KR930007429B1 - 인터페론의 정제방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인터페론의 정제방법

본 발명은, DNA 재조합 기술에 의해서 얻어지는 생리활성을 가진 폴리펩티드, 특히 생리활성을 가진 폴리펩티드에 대한 유전암호를 지정하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 형질전환된 미생물에 의해서 생산되는 폴리펩티드에 변성되지 않게 또한 프로테아제에 의해 분해됨 없이 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 앤터페론활성, 특히 인체의 면역(또는 감마) 인터페론활성을 가진 폴리펩티드를 생산할 수 있는 미생물의 배양물로부터 목적하는 폴리펩티드를 정제하기 위한 효과적인 방법을 제공한다.

기술의 배경

인터페론 단백질은 항원 및 구조의 차이에 입각하여 알파, 베타 및 감마의 3종(각각 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ로 약칭함)으로 분류된다. 감마 인터페론은 알파 및 베타 인터페론과 구별되는 많은 특징을 가지고 있다. 이들의 차이점으로서는 항원구별성과 면역조절 및 항 종양효과에 대한 보다 강한 활성을 갖는다는 점 등이 있다. 인체의 감마 인터페론(이하 "h-IFN-γ"라 칭함)은 T-임파구가 감지하는(sensitize) 면역원 또는 항원에 의해 자극을 받아 T임파구에 의해서 생산할 수 있다. 또한 인체의 감마 인터페론은 종래 기술로 알려진 클로닝(cloning) 및 발현기술에 의하여 생산할수도 있다.

최근에 와서 유전공학 기술의 발전으로 인하여, 종래는 생체로부터 분리, 정제에 의존하였던 많은 생리활성 폴리펩티드를 미생물이나 동물세포로부터 생산하는 것이 가능하게 되었다. 그러나 이들 목적물질을 약제로서 사용하기에 충분할 만큼 순수하게 추출, 정제하는 방법 또한 변질시키거나 분해시키지 않고 추출, 정제하는 방법은 아직 확립되지 못하고 있다.

그러나 얻어진 감마 인터페론을 함유하는 세포를 수집하여 삼투압 쇼크, 초음파진동, 분쇄 또는 강력 전단파쇄와 같은 여러가지 수단으로 파쇄하고 이렇게 파쇄된 세포-감마 인터페론 혼합물을 곧 처리하여 감마 인터페론을 분리하고 있다. 불용성 파쇄 부스러기는 원심 분리기에 의하여 분리해내고, 감마 인터페론을 함유하는 상층액(supernatent)은 정제하기 위하여 수집된다.

재조합된 미생물이 생산해내는 폴리펩티드를 염산 구아니딘이나 요소등을 사용하여 추출, 정제하는 방법(일본국 특개소 59-161321호 공보 및 미국 특허 제 4,476,049호)과 모노 클로널(monoclonal)항체를 사용한 정제법(일본국 특개소 59-186995호 공보) 등 정제법에 관한 기술이 제시되어 있지만, 이들의 방법에 있어서도 목적하는 물질이 변성되지 않고 그 활성이 손상되는 일없이 충분히 정제될 수 있는 것은 아니다.

유럽 특허 출원 제 0,087,686 호는 세포를 함유하지 않는 상충액으로부터 또는 조제(粗製)의 인터페론 원료로부터의 추출액에서 인체면역 인터페론을 정제해내는 3공정의 제조법이 기술되어 있다. 제 1 공정(자연 산출 인터페론에 대하여)에서는 콘가나발린-에이 세파로스(Concanavalin-A Sepharose)와 같은 친화성 컬럼(affinity column)이 사용되며 다음에 염(salt)증가 구배를 사용하는 카복시 메틸 실리카 칼럼으로 크로마토그라피를 수행하고 마지막으로 실리카 겔 투과 컬럼으로 크로파토그라피를 수행한다. 만약 충분한 순도를 얻지 못할 경우, TSK나 CM컬럼에 의한 농축 및 크로마토그라피가 수행된다.

유럽 특허 출원 제 0,063,482 호에는 (1) 제어된 포어글라스염주(Pore Glass beads) : (2) 콘카나발린-에이 세파로스 : (3) 헤파린-세파로스 또는 프로시온 레드 아가로스 : 및 (4) 겔여과를 사용하는 크로마토그라피 방법을 사용하는 정제공정이 기술되어 있다.

유럽 특허 출원 제 0,017,498 호 및 제 0,077,670 호는 (1) 폴리에틸렌이민의 침전 : (2) 박테리아 단백질의 pH 침전 : (3) 농축 및 투석 : (4) a) 카복시메틸 셀룰로스 : b) 인산 칼슘 : c) 카복시메틸 셀룰로스 : 및 d) 여과수지 겔에 의한 크로마토그라피를 수행하는 정제방법이 기재되어 있다.

이들 정제방법은 수많은 공정을 필요로하며, 인터페론 분자의 분해 또는 응집에 의한 인터페론의 감성(減成)을 발생시키거나 또는 그렇지 않으면 낮은 수율로 또는 낮은 활성의 감마 인터페론 생성물 밖에 얻을 수 없다.

목적물질의 활성을 손상시키지 않고 혹은 변성이 일어나지 않도록, 목적물질을 생산하는 미생물의 배양물로부터의 목적 폴리펩티드를 추출, 정제하는 방법은 그 폴리펩티드를 의약품으로 사용할 경우에 중요한 것이며, 그 기술의 확립은 산업상 매우 유용한 것임은 말할 것도 없다.

이러한 정제방법은 현재 의약품으로서의 이용이 진행되고 있는 인터페론에 대하여 특히 기대되고 있다. 인터페론은 항 바이러스 활성을 가지고 있으나, 그중에서도 IFN-γ는 특히 세포증식억제 작용이 강하므로 항 종양제 및 면역 조절제로서의 이용이 기대된다. 또한 인터페론 활성은 몇가지 특이성이 있으므로 예를들면 인터페론을 약제로 인체에 사용할 경우, 인체에서 비롯된 인터페론을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 유전공학에 의해 생산되는 인터페론에서는 추출, 정제공정의 확립이 기대되고 있다.

보통 재조합된 미생물로부터 얻은 폴리펩티드의 추출, 정제에 있어서, 먼저 배양된 미생물은 살균제를 사용하여 죽인 다음(안전성의 견지에서 필요한 공정임), 죽은 세포들을 파쇄시키고 그후에 추출을 수행한다. 이들 처리과정에서 목적하는 폴리펩티드가 때때로 변성하거나 그 활성이 손상되는 일이 있다. 또한, 이들의 처리과정에서는 세포에 함유된 프로테아제의 활성화를 일으키기 쉽고 때로는 목적하는 폴리펩티드가 분해되는 일도 있다.

세포 또는 재조합된 미생물로부터 폴리펩티드를 정제할 경우, 요소 또는 염산 구아니딘과 같은 변성제를 사용하여 변성되고 용해화된 단백질을 추출하고, 정제과정에서 변성제를 제거하는 방법이 발표되어 있다(일본 특개소 59-161321호 공보, 미국 특허 제 4,476,049 호 등).

그러나 변성제를 제거할지라도 목적하는 폴리펩티드가 완전하게 원상태로 복귀된다는 보증을 얻기가 어렵다. 그러므로 이 방법은 목적하는 폴리펩티드를 의약품으로 사용할 경우에는 바람직하지 못한데 그 이유는 일부 변성된 폴리펩티드가 혼합될 경우는 항원으로도 될 수 있기 때문이다. 한편, 모노클로널 항체를 사용한 정제법도 보고되어 있다(일본 특개소 59-186995 호 등). 사용된 모노클로널 항체에 의해 판별할 수 있는 항원의 결정인자에 좌우되어 변성되고 바람직하지 못하게 된 폴리펩티드 또는 다이머(dimer) 및 트리머(trimer)와 같은 중합체화된 폴리펩티드가 모노클로널 항체에 결합될 수 있다고 생각할 수 있다. 최근에, 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 분해를 저지할 목적으로 프로테아제 억제제의 공존하에 재조합된 에스체리키아 콜리(Escherichia coli)가 생산하는 h-IFN-γ을 추출하는 방법이 상기 미국 특허에 발표되었으나, 거기서 사용되는 염산 구아니딘은 또한 단백질 변성제로서 알려져 있으며(예로서 일본 특개소 59-161321 호 공보), 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 분해를 억제시킬 수 있기는 하나 변성 단백질이 생산될 것이 예상된다.

(1) 감마 인터페론이 생산된 세포의 파쇄 부스러기로부터 감마 인터페론을 분리하는 정제 방법을 제공하고 : (2) 세포 불순물로부터 높은 산출율, 높은 순도, 그리고 높은 활성도의 감마 인터페론을 분리하고 : (3) 재조합된 감마 인터페론을 세포 불순물로부터 분리하고 : (4) 실질적으로 인터페론을 감성시키지 않고 세포 불순물로부터 감마 인터페론을 분리하는 것이 바람직할 것이다. 이하에 설명하는 방법이 그 바람직한 분리방법이다.

발명의 공개

본 발명에 의한 정제방법은 폴리펩티드의 변성을 가져오지 않고 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 분해를 억제하면서 실질적으로 순수한 형태의 목적하는 생리활성을 가진 폴리펩티드를 효과적으로 제공한다. 또한 본 발명은 h-IFN-γ활성을 가진 폴리펩티드의 정제에도 수행될 수 있지만, 또한 본 발명의 방법은 h-IFN-γ 이외의 다른 폴리펩티드의 추출 및 정제에도 적용할 수 있는데, 재조합된 미생물이 생산하는 Arg-Lys 및 Arg-Arg와 같은 프로테아제에 의한 분해를 받기 쉬운 부위를 함유하는 h-IFN-γ 이외의 다른 폴리펩티드의 추출, 정제에도 적용될 수 있다.

본 발명은 추출공정에서 1종 이상의 아연 또는 구리염과 폴리에틸렌이민(이하 PEI로 약칭함)을 첨가하므로서 상기 문제점을 해결한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 재조합된 미생물의 배양세포를 1종 이상의 아연 또는 구리염을 함유하는 완충제 용액속에 현탁시키고 세포를 파쇄시킨 다음, 원심분리하여 얻은 상층액에 PEI를 첨가한 후 연속적으로 적당한 정제공정을 거치게 하는 것이다.

아연 또는 구리염으로 사용할 수 있는 화합물로는 염화아연, 황산아염, 아세트산아연, 아세틸아세토네이트아연, 황산구리가 있으나 그 중에서 염화아연, 아세트산아연 및 황산구리가 바람직하다. 이들 염류의 첨가량은 펩티드 생산 균주에 의해 염의 적정 농도에 차이가 있으나 일반적으로는 아연 염의 경우 0.5-5mM, 바람직하게는 1-3mM이며, 구리염의 경우는 0.01-3mM, 바람직하게는 0.25-1mM의 농도이다.

이들 염을 상기 농도로 완충용액과 혼합하고, 배양균을 상기 용액에 현탁한 후 균체를 파쇄하고 원심분리하여 상층액을 얻는다. 이 상층액에 PEI를 첨가하여 최종 농도 0.5 내지 1.1%를 달성한다. PEI를 첨가하면 또한 불순한 단백질의 상당한 량을 침전시키는 기능을 발휘한다. PEI첨가후, 상층액을 충분히 낮은 온도(예를들면 4℃)로 방치한 다음 생긴 침전물을 제거하기 위하여 원심분리를 수행한 후 목적하는 물질을 종래의 방법으로 정제한다. 이 정제는 종래부터 사용되고 있는 여러 컬럼과 투석법을 결합하여 수행될 수 있다. 경우에 따라서, 염석을 공정중에 포함시킬 수도 있다. 구체적으로 다음 설명하는 실시예에서 설명한다.

본 출원 이전에, IFN-β생산에 있어서 배양배지에 아연염을 첨가하면 IFN-β의 생산성을 높일 수 있다는 보고가 있었다(일본 특개소 59-146597 호 공보). 그러나 그 보고는 단순히 배양중 역가(力價)의 향상을 목적으로 한 것이며, 본 발명에서와 같이 추출하는 단계에서 PEI와 동시에 염을 첨가하는 것을 설명하는 것은 아니었다. 정제공정에서 구리 화합물을 사용하는 것에 관하여는 일본 특개소 59-1697597 호 공보에서 구리 킬레이트 수지 컬럼을 사용하는 예가 보고되고 있으나, 그 발명은 예비 정제한 IFN 용액의 정제방법에 관한 것이다.

상기 발명들의 중전 보고는 시종 단백질을 변성 및 분해시키지 않고 정제하는 것을 목적으로, 추출시에 염을 첨가하는 것을 특징으로 하는 본 발명과는 본질적으로 다른 것이다. 본 발명의 다른 또하나의 목적은 본 발명의 추출정제법에 의하여 얻을 수 있는 h-IFN-γ활성을 가진 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

h-IFN-γ활성을 가진 폴리펩티드를 생산할 수 있는 균주중의 하나인 W3110/pIN5T4의 조성에 대해서는 유럽 특허 출원 제 0,134,673 호에 발표되어 있다. 그 균주에 의해 생산된 폴리펩티드는 GIF 146이라 불리우며 다음의 아미노산 배열(Ⅰ)에 의해 표시된다.

GIF 146을 생산하는 균주는 상술한 GIF 146에 대한 유전암호를 지정하는 DNA 단편을 함유하는 플라스 미드 벡터에 의해 형질전환된 에스체리키아 콜리 W3110이며, DNA배열(Ⅱ)로 표시된다.

한편, h-IFN-γ활성을 가지며 아래 아미노산의 배열(Ⅲ)에 의해 표시되는 폴리펩티드(GIF 143이라 칭함)을 생산할 수 있는 균주(W3110/pIN5T4N 143)는 참고여에서 설명하지만 이하에서와 같이 조성할 수가 있다.

상기 아미노산의 배열에서, GIn*은 GIn 또는 p-GIn을 표시한다.

또한 폴리펩티드(GIF 143)에 대한 유전암호를 지정하는 DNA배열에 의해 표시되는 DNA단편은 목적하는 플라스미드 벡터의 조성에 사용될 수 있다.

첨부도면 제1도를 참조하여 설명하면, 우선 P GIF 54(일본국 특개소 58-201995호 중에 발표되어 있는 P GIF 4와 실질적으로 동일한 플라스미드)의 Aat Ⅱ와 Bgl Ⅱ 절단에 의하여 얻어지는 DNA 단편을 다시 Ava Ⅱ로 처리하여 제 1 도에 도시된 바와 같은 Ava Ⅱ-Bgl Ⅱ DNA 단편을 얻었다. 다음에, pIN5T4(유럽 특허 출원 제 0,134,673 호에 기술됨)를 Bgl Ⅱ와 EcoRI로 처리하여 얻어진 테트라시클린 내성유전자(TC^r)를 갖고있는 더 긴쪽 DNA단편의 EcoRI부위와 상기 Ava Ⅱ-Bgl Ⅱ의 Ava Ⅱ 단편사이에,

5'-AATTCATGCAG-3'

3'-GTACGTCCTG-5'

로 표시되는 합성링크 DNA단편을 DNA리가제의 존재하에 삽입시키는 것으로써 목적하는 플라스미드 pIN5T4N 143을 얻었다. 그 결과 얻은 플라스미드는 GIF 146의 N-말단측에 3개의 아미노산 잔기로 되는 배열, 즉 Cys-Tyr-Cys가 제거된 GIF 146에 대응하는 폴리펩티드 GIF 143에 대한 유전암호를 지정하는 유전자를 함유한다. 연속적으로 이 플라스미드를 사용하여 숙주(E.Coli W3110)를 종래의 방법에 따라 형질전환시켜서 GIF를 생산하는 형질전환된 에스체리키아 콜리(W3110/pIN5T4N 143)를 얻는다.

모든 도면에 있어서, 정제방법은 균질화된 감마 인터페론 함유 세포의 원심분리에 의해서 생기는 상층액으로부터 헥산을 제거하는 것으로 시작된다. 그 이전의 공정은 설명을 기하기 위하여 표시되었으나 본 발명의 일부분은 아니다.

또한 실시예에서는 아연의 염으로서 염화아연을 사용한 정제예를 설명하지만 염으로서는 이에 국한되지 않고 예를들면, 황산아연, 또는 아세트산아연과 같은 아연염, 또는 항산구리와 같은 구리염을 사용하여도 좋다. 표 1은 여러가지 금속염 화합물의 프로테아제 억제효과를 표시하는데 이러한 효과의 시험은, 금속화합물 1mM 또는 0.2mM를 함유하는 완충용액내에서 재조합된 박테리아의 세포를 파쇄시키고 그 상층액에 함유된 h-IFN-γ활성을 가진 폴리펩티드의 안정성을 지표로 하여 측정하므로서 수행되었다. 표 1에서 분명한 바와 같이, 염화아연과 마찬가지로 황산아연, 아세트산아연, 아세틸아세토네이트아연, 및 황산구리등이 소기의 효과가 있는 것을 알게되었다.

[표 1]

제5도(사진)는 h-IFN-γ활성을 가진 폴리펩티드의 안정도를 표시하는 SDS-PAGE의 모형이다(이 도면에서 GIF 146으로 표시한 화살표는 단백질 밴드임). 시험표본은 각종 농도의 염화아연을 함유하는 바람직한 완충용액내에서 세포들을 파쇄하여 조제되었다.

제5도에서 h-IFN-γ활성을 가지는 폴리펩티드는 0.5 내지 2mM의 염화아연의 존재하에서 안정하며 염화아연을 함유하지 않을 경우 또는 저농도의 경우에서는 분해되기 쉽다는 것을 나타내고 있다. 화살표 "B"로 표시하는 단백질 밴드는 정제공정중 프로테아제에 의해서 GIF 146이 부분분해된 폴리펩티드의 밴드이다. 또한 2-1로 표시되는 샘플은 2mM의 Zncl₂를 사용하여 동일하게 처리하고 또한 정제를 더 진행시킨 단계에서 얻은 표본에 의한 것이다. 또한 2-2로 표시되는 표본은 Zncl₂를 사용하지 않고 처리한 후에 정제를 진행시킨 단계에서 얻은 것이다. 염화아연 대신에 황산구리를 사용한 동일한 시험예를 제 6 도(사진)에 도시하였으나 이 경우 0.1 내지 4mM의 범위에서 원하는 바의 결과가 관찰된다. 이들 염은 농도가 높은 쪽이 충분한 프로테아제 억제작용을 나타내었으나, 이들 염은 가능한한 낮은 농도로 사용하는 것이 좋은데 그 이유는 정제공정에서 이들 염을 최종적으로 제거해야할 필요가 있으므로 그 농도를 가능한한 낮게 하는 것이 바람직하다. 염화아연의 경우, 1 내지 3mM, 황산구리의 경우는 0.25 내지 1mM의 범위로 사용하는 것이 바람직하다.

제7도(사진)는 GIF 143을 생산하는 박테리아에 대하여 제 5 도에서 행한 것과 동일하게 처리하여 얻는 사진이다. 이 도면에서 GIF 143이라고 표시된 화살표에 의해 가리켜진 단백질 밴드는 h-IFN-γ활성을 가진 폴리펩티드이며, "E"는 GIF 143의 프로테아제에 의한 부분분해 폴리펩티드를 나타낸다.

파쇄된 세포와 감마 인터페론 혼합물내에 있는 주된 불순물은 미세입자 및 수용성 유분이며, 수용성 유분은 핵산, 프로테아제, 세포단백질, 탄수화물, 지방에스테르, 인터페론 분해단편, 및 인터페론 응집물 및 인터페론이 생산된 세포의 파쇄에 의해서 생기는 기타 단편들이다. 본 발명자는 인터페론 함유 혼합물을 다음의 구체적 순서로 처리하여 인터페론의 감성을 극소화시키고 인터페론 함유 혼합물로부터 이하에 기술된 순서로 불순물을 제거함으로써, 생물학적 활성을 보유한채 양호한 수율을 갖는 높은 순도의 감마 인터페론을 얻을 수가 있다.

충분하게 개선된 순도 및 활성은 다음 순서로 인터페론 함유 혼합물내의 불순물을 제거하는 것에 의해서 얻을 수 있다.

1) 핵산 : 2) 음으로 하전된 프로테아제 및 불순물 세포 단백질 ; 3) 양으로 하전된 프로테아제 및 불순물 세포 단백질 ; 및 4) 분해되고 응집된 인터페론.

상기 공정의 순서는 본 발명에 의한 소기의 결과를 달성하는데 있어서 필수적인 것이다. 상기 열거한 불순물을 특정한 순서로 제거하는 것을 전제로 하여, 고분자량 소수성 물질과 같은 기타 불순물이 존재할 경우 추가공정에 의해서 그 불순물을 제거할 수 있다. 이들 기타 불순물은 공정 3 또는 공정 4 다음에 제거하는 것이 편리하다.

이러한 분리를 달성하는 많은 방법이 공지되어 있다. 상술한 바와 같이, 가장 평온한 조건하에서 분리를 수행하여 인터페론의 감성을 가장 적게 할 수 있는 이들 방법이 가장 바람직한 것이다.

본 발명자들은 최초의 폴리에틸렌이민 침전을 수행시킨 다음 얼마간의 크로마토그라피에 의한 분리를 수행하는 것에 의하여 상기 특정한 순서로 불순물을 제거하는 방법이 바람직한 방법이라는 것을 발견하였다. 크로마토그라피 분리에서 사용되는 수지 및 그 사용순서는 다음과 같다.

1) 음이온 교환수지 ; 2) 양이온 교환수지 ; 3) 분자체.

크로마토그라피 분리에 의하여 침전, 여과, 농축 및 투석 등의 공정을 사용하는 것이 유익하다.

바람직한 방법에 있어서, 감마 인터페론을 함유하는 혼합물은 다음 공정을 수행한다.

1) 폴리에틸렌이민 침전법을 사용하는 것에 의한 헥산의 제거 ; 2) 약염기성 음이온 교환수지를 사용하는, 음으로 하전된 프로테아제 및 불순물 세포 단백질의 제거 ; 3) 약산성 양이온 교환수지를 사용하는, 양으로 하전된 프로테아제 및 불순물 세포 단백질의 제거 ; 4) 분자체를 사용하는 분해 및 응집된 인터페론 및 세포단편의 제거.

각 공정후 여과하고 공정 3 및/또는 공정 4 다음에 농축하고 공정 5 다음에 투석을 하는 것이 유익한 부가적 공정이다.

상기 새로운 방법에서는 5% 이상의 수율로, 95% 이상의 순도를 갖는 감마 인터페론이 확실하게 생산되었다.

본 발명의 중요한 특징은 새로운 정제방법인데, 이 방법은 조직배양에 의해서 증식된 인체의 세포로부터, 혈액 샘플에서 수집된 백혈구로부터, 또는 이 분야에서 잘 알려져 있는 클론닝(cloning)기술과 같은 많은 방법중 임의의 방법에서 생산된 감마 인터페론의 사용에 적합하다. 이 정제방법은 에스체리키아 콜리 세포에서 회수한 재조합된 감마 인터페론을 정제하는데에 특히 적합하다. 세포는 예를들면 클로르헥시딘 글루코네이트와 같은 화학살육제를 첨가하는 것과 같은 표전방법의 어느 하나에 의하여 비활성화된다. 이 비활성화 세포를 원심분리시키고 완충액내에 재현탁시켜 균질화시킨다. 감마 인터페론을 함유하는 세포의 균질화를 위한 편리한 방법은 만톤-가울린의 균질화기를 사용하는 전단 파쇄법이다. 파쇄된 세포를 원심분리에 의하여 침전물과 상층액으로 분리한다. 이 방법에서 얻은 상층액은 여기서 설명하는 방법에 의하여 분리 및 정제되는 감마 인터페론의 적절한 원료이다.

용해된 세포의 현탁액은 단백질, 지방에스테르, 탄수화물, 핵산 및 불용성 세포의 파쇄 부스러기를 함유하고 있다. 종래의 방법을 사용하여, 불수용성 성분은 상층액속에 남아있는 세포의 수용성 파편으로부터 분리된다.

세포로부터 감마 인터페론을 추출하기 앞서서 어떤 예비적 처리, 예를들면 처리중 인터페론의 감성을 극소화시키는 방법을 수행하는 것이 흔히 바람직하다. 어떠한 예비처리도 이것이 본 발명의 정제방법을 방해하지 않는 것을 전제로 사용될 수 있다.

다공정 정제방법에 의하면 생물활성을 유지하면서 높은 순도를 갖는 인터페론의 고수율이 달성된다. 분리공정의 순서는 극히 구별성이 있으며 발표된 소기의 결과를 달성하는데 결정적 역할을 한다.

인터페론 함유 혼합물로부터 불순물을 제거하는 순서는 다음과 같다.

a) 핵산의 제거 : b) 음으로 하전된 프로테아제 및 불순물 세포 단백질의 제거 ; c) 양으로 하전된 프로테아제 및 불순물 세포 단백질의 제거 ; d) 저분자량 및 고분자량의 불순물, 분해된 인터페론 및 인터페론 응집물의 제거.

현재 아직 이유는 알려져 있지 않으나, 상기 순서에서의 불순물 제거는 생물활성을 유지한 정제 감마 인터페론에 대하여 높은 수율을 달성하는데 있어서 결정적으로 중요한 것이다. 각종의 불순물을 제거하는데 사용되는 개개의 공정은 종래적인 것이며 이 기술분야에서 공지되어 있다. 감마 인터페론이 가혹한 공정조건하에서는 분해 또는 응집하여 불활성체로 되는 경향이 있기 때문에, 가장 평온한 처리조건하에서 수행할수 있는 정제공정이 바람직하다.

인터페론의 감성을 극소화시키는 것으로 판명된 구체적 처리공정 및 조건을 사용하여 본 발명을 더 설명하자면 불순물 제거의 순서를 기술한 바와 같이 유지하는 것을 전제로 하여 발표된 방법을 다른 종래적인 처리공정으로 변환시킬 수가 있다.

아래 설명에서 별도로 언급하지 않는한 주어진 pH값은 일반적으로 ±0.5, 바람직하게는 ±0.25, 더욱 바람직하게는 ±0.1의 범위내에서 변화할 수 있다.

전도율의 측정치는 ±5mS의 범위에서 변화할 수 있으나 바람직하게는 ±3mS의 범위로 유지시키는 것이 바람직하다. 조작은 약 2°내지 15℃의 온도에서 수행된다.

처리방법의 제 1 공정은 핵산을 제거하는 것이다. 용해된 감마 인터페론을 함유하는 세포의 원심분리된 혼합물로부터 얻은 상층액에 폴리에틸렌이민을 첨가하므로서 상기 제거를 수행하는 것이 편리하다. 다른 방법으로는, 원한다면, 세포의 균질화 이전에 폴리에틸렌이민 용액을 첨가할 수도 있다. 교반시키면서, 폴리에틸렌이민을 최대농도가 약 0.8%에 이를때까지 서서히 첨가하여, 이 혼합물을 적절한 기간, 일반적으로는 약 30분 내지 90분 동안 정치한다. 다음 이 혼합물을 원심분리하여 상층액을 회수한다. 폴리에틸렌 이민을 10%(V/V) 수용액으로하여 용액전량에 대하여 약 0.7 내지 0.8%(V/V)가 되도록 충분한 양을 첨가할 경우에 우수한 결과를 얻을 수 있다. 이 용액의 pH값은 8±0.5, 바람직하게는 8±0.1이며 온도는 약 2°내지 15℃의 범위로 유지된다. 상층액내의 단백질 농도는 표준 쿠마시 블루-결합분석에 의하여 상기 공정 및 각각 다른 처리공정에서 측정된다.

핵산을 제거하는 다른 방법은 히드록시아페타이트 또는 고정화 PEI의 크로마토그라피를 사용하는 것에 의한다. 황산 프로트아민에 의한 침전은 다른 유용한 방법이다.

핵산 제거후 감마 인터페론을 함유하는 혼합물을 제 1의 제거공정을 거치게 한다. 프로테아제를 제거하는 가장 편리한 방법은, 음이온 교환수지를 사용하여 핵산 제거공정에서 얻은 상층액을 크로마토그라피하는 것이다. 4차 아미노에틸, 혼합 아민 또는 기타 염기 수지중간체 또는 P-아미노 벤질 셀룰로스와 같은 약염기 수지가 특히 유용하다.

4차 아미노에틸은 바람직한 음이온 교환수지이다. 4차 아미노에틸은 교차결합된 덱스트란, 셀룰로스, 아가로스 또는 아크릴계 지지체에 결합될 수가 있다. 상층액의 pH는 수산화나트륨 또는 기타 임의의 바람직한 염기를 사용하는 것에 의하여, 8.7±0.5, 바람직하게는 ±0.1로 조정한다. 이 용액의 전도율은 탈이온수를 첨가하는 것에 의하여 10mS이하, 바람직하게는 약 4 내지 8mS의 범위로 조정한다.

용출완충액은 20mM의 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진-프로판 황산나트륨 및 0.1%(V/V)의 2-머캅토에탄올을 함유하고 있다. 완충액의 pH는 수산화나트륨 또는 기타 염기를 사용하여 약 8.7로 조절시킬 수 있다. 피페라진 유도체 대신에 동일 pH범위로 사용하기에 적합한 다른 완충액을 대치할 수 있으며 또한 머캅토에탄올 대신에 기타 산화방지제로 대치할 수도 있다.

4차 아미노에틸컬럼은 완충용액으로 미리 예비 평형화하여 감마 인터페론 함유 용액을 첨가하고 이렇게하여 흡수물질을 같은 완충액으로 용출시킨다. 용출된 단백질 용액의 최초 3분의 2, 즉 전용적의 최초 3분의 2를 다음 정제공정으로 이송시키기 위하여 저장한다. 용출된 액의 나머지 3분의 1은 같은 방법으로 평형화시킨 같은 컬럼으로 다시 크로마토그라피 할 수 있다. 유동한 단백질의 최초 3분의 2는 다시 저장시킨다. 나머지 용액은 다시 같은 방법으로 처리할 수 있다. 상술한 바와 같이, 단백질 농도는 쿠마시블루-결합분석에 의하여 측정된다.

정제의 이 시점에서 임의의 농축공정이 사용될 수 있다. 용액을 농축시키는 한가지 편리한 방법은 황산암모늄에 의한 침전이다. 4차 아미노 에틸 컬럼에서 얻은 용출액은 0.2μ의 여과기를 통과시키고, 황산암모늄을 교반하에 5 내지 10분간에 걸쳐 첨가하여 최종농도가 약 40 내지 50% 포함상태가 되도록 한다. 이 현탁액을 얼음 욕탕에 수시간 동안 방치한다. 다음, 침전물은 원심분리법에 의해 회수하며 다시 처리가 필요하게 될때까지 약 -20℃로 보존할 수 있다.

필요한 경우, 미리 10,000의 분자량 차단 여과기를 통과한 20mM 트리스-HCl 및 0.1% 2-머캅토에탄올로 되는 용액(pH 약 7.5)에 침전물을 용해시킨다. 이 용액의 전도율은 10mM 트리스-HCl 및 0.1% 머캅토에탄올로 되는 용액(pH 약 7.5)을 첨가하는 것에 의하여 약 3 내지 5mS로 낮추게 된다. 이 용액을 0.2μ의 여과기에 통과시킨 다음 처리하게 된다. 트리스-HCl 대신에 그와 동일한 pH 범위에서 사용하기에 적합한 다른 완충제로서 대치할 수 있으며, 머캅토에탄올은 기타 산화방지제로서 대치할 수 있다.

용액에 양으로 하전된 프로테아제 및 기타 단백질들은 양이온 교환수지를 사용함으로서 편리하게 실시되는 다음 처리공정에서 제거된다.

카복시메틸 양이온 교환수지(교차결합된 덱스트란, 셀룰로스, 아가로스, 또는 아크릴 지지체에 부착된 카복시메틸)를 사용하는 것에 의하여 우수한 결과를 얻을 수 있다. 앞의 공정에서 얻은 용액의 pH는 HCl 또는 기타 적절한 산을 사용하여 pH 약 7.5로 조절한다. 2-머캅토에탄올 또는 기타 적절한 산화방지제를 약 0.1%(V/V)의 농도로 첨가한다. 0.1%(V/V)의 2-머캅토에탄올을 함유하는 탈이온수를 첨가하여 전도율을 20mS이하로, 바람직하게는 약 3 내지 5mS로 저하시킨다. 이 용액은 0.2μ의 여과기를 통과시킨 다음 크로마토그라피 시험에 대비한다.

양이온 교환수지컬럼을 20mM 트리스-HCl 및 0.1%의 2-머캅토에탄올을 함유한 용액(pH 약 7.5)과 같은 적절한 완충액으로 평형화시킨다. 평형화 컬럼을 평형화할 때 사용하는 완충액으로 2-3회 씻고 감마인터페론 함유 용액을 첨가한후 이 용액을 평형화할때 사용하는 완충액내에 용해시킨 염화나트륨의 구배(컬럼용적의 13-15배량)로 용출한다. 염화나트륨 함량은 완충액내에서 0 내지 약 0.5M의 농도로 증가된다.

적절한 유분(溜分)은 수집되어 겔 전기영동(SDS-PAGE), HPLC분석 및 항바이러스 활성등에 의하여 분석될 수 있다. 가장 순수한 유분을 다음의 처리에 대비하여 저장한다. 낮은 순도를 가진 인터페론을 함유하는 유분은 약 40-60% 포화 황산암모늄으로 침전시켜 재용해하고 여과하여, 전술한 바와 같이 카복시메틸 컬럼에 의해 다시 크로마토그라피 할 수 있다. 다시 크로마토그라피한 용액에서 수집한 유분을 분석하며 가장 순도가 높은 유분을 제 1의 카복시메틸용출액에서 얻은 유분과 함께 저장한다.

만약 고분자량의 소수성 불순물의 존재가 SDS-PAGE 또는 기타 적절한 방법에 의하여 검출된 경우에는, 이 용출액을 임의의 크로마토그라피 시험을 하여 정제방법에서의 이 단계에서 상기 불순물을 제거한다. 페닐수지에 의하여 만족스러운 결과가 얻어짐이 판명되었다. 또한, 옥틸 및 부틸 수지도 사용될 수 있다. 앞 공정에서 얻은 용액을 0.2μ의 여과기를 통하여 여과하고 염화나트륨(0.5-0.75M)을 가하여 용액의 도전율을 약 50-75mS로 상승시킨다.

완충액은 20mM 트리스-HCl, 0.1%(V/V) 2-머캅토에탄올 및 도전율을 적절한 범위로 상승시키기 위한 염화나트륨 또는 기타염을 함유한 용액이다.

컬럼은 완충액으로 예비평형화하고 샘플을 컬럼에 넣는다. 컬럼용적의 약 2-4배량이 완충액을 컬럼에 넣은 다음, 흡수된 물질을 용액의 컬럼용적의 1배 이상, 바람직하게는 약 5-10배량으로 용출시키는데, 이때 용액은 20mM 트린스-HCl, 100mM NaCl 및 0.1%(V/V) 2-머캅토에탄올을 함유한 용액(pH, 약 7.5)이다. 적절한 규격의 유분을 수집하고, SDS-PAGE, HPLC분석 및 항 바이러스 활성을 사용하여 분석한다. 이중 가장 순도가 높은 유분을 저장한다.

인터페론 함유 용액을 페닐 컬럼 크로마토그라피 처리후에 농축시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 또한 임의의 공정인 소수성 컬럼 크로마토그라피를 사용하지 않은 경우의 실례에서는, 이 시점에서 인터페론함유 용액을 농축시키는 것이 일반적으로 바람직하다.

용액의 단백질 농도는 구마씨 블루 결합분석(Coomassie blue binding assay)에 의해 결정된다. 단백질 농도가 0.2mg/ml 이하인 경우, 그 용액을 10,000분자량 차단막을 사용하는 한외여과(ultra-filtration)에 의해 용액을 농축하는 것이 바람직하다.

이 용액에, 황산암모늄 최종 농도가 약 40-60% 포화상태로 되도록, 5 내지 10분간 교반시키면서 황산암모늄을 첨가함에 의하여 더 농축시킬 수 있다. 현탁액을 얼음 욕탕에 넣어 방치한후 생긴 침전물을 원심분리하여 수집한다. 침전물을 20mM 트리스-HCl, 500mM NaCl 및 0.1% 2-머캅토에탄올을 함유한 용액으로 미리 10,000분자량 차단 여과기를 통하여 여과한 용액(pH, 약 7.5)에 다시 용해시킨다. 농축액은 0.2μ의 여과기에 통과시켜 다음 정제공정에 대비한다.

저분자량 및 고분자량 불순물과 분해된 감마 인터페론 및 인터페론 응집물을 최종 크로마토그라피 정제공정으로 제거한다. 이 공정은 앞의 처리공정으로부터 감마 인터페론 함유용액을 겔 여과수지에 통과시킴으로써 수행된다. 친수성 여과겔은 분자체로 작용하여, 용액내에 함유된 고분자 및 저분자 불순물로부터 적절한 규격의 유분을 분리한다. 특히 유용한 여과겔은 파마시아 파인 케미칼스 회사 제품인 세파덱스 G-100(상품명)으로서 특정되는, 교차 결합된 덱스트란을 기초로한 겔이다. 이 수지는 구상 단백질 및 펩티드에 대하여 4,000-150,000의 분획(分劃)분자량 및 다당류에 대하여 1,000-100,000의 분획분자량을 가진다. 단백질에 대하여 약 1,000-200,000의 분리범위를 가진 기타 수지도 또한 사용할 수 있다.

세파덱스-G100 수지컬럼은 20mM 트리스-HCl, 500mM NaCl 및 0.1%, 2-머캅토 에탄올을 함유한 완충액(pH, 약 7.5)으로 미리 평형화시킨다. 흡수된 물질을 상기 완충액으로 용출시킨 다음 적절한 유분을 수집한다. 각 유분의 단백질 농도를 쿠마씨 블루 결합 분석으로 측정한다. 각 유분을 SDS-PAGE, HPLC분석 및 항 바이러스 활성으로 판단된 순도에 의하여 합친다.

이와는 달리, 황산암모늄 농축공정에서 얻은 침전물을 20mM 인산나트륨, 500mM의 염화나트륨 및 0.1%(V/V) 2-머캅토에탄올을 함유한 용액(pH, 약 7.5)에 용해시킬 수 있다. 이 감마 인터페론 함유용액을 미리 상기 완충액으로 평형화시킨 세파크릴 S-200겔 여과 컬럼에 충전시킨다(세파크릴 S-200은 아크릴 아미드와 교차결합시킨 아가로스 수지에 대한 마마시아 케미칼스 회사의 상품명임). 최종 생성물은 투명 내지 약간 흐린 용액으로 무색 내지 연황색이다. SDS-PAGE에 의해 결정되는 분명한 분자량은 17,000 내지 19,500이다.

정제된 감마 인터페론은 전에 사용한 완충액에 투석시킨다. 적당한 완충액은 20mM의 인산나트륨 및 6mM의 L-시스테인을 함유하며 pH 약 6.8이다. 다른 적당한 완충액은 15mM의 인산나트륨, 8mM의 구연산나트륨 및 6mM의 L-시스테인 HCl을 함유한 pH 5.0의 용액이다. 8시간 이상 투석을 계속하며 전시스템내에 질소를 연속적으로 확산시켜 산화를 극소화시키는 것이 바람직하다.

필요하면, 정제된 감마 인터페론 용액을 상기의 방법으로 농축시킬 수 있다. 이하 본 발명을 참조예 및 실시예 1-3에 의하여 설명한다.

참조예 : (GIF 143 발현 벡터의 구성)

GIF 143 발현 벡터를 다음 순서에 따라 생산한다.

dcm 에스체리키아 콜리(시토신의 메틸화 반응이 결손된 균주) 형질전환체인 WA802/pGIF 54로부터 종래방법에 따라서 pGIF 54(GIF 146에 대해 유전암호를 지정하는 유전자를 포함하는 pGIF 4와 동등한 플라스미드)를 얻었다. pGIF 54(5㎍)를 20유니트의 Aar Ⅱ 및 20 유니트의 Bal Ⅱ로서 처리하고 약 600염기쌍의 GIF 146 유전자 일부와 lac UV5 촉진제를 포함한 DNA단편을 얻었다. 다음에 이 DNA단편 약 0.5㎍을 5유니트의 Ava II를 사용, 절단하여 GIF 146유전자의 일부를 포함한 약 400염기쌍의 DNA단편을 얻었다. 반면에 pIN 5T4, 5㎍을 20유니트의 EcoRI와 20유니트의 Bgl Ⅱ를 사용, 절단하여 테트라시클린 내성유전자, 1pp 촉진제 및 복제기점(replication initiation site)을 포함한 DNA단편을 얻었다. 양 DNA단편 및 제1도에 도시한 화학 합성 링커(DNA합성제, 즉 응용 바이오시스템 380A를 사용하여 합성) 0.5㎍을 혼합, 결찰(ligation)시켜 pIN5GN 143을 얻었다. 이렇게 얻은 pIN5T4N 143을 종래의 방법, 예를들면 일본국 특개소 제 63395/1983 호 기재방법에 의하여 W3110에 형질 전환하여 W3110/pIN5T4N 143을 얻었다.

이렇게 얻은 형질전환체가 GIF 143을 생산하는 균주인 것이 다음에 제시하는 순서에 의하여 확인되었다.

W3110/pIN5T4N 143을 폴리펩톤 3%, 효모추출물 2%, 글루로스 2%, KH₂PO₄0.5%, MgSO₄, 7H₂O 0.010% 및 테트라시클린 20㎍/ml을 함유하는 배지 1.5ml와 함께 16.5mm의 시험관에 넣고 30℃(OD₆₆₀=8)에서 진탕 배양한 후, 이 배양혼합액의 0.5ml을 1.5ml의 에펜돌프컵(Eppendorf cup)으로 이송시켜 원심분리(10,000r. p. m, 5분간)하여 집균되었다. 이것을 1mg/ml의 리소짐 1mM-EDTA를 함유하는 PBS용액(0.8%의 염화나트륨, 0.02%의 염화칼륨, 0.115%의 Na₂HPO₄, 0.02%의 NaH₂PO₄) 0.5ml에 현탁하여 0℃ 30분간 반응시켰다. 동결융해를 3번 반복하여 이 세포를 파쇄시키고 원심 분리(10,000r. p. m, 10분간)하여 상층액 단편을 회수했다. 이 상층액 단편을 일본국 특개소 201995/1983에 기재된 방법에 따라 항 바이러스 활성에 대해 검토하였다. 이 결과 6×10⁴유니트/ml의 항 바이러스 활성이 인정되었다. 한편, 동일하게 집균하여 얻은 균체를 SDS샘플용액(7M의 요소, 1%의 SDS, 1%의 2-머캅토에탄올을 함유하는 10mM의 인산염 완충액, pH 7.2) 200㎕에 용해한 다음 끓는 물 욕탕에서 10분간 가열하였다. 이 결과 얻은 샘플 20㎕를 13%의 SDS-PAGE로서 분리하고, 쿠마씨 블루 R 250으로 단백질 염색하였다. 이 결과, 에스체리키아 콜리 총 단백질의 약 20%에 상당하는 GIF 143 단백질(분자량 약 18kd) 생산을 확인하였다.

제1도는 본 발명의 정제방법이 적용되는 정제될 GIF 143을 생산하기 위한 에스체리키아 콜리의 형질전환용 플라스미드 벡터 pIN5T4N 143의 조성경로를 설명하는 도표.

제2도는 본 발명의 감마 인터페론 정제방법의 바람직한 태양을 도시한 과정도.

제3도는 주로 크로마토그라피 정제수단을 도시하는 본 정제방법의 보다 바람직한 태양의 과정도.

제4도는 본 발명의 특히 바람직한 태양의 과정도.

제5도는 각종 농도의 염화아연을 함유하는 완충용액속에서 세포(W3110/pIN5T4N 146)를 파쇄하고 이상층액을 SDS-PAGE에 종속시켜 얻어지는 단백질 밴드를 도시한 사진도.

제6도는 염화아연 대신에 황산구리를 사용하여 얻어지는 SDS-PAGE의 단백질 밴드를 도시한 사진도.

제7도는 각종 농도의 염화아연을 함유하는 완충용액속에서 세포(W3110/pIN5T4N 143)를 파쇄하고 상층액을 SDS-PAGE에 종속시켜 얻어지는 단백질 밴드를 도시한 사진도.

GIF 146의 추출 및 정제

GIF 146생산 균주인 W3110/pIN5T4를 3%의 폴리펩톤, 2%의 효모추출물, 2%의 글루코스, 0.5%의 KH₄PO₄, 0.01%의 MgSO₄, 7H₂O 및 20㎍/ml의 테트라시클린을 함유하는 배지에서 24시간 동안 통기시키면서 진탕, 배양하였다. 이 배양 혼합액의 세포들을 글루콘산 클로로헥시딘으로서 완전히 살균한후 원심분리(8,000r. p. m, 10분간)하여 W3110/pIN5T4 젖은 세포 800g을 얻었다. 이것을 pH값이 7.4이며 1mM의 ZnCl₂를 함유하는 냉각된 20mM 트리스-HCl완충액(이하 "THB"이라 약칭함) 5.1ℓ에 현탁시키고, 빙냉한 균질기 M15(맨턴 골린회사 제품)에 넣어 파쇄시킨 다음, 원심분리(7,000r. p. m, 20분간)하여 상층액을 얻었다. 이 상층액에, HCl로 조정하여 pH 8.0을 가진 폴리에틸렌이민(이하 "PEI"라 약칭함) 15% 수용액을 첨가하여 0.75%의 최종농도가 얻어지도록 하였다. 이 결과 얻은 용액을 10분간 교반한 다음 4℃에서 2시간 동안 방치하였다. 여기서 생성된 침전물을 원심분리(7,000r. p. m, 20분간)하여 제거함으로써 상층액 4.7ℓ를 얻었다. 이 상층액을 pH가 8.6인 20mM의 N-2-히드록시에틸-피페라지닐-N'-3-프로판술폰산 완충제(EPPS완충제)로서 균형화시킨 QAE세파덱스 A-25(파마시아 회사제품) 컬럼에 통과시켜 비흡수 단편을 얻었다. 다음, 0.1%의 2-머캅토에탄올(이하 "2-EM"라 약침함)을 함유하는 pH 7.4의 20mM THB로 균형화시킨 CM 세파로스 CL6B(파마시아 회사제품) 컬럼에 상기 단편을 넣어, 흡수된 활성단편을 0 내지 0.5M의 염화나트륨의 직선 농도 구배로 용출시켜 인터페론 활성이 높은 단편을 수집하였다. 또한 인터페론 활성은 일본국 특개소 제 201995/1983 호 공보에 기술된 방법에 따라 측정하였다.

다음, 이 단편에 황산암모늄을 첨가하여 50%의 포화상태가 되도록 한 다음, 염석을 수행하고, 20분간 7,000r. p. m으로 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물은 0.3M NaCl 및 0.1%의 2-ME를 함유하는 pH 7.4의 인산나트륨 완충제 20mM(이하 "20mMPBS"라 약칭함)내에 용해시켜 동일한 완충제로 균형화시킨 세파크릴 S-200(파마시아 회사제품) 컬럼에 넣어 최종정제품으로서 GIF 146에 대응하는 폴리펩티드 298mg을 얻었다(인터페론의 단위량에 대한 활성 : 1.6-1.7×10⁶μ/mg단백질)이 폴리펩티드의 SDS-PAGE에 의한 순도분석에서는 순도가 99% 이상이며 또 동일한 SDS-PAGE에 의한 밴드의 위치는 분해되지 않은 GIF 146의 위치와 일치하였다. 그리고 아미노산 분석에 의해서, 얻은 폴리펩티드가 상기 아미노산 배열(Ⅰ)과 동일한 아미노산 배열을 가지는 것도 확인되어서, 본 발명의 추출 정제방법이 유용하다는 것이 인정되었다.

또한 상기 정제과정중에서 사용한 세파크릴 S-200 대신에 세파덱스 G-100(파마시아 회상제품)을 사용하여도 동일한 결과를 얻었다.

[실시예 2]

GIF 143의 정제 추출

실시예 1과 동일하게 W3110/pIN5T4N 143(참조예를 참조)를 배양한 다음 글루콘산 클로로헥시딘으로 살균하여 집균하였다. 이렇게 하여 얻은 젖은 세포 300g을 3mM의 ZnCl₂를 함유하는 pH 7.4의 냉각된 20mM THB 2.1ℓ에 현탁시켜 균질화한 다음 원심분리(7,000r. p. m, 20분간)하여 상측액을 얻었다. 이것을 실시예 1과 동일한 방법으로 PEI처리하여, 1,000ml의 상층액을 얻었다. 다음, 이 액체를 0.1%의 2-ME를 함유하는 20mM THB(pH 7.4)로 균형화시킨 CM 세라포스 CL6B 컬럼에 흡수시키고 0.10-0.8M NaCl의 직선농도 구배로 용출시켰다. 활성 단편을 0.1%의 2-ME를 함유하는 20mM THB를 사용하여 최초분량의 10배로 희석하고, 상기와 같은 완충제로서 균형화시킨 CM-도요펄 컬럼(도요 소다회사제품)에 흡수시켜, 세척한후 0.1-0.8M NaCl의 직선 농도 구배로 용출하였다. 인터페론 활성을 가진 단편들을 수집하고 황산암모늄을 가하여 20%의 포화상태로 만든 다음 부틸 도요펄 컬럼(도요소다 회사제품)에 통과시켰다. 이 컬럼을 통과한 단편을 수집하고 증류수에 대하여 투석시켜 최종제품인 단백질 396mg을 얻었다(인터페론의 단위량에 대한 활성 4.8×10⁶μ/mg단백질).

실시예 1의 경우와 동일하게, 아미노산 분석 및 SDS-PAGE의 결과로부터 순도가 99% 이상이고 상기 아미노산 배열(Ⅲ)과 동일한 아미노산 배열을 가지는 폴리펩티드(GIF 143)가 얻어졌다. 그리고, 추출시에 첨가한 아연화합물은 원자 흡수분광 분석을 수행하여도 검출되지 않는다.

[실시예 3]

Ⅰ. 세포의 회수, 단백질의 유리 및 폴리에틸렌이민에 의한 침전

재조합된 감마 인터페론을 함유하는 불활성화된 에스체리키아 콜리(W3110/pIN5T4) 세포를 원심분리하여 회수한다. 세포를 1mM의 ZnCl₂를 함유하는 20mM의 트리스-HCl완충액(pH 7.5)에 다시 현탁시켰다. 이 세포는 곧 고압균질기에 의하여 파쇄시켰다. 세포의 파쇄물을 원심분리하여 상층액은 회수한다. 염산으로서 pH 8로 조정한 10%(V/V) 폴리에틸렌이민(PEI) 수용액을 상층액에 첨가하여 최종 PEI농도가 최고 0.8%가 되도록 한다. 이 혼합물을 원심분리하고 상층액을 회수한다.

Ⅱ. 4차 아미노에틸(QAE) 컬럼 크로마토그라피

PEI상층액의 pH를 4N NaOH를 사용하여 8.7로 조정한다.

탈 이온수를 첨가하여 도전을 10mS 이하로 감소시킨다. 1회분을 겔 1ℓ당 단백질 50g 이하의 부하로 GAE 컬럼에 수용시킨다. 이 컬럼은 부하를 걸기전에 20mM의 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진-프로판 술폰산 나트륨 및 0.1% 2-머캅토 에탄올의 완충액(pH 8.7)으로 컬럼을 균형화시킨다. 용출은 동일 완충액으로 수행한다. 단백질 용액을 회수하여 다음의 제 Ⅲ 공정에서 크로마토그라피한다.

Ⅲ. 카복시메틸(CM) 컬럼 크로마토그라피

공정 2에서 얻은 단백질 용출액의 pH값을 4N HCl을 사용하여 7.5로 조절하고 2-머캅토에탄올을 첨가하여 0.1%의 최종 농도가 되도록 한다. 0.1%의 2-머캅토에탄올을 함유하는 한외여과수로 희석하는 것에 의하여 도전율을 20mS 이하로 조절한다. 이 용액을 0.2μ의 여과기에 통과시킨후 겔 1ℓ당 단백질 35g 이하의 부하로서 CM컬럼에 충전시킨다. 이 컬럼에 부하를 걸기전에, NaCl로서 도전율을 20mS 이하로 조절한, 20mM 트리스-HCl과 0.1% 2-머캅토에탄올로 된 완충액(pH 7.5)으로 컬럼을 균형화시킨다. 컬럼용량의 2배 이상의 균형화 완충액을 사용하여 컬럼을 세척한다. 이 균형화 완충액에 용해된 0-0.5M NaCl의 농도구배로 감마 인터페론을 용출시킨다. 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔의 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 결정되는 단편을 결합시켰다.

Ⅳ. 페닐 컬럼 크로마토그라피

SDS-PAGE에 의해서 고분자량 불순물이 검출된 다음 페닐컬럼에 의한 크로마토그라피를 수행한다. 염화나트륨을 첨가하여 도전율을 50-75mS로 한 다음 용액을 겔 1ℓ당 단백질 15g 이하의 부하로 페닐컬럼에 충전한다. 이 컬럼에 부하를 걸기전에, 20mM 트리스-HCl, 0.5M NaCl, 0.1% 2-머캅토에탄올로 된 완충액(pH 7.5)으로 균형화시킨다. 샘플을 컬럼에 부하시킨후에 적어도 컬럼용적량의 균형화 완충액을 가한다. 이 컬럼은 20mM의 트리스-HCl, 0.15M의 NaCl, 0.1%의 2-머캅토에탄올로 된 용액(pH 7.5)으로 용출시킨다. 활성 단편들은 SDS-PAGE 및 항 바이러스 분석에 의해서 결정되는 활성단편을 결합시킨다.

Ⅴ. 황산암모늄 침전

결합시킨 카복시메틸(공정 Ⅲ) 또는 페닐(공정 Ⅳ) 단편의 단백질 농도가 0.2mg/ml 미만인 경우, 이 용액을 10,000 M. W. 차단형 막을 사용하는 한외여과에 의하여 농축시킨다. 황산암모늄을 최종농도 40 내지 60% 포화상태로 되도록 첨가한다. 필요하면, 침전물을 원심분리에 의해 회수하고 필요하면 약 -20℃에서 보존한다.

Ⅵ. 세파덱스 G-100컬럼 크로마토그라피

황산암모늄 침전물을 20mM 트리스-HCl, 0.5M NaCl, 0.1% 2-머캅토 에탄올로 된 완충액(pH 7.5)에 용해시킨다. 이 용액은 0.2μ의 여과기에 통과시키기 전 원심분리시킨다. 여과액을 미리 상기 완충액으로 균형화시킨 세파덱스 G-100컬럼에 충전시킨다. 부하는 겔 1ℓ당 단백질 3.5g 이하이다. 이 컬럼을 상기 완충액으로 용출하여 단편을 SDS-PAGE에 의해 결정된대로 결합시킨다.

Ⅶ. 정제된 감마 인터레론의 투석

결합시킨 세파덱스 G-100의 단편을 15mM 인산나트륨, 8mM 구연산나트륨, 6mM L-시스테인 HCl로 된 용액(pH 5.0)으로 투석시킨다. 투석은 최소한 5시간 간격으로 완충액을 2번 교환하면서, 완충액내로 질소를 계속 스파징(sparging)시켜 투석을 수행한다. 필요하면, 투석된 용액을 10,000분자량 차단형막을 사용하는 한외여과에 의하여 단백직 농도를 1mg/ml 이상으로 농축한다. 정제된 감마 인터페론의 용액을 0.2μ의 여과기에 통과시킨후 -20℃이하로 보존한다.

감마 인터페론을 함유하는 용액에 50%의 글리세롤을 첨가함에 의하여 약 -20°내지 -30℃의 온도에서 정제된 감마 인터페론을 최소한 수개월간 보존할 수 있다.

이 감마 인터페론은 0.2μ의 여과기를 통한 여고 및 20mM 인산나트륨과 6mM L-시스테인을 함유한 용액(pH, 약 6.8)에 대하여 투석함으로써 사용에 제공된다. 다른 방법으로서는, 투석용액을 15mM의 인산나트륨, 8mM 구연산나트륨 및 6mM L-시스테인 HCl을 함유하는 용액(pH, 약 5)으로 한다. 계속 질소를 스파징하면서, 투석을 8시간 이상 수행한 다음, 이 용액을 10,000분자량 차단형 여과기에 의하여 여과하는 것이 바람직하다.

이렇게 얻은 생성물은 순도 95% 이상의 감마 인터페론을 함유하며, 약 5% 이상의 수율을 가진다.

Claims (14)

1. DAN 재조합 기술에 의해서 얻어지는 생리활성을 가진 폴리펩티드를 생산할 수 있는 미생물을 배양하여 얻은 배양물로부터 폴리펩티드를 추출 및 정제하는 공정에 있어서, 아연염 또는 구리염 및 폴리에틸렌이민을 첨가하는 것을 특징으로 하는 생리활성을 가지는 폴리펩티드의 정제방법.
2. 청구범위 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드 생산 미생물의 배양물로부터 얻어지는 미생물 세포를 아연염 또는 구리염을 함유하는 용액에 현탁시켜 파쇄하고 이 파쇄된 세포들의 현탁액을 원심분리하여 얻어진 상층액(supernatant)에 폴리에틸렌이민을 첨가하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
3. 청구범위 제 1 또는 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성을 가진 폴리펩티드는 인터페론 활성을 가진 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
4. 청구범위 제 1 항에 있어서, 상기 아연염은 그 농도가 0.5mM-5mM 범위인 양으로 참가되며, 또는 상기 구리염은 그 농도가 0.05mM-3mM범위인 양으로 첨가되며 폴리에틸렌이민은 그 농도가 0.5-1.5% 범위가 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
5. 청구범위 제 1 항에 있어서, 감마 인터페론 함유 용액으로부터 음이온 하전된 불순물 단백질, 고분자량 물질을 제거하는 추가적 공정을 포함하며, 특히 1) 약 염기성 음이온 교환수지컬럼 크로마토그라피에 의하여 음으로 하전된 불순물 단백질을 제거하고, 2) 약산성 양이온 교환수지컬럼 크로마토그라피에 의하여 양으로 하전된 불순물 단백질을 제거한 다음, 3) 겔여과 수지에 의한 삼투 크로마토그라피로 저분자량 및 고분자량 물질을 제거하는 순차적 공정을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 정제방법.
6. 청구범위 제 5 항에 있어서, 양으로 하전된 단백질을 제거한 직후, 또는 저분자량 및 고분자량 물질을 제거한 직후에 감마 인터페론 함유용액으로부터 고분자량 소수성 물질을 제거하는 공정을 다시 추가하여 포함시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
7. 청구범위 제 5 항에 있어서, 음이온 교환수지는 4차 아미노에틸 수지이며 또한 약산성 양이온 교환수지는 카복시메틸수지이며 또한 겔여과수지는 세파덱스 G-100 또는 세파크릴 S-200에서 선택되며, 또한 감마 인터페론 함유 용액을 공정 1 즉, 황산암모늄에 의한 침전, 구체적으로는 한외 여과를 하고 황산암모늄에 의해 침전시키거나 한외여과와 황산암모늄에 의한 침전을 행한 다음에 농축시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
8. 청구범위 제 5 항에 있어서, 상기 공정이 산소를 함유하지 않는 환경에서의 시스테인 함유 완충액에 대한 감마 인터페론 함유용액의 투석을 최종공정으로 포함하는 폴리펩티드 정제방법.
9. 청구범위 제 1 항에 있어서, 1) 폴리에틸렌이민 및 아연 또는 구리염을 함유하는 혼합물을 원심분리하여 얻은 침전물을 상층액으로부터 분리하고 ; 2) 상기 1)에서 얻은 용액을 음이온 교환수지를 함유하는 컬럼에 흡착시켜 ; 3) 흡착물질을 용출시키고 ; 4) 양이온 교환수지를 함유하는 컬럼에 상기 3)에서 얻은 용출액을 흡착시키고 ; 5) 흡착물질을 용출시키고 ; 6) 겔여과수지를 함유하는 컬럼에 상기 5)의 용출액을 흡착시킨 다음 ; 7) 흡착물질을 용출시키는 공정을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
10. 청구범위 제 9 항에 있어서, 상기 공정 2에서 얻은 흡착물질은 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진-프로판 설폰산 나트륨과 황산화제로 구성된 완충액으로 용출시키고 또한 공정 4에서 얻은 흡착물질은 트리스-HCl 및 항산화제로 구성된 완충액으로 용출시키고 또한 공정 6에서 얻은 흡착물질은 트리스-HCl로 구성된 완충액으로 용출시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
11. 청구범위 제 10 항에 있어서, 음이온 교환수지는 4차 아미노에틸 수지이며, 양이온 교환수지는 카복시메틸 수지이며, 겔여과 수지는 세파덱스 G-100인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제방법.
12. 청구범위 제 10 항에 있어서, 항산화제는 2-머캅토 에탄올인 것을 특징으로 하는 정제방법.
13. 청구범위 제 1 또는 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성을 가진 폴리펩티드는 인체 면역성 인터페론 활성을 가진 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 정제방법.
14. 청구범위 제 1 또는 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성을 가진 폴리펩티드는 GIF 146 또는 GIF 143인 것을 특징으로 하는 정제방법.

Images