DE3586316T2 - Beschirmendes peptidantigen uebereinstimmend mit plasmodium-falciparum-circumsporozoitprotein. - Google Patents
Beschirmendes peptidantigen uebereinstimmend mit plasmodium-falciparum-circumsporozoitprotein.Info
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Description
- Die Regierung hat Rechte an dieser Erfindung, basierend auf Forschungsmitteln in der Form der Subvention Nr. 5RO1-AI-17429-03 von dem Department of Health and Human Services und Subvention Nr. AID-DPE-0453-C-00-2002-00 von dem Department of State, Agency for International Development.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Antigen, das geeignet ist, schützende Immunität gegen Malaria, z.B. durch Einbringen in einen Impfstoff, bereitzustellen. Ein beträchtliches Gesundheitsproblem großer Bereiche der Welt, Malaria, betrifft mehr als 150 Millionen Menschen in jedem Jahr. Von den vier Plasmodiumarten, die Malaria in Menschen hervorrufen, ist Plasmodium falciparum für die meisten der schweren Infektionen und die höchste Sterblichkeitsrate verantwortlich. Die Bekämpfung von durch P.falciparum verursachter Malariaverseuchung ist schwieriger geworden aufgrund der Ausbreitung medikamentenresistenter Organismen in vielen Regionen. Das Auftreten schwerer epidemischer Ausbrüche dieser Krankheit verleiht jüngsten Bemühungen, einen Malariaimpfstoff zu entwickeln, besondere Dringlichkeit.
- Unter normalen Bedingungen wird eine Malariainfektion eingeleitet durch das Einbringen von Sporozoiten in den Blutstrom des Wirts durch den Biß infizierter Moskitos. Somit könnte die Inaktivierung dieser Sporozoiten durch das Immunsystem des Wirts vollständig die Entwicklung der Infektion blockieren. Einige jüngere Befunde deuten auf die Durchführbarkeit der Entwicklung eines Anti-Sporozoiten- Impfstoffs. Sporozoiten sind stark immunogen und sind in der Lage, eine schützende Immunantwort in mehreren Wirtsarten, einschließlich Mensch, hervorzurufen: siehe z.B. Cochrane, A.H. et al. Malaria, Band 3, J.D. Kreier, Hrg. (Academic Press, New York 1980), S. 163 bis 202. Die Immunogenität von Sporozoiten beruht im wesentlichen, falls nicht ausschließlich, in einem einzigen Antigen, dem Circumsporozoiten (CS)-Protein (ausführlich beschrieben von F. Zavala, A.H. Cochrane, E.H. Nardin, R.S. Nussenzweig, V. Nussenzweig, J. Exp. Med. 157: 1947 (1983)), das die gesamte Parasitenoberfläche abdeckt, wie berichtet von M. Aikawa, N. Yoshida, R.S. Nussenzweig und V. Nussenzweig in Journal of Immunology, 126: 2494 (1981). Schließlich ist die Immunogenität des CS-Proteins fast ausschließlich auf ein einziges Epitop beschränkt, das identisch oder quasiidentisch mehrere Male hintereinander wiederholt ist: G.N. Godson, et al. Nature 305: 29 (1083); V. Enea et al., zur Veröffentlichung akzeptiert Proc. Nat'l. Acad. Sci. (1984).
- Identifizierung der Aminosäuresequenz von CS-Epitopen von allen Plasmodiumarten, die Menschen infizieren, ist eine Voraussetzung für die Entwicklung eines menschlichen, synthetischen Sporozoitenimpfstoffs.
- Mehrere monoklonale Antikörper gegen das CS-Protein von Plasmodium falciparum-Sporozoiten sind erzeugt worden. Diese Antikörper inaktivieren die Parasiten. Verfahren zum Herstellen solcher Antikörper sind dem Fachmann bekannt und sind offenbart worden von Nardin E. et al. in J. Exp. Med. 156: 20 (1982) und in US-SN 234 096 von Nussenzweig et al., eingereicht 12. Februar 1981, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingebaut wird.
- (Die Offenbarung dieser Anmeldung baut ebenfalls durch Bezugnahme die gesamte Offenbarung des Abtretungsempfängers mitanhängiger US-SN 574 553 (eingereicht am 27. Januar 1984) von Nussenzweig et al., mit dem Titel Schützendes Peptidantigen, ein).
- Diese monoklonalen Antikörper gegen CS-Protein binden an ein wiederholtes Epitop, das verschiedenen Isolaten der Parasiten, die von verschiedenen geographischen Regionen erhalten wurden, gemein ist. Solche Antikörper können verwendet werden, um Klone abzusuchen, die Peptide mit der Aminosäuresequenz der CS-repetitiven Epitope oder diese eingebaut haben, exprimieren.
- Von Antikörpern gegen die Sporozoiten-Antigene ist gezeigt worden, daß sie schützende Immunität gegen die Plasmodienart, von der sie erhalten wurden, in Nagern, Affen und menschlichen Freiwilligen bereitstellen. Das schützende Sporozoiten-Antigen wird hierin CS-Protein genannt oder Circumsporozoitenprotein oder Sporozoiten-CS- Protein, wobei diese Ausdrücke als äquivalent gelten und austauschbar verwendet werden. Des Abtretungsempfängers mitanhängige US-SN 234 096 von Nussenzweig, eingereicht am 12.Februar 1981, offenbart einen Impfstoff, basierend auf gereinigtem CS-Protein. Des Abtretungsempfängers mitanhängige Anmeldung SN 574 553 offenbart ein Peptid, umfassend ein Epitop eines Sporozoiten-CS-Proteins.
- Die hierin offenbarten Ergebnisse basieren teilweise auf Techniken und Konzepten auf dem Gebiet der Immunologie. Zur Zweckmäßigkeit werden auf dem Gebiet üblicherweise verwendete Ausdrücke hierin definiert. Der Ausdruck "immunchemische Reaktion" wird verwendet, um die spezifische Wechselwirkung zu bezeichnen, die zwischen einem Antigen und seinem korrespondierenden Antikörper erfolgt, unabhängig von der Meßmethode. Eine solche Reaktion ist charakterisiert durch eine nicht kovalente Bindung eines oder mehrerer Antikörpermoleküle an ein oder mehrere Antigenmoleküle. Die immunchemische Reaktion kann durch eine große Vielzahl bekannter Immunoassays nachgewiesen werden. Die Ausdrücke "immunogen", oder "antigen" werden hierin verwendet, um die Fähigkeit einer gegebenen Substanz, die Erzeugung von Antikörpern zu stimulieren, die spezifisch immunreaktionsfähig mit einer Substanz sind, wenn diese Substanz einem geeigneten Testtier unter Bedingungen verabreicht wird, die bekanntermaßen die Antikörperproduktion hervorrufen, zu beschreiben. Der Ausdruck "schützendes Antigen" bezieht sich auf die Fähigkeit eines gegebenen Immunogens, einem geeigneten Wirt Resistenz gegen ein gegebenes Pathogen zu verleihen. Der Ausdruck "Epitop" bezieht sich auf eine spezielle antikörperbindende Stelle auf einem Antigen. Makromolekulare Antigene, wie Proteine, haben typischerweise mehrere Epitope mit unterschiedlichen Antikörperbindungsspezifitäten. Verschiedene Epitope des gleichen Antigens sind mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern unterscheidbar, die aufgrund ihres hohen Grades an Spezifität gegen ein einziges Epitop gerichtet sind. Zwei verschiedene monoklonale Antikörper, die gegen verschiedene Epitope auf dem gleichen Antigen gerichtet sind, können das Antigen ohne gegenseitige Beeinflussung binden, sofern die Epitope nicht so nahe beieinander sind, daß die Bindung eines Antikörpers die Bindung des anderen sterisch hindert. Der Ausdruck "immundominante Region" bezeichnet einen Bereich des Antigenmoleküls, der im wesentlichen verantwortlich für dessen Antigenität ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft den Befund, daß die schützenden CS-Sporozoiten-Antigene von P.falciparum eine immundominante Region besitzen, die sich aus vier Amminosäuren (Prolin-Asparagin-Alanin-Asparagin), die mindestens 23x hintereinander wiederholt sind, zusammensetzt. Das Repeat umfaßt auf der Nucleotidebene 8 Varianten. Beide Asparagincodons, drei der vier Prolincodons und zwei der vier Alanincodons werden verwendet. Von dieser wiederholten Sequenz ist gezeigt worden, daß sie das Epitop des CS-Proteins von Plasmodium falciparum enthält. Analoga der wiederholten Peptide sind chemisch synthetisiert worden und von ihnen wurde gezeigt, daß sie immunchemisch reaktionsfähig mit polyklonalen Antikörperpräparationen gegen Plasmodium falciparum sind. Weiterhin reagieren monoklonale Antikörper gegen CS-Proteine, die die Infektiosität von Sporozoiten in vitro neutralisieren, auch mit dem synthetischen Peptid. Impfstoffe, die mit dreifach und sechsfach hintereinander wiederholten Repeats der Vier-Aminosäuren-Sequenz (12-MER- und 24-MER-Peptide) hergestellt wurden, verleihen gegenüber P.falciparum Sporozoiten Immunität. Somit besitzen diese synthetischen Peptide schützende, antigene Eigenschaften des P.falciparum CS-Proteins.
- In der folgenden Beschreibung waren die verwendeten Materialien gewerblich erhältlich, sofern nicht anders angegeben. Die in den Klonierungsverfahren verwendeten Enzyme wurden von gewerblichen Quellen bezogen. Reaktionen mit Restriktionsendonucleasen wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, waren die Reaktionsbedingungen für andere Enzymreaktionen übliche Standardbedingungen, wie beispielsweise beschrieben in Methods in Enzymology (Band 68, R.Wu, Hrsg.) Academic Press, (1980). Sofern nicht anders angegeben, sind die hierin verwendeten Abkürzungen zur Publikation in wissenschaftlichen Journalen akzeptierbare Standardabkürzungen, die üblicherweise von einem Fachmann zur Veröffentlichung seiner Ergebnisse, wie der hierin zitierten, verwendet werden.
- Monoklonale Antikörper gegen P.falciparum Sporozoiten wurden aus Mäuseascites isoliert, in den Hybridome injiziert wurden, die hergestellt wurden durch Fusionieren der Milzzellen von mit P.falciparum Sporozoiten hyperimmunisierten Mäusen mit NS1 Myelomzellen, wie beschrieben in Nardin, E.H., et al J. Exp. Med. 156:20-30 (1982). Der zur Identifizierung des Klons, der das erfindungsgemäße schützende Peptidantigen exprimiert, verwendete Antikörper wurde gemäß dem Verfahren von Nardin, et al., siehe oben, hergestellt und als "2A10" bezeichnet.
- Als allgemeiner Umriß werden die Experimente und die aus den Ergebnissen folgenden Schlüsse ausgeführt. Das erfindungsgemäße synthetische Peptid wurde definiert und anfänglich gesichert durch Klonieren einer cDNA, hergestellt aus einer von infizierten Moskitos erhaltenen mRNA. Eine cDNA-Bank wurde aus von Plasmodium falciparum infizierten Moskitos stammender Poly (A)&spplus; RNA konstruiert. Doppelsträngige cDNA wurde in die PstI-Stelle des Plasmids pBR322 unter Verwendung des Verfahrens des dC-dG-Tailings eingefügt, um rekombinante Plasmide zu erzeugen, die die Inserts als ein Fusionsprotein mit der durch den Vektor codierten beta-Lactamase exprimieren konnten. Bakterielle Wirtszellen (LE 392, abgeleitet von E. coli K-12) wurden transformiert, und die erhaltenen Tetracyclin-resistenten DNA-Moleküle wurden nach der Expression von CS-Antigen unter Verwendung eines in situ-Filterimmunoassays abgesucht.
- Ungefähr 10 000 Kolonien wurden in einem in situ-Radioimmunoassay mit dem monoklonalen Anti-Sporozoiten-Antikörper (2A10) abgesucht, und ein stark positiver Klon, als p277-19 bezeichnet, wurde identifiziert.
- Extrakte des das Plasmid p277-19 tragenden Wirtsbakteriums LE392 wurden dann in einem doppelten immunradiometrischen Assay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 2A10, immobilisiert in Plastikvertiefungen, und dem gleichen [¹²&sup5;J]-markierten Antikörper in der Flüssigphase getestet: F. Zavala et al, Nature 229: 737 (1982).
- Das von dem Klon p277-19 exprimierte rekombinante Protein ist in der Lage, gleichzeitig den immobilisierten und den radiomarkierten Antikörper zu binden. Dies zeigt an, daß das rekombinante Protein, wie das authentische CS-Protein, mindestens zwei Epitope enthält, die durch den Anti-CS-monoklonalen Antikörper 2A10 erkannt werden.
- Die Nukleotidsequenz des p277-19-Inserts ist in Fig. 1 dargestellt. In dem durch diese Sequenz codierten Protein ist die Aminosäuresequenz Prolin, Asparagin, Alanin und Asparagin ohne Variationen 23x hintereinander wiederholt. Dieses repetitive Muster von vier Aminosäuren ist das kürzeste der bekannten CS-Protein-Repeats. Die Repeats von P. knowlesi und P. cynomolgi (Gombak-Stamm), zweier AffenMalariaparasiten, sind zwölf bzw. elf Aminosäuren lang, Godson et al., Nature 305: 29(1983); V. Enea et al., siehe oben (1984).
- Obwohl weder die DNA- noch die Proteinsequenzen dieser wiederholten Peptide miteinander verwandt sind, sind bestimmte Ähnlichkeiten aus einer Analyse ihrer Aminosäurezusammensetzung offensichtlich. So sind Alanin und Asparagin in den Repeats aller bekannten CS-Proteine vorhanden; Prolin ist in P. knowlesi und P. falciparum vorhanden, und Glutaminsäure und Glycin sind in P. knowlesi und P. cynomolgi (Gombak) vorhanden.
- Die vorliegenden Befunde zeigen an, daß das immundominante Epitop des CS-Proteins von P.falciparum aus einer Abfolge von Aminosäuren besteht, die anscheinend keine weiteren Modifikationen benötigt, um antigen zu sein.
- RNA wurde aus den Thoraxen von Anopheles balabacensis Moskitos, die mit Plasmodium falciparum des Thai K-1-Stamms infiziert waren, hergestellt. Das gesammelte Thoraxgewebe (von 1837 Moskitos) wurde in 10 Volumen 4 M Guanidinisothiocyanat (pH 5,0) und 0,1M 2-Mercaptoethanol homogenisiert (Liu et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 76: 4503 1979; Ellis et al, Nature 302:536 (1983). Das Homogenat wurde bei 9000 Upm für 3 Minuten in einer Sorval (RC2-6)-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dann aufgeschichtet über 0,2 Volumen 5,7 M Cäsiumchlorid und 0,1 EDTA (pH 6,5) und in einem SW-41 Rotor bei 28K für 16 bis 20 Stunden bei 16-20ºC zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde in 7,5M Guanidinhydrochlorid in 25 mM Natriumcitrat (pH 7,0) mit 5 mM beta-Mercaptoethanol resuspendiert. Die RNA wurde durch Zusatz von 1/40 Volumen 1M Essigsäure und einem halben Volumen 95% Ethanol bei -20ºC für 2-3 Stunden präzipitiert (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5294 1979). Dies wurde gefolgt von einer zweiten Präzipitation in 0,3M Natriumacetat (pH 5) und 2,5 Volumen 95% Ethanol, übernacht bei -20ºC. Nach erfolger Zentrifugation wurde das RNA-Pellet in Wasser resuspendiert und bei -70ºC gelagert.
- Poly (A)&spplus;-RNA wurde gemäß dem Verfahren von Aviv und Leder Proc. Nat'l Acad.Sci. (USA) 69: 1408 (1972) hergestellt. Die RNA wurde bei 68ºC für 10 Minuten erwärmt, dann auf Eis für 5 Minuten abgekühlt. Nach Erwärmen der RNA-Probe auf Raumtemperatur wurde Bindungspuffer bis zu einer Endkonzentration von 0,5M Natriumchlorid, 0,01M Tris-HCl (pH 7,4) und 0,01M EDTA (pH 7,0) zugesetzt. Die RNA wurde 3 bis 5 mal durch eine Oligo(dT)-Zellulosesäule (Collaborative Research, Inc., Waltham, Mass.) mit einem Bettvolumen von 0,2 bis 0,4 ml geleitet. Die Poly(A)&spplus;-RNA wurde von der Säule mit sterilem Wasser bei Raumtemperatur eluiert. Die RNA wurde wiedergewonnen durch Präzipitation mit Ethanol und in Wasser bei -70ºC gelagert.
- Vor der cDNA-Synthese wurden 1,5ug der Poly(A)&spplus;-RNA mit 75 ng Kaninchen-Globin-mRNA (Bethesda Research Laboratories (BRL), Bethesda, Md.) gemischt, extrahiert zuerst mit Phenol und Chloroform (1:1 V/V) und dann mit Chloroform. Die RNA wurde in 0,3M Natriumacetat und 2 1/2 Volumen 95% Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in 6 ul resuspendiert und dann bei -70ºC gelagert.
- Der erste und der zweite Strang der cDNA wurde durch eine Modifikation des Verfahrens von Okayama und Berg, Molecular and Cellular Biology 2:161 (1982) synthetisiert. Ungefähr 1,5 ug von P.falciparum poly(A)&spplus;-RNA, gemischt mit 75 ng Kaninchen-Globin-mRNA (Bethesda Research Laboratories), wurden in einem 30 ul Reaktionsvolumen, enthaltend 50 mm Tris-HCl (pH 8,3), 50 mm KCl, 8 mm MgCl&sub2;, 2 mm Dithiothreitol, 30 ug/ml Oligo-dT (12-18)-Zellulose (Collaborative Research), 100 ug/ml Actinomycin-D (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 100 ug/ml BSA (Rinderserumalbumin), 0,25 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 50 x 10&supmin;&sup6; Ci-alpha-[³²P)-dATP (spezifische Aktivität 3000 Curie/mmol) und 120 Einheiten von reverser Transkriptase (BRL) bei 42ºC 2 Stunden inkubiert.
- Die Reaktion wurde gestoppt durch Extraktion mit Phenol und Chloroform (1:1 V/V), dann mit einem gleichen Volumen an Chloroform und 2 x präzipitiert mit 2 M Ammoniumacetat und Ethanol. Das Pellet wurde mit 80% Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 46,9 ul Wasser resuspendiert.
- Der zweite Strang wurde in einem 65 ul Reaktionsvolumen mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM Magnesiumchlorid, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 mM KCl, 50 ug/ml BSA, 0,3 mM Nikotinamidadenindinucleotid (NAD) oxidiert (Sigma), 0,1 mM von jedem der Desoxynucleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dTTP, dGTP1)), 1 Einheit DNA Polymerase I (Boehringer, Mannheim, Biochemical, Indianapolis, Indiana), 1,5 Einheiten RNAase H (BRL), 1 Einheit E. Coli-Ligase, (P.L. Biochemical) synthetisiert. Die Reaktionspartner wurden zunächst bei 15ºC für eine Stunde, dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Wieder wurde die Reaktion durch 1) Dieses und alle dNTP's stammtenvon P.L.Biochem., Milwaukee, Wisc.Extraktion gestoppt, zuerst mit Phenol/Chloroform (1:1) und dann mit einem gleichen Volumen von Chloroform. Die Mischung wurde einmal präzipitiert mit 2M Ammoniumacetat und Ethanol, und das Pellet wurde mit 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 4,5 ul Wasser resuspendiert.
- Die Synthesereaktion des zweiten Strangs wurde vervollständigt mit T&sub4; DNA-Polymerase (BRL). Die doppelsträngige cDNA wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 6 mM Magnesiumchlorid, 25 mM KCl, 0,1 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 3,5 Einheiten T&sub4;-DNA-Polymerase bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Diese Reaktion wurde durch den Zusatz von 25 mM EDTA gestoppt. Die Reaktionsmischung wurde mit Phenol und Chloroform (1:1 V/V) und dann mit dem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit Äther. Die doppelsträngige cDNA wurde dann mit 0,5 M NaCl und 10% PEG (Polyethylenglycol, durchschnittliches Molekulargewicht 8000) bei 4º übernacht präzipitiert. Die doppelsträngige cDNA wurde an den Enden verlängert mit Desoxycytidinresten gemäß Roychoudhury, et al., Nucl. Acids Res., 3, 101 (1976); Land et al., Nucl. Acids Res. 9:2251 (1981). Doppelsträngige cDNA (30 bis 50 ng) wurde in einem 25 ul Reaktionsvolumen mit 0,1 M Kaliumkakodylat (pH 7,0), 0,5 mM dCTP, 0,1 mM DTT und 2 mM CoCl&sub2; bei 37º C für 5 Minuten inkubiert. 10 Einheiten terminaler Desoxynucleotidyltransferase (Enzo Biochemical, Inc.) wurden zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 Minute inkubiert. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von EDTA auf 10 mM gestoppt. 2 ug Hefe-tRNA wurden zugesetzt, und die Mischung wurde zweimal mit Phenol/Chloroform (1:1) und einmal mit Chloroform extrahiert und dann mit 2M Ammoniumacetat und Ethanol präzipitiert.
- Die mit Desoxy(C) an den Enden verlängerte doppelsträngige cDNA wurde in 60 ul Annealingpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA) resuspendiert. Die Konzentration wurde auf 0,6 bis 3 ug/ml geschätzt. Die an den Enden verlängerte cDNA wurde an PstI-geschnittenes, an den Enden mit Desoxy(G)-verlängertes pBR 322 (New England Nuclear) in verschiedenen Verhältnissen hybridisiert (unter Verwendung des Verfahrens von Land, et al, siehe oben, 1981), um das optimale Verhältnis von Insert zu Vektor zu bestimmen.
- Alle Versuchshybridisierungen wurden bei einer Konzentration von 250 ng pBR322/ml in einem 200 ul Reaktionsvolumen durch Mischen von 50 ng pBR322 mit 20, 8,0, 4,2 und 3,3 ul der an den Enden verlängerten doppelsträngigen cDNA durchgeführt. Die 20 und 4,2 ul Versuchsreaktionen ergaben die maximale Anzahl von Kolonien und wurden deshalb in einem größeren Maßstab durchgeführt, um größere Präparationen zur Transformation herzustellen.
- E. coli LE 392-Zellen wurden als Bakterienwirt verwendet (P. Leder, et al., Science 196:175 (1977). Dieser ist eine Variante des E. coli K-12-Stamms. Jedoch kann die Transformation auch in anderen Wirtszellen, wie DH1, erhältlich von dem E. Coli Genetic Stock Center, Yale Univ. (CGSC Nr. 6040), durchgeführt werden.
- Die Wirtszellen wurden durch die rekombinanten Plasmide unter Verwendung einer Modifizierung des Verfahrens von Hanahan et al, J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983) transformiert. 2,5 ng des hybriden Plasmides wurden zu 210 ul kompetenten LE 392-Zellen zugesetzt. Die Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert, hitzegeschockt bei 42ºC für 90 sec und auf Eis für 1-2 min gegeben. 800 ul SOC (2% Bactotrypton (Difco Detroit, Mich.), 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM MgSO&sub4;, 20 mM Glukose) wurden zugesetzt, und die Reaktion wurde bei 37ºC unter Schütteln bei 225 Upm für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden bei 2000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert und in 0,4 ml SOB ohne Magnesium (2% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl) resuspendiert und auf 2 Hanahan-Platten (1% Bactotrypton, 0,95% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 1,5% Bactoagar) mit 12,5 ug/ml Tetracyclin (Sigma) ausplattiert. Die Transformationseffizienz betrug ungefähr 10&sup5; Transformanden pro Mikrogramm hybridisierter DNA.
- Die cDNA-Bank wurde nach einer Modifikation des in situRadioimmunoassays, wie von Helfman, et al. Proc. Nat'l Acad. Sci., (USA) 80: 31-35 (1983) beschrieben, und wie bei Enea et al., siehe oben beschrieben, abgesucht.
- Die Bakterien wurden auf 82 mM Nitrozellulosefilter (Millipore HATF Millipore, Bedford, Mass.) übertragen. Replikafilter wurden hergestellt und erneut auf den oben beschriebenen Tetracyclinplatten bei 37ºC wachsengelassen.
- Die Bakterienkolonien wurden lysiert durch Anbringen der offenen Petrischalen über 1 ml Chloroform für 15 Minuten. Die Filter wurden dann in einzelne Petrischalen gegeben oder als Pool in Schalen gegeben, die 50 mm Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid, BRL), 3% BSA, 40 ug/ml Lysosome, 1 ug/ml DNAase I enthielten, und vorsichtig bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden geschüttelt. Die Filter wurden mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl für 1 bis 2 Stunden gespült und dann für 15 bis 30 Minuten in 50 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 150 mM NaCl und 3% BSA inkubiert. Die Filter wurden dann in einem 50 ml Volumen mit 50 x 10&sup6; cpm [¹²&sup5;J]-markiertem monoklonalem Antikörper 2A10 in 150 mM NaCl, 3% BSA unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur übernacht inkubiert. Die Filter wurden ausgiebig mit 150 mM NaCl, 0,1% NP40 (Sigma), und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen, luftgetrocknet und zur Autoradiographie angebracht.
- Nach Absuchen von ungefähr 10 000 Kolonien wurde eine gefunden, die mit dem monoklonalen Antikörper 2A10 reagiert.
- Der Klon wurde gereinigt durch Ausstreichen auf LB-Platten (10% Bactotrypton, 50% Hefeektrakt, 170 mM NaCL, 1,5% Bactoagar) enthaltend 12,5 ug/ml Tetracyclin.
- Eine Einzelkolonie wurde abgenommen und wurde durch beide, das obenbeschriebene in situ-Radioimmunoassayverfahren und den doppelten Radioimmunoassay (Ellis et al., Nature, Band 302: 536-538) (1983) getestet. Bei diesem Verfahren wurde der Antikörper 2A10 an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Rohlysate der zu testenden Bakterienklone wurden den Vertiefungen zugesetzt und für ausreichende Zeit inkubiert, um dem in dem Lysat vorhandenen immunoreaktiven Protein zu ermöglichen, an den adsorbierten monoklonalen Antikörper zu binden. Die Vertiefungen wurden dann gewaschen, um jegliche kontaminierenden Proteine zu entfernen und radiomarkierter monoklonaler Antikörper 2A10 wurde zugesetzt. Der markierte Antikörper heftete sich an das antigene Protein, das bereits durch den ersten monoklonalen Antikörper an die Oberfläche der Mikrotitervertiefung gebunden ist. Extrakte von LE 392, die das Plasmid enthielten, zeigten sich positiv in diesem Assay.
- Plasmid DNA wurde von LE392 (p277-19) unter Verwendung einer Modifikation der Methode von Birnbaum et al. Nucleic Acid Research 7: 1515-1523 (1979) hergestellt. Kurz, Bakterienzellen wurden in LB-Medium (enthaltend 10g Bactotrypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 10 g NaCl [mit NaOH eingestellt auf pH 7,5]/1) entweder bis zur Sättigung oder bis zu einer optischen Dichte von OD-600 nm von ungefähr 0,4 kultiviert, wobei in diesem Fall Chloramphenicol auf 0,17 mg/ml zugesetzt wurde. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation inkubiert und in ungefähr 20 Volumen 50 mM Glukose resuspendiert. 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA und 2 Volumen 0,2 N NaOH und 1% SDS wurden zugesetzt. Nach Inkubieren der Suspension auf Eis für 10 Minuten wurden 1,5 Volumen 5M Kaliumacetat (pH 4,8) zugesetzt. Folgend auf eine 10-minütige Inkubation auf Eis wurde die Probe bei 8000 Upm für 60 Minuten in einem Festwinkel-Sorvalrotor zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt und mit 0,6 Volumen Isopropanol vereinigt. Das Präzipitat wurde in 10 mM Tris, 10 mM EDTA (pH 8,0) resuspendiert mit RNase A (BRL, 20 ug/ml) und RNase T1 (BRL; 1 Einheit/ml) bei 37ºC für 45 Minuten behandelt. Carbowax 8000 (Dow Chemical Co., Midland, Mich.) und NaCl wurden auf 10% w/v und 0,4 M zugesetzt, und die Probe wurde übernacht bei 4ºC inkubiert. Die Präparation wurde dann bei 8000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert und das Pellet in 10 mM Tris (pH 8) und 1 mM EDTA resuspendiert, extrahiert mit Phenol/Chloroform (1:1 V/V) und mit Ethanol präzipitiert.
- Kartieren von p277-19 mit Restriktionsenzymen MspI, HinfI, ScaI, BglI, PstI, AluI und RsaI (von BRL und New England Biolabs) zeigte, daß das Plasmid eine Deletion trug von ungefähr Nucleotid 3350 bis Nucleotid 3608 auf der pBR322-Standardkarte (Sutcliffe, J.G., Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol., 43:77-90 (1979)). Als ein Ergebnis dieser Deletion fehlte die PstI-Stelle 3' von dem Insert, und die HinfI-Stelle bei Nucleotid 3362 befand sich nahe bei dem 3'-Ende des Inserts. Die Karte des Vektors 5' von dem Insert war unverändert. Diese Befunden beeinflußten die Auswahl der Technik zum Sequenzieren des Inserts, wie oben beschrieben.
- 6 ug der Plasmid-DNA wurden für 2 Stunden bei 37ºC mit 24 Einheiten MspI (New England Biolabs, Beverly, Mass.) in einem 35 ul Reaktionsvolumen, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT, verdaut. Die verdaute Plasmid-DNA wurde auf einem 1,2%igen Gel aus niedrigschmelzender Agarose (International Biotechnologies, Inc., New Haven, Conn.) fraktioniert. Das größte Fragment, mit einer Länge von ungefähr 700 Basenpaaren, das als das DNA-Insert enthaltene Fragment identifiziert wurde (über das obenbeschriebene Kartieren), wurde isoliert durch Schmelzen des Agarosestreifens bei 70ºC, gefolgt von 3 Phenolextraktionen hintereinander, einer Chloroformextraktion und 2 Runden der Präzipitation in Ethanol, enthaltend 2 M Ammoniumacetat. Die DNA wurde in 10 ul Wasser resuspendiert und bei -20ºC gelagert.
- Ungefähr 1 ug der gelgereinigten p277-19 DNA wurde in einem 10 ul Reaktionsvolumen mit 6 Einheiten HinfI (BRL) bei 37ºC für eine Stunde in Hin-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl) und 1 mM DTT (Dithiothreitol) verdaut. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 65ºC für 10 Minuten gestoppt.
- Die HinfI-verdaute DNA wurde dann endmarkiert in einem 20 ul Reaktionsvolumen durch Zusetzen von jeweils dGTP, dTTP, dCTP auf 50 mM und 30 x 10&supmin;&sup6; Ci alpha-[³²P]-dATP (3000 Ci/mmol) in Hin-Puffer (oben beschrieben) mit 1 mM DTT und 2 Einheiten des Klenow-Fragments von E.coli-DNA Polymerase I (Boehringer-Mannheim) bei Raumtemperatur für 15 Minuten. 2 ul 0,5 mM dATP wurden zugesetzt, und die Inkubation wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 65ºC für 10 Minuten gestoppt.
- Die endmarkierten DNA-Fragmente wurden in einem 2%igen bei niedriger Temperatur schmelzenden Agaroseminigel fraktioniert. Die Fragmente wurden aus dem Gel elektroeluiert durch Ausschneiden einer kleinen Vertiefung vor dem vorderen Ende der zwei DNA-Banden, Auffüllen der Vertiefungen mit ungefähr 35 ul Laufpuffer (0,04M Tris-acetat, 0,002M EDTA) und Fortsetzen der Elektrophorese mit vier Pulsen von 45-60 Sekunden (60 V). Der Puffer in den Vertiefungen wurde gesammelt, und die Vertiefungen wurden erneut gefüllt zwischen jedem Strompuls.
- 6 ug Lachsspermien DNA (Sigma) wurden den DNA-Fragmenten zugesetzt, und die Mischung wurde einmal mit Phenol und Chloroform (1:1 V/V) und einmal mit Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Präzipitation mit 2M Ammoniumacetat und Ethanol.
- Die präzipitierte DNA wurde in 53 ul Wasser resuspendiert und sequenziert gemäß dem Verfahren von Maxam and Gilbert, Methods in Enzymology, Band 65, 499-560 (1980). Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind in Tabelle I aufgeführt, die auf einer Tabelle in Maniatis, et al., "Recombinant DNA: A Cloning Manual" Cold Spring Harbor (1980) basiert.
- Das DNA-Fragment p277-19 kodierte für ein Peptid, das eine Serie von hintereinander wiederholten Aminosäurerepeats enthielt. Die repetitive Einheit des Peptids betrug vier Aminosäuren und bestand aus Prolin, Asparagin, Alanin und Asparagin 23 x hintereinander wiederholt. Die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments ist in Fig. 1 dargestellt. Die Sequenz ist als eine Matrix angeordnet mit dem Leseraster in Register mit dem der beta-lactamase. Die Sequenz wurde erhalten gemäß dem Verfahren von Maxam and Gilbert, siehe oben, unter Verwendung der Hpa II-Stelle 5' zu dem PstI-Insert in pBR322 und einer HinfI-Stelle 3' zu dem Insert als Markierungsstellen. Aufgrund der 300 Basenpaardeletion in dem pBR322 auf der 3'-Seite des Inserts gelangte die HinfI-Stelle innerhalb von 10 Basenpaaren des 3'-Endes des mit d(C) an den Enden verlängerten cDNA-Inserts. Tabelle I Zusammenfassung der basenspezifischen Reaktionen zum Sequenzieren von endmarkierten DNA 1 mg Lachsspermien DNA in jedem Mix Abkühlen auf Zusetzen Inkubieren Aufbewahren Zentrifugieren Zum Pellet zusetzen Aufbewahren 200ul DMS Puffer 10ul [³²P]DNA 50ul DMS-Stop 750ul Ethanol 250ul 0,3M NaAc 750ul Ethanol 25ul Ameisensäure 200ul HZ-Stop 750ul Ethanol Erwärmen auf 90ºC 3-4 min 150ul 1 N Essigsäure 5ul tRNA (1mg/ml) 750ul 95% Ethanol Tabelle I (Fortsetzung) Zentrifugieren Waschen vom Pellet mit Vakuumtrocknen Zum Pellet zusetzen Erwärmen auf Lyophilisieren Zusetzen Vortexen Erwärmen auf Abkühlung auf Eis 70% Ethanol 100ul 1,0M Piperidin 10ul Auftragungspuffer Auftragen auf Gel Reaktionen sollten in silizierten Eppendorfgefäßen durchgeführt werden.
- Die Anwesenheit von repetitiven Epitopen in P. falciparum CS-Proteinen wurde durch Durchführen eines doppelten immunoradiometrischen Assays mit einem einzigen monoklonalen Antikörper bestätigt. Dies wird in Fig. 2A und 2B erläutert.
- In diesem Assay wurden Vertiefungen in flexiblen Mikrotiterplatten (Dynatech Inc.) mit 20 ug/ml Anti-Plasmodium falciparum monoklonalem Antikörper (2A10) beschichtet. Nach wiederholtem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1% Rinderserumalbumin, wurden die Vertiefungen mit 2fach Serienverdünnungen von Lysaten von E. coli LE 392, enthaltend Plasmid p277-19, oder E. coli LE 392, enthaltend den pBR 322-Vektor, inkubiert. Gefolgt auf eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen gewaschen, und 30 ul [¹²&sup5;J]-markierter monoklonaler Antikörper 2A10 (1 x 20&sup5; cpm; spezifische Aktivität 2 x 10&sup7; cpm/ug) wurden zugesetzt. Nach einer Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen mit PBS-Tween 20-BSA gewaschen, getrocknet und in einem Gamma-Zähler gezählt. Lysate von E. coli LE 392, enthaltend das Plasmid p277-19, wurden auch getestet unter Verwendung von mit monoklonalem Antikörper 2A10 beschichteten Platten und einem nicht verwandten [¹²&sup5;J] markierten monoklonalen Antikörper (X-X). Wie in Fig. 2A erläutert, bindet das von Klon p277-19 exprimierte rekombinante Protein gleichzeitig den immobilisierten und den radiomarkierten Antikörper. Dies zeigt an, daß das rekombinante Protein, wie das authentische CS-Protein, mindestens zwei Epitope enthält, die von dem anti-CS-monoklonalen Antikörper 2A10 erkannt werden.
- Inhibierende Wirkung von aus LE 392 (p277-19) hergestellten Bakterienextrakten auf die Bindung von markiertem monoklonalen Antikörper an die Epitope von authentischen P. falciparum CS-Proteinen
- Der folgende Inhibierungsassay wurde durchgeführt. 10 ul (5 x 10&sup4; cpm) [¹²&sup5;J]-markierter monoklonaler Antikörper 2A10 wurden mit 30 ul zweifacher Serienverdünnungen von Lysaten von E.coli LE 392, enthaltend Plasmid p277-19 (O-O), oder E.coli LE 392, enthaltend den pBR322-Vektor (X-X), inkubiert. Folgend auf eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur wurden 30 ul dieser Mischungen auf zuvor mit einem Extrakt aus P. falciparum Sporozoiten beschichteten Mikrotiterplatten übertragen (Zavala et al., J. Exp. Med. 157:1947 (1983)). Nach einer einstündigen Inkubationsperiode wurden die Vertiefungen gewaschen, getrocknet und in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Ergebnisse dieses Inhibierungsassays sind in Fig. 2B erläutert. Die Ergebnisse zeigen, daß die aus LE 392, enthaltend das Plasmid p277-19, hergestellten Bakterienextrakte die Bindung von markiertem monoklonalem Antikörper an die Epitope von nativen P. falciparum CS-Proteinen inhibieren. Die Spezifität dieser Reaktion wurde durch ein weiteres Experiment bestätigt, in dem gezeigt wurde, daß Zellextrakte von p277-19 die Bindung eines monoklonalen Anti-Plasmodium berghei-Antikörpers an das entsprechende CS-Protein nicht inhibieren. Diese Daten zeigen, daß das von p277-19 codierte rekombinante Protein die antigene Eigenschaft des P. falciparum CS-Proteins besitzt.
- Die Nucleotidsequenz des p277-19-Inserts wurde erhalten gemäß dem Verfahren von Maxam and Gilbert, Proc. Nat'l. Acad. (USA), 74:560 (1977) unter Verwendung der Hpa II-Stelle 5' zu dem Insert der PstI-Stelle in pBR322 und einer HinfI-Stelle 3' zu dem Insert als Markierungsstellen. Die Nucleotidsequenz des p277-19-Inserts ist in Fig. 1 dargestellt. Das verfolgte Verfahren ist ausführlich in Tabelle I beschrieben.
- Die gefolgerte Aminosäuresequenz des unten ausgeführten Vier-Aminosäuren-Repeats basiert auf der Translation der Nucleotidsequenz in das richtige Leseraster: Pro-Asn-Ala-Asn. (Alle Sequenzen werden angegeben von dem dem NH&sub2;-Terminus nächsten Ende auf der linken Seite zu dem dem -COOH-Terminus nächsten Ende auf der rechten Seite).
- Die Sequenz aus vier Aminosäuren ist 23x hintereinander wiederholt. Jedoch bestehen auf der Nucleotidebene die Repeats in p277-19 aus acht Varianten. Beide der Asparagincodons, drei der vier Prolincodons und zwei der vier Alanincodons werden verwendet (Fig. 1). Dieses repetitive Muster von vier Aminosäuren ist kürzer als jedes der drei bekannten CS-Protein-Repeats. Die Repeats von P.knowlesi und P. cynomolgi (Gombakk-Stamm), zweier Affen-Malaria-Parasiten, sind zwölf bzw. elf Aminosäuren lang (Godson, et al. Nature 305:29 (1983); V. Enea et al. PNAS eingereicht (1984).
- Obwohl weder die DNA- noch die Proteinsequenzen dieser drei Sätze an Repeats ausgiebige Homologie aufweisen, besitzen sie Ähnlichkeiten in ihrer Aminosäurezusammensetzung. Alanin und Asparagin sind in den Repeats sämtlicher drei CS-Proteine vorhanden; Prolin ist in P. knowlesi und P.falciparum vorhanden; und Glutaminsäure und Glycin sind in P. knowlesi und P.cynomolgi (Gombak) vorhanden.
- Das CS-Protein von P. falciparum scheint durch ein Gen in einer einzelnen Kopie codiert zu sein, basierend auf den Ergebnissen von Kartierungsexperimenten von genomischer DNA. Als Abriß, der genomische Klon wurde wie folgt kartiert:
- P. falciparum DNA, erhalten aus Blot-Phasen, wurde mit Restriktionsenzymen (einschließlich EcoRI, BamHI, HindIII, BglII, SalI, XhoI) verdaut, auf Agarosegel fraktioniert, auf Nitrozellulosefilter übertragen, hybridisiert mit [³²P]-markiertem p277-19 und autoradiographiert. Dieses Verfahren erlaubt das Bestimmen der Größen der P. falciparum DNA (erzeugt durch sämtliche der obigen Restriktionsfragmente), die Homologie zu der radioaktiven Probe besitzt. Insbesondere erzeugte der SalI-Verdau ein Fragment von ungefähr 7000 Nucleotiden, das mit der Probe hybridisierte. Da ein Fragment dieser Größe beträchtlich kleiner war als der Großteil der mit SalI erzeugten Fragmente, wurde eine Größenfraktionierung der SalI-verdauten DNA unternommen, um das durch SalI erzeugte Fragment von 7000 Nucleotiden zu erhalten, wobei angenommen wurde, daß dies eine beträchtliche Anreicherung des CS-Gens darstellt.
- Sall-verdaute DNA wurde auf einem Sucrosegradienten (10-40% w/v in 1 M NaCl, 2 mM Tris-HCl (pH 8) und 5 mM EDTA; SW-41) bei 38 000 Upm bei 20ºC für 16,5 Stunden fraktioniert. Die Fraktionen wurden gesammelt und Aliquots wurden mit [³²P]-markiertem p277-19 hybridisiert.
- Die Fraktion, die die CS-Sequenz enthielt, wurde mit SalI-verdauter EMBL4-DNA ligiert. (EMBL4 ist ein Derivat des Phagen-Lambda; andere SalI-verdaute Lambda-Phagen-DNA- Vektoren, wie Charon 28, erhältlich von BRL, hätten verwendet werden können).
- Das ligierte Produkt wurde in vitro verpackt (Verpackungsextrakte und Protokolle sind gewerblich erhältlich von BRL und anderen Quellen) und auf LE 392 ausplattiert. Die erhaltenen Plaques wurden mit [³²P] markiertem p277-19 abgesucht. Zwei unabhängige positive Plaques wurden so identifiziert.
- Charaktersierung der Isolate wird anhand bekannter Techniken durchgeführt und umfaßt physikalisches Kartieren der Phagen, Subklonieren der spezifischen DNA-Fragmente in Plasmidvektoren, Bestimmen der DNA-Sequenz dieser Fragmente und, falls nötig, Kartierungsexperimente mit der Messenger-RNA des P. falciparum CS-Proteins. Mit Hilfe dieses Verfahrens wird das Gen, das für das vollständige CS-Protein von P. falciparum codiert, isoliert und sequenziert.
- Zum Bestätigen, daß die vorherige Aminosäuresequenz die immunreaktive Stelle enthält, ist ein korrespondierendes synthetisches Peptid unter Verwendung der Festphasenharzsynthese (Marglin, H. und Merrifield, R.B., Ann.Rev. Bio. Chem. 39:841-866 (1970)) synthetisiert worden. Die allgemeinen Schritte der hierin verwendeten Peptidsynthesetechniken sind bekannt. Die Synthese wurde durchgeführt unter Verwendung eines Benzhydrylamin (BHA)-Harzes in einem automatischen Synthesizer, der durch einen Computer kontrolliert wurde unter Verwendung eines Programms, das auf dem von Merrifield, R. B., Fed. Proc. 21:412 (1962); J. Chem. Soc. 85:2149, (1963) basiert. Das Repeat aus vier Aminosäuren wurde auf dem Benzhydrylaminharz zusammengesetzt. Das Tandemrepeat wurde durch das sequenzielle Zusetzen von geschützten Aminosäuren in der gleichen Reihenfolge wie in dem Vier- Aminosäuren-Repeat zusammengesetzt, unter Verwendung der obenbeschriebenen Methode. Aminosäurezusammensetzung und Sequenzanalyse, ausgeführt durch automatisierten Edmanabbau, bestätigen, daß das Peptid richtig synthetisiert worden war. Ein 12-MER-Peptid wurde somit synthetisiert, das aus drei sequentiellen Repeats der minimalen Repeateinheit (Pro-Asn-Ala-Asn) bestand.
- Zum Bestätigen, daß das richtige Epitop erhalten worden ist, wurden Kaninchen mit einem Peptid immunisiert, das aus drei und sechs Tandemrepeats der vier Aminosäuren bestand, das an einen Träger (Rinder-Gamma-Globulin in komplettem Freund's Adjuvanz) gekoppelt war. Vier Wochen nach der Injektion wurde den Kaninchen Blut entnommen und ihr Serum auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen die tandem-wiederholten Peptide und gegen Extrakte von P. falciparurn Sporozoiten getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß die Tiere hohe Titer (größer als 1:1000) der Antikörper gegen das in den Parasitenextrakten vorhandene native CS-Protein herstellen.
- Die Antigenität eines synthetischen Peptids aus 12 Aminosäuren, das aus einem 3 x-Tandemrepeat der minimalen Repeateinheit (Pro-Asn-Ala-Asn) des P. falciparum CSProteins bestand, wurde durch einen direkten Radioimmunoassay wie folgt bestätigt:
- P. falciparum-Sporozoitenextrakt wurde verwendet, um den Boden von Mikrotiterplatten zu beschichten (wie zuvor beschrieben). Ungebundenes natives Antigen wurde durch Waschen entfernt, und die Vertiefungen wurden mit Serienverdünnungen von PBS-BSA, enthaltend Serienverdünnungen des synthetischen Peptids mit 12 Aminosäuren mit der Sequenz (Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn) gefüllt. Kontrollvertiefungen wurden mit Serienverdünnungen von PBS-BSA, enthaltend das synthetische Peptid mit 12 Aminosäuren, das das Epitop von P. knowlesi, darstellt, d.h. (Gln-Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-Pro), gefüllt. Sättigungsmengen von [¹²&sup5;J]-markiertem monoklonalem Antikörper 2A10 wurden dann den Vertiefungen zugesetzt (8 x 10&sup4; cpm) und bindengelassen. Nach Entfernen des Überstands wurde restliche Radioaktivität mit einem Gammazähler gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Vertiefung Nr. (1) P. falciparum 12-Peptid (ug/ml) (2) Restliche Radioaktivität von (1) (cpm) (3) Nicht-spezifisches Antigen (P. knowlesi 12-Peptid) (ug/ml) (4) Restliche Radioaktivität von (3) (cpm)
- Kontrolle von Vertiefungen, die mit BSA alleine ohne Sporozoitenextrakt beschichtet waren, zeigten eine restliche Radioaktivität von 27-58 cpm.
- Die obigen Ergebnisse zeigen, daß der monoklonale Antikörper das synthetische Peptid aus 12 Aminosäuren erkennt und quantitativ bindet.
- Ein anderer immunradiometrischer Assay wurde verwendet, um zu zeigen, daß das synthetische Peptid aus 12 Aminosäuren durch mehrere Antikörper gegen P. falciparum CS-Protein erkannt wird. Die verwendeten Antikörper werden als 2A10, 1E9, 3D6 und 2C11 bezeichnet.
- Ein synthetisches 12-MER-Peptid (drei Repeats des Peptids Pro-Asn-Ala-Asn) (20 ug/ml) wurden an den Boden von Mikrotitervertiefungen, wie zuvor beschrieben, gebunden. Die Vertiefungen wurden mit BSA gesättigt.
- Serienverdünnungen eines jeden Typs von nichtmarkierter monoklonaler Antikörperpräparation (10 ug/ml) in Serienverdünnung wurden in getrennte, mit 12-MER beschichtete Vertiefungen eingeführt, und dem Antikörper wurde ausreichend Zeit gegeben, um an den Überzug zu binden.
- Schließlich wurden nach Waschen der Zellen Sättigungsmengen an affinitätsgereinigtem, radiomarkiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG ebenfalls in die Vertiefungen gegeben und an die an den Peptidüberzug gebundenen monoklonalen Antikörper binden gelassen. Dann wurden die Vertiefungen gewaschen und restliche Radioaktivität wurde in einem Gammazähler gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III unten zusammengefaßt.
- Nichtmarkierte monoklonale Antikörper gegen P. knowlesi, BSA-beschichtete Vertiefungen (in der Abwesenheit von monoklonalem Anti-P. falciparum-Antikörper) und mit dem Peptid aus 12 Aminosäuren beschichtete Vertiefungen (in der Abwesenheit von monoklonalem Anti-P. falciparum-Antikörper) wurden als Kontrollen verwendet. Die Kontrollen zeigten 40-100 cpm. Tabelle III Vertiefung Nr. Nicht-markierter Antikörper (ug/ml) Restliche Radioaktivität (cpm)
- Die Kontrollen, bei denen die Vertiefungen unter Verwendung von Verdünnungen von drei anderen nichtspezifischen monoklonalen Antikörpern des gleichen Isotyps inkubiert wurden, führten zu restlicher Radioaktivität in dem Bereich zwischen 44 und 100.
- Die obigen Ergebnisse zeigen, daß mehrere monoklonale Anti-P. falciparum-Antikörper das synthetische Peptid aus 12 Aminosäuren erkennen und quantitativ daran binden.
- Ein hintereinander wiederholtes Peptid (3x und 6x) wird wie oben beschrieben synthetisiert, außer daß ein Cysteinrest an den N-Terminus angefügt wird. Zum Bestimmen, ob die Synthese korrekt durchgeführt worden ist, wird ein Aliquot einer sauren Hydrolyse bei verringertem Druck (5,6M HCl 110ºC, 72 Stunden) unterzogen, und seine Aminosäurezusammensetzung wird bestimmt. Das Peptid wird an ein Trägerprotein gekoppelt ((z.B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) oder Tetanustoxoid, über seinen N-terminalen Cysteinrest, unter Verwendung eines m-Malemidolbenzoyl-N-hydroxysuccinimidesters (MBS) als Kupplungsreagenz (Ling et al, Biochemistry 18, 690 (1979)). Dies ist ein bifunktionelles Reagenz, das unter geeigneten Bedingungen mit der Aminogruppe des Trägers und mit der dritten Gruppe der Peptide reagiert. 4 mg des Trägerproteins in 0,25 ml 0,05 PO&sub4;-Puffer, pH 7,2 wird tropfenweise mit 0,7 mg MBS, gelöst in Dimethylformamid, umgesetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das MB-Träger-Produkt wird von dem nichtumgesetzten Chemikalien durch Überleiten über eine Sephadex C-25-Säule, equilibriert in 0,05 M PO&sub4;-Puffer, pH 6,0, abgetrennt. Der MB-Träger wird dann mit 5 mg der das 12- oder 24-MER enthaltenden Verbindung, gelöst in PBS (pH 7,4), umgesetzt. Die Mischung wird für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und die Kupplung wird mit radioaktivem Peptid überwacht. Das Konjugat wird dialysiert und als Impfstoff zur Verabreichung an nichtmenschliche Primaten in einem physiologisch akzeptablen Medium verwendet.
- Alternativ kann das hintereinander wiederholte Peptid (3x) weiter mit Glutaraldehyd wie folgt polymerisiert werden: Auflösen von 20 mg des Peptids n 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Herstellen von frischem Glutaraldehyd aus einer Stammlösung mit 13 ml des PBS. Rühren des Peptids und Glutaraldehyds übernacht bei Raumtemperatur und Neutralisieren des überschüssigen Glutaraldehyds mit 1M Ethanolamin. Abtrennen des polymerisierten Peptids durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung nach Größe trennender Säulen und wiederholtes Dialysieren gegen Wasser. Dieses wird dann in einer Impfstoffpräparation verwendet.
- Fünf Schimpansen werden mit 200 ug des konjugierten Proteins oder des an Aluminiumhydroxidgel absorbierten polymerisierten Produkts immunisiert. Ihr Serum wird auf die Anwesenheit von Antikörper gegen CS-Proteine von P. falciparum unter Verwendung eines immunradiometrischen Assays untersucht. Serumverdünnungen werden in antigenbeschichteten Vertiefungen van Mikrotiterplatten inkubiert. Die Anwesenheit von an das Festphasenantigen gebundenen Antikörpern wird durch Inkubation mit [¹²&sup5;J]-markiertem, affinitätsgereinigtem Kaninchen-Anti-Mensch-IgG (das stark kreuzreagiert mit Schimpansen-IgG) ermittelt.
- Nach 30 Tagen steigt der Serumtiter der Schimpansen auf Titer von größer als 1/1000. Zu diesem Zeitpunkt werden diese Schimpansen (wie auch fünf andere Kontrollschimpansen, die mit nicht-konjugiertem Trägerprotein adsorbiert an Aluminiumhydroxid injiziert waren) mit 2000 lebenden P. falciparum-Sporozoiten infiziert. Die Infektion wird täglich registriert für insgesamt 30 Tage, durch mikroskopische Untersuchung von Blutausstrichen, beginnend eine Woche nach dem Einbringen der Parasiten. Die Ergebnisse zeigen, daß die fünf mit dem Impfstoff (konjugiertes Protein) immunisierten Schimpansen vollkommen geschützt sind, d.h. es werden keine Parasiten in ihrem Blut gefunden. Im Gegensatz dazu besitzen die Kontrollschimpansen Trophozoiten van P. falciparum in ihrer Zirkulation 10 bis 12 Tage nach dem Infizieren. Basierend auf den starken Ähnlichkeiten der Immunantworten von Mensch und Schimpanse und auf der Tatsache, daß schützende Immunität im Menschen erhalten worden ist durch Injektion von inaktivierten Sporozoiten von P. falciparum, werden die durch Immunsierung von Schimpansen mit dem beschriebenen synthetischen Peptid erhaltenen Ergebnisse auch erhalten durch ähnliche Behandlung von menschlichen Patienten.
Claims (38)
1. Ein Peptid enthaltend die Aminosäuresequenz
(pro-asn-ala-asn) mindestens 23 mal hintereinander
wiederholt.
2. Das Peptid nach Anspruch 1, worin die
Aminosäuresequenz einem Epitop des CS-Proteins eines
Sporozoiten der Art Plasmodium falciparum entspricht.
3. Das Peptid nach Anspruch 1 oder 2, worin das Peptid
ein chemisch synthetisiertes Peptid ist.
4. Das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin
das Peptid antigen ist.
5. Ein Impfstoff gegen Malaria umfassend als Wirkstoff
das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen
Träger.
6. Der Impfstoff nach Anspruch 5, worin das Peptid an
ein Trägerprotein adsorbiert oder kovalent angebracht
ist.
7. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 5 und 6
weiterhin umfassend ein physiologisch akzeptables Medium.
8. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin
der Impfstoff gegen P. falciparum Sporozoiten gerichtet
ist.
9. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 5 bis 8, worin
der Wirkstoff mit einem monoclonalen oder polyclonalen
Antikörper gegen ein Sporozoiten-CS-Protein der Art
P. falciparum immunchemisch reaktionsfähig ist.
10. Verwendung des Impfstoffs nach einem der Ansprüche 5
bis 9 zum Herstellen eines Medikaments zum Immunisieren
eines Säugers gegen Malaria.
11. Ein DNA-Fragment umfassend eine
Desoxynucleotid-Sequenz, die für eines der Peptide der
Ansprüche 1 und 2 codiert.
12. Ein rekombinantes DNA-Molekül umfassend das
DNA-Fragment von Anspruch 11.
13. Das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 12, worin
das DNA-Fragment in einen Vektor an einer geeigneten
Stelle zur Expression der codierenden Sequenz, entweder
direkt oder als Fusionsprotein, eingefügt ist.
14. Ein durch das rekombinante DNA-Molekül nach einem der
Ansprüche 12 und 13 transformierter Mikroorganismus.
15. Der Mikroorganismus nach Anspruch 14, der E. coli
ist.
16. Ein Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen
CS-Antigen von P. falciparum Sporozoiten, wobei das
Verfahren die Immunisierung eines Wirts unter Verwendung
des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt, wobei
der Wirt nur als Quelle zum Erhalten der Antikörper
verwendet wird.
17. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zum
Neutralisieren der Infektiosität von P. falciparum
Sporozoiten umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche
1 bis 4, gekoppelt an einen Träger.
Patentansprüche für den Vertragsstaat AT
1. Ein Peptid umfassend die Aminosäuresequenz
(pro-asn-ala-asn)
2. Das Peptid nach Anspruch 1, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) 3 mal hintereinander wiederholt ist.
3. Das Peptid nach Anspruch 1, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) 6 mal hintereinander wiederholt ist.
4. Das Peptid nach Anspruch 1, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) mindestens 23 mal hintereinander
wiederholt ist.
5. Das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die
Aminosäuresequenz einem Epitop des CS-Proteins eines
Sporozoiten der Art Plasmodium falciparum entspricht.
6. Das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin
das Peptid ein chemisch synthetisiertes Peptid ist.
7. Das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin
das Peptid antigen ist.
8. Ein Impfstoff gegen Malaria umfassend als Wirkstoff
das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen
Träger.
9. Der Impfstoff nach Anspruch 8, worin das Peptid an
ein Trägerprotein adsorbiert oder kovalent angebracht
ist.
10. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 8 und 9
weiterhin umfassend ein physiologisch akzeptables Medium.
11. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin
der Impfstoff gegen P. falciparum Sporozoiten gerichtet
ist.
12. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin
der Wirkstoff mit einem monoclonalen oder polyclonalen
Antikörper gegen ein Sporozoiten-CS-Protein der Art
P. falciporum immunchemisch reaktionsfähig ist.
13. Verwendung des Impfstoffs nach einem der Ansprüche 8
bis 12 zum Herstellen eines Medikaments zum Immunisieren
eines Säugers gegen Malaria.
14. Ein DNA-Fragment umfassend eine
Desoxynucleotid-Sequenz, die für eines der Peptide der
Ansprüche 1 bis 5 codiert.
15. Ein rekombinantes DNA-Molekül umfassend das
DNA-Fragment von Anspruch 14.
16. Das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 15, worin
das DNA-Fragment in einen Vektor an einer geeigneten
Stelle zur Expression der codierenden Sequenz, entweder
direkt oder als Fusionsprotein, eingefügt ist.
17. Ein durch das rekombinante DNA-Molekül nach einem der
Ansprüche 15 und 16 transformierter Mikroorganismus.
18. Der Mikroorganismus nach Anspruch 17, der E. coli
ist.
19. Ein Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen
CS-Antigen von P. falciparum Sporozoiten, wobei das
Verfahren die Immunisierung eines Wirts unter Verwendung
des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt, wobei
der Wirt nur als Quelle zum Erhalten der Antikörper
verwendet wird.
20. Ein Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zum Neutralisieren der Infektiosität
von P. falciparum Sporozoiten umfassend ein Peptid
nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekoppelt an einen
Träger, durch Kombinieren der Bestandteile in an sich
bekannter Weise.
21. Ein Verfahren zum Herstellen eines Peptids, umfassend
die Aminosäuresequenz (pro-asn-ala-asn)
durch Synthese oder rekombinante DNA-Technologie.
22. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) 3 mal hintereinander wiederholt ist.
23. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) 6 mal hintereinander wiederholt ist.
24. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Sequenz
mindestens 23 mal hintereinander wiederholt ist.
25. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24,
worin die Aminosäuresequenz einem Epitop des CS-Proteins
eines Sporozoiten der Art Plasmodium falciparum
entspricht.
26. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25,
worin das Peptid ein chemisch synthetisiertes Peptid
ist.
27. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26,
worin das Peptid antigen ist.
28. Ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs
gegen Malaria umfassend als einen Wirkstoff das Peptid
nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen Träger durch
Kuppeln des Peptids an den Träger.
29. Das Verfahren nach Anspruch 28, worin das Peptid
an ein Trägerprotein adsorbiert oder kovalent angefügt
ist.
30. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 28 und 29
weiterhin umfassend das Zusetzen eines physiologisch
akzeptablen Mediums.
31. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30,
worin der Impfstoff gegen P. falciparum Sporozoiten
gerichtet ist.
32. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31,
worin der Wirkstoff immunchemisch reaktionsfähig ist
mit einem monoclonalen oder polyclonalen Antikörper
gegen ein Sporozoiten-CS-Protein der Art P. falciporum.
33. Verwendung des Impfstoffs nach einem der Ansprüche
8 bis 12 oder hergestellt nach einem der Ansprüche
28 bis 32 zum Herstellen eines Medikaments zum
Immunisieren eines Säugers gegen Malaria.
34. Ein Verfahren zum Herstellen eines DNA-Fragments
umfassend eine Desoxynucleotid-Sequenz, die für eines
der Peptide der Ansprüche 1 bis 5 oder eines der Peptide
hergestellt nach den Ansprüchen 21 bis 25 codiert, durch
rekombinante DNA-Technologie.
35. Ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten
DNA-Moleküls umfassend das DNA-Fragment von Anspruch 14
oder das DNA-Fragment hergestellt nach Anspruch 34 durch
rekombinante DNA-Technologie.
36. Das Verfahren nach Anspruch 35, worin das DNA-Fragment
in einen Vektor an einer geeigneten Stelle zur Expression
der codierenden Sequenz, entweder direkt oder als
Fusionsprotein, eingefügt wird.
37. Ein Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus,
der durch das rekombinante DNA-Molekül nach einem der
Ansprüche 15 oder 16 oder das DNA-Molekül hergestellt nach
einem der Ansprüche 35 und 36 transformiert ist, durch
Transformieren einer Wirtszelle in an sich bekannter
Weise.
38. Das Verfahren von Anspruch 37, worin der
Mikroorganismus E. coli ist.
Patentansprüche für den Vertragsstaat LU
1. Ein Peptid umfassend die Aminosäuresequenz
(pro-asn-ala-asn).
2. Das Peptid nach Anspruch 1, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) 3 mal hintereinander wiederholt ist.
3. Das Peptid nach Anspruch 1, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) 6 mal hintereinander wiederholt ist.
4. Das Peptid nach Anspruch 1, worin die Sequenz
(pro-asn-ala-asn) mindestens 23 mal hintereinander
wiederholt ist.
5. Das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die
Aminosäuresequenz einem Epitop des CS-Proteins eines
Sporozoiten der Art Plasmodiuin falciparum entspricht.
6. Das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin
das Peptid ein chemisch synthetisiertes Peptid ist.
7. Das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin
das Peptid antigen ist.
8. Ein Impfstoff gegen Malaria umfassend als Wirkstoff
das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen
Träger.
9. Der Impfstoff nach Anspruch 8, worin das Peptid an
ein Trägerprotein adsorbiert oder kovalent angebracht
ist.
10. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 8 und 9
weiterhin umfassend ein physiologisch akzeptables Medium.
11. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin
der Impfstoff gegen P. falciparum Sporozoiten gerichtet
ist.
12. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin
der Wirkstoff mit einem monoclonalen oder polyclonalen
Antikörper gegen ein Sporozoiten-CS-Protein der Art
p. falciparum immunchemisch reaktionsfähig ist.
13. Verwendung des Impfstoffs nach einem der Ansprüche 8
bis 12 zum Herstellen eines Medikaments zum Immunisieren
eines Säugers gegen Malaria.
14. Ein DNA-Fragment umfassend eine
Desoxynucleotid-Sequenz, die für eines der Peptide der
Ansprüche 1 bis 5 codiert.
15. Ein rekombinantes DNA-Molekül umfassend das
DNA-Fragment von Anspruch 14.
16. Das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 15, worin
das DNA-Fragment in einen Vektor an einer geeigneten
Stelle zur Expression der codierenden Sequenz, entweder
direkt oder als Fusionsprotein, eingefügt ist.
17. Ein durch das rekombinante DNA-Molekül nach einem der
Ansprüche 15 und 16 transformierter Mikroorganismus.
18. Der Mikroorganismus nach Anspruch 17, der E. coli
ist.
19. Ein Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen
CS-Antigen von P. falciparum Sporozoiten, wobei das
Verfahren die Immunisierung eines Wirts unter Verwendung
des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt, wobei
der Wirt nur als Quelle zum Erhalten der Antikörper
verwendet wird.
20. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zum
Neutralisieren der Infektiosität von P. falciparum
Sporozoiten umfassend eine Peptid nach einem der Ansprüche
1 bis 7, gekoppelt an einen Träger.
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