CN108220369B - 一种生产重组水蛭素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产重组水蛭素的方法,所述方法包括:将pBH‑2工程菌(保藏号:CGMCC No.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中,首先在25℃‑35℃的温度下培养至对数生长期结束,然后升温至35℃‑45℃继续进行培养,该升温过程是在1小时内完成,可选地在10分钟内完成,还可选地在5分钟内完成。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术,特别是发酵工程,尤指一种生产重组水蛭素的方法。
背景技术
水蛭素是凝血酶特异性抑制剂,能有效预防和治疗弥散性血管内凝血,在心脑血栓疾病方面均有显著作用。由于天然的水蛭素产量有限,每条水蛭只含20μg的水蛭素,不能满足临床应用的要求,为此,采用生物工程技术生产重组水蛭素的研究——特别是能够生产高产率的重组水蛭素的方法——显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种生产重组水蛭素的方法,所述方法采用pBH-2工程菌(大肠埃希氏菌(Escherichia coli);中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所;保藏日期:2003年03月19日;保藏编号:CGMCC No.0908),通过高密度、高表达的发酵工艺生产重组水蛭素,能够极大地提高重组水蛭素的产量。
为了达到本发明目的,本发明提供了一种生产重组水蛭素的方法,所述方法包括:将pBH-2工程菌(保藏号:CGMCC No.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中,在需氧条件下,在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束,然后升温至35℃-45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值。
在以上或其他实施方式中,可以继续培养3-16小时或更长,使得水蛭素产量达到峰值。
在以上或其他实施方式中,可以在30℃的温度下培养至对数生长期结束。
在以上或其他实施方式中,可以升温至42℃继续进行培养3-16小时或更长,使得水蛭素产量达到峰值。
在以上或其他实施方式中,升温过程可以在1小时内完成。
在以上或其他实施方式中,升温过程可以在10分钟内完成。
在以上或其他实施方式中,升温过程可以在5分钟内容完成。
在以上或其他实施方式中,所述碳源物质可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种。其中,所述发酵培养基中的所述碳源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定。例如,在一些情况下,所述发酵培养基中的所述碳源物质的量为基于培养基溶液的总体积计的5-200g/L。
在以上或其他实施方式中,所述碳源物质可以为蔗糖。
在以上或其他实施方式中,所述碳源物质可以为蔗糖与选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种的组合。
在以上或其他实施方式中,其中所述氮源物质可以选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种。所述发酵培养基中的所述氮源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定。例如,在一些情况下,所述发酵培养基中的所述氮源物质的量为基于培养基溶液的总体积计的10-120g/L。
在以上或其他实施方式中,所述氮源物质可以为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者。
在以上或其他实施方式中,所述氮源物质可以为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者与选自玉米浆、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种的组合。
在以上或其他实施方式中,所述氮源可以选自安琪蛋白胨FP318、安琪酵母粉FM818或两者。
在以上或其他实施方式中,其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比可以为0.2-40:1。
在以上或其他实施方式中,其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比可以为1.1:1。
在以上或其他实施方式中,还可以向所述培养基中加入其它无机物质以促进微生物的生长和提高重组水蛭素的产率。比如,在以上或其他实施方式中,所述发酵培养基还可以包含磷酸盐、镁盐、钠盐或其组合,可选地,所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或更多种。
在以上或其他实施方式中,所述磷酸盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.2-20g/L。
在以上或其他实施方式中,所述镁盐可以为硫酸镁或氯化镁。
在以上或其他实施方式中,所述镁盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.1-1.5g/L。
在以上或其他实施方式中,所述钠盐可以选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、醋酸钠中的一种或更多种。
在以上或其他实施方式中,所述钠盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.1-25g/L。本申请的发明人发现,钠盐的加入有利于促进pBH-2工程菌表达更多的重组水蛭素。
在以上或其他实施方式中,所述培养基还可以包含铁盐、锰盐、铝盐、钴盐、锌盐、铜盐、镍盐、硼酸、维生素B1中的一种或更多种。本领域技术人员可以根据实际需要选择上述各个组分并确定其添加量。
在以上或其他实施方式中,所述发酵培养基还可以含有抗生素物质。
在以上或其他实施方式中,所述抗生素物质可以为氨苄青霉素(AMP)。
在以上或其他实施方式中,所述抗生素物质的加入量为基于培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L。
在以上或其他实施方式中,所述抗生素物质可以分两次加入发酵培养基中,其中第一次加入是在接种时且第二次加入是在菌体培养至对数生长期结束之前。
在以上或其他实施方式中,第一次在接种时以培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L的量加入所述抗生素物质,第二次在菌体培养至对数生长期结束之前,以基于培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L的量加入抗生素物质。
在以上或其他实施方式中,所述抗生素物质的第二次加入可以以流的形式进行添加。本申请的发明人经过大量的实验研究发现,在第二次加入抗生素物质比如氨苄青霉素AMP时,把抗生素物质的流加进发酵液较一次性加入更有利于促进pBH-2工程菌表达更多的重组水蛭素。例如,流加的方式可以为将流速控制在每分钟补入基于培养基溶液的总体积计的0.017mg/L-0.33mg/L的抗生素物质。
在以上或其他实施方式中,所述发酵培养基的组成物质比如氮源物质和碳源物质及其他可选择加入的物质可以分两次加入,其中第一次加入是在接种前加入,第二次加入是于接种后以流的方式加入且在13小时内完成。
在以上或其他实施方式中,可以以1%-20%的接种量将所述pBH-2工程菌接种至所述发酵培养基。
在以上或其他实施方式中,可以以15%的接种量将所述pBH-2工程菌接种至所述发酵培养基。
在以上或其他实施方式中,菌株培养初始pH值为5.5-11,其中,初始pH值为培养基配制完毕后,用0.5N-1N的氢氧化钠来调节。
在以上或其他实施方式中,菌株培养初始pH值为6.5-8.0,可选地为7.0。
在以上或其他实施方式中,在培养过程用0.5N-1N的HCl和0.5N-1N的NaOH或10wt%-20wt%氨水将pH值调整为4-9.5,可选6.5-8.0。
在以上或其他实施方式中,本申请的菌株培养是在需氧条件下进行的。
在以上或其他实施方式中,在本申请的菌株培养过程中,控制溶氧值达40%以上。
在以上或其他实施方案中,在本申请的菌株培养过程中,通过在摇瓶上使用装量10-20ml/100ml,转速250-300rpm,在发酵罐上接种后使用较大通气量(例如控制溶氧值达40%以上),通过调节转速、通气量和通氧气等手段达到调控目的。
在以上或其他实施方式中,所述方法还包括对菌株发酵液进行灭活处理,灭活温度60℃-80℃,可选75℃;灭活时间为5min-20min。
在以上或其他实施方式中,所述方法还包括:灭活处理后的菌株发酵液经0.1~1μm孔径的陶瓷膜进行固液分离,纯化水水洗(例如水洗三次),收集陶瓷膜透析液,陶瓷膜透析液再用3万分子量以下孔径的超滤膜浓缩,浓缩后浓缩液加重量比为5%-30%的盐进行喷雾干燥
在以上或其他实施方式中,灭活温度75℃。
在以上或其他实施方式中,灭活时间为10min。
在以上或其他实施方案中,所述发酵培养过程可以在本领域常规或已知的装置和条件下进行,例如可使用摇瓶在本领域常规或已知的转速下进行;也可以在常规的发酵罐中进行,例如可以在5L发酵罐中进行。
在所述培养过程中需要使用5L发酵罐时,可以采用液种进罐的接种方式。可在发酵过程中流加补充碳源物质、氮源物质、无机物质和抗生素物质。在发酵全程可用0.5N-1NHCl和0.5N-1N NaOH或10%-20%氨水调节pH值为6.5-8.0。在接种后使用较大通气量(例如控制溶氧值达40%以上)。
与现有技术相比,本发明包括一种制备重组水蛭素的方法,所述方法包括将pBH-2工程菌(保藏号:CGMCC No.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中,在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束,然后升温至35℃-45℃继续进行培养3-16小时。
本申请的方法通过在使用pBH-2工程菌(保藏号:CGMCC No.0908)且在对数生长期结束后升温至35℃-45℃继续培养,能够使得菌株特异性地且高产量地表达和分泌重组水蛭素。
进一步地,本申请的方法还通过特异性地选择碳源物质比如蔗糖和/或氮源物质比如酵母粉和蛋白胨和/或将升温过程控制在10分钟之内(可选地,5分钟之内)和/或以流的形式实施抗生素物质的第二次加入和/或加入钠盐,尤其是通过将升温过程控制在10分钟之内(可选地,5分钟之内)和/或以流的形式实施抗生素物质的第二次加入,以进一步提高重组水蛭素的表达和分泌。
在本申请中,升温是必须的一个诱导过程,原理如下:本申请所使用的菌株的表达质粒含有λPL启动子,该启动子启动则菌体表达水蛭素,阻遏蛋白cI可以阻止λPL启动子启动,当温度升高时,阻遏蛋白cI失活,解除λPL启动子的阻遏,开始表达水蛭素。在30℃培养时:调节基因产生有活性的cI阻遏蛋白,可与操纵基因结合,阻止外源基因转录,细菌大量生长;当迅速升温至42℃:cI阻遏蛋白失活,不与操纵基因结合,启动子启动外源基高效转录,合成大量重组水蛭素。如果不升温,基本上不会表达水蛭素。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述,并且,部分地从说明书中变得显而易见,或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书以及权利要求书中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案,并不构成对本发明技术方案的限制。
图1A-D为显示本申请的升温培养过程中的结晶紫染色后的菌体的显示图,其中图1A是培养3.5小时的结晶紫染色后菌体显示图,测得的水蛭素产量为0,图1B是培养12小时的结晶紫染色后菌体显示图,测得的水蛭素产量为9000ATU/ml,图1C是培养14小时的结晶紫染色后菌体显示图,测得的水蛭素产量为12000ATU/ml,图1D为培养20小时的结晶紫染色后菌体显示图,测得的水蛭素产量为6000ATU/ml。从图1A-D可以看出,随着水蛭素产量的增加,菌体染色变亮,且当菌体染色变亮至一定程度并开始变浅时,水蛭素产量几乎达到峰值,而当颜色继续变浅时,水蛭素产量也下降。
图2为本申请的实施例2的电泳图,其中自左边起的第一个样品为蛋白分子量marker,第二个样品是本申请纯化后的水蛭素样品,且第三个样品是本申请的发酵液未经纯化的水蛭素样品。
图3为本申请的实施例2的HPLC图,其中图3A为水蛭素对照品的HPLC图,图3B为本申请纯化后的HPLC图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
此外,还需要说明的是,对于以下实施例所计算的产率,本领域技术人员已知的是,影响产率的因素除了配方中物质种类,还有接种量和碳氮比。比如,实施例5,接种量达到20%,以至于后期营养可能不足;实施例7,接种量为8%,以至于后期的营养过剩造成营养抑制。
实施例1待接种的菌种的制备
接种pBH-2工程菌(保藏号:CGMCC No.0908)甘油保藏菌至装有10ml种子培养基(见表1)的100mL三角瓶中,于30℃,270rpm摇床培养2小时,即得待接种的菌种。
表1:种子培养基
其中,在本实施例中,g/L中的L是最终培养基的体积。
其中,蔗糖购自广州化学试剂厂,且其规格为AR级;蛋白胨购自OXOID,且其规格为AR级;酵母粉购自OXOID,且其规格为AR级;氯化钠购自广州化学试剂厂,且其规格为AR级;AMP购自石药集团中诺药业(石家庄)有限公司,且其规格为医药级。
实施例2摇瓶发酵
将实施例1所得菌种采用液种直接接种的方法,将种龄2h的菌种按OD600为0.7换算接种量5%接种到发酵培养基。装量为10ml/100ml三角瓶、培养温度为30℃、转速270rpm。在需氧条件下,接种后发酵至测得的菌液的OD值趋于稳定,即对数生长期结束,用时3.5小时,然后在5分钟内升温至40℃继续培养至显微镜镜检中结晶紫染色后菌体着色变浅,用时11.5小时。发酵周期为15小时。最后,对菌株发酵液进行灭活处理,灭活温度75℃,灭活时间10min。
其中,发酵培养基由以下组成且pH为7.2:蔗糖41g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉13g/L、氯化铵6.5g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸氢二钠0.6g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸钠1.2g/L、柠檬酸钠0.17g/L、氯化钠8g/L、维生素B10.028g/L、微量元素-硫酸亚铁40g/L、硫酸铝28g/L、硫酸锰6.1g/L、氯化钴4g/L、氯化锌0.95g/L、钼酸钠2.16g/L、硼酸0.5mg/L、硫酸铜2.93g/L、硝酸镍30g/L,pH7.2)。接种时加入抗生素物质AMP 0.1g/L。其中,在本实施例及以下的实施例中,g/L中的L是最终发酵培养基的体积。
此外,培养基中的各组分的生产厂家及规格信息如下表2所示的。
表2
灭活处理后的发酵液经0.1~1μm孔径的陶瓷膜(厂家:厦门三达膜科技有限公司,设备型号:MFM-C-770)进行固液分离,纯化水水洗三次,收集陶瓷膜透析液,陶瓷膜透析液再用3万分子量以下孔径的超滤膜(厂家:厦门三达膜科技有限公司,设备型号:UFM-84S-2)浓缩,浓缩后浓缩液加10%(重量比)的氯化钠盐进行喷雾干燥,得到水蛭素粗品。
将十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),应用于提纯过程中纯度的检测。纯的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带。
除了SDS-PAGE,还同时进行了水蛭素对照品(购自SIGMA,货号规格377853-2000U)与本申请纯化后的水蛭素样品的高效液相同步检测,其结果如图3所示的。
其中,高效液相的测试条件如下所示:
实验仪器:Agilent1260
色谱柱:Agilent Zorbax 300SB-C3柱
流动相:水(含0.1%TFA):90%乙腈(含0.1%TFA)
洗脱方式:梯度洗脱
流速:1.2ml/min
UV:214nm
柱温:35℃。
此外,按照如下的方法测量和计算得到的水蛭素发酵产率为10000ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%以上:
1实验原理:
水蛭素与凝血酶的反应速度快,反应呈正比关系,水蛭素与凝血酶结合比例为1:1。一个ATU的水蛭素是指在37℃下,能使一个单位的凝血酶失活所需的水蛭素的量。
2实验试剂及设备:
2.1凝血酶(购自中检所)
2.2牛纤维蛋白原(购自sigma)
2.3生理盐水
2.4 0.05mol/L Tris-HCl:取0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml、0.1mol/L盐酸约40ml和氯化钠0.8766g混合,溶解,调节pH至7.5,然后加蒸馏水定容至100ml即可。
2.5恒温水浴锅
3实验方法:
3.1 0.5%牛纤维蛋白原溶液:用0.05mol/L Tris-HCL缓冲液溶解牛纤维蛋白原,配成0.5%牛纤维蛋白原溶液。
3.2凝血酶溶液的配制:用生理盐水配成适宜凝血酶浓度的溶液。
3.3取100ul样品于1.5ml试管中,加入0.5%牛纤维蛋白原溶液200ul,摇匀,置37℃水浴,浸提5分钟,滴加凝血酶溶液5ul(每1分钟滴加1次,每次5ul,边滴加边轻轻摇匀)至凝固。
4结果计算:
水蛭素活力:(C1×V1)/(V2×稀释倍数)。
C1:凝血酶溶液的浓度,单位为NIH/ml
V1:消耗凝血酶溶液的体积,单位μl
V2:供试品溶液加入量,单位μl。
以下实施例中提及的水蛭素发酵产率均是按照本实施例的方法测量和计算得到的。
实施例3摇瓶发酵
将实施例1所得菌种采用液种直接接种的方法,将种龄2h的菌种按OD600为0.7换算接种量10%接种到发酵培养基。装量为10ml/100ml三角瓶、培养温度为30℃、转速270rpm。在需氧条件下,接种后发酵至测得的菌液的OD值趋于稳定,即对数生长期结束,用时3.5小时,紧接着在10分钟内升温至37℃继续培养至显微镜镜检中结晶紫染色后菌体着色变浅,用时11.5小时。发酵周期为15小时。最后,对菌株发酵液进行灭活处理,灭活温度为80℃,灭活时间5min。
其中,发酵培养基由以下组成且pH为7.2:甘油10g/L、葡萄糖10g/L、酵母粉20g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁1.0g/L、磷酸氢二钠5g/L、硫酸钠3.0g/L、柠檬酸钠0.3g/L、氯化钠20g/L、维生素B1 1mg/L、微量元素-硫酸亚铁40g/L、硫酸铝28mg/L、硫酸锰6.1mg/L、氯化钴4mg/L、氯化锌0.95g/L、钼酸钠2.16g/L、硼酸0.5mg/L、硫酸铜2.93g/L、硝酸镍32g/L。接种时加入抗生素物质AMP 0.5g/L。
其中,甘油和葡萄糖、硝酸铵的生产厂家和规格信息如下所示,其他物质的信息与上面的实施例相同:
甘油:广州市宝吉丽化工有限公司,食品级
葡萄糖:吴江市建诚精细化工有限公司,食品级
硝酸铵:广州化学试剂厂,AR级
根据实施例2的纯化方法进行纯化。
计算得到的水蛭素发酵产率为11000ATU/ml,且本纯化方法的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例4摇瓶发酵
将实施例1所得菌种采用液种直接接种的方法,将种龄2h的菌种按OD600为0.7换算接种量15%接种到发酵培养基。装量为20ml/100ml三角瓶、培养温度为28℃、转速250rpm。在需氧条件下,接种后发酵至测得的菌液的OD值趋于稳定,即对数生长期结束,用时3.5小时,然后在10分钟内升温至37℃继续培养至显微镜镜检中结晶紫染色后菌体着色变浅,用时11.5小时。发酵周期为15小时。最后,对菌株发酵液进行灭活处理,灭活温度为70℃,灭活时间20min。
其中,发酵培养基由以下组成且pH为7.2:葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、酵母粉10g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化铵0.5g/L、硫酸镁0.9g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸钠5.0g/L、柠檬酸钠0.87g/L、氯化16g/L、维生素B1 0.05mg/L,微量元素-硫酸亚40g/L、硫酸铝28mg/L、硫酸锰6.1mg/L、氯化钴4mg/L、氯化锌0.95g/L、钼酸钠2.16g/L、硼酸0.5mg/L、硫酸铜2.93g/L、硝酸镍32g/L。接种时加入抗生素物质AMP0.5g/L。各组分的生产厂家及规格的信息与上面的实施例相同。
根据实施例2的纯化方法进行纯化。
计算得到的水蛭素发酵产率为12000ATU/ml,且本纯化方法的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例5摇瓶发酵
将实施例1所得菌种采用液种直接接种的方法,将种龄2h的菌种按OD600为0.7换算接种量20%接种到发酵培养基。装量为20ml/100ml三角瓶、培养温度为35℃、转速250rpm。在需氧条件下,接种后发酵至测得的菌液的OD值趋于稳定,即对数生长期结束,用时3.5小时,然后在60分钟内升温至45℃继续培养至显微镜镜检中结晶紫染色后菌体着色变浅,用时11.5小时。发酵周期为15小时。最后,对菌株发酵液进行灭活处理,灭活温度60℃,灭活时间20min。
其中,所述发酵培养基由以下组成且pH为7.2:葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、酵母粉10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化铵0.5g/L、硫酸镁0.9g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸钠5.0g/L、柠檬酸钠0.87g/L、氯化钠16g/L、维生素B10.05mg/L,微量元素-硫酸亚铁40g/L、硫酸铝28mg/L、氯化钴4mg/L、氯化锌0.95g/L、钼酸钠2.16g/L、硼酸0.5mg/L、硫酸铜2.93g/L、硝酸镍32g/L。接种时加入抗生素物质AMP 0.5g/L。各组分的生产厂家及规格的信息与前面的实施例相同。
根据实施例2的纯化方法进行纯化。
计算得到的水蛭素发酵产率为9000ATU/mL,且本纯化方法的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例6 5L罐发酵
按照实施例1的方法,不同的是温度为30℃,270rpm、培养2小时,得到一级种子的菌体,采用液种进罐方法,按OD600为0.7换算接种量15%进行接种,接种到5L发酵罐中的发酵培养基。
其中,所述发酵培养基由以下组成且pH为7.2:蔗糖41g/L、蛋白胨FP318(琪酵母股份有限公司)20g/L、酵母粉FM818(安琪酵母股份有限公司)13g/L、氯化铵6.5g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸氢二钠0.4g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸钠1.3g/L、柠檬酸钠0.12g/L、氯化钠8.2g/L、维生素B10.02g/L、微量元素-硫酸亚铁3mg/L、硫酸铝2.3mg/L、硫酸锰0.5mg/L、氯化钴0.3mg/L、氯化锌0.07mg/L、钼酸钠0.2mg/L、硼酸0.04mg/L、硫酸铜0.24mg/L、硝酸镍2.5mg/L。接种时加入抗生素物质氨苄青霉素AMP0.04g/L。各组分的生产厂家及规格的信息与上面的实施例相同。
发酵过程pH值用20重量%的氨水和0.5N HCl控制pH值在6.5~8.0之间。接种后控制溶氧值达40%以上。于接种后1小时用流加的方法以每分钟流加2.6mL的速度加入额外的35g/L的蔗糖、16g/L的蛋白胨、10g/L的酵母粉和7g/L的无机物质磷酸氢二钠0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L和氯化钠1g/L(共2L补料液)。在对数生长期结束之前,以流的方式按每分钟补入基于培养基溶液的总体积计的0.033mg/L的速度加入占培养基0.02g/L的氨苄青霉素AMP。发酵周期为15小时。其中,在以流的方式添加额外的物质的过程中,保持温度30℃发酵11小时(此时测得的菌液的OD值趋于稳定,即对数生长期结束),然后在5分钟的时间内升高温度至42℃,继续控制培养至显微镜镜检中结晶紫染色后菌体着色变浅,用时4小时。发酵液灭活处理,灭活温度75℃,灭活时间10min。
根据实施例2的纯化方法进行纯化。
计算得到的水蛭素发酵产率为12500ATU/mL,且本纯化方法的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例7 5L罐发酵
按照实施例1的方法,不同的是温度为30℃,270rpm、培养2小时,得到一级种子的菌体,采用液种进罐方法,按OD600为0.7换算接种量8%进行接种,接种到5L发酵罐中的发酵培养基。
其中,发酵培养基由以下组成且pH为7.2:蔗糖80g/L、蛋白胨FP31865g/L-OXOID、氯化铵12g/L、硫酸镁0.7g/L、磷酸氢二钠0.6g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸钠1.7g/L、柠檬酸钠0.17g/L、氯化钠14g/L、维生素B10.028g/L、微量元素-硫酸亚铁3mg/L、硫酸铝2.3mg/L、硫酸锰0.5mg/L、氯化钴0.3mg/L、氯化锌0.07mg/L、钼酸钠0.2mg/L、硼酸0.04mg/L、硫酸铜0.24mg/L、硝酸镍2.5mg/L。接种时加入抗生素物质氨苄青霉素AMP0.1g/L。各组分的生产厂家及规格的信息与前面的实施例相同。
发酵过程pH值用1N NaOH和1N HCl控制pH值在6.5~8.0之间。接种后控制溶氧值达60%以上。于接种后40分钟用流加的方法以每分钟流加2.6ml的速度加入额外的10g/L的蔗糖和30g/L的蛋白胨(共2L补料液)。在发酵5小时后一次性加入占培养基0.1g/L的氨苄青霉素AMP。发酵周期为15小时。其中,在以流的方式添加额外的物质的过程中,保持温度35℃发酵11小时(此时测得的菌液的OD值趋于稳定,即对数生长期结束),然后控制在30min内从35℃升温至40℃,继续发酵至显微镜镜检中结晶紫染色后菌体着色变浅,用时4小时。发酵液灭活处理,灭活温度80℃,灭活时间5min。
根据实施例2的纯化方法进行纯化。
计算得到的水蛭素发酵产率8000ATU/ml,且本纯化方法的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例8 5L罐发酵
按照实施例1的方法,不同的是温度为30℃,270rpm、培养2小时,得到一级种子的菌体,采用液种进罐方法,按OD600为0.7换算接种量10%进行接种,接种到5L发酵罐中的发酵培养基。
其中,所述发酵培养基由以下组成且pH为7.2:蔗糖80g/L、酵母粉65g/L、硝酸铵12g/L、硫酸镁0.7g/L、磷酸氢二钠0.6g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸钠1.7g/L、柠檬酸钠0.17g/L、氯化钠14g/L、维生素B1 0.028g/L、微量元素-硫酸亚铁3mg/L、硫酸铝2.3mg/L、硫酸锰0.5mg/L、氯化钴0.3mg/L、氯化锌0.07mg/L、钼酸钠0.2mg/L、硼酸0.04mg/L、硫酸铜0.24mg/L、硝酸镍2.5mg/L。接种时加入抗生素物质氨苄青霉素AMP 0.04g/L。各组分的生产厂家及规格的信息与前面的实施例相同。
发酵过程pH值用0.5N NaOH和0.5N HCl控制pH值在6.5~8.0之间。在接种后控制溶氧值达40%以上。于接种后用流加的方法接种1小时,以每分钟流加2.6ml的速度加入额外的15g/L的蔗糖和30g/L的蛋白胨。发酵8小时后加入占培养基0.05g/L的氨苄青霉素AMP。发酵周期为15小时。其中,在以流的方式添加额外的物质的过程中,保持温度30℃发酵11小时(此时测得的菌液的OD值趋于稳定,即对数生长期结束),控制在10min内从35℃升温至45℃,继续发酵至显微镜镜检中结晶紫染色后菌体着色变浅,用时4小时。发酵液灭活处理,灭活温度60℃,灭活时间20min。
根据实施例2的纯化方法进行纯化。
计算得到的水蛭素发酵产率为8500ATU/ml,且本纯化方法的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例9
按照实施例2的方法制备和纯化重组水蛭素,除了将发酵培养基变换成由蔗糖41g/L、蛋白胨20g/L和水1L组成,pH为7.0且接种量为1%以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为6000ATU/ml,且本纯化方法的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例10
按照实施例9的方法制备和纯化重组水蛭素,除了将蔗糖替换成果糖41g/L且将蛋白胨替换成氯化铵20g/L,将初始培养温度调整为25℃且灭菌条件调整为60℃,20分钟以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为5500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例11
按照实施例6的方法制备和纯化重组水蛭素,除了将发酵培养基不含磷酸氢二钠0.4g/L、硫酸钠1.2g/L、柠檬酸钠0.17g/L、氯化钠8g/L以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率:11500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%以上。
实施例12
按照实施例6的方法制备和纯化重组水蛭素,除了将发酵培养基仅含蔗糖41g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉13g/L、氯化铵6.5g/L以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为10500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%以上。
实施例13
按照实施例6的方法制备和纯化重组水蛭素,除了AMP的第二次加入是在发酵1小时后一次性加入以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为10600ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例14
按照实施例7的方法制备和纯化重组水蛭素,除了在培养过程中一次性添加的额外的10g/L的蔗糖和30g/L的蛋白胨在接种时已经被同时加入到发酵培养基中以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为6500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%。
实施例15
按照实施例6的方法制备和纯化重组水蛭素,除了接种量15%,蔗糖41g/L、蛋白胨FP318(琪酵母股份有限公司)22g/L、酵母粉FM818(安琪酵母股份有限公司)15.3g/L以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为13500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%。
比较实施例1
按照实施例2的方法制备和纯化重组水蛭素,除了在25℃下培养至对数生长期结束且然后升温至32℃以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为4500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%。
比较实施例2
按照实施例2的方法制备和纯化重组水蛭素,除了在20℃下培养至对数生长期结束且然后升温至50℃以外,其他均相同。
计算得到的水蛭素发酵产率为500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%。
比较实施例3
根据专利号为ZL 03 1 09244.6的方法:菌种按2%比例接种于1L液体种子培养基中,37℃,190r/min培养12h,得种子液。种子培养基:蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,氯化钠1%,氨苄青霉素100ug/m1,pH7.0;发酵培养基:蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,谷氨酸钠4%,麦芽汁12%,氨苄青霉素100ug/m1,pH6.5,37℃培养,通气量为4.48L/min,控制溶氧在12%左右,溶氧与转速级联控制。当发酵液pH值自然下降到6以下,通过补加酸碱控制pH值在5.7~5.9当发酵液pH值上升到8以上时,发酵培养结束。
计算得到的水蛭素发酵产率为5500ATU/ml,且本纯化方法得到的水蛭素纯度为电泳纯50%。
其中,以上实施例测试且计算的水蛭素产率总结在如下的表1中:
表1
虽然本发明所揭露的实施方式如上,但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式,并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员,在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下,可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化,但本发明的专利保护范围,仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (19)
1.一种生产重组水蛭素的方法,其特征在于,包括:将pBH-2工程菌保藏号:CGMCCNo0908接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中,在需氧条件下,在28℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束,然后在1小时内升温至37℃-45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值,其中所述发酵培养基还包含磷酸盐、镁盐、钠盐或其组合,所述培养基还包含铁盐、锰盐、铝盐、钴盐、锌盐、铜盐、镍盐、硼酸、维生素B1中的一种或更多种;
其中所述发酵培养基还含有抗生素物质,所述抗生素物质为氨苄青霉素;所述抗生素物质分两次加入发酵培养基中,其中第一次加入是在接种时以0.04g/L的量加入,且第二次加入是在菌体培养至对数生长期结束之前;所述抗生素物质的第二次加入是以流加的形式进行按每分钟补入基于培养基溶液的总体积计的0.033 mg/L的速度加入占培养基0.02g/L的抗生素物质。
2.根据权利要求1所述的方法,其中继续培养3-16小时或更长,使得水蛭素产量达到峰值。
3.根据权利要求2所述的方法,其中在30℃的温度下培养至对数生长期结束,然后升温至42℃继续进行培养3-16小时或更长。
4.根据权利要求1所述的方法 ,其中升温过程在10分钟内完成。
5.根据权利要求4所述的方法,其中升温过程在5分钟内完成。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述碳源物质选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述碳源物质为蔗糖,或所述碳源物质为蔗糖与选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种的组合。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述氮源物质选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者,或所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者与选自玉米浆、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种的组合。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比为0.2-40:1。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比为1.1:1。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或更多种;所述镁盐为硫酸镁或氯化镁;所述钠盐选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、醋酸钠中的一种或更多种。
13.根据权利要求1所述的方法,其中以1%-20%的接种量将所述pBH-2工程菌保藏号:CGMCC No0908接种至所述发酵培养基。
14.根据权利要求13所述的方法,其中以15%的接种量接种。
15.根据权利要求1所述的方法,其中菌株培养初始pH值为5.5-11。
16.根据权利要求15所述的方法,其中菌株培养初始pH值为6.5-8.0。
17.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括以下步骤:
对菌株发酵液进行灭活处理,灭活温度60℃-80℃;灭活时间为5min-20min;
灭活处理后的菌株发酵液经0.1~1μm孔径的陶瓷膜进行固液分离,纯化水水洗,收集陶瓷膜透析液,陶瓷膜透析液再用3万分子量以下孔径的超滤膜浓缩,向浓缩后的浓缩液加重量比为5%-30%的盐进行喷雾干燥。
18.根据权利要求17所述的方法,所述方法还包括以下步骤:灭活温度75℃;灭活时间为10min;
灭活处理后的菌株发酵液经0.1~1μm孔径的陶瓷膜进行固液分离,纯化水水洗,收集陶瓷膜透析液,陶瓷膜透析液再用3万分子量以下孔径的超滤膜浓缩,向浓缩后的浓缩液加重量比为5%-30%的盐进行喷雾干燥。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述发酵培养基的组成物质分两次加入,其中第一次加入是在接种前加入,第二次加入是于接种后以流加的形式加入且在11小时内完成。
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