JP3746847B2 - 植物細胞増殖因子 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の成長・促進に必要な植物成長剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物由来の植物増殖因子としては、オオムギ由来の分子量６００以下の脂溶性脂肪酸〔ジャーナル オブ プラント フィジオロジー、１２１巻、１８１〜１９１頁、１９８５年〕、松由来の分子量１０００以下のオリゴ糖からなる増殖因子〔プラント セル、ティッシュ アンド オルガン カルチャー、２６巻、５３〜５９頁、１９９１年〕、ニンジン由来の分子量約７００の耐熱性の増殖因子〔プラント サイエンス、５１巻、８３〜９１頁、１９８７年〕、黒メキシコトウモロコシ由来で、分子量１３５０以下、オリゴ糖様の特徴を持ち、ｐＨ５の緩衝液中で陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂に非吸着である増殖因子〔ジャーナル オブ プラント フィジオロジー、１３２巻、３１６〜３２１頁、１９８８年〕が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
公知の植物由来の細胞増殖因子は単離精製が困難であり、該因子を大量に製造する技術も知られていない。植物細胞増殖因子を植物細胞成長剤として使用するためには、大量生産しやすい植物細胞増殖因子を探査し、工業化のためにはより低分子量の植物細胞成長剤を提供する必要がる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式（Ｉ）
【０００５】
【化２】

【０００６】
（式中、Ｒ¹ 又はＲ² の少なくとも一つはＳＯ₃ Ｈを表し、他はＨを表し、Ｚはα−アミノ酸残基を表し、ＸはＨ又はアシルを表し、ＹはＯＨ、低級アルコキシ、又はＮＨ₂ を表す）で表されるペプチドに関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
【０００８】
以下、式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）と称す。
式（Ｉ）の各基の定義において、Ｒ¹ 又はＲ² の少なくとも一つはＳＯ₃ Ｈを表し、他はＨを表すとは、Ｒ¹ およびＲ² がＳＯ₃ Ｈを表すかまたはＲ¹ 又は
Ｒ² のどちらか一方がＳＯ₃ Ｈを表し、他方がＨを表すことを示す。
【０００９】
α−アミノ酸残基におけるα−アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族アミノ酸類、セリン、トレオニン等のオキシアミノ酸類、システイン、シスチン、メチオニン等の含イオウアミノ酸類、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸類、アスパラギン、グルタミン等のアミドアミノ酸類、リジン、アルギニン、オルニチン等の塩基性アミノ酸類、フェニルアラニン、チロシン等の芳香族アミノ酸類、ヒスチジン、トリプトファン、プロリン、オキシプロリン等の複素環アミノ酸類があげられ、これらの中でも脂肪族アミノ酸が好ましく、なかでもバリン、イソロイシンがとりわけ好ましい。また該アミノ酸には、Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体のいずれも用いることができるがＬ体を用いることが好ましい。
【００１０】
アシルとしては、炭素数１〜７の例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ピバロイル等の低級アルカノイル、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイル等のアロイルがあげられる。
【００１１】
低級アルコキシのアルキル部分としては炭素数１〜６の例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等があげられる。
【００１２】
化合物（Ｉ）は、通常のペプチド合成法で得ることができる植物細胞増殖因子である。
例えば“ペプチド合成”泉屋信夫ら著、昭和５０年丸善刊等に記載されたペプチド合成法により、ペプチド骨格を合成し、次いでチロシンのＯＨ基の保護基を脱離させた後、スルフォニル基転移酵素を用いる酵素法や、スルフォニル−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のスルフォニル化剤を用いた方法により、スルフォン化を行い、化合物（Ｉ）を得ることができる。
【００１３】
得られた化合物（Ｉ）は、高速液体クロマトグラフィー等の通常用いられる精製手段により精製することができる。
【００１４】
化合物（Ｉ）は、植物成長剤として以下のような形態で使用できる。
▲１▼溶剤
防腐剤、ｐＨ調整剤を含む水溶液に、化合物（Ｉ）を０．０００１〜１％溶解して植物細胞成長促進剤を製造する。防腐剤としては、ホウ酸、さらし粉、安息香酸、サリチル酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸、プロピオン酸、イソシアヌル酸、亜塩素酸、次亜塩素酸、パラオキシ安息香酸およびそのエステル、ラウリルトリメチルアンモニウム−２，４，５−トリクロロカルボニライト、トリブロモサリチルアニライド、３，４，４′−トリクロロカルボニライド、ヘキサクロロフェン、ビチオノール、クロラミン−Ｔ、クロラミンＢハラゾーン等、好ましくはソルビン酸があげられる。ｐＨ調整剤としてはクエン酸塩、リン酸塩等一般に用いられているものを、単独あるいは組み合わせて使用できる。
【００１５】
前記のように製造した溶剤を水に１００〜１００００倍、好ましくは１０００倍に希釈したものに植物の種子あるいは差し穂等の種苗を浸漬するか、または水耕培の培養液に当該ペプタイドの最終濃度が０．００１から１０ＰＰＭになるよう添加することにより、植物成長剤として用いることができる。
【００１６】
▲２▼ペースト製剤
当該ペプチドを０．０１〜１０ＰＰＭペースト材料に練りこみ植物成長促進剤を製造する。ペースト材料としては脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、ろう、樹脂、プラスチック、グリコール、高級アルコール類、グリセリン等、好ましくはワセリン、ラノリンがあげられる。
【００１７】
前記のように製造したペースト製剤を接ぎ木された植物の接ぎ木部分、あるいは果実の果柄部分、あるいは切断時の切断面等に塗布することにより植物成長剤として用いることができる。
【００１８】
化合物（Ｉ）の具体例として
【００１９】
【化３】

【００２０】
が例示される。
以下に本願発明の植物細胞増殖因子の植物細胞増殖活性を試験例で示す。
【００２１】
試験例１．
【００２２】
（１）アスパラガス遊離細胞の調製
長さ約１０ｃｍのアスパラガス葉状茎を、生物検定には１本、調製培養液（ＣＭ）の調製には２００ｍｌあたり４本使用した。採集した葉状茎は、７０％エタノールに３０秒間浸漬後、１０倍希釈アンチホルミンに１００ｍｌあたり２滴のＴｗｅｅｎ２０を加えた溶液中で１０分間滅菌し、さらに滅菌蒸留水で３回洗浄した。次に、クリーンベンチ内にてガラス製ホモジェナイザー（２２×１６７ｍｍ、岩城硝子）を用い、滅菌蒸留水中で葉状茎を破砕後、破砕液を３７μｍのステンレス製メッシュ（飯田製作所）で濾過し、濾液を遠心分離（１００×ｇ、３ｍｉｎ、Ｋｕｂｏｔａ ＫＳ−５０００）することにより遊離単細胞を沈殿させた。沈殿した遊離単細胞は再度滅菌蒸留水に懸濁させ、遠心分離後に上清を除去する操作を３回繰り返し、完全に夾雑物を除いた。
【００２３】
（２）培地の調製
第１表に示した液体培地を、使用直前に保存液を目的濃度の４倍濃度となるように蒸留水で希釈して調製し、１．０Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８とした後、滅菌フィルター（ＡＤＶ ＡＮＴＥＣ ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ ０．２０μｍ）を用いて濾過滅菌した。培地組成を第１表に示す。
【００２４】
【表１】

【００２５】
（３）ＣＭの採取
遊離単細胞懸濁液を、ビュケルチュルク血球計算盤（日本臨床器械工業）を用いて、約５．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、その５０ｍｌと２倍濃度の液体培地５０ｍｌの合計１００ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコに加え、シリコン栓をかぶせて、暗黒下、２８℃、１２０ｒｐｍの条件で浸盪培養（高崎科学器械 ＴＢ−２５Ｒ）した。細胞増殖が最大となる培養開始１０日目に、吸引濾過（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．２）により調製培養液（以下ＣＭという）を回収し、−３０℃で凍結保存した。
【００２６】
（4）培養細胞の調製
（1）の方法により得られたアスパラガスの遊離細胞を（2）の方法により調製した培地に移植し、本発明の植物細胞増殖因子を添加して培養し、培養アスパラガス細胞の増殖に対する植物細胞増殖因子の影響をコロニー形成率の変化を測定することにより調べた。
【００２７】
（ｉ）細胞の培養
細胞培養には２４穴のマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ ３８２０−０２４）を用いた。マイクロプレート１穴あたり、あらかじめ目的とする細胞密度の２倍密度となるように調製したアスパラガスの遊離単離細胞懸濁液２５０μｌ、４倍濃度の液体培地１２５μｌ、滅菌蒸留水１２５μｌ、または濾過滅菌（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＤＩＳＭＩＣ−１３ｃｐ ０．２０μｍ）後希釈した（３）で得られたＣＭ １２５μｌを加えよく撹拌し、蒸散防止のためビニルテープでシールドした後、暗黒下、２８℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪培養（ＴＡＩＴＥＣ ＢＲ−３００Ｌ）した。
【００２８】
（ii）細胞の観察
１穴ごとに１００倍の倒立顕微鏡（ＯＬＩＭＰＵＳ ＣＫ２）下で、視野内に存在する生存細胞数（コロニー形成細胞を含む）、死細胞数、およびコロニー形成細胞数をカウントし、３穴以上の観察結果をもとにして、以下の計算式に従いコロニー形成率（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、および細胞生存率を算出した。
【００２９】
Ｃ（％）＝ａ／ｂＸ１００
Ｃ：コロニー形成率 ａ：コロニー形成細胞数 ｂ：生存細胞数
Ｌ（％）＝〔ｂ／（ｂ＋ｄ）〕×１００
Ｌ：細胞生存率 ｂ：生存細胞数 ｄ：死細胞数
【００３０】
（iii ）化合物（Ｉ）の植物細胞増殖活性（コロニー形成率）へ与える影響
５×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍｌおよび２．５×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍｌのアスパラガスの遊離細胞培養液中に、実施例１で得られた化合物１、参考例１で得られた化合物ａを最終濃度（１０^-5〜１０^-9Ｍ）になるように加え、細胞を培養した。各濃度におけるアスパラガス培養細胞のコロニー形成率を測定し、ＥＤ₅₀を測定した。結果を第１表に示した。
【００３１】
【表２】

【００３２】
第２表によればトリペプチドの化合物１は非常に強い細胞増殖活性を示した。
【００３３】
【実施例】
実施例１
化合物は、ペプチド合成液相法により以下のように行った。
ペプチド協会より購入したＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）（式中、Ｆｍｏｃは９−フレオレニルメトキシカルボニルを表し、ｔ−Ｂｕは第三級ブチルを表す）を用いて常法によりＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＢｚｌ（式中、Ｂｚｌはベンジルを表す）を製造した（ダーンら、ジャーナル オブ オルガニック ケミストリー、４７巻、１９６２〜１９６５頁、１９８２年）。得られたＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＢｚｌに対してＦｍｏｃ−Ｉｌｅ“ペプチド協会製”およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）を連続的に縮合剤ジエチルホスファシアニデート（以下ＤＥＰＣという）を用いて常法により結合させた（中尾ら、ケミカルファーマ ブルチン、３７巻、９３０〜９３２頁、１９８９年）。得られたＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＢｚｌに９５％トリフルオロ酢酸溶液を添加してｔ−Ｂｕ基を脱離させた後、シリカゲルクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−アセトン（９：１）混合溶媒で溶出した。
【００３４】
得られたＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＨ）−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＯＨ）−ＯＢｚｌ〔３５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ〕をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦという）−ピリジン〔配合比４：１〕の混合溶液に溶解し、更にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド スルファトリオキサイド（３０当量）を加え１２時間反応させた。反応液を濃縮した後、１０％アンモニウムヒドロキシドで中和してから、ｎ−ブタノールで抽出した。残存する保護基のうちベンジル基は触媒還元反応によって（二木ら、ジャーナル オブ ケミカル ソサエティー パーキン トランザクション １、１７３９〜１７４４頁、１９９０年）、Ｆｍｏｃ基は５０％ピペリジン含有ＤＭＦと１時間反応させることによって脱離させた。粗生成物を冷却エーテル３０ｍｌで沈殿させた後、１０％アンモニウムヒドロキシド（２０ｍｌ）で溶解し、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−１０カラム（２０×２５０ｍｍ） 野村化学、瀬戸日本）を用いた高速液体クロマトグラフィーに付した。溶出は、８％アセトニトリル含有酢酸アンモニウム溶液を溶出液として用い流速２０ｍｌ／分で行った。得られた化合物１の構造はＦＡＢ−ＭＳの物性データー（擬似分子イオンピーク m/z 638［M-2H+Na］⁻；分子イオンピークm/z 616［M-H］⁻；フラグメントイオン m/z 536［M-H-SO_３］⁻）からＨ−Ｔｙｒ（ＳＯ_３Ｈ）−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＳＯ_３Ｈ）−ＯＨであると決定した。
【００３５】
参考例１
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＢｚｌとＦｍｏｃ−ＩｌｅのみをＤＥＰＡＣにより反応させる以外は実施例１と同様の方法によりＴｙｒ（ＳＯ₃ Ｈ）−
Ｉｌｅの構造を持つ化合物ａを得た。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、大量合成が可能で強い植物細胞増殖活性を持つ植物成長剤が提供される。

Claims (3)

1. 式（Ｉ）
   

   

   （式中、Ｒ ^１ 又はＲ ^２ の少なくとも一つはＳＯ _３ Ｈを表し、他はＨを表し、ＸはＨ又は炭素数１〜７のアルカノイルもしくはアロイルを表し、ＹはＯＨ、炭素数１〜６のアルコキシ、又はＮＨ _２ を表す）で表されるペプチド。
2. Ｒ ^１ およびＲ ^２ がＳＯ _３ Ｈであり、ＸがＨであり、ＹがＯＨである請求項１記載のペプチド。
3. 請求項１または２記載のペプチドを含有することを特徴とする植物成長剤。