥ （Ｉ Ｏμｇ） をＩＥｃｏＲ
ｌ（２０単位）で消化し、１％の低融点アガロースゲル
電気泳動の後、２．９ｋＬ１のフラグメントを切出し溶
出する。このフラグメントはＭ１３ｍｐ９ファージの複
製型のα冴Ｒ■フラグメント中へ挿入する。 ＥｃｏＲｌフラグメントを押入されたＩ） Ｎ ＡはＢ
ＲＬ社の手引書〔ユーザーマニュアル（Ｕｓｅｒ Ｍａ
ｎｕａｌ）／ＭＩ３ｍｐ７クローニング（Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ） ／ ’デイデオキシ（Ｄｉｄｅｏｘｙ） ’シー
ケンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ）、１９８０年］
に従い、大腸菌ＪＭ１０３（−ニーイングランドバイオ
ラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ １３ｉｏ１ａｂｓ）
、ＮＥＷ ＩＥＮＧＬＡＮＤ １３ｉｏ１ａｂｓ ＣＡ
ＴＡＬＯＧ ＋９８１−１９８２所載〕を形質転換する
。生成物をＭ１３ｍｐ９−ＨＧＥと命名する。 工程＋６ （Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＥ ｍ鎖ＤＮＡとプ
リーターＥ３−４を用いるイントロン３の除去） Ｍｌ ３ｍｐ９−ＨＧＥ−ｍ鎖ＤＮＡはＢＲＬ社の手引
書〔ユーザーマニュアル（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ）
７Ｍ ｌ ３ ｍ ｐ ７クローニング（Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ） ／’デイデオキシ（Ｄｉｄｅｏｘｙ） ’シーケ
ンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、１９８０年］に従
って調製される。 工程１４で調製されたオリゴデオキシヌクレオ−Ｆ−ト
４ ） ３ ’ −ＡＣＡＴＣＧＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴ
ＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴ５′がイントロン
３のプリーターとして用いられる。イントロン３のプリ
ーターは” Ｅ ３−４ ”と命名する。 プリーターＥ３−４は、除去されるべきイントロン３の
０１ｊ方（即ちエクソン３）、及び後方（即ちエクソン
４）に対し相補的な配列を有している。 イントロン３の除去はウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら
の方法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２０９巻１３
９６頁（１９８０年））に従い、次の如く行う。 Ｅ３−４ （１６４ｎｇ１１５ｐ＊ｏｌｅ）は、Ｔ、キ
ナーゼおよびＡ ＴＰ （３ｍＭ）を用いてリン酸化さ
れ、鋳型Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＥ （１，６５／ｊｇ。 ０ 、５ ｐｍｏｌｅ）に加えられる０反応混合物は６
５℃に加熱し、５分間室温に冷却し、更に氷水中で冷却
する。各０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣ：ＴＰ％ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰおよびＡＴＰ溶液に対し、クレノーフラグメ
ント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ） ５単位、Ｔ
ＩリガーゼｌＯ単位を含むヒン（Ｈｉｎ）緩衝液〔ウオ
ーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、ヌク、アク、レス。 （Ｎｕｃ、＾ｃ、 Ｒｅｓ、 ）、９巻３６４７頁（１
９８１年月、即ち１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，２）
、 ２ｍＭ塩化マグネシウム及びＩｍＭβ−メルカプ
トエタノールを含む液、を加える０反応混合物（ｆｆｉ
終容ｆｉｔ ５０ Ｉｔ Ｑ ）は４℃で３０分間及び
室温で３０分間、インキュベートする。オリゴヌクレオ
チドをブライマーとして二ｍｔｔ＜合成されたＤＮＡは
ピーアールエル（Ｂ ＲＬ）社の手引書〔ユーザーマニ
ュアル（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ）／ Ｍ ｌ ３ ｍ
ｐ ７クローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ） ／’デイデ
オキシ（Ｄｉｄｅｏｘｙ） ’シーケンシング（Ｓｅｑ
ｕｅｎｃ ｉｎｇ）、１９８０年〕に従って、大腸菌Ｊ
ＭＩ０３株に感染せしめる。このようにして得られるプ
ラークは、ＹＴブレー１・〔ジェイ、エイチ、ミラー（
Ｊ、Ｉｌ、Ｍｉｌｌｅｒ）、エクスペリメンツィンモレ
キュラージェネティックス（Ｅｘｐｅｒｉ＋＊ｅｐｔｓ
ｘｎ Ｍｏ１ｅｃｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１
９７２年）４３３頁〕に移す。得られるコロニーは、°
”Ｐで標識されたＥ３−４と５５℃２時間の条件でハイ
ブリダイズされる。イントロン除去工程の結果書られる
各種生成物の内から、所望の配列を有するＤＮＡを得る
ためのプローブとして、ここでは、プリーターＥ３−４
それ自身を利用する。かくしてプリーターＥ３−４とハ
イブリダイズするコロニーを得、更にファージを取得す
る。 得られるファージをプレートにまき、得られるプラーク
をＹＴプレートに移す、ここで再び°゛Ｐで放射ラベル
したＥ３−４と５５℃２時間の条件でハイブリダイズせ
しめる０強くハイブリダイズするクローンから、ファー
ジＤＮＡを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が
完全に除去されているファージを選別する。このような
ファージの１つをｍ ｐ ９− ＨＧ ＥΔ３−１と命
名する。 工程１７ （ｐＨＴＮＦ−ＱａｃｌＪＶ５−２の構築） ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ△３−１の複製型をＥｃｏＲｌ
で消化し、電気泳動により単離する。この断片をＥｃｏ
Ｒｌで切断したｐＢＲ３２７に押入し、プラスミドｐ
ＨＧ ＩＥへ３−１を得る。 次にプラスミドｐＨＧＥ△３−１を用い、ＱａｃＵＶ５
をプロモーターとして］’ Ｎ Ｆを大腸菌中で、直接
発現させることのできるプラスミドを（１Ｘ！築する。 この構渠方法は第７図に示される。 まず１１０１ｚのプラスミドｐ ｌ−Ｉ ＣＥへ３−１
をｌＯ弔位の＾ｖａｌとＥｃｏｒｌ Ｉ （Ｂ ＲＬ
社、米国）で３７℃２時間消化し、４ｆｆｉｆｆｉ％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により目的フラグメント
を単離する。約１μｇの断片が電気泳動溶出によりゲル
から回収される。工程１４と同じように第７図に示され
る２種のオリゴデオキシヌクレオチド即ち５゛−＾＾Ｔ
ＴＣ＾ＴＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＣ：ＧＡＡＣＣニー ３
’及び５’−ＴＧＧＧＧＧＴ丁ＣＧＡＧ＾＾ＧＡＴＧ
ＡＣＡＴＧ−３’ を合成する。次いで文献（３）
ｌ ２２真の方法に従いこの２本のオリゴヌクレオチド
（約１００ｐｍｏｌｅ）の５゛端をＴ、ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いてリン酸化する。 反応後、フェノールで次いでクロロホルムで抽出する。 かくして得られる合成オリゴマーと、上記で得られるｐ
ＨＧ ＥΔ３−１の＾ｖａ Ｉ −ＥｃｏＲＩ断片０
．５μｇとを混合し、エタノール沈澱した後、文献（１
）３７頁の方法に従ってｌＯ小単位′「、リガーゼを用
い４℃−夜で結合せしめる０反応終了後、混合物はエタ
ノール沈澱し、４重量％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により目的断片を単離する。 プラスミドｐＯＰ９５−１５はエフ、フラー（Ｆ。 Ｆｕｌｌｏｒ）の方法［ジーン（Ｇｅｎｅ） Ｉ ９０
．４．２−５４頁（１９８２年）ｊにより調製する。 ｐＯＰ９５−１５のｔ／ＡｇをＥｃｏＲＩでン肖化して
フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を
して調製したベクター０．５μｇと、上記の如く＃ｉ）
だ断片を、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。実験
１Ｆ（４）、２０頁に従って、得られるベクターで大腸
菌ＪＭＩＯＩ株（ＡＴＣ：Ｃ３３８７６）を形質転換し
て１ｍＭ ＩＰＴＯ及び０゜００４％（ｗ／ｖ） ｘ
−ｇａｌを含む寒天培地上に約１００個の白色コロニー
を得る。 これらの′形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
ＥｃｏＲＩで消化し、目的の以遠１０断片を有するプラ
スミドを同定する。更にＤＮＡの挿入の方向を調べるた
めにこれらのプラスミドをＰｖｕ Ｕと１’ｓｔｌ消化
して１．５重量％アガロースゲル電気泳動を行った結果
約１２８０ｂｐ及び約２６００ｂｐの断片を有し、１ａ
ｃＵＶ５プロモーターの下流に正しく Ｔ Ｎ Ｆをコ
ードするＤＮＡが接続されているプラスミドを選別する
。 塩基配列を決定すると、２コのプラスミドは同じ塩基配
列を有し、合成オリゴヌクレオチド及び染色体由来のＤ
ＮＡが正しく接続されていることが示される。１１）ら
れるプラスミドをｐＨＴＮＦ−ＩａｃＵＶ５−２と命名
する。 ｐＮＴＮＦ−１ａｃｔＪＶ５−２を含有する大＋１９菌
を、通常の栄４Ａ培地で培養する。生成物のＴＮＴ”活
性を測定すると、ｌａｃプロモーターによって制御され
るウサギｒＮＦ遺伝子を有するｐＴＮＦｌａｃＬＪＶ５
−１を含有する大腸菌の生産物とほとんど同様の活性を
示す。 実施例２ 実施例１における工程１から１４に従ってＦＪ１１！さ
れるプラスミドｐ ＩＩＣＥとオリゴヌクレオチド１）
−４）を用いて、ｐ Ｈ”Ｉ’ Ｎ Ｆ−１ａｃＵ Ｖ
５−１を調製する。その調製方法を第６図に示す。 本発明の一部を１１り成する新規な微生物および培養細
胞はヒトＴ Ｎ Ｆを産生する能ツノがあるために重要
であり新規であることが理解されよう、従って、以」二
の記載に従って調製される形質転換微生物および培養細
胞に加えて、本発明は更に、′ｒＮＦ産生において強い
活性を示すようなそれらの変異株や突然変異体をも包含
するものである。 微生物及び新規プラスミドは、該プラスミドを含有する
微生物の試料を寄託することにより、アメリカ合衆国、
メリーランド、ロックビル（ＲＯｃｋ−ｖｉｌｌｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ、 Ｕ、Ｓ、Ａ）のアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ口Ｔｙ
ｐｅＣｕｌＬｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に１９８
４年４月６日付で寄託されている。微生物大腸菌に一１
２ＪＭ８３（ｐＲＧＥ）株にはＡＴＣＣ寄託番号第３９
６５５号が、大腸菌に−１２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株
にはＡＴＣＣ寄託番号第３９６５６号が与えられている
。 以上本発明について述べたように、本発明は様々な方法
で達成することができる。そのような変化は本発明の精
神と範囲からはずれるものと見なすべきではなく、当業
者にとって明らかであるそのような全ての変化は本願の
特許Ｒ／ｊ求の範囲に含まれるものである。
第１図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを各々含有するプラスミドインサートの制限酵
素地図である。第２図は従来のウサギ生理活性ポリペプ
チドをコードする組換ＤＮＡ（ｐｉ’ＮＦ−１ａｃ −
１）の調製方法を示すフローシートである。ｍ３図は従
来のウサギ生理活性ポリペプチドをコードするもう一つ
の組換ＤＮＡ（ｐ−Ｉ”ＮＦ−１ａｃ ＵＶ５−１）の
調製方法を示すフローシートである０ｍ４図は本発明の
ヒト生理活性ポリペプチドの遺伝子を含有するプラスミ
ドの一部分の制限酵素地図である。第５図は従来のウサ
ギ生理活性ポリペプチドの遺伝子を含有するプラスミド
の一部分の制限酵素地図である。第６Ｕ；！Ｊは本発明
のヒト生理活性ポリペプチドをコードする組換ＤＮＡ
（ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−１）の調製方法を示すフ
ローシートである。第７図は本発明のヒト生理活ポリペ
プチドをコードするもう一つの組ｔＡＤＮＡ （ｐＨＴ
ＮＦ−１ａｃＵＶ５−２）の調製方法を示すフローシー
トである。 特許出願人 旭化成工業株式会社
るＤＮＡを各々含有するプラスミドインサートの制限酵
素地図である。第２図は従来のウサギ生理活性ポリペプ
チドをコードする組換ＤＮＡ（ｐｉ’ＮＦ−１ａｃ −
１）の調製方法を示すフローシートである。ｍ３図は従
来のウサギ生理活性ポリペプチドをコードするもう一つ
の組換ＤＮＡ（ｐ−Ｉ”ＮＦ−１ａｃ ＵＶ５−１）の
調製方法を示すフローシートである０ｍ４図は本発明の
ヒト生理活性ポリペプチドの遺伝子を含有するプラスミ
ドの一部分の制限酵素地図である。第５図は従来のウサ
ギ生理活性ポリペプチドの遺伝子を含有するプラスミド
の一部分の制限酵素地図である。第６Ｕ；！Ｊは本発明
のヒト生理活性ポリペプチドをコードする組換ＤＮＡ
（ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−１）の調製方法を示すフ
ローシートである。第７図は本発明のヒト生理活ポリペ
プチドをコードするもう一つの組ｔＡＤＮＡ （ｐＨＴ
ＮＦ−１ａｃＵＶ５−２）の調製方法を示すフローシー
トである。 特許出願人 旭化成工業株式会社
Claims (6)
- （１）次式（ I ） 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｇｌｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシン残
基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｇｌｕ
はグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、Ａｓｎは
アスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｈｅはフ
ェニルアラニン残基、Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈｉｓは
ヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒはスレオ
ニン残基、Ｉｌｅはイソロイシン残基、Ｔｒｐはトリプ
トファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍｅｔはメチ
オニン残基及びＣｙｓはシステイン残基を表わす） で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性ポリペ
プチドをコードするデオキシリボ核酸。 - （２）次式（II）で表される塩基配列 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及びＴはチ
ミジル酸残基を表わし、式（II）の左端および右端はそ
れぞれ５’−水酸基側および３’−水酸基側を表わす） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有する、又は遺伝
子のコードの縮重に基き、該デオキシリボ核酸の少なく
とも１つの塩基配列の少なくとも１つの塩基を置換して
得られる塩基配列を含有する特許請求の範囲第１項記載
のデオキシリボ核酸。 - （３）次式（ I ） 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｇｌｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシン残
基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｇｌｕ
はグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、Ａｓｎは
アスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｈｅはフ
ェニルアラニン残基、Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈｉｓは
ヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒはスレオ
ニン残基、Ｉｌｅはイソロイシン残基、Ｔｒｐはトリプ
トファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍｅｔはメチ
オニン残基及びＣｙｓはシステイン残基を表わす） で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性ポリペ
プチドをコードするデオキシリボ核酸と複製可能な発現
ベクターとを含有する複製可能な組換ＤＮＡ。 - （４）次式（II）で表される塩基配列 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及びＴはチ
ミジル酸残基を表わし、式（II）の左端および右端はそ
れぞれ５’−水酸基側および３’−水酸基側を表わす） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有する、又は遺伝
子のコードの縮重に基き、該デオキシリボ核酸の少なく
とも１つの塩基を置換して得られる塩基配列を含有する
デオキシリボ核酸と複製可能な発現ベクターとを含有す
る特許請求の範囲第３項記載の複製可能な組換ＤＮＡ。 - （５）次式（ I ） 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｇｌｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシン残
基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｇｌｕ
はグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、Ａｓｎは
アスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｈｅはフ
ェニルアラニン残基、Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈｉｓは
ヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒはスレオ
ニン残基、Ｉｌｅはイソロイシン残基、Ｔｒｐはトリプ
トファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍｅｔはメチ
オニン残基及びＣｙｓはシステイン残基を表わす） で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性ポリペ
プチドをコードする塩基配列および該塩基配列に相補的
な塩基配列からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩
基配列を含有する、又は遺伝子のコードの縮重に基き、
該デオキシリボ核酸の少なくとも１つの塩基を置換して
得られる塩基配列を含有するデオキシリボ核酸と複製可
能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換ＤＮＡで
形質転換された微生物。 - （６）前記式（ I ）で表されるアミノ酸配列を含有す
るヒト生理活性ポリペプチドをコードする塩基配列が下
記の式（II）で表されるものである特許請求の範囲第５
項に記載の微生物または細胞。 式（II） 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及びＴはチ
ミジル酸残基を表わし、式（II）の左端および右端はそ
れぞれ５’−水酸基側および３’−水酸基側を表わす）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16406089A JPH0242986A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16406089A JPH0242986A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60071283A Division JPS60252496A (ja) | 1984-04-06 | 1985-04-05 | 新規なヒト生理活性ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242986A true JPH0242986A (ja) | 1990-02-13 |
Family
ID=15786021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16406089A Pending JPH0242986A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0242986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04146374A (ja) * | 1990-10-05 | 1992-05-20 | Kajima Corp | 駐車場付き建物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60185799A (ja) * | 1984-03-06 | 1985-09-21 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
-
1989
- 1989-06-28 JP JP16406089A patent/JPH0242986A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60185799A (ja) * | 1984-03-06 | 1985-09-21 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04146374A (ja) * | 1990-10-05 | 1992-05-20 | Kajima Corp | 駐車場付き建物 |
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