DE10033195A1 - Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP - Google Patents
Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAPInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft bifunktionale Fusionsproteine, die Hirudin oder eine Variante von Hirudin und TAP (Tick Anticoagulant Peptide) oder eine Variante von TAP enthalten, die Herstellung und Verwendung der bifunktionalen Fusionsproteine sowie Arzneimittel, die diese bifunktionalen Fusionsproteine enthalten.
Description
Die Erfindung betrifft bifunktionale Fusionsproteine, die Hirudin oder eine Variante
von Hirudin und TAP (Tick Anticoagulant Peptide) oder eine Variante von TAP
enthalten, die Herstellung und Verwendung der bifunktionalen Fusionsproteine
sowie Arzneimittel, die diese bifunktionalen Fusionsproteine enthalten.
Die Komplexizität des humanen Blutgerinnungssystemes bedingt die Einbeziehung
einer Vielzahl von Blutgerinnungsfaktoren. Diese können Proteinfamilien
entstammen, deren Mitglieder gemeinsame strukturelle Eigenschaften aufweisen,
andererseits aber aufgrund während der Evolution entwickelter geringfügiger
struktureller Änderungen durch spezifische Wechselwirkung mit jeweils einer
anderen Zielstruktur spezifisch wirken. Aufgrund der strukturellen Verwandtschaft
der Mitglieder dieser Proteinfamilien und der während der Evolution entwickelten
Spezifität ist es sehr schwierig, chemisch synthetisierte Moleküle zu finden, die
einerseits hochspezifisch mit einem der Mitglieder interagieren anderseits aber mit
den anderen Mitgliedern der Familie nicht interagieren, so daß bei therapeutischer
Anwendung das Risiko von Nebenwirkungen minimiert ist.
Blutsaugende Parasiten verfügen über hunderte von Millionen von Jahren
Evolution entwickelte Peptide, die spezifische mit Blutgerinnungsfaktoren
wechselwirkend und dadurch den Wirt nur wenig schädigen. Dabei wurden
während der Evolution Wirt-Parasit spezifische Mechanismen der
Gerinnungshemmung entwickelt.
Blutegel vom Typ Hirudo entwickelten z. B. verschiedene Isoformen des
Thrombinhibitors Hirudin. Durch künstliche Variation des Moleküls, z. B.
Austausch der N-terminalen Aminosäure, wurde Hirudin für pharmazeutisch
technische Anforderungen optimiert (z. B. EP 0 324 712).
Andere Blutegel wie z. B. Hementeria gigantii entwickelten Proteine die Blutgerinsel
auflösen und ähnlich dem humanen tPA (Tissue Plasminogen Activator) wirken.
Tuszynski et al. (J. of Biol. Chem. (1987), 262, 9718-9723) beschreiben ein ca.
17000 dt großes Protein, das aus dem mexikanischen Blutegel isoliert werden kann
und ein Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa ist.
Auch Zecken haben Thrombininhibitoren entwickelt. EP 0 345 616 beschreibt ein
Protein Amblyommin, welches aus afrikanischen Schildzecken isoliert werden kann.
Amblyommin inhibiert Thrombin, obwohl es eine von Hirudin verschiedene
Primärstruktur hat.
Dies zeigt, daß bei gleichem Zielprotein dennoch verschiedene inhibitorische
Proteine, die eine ähnliche Wirkung haben, während der Evolution entwickelt
wurden. Weichzecken wie Ornithodoros moubata, haben Inhibitoren des
Blutgerinnungsfaktors Xa entwickelt. Das Polypeptid TAP (Tick Anticoagulant
Peptide) (Waxman L. et al. (Science 248pp. 595-596; 1990) hemmt spezifisch den
Blutgerinnungsfaktor Xa, der inaktives Prothrombin in aktives Thrombin umwandelt.
US 5,239,058 und US 5,328,997 beschreiben TAP und dessen Herstellung.
Diese Beispiele zeigen, daß verschiedene Stufen der Blutgerinnnungskaskade
(verschiedene Blutgerinnungsfaktoren) als Ziel der Gerinnungshemmung während
der Evolution entwickelt wurden und der Mechanismus der Hemmung spezifisch
von einzelnen Tierspezies je nach den individuellen Lebensumständen optimiert
wurde.
Von großem pharmazeutischen Interesse sind Proteine, die die Eigenschaften von
verschiedenen dieser Inhibitoren miteinander kombinieren, so daß synthetische
bifunktionale Proteine entstehen.
Seno et. al. (FEBS Letters 199, pp. 187-192 1986) und EP 0 288 809 beschreiben
das Prinzip synthetischer bifunktioneller (bifunktionaler) Proteine. Grundlage für
diese Proteine sind Polypeptide, die immunologisch wirksam sind und der Gruppe
der Lymphokine und Interferone entstammen. EP 0 227 938 beschreibt für die
Konstruktion von Fusionsproteinen die Verwendung einer Faktor Xa-Spaltstelle
als Bindeglied zwischen Interleukin-2 und einem zweiten Teilprotein, das
vorzugsweise Proinsulin oder Hirudin ist. Über die Faktor Xa-Spaltstelle kann das
Protein von Interesse abgetrennt werden. Im Fusionsprotein weist Interleukin-2 keine
Interleukin-2 Aktivität auf.
EP 0 502 968 beschreibt eiweißartige Plasminogenanaloga, die durch ein an der
Blutgerinnung beteiligtes Enzym, wie z. B. Faktor Xa spaltbar sind, wodurch eine
Verbindung mit Plasmin-Aktivität gebildet wird. Zunächst werden inaktive
Fusionsproteine, bestehend z. B. aus Hirudin und Streptokinase über diese
Spaltstelle fusioniert und nach Injektion in das Blutkreislaufsystem durch Enzyme
der Gerinnungskaskade, z. B. durch den Faktor Xa gespalten, wodurch die jeweils
aktive Form des Teilproteins, z. B. Hirudin und Streptokinase (Hemmung der
Blutgerinselbildung durch Hirudin und Fibrinolyse durch Streptokinase) gebildet
werden. Die Fusionsproteine wirken als "Prodrug"; d. h. sie müssen erst durch
Spaltung in ihre aktive Form überführt werden. Als Prodrug sind sie nicht oder nur in
geringem Maße aktiv. Das hat unter anderem den Nachteil, daß z. B. im Fall einer
massiven Verletzung, wie z. B. der Bildung von Thromben nach einer Operation,
diese Fusionsproteine nicht sofort - sondern erst nach Aktivierung bzw. Spaltung -
und auch nicht in so ausreichendem Maße wirken, daß die Gefahr der
Blutgerinselbildung unterdrückt wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein bifunktionales Fusionsprotein
herzustellen, wobei beide Teilproteine bereits im Fusionsprotein aktiv sind und wobei
beide Teilproteine die Blutgerinnung hemmen.
Gegenstand der Erfindung ist ein bifunktionales Fusionsprotein, daß Hirudin oder
eine Variante von Hirudin und TAP oder eine Variante von TAP enthält.
Überraschend wurde gefunden, daß mit Hirudin und dem aus Weichzecken
isolierten Faktor Xa - Inhibitorpeptid Tick Anticoagulant Peptide (nachfolgend TAP)
Fusionsproteine gebildet werden können, die bifunktional aktiv sind, d. h. beide
Teilproteine des bifunktionalen Fusionsproteins - Hirudin und TAP - sind bereits
ohne vorherige enzymatische Aktivierung bzw. Spaltung aktiv.
Da beide Funktionen - einerseits Hirudin oder eine Variante von Hirudin und
andererseits TAP oder eine Variante von TAP - bereits im Fusionsprotein aktiv sind,
ist eine Spaltung in die Teilproteine - d. h. in Hirudin oder eine Variante von Hirudin
einerseits und TAP oder eine Variante von TAP andererseits - für die Aktivität der
Teilproteine keine notwendige Voraussetzung.
Vorzugsweise ist in diesen synthetischen bifunktionalen Fusionsproteinen jede
einzelne Eigenschaft bzw. Funktion vergleichbar effizient zu der des jeweiligen
Ausgangsproteins. Für eine pharmazeutische Anwendung brauchen die Teilproteine
dann nicht getrennt oder als Mischung dargereicht zu werden. Die bifunktionalen
Proteine haben verbesserte Halbwertszeiten, so daß von jedem Teilprotein weniger
appliziert werden muß, als bei einzelner Darreichung. Ein Vorteil ist, daß dadurch
das Blutungsrisiko verringert werden kann.
Darüber hinaus interagieren die beiden Teilproteine mit verschiedenen Zielen der
Blutgerinnungskaskade. Dies hat den Vorteil, daß in akuten Situationen gleichzeitig
durch Hirudin (welches Thrombin inhibiert), die Gerinselbildung gehemmt und durch
TAP die Neubildung von Thrombin aus Prothrombin, die über die enzymatische
Aktivität des Faktor Xa abläuft, verhindert wird. Dadurch wird die antithrombotische
Wirkung verlängert und verstärkt.
Die Erfindung beinhaltet die Verwendung von Hirudin und Hirudin Varianten in dem
bifunktionalen Fusionsprotein. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung wird
eine der natürlichen Isoformen des Hirudins (die natürlichen Isoformen werden
zusammen als "Hirudin" bezeichnet) verwendet. Eine natürliche Isoform ist z. B. Val-
Val-Hirudin. In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird eine Variante einer
natürlichen Hirudin Isoform eingesetzt. Eine Variante leitet sich von einer natürlichen
Isoform des Hirudins ab, enthält aber z. B. zusätzliche Aminosäuren und/oder
Aminosäuredeletionen und/oder Aminosäureaustausche im Vergleich zu der
natürlichen Isoform. Eine Variante von Hirudin kann alternierend Peptidabschnitte
natürlicher Isoformen des Hirudins und neue Aminosäuren enthalten. Beispielsweise
kann eine Variante von Hirudin eine natürliche Sequenz von bis zu 15 Aminosäuren
mit einer kurzen, vorzugsweise 6-20 Aminosäure langen neuen Sequenz
verknüpfen, vorzugsweise kann dadurch eine Hirudin-Variante erzeugt werden, die
keine Disulfidbrücken enthält. Varianten des Hirudins sind bekannt und z. B. in
DE 34 30 556 beschrieben. Eine besondere Ausführungsform betrifft die Hirudin-Variante
Refludan (Leu-Hirudin, auch bezeichnet als [Leu1,The2]-63-Desulfatohirudin bzw.
Lepirudin; beschrieben in EP-B 0 324 12 Sequenz Nummer 4; SEQ ID NO. 15). Eine
weitere besondere Ausführungsform betrifft Hirudin-Varianten mit verzögerter
Wirkung (z. B. PEG-Hirudin, beschrieben in EP 0 345 616). Eine besondere
Ausführungsform betrifft Hirudin und Hirudin-Varianten, die gegenüber den
natürlichen Isoformen oder Varianten am N-Terminus und/oder C-Terminus verkürzt
sind. Vorzugsweise hat eine Hirudin-Variante 80% oder mehr Homologie
(Aminosäureidentität) zu einer natürlichen Isoform des Hirudins.
In analoger Weise können Isoformen und Varianten von TAP verwendet werden.
In besonderen Ausführungsformen wird eine natürliche Isoform von TAP (natürliche
Isoformen werden zusammen als "TAP" bezeichnet) verwendet z. B. TAP gemäß
SEQ ID NO. 17 oder Waxman (Waxman et al. (1990) Science 248, 595-596). In
anderen Ausführungsformen der Erfindung wird eine Variante von TAP verwendet.
Eine Variante von TAP leitet sich von einer natürlichen Isoform des TAPs ab
vorzugsweise von SEQ ID NO. 17, enthält aber z. B. zusätzliche Aminosäuren
und/oder Aminosäuredeletionen und/oder Aminosäureaustausch (Mutationen) im
Vergleich zur natürlichen Isoform. Eine besondere Ausführungsform betrifft TAP
Varianten, die gegenüber der natürlichen Isoform oder TAP Varianten, vorzugsweise
gegenüber SEQ ID NO. 17, am N-Terminus und/oder C-Terminus verkürzt sind.
Vorzugsweise hat eine TAP-Variante 80%, besonders bevorzugt 90% oder mehr
Homologie (Aminosäureidentität) zu einer natürlichen Isoform des TAPs,
vorzugsweise zu SEQ ID NO. 17.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein bifunktionales
Fusionsprotein, bei dem die Teilproteine über einen Spacer miteinander verbunden
sind. Dieser Spacer besteht vorzugsweise aus 1 oder mehreren Aminosäuren,
vorzugsweise maximal 10 Aminosäuren. Beispiele für Spacer sind: -Asp-Pro- und
-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein bifunktionales Protein, bei
dem die beiden Teilproteine über eine Faktor Xa-Spaltstelle verknüpft sind. Dies
hat den Vorteil, daß Spuren von nicht inaktiviertem Faktor Xa eine zusätzliche
Spaltstelle als Substrat in Konkurrenz zu der natürlich vorhanden Spaltstelle im
Prothrombin angeboten wird. Durch diese Substratinhibition wird ein weiterer
vorteilhafter Begleiteffekt erzielt. Überraschenderweise werden dabei weder die
Hirudinwirkung noch die TAP-Wirkung beeinträchtigt.
Besondere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Fusionsproteine
- - Hir1-63TAP2-60 (Aminosäuren 1-63 des Hirudins gemäß SEQ. ID. NO. 15, Aminosäuren 2-60 des TAPs gemäß SEQ ID NO. 17) Teile der Sequenz sind in Fig. 1 (SEQ ID NO. 7) gezeigt;
- - Hir1-65-AspPro-TAP1-60 (Fusionsproteine enthaltend Aminosäuren 1-65 des Hirudins gemäß SEQ ID NO. 15, einen Spacer (Asp, Pro) und die Aminosäuren 1-60 aus TAP gemäß SEQ ID NO. 17);
- - Hir1-63-Ala Ile Glu Gly Arg-TAP1-60(Gly 34) (Aminosäuren 1-63 aus Hirudin gemäß SEQ ID NO. 15, einen Spacer, (-Ala Ile Glu Gly Arg-) mit einer Erkennungsstelle für Faktor Xa Protease; Aminosäuren 1-60 aus TAP gemäß SEQ ID NO. 17) wobei in Position 34 der TAP-Sequenz ein Glycin (Gly 34) eingeführt ist,
- - Ala-Hir(2-63)-Ala Ile Glu Gly Arg-TAP(1-60) (Aminosäure Ala N-Terminus; Aminosäuren 2-63 des Hirudins gemäß SEQ ID NO. 15, Spacer-Ala Ile Glu Gly Arg-; Aminosäuren 1-60 aus TAP gemäß SEQ ID NO. 17; das Fusionsprotein enthält an Position 34 der TAP-Peptid sequenz ein Glycin).
Gegenstand der Erfindung ist auch ein bifunktionales Fusionsprotein, das eine der
Signalsequenzen SEQ ID NO. 18-27, vorzugsweise SEQ ID NO. 18, SEQ ID
NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 oder SEQ ID NO. 22 enthält (Tabelle 1, DE 19 944 870.1).
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, die für
das bifunktionale Fusionsprotein kodiert. Beispielsweise enthält die DNA eine der
Sequenzen SEQ ID NO. 14 (kodiert für Leu-Hirudin) und/oder SEQ ID NO. 16
(kodiert für TAP) oder Teile dieser Sequenzen. In besonderen Ausführungsformen
der Erfindung, enthält die DNA außerdem eine Sequenz, die für eine der
Signalsequenzen aus Tabelle 1 kodiert.
Vorzugsweise wird das Fusionsprotein durch eine DNA kodiert, die für Hirudin oder
eine Hirudin-Variante und TAP oder eine TAP-Variante kodiert. Die für das
bifunktionale Fusionsprotein kodierende DNA liegt vorzugsweise in einem Plasmid
vor, z. B. dem Plasmid pK152 (EP 0 448 093; Europäische Patentanmeldung Nr.
8 974 322). Das Plasmid pK152 enthält die Sequenz für Hirudin gemäß EP 0 324 712.
Gegenstand der Erfindung ist eine DNA, die für das bifunktionale
Fusionsprotein kodiert sowie ein Plasmid, das diese DNA enthält. Gegenstand der
Erfindung ist auch die Verwendung einer DNA, die für das bibunktionale
Fusionsprotein kodiert und die Verwendung eines Plasmids, das diese DNA enthält.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zelle, eukaryotisch oder prokaryotisch, die
eine DNA, die für das bifunktionale Fusionsprotein kodiert, z. B. vorliegend in einem
Plasmid, enthält.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des bifunktionalen
Fusionsproteins. Vorzugsweise wird das bifunktionale Fusionsprotein durch
heterologe Expression in rekombinanten eukaryotischen Zellen - z. B. Hefe- oder
rekombinanten prokaryotischen Zellen - z. B. E. coli, z. B. E. coli K12 MC 1061
(Sambrock et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) -
hergestellt. Es wurde überraschend gefunden, daß sich ein bifunktionales
Fusionsprotein aus Hirudin und TAP in E. coli exprimieren läßt, wobei hohe
Ausbeuten, vergleichbar der Expression von Lepirudin in Grammmengen in das
Nährmedium abgegeben werden. Dies ist besonders überraschend, da das
bifunktionale Fusionsprotein bis zu 12 für die biologische Funktion wichtige
Cysteinreste enthält. TAP enthält sechs Cysteine, die drei zusätzliche
Cysteinbrücken ausbilden können. Beide funktionalen Gruppen des durch
Expression in E. coli erhaltenen bifunktionalen Fusionsproteins sind biologisch aktiv.
Die funktionale Aktivität kann wie in Beispiel 1 (Bestimmung der Hirudin-Aktivität
nach Grießbach et al.) und Beispiel 2 (Bestimmung der Aktivität von TAP nach der in
EP 0 454 372 beschriebenen Methode) beschrieben, bestimmt werden. Vorteilhaft ist
auch, daß das bifunktionale Fusionsprotein bei der Expression in E. coli ins Medium
ausgeschleust wird, insbesondere, wenn eine der Signalsequenzen aus De 19 944 870.1
verwendet wird.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des bifunktionalen
Fusionsproteins, wobei vorzugsweise die Signalsequenzen, die in DE 199 44 870.1
beschrieben sind, verwendet werden. DE 199 44 870.1 beschreibt Vektoren und
Signalsequenzen, die die Expression und und Sekretion von Hirudin und Hirudin
Varianten sowie des bifunktionalen Fusionsproteins in das Fermentationsmedium
erlauben. EP 0 448 093 beschreibt diesen Prozeß für die Hirudin Variante Ala-
Hirudin (Beispiel 6). Aus dem Medium bzw. Zellüberstand kann das biologisch aktive
bifunktionale Fusionsprotein isoliert werden.
Da das bifunktionale Fusionsprotein im Medium bzw. Zellüberstand gefunden wird,
lassen sich die bifunktionalen Fusionsproteine über kostengünstige und einfache
Verfahren, z. B. gemäß dem in EP 0 549 915 beschriebenen Verfahren, herstellen.
In besonderen Ausführungsformen wird das aufgereinigte bifunktionale
Fusionsprotein anschließend gefriergetrocknet.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein bifunktionales Fusionsprotein, enthaltend
Hirudin oder eine Hirudin-Variante und TAP oder eine TAP Variante, das auch eine
Signalsequenz, vorzugsweise eine in DE 199 44 870.1 beschriebene enthält
(Tabelle 1). Vorzugsweise enthält das Fusionsprotein eine der Signalsequenzen
SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 oder SEQ ID
NO. 22. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der Signalsequenzen aus
DE 199 44 870.1 bzw. Tabelle 1 zur Herstellung des bifunktionalen Fusionsproteins,
wobei die Signalsequenz im Verlauf der Expression durch E. coli abgespalten wird.
Gegenstand der Erfindung sind auch bifunktionale Fusionsproteine, die an einen
Träger gekoppelt sind. Vorzugsweise erfolgt die Kopplung über Hirudin oder die
Hirudin-Variante, beispielsweise wie in EP 0 345 616 beschrieben. Als Träger wird
beispielsweise PEG (Polyethylenglykol) oder Dextran verwendet.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der bifunktionalen Fusionsproteine,
insbesondere als pharmazeutischer Wirkstoff. Die Erfindung betrifft auch Verfahren
zur Herstellung eines Arzneimittels, das das bifunktionale Fusionsprotein enthält;
insbesondere ein Verfahren, wobei zuerst das bifunktionale Fusionsprotein
hergestellt und dieses dann mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger und
gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen gemischt wird. Gegenstand der Erfindung ist
ein Arzneimittel, das ein bifunktionales Fusionsprotein und ggf. weitere Zusatzstoffe
und geeignete pharmazeutische Träger enthält. Insbesondere betrifft die Erfindung
ein Arzneimittel, hergestellt durch Mischung und Gefriertrocknung. Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Arzneimittel für die orale oder nasale Applikation.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Nasal Spray, das das bifunktionale
Fusionsprotein enthält sowie die Verwendung des Nasal Sprays insbesondere für
akute Angina pectoris. Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel, die ein
bifunktionales Fusionsprotein, gebunden an einen Träger, enthalten.
Das bifunktionale Fusionsprotein bzw. ein Arzneimittel, das dieses bifunktionale
Fusionsprotein enthält, kann zur Behandlung und Prävention von thrombotischen
Ereignissen verwendet werden. Sie eignen sich insbesondere z. B. zur Prophylaxe
venöser und arterieller Thrombosen, zur Verhinderung der Verbrauchskoagulopathie
oder zur Behandlung der instabilen Angina pectoris.
Fig. 1 zeigt die Sequenz des DNA-Fragmentes, das für die
Aminosäuren 57-63 aus Lepirudin und 2-60 aus TAP kodiert.
Fig. 2 zeigt die Sequenz der Oligonukleotide hir 65_DP_zehna 1 und
hir 65_DP_zehna 2, die zusätzlich zu den Oligonukleotiden Zwehna3 bis zehna6
aus Fig. 1 zur Konstruktion von Lepirudin (1-65)-Asp, Pro-TAP (1-60)
benötigt werden. Dabei markieren die unterstrichenen Sequenzbereiche die Codone
für die neu eingeführten Aminosäuren.
Fig. 3 zeigt die Oligonukleotide, die zusätzlich zu den in Fig. 1 beschriebenen
Sequenzen zehna5/6 zur Konstruktion von Lepirudin (1-63)-Ala, Ile, Glu, Gly,
Arg-TAP (1-60) benötigt werden.
Die unterstrichenen Sequenzabschnitte markieren die jeweils beschriebenen
Änderungen.
Darstellung der DNA-(SEQ ID NO. 14) und Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO. 15) von Lepirudin (Leu-Hirudin). Die Sequenz entspricht der Sequenz aus
pk152.
Darstellung der DNA-(SEQ ID NO. 16) und Aminosäuresequenz (SEQ ID
NO. 17) von TAP.
Die Bestimmung der Hirudinkonzentration wird entsprechend der Methode von
Grießbach et al. (Thrombosis Research 37, 347-350, 1985) "Chromogenic assay"
durchgeführt. Dazu werden definierte Mengen einer Lepirudin-Standardlösung (z. B.
Hirudin Variante (Leu Hirudin) aus EP 0 324 712) zur Erstellung einer Eichkurve in
die Meßreihe mit einbezogen. Damit kann die Ausbeute direkt in mg/l angegeben
werden.
Die Verifikation der Expression von aktiven TAP-Protein kann entsprechend der
Beschreibung in EP 0454 372 B1 durchgeführt werden. Die bakteriellen Überstände
können dazu 1 : 5 und dann in einer Verdünnungsreihe mit in einem Puffer aus 50 mM
Tris (pH 7,5-8,0), 150 mM NaCl 0,1% BSA und 10% DMSO verdünnt werden. Zur
Bestimmung der Inhibitorkonstante wird die mit Hirudin oder Lepirudin ermittelte
Proteinkonzentration und das Molekulargewicht des jeweiligen bifunktionalen
Fusionsproteins zugrunde gelegt. Die Festlegung der Konstante kann entsprechend
der Beschreibung von Waxman et al. (Science (1990) 248, 595-596) erfolgen.
Zur Konstruktion der dieses Protein kodierenden DNA-Sequenz wird das
Plasmid pK152, das die Sequenz für Hirudin gemäß EP 0 324 712 enthält,
verwendet.
Zur Konstruktion des Expressionsplasmides wird beispielhaft der in DE 129 44 870.1
in Beispiel 1 beschriebene Vektor (Laborbezeichnung pD2B) benutzt.
Die das TAP kodierende DNA-Sequenz wird synthetisch hergestellt. Dazu werden
6 Oligonukleotide - Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6 - z. B. mit Hilfe des
Expedite Synthesegerätes (PerSeptive Biosystems) hergestellt. Diese
Oligonukleoticie haben folgende Bezeichnungen und Sequenzen:
Die drei in der Sequenz SEQ ID NO. 1 in Aminosäuren übersetzten Codone
markieren den Übergang von Hirudin nach TAP (Fig. 1).
Auf der für das bifunktionale Fusionsprotein kodierenden DNA (SEQ ID NO. 7) sind
die Oligonukeotide so angeordnet, daß drei Blöcke hir63-zehna1 und hir63-zehna2,
zehna3 und zehna4 sowie zehna5 und zehna6 als Sense und Antisense-Stränge
entstehen, die miteinander hybridisieren können. Dabei entstehen 5' überhängende
Enden, die jeweils mit dem überhängenden Ende des nächsten Blockes
hybridisieren und ligiert werden können. Fig. 1 verdeutlicht das Schema. Die
überhängenden Enden am Anfang und am Ende der für TAP kodierenden Sequenz
stellen jeweils eine Hälfte der Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Bstb1
und Hind3 dar. Diese können für die Klonierung der in Fig. 1 dargestellten DNA
(SEQ ID NO. 7) verwendet werden.
Zur Herstellung der in Fig. 1 dargestellten DNA werden je 1 µg der 6
Oligonukleotide in 1 ml H2O vereint und anschließend 10' bei 94°C dann 20' bei 65°C
inkubiert. Am Ende der Hybridisierungsreaktion wird das Gemisch in ein Eisbad
überführt. Von dem Ansatz wird ein Aliquot von 150 µl entnommen und in eine T4-
Ligasereaktion eingesetzt.
Die Reaktionsprodukte werden mittels Ethanolfällung konzentriert und über ein 8%-
iges PAA-Gel voneinander getrennt. Die DNA-Bande, die der erwarteten Größe
von ca. 200 bp der in Fig. 1 abgebildeten DNA (SEQ ID NO. 7) entspricht, wird
ausgeschnitten und aus dem Gelstück isoliert. Nach Elution und Reinigung wird das
Fragment in das mit Bstb1 und Hind3 geöffnete Plasmid pK152 in einer T4-
Ligasereaktion insertiert. Kompetente Zellen des Stammes E. coli MC1061 werden
mit den Ligationsprodukten transformiert und von Transformanten Plasmid-DNA
isoliert und charakterisiert. Von einem Klon wird das insertierte DNA-Fragment
über Sequenzanalyse als richtig identifizert. Die Plasmid-DNA dieses Klones dient
als Ausgangsmaterial für die weitere Klonierung. Sie enthält die DNA, die für das
gewünschte Hirudin-TAP Fusionsprotein kodiert.
Das Bstb1/Hind3-Fragment wird aus dem Plasmid reisoliert und in das Plasmid
pD2B in einer T4-DNA-Ligasereaktion insertiert. Kompetente Zellen des
Stammes E. coli K12 MC1061 (Sambrook et al. "Molecular Cloning" (Old Spring
Habor Laboratory Press 1989) werden mit dem Ligationsgemisch transformiert und
von Transformanten Plasmid - DNA zur Charakterisierung isoliert. Parallel wird von
den über Plasmidanalyse charakterisierten Transformanten eine Erhaltungsplatte
angelegt. Ausgehend von dieser Platte werden Expressionexperimente wie in
Beispiel 3 von EP 0 549 915 beschrieben, durchgeführt.
Die Zellen werden nach Expression abzentrifugiert und die klaren Überstände auf
Hirudinwirkung und TAP-Aktivität über prüft. Als Kontrolle dient ein
Expressionsüberstand von rekombinanten E.coli MC1061-Zellen, die mit dem
Plasmid pD2B transformiert sind. Es zeigt sich, daß die entwickelte Hirudinaktivität in
den Überständen aus Kontrollversuch und Expression des bifunktionalen
Fusionsproteins vergleichbar hoch sind. Die Konstante der Faktor Xa Inhibition wird
im nanomolaren Bereich bestimmt, während im Kontrollversuch keine bzw. nur
geringe inhibitorische Wirkung beobachtet wird. Die Ergebnisse zeigen, daß das
bifunktionale Fusionsprotein beide Wirkungen voll entfaltet und das E. coli Varianten
überraschend in der Lage sind dieses Protein in aktiver Form auszuschleusen.
Das Beispiel beschreibt die Herstellung und Expression eines bifunktionalen
Fusionsproteins, das die vollständige Sequenz des Hirudin und des TAP umfaßt.
Beide Proteine sind durch ein Brückenglied (Spacer) der Form Asp-Pro voneinander
getrennt. Zur Konstruktion geht man entsprechend Beispiel 3 vor. Dabei werden
aber die Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO. 1 (hir63_zehna1) und
SEQ ID NO. 2 (hir63_zehna2) durch die Sequenzen SEQ ID NO. 8 (hir65_DP_zehna1)
und SEQ ID NO. 9 (hir65_DP_zehna2) ersetzt (vgl. Fig. 2).
Nach Expression ergibt sich eine zu Beispiel 3 vergleichbare Ausbeute an
bifunktionalem Fusionsprotein, das sowohl wie Hirudin als auch wie TAP wirkt.
Das Beispiel beschreibt die Konstruktion eines hybriden Proteines das in Position 64
der Hirudinsequenz Alanin anstelle von Leucin und die Aminosäure 65-Glutamin-
deletiert enthält und in Position 34 des TAP Proteines die Aminosäure Glycin statt
Asparaginsäure trägt. Beide Mutationen sind für das jeweilige Einzelprotein nicht
beschrieben. Getrennt werden die beiden Fusionspartner durch die
Erkennungsstelle Ile Glu Gly Arg der Faktor Xa Protease.
Zur Konstruktion der das Protein kodierenden DNA-Sequenz geht man
entsprechend Beispiel 3 vor. Man benötigt aber vier neue Oligonukleotid
(vgl. Fig. 3).
Nach Expression ergibt sich eine zu Beispiel 3 vergleichbare Ausbeute an hybriden
Protein, das sowohl wie Hirudin als auch wie TAP wirkt. Basierend auf der
gemessenen Hirudinaktivität liegt die die TAP Aktivität charakterisierende
Inhibitionskonstante im nanomolaren Bereich.
Das Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Plasmides, das für ein Hirudin-TAP-
Derivat kodiert, welches der in Beispiel 5 beschriebenen Sequenz entspricht, N-
terminal im Hirudin aber Ala statt Leucin trägt. Dazu wird das, in EPO 448 093
beschriebene Plasmid pCM7053 mit den Restriktionsenzyme BamH1 und Hind3
geöffnet und mit dem aus dem in Beispiel 5 konstruierten Plasmid isolierten BamH1
Hirudin-TAP-Hind3 Fragment ligiert. Das entstanden Plasmid kodiert nun für das
Protein Ala-Hir (2-63)-Ala Ile Glu Gly Arg TAP(1-60)(Gly34). Das Protein läßt sich
mit zu Leu-Hirudinvarianten vergleichbaren Ausbeuten aktiv exprimieren.
Claims (20)
1. Bifunktionales Fusionsprotein aus Hirudin oder einer Variante von Hirudin und
TAP (Tick Anticoagulant Peptide) oder einer Variante von TAP.
2. Bifunktionales Fusionsprotein nach Anspruch 1, enthaltend die Hirudin-
Variante [Leu1,Thr2]-63-Desulfatohirudin oder einen Teil davon.
3. Bifunktionales Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 und 2 enthaltend
die Aminosäuren 1-63 aus Sequenz SEQ ID NO. 15.
4. Bifunktionales Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei TAP
die Sequenz SEQ ID NO. 17 hat.
5. Bifunktionales Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
Variante von TAP einem Teil der Sequenz SEQ ID NO. 17 entspricht.
6. Bifunktionales Fusionsprotein nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
5, wobei Hirudin oder dessen Variante und TAP oder dessen Variante über
einen Spacer, der aus einer oder mehreren Aminosäuren besteht, verbunden
sind.
7. Bifunktionales Fusionsprotein nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
6, wobei das Fusionsprotein an einen Träger gekoppelt ist.
8. Bifunktionales Fusionsprotein nach Anspruch 7, wobei der Träger
Polyethylenglycol (PEG) oder Dextran ist.
9. Bifunktionales Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, enthaltend
ein Signalpeptid.
10. DNA kodierend für ein bifunktionales Fusionsprotein nach einem oder
mehreren der Ansprüche 1 bis 9.
11. Plasmid, enthaltend eine DNA nach Anspruch 10.
12. Zelle, enthaltend eine DNA nach Anspruch 10 oder ein Plasmid nach
Anspruch 11.
13. Verfahren zur Herstellung eines bifunktionalen Fusionsproteins nach einem
der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine DNA, die für das bifunktionale
Fusionsprotein kodiert, in eine Zelle eingebracht und exprimiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine E. coli Zelle ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das bifunktionale Fusionsprotein
aus dem Medium bzw. Zellüberstand aufgereinigt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das bifunktionale
Fusionsprotein anschließend gefriergetrocknet wird.
17. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels wobei ein bifunktionales
Fusionsprotein nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 hergestellt
und mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger und gegebenenfalls
weiteren Zusatzstoffen gemischt wird.
18. Verfahren zur Herstellung eines nasal applizierbaren Arzneimittels wobei ein
bifunktionales Fusionsprotein nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
9 hergestellt, mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger und
gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen gemischt und gefriergetrocknet wird.
19. Arzneimittel enthaltend ein bifunktionales Fusionsprotein nach einem oder
mehreren der Ansprüche 1 bis 9.
20. Nasal Spray enthaltend ein bifunktionales Fusionsprotein nach einem der
Ansprüche 1 bis 9.
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