JPH07106157B2 - ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター - Google Patents

ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター

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JPH07106157B2 JP3056714A JP5671491A JPH07106157B2 JP H07106157 B2 JPH07106157 B2 JP H07106157B2 JP 3056714 A JP3056714 A JP 3056714A JP 5671491 A JP5671491 A JP 5671491A JP H07106157 B2 JPH07106157 B2 JP H07106157B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｅ．コリー分泌型突然
変異体からヒルジン誘導体を得る方法並びにＮ−末端ア
ミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを
有するヒルジン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒルジンは、６５のアミノ酸を有するポ
リペプチドであり、ヒル（Ｈirudomedicinalis）から単
離された。これは、トロンビンに対する高特異的な抑制
剤としての作用をし、この際、これはトロンビンと安定
な錯体を形成し、従って、多くの治療的使用可能性、殊
に、抗凝血治療のための用途を有する（ Ｆ. Ｍarkqua
rdt， Ｂiomed． Ｂiochem. Ａcta ４４（１９８
５）、１００７〜１０１３参照）。
【０００３】ヒルジンの完全なアミノ酸配列の開示
（Ｊ．Ｄodt 等によるＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ １６
５（２）、（１９８４）、１８０〜１８４）の後に、組
換えＤＮＡ−技術及び微生物中での表現によるヒルジン
の製造に関する前提が示された。
【０００４】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１５８５６４号
（Ｔransgene）明細書は、宿主細胞殊にバクテリア細胞
内でのヒルジン又はヒルジン類縁体の表現のためのクロ
ーニングベクターを開示している。ここでは、ヒルジン
に関してコードする遺伝子が、ヒルからのｍＲＮＡから
出発してｃＤＮＡ−合成により得られる。殊に、Ｎ−末
端配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有す
るヒルジン誘導体並びにその取得法が記載されている。
【０００５】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１６８３４２号
（Ｃiba Ｇeigy）明細書中には、ヒルジンの天然アミ
ノ酸配列に関してコードするＤＮＡ−配列が開示されて
おり、ここでＮ−末端アミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ｖａｌ
−Ｔｈｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐである。ヒルジンの表現は、
微生物Ｅ．コリー及びサッカロミセス・セレヴィジアエ
（Ｓaccharomyces Ｃerevisiae）の細胞内で起こる。
【０００６】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１７１０２４号
（Ｈoechst ＡＧ）明細書中には、殊にＥ．コリー細胞
内でのヒルジン活性を有するポリペプチドの遺伝子技術
による製法が開示されており、これによれば、細胞を溶
解させ、その細胞抽出物からヒルジン活性を有するポリ
ペプチドを取得する。場合により存在する融合蛋白質分
は、蛋白質分解又は化学的分解により分離除去でき、遊
離されたヒルジン分子を精製することができる。
【０００７】西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第３
４４５５７１号（ＧＥＮ−ＢＩＯ−ＴＥＣ）の目的は、
ヒルジンの生物学的活性を有する蛋白質に関してコード
するＤＮＡ−配列並びに適当な組換えベクターで形質転
換されているようなＥ．コリー細胞からの細胞のリシス
（Ｌysis）による蛋白質の取得法である。
【０００８】ベルクマン（Ｂergmann）等による論文
（Ｂiol. Ｃhem. Ｈoppe Ｓeyler ３６７（１９８
６）、７３１〜７４０頁）にも、Ｅ．コリー中でのヒル
ジン合成が記載されている。この細胞からのヒルジンの
遊離を、トルオールでの処理により行なっており、この
際、細胞のＡ578単位約５００ｎｇ／ｌの僅かな収量の
みが達成される。
【０００９】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第２００６５５号
（Ｔransgene）、同第２５２８５４号（Ｔransgene）及
び同第２２５６３３号（Ｃiba Ｇeigy）明細書には、
分泌により真核性宿主微生物殊に酵母からヒルジン活性
を有する蛋白質を取得することが開示されており、ここ
では、構造遺伝子の上流に１個の信号ペプチドを有する
ＤＮＡ−配列を有するベクター上での表現を行なってい
る。酵母中のＮ−末端配列Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ並びにＮ−末端配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体の分泌が開
示されている。この際、１００ｍｇ／ｌまでの収量が示
されている。
【００１０】西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第３
９００６２６号（Ｈoechst ＡＧ）明細書中には、Ｎ−
末端配列Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有
するヒルジン誘導体が記載されている。この表現は、有
利に、酵母中で認められ、この際、酵母−フェロモン遺
伝子ＭＦαのプロモータ及び信号配列がヒルジン誘導体
の表現及び分泌のために使用される。
【００１１】しかしながら、前記の全てのヒルジン誘導
体の製法は欠点を有する。例えば宿主微生物として酵母
を使用し、培地中でのヒルジンの分泌を用いる際に、比
較的高い収量が得られるが、酵母細胞の培養は、細菌例
えばＥ．コリーのそれよりも時間がかかり、困難が多
い。これに反して、Ｅ．コリー細胞中では、収量が比較
的僅かでかつ／又は細胞の溶解時に複雑な単離法が必要
である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、細胞の溶解を必要としない方法で、バクテリア細胞
から高収量でヒルジン誘導体を取得することのできる簡
単な方法を開発することであった。
【００１３】
【課題を解決する手段】本発明の目的は、Ｅ．コリー分
泌型突然変異体からヒルジン誘導体を得る方法であり、
この方法は、 （１） バクテリア信号ペプチドをコードするＤＮＡ−
フラグメントの後にヒルジン誘導体に関してコードする
遺伝子を有する組換えベクターを形成し、 （２） 工程（１）で形成された組換えベクターを用い
てＥ．コリー分泌型突然変異体を形質転換させ、 （３） この形質転換された細胞を培地中で培養し、 （４） この培地からヒルジン誘導体を取得することよ
り成る。
【００１４】本発明によるヒルジン誘導体とは、ヒルか
ら誘導され、トロンビン抑制剤としての作用をし、最低
１００００ＡＴ−Ｕ（抗トロンビン単位）／ｍｇの特異
活性を有する蛋白質（ Ｄodt 等の Ｂiol. Ｃhem. Ｈ
oppe Ｓeyler，３６６（１９８５）、３７９〜３８５
頁）である。ヒルジン誘導体の概念には、約５０のアミ
ノ酸の長さのＮ−末端融合分を有し、蛋白質分解又は化
学的分解により部分的に又は完全に除去できる融合蛋白
質をも包含し、この際、分解生成物として最低１０００
０ＴＡ−Ｕ／ｍｇの特異活性を有するヒルジン誘導体が
生じる。
【００１５】有利に、本発明の方法により、次のＮ−末
端アミノ酸配列を有するヒルジン誘導体が得られる： Ｚ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ ［ここでＺはＡｌａである遺伝子コード化可能なアミノ
酸を表わす］。
【００１６】ｍが０より大きい場合には、配列Ｘは特に
その末端に蛋白質分解又は化学的分解−位置を有するこ
とが有利である。例えば、配列Ｘの最後のアミノ酸がＡ
ｒｇ−基である場合は、融合配列Ｘは、典型的な消化
（Ａｒｇへの分解）により、離脱させ、活性のヒルジン
誘導体を精製することができる。しかしながら、融合分
の離脱は、同様に、他の公知の蛋白質分解酵素又は化学
的分解試薬によって実施することができる。例えば、Ｘ
のアミノ酸配列が末端にＭｅｔ−基を有する場合は、シ
アン化ハロゲン分解（ Ｅ. Ｇross 及び Ｂ. Ｗittko
p 、 Ｊ. Ａm. Ｃhem. Ｓoc．８２（１９６１）、１５１
０〜１５１７）により、融合蛋白質を分解することがで
きる。例えば、ＸのＣ−末端アミノ酸配列が、アミノ酸
配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含有する場合
は、因子Ｘａを用いる分解を行なうことができる（欧州
特許ＥＰ−Ａ第２５１９０号及び同第１６１９７３号参
照）。
【００１７】本発明の方法では、ｍが０で、ＺがＡｌａ
であるヒルジン誘導体が最も有利である。
【００１８】従って、本発明の目的物の１つは、Ｎ−末
端配列Ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ここでＡ
はＡｌａを表わす）を有するヒルジン誘導体である。こ
のヒルジン誘導体から、Ｅ．コリー分泌型突然変異体の
培養上澄み中に、意想外にも、２ｇ／ｌ（培地）より多
い活性ヒルジンを得ることができた。
【００１９】本発明方法のもう１つの利点は、細胞培地
内へのヒルジン誘導体の分泌により、ヒルジンのジサル
ファイド橋が、培地の酸化条件下に正当に形成されるこ
とである。
【００２０】本発明におけるＥ．コリー分泌型突然変異
体とは、培地中で、多量の蛋白質分泌を示すＥ．コリー
菌株である。この分泌型突然変異体の製法は、欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第３３８４１０号明細書中に開示されてい
る。適当なＥ．コリー分泌型突然変異体の取得時には、
殊にＥ．コリーＤＳ４１０（ＤＳＭ４５１３）又はＥ．
コリーＢＷ７２６１（ＤＳＭ５２３１）から出発するこ
とができる。それぞれのＥ．コリー菌株を、まず、分泌
可能な蛋白質に関してコードするＤＮＡ−配列を含有す
るプラスミドを用いて形質転換させる。引続きこの形質
転換されたＥ．コリー菌株をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いる処理により突然変異
生成を行なわせる。次いで、適当な分泌型突然変異菌株
の選択を行なう。分泌可能な蛋白質として例えばα−シ
クロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを使用
すると、分泌型突然変異体は、細胞壁活性物質Ｄ−サイ
クロセリンに対する耐性により認識できる。更に、α−
サイクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ
（ＣＧＴアーゼ）の分泌は、周囲の培地（これはアミロ
ペクチン−アズール−培地の使用の際に、分泌型突然変
異体に関する付加的な選択可能性を与える）中のデンプ
ンを加水分解する作用をする。
【００２１】本発明のための組換えベクターとしては、
Ｅ．コリーゲノム中に集積できるベクター（例えばバク
テリオファージλ）又は形質転換されたＥ．コリー細胞
内に染色体外で存在するベクター（例えばプラスミド）
が好適である。プラスミドを使用するのが有利である。
【００２２】信号蛋白質及びヒルジン−誘導体より成る
蛋白質に関してコードする組換えベクター上のこの遺伝
子構成は、有利に、誘導可能なプロモータ特にｔｒｐ−
ｌａｃ−融合プロモータ（これは、ラクトース−又はイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−
添加により誘導可能である）の制御（Ｋontrolle）下に
存在する。このベクター上には、更に、選択マーカー遺
伝子及び場合によりｌａｃ−リプレッサー遺伝子が存在
する。
【００２３】ヒルジン誘導体の分泌を可能とするバクテ
リア信号配列としては、原則的に、Ｅ．コリー細胞の膜
の侵入を許容する全ての周知信号蛋白質が好適である。
従って、グラム陰性菌からの信号蛋白質、例えば次の
Ｅ．コリーの蛋白質の信号蛋白質を使用するのも有利で
ある：細胞膜外蛋白質ＯｍｐＡ（ＤiＲienzo 等の１９
７８、Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．４７，４８１〜５３
２）、アルカリホスファターゼＰｈｏＡ（Ｉnouye 等の
１９８２、Ｊ. Ｂacteriol． １４９，４３４〜４３
９）、ＬａｍＢ−蛋白質（Ｈedgpeth 等の１９８０、Ｐ
roc. Ｎat. Ａcad. Ｓci.ＵＳＡ ７７，２６２１〜２
６２５）、マルトース結合蛋白質Ｍａ１Ｅ（Ｂedouelle
Ｈ. 等の１９８０、Ｎature ２８５：７８〜８１）。
【００２４】特にα−ＣＧＴアーゼ−信号蛋白質を使用
するのが有利である。
【００２５】本発明の方法に好適なベクターは、例えば
プラスミドｐＣＭ７０５（図１参照）であり、これは、
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第３８３４１０号明細書に記載の
プラスミドｐＣＭ７０３から、約１ｋｂの長さのＮｒｕ
Ｉ−フラグメントの除去により入手される。このベクタ
ーは、アンピシリン−耐性遺伝子、ｌａｃ−リプレッサ
ーに関する遺伝子及び信号蛋白質に関してコードする断
片を５′−末端に有するＣＧＴアーゼ−遺伝子を有す
る。ヒルジン誘導体に関してコードする遺伝子は、ベク
ターｐＣＭ７０５内に集めると、細胞内で、そのＮ−末
端にα−ＣＧＴアーゼの信号蛋白質を有する先駆分子が
生じる。この遺伝子構造は、ｔａｃ−プロモーターの制
御下にある。この方法で得られるプラスミドを用いて、
Ｅ．コリー分泌型突然変異体が形質転換されうる。
【００２６】ポジチブに形質転換されたクローンを振動
フラスコ中又は培養器中で培養する。約１の光学密度
（ＯＤ600）の達成時にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド）又はラクトースによる誘導を行
なう。
【００２７】次いで、トロンビン−不活性化試験（Ｇri
esbach 等のＴhrombosis Ｒesearch３７、（１９８
５）、３４７〜３５０）を用いて、ヒルジン誘導体の生
産の経過を測定する。融合蛋白質の蓄積をＨＰＬＣ−ク
ロマトグラフィ（逆相）により分析する。融合蛋白質の
プレ分（Ｐraeanteil）は、分解することができ、生じ
る活性ヒルジン誘導体を精製することができる。
【００２８】
【実施例】次の実施例につき、図１〜図５を用いて本発
明を詳説する。
【００２９】図面は次のものを示している： 図１ プラスミドｐＣＭ７０５ 図２ ｐＫ１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤＮＡ
−配列 図３ オリゴヌクレオチドＨＩＲ１、ＨＩＲ２及びＨ
ＩＲ３の配列 図４ プラスミドｐＣＭ７０５１ 図５ プラスミドｐＣＭ７０５３ 例 １ 分泌ベクターの形成 プラスミドｐＫ１５２は、その配列が欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第０１７１０２４号明細書中に記載されている合成
ヒルジン遺伝子を有する。このプラスミドから出発し
て、アガロース−ゲル電気泳動により、約２００ｂｐの
大きさのＨｉｎｆＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ−プラ
グメント（これはヒルジンに関してコードするＤＮＡ配
列の大部分を有する）（図２）を単離した。欠失５′−
末端配列を、新合成オリゴヌクレオチド（ＨＩＲ１）に
より再生させる。このオリゴヌクレオチドのこのコード
する配列は図３中に示されている。Ｈｉｎｆ Ｉ−末端
の融合により、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体が生じる。
【００３０】プラスミドｐＣＭ７０５（図１）をＰｓｔ
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて切断する。双方の切
断位置は、ＣＧＴアーゼの遺伝子に関するコード化範囲
内にあり、これにより、約１ｋｂの大きさのＤＮＡ−片
が切り出される。Ｐｓｔ Ｉは、信号ペプチダーゼ切断
位置に関してコードする範囲内で正確に切断する。
【００３１】フラグメントｐＣＭ７０５ Ｐｓｔ Ｉ−
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ６．３ｋｂ、ｐＫ１５２ Ｈｉｎｆ
Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ０．２ｋｂ及びオリゴヌクレ
オチドＨＩＲ１は相互に連結され、これにより、プラス
ミドｐＣＭ７０５１が生じる（図４）。この連結バッチ
を用いて、Ｅ．コリー菌株ＨＢ１０１（ＤＳＭ１６０
７）を形質転換させる。アミロペクチンアズール（着色
されたアミロペクチン）を有する選択培地上でデンプン
分解暈を示さず、従ってα−ＣＧＴアーゼ−表現を示さ
ないコロニーを単離し、単一になるまで精製する。多数
の精製されたクローンから、プラスミド−ＤＮＡを単離
し、制限分析により特徴付ける。ヒルジン−インサート
を有する２個のプラスミドで、融合領域の配列分析を実
施する。
【００３２】正確なヒルジン−遺伝子構造を有するプラ
スミド−ＤＮＡを、Ｎｒｕ Ｉ及びＮｄｅ Ｉを用いて
切断し、アガロースゲル電気泳動により５．１８ｋｂの
大きさのフラグメントを単離する。
【００３３】Ｎｄｅ Ｉ切断により突出する配列のクレ
ノフ−酵素での充填の後に、このフラグメントをリゲー
ションにより環状化させる。生じたプラスミドをｐＣＭ
７０５３と称する（図５）。
【００３４】このプラスミドｐＣＭ７０５３を用いて、
分泌型突然変異体Ｅ．コリーＷＣＭ１００（これは、欧
州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記載の方法
で得られた）を形質転換させる。
【００３５】 例 ２ 振動フラスコ実験でのヒルジンの分泌の試験 アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−培地１
０ｍｌに、ＷＣＭ１００ｐＣＭ７０５３の新製１晩培養
物を光学密度ＯＤ420＝０．１まで接種した。この培養
物を３０℃で振動させる。光学密度ＯＤ420＝１．０に
達したら直ちに、インダクターラクトースを１％の最終
濃度まで添加する。４８時間後に、培養物から試料を取
り出し、細胞を遠心分離し、上澄み中のヒルジン濃度を
測定する。この測定は、トロンビン失活試験を用いて行
なう。４０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌ（抗トロンビン単位）ま
での収量が測定された（∧２５０ｍｇ／ｌ）。
【００３６】 例 ３ １０ｌ醗酵槽内でのヒルジン生産 アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するミニマル培地
（Ｍinimalmedium）７ｌに、ＷＣＭ１００ｐＣＭ７０５
３の新製１晩培養物を、光学密度ＯＤ600＝０．１にな
るまで接種する。
【００３７】 醗酵条件は次のとおりである： 温度 ：３０℃ 撹拌速度：４５０〜９５０ｒ．ｐ．ｍ． 通気 ：０．５〜１．５Ｖｖｍ ｐＨ値 ：７．０±０．１ 光学密度ＯＤ600＝１．０の達成時に、ＩＰＴＧ（イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）０．５ｍＭを添
加する。
【００３８】ＩＰＴＧ添加後４０時間に、上澄み中で３
６０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定できた（∧２．２５ｇ／
ｌ）。
【００３９】例 ４（参考例） Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジンの分泌 例１と同様に実施するが、オリゴヌクレオチドＨＩＲ１
の代りにオリゴヌクレオチドＨＩＲ２（図３）を用いる
と、信号ペプチドの離脱の後に、Ｎ−末端配列Ａｌａ−
Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｐを有するヒルジン融合蛋白質が得られる。上澄み中
でのこの融合蛋白質の蓄積を、逆相条件の使用下（Ｃ
１８−クロマトグラフィカラム）でＨＰＬＣ−分析によ
り測定する。この遺伝子構造を有する菌株ＷＣＭ１００
の醗酵は、融合蛋白質２５ｍｇ／ｌの収量をもたらし
た。
【００４０】トリプシン−分解により、Ｎ−末端配列Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有する活性ヒ
ルジンを得ることができる。
【００４１】 例 ５ 分泌型突然変異体ＷＣＭ８８を用いるヒルジンの分泌 同様に欧州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記
載の方法で得られた分泌型突然変異体ＷＣＭ８８を、プ
ラスミドｐＣＭ７０５３を用いて形質転換させる（例１
参照）。培地中での分泌によるヒルジンの生産を、振動
フラスコ実験及び醗酵により試験する。
【００４２】 ａ） 振動フラスコ実験 例２と同様に、菌株ＷＣＭ８８ｐＣＭ７０５３を培養す
る。４８時間後に、培養液の上澄み中のヒルジン濃度を
測定する。１８００ＡＴ−Ｕ／ｍｌまでの収量が得られ
た（∧１１０ｍｇ／ｌ）。
【００４３】 ｂ） １０ｌ醗酵槽内での生産 例３の記載と同様に、菌株の醗酵を行なう。ＩＰＴＧの
添加４５時間後に、上澄み中で２１０００ＡＴ−Ｕ／ｍ
ｌが測定できた（∧１．３ｇ／ｌ）。
【００４４】 例 ６ テトラサイクリン耐性遺伝子を有する分泌ベクターの形
成 プラスミドｐＢＲ３２２（Ｆ. Ｂoliver 等の Ｇene
２、９５〜１１３（１９７７））の１．１ｋｂ Ｎｒｕ
Ｉ−フラグメンを単離し、Ｎｒｕ Ｉ−分解により線
状化されたプラスミドｐＣＭ７０５１（図４参照）と連
結させた。この連結混合物を用いてＥ．コリーＨＢ１０
１を形質転換させた。形質転換物をそのテトラサイクリ
ン耐性に基づき選択した。選択されたクローンのプラス
ミド−ＤＮＡを再単離し、Ｎｄｅ Ｉ及びＡｖａ Ｉを
用いて切断した。ＤＮＡ−フラグメントをアガロースゲ
ル−電気泳動で分離した。大きいフラグメントを単離
し、突出１本鎖にクレノフ酵素を充填し、連結させた。
【００４５】生成プラスミドはｐＣＭＴ２０３であっ
た。
【００４６】 例 ７ 分泌ベクターｐＣＭＴ２０３の使用下でのヒルジンの分
泌 分泌型突然変異体ＷＣＭ１００（例１参照）を、プラス
ミドｐＣＭＴ２０３を用いて形質転換させた。生じる菌
株を１０ｌ醗酵槽内で培養した。ＩＰＴＧ添加の４５時
間後に、ヒルジン４２０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定され
る（∧２．６３ｇ／ｌ）。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＣＭ７０５を示す図
【図２】ｐＫ１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤＮＡ
−配列を示す図
【図３】オリゴヌクレオチドＨＩＲ１、ＨＩＲ２及びＨ
ＩＲ３の配列を示す図
【図４】プラスミドｐＣＭ７０５１を示す図
【図５】プラスミドｐＣＭ７０５３を示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 平２−35077（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開352228（ＥＰ，Ａ) 欧州特許出願公開356335（ＥＰ，Ａ) ＦＥＢＳ ＬＥＴ．，ＶＯＬ．202，Ｎ Ｏ．２，Ｐ．373−377（1986)

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｎ−末端配列： Ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ 〔ここで、ＡはＡｌａである〕を有することを特徴とす
    る、ヒルジン誘導体。
  2. 【請求項２】 培地中で多量の蛋白質−分泌を示すＥ．
    コリー菌株から請求項１に記載のヒルジン誘導体を取得
    する方法において、 （１）バクテリア信号ペプチドに関してコードするＤＮ
    Ａ−フラグメントの直後に請求項１に記載のヒルジン誘
    導体に関してコードする遺伝子を有する組換えベクター
    を形成し、 （２）工程（１）で形成された組換えベクターを用い
    て、培地中で多量の蛋白質−分泌を示すＥ．コリー菌株
    を形質転換させ、 （３）この形質転換された細胞を培地中で培養し、 （４）この培地からヒルジン誘導体を取得することを特
    徴とする、Ｅ．コリー菌株から請求項１に記載のヒルジ
    ン誘導体を取得する方法。
  3. 【請求項３】 組換えＤＮＡにおいて、これは、請求項
    １のヒルジン誘導体に関してコードすることを特徴とす
    る、組換えＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 組換えベクターにおいて、これは、バク
    テリア信号ペプチド及び請求項１のヒルジン誘導体より
    なる蛋白質に関してコードする遺伝子構造のコピー１以
    上を有することを特徴とする、組換えベクター。
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