JPS6265695A - 屈折体の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は生化学的分離又は回収方法に関し、この方法
においては、微生物的に生産された蛋白質を含有する屈
折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ）が、それ
らを生産する微生物宿主から分離され又は回収される。

〔従来の技術〕

多くのタイプの蛋白質、特に医療的に使用される可能性
のある蛋白質、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）、イ
ンターロイキン−２（ＩＬ−２）　、ネコ白血病ウィル
ス抗原（ＰｅｌＶ）等が組換ｒ）ＮＡを含有する形質転
換された宿主細胞により生産されている。宿主細胞が所
望の異種性蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベ
クターにより形質転換され、そして次に該所望の蛋白質
の生産のために好都合な条件下で焙養される。

しばしば、宿主細胞により生産された異種性蛋（ｌＯ） 白質は、細胞中に溶解しているのではなく細胞内に沈澱
する。細胞内に生産された蛋白質は、それが精製された
生物学的に活性な物質にされる前に、細胞片から分離さ
れそして細胞から回収されなければならない。

Ｔ細胞から天然＋１．−２を精製する方法がＷａｔｓｏ
ｎ。

＋６等、Ｊ−、Ｅｘｐ４１ｅｄ、　（ｉ９７９）　１５
０　：　８４９−８６１；Ｇ１１ｌｉｓ。

Ｓ６等、Ｊ、Ｉｍｍｕｐｏｌｏｇ￥（ｉ９８０）　１２
４　：　１９５４−１９６２；Ｍｏｃｈｉｚｕｋ＋・０
・Ｙ・等・月ｍ　ｍ　！−ｎ　ｏｋ助捷、　（ｉ９８０
）卿：１８５−２０１；　Ｗｅｌｔｅ、　Ｋ、等１．１
．ｊｊｘｐ、Ｍｅｄ、　（ｉ９８２）−↓四：４５４−
４６４：ＦｉＰ　９２，１６３　、及びＥＰ　９４．３
１７に記載されている。一般にこれらの方法は硫酸アン
モニウムにより培養上清から蛋白質を沈澱せしめ、次に
クロマトグラフィーにより分画することを含む。

米国特許階４，４５０．１０３及び階４，４６２，９４
０　、並びにＤｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，等、！！ａ、ｊ、
ｕ−ｒｅ　（ｉ９８０）　２８７　：１９３−１９７は
、ＩＦＮ−β−生産性町−ｐＩＪからＩＦＮ−βを回収
する方法を記載している。前記の特許は、２−ブタノー
ル又は２−メチル−２−ブタノールにより細胞材料から
ＩＦＮ−βを抽出する方法を記載している。

１９８４年３月２８日に出願されそして１９８６年２Ｊ
ｌｌＩ日に特許されたに、Ｋｏｔｈｓ等の共有に係る米
国特許Ｎ［１４，５６９，７９０には＋１．−２仕産性
微ｔ１−物から１１，２を回収する方法が記載されてお
り、ごの方法においては微生物細胞膜が破砕され、この
破砕物が尿素のごときチャオトロピノク剤（ｃｈａｏｔ
ｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ）の水性溶液により抽出され、
ＩＬ−２が例えばドデシル硫酸ナトリウムにより可溶化
され、そしてＩＬ−２が還元側の存在下で分離される。

１９８４年ｌＯ月１７日に出願されそして１９８５年７
月２３日に特許されたＺ、５ｈａｋｅｄ等の共有に係る
米国特許１１ｈ４，５３０，７８７には、＋１．−２の
ごとき組換蛋白質をＯ−ヨードソ安息香酸を用いて酸化
し、該蛋白質がその天然対応物と同等に機能することを
保証する方法が記載されている。

蛋白質を回収するためのＬ記の技法は高価な試薬の使用
を必要とし、この試薬は該蛋白質の製剤化の前に該蛋白
質から除去されなけ相ばならない。

さらに、多くの異種性蛋白質が屈折体（ｒｅｆｒａｃｔ
ｉｌｅｂｏｄｉｅｓ）又は封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
　ｂｏｄｉｅｓ）の形で細胞内に蓄積し、これらは１０
００倍以上の倍率の位相差顕微鏡のもとて細胞中で可視
性の明るいスポットとして現われる。例えば、Ｍｉｌｌ
ｅｒ等、各１は駈（（ｉ９８２）　２−１恥６８７−６
９０、及びＣｈｅｎｇ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、御粘Ｒｅｑ
、、Ｃｏｍａ、、（ｉ９８３）　ｊｌｌ：１０４−１１
１を参照ノコと。

前記の技法を用いる場合、それらの蛋白質は蛋白質汚染
物から、あるいは細胞内で生産された場合に生物学的に
不活性である形態の蛋白質から十分に分離され得ない。

Ｂｅｃｈｅｒ等、Ｂｉ岳ｔ！ｉｃｊ　Ａｄｖｓ、　（ｉ
９８３）　ｌ　：２４７−２６１は屈折体又は封入体を
低速遠心によりほとんどの細胞片及び可溶性不純物から
分離することを開示している。さらに、Ｋｌｅｉｄ　等
、Ｄ鯖−１狸見明り釦１ｑｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏ↓Ｕ、Ｖｏｌ　２５．３１７−３２５頁、１２
章（Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　。

アーリントン、ＶＡ、　１９８４）は、ホモシネ−ジョ
ン及びこれに続く遠心分離による屈折体の精製を記載し
ている。さらに、Ｍａｒｓｔｏｎ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌ。

（ｉ９８４年９月）　、８００−８０４頁は、酵素的及
び機械的破砕技法並びに音波処理による封入体の放出を
記載している。細胞溶解物の４℃、１２，０ＯＯＸ　ｇ
における５分間の遠心分離により、すべての封入体が上
清から除去される。得られるペレットがトリトンＸ１０
０及びｌ’！ＤＴＡに懸濁され、そして変性前に遠心分
離される。

沈澱した異種性蛋白質の精製及び活性の保証がさらに米
国特許！１ｋＬ４，５１１，５０２　、階４．５１１，
５０３　、階４．５１２，９２２　、及び階４，５１８
，５２６　、並びにＰ、Ｐ　１４４，５０６に記載され
ている。米国特許１１ｍ４，５ＩＬ５０２には、宿主細
胞から屈折性蛋白質を精製し、該蛋白質を強度性溶液中
に溶解し、そして高速遠心により不純物を除去すること
が記載されている。米国特許１１ｈ４，５１１，５０３
には、屈折性蛋白質を宿主細胞から単離しそして強度性
溶液により該蛋白質を処理することが記載され、そして
特許請求されている。

米国特許１ｍ４，５１２．９２２には、屈折体を強度性
溶液中で可溶化しそして弱度性溶液で置換することが記
載され、そして特許請求されている。米国特許Ｎ１１４
，５１８．５２６は、宿主蛋白質を可溶化するがしかし
屈折性蛋白質を可溶化しないのに十分なイオン強度の緩
衝液により宿主細胞培養物を可溶化し、細胞を破砕し、
そして不溶性画分を処理して屈折性蛋白質を得ることを
記載している。ＥＰ　１１４，５０６は、屈折性材料を
変性溶液と接触せしめ、場合によってはこれをサイズ区
別分子篩と接触せしめ又は該溶液から高分子成分を除去
するために高速遠心にかけることにより、宿主細胞から
蛋白質を回収するように、異種性蛋白質を含有する屈折
性材料を処理するための方法を開示している。ＥＰ１１
４．５０６の例は生成物の好結果の回収のために反復Ｔ
稈を必要とする。

〔発明が解決しようとする問題点〕

宿主細胞から異種性発現生成物を含有する屈折性粒子を
回収する方法であって、コストが安く、扱いが容易であ
り、且つ化学薬剤を使用しないで生物学的に活性な形の
純粋な蛋白質の最大の回収をもたらす方法の必要性が、
当業界になお存在する。

以下余白 〔問題点を解決するための手段〕 この発明は、付随する廃棄の問題を伴う高価な試薬を使
用せず、工程の反復を必要と廿ず、そして純粋な生物学
的に活性な蛋白質生成物をもたらす組換蛋白質の回収法
に関する。

さらに、詳しくは、この発明は、異種性蛋白質を生産す
るために形質転換された宿−Ｖ？ＩＬｌ＋−物細胞培養
物から該蛋白質を含有する屈折性材料を回収する方法で
あって、 （ａｌ　　該微生物の細胞壁及び細胞膜を破砕し；（ｂ
ｌ　　この破砕物から９９重量％以トの塩を除去し； （Ｃ１この脱塩された破砕物を再破砕し；（ｄｌ　　こ
の破砕物中の液の密度もしくは粘度をト昇せしめるため
、又は咳液中の密度もしくは粘度の勾配を生じさせるた
めに該破砕物に物質を添加し；そして ｔｅｌ　　高速遠心分離により細胞破片から屈折性材料
を分離する； ことを含んで成る。

好ましい態様においては、段階（ｂｌはダイアフィルト
レーション又は遠心分離によって行い、そして段階（ｄ
）はある特定の範囲内で液の密度又は粘度を増加せしめ
ることにより行う。

この発明はまた、異種性蛋白質を生産するために形質転
換された宿主微生物細胞培養物から該蛋白質を含有する
屈折性材料を回収する方法であって、上に要約した段階
（ａ）〜（ｅｌのみならず、次の段階すなわち、 ｆｆ）　　前記屈折性材料を還元条件下で可溶化し；（
ｇ）　　前記可溶化された屈折性材料を有機抽出し；そ
して、 （ｈｌ　　この屈折性材料を抽出物から分離する；を含
んで成る。

好ましい態様において、段階（ｆ）は還元剤の存在下で
水性緩衝液中可溶化剤を用いて行い、段階ｆｇ）は有機
抽出剤として２−ブタノールを用いて行い、そして段階
（ｈｌは酸沈澱段階及びこれに続く遠心分離により行う
。

以下余白 〔具体的な説明〕 この明細書において使用する場合、“異種性”（ｈｅｔ
ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）蛋白質なる語は、それらを生産す
るために形質転換される宿主細胞にとって外来性である
蛋白質を意味する。すなわち、宿主は一般にそれ自体に
よってはそのような蛋白質を生産しない。このような蛋
白質は、当業界においてよく知られている技法を用いる
組換ＤＮＡ技法により生産される。ここで、蛋白質はし
ばしば疎水性である。すなわち、約６．５〜７．８の範
囲のｐＨ１すなわちおよそ中性又は生理的ｐｉにおける
室温及び大気圧から成る周囲条件下で水性媒体中に溶解
しないか、又は容易には溶解しない。

この発明の方法により異種性蛋白質が屈折性材料から回
収される。“屈折性”　（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）材料
なる語は、光を屈折しそして位相差顕微鏡で観察した場
合に明るい斑点として現われる材料又は物体を示す。屈
折性材料はまた“封入体”（ｉｎｃｌｕ−ｓｉｏｎ　ｂ
ｏｄｉｅｓ）としても知られている。一般に見られる培
養条件下で屈折体を形成する異種性蛋白質の例にはイン
ターロイキン−２（ＩＬ−２＞　、インターフェロン−
β（ＩＦＮ−β）、ネコ白血病ウィルス抗原（Ｐｅｔν
）からのエンベロープ蛋白質、ヒト成長ホルモン、うシ
成長ホルモン（ｂＧＩＩ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ
）、及びＦＭｒ）ウィルスのごときウィルスによりコー
トされでいるか又は融合しているある種の蛋白質が含ま
れる。ある種の蛋白質、例えばインターフェロン−α（
ＩＦＮ−α）、インターフェロン−ｒ　（ＩＦＮ−γ）
、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は細胞質中で一層可溶性
である。

蛋白質の正確な化学的構造は多くの因子に依存するであ
ろう。イオン化可能なアミノ基及びカルボキシル基が分
子中に存在する場合、特定の蛋白質は酸性塩もしくは塩
基性塩として、又は中性の形で得られる。適切な環境条
件に置かれた場合にその活性を維持しているすべての調
製物がこの発明の蛋白質の定義に含まれる。さらに、蛋
白質の一次アミノ酸配列は、糖成分を用いる誘導体化（
グリコジル化）により、あるいは他の補充分子、例えば
リピド、ホスフェート、アセチル基等によす、さらに一
般的にはサッカライトとの接合により、増大され得る。

このような増大の幾つかの観点は生産宿主の翻訳後プロ
セシング系に、Ｌり達成され、他の変形（修飾）はイン
ヒトｌ’ｌで書入され得る。ともかく、Ｆ記のように蛋
白質の活性が破壊されない限りにおいζ、このような変
形物はこの発明の定義の範囲内に含まれる。８うまでも
なく、これらの変形は、種々のア・７セイ法において蛋
白質の活性を増強し又は低−ドせしめることにより、活
性に電的又は質的な影響を与える。

さらに、鎖中の個々のアミノｆｌＩ残フ、（を、酸化、
還元又は他の誘導体化によって変形することができ、そ
して蛋白質を開裂せしめて活性を保持する断片を得るこ
とができる。活性を破壊しないこのような変形は、蛋白
質配列を定義から排除するものではない。

最後に、翻訳中に導入されるアミノ酸の欠失、付加、又
は変化による一次構造それ自体の変更が、蛋白質の活性
を破壊することなく行われ得る。例えば、生物学的活性
のために必須でなく、生物学的に活性な蛋白質中に存在
し、そしてジスルフィド結合を形成するために開放され
ている少なくとも１個のシスティン残基を除去し又は他
のアミノ酸で置き換えることによって、分子間ジスルフ
ィド架橋又は正しくない分子内ジスルフィド結合の形成
を排除することができる。“ミューティン”（ｍｕｔｅ
ｉｎ）として知られるこのような変形された蛋白質は１
９８５年５月２１日に発行された米国特許隘４．５１８
，５８４に記載されている。他の例においては、＋１−
２又はＩＦＮ−βのごとき生物学的に活性な蛋白質の保
存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸が、クロラ
ミンＴ又は過酸化物酸化に対して感受性の各メチオニン
に代って置換され、ここで他の非感受性メチオニン残基
はそのように置換されない。ここで、保存的アミノ酸の
変化は、生物学的活性に不都合な影響を与えず、そして
中性もしくは非極性アミノ酸置換又はメチオニンの除去
を含む変化として定義される。この態様の好ましい例に
おいて、ＩＬ−２のアミノ酸位置１０４のメチオニンが
アラニン残基により置き換えられる。

好ましくは、この発明の蛋白質は１１−２又はＩＦＮ−
βである。最も好ましい蛋白質は、（ａｌ天然ヒトＩＬ
−２のアミノ酸配列と少なくとも実質的に同一であるア
ミノ酸配列を有しそして（ｔｌ）天然ヒトＩＬ−２に共
通の生物学的活性を有する蛋白質をコードするヒ目Ｆ−
２遺伝子又はヒＨ１、−２遺伝子の変形体により形質転
換されている微生物により生産される未グリコジル化Ｉ
Ｌ−２である。アミノ酸配列の実質的な同一性とは、配
列が同一であるか、あるいは合成蛋白質と天然ヒトＩＬ
−２との間の不都合な機能的相違を惹起しないｌ又は複
数のアミノ酸の変化（除去、付加、置換）により異るこ
とを意味する。

このような蛋白質の例は、１９８３年２月３日に出願さ
れたヨーロッパ特許出願ｔ１ｋ１８３１０１０３５．０
　（ｉ９８３年１０月１９日に階９１５３９として公開
）及び１９８２年１２月２２日に出願されたヨーロッパ
特許出願Ｎ１１８２３０７０３６．２（ｉ９８３年９月
１４日に階８８１９５として公開）中に記載されている
ＩＬ−２ｗ４、前記のミューティン＋１．−２、並びに
本明細書の例に記載されているＩＬ−２１１［である。

この明細書において使用する場合、宿主微生物細胞培養
物を記載する際の“形質転換された”なる語は、天然蛋
白質の活性を有する異種性蛋白質を１１；産するために
遺伝子操作されている微生物を示す。形質転換された微
生物の例は、この明細書の例において記載する。細菌が
蛋白質を生産するために好ましいｍＺｋ物である。合成
蛋白質はまた、適切に形質転換された酵母及び咄乳頻細
胞においても４Ｆ産され得る。Ｅ、コリ　Ｉユリ１０が
特に好ましい。

形質転換された微生物は適当な増殖培地中で、６８０ｎ
ｍにおいて典型的には約３０の光学濃度（（）ｌ）　）
に、そして好ましくは６８０ｎｍにおいて約２０〜４０
のＯＤに増殖セしめる。増殖培地の組成は用いられる特
定の微生物に依存するであろう。

培地は、微生物の栄養要求を満足させる化合物を含有す
る水性培地である。培養培地は典型的には資化性の炭素
及び窒素源、エネルギー源、マグネジうム、カリウム及
びナトリーノムイオン、並びに場合によってはアミノ酸
、及びプリン及びピリミジン塩基を含有するであろう。

〔１輪νｊ　９　ｗ−、、ｐ　ｒ−Ｑｅｄｉｃａｌ　Ｂ
ｉｏｊｏＨｙ−−、レンジ・メディカル・パブリケーシ
ョンズ、１４版、８Ｏ−８５１（＋９８０）を参照のこ
と。）ｔｒｐプロモーターを用いる発現ヘクターにおい
ては、培地中のトリジ１フアン濃度が、蛋白質の発現が
望まれる時点において限界になるように注意深く調節さ
れる。

培養物から細胞を収得した後、必要であれば、クロス−
フロー濾過、遠心分離又は他の常法により約２０〜１５
０ｍ　ｇ　／　ｍ　１　、好ましくは８０〜１００ｍｇ
　／　ｍｌ　（６８０ｎ　ｍでの０１）が４０〜３００
、好ましくは１６０〜２００）に細胞を濃縮する。好ま
しくは、ヒトに対して毒性のない化合物、例えば１−オ
クタノールを全成分の約１重置％の参で、細胞の濃縮の
前又は濃縮中に発酵槽に加えることにより、細胞膜封入
体（ｃｅｌｌ　ｍｅｎ＋ｂｒａｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｍ
ｅｎｔ）が破壊される前に生存微生物が残存しないこと
を確実にする。

収得された培養物の濃縮の後、微生物の細胞膜を破壊す
る。この方法のこの段階においては、常用の細胞破壊技
法、例えば均質化、音波処理、又は圧力循環を用いるこ
とができる。好ましい方法は、音波処理、又はホモジナ
イザーを用いる均質化である。破砕段階の終点は、典型
的には細胞溶解と共に増加する懸濁液の２６０ｎｍにお
ける吸収の光学濃度をモニターすることにより決定する
ことができる。ともかく、無傷の細胞が実質上全く可溶
化段階に運ばれないように、実質上すべての細胞を破砕
すべきである。必要であれば、破砕の前に、次の段階で
異種性蛋白質を不溶性複合体として細胞破片中に残しな
がらＥ、コリの蛋白質の除去を促進するレベルに濃縮物
の液相のｐＨを調整する。

破砕段階に続く回収工程中の段階は、屈折性材料を他の
汚染蛋白質及び他の細胞破片から分離するために主とし
て設計される。この工程を用いて屈折体を細胞破片から
単離して約５０重量％の蛋白質純度を得ることができる
。これに続く、好ましい技法を用いる蛋白質の単離及び
精製は９５％以上、好ましくは９８％以上の純度の生成
物を良好な収率でもたらすであろう。同時に、この精製
工程はまた、最終生成物中の発熱性物質を患者への非経
腸的投与のために許容されると信じられるレベルに低下
せしめる。

細胞が破砕された後、好ましくは脱イオン水を破砕物に
加え、そしてこれから９９重置％以トの塩を除去する。

塩は、逆に荷電した複数の小分子量イオンから成る水溶
性物質である。破砕物のイオン強度を低下せしめるため
のこれらの塩の除去は、脱イオン水又は蒸留水を用いる
ダイアフィルトレーション（ｄｉａ（ｉ）ｔｒａｔｉｏ
ｎ）によりイオンをフラッシュアウトすることにより、
又は遠心分離により細胞破片及び屈折体をペレット化し
、次に脱イオン水又は蒸留水中に再懸濁することにより
行う。ダイアフィルトレーションを用いる場合には、好
ましくは水の添加速度が濾過速度と同じになるように、
脱イオン水又は蒸留水を連続的に添加する。

塩が実質上除去された後、１−オクタノールのごとき化
合物が最初に添加されていない場合には、場合によって
はそれを脱塩された破砕物に添加することにより、封入
体（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）が破壊される前に生存組
換体微生物が存在しないことを確実にする。脱塩された
破砕物を、最初の破砕について前記したようにして再度
破砕する。

再破砕の後、この破砕物に物質を加えることにより該破
砕物内の液中で、密度もしくは粘度を上昇せしめ及び／
又は遠心の間に勾配を生じさせる。

この目的を達成するために幾つかの手段が存在し、すべ
てが、液相の密度及び／又は粘度を変化せしめることに
よる粒子の沈降特性に依存する。この目的を達成するた
めの１つの手段は、液の密度を約１．１〜ｌ、　３　ｇ
　７〜ｌ　、好ましくは１．１３〜１．１７ｇ／　ｍ　
ｌのρに一ヒ昇せしめるように物質を添加することであ
る。

この密度の上昇を達成するために使用することができる
物質は糖又は糖の混合物、例えばシュークロース、デキ
ストリン、フラクトース、マルトース、マルトトリオー
ス、及び他のモノ−、ジー又はポリ−サツカライドを包
含する。最も好ましく２７） くは、糖はシュークロースである。他の方法として、物
質の２層系、例えばグリセリン／シュークロース混合物
を使用することができ、ここで破砕された粒子は重相及
び軽相の間の界面に分布し、そして液／液分離により溶
出することができる。

さらに、液相の粘度を任意の適当な手段により、例えば
粘稠な化合物、例えばシュークロース又はグリセリンを
液相に添加することにより、５〜１Ｏｃｐｓに上昇せし
めることができる。また、例えば粒子が６０％水性グリ
セリン懸濁液として存在し、遠心ボールが８０％水性グ
リセリンを収容している場合には、勾配が形成される。

省略された“フロント−エンド”　（，１１）ｌ）ｒｅ
ｖｉａｔｅｄｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ）法の最終段階におい
て、屈折体を回収するため、目的蛋白質を含有する屈折
体を高速遠心により細胞破片から分離する。“高速遠心
”とは、約１０，０００〜４０，０ＯＯＸ　ｇ、好まし
くは約１０．０００〜２０，０ＯＯＸ　ｇにおいて、容
量に依存する適当な時間、一般に約１０分間〜７２時間
にわたり、懸濁液を回転せしめることを意味する。媒体
の密度は一般に、低速遠心により粒子を分離するには高
過ぎる。従って、遠心を低速（例えば、５００〜５．０
ＯＯＸｇ）で行う場合、満足な結果は得られない。正確
な遠心速度は蛋白質及び勾配を形成するために添加され
る物質（例えばシュークロース）の最終濃度に依存する
であろう。例えば、インターフェロンは最大回収を得る
ために一層低いシュークロース濃度を必要とし、そして
そのために遠心速度を低下せしめるか、又は遠心時間を
短縮することができよう。

第１図は屈折体中に含有される目的蛋白質を得るための
１つの好ましい方式を例示する。この方式においては、
屈折体を含有する細胞をクロス−フロー（ｃｒｏｓｓ−
ｆｌｏｗ）濾過により濃縮し、そして破砕する。次に破
砕物を脱イオン水に対してダイアフィルトレーションし
て液のイオン強度を低下せしめ、そして次に再破砕する
。次に、シュークロースを加えてρ−１，１〜１．３の
液の最終密度を得る。次に、混合物を高速遠心を用いて
遠心分離して屈折体を含有するペレット及び上清を得、
そしく２９） て−上清は廃棄する。このペレットは“粒子ペレット”
又は“粒子ペースト°として、後に記載する前記の方法
に代る延長された“フロント−エンド”（ｅｘｐａｎｄ
ｅｄ　ｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ）法から得られる“最終ペレ
ット”又は“最終ペースト”と区別することができる。

屈折体を回収するための前記の方法に代る延長された“
フロント−エンド”法を第２図に模式的に例示する。こ
の方法においては、第１図の遠心段階（６）から得られ
る粒子ペレットを可溶化し、還元し、そして次に２−ブ
タノールにより水性媒体から抽出する。次に、抽出剤相
を酸により沈澱せしめ、そして遠心分離して“最終ペレ
ット”又は“最終ペースト”を得、次にこれを示されて
いるようにして精製する。例５は延長されたフロント−
エンド法を例示する。

省略されたフロント−エンド法の終点での遠心分離によ
り得られる粒子ペレットは、ローリ−・アッセイ（Ｌｏ
ｗｒｙ等、　　Ｊ、Ｒ，、ｉｏ、、１．ＣＩ！ｇ、ｇ、
　（ｉ９５ｉ）　１９３：２６５−２７５　）により決
定する場合、約１５〜７５重量％の目的とする異種性蛋
白質を含有する。他方、延長されたフロント−エンド法
からの最終ペレットは約７０〜８５重量％の目的蛋白質
を含有する。

延長されたフロント−エンド法は、次の追加の段階、ず
なわら還元条件下での屈折体の可溶化、可溶化された屈
折性材料の有機抽出、及び抽出剤からの前記屈折性材料
の華離を含む点において省略されたフロント−エンド法
と区別される。この延長されたフロント−エンド法は、
宿主株内の屈折体中に貯蔵されている前記の候補異種性
蛋白質のいずれかの回収を促進するために行うことがで
きる。本質的に、粒子ペレットに対して最終ペレットの
ｌ−昇した純度はその後の処理の精製負荷を低下せしめ
る。最終η−成物の望ましい純度レベルを達成するため
に、フロント−エンド法の精製段階及びその後の工程を
精製段階の選択の間に相互依存性が存在する。屈折体の
特定のフロント−エンド回収の選択が行われた後、当業
者は最終生成物の望ましい純度レベルを達成するために
後に概略記載する他の精製段階を取りあげそして選択す
ることができる。

延長されたフロント−エンド法の有機抽出は第１に、水
相及び同相のりボポリサソカライド及び核酸からの疎水
性蛋白質の分別にもたらす。第２に、この抽出はまた宿
主細胞のエンドトキシン及び他の蛋白質の幾らかを除去
する。好ましくは酸沈澱及びそれに続く遠心による争離
段階は、有機抽出剤及び他の細胞破片から屈折性材料を
分離する。

延長されたフロント−エンド法の粒子ペレットの可溶化
のため、次の可溶化剤、すなわちドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳｒｌＳ）、ラウリン酸ナトリウム、尿素、ドデシ
ルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、テト
ラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルスルホン酸ナトリ
ウム、ミリスチン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム
、ドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウム、及びテトラデ
シルＮ−サルコシン酸ナトリウムを使用することができ
る。

好ましい可溶化剤はＳＤＳ又はラウリン酸ナトリウムで
ある。ＳＤＳが最も好ましい。

可溶化剤は水性緩衝液中、好ましくはリン酸緩衝化塩溶
液中で使用される。可溶化剤の好ましい％は１％〜５％
（Ｗ／Ｖ）の範囲である。（ここで、％は重量：容量比
を反映する。）最も好ましい可溶化溶液は２％のＳＤＳ
を含有するリン酸緩衝化塩溶液である。

可溶化段階において使用することができる還元剤にはメ
ルカプトエタノール、グルタチオン、システィン及びジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）が含まれる。ＤＴＴは最も
好ましい還元剤である。媒体中の還元剤の濃度は通常約
５〜２０ｍＭの範囲であり、約１０ｍＭが最も好ましい
濃度である。

還元条件はまた、１〜５ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭ
のキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
＾）の添加を含む。通常ｐ）１８．５〜９．５、特に好
ましくはｐＨ９のアルカリ性において還元を行うことも
好ましい。ｐＨの調整はＮａＯＨのごとき塩基の添加に
より行うことができる。

さらに、上昇した温度、好ましくは４５℃〜５５℃にお
いて、そして最も好ましくは５０℃において、材料の効
率的な還元を行うために窒素のもとで、還元反応を行う
のが好ましい。反応は典型的には５〜１５分、最も好ま
しくは１０分間にわたって行う。

還元が完了した後、通常約２５℃に冷却し、そして酸、
好ましくは氷酢酸によってｐｌ＋を７〜７．８、最も好
ましくは７．４に調整する。前記の可溶化及び還元段階
が完了した後、有機抽出を開始する。

有機抽出剤は２−ブタノール、２−メチル−ブタノール
、又はこれらの混合物であることができる。最も好まし
くは抽出剤は２−ブタノールである。抽出条件は、水性
媒体と抽出剤の間の相分離を維持する条件である。

抽出剤は通常、蛋白質の水性溶液と、約０．８：１〜約
３：１、好ましくは約１：１　（抽出剤：懸濁液の容量
）の容量比で混合する。この抽出は、常用の回分式又は
連続式液−液抽出技法及び装置を用いて行うことができ
る。抽出は２０℃〜１００℃にて行い、約１分間〜１時
間の接触時間を用いる。

抽出が完了した後、水相及び抽出剤相を分離し、そして
次に目的の蛋白質を抽出剤相から単離する。

種々の抽出技法、例えば沈澱、分子篩クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、及び電気泳動
を用いることができる。

好ましい単離技法は酸沈澱及びこれに続く遠心分離であ
る。抽出物溶液を還元条件下でリン酸緩衝化塩溶液中に
可溶化剤を含有する水性緩衝液と混合することにより、
目的の異種性蛋白質を含有する抽出された屈折性材料を
抽出物から沈澱せしめる。好ましい可溶化剤は、約０．
０５〜０．２％、最も好ましくは０．１％の濃度でのＳ
ＤＳである。

有機抽出物／緩衝液に添加する還元剤はメルカプトエタ
ノール、グルタチオン、システィン又はジチオスレイト
ール（ｒｌＴＴ）であることができ、ＤＴＴが最も好ま
しい。還元剤の最終濃度は０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で
あることができ、そして２ｍＭのＤＴＴが最も好ましい
。

次に、有機抽出物／緩衝液のｐｉを、酸を用いて典型的
には約５〜６．５の範囲に低下せしめる。このｐＨ調整
は最も好ましくは氷酢酸を用いてｐＨ約６．２にするこ
とにより行う。

次に、沈澱した混合物を高速で、好ましくは１０．００
０〜１５，０ＯＯＸ　ｇにて、発酵の規模に依存して好
ましくは１５分間〜１０時間、遠心する。例５に例示す
るように１０００１の実施においては好ましい遠心時間
は１０時間であろう。

このような遠心分離は延長されたフロント−エンド法の
最終段階であり、最終ペレット又は最終ペーストをもた
らす。目的の異種性蛋白質を含有する屈折体を回収する
ために省略されたフロント−エンド法又は延長されたフ
ロント−エンド法のいずれを選択するにし７）、精製に
おける次の段階は下記のような屈折体の可溶化である。

省略されたフロント−エンド法又は延長されたフロント
−エンド法の最終精製段階の後、目的とする異種性蛋白
質のそれぞれ１５〜７０％又は７０〜８５％の純度の異
る負荷で屈折材料を含有する粒子ペレット又は最終ぺ【
・ソトがもたらされる。フロント−エンド法の省略され
た変法又は延長された変法のいずれであっても、精製法
における次の段階は変性剤による粒子ペレット又は最終
ペレットの可溶化である。

遠心骨Ｍ後に得られる屈折体を含有するペレットを、好
ましくは蛋白質変性剤（可溶化剤）のみならず還元剤を
も含有する中性水性緩衝液と接触せしめることにより可
溶化する。疎水性蛋白質を可溶化するために適当な疎水
性−親水性バランスを有する界面活性剤（洗剤）を可溶
化剤として使用することができる。強力な蛋白質変性剤
、例えば１０〜１４個の炭素原子を含有するアルカリ金
属硫酸塩、及びアルカリ金属アルキルサルコシネートが
好ましい可溶化剤であり、ＳＤＳ及びサルコシルが特に
好ましい。場合によっては、前記水性緩衝液はさらに３
〜７ｍＭの濃度でキレート剤を含有することができる。

最も好ましくは、該キレート剤は５ｍＭ濃度のＥＤＴＡ
である。

可溶化において使用される可溶化剤の量は特定の薬剤に
依存するであろう。ＳＤＳ又はサルコシルを使用する場
合、ＳＤＳ／サルコシルの好ましい濃度（Ｗ／Ｖ）は、
緩衝液、例えばリン酸緩衝化塩溶液（５０ｍＭリン酸ナ
トリウム、ｐ１１７．０．９％塩化ナトリウム）中１〜
１０％である。５ｒ）Ｓの好ましい範囲は２〜７％であ
り、最も好ましくは５％である。可溶化媒体はまた、可
溶化された蛋白質が有意な程度に酸化されるのを防１ト
するために十分な量の還元剤を含有することができる。

蛋白質還元剤、例えばジチオスレイトール（ｎＴＴ）及
び２−メルカプトエタノールをこの目的のために使用す
ることができる。Ｄ”ＦＴのごとき還元剤の媒体中濃度
は通常約５〜３０ｍＭの範囲、最も好ましくは２０ｍＭ
である。可溶化は、典型的には２０℃〜２５℃の範囲の
温度において、固相と可溶化媒体との接触を促進するた
めに混合しながら行う。

場合によっては、この時点で還元段階を行うことができ
る。必要であれば、ｐＨを８〜９の範囲に、最も好まし
くは約８．５に調整することができる。

懸濁液は５０±５℃にて５〜１５分間窒素のもとで加熱
することができる。次に、反応混合物を約２５℃に冷却
する。

サンプルを１５分間放置した時又は溶液が半透明になっ
た時に可溶化が完了すると考えられる。

場合によってはこの時点で、可溶化が完了した後に不溶
性物質を遠心分離又は濾過により分離する。

蛋白質が可溶化した後、得られた懸濁液を場合によって
は１０，０００〜４０．ＯＯＯＸｇ、好ましくは２５．
０００〜３５，０ＯＯＸ　ｇにて遠心分離することによ
り、目的とする蛋白質の分子量に非常に近い分子量を有
するある種の汚染物を特徴とする特に追加の宿主（例え
ば、Ｅ、コリ）蛋白質を含有するペレットを得る。低速
においてさえほとんどの不溶物が除去されるから、遠心
分離の正確な速度は臨界的ではない。ベレットを除去し
、そして目的とする蛋白質を含有する上清を残し、そし
て目的蛋白質を回収するために処理する。他方、可溶化
、又は可溶化／還元段階の後に懸濁液のｐｌ＋を約５〜
６、最も好ましくは５．５に氷酢酸により調整し、そし
て次に濾過することができる。

可溶化の間に還元段階を行わなかった場合、方法の次の
段階は可溶化された屈折体蛋白質の還元であるかもしれ
ない。好ましい還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）
であり、このものはこの目的のために］Ｏ〜ｌＯＯｍＭ
、　最も好ましくは２０〜５０ｍＭの最Ｐ：濃度に加え
ることができる。還元条件はまた、エチレンジアミン四
酢酸（ＦＩ〕Ｔ＾）のごときキレート剤の１〜５ｍＭの
範囲の温度での添加を含むことができる。ｉｌｌｌ日常
９．５、特に好ましくは８．５±０．１の幾分アルカリ
性のｐｌ＋において還元を行うことが好ましい。このｐ
ｌ＋調整はＮａ０ＩＩのごとき塩基の添加によって達成
することができる。さらに、物質の効率的な還元を行う
ことを保証するために−Ｌ昇した温度において窒素のも
とて還元反応を行うのも好ましい。反応は、典型的には
４５℃〜５５℃にて５〜３０分間、窒素のもとで行う。

１０〜２０分間の反応時間が好ましい。還元が完了した
後、通常約２５℃に冷却し、そしてｐＨを酸、例えば氷
酢酸を用いて５〜６の範囲に調整する。最も好ましくは
、ｐＨは５．５に調整されよう。

この方法の次の段階は、上清中の蛋白質を、遠心分離又
は濾過の後に残留するすべての宿主汚染物から、そして
場合によっては可溶化剤から分離することである。ゲル
濾過クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（ｆｌＰ−）ＩＰＬｃ）、又はゲル濾過クロマトグ
ラフィーとｌ？Ｐ−ＨＰＬＣとの組合わせを用いること
ができる。ゲル濾過クロマトグラフィーは好ましくは、
発熱成分（パイロジエン）及び目的蛋白質の分子量より
も大きいか又は小さい分子量を有する蛋白質汚染物の両
者を除去する２段階において行う。これらの汚染物から
蛋白質の分離が可能なように溶液を分画することができ
るゲルは市販されている。セファクリル（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ）はより高い分子量の成分を除去するのに好まし
いゲルであり、そしてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）　Ｇ−２５、Ｇ−７５又は（、−１００はより低い
分子量の汚染物を除去するために好ましい。

ゲル濾過は典型的には、約０．１〜１．５％の可溶化剤
及び約０．５〜１０ｍＭ還元剤を含有する緩衝液（ｐＨ
５，５〜７．０）中で行われるであろう。カラムの大き
さは目的成分の適切な分離が可能なように決定する。

ＲＰ−ＨＰＬＣはゲル濾過に代るものである。　ＲＰ−
ＨＰＬＣはさらに、目的蛋白質に近い分量計を有しそし
てそれ故にゲル濾過によっては完全に除去されない分子
を溶液から除去することができる。さらに、細菌エンド
トキシンのごとき汚染物もｌ？Ｐ−１１１’１．ｃによ
り効果的に除去される。従って、ＲＰ−１１１”ｌｃを
ゲル濾過後の最終精製段階として使用することもできる
。蛋白質の良好な分離をもたらす支持体（不動相）がｌ
？Ｐ−）ＩＰＬｃ中で使用される。３００オングストロ
一ム以上の孔サイズのＣ−４、Ｃ−８、又はＣ−１８支
持体が好ましい支持体の例である。蛋白質を溶液状に維
持するため約５．５のρ１１において分離を行う。これ
に関し、蛋白質溶液のｐ旧ま好ましくはこの範囲に調整
されよう。溶液をＲＰ−ＨＰＬＣに負荷し、そして不動
相に吸着せしめる。酢酸又はトリフルオロ酢酸のごとき
有機酸とプロパツール又はアセトニトリルのごとき有機
溶削とを含んで成るグラジェント溶剤系を用いてカラム
から蛋白質を溶出する。酢酸／プロパツール、トリフル
オロ酢酸／プロパツール、及びトリフルオロ酢酸／アセ
トニトリル系が好ましい溶剤系である。＋１．−２は酢
酸／プロパツール系においては約４０％のプロパツール
で溶出し、トリフルオロ酢酸／プロパツール系において
は約５０％のプロパツールで溶出し、そしてトリフルオ
ロ酢酸／アセトニトリル系では約６２％のアセトニトリ
ルで溶出する。便宜上、溶離液の有機溶剤含量を通常、
蛋白質が溶出する溶剤濃度よりも幾分低いレベルにまで
急速に上屏せしめ、次に約０．１〜１．０％／分の範囲
でゆっくりしたグラジェント変化を行う。

クロマトグラフィ一段階から蛋白質が回収された直後に
、それを凍結乾燥し、そして還元剤（蛋白質を還元状態
に保つため）及び可溶化剤（蛋白質を溶液状に保つため
）を含有する中性水性緩衝液中に再懸濁する。ＩＬ−２
はこの形態で安定であり、そして使用前にさらに処理し
そして製剤化するために貯蔵することができる。

これに代るそして好ましい方法は、１９８４年１２月６
日に出願されそして１９８６年２月２５日にに、Ｋｏｔ
ｈｓ等に与えられた米国特許１’＆ｉ４，５７２，７９
８（Ｃｕ４２陽イオンを含有する酸化促進剤を使用する
）、又は１９８４年１０月１７日に出願されそして１９
８５年７月２３０にＺ、５ｈａｋｅｄ等に与えられた米
国特許ＩＴｈ　４　、５３０．７８７（ｏ−ヨードソ安
息香酸を使用する）に記載されているように、ゲル濾過
により分離された後に３’５白質を制御された条件下で
選択的に酸化し、そして酸化された精製物をＲＰ−１１
ＰＬＣに、Ｆす、又はゲル濾過及びそれに続＜ＩＩＰ−
１１円、Ｃにより精製する方法である。このための好ま
しい酸化剤はＣｕＣ１ｚ及び０−ヨードソ安息香酸であ
る。Ｃｕ”酸化は、可溶化された形の組換蛋白質を含有
する水溶液を空気の存在下約５．５〜９のｐＨにてＣｕ
　＊　２陽イオンを含有する少な（とも有効量の酸化促
進剤と反応せしめることを含んで成る。制御された酸化
が、組換蛋白質中に、その天然対応物中の架橋に一致す
るジスルフィド架橋の形成を、過剰酸化及び一致しない
架橋又はオリゴマーの形成を伴わないであるいは最少の
これらを伴って生じさせる。このような酸化は、その天
然対応物の配置に最も頻偵した配置の組換蛋白質の高収
酸の生産を可能にし、これにより組換蛋白質が天然蛋白
質と機能的に同等であることが保証されるようである。

使用される酸化剤及び酸化促進剤の量は少なくとも酸化
のために有効な量、すなわち、便利な時間内に酸化反応
を効果的に行うために必要な最小量以上である。効果的
な量は、所望のジスルフィド結合を形成するのに関与す
ることが望まれる蛋白質上の遊離スルヒドリル基の濃度
とおよそ等量である。好ましくは、ＣｕＣｊ２　、の量
は、蛋白質濃度に依存して約１〜４００．ｔ＋Ｍの範囲
であり、さらに好ましくは、蛋白質がＩＬ−２であれば
５〜５０μＭである。０−ヨードソ安息香酸の場合、酸
化剤と蛋白質のモル比は、好ましくは約０．０５：１〜
約５：１の範囲であり、最も好ましくは約０．８：１〜
約１：２の範囲である。反応混合物中の蛋白質の濃度は
低く、すなわち、一般には５ｍｇ／ｍｆ未満に、好まし
くは約０．０５〜約２ｍｇ／ｍｌｌに、そしてさらに好
ましくは約０．１〜約１ｍｇ／ｍ１に維持することによ
りオリゴマーの形成の可能性を低下せしめる。

Ｃｕ　”　”酸化のための反応媒体のｐＨは一般に約５
．５〜９、好ましくは６〜８、そしてさらに好ましくは
約７に維持する。

０−ヨードソ安息香酸のための反応媒体のｐＨは酸化さ
れるシスティン残基のｐＫａより少なくとも約０．５　
ｐＨ単位低いレベルに維持する。これらの残基のｐＫａ
が異る場合、ρ■は好ましくは最も低いｐＫａを有する
システィン残基のｐＫａよりも少なくとも約０．５９Ｈ
単位低く維持する。０−ヨードソ安息香酸のためのこの
ようなｐＨの調節がイオン化されないチオールの量を調
節し、これによって反応速度を調節し、そして所望のジ
スルフィド結合の形成を好都合にする。組換ＩＦＮ−β
のためには、０−ヨードソ安息香酸酸化のためのｐＨは
６〜９、好ましくは７．０〜９．０に維持する。組換Ｉ
Ｌ−２のためには、これは５．５〜９、好ましくは７．
０〜８．０に維持する。

蛋白質の酸化形よりも溶解しにくい還元されたクローン
化蛋白質は一般に、効果的な酸化が生ずるためには、溶
液状に、すなわち溶解された形に維持されなければなら
ない。従って、Ｃｕ＋　２を含有する反応混合物には好
ましくはさらに少なくとも有効量の可溶化剤を含有せし
めることにより溶液から蛋白質が沈澱するのを防止する
。この明細書において使用する場合、“可溶化剤”なる
語は、イオン性又は非イオン性の蛋白質可溶化溶質、例
えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）又は尿素を意味
する。この目的のために使用することができる可溶化剤
の量は、主として蛋白質及び使用される酸化促進剤のタ
イプに依存して、一般に約０．０５〜約ＩＷ／Ｖ％、最
も好ましくはＯ，１％、又は約５〜９Ｍ（尿素の場合）
である。

酸化反応時間は、例えば反応混合物中の試薬の濃度、反
応温度、及び試薬のタイプに依存するであろう。反応温
度はｉｆｆ常約２ｏり〜４０℃、便利には室温として可
溶化剤／蛋白質混合物を溶液状に維持する。Ｃｕ＊　２
酸化については、反応温度の上昇が反応速度を上昇せし
める。酸化反応は、ｐｎを反応が停止するレベルに低下
せしめること、溶液を凍結すること、又はＥＩＩＴＡの
ごときキレート剤を反応混合物に添加することにより効
果的に停止卜せしく４７） めることかできる。反応の後、選択的限外濾過又はクロ
マトグラフ技法により残留する酸化促進剤及び不所望の
異性体又はオリゴマーを除去することができる。必要で
あれば、蛋白質精製法、例えばｌ？Ｐ−ＨＰＬＣを用い
て副１１成物及びすべての残留還元蛋白質から、酸化さ
れた蛋白質を精製することができる。

クロマトグラフィ一段階後の蛋白質の純度は約９５％以
上、そして通常約９８％以トである。この高度に純粋な
物質のエンドトキシン含量は、１００．０００ユニツト
の蛋白質生物活性当り約５ｎｇ未満、通常は約０．０１
０ｇ未満である。

この発明に従う蛋白質の製剤化は、精製され選択的に酸
化された蛋白質を用いる別の操作として、又は選択的に
酸化された蛋白質の精製と一体化された操作において行
うことができる。後者の場合には、製剤化のための出発
材料は選択的に酸化された生成物のＲＰ−ＨＰｌ、Ｃ処
理からの蛋白質含有生成物である。好ましくは、ＲＰ−
ＨＰｌ、Ｃ生成物（プール）により選択的に酸化された
生成物は水−有機溶剤混合物中蛋白質の溶液から成るで
あろう。有機溶剤の種類はＲＰ−ＨＰＬＣにおいて使用
される溶剤系に依存するであろう。使用することができ
る系の例は、酢酸又はトリフルオロ酢酸のごとき有機酸
とプロパツール又は７セトニトリルのごとき有機溶剤と
の組み合わせである。

場合によっては、ＲＰ〜ＨＰＬＣプールからの蛋白質の
１つの製剤化法における第１段階は、水中での蛋白質の
溶解性を増強するＳＤＳ又はサルコシルのごとき洗剤を
含有する水性緩衝液中に前記プールを再懸濁（稀釈）す
ることにより混合物を水性にすることである。この稀釈
の後、有機相を蛋白質含有水性相から除去し、そして適
切な緩衝剤を用いるダイアフィルトレーションにより洗
剤の濃度を低下せしめる。ＳＤＳを使用し、蛋白質とし
てｔＬ−２を使用する場合、ＳＤＳを約１０Ｑ〜２５０
μｇ／ｍｇ、好ましくは約２００μｇ／ｍｇのレベルに
低下せしめる。ダイアフィルトレーションの後、蛋白質
濃度を、主として蛋白質及びその意図される用途に依存
して約０．０１〜１０ｍｇ／ｍ＃の範囲に、ＩＬ−２に
ついては好ましくは０．０１〜２ｍｇ／ｍＩ！に再調製
し、そして水溶性担体を所望のレベルに加える。担体は
典型的には、溶液中に約１〜１０重量％、好ましくは約
５重置％で存在するように添加する。添加する担体の正
確な量は臨界的ではない。医薬錠剤の製剤化に使用され
る常用の固体増量剤を担体として使用することができる
。これらの材料は水溶性であり、蛋白質と反応せず、そ
してそれ自体安定である。これらはまた、好ましくは水
に対して非感受性（すなわち、非吸湿性）である。使用
することができる特定の例には、デキストロース、ラク
トース、マンニトール、及び他の還元された糖、例えば
ソルビトール、並びに小麦、トウモロコシ、米及びポテ
トからの澱粉及び澱粉加水分解物、ミクロクリスタリン
セルロース、並びにアルブミン、例えばヒト…ｌ清フル
ブミンが含まれる。マンニトール及びデキストロースが
好ましい。

担体は製剤に嵩を加え、単位投与耐の溶液が容器、例え
ば無菌バイアル中で凍結乾燥された場合に、凍結乾燥さ
れた残渣が肉眼で明瞭に見えるようにする。これに関し
て、好ましい担体はマンニトールであり、水に感受性で
ない美的に許容される（白色結晶性）残渣をもたらす。

他の方法において、目的蛋白質の他の好ましい製剤化法
における第１段階は安定化段階である。

α−インターフェロン及び天然β−インターフェロンは
親脂性の蛋白質ではない。従って、これらは生理的ｐｌ
＋においてヒト血清アルブミンのごとき安定剤を添加す
ることにより安定化及び可溶化することができる。これ
に対して、組換β−インターフェロン及びインターロイ
キン−２のごとき親脂性蛋白質はｐＨ６，８〜７．８に
おいてヒト血清アルブミンの添加によって安定化されな
い。

Ｅ　Ｐ　１５８，４８７（ｉ９８５年１０月１６日公開
）は、ヒト血清アルブミン、還元剤又はこれらの組み合
わセを含んで成るＩＬ−２組成物を記載している。溶液
の場合にｐ）ｌが３〜６に調整される。このような製剤
化経路は、この発明の方法により回収された異種性蛋白
質の製剤法に代るものと考えられる。

宿主微生物から回収さねそして精製された親脂性組換蛋
白質、例えばヒトβ−インターフェロン及びインターロ
イ；トン−２を安定な医薬組成物に製剤化するだめの他
の好ましいノｆ法が存Ｚｔする。

例えば、医薬として有効な甲の７Ｆ物学的にｌ−ｉ　ｆ
Ｆな組換体親脂性蛋白質を非毒性の無活性の医薬として
許容されるｐＨ６，８〜７．８の相体媒体中に世持し、
さらに蛋白質のための安定剤、例λばヒト血１ｇアルブ
ミン、正常血清アルブミン及びヒト血止蛋白質画分を含
有する組成物を製剤することができる。

α−インターフェロン及び天然β−インターフェロンは
親脂性蛋白質ではない。従って、これらは生理的ｐＨに
おいて製剤にヒト血清アルブミンのごとき安定剤を直接
添加することにより安定化しそして可溶化することがで
きる。これに灯して、組換β−インターフェロン及びイ
ンターロイキン−２のごとき親脂性蛋白質はｐＨ６，８
〜７．８におけるヒト血清アルブミンの添加によっては
可溶化されない。精製された蛋白質プールのｐＨは、ｐ
１１２〜４にあらかじめ調製された安定剤を添加するこ
とにより約２〜４に調製し、場合によってはこの混合物
をインキュベートし、そしてそのｐｌ＋を６．８〜７．
８に上昇せしめることができる。インキュベーション時
間は主として蛋白質のタイプ、安定剤のタイプ、正確な
ｐＨ１並びに蛋白質及び安定剤の濃度に依存し、そして
典型的には０〜１００分間、好ましくは１０〜１００分
間、さらに好ましくは１５〜６０分間、そして最も好ま
しくは１５〜４５分間である。

ｐＨが製剤化のために低い他の方法においては、安定剤
及び蛋白質プールを一緒に混合し、そしてこの混合物の
ｐＨを２〜４に調製し、そしてｐｉ−１を徐々に又は一
度に６．８〜７．８に上昇せしめる。

従って、親脂性異種性蛋白質、例えば組換β−インター
フェロンのためには、蛋白質を例えば最終精製段階とし
てゲルクロマトグラフィーにより精製した後、次の製剤
段階を行うことができる。

（ｉ）精製された異種性親脂性蛋白質を含有する溶出液
を集め； （２）溶出液のｐＨを約１２に調製し；（３）異種性親
脂性蛋白質を含有する溶液をｐＨ約１１において、ｐＨ
約１１に調整された純水又はＨ２Ｏ−エタール混合物に
対してダイアフィルトレーションし； （４）ダイアフィルトレートのｐＨを約１２に調整し、
そして溶液の０．５〜１０重量％のデキストロース及び
ｐＨ約１２に調製されたヒト血清アルブミンを添加しそ
してｐＨ１２にて１〜１５分間保持することにより蛋白
質を安定化（及びそれにより可溶化）シ； （５）該溶液のｐＨを生理的ｐＨに調製し；（６）所望
により、蛋白質サンプルを凍結乾燥し；そして （７）所望により、凍結乾燥された蛋白質サンプルを再
溶解する。

一１１ｍに、蛋白質は高アルカリ性ｐｌ＋範囲において
変性、ペプチド結合の加水分解、個々のアミノ酸の加水
分解、β−説離、ラセミ化、異るアミノ酸の生成及び同
様の反応に対して感受性であるが、しかし親脂性異種性
蛋白質例えば組換β−インターフェロンについては、上
記の分解反応が検出さく５４） れない。他方、蛋白質をｐＨ約１１においてダイアフィ
ルトレーションする場合、蛋白質例えばβ−インターフ
ェロンは純粋でありそして均一であり、そして天然蛋白
質、例えば天然β−蛋白質の比活性に近い高い比活性を
示す。

親脂性異種性蛋白質、例えば組換体β−インターフェロ
ン又はインターロイキン−２のための他の製剤法は、蛋
白質を回収しそして精製した後、次の段階を含む。

（ｉ）ｐ）１９．２〜１１での０２５クロマトグラフイ
ーにより蛋白質を脱塩し； （２）脱塩されたプールのｐｌ−１を約３．５に調整し
；（３）ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分のｐｌ
＋を３．５に調整し； （４）このヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分を前
記脱塩されたプールに加え、そして１５〜４５分間イン
キュベートし； （５）所望により、蛋白質サンプルを凍結乾燥し；そし
て （６）所望により、凍結乾燥された蛋白質サンプルを再
溶解する。

他の製剤法においては、異種性親脂性蛋白質をフ（−に
より蛋白質を脱塩し； （２）ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分を脱塩さ
れたプールに添加して混合物を形成し；（３）この混合
物のｐＨを３〜４に低下セしめ；（４）この混合物を１
５〜４５分間インキュベートし； （５）所望により、蛋白質サンプルを凍結乾燥し；そし
て （６）所望により、凍結乾燥された蛋白質サンプルを再
溶解する。

すなわち、蛋白質を単離した後、これを上記のごとき安
定剤を用いて水性担体媒体中に可溶化する。しかしなが
ら、可溶化を生じさ・Ｕるために安定剤を単に蛋白質と
混合することはできない。まず、安定剤のｐＨを適当な
塩基を用いて１０．５〜１２．５に、好ましくは約１２
に十昇・υしめ、次にこの安定則をρ旧０．５〜１２．
５のダイアフィルトレートされた蛋白質プールに加え、
そして最後に、得られた配合物のｐＨを約６．８〜７．
８に低下せしめる。ｐｌ−１が低下する際に、蛋白質は
媒体中に可溶化する。

他の方法においては、ＳＤＳを脱塩カラムにより除去し
た後、溶出液のｐＨを２〜４に調整し、安定剤のｐｉを
２〜４に調整し、この安定剤を前記溶出液に添加し、場
合によってはこの混合物を前記の因子に依存して一般に
約１０〜１００分間インキュベートし、そしてｐＨを６
．８〜７．８に調整する。

医療的又は臨床的投与用製剤のために使用される担体媒
体は任意の非毒性の不活性のそして水性のビヒクル、例
えば動物又はヒトに投与するための薬剤の製剤化のため
に一般に使用されるものである。担体はまた、それが親
脂性蛋白質の生物学的活性に影響を与えないように選択
される。

このような担体の例には、蒸留水、生理食塩水、リンゲ
ル溶液、デキストロース溶液、及びバンク溶液が含まれ
る。凍結乾燥された親脂性蛋白質を再溶解するために同
じ担体を使用することができ使用する安定剤のタイプ及
びその濃度は十として使用する製剤法及びｐｌ＋並びに
蛋白質に依存するであろう。例えば、ＩＩ、−２のミュ
ーティンを用いる低ｐＨにおいて処理する製剤及び高ｐ
ｌ＋製剤のためにはＨ３Ａ、又は）ｌ　Ｓ　Ａとデキス
トロースとの混合物が好ましい。しかしながら、ＩＦＮ
−βｓＩＬを用いる低ｐＨ製剤のためにはＰＰＰが好ま
しい。ＰＰＦは市販されており、そして８３％以りのア
ルブミン及び１７％未満のグロブリン（α及びβ）がら
なり、蛋白質の１％未満がγ−グロブリンである。血清
中のα−及びβ−グロブリンは幾つかの機能を有し、そ
の１つは、コレステロール、脂溶性ビタミン及びホルモ
ン類を包含する比較的不溶性の血液成分を安定な不溶液
として維持することである。炭水化物安定剤はｐ１１２
〜４において維持され／凍結乾燥される製剤においての
み使用され得る。

安定剤の最終濃度は一般に主として蛋白質、安定剤のタ
イプ及び用いるｐＨに依存して０．１〜ＩＯＷ／■％の
範囲であり、低いｐｕのためにはより高濃度であること
が好ましい。Ｈ３Ａ及びβ−ＨＩＦＮについては０．５
〜ＩＯＷ／Ｖ％の範囲が典型的であり、β−ＨＩＦＮ又
はＩＩ、−２を含むＰＰＰについては０．１〜５Ｗ／Ｖ
％が典型的であり；そしてｌ１ｌ−２を含むＨ３Ａにつ
いては０．５〜ＩＯＷ／Ｖ％が典型的である。

１９８３年５月１８日に出願されそして１９８４年７月
３１日にＨａｎｉｓｃｈ等に与えられた米国特許１１ｍ
４，４６２，９４０は高ｐｔ＋製剤法を記載している。

担体を添加した後、単位投与量（すなわち、ＩＬ−２に
ついては、投与当り０．０１〜２　ｍ　ｇ　、好ましく
は０．２〜０．３　ｍ　ｇのＩＬ〜２をもたらす容量）
の溶液を容器に入れ、この容器を有溝栓によりキヤ・ノ
ブし、そしてこの内容物を常用の凍結乾燥条件及び装置
を用いて凍結乾燥する。

凍結乾燥された無菌生成物は（ｉ）蛋白質、（２）担体
（デキストロース又はマンニトール）、（３）洗剤、及
び（４）混合物が再溶解された場合に生理的ｐｉをもた
らす少量の緩衝剤の混合物から成る。この生成物はまた
化学的安定性を増強するための少量の防腐剤を含有する
ことができる。

蛋白質がＩＬ−２である場合、組換ＩＬ−２は典型的に
は混合物の約０．０１５〜３．８５重量％、さらに好ま
しくは混合物の約０．４〜０．６％を構成する。このｔ
ｌ”酸物の貯蔵試験は、＋１．−２がこの形態において
２′［′″〜８℃にて３ケ月以上安定であることを示す
。

凍結乾燥された混合物は、常用の非経腸的水性注射剤、
例えば注射用蒸留水、リンゲル注射液、バンク注射液、
注射用生理食塩水等をバイアルに注入することにより再
溶解することができる。注射液をバイアルの側壁に対し
て加えることにより過度の発泡を防ｌ卜する。バイアル
に添加される注射剤の量は典型的には１〜５ｍｊ！、好
ましくは１〜２ｍＩ！の範囲である。

他の製剤法において、疎水性蛋白質を、洗剤によってで
はなく、蛋白質をポリエチレングリコール、ポリプロピ
レングリコール又はポリブチレングリコールから選択さ
れる活性化されたホモポリマーと反応せしめることによ
り可溶化することができ、このホモポリマーは５００〜
２０，０００ダルトン、好ましくは２０００〜１０，０
００ダルトンの分子量を有するものである。このホモポ
リマーは、蛋白質の遊離アミン又はチオール基及びホモ
ポリマーのヒドロキシル基の両者と反応性である末端基
を有するカップリング剤との結合により活性化される。

このようなカップリング剤の例にはヒドロキシニトロベ
ンゼンスルホン酸エステル、シアヌール酸クロリド、及
びＮ−ヒドロキシサクシンイミドが含まれる。この修飾
が、生理的ｐｎにおいて蛋白質を可溶化するために洗剤
を添加する必要性を除去する。次に蛋白質を前記の緩衝
剤及び水性担体と共に直接配合し、この配合物を凍結乾
燥し、そして凍結乾燥された混合物を前記のように再溶
解する。

第４図は、発酵から凍結乾燥までの、目的蛋白質を得る
ための１つの好ましい方式の流れ図を例示する。第５Ａ
図及び第５Ｂ図は他の好ましい方式を示す。

上記のようにして調製された再溶解された製剤は医薬と
して有効な量（すなわち、患者の病的状態を除去し又は
緩和する量）においてヒト又は他の哺乳類に非経腸投与
し、これらに対して療法をもたらすために適当であり、
療法のタイプは蛋白質のタイプに依存する。例えば、Ｉ
Ｉ、−２療法は種々の免疫調節適用、例えばＴ細胞変異
誘発、細胞毒性Ｔ細胞の誘導、ナチュラルキラー細胞活
性の増強、ＴＦＮ−γの誘導、細胞性免疫の回復又は増
強（例えば、免疫不全状態の治療）、及び細胞性抗腫瘍
活性の強化のために適当である。ＩＦＮ−β療法は抗癌
、抗ウィルス、抗乾瘤治療のために適当である。

次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではない
。これらの例中、特にことわらない限りすべての温廣は
℃で示す。

尉上　皿逝１イｌ青盟方−汰 Ａ、細胞増殖 Ｅ、コリのｔｒｐプロモーター／オペレーターの制御の
もとに異種性遺伝子を担持する組換体プラスミドｐＢＲ
３２２により形質転換されており、アメリカン・タイプ
・カルチュア・コレクションにＡＴＣＣＮｎ３９．５１
５として寄託されているＥ、コリに−１２／ＭＭ２９４
−１を下記のようにして３７℃にて１０１及び１０００
１の発酵槽中で増殖せしめた。必要により（ｉ）撹拌の
増加、（２）空気の添加、及び（３）酸素の添加により
、溶存酸素を約４０％に維持した。増殖培地として次の
ものを使用した。

戒−−分　　　　　　濃一度 （ＮＩ＋４）、ＳＯ４７２ｍＭ ＫＮ、Ｐｆ１４２１　ｍ　Ｍ ＭｇＳＯ４・７１１２０　　　　３　ｍ　ＭＮａ３サイ
トレート・２ｎ、ｏ　　　　　１．５　　ｍ　ＭＭｎＳ
Ｏａ　＋　４１ｈ０　　　３０ｎＭＺｎＳＯａ　・７Ｈ
２０３０μＭ ＣｕＳＯｎ　・５Ｈｚ０　　　　３μＭＬ−トリプトフ
ｙン　　　　　　　　　７０ｍｇ／ｊ！ＦｅＳＯ４・　
７１Ｌｚ０　　　　　　　７　２　　μ　Ｍチ７ミｙ−
ＨＣＩ　　　　　　　　　　　２　０ｍｇ／　１クルコ
ース　　　　　　　　　　　　　　　５　　ｇ／１テト
ラサイクリン　　　　　　　　　　　　５　　ｍ　　ｇ
　／　　ＩＫＯＨにてｐＨを６．８に調整。

供給されるグルコースはグルコース濃度を５〜ｌＯｇ／
ｌに維持するためにも使用した。接種物は凍結培養物又
は種母培養物からの２ｍ　ｇ　／　１とした。

培地からの１４−トリプトファンの涸渇による異種性蛋
白質生産の誘導はおよそ０Ｄ６８゜−１０において生じ
、これに続き０Ｄ６１１０　＝　１５においてカザミノ
酸を２％の最終濃度に添加した。３〜５時間後に培養物
を収得した。

Ｂ、異種性蛋白質の争乱 屈折体分離法を用いる異種性蛋白質の一般的精製方式を
第１図に示す。封入体から目的蛋白質を可溶化するため
の変性剤の選択及び精製方法における追加の段階は、Ｍ
ａｒｓｔｏｎ等、前掲、及びＫｌｅｉｄ等、前掲にある
程度記載されている。しかしながら、この発明の詳細は
すべての場合に類似しており、そして下記する。

以下余白 １．１０＃規模 １０１の発酵の後、中空繊維カートリッジを用いて細胞
を１０倍に濃縮した。さらに、１ｚの脱イオン水を用い
て細胞を洗浄した。ＰＩＩＴＡを２５ｍＭに加え、そし
て細胞をブライン冷却したホモジナイザー中で７５００
ｐｓ　＋にて３回通して破砕した。

この系を０．５１の脱イオン水で洗浄し、そして最終容
量３Ｉ！になるように脱イオン水を加えた（破砕物１）
。この細胞溶解物をカセット（ｏ，４５ミクロン）を有
するハウジング中で２１に濃縮し、次に５容量の５　ｍ
　ＭＥＤＴＡに対してダイアフィルトレーションした（
ダイアフィルトレート破砕物）。

この残液を約１７！に濃縮し、そして系を０．５１の脱
イオン水によりすすいだ。この濃縮された残液を、ブラ
イン冷却したホモジナイザー中で７５００ｐｓ　＋にて
５回通すことにより完全な細胞溶解を保証した（破砕物
２）。

ホモジナイザーを等容量＋０．１１の６３％シュ１、１
〜１．２５ｇ／ｍ１であった。破砕物の］Ｏｍ＃のサン
プルの温度及び重量を記録した。遠心に先立ち２０℃以
上の温度を維持した。混合物を１２．０ＯＯｘ　ｇ、　
７５　ｍｌ　／分〜±５ｍ１／分で遠心分離した。上清
は曇っていたが濁ってはいなかった（上清１）。上清を
廃棄し、そしてペレットをビーカーに取り出しそして秤
量した。ペレットをプローブと共に１．５βの１０ｍＭ
Ｅｒ１ＴＡ中に再懸濁しく再懸濁液１）そして前に用い
たのと同じ流速及び温度において再度遠心分離した。上
清を再びデカントレ（上清２）そして精製された屈折体
粒子を含有するペレット（最終ペレット）を凍結ペース
トとして一８０℃にて貯蔵した。屈折体粒子調製物を全
蛋白質のローリ−（Ｌｏｗｒｙ）アッセイ、生物活性、
５Ｏ３−ＰＡＧＥ、及びリポポリサッカライドアッセイ
により特徴付けた。

２．１０００１規模 １０００１の培養物から屈折体を学齢するための精製方
式は、大規模な装置を使用した点を除き１０１規模につ
いて記載したのと本質的に同じである。

培養物を、スパイラルカートリッジを用いてクロス−フ
ロー濾過により濃縮した。６５００ｐｓ　ｉにて破砕機
を３回通すことにより細胞を破砕した。脱イオン水に対
するダイアフィルトレーションの後、ＥＤＴＡを２ｍＭ
の最終濃度に添加した。封入体が破壊される前に生存微
生物が残存していないことを保証するため、１１のオク
タツールも発酵槽に加えた。数時間の後、ダイアフィル
トレーションされた破砕物を、破砕機に通すことにより
再度破砕した。

破砕物にシュークロースを添加して１．１〜１．２５ｇ
／ｍｌの最終密度とした。遠心分離中又はその前に２０
℃以上の濃度を維持した。混合物を１０．０００〜２０
．０ＯＯＸ　ｇ、１〜２１／分にて遠心分離した。精製
された屈折体粒子を含有する生ずるベレットを凍結ペー
ストとして一８０℃にて貯蔵した。屈折体調製物を次に
蛋白質のローリ−アッセイ、生物活性、５Ｏ５−ＰＡＧ
Ｅ、及びリボポリサンカライドアッセイにより特徴付け
た。

以下余白 例Ｌ　イ文タ□−口／」予へｌｊ、−２）含有荊折俸の
精製Ｚ、５ｈａｋｅｄ等により１９８４年１０月１７１
１に出願された共同出願に係る係属中の米国特許出願Ｎ
［１６６１，９０２号に記載されているｐｌ、Ｗ４５　
（ＡＴＣＣ＃３９，６２６）を相持するＥ、コリＫ　１
２　／ＭＭ２９４−１細胞を例１（Ａ）に記載したよう
にして増殖せしめた。屈折体を例１　　（Ｒ）に記載し
た方法に３Ｌり精製した。

Ａ、１ＯＮ規模 屈折体の調製物を第１表中精製の各段階において特徴付
ける。一般に、ＩＬ−２は精製された粒子中の全蛋白質
の約５０％を占める。他の５０％はおそら＜Ｅ、コリ細
胞性蛋白質により寄与される。

第１表に示すローリ−データは、低いＢＳＡ標準のため
に正常値より約２０％高く、全粒子蛋白質に対する見か
けト低いＩＬ−２の寄与を示す。屈折体蛋白質の５Ｏ３
−ＰＡＧＥ分離のデンシトメータースキャンニングから
、ＩＬ−２は全屈折体蛋白質の８５％という多くを占め
るであろう。デンシトメーター吸収は蛋白質に結合する
クマソシー色素の量〔これは蛋白質ごとに異る（重量当
り）〕に依存するので、これは一般に屈折体蛋白質を予
想するための正確な手段ではない。ともかく、屈折体中
に存在するＥ、コリ蛋白質の多くは１４．４ｋｄのＩＬ
−２蛋白質より非常に分子量が大であり、そしてそれ故
に他の方法によって一層容易に除去され得る。

細胞収得物から屈折体を含有する粒子ペーストまでのＩ
Ｌ−２の回収率は第１表に示す例において約５０％であ
った。処理中注意深く洗浄することにより、収率は７０
％という高きに達する。これらの結果は２０〜２５％で
ある現在使用されている方法と比較される。さらに、約
７．４倍の精製が達成される。リポポリサッカライドア
ッセイの結果は、再懸濁された粒子ペレット中のエンド
トキシンレベルが約２〜２０μｇ／ｍｔ＋　（又は約４
０〜４００ｎｇ／ｍｇ蛋白質）であったことを示してい
る。

以下余白 Ｂ、この発明の屈折体の精製における＋１．−２の一層
高い比活性 この発明の方法及びＭａｒｓ　ｔｏｎ等により記載され
ている方法による同じ発酵からの屈折体の精製は次の結
果をもたらした。

すなわち、（ｉ）粒子に会合している汚染物質を除去す
るための脱イオン水に対する追加のダイアフィルトレー
ション、及び（２）屈折体よりも密度の低い物質がペレ
ット化しないためのシュークロースの添加による十厨し
た密度が、従来の方法により得られるものより８倍高い
ＩＬ−２のＩｔ活性をもたらす。

Ｃ，１０００１規模 屈折体の調製物を第２表中の精製の幾つかの段階におい
て特徴付ける。この表は第１試行を示す。

やはり１０１規模の場合と同様に、＋１−２は全屈折体
蛋白質の約５０％（５３，５％）を占める。最終比活性
は１０１調製において得られたそれよりもわずかに低い
が、しかし実験誤差の範囲である。第３表は、収得から
１０，０００〜２０，０ＯＯＸ　ｇにおけるシュークロ
ース中懸濁液の遠心分離後に得られた最終屈折体ペレッ
トまでのＩＬ−２の回収を示す。５ＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分離された蛋白質のデンシトメータースキャンニング
により算定する場合最初のＩＬ−２蛋白質の約ＩＬ３％
が回収され、他方最初のＩＬ−２生物活性の約２５％が
回収された。第２試行においては、第４表及び第５表並
びに第３図に示すように、ＩＬ−２は全屈折体蛋白質の
約５０％（４５，７％）を占め、そしてそれぞれ最初の
ＩＬ−２生物活性及び蛋白質の約１７〜２３％が回収さ
れた。

屈折体の精製の各段階における材料の５Ｏ３−ＰＡＧＩ
’：（ｉ５％、還元）分析を第３図に示す。５Ｏ５−Ｐ
ＡＧＥのレーンＡは上から下に向って９４　、６７　、
４３　、３０　。

２０及び１４．４キロダルトンの分子量マーカーを含む
。

レーンＢ−Ｅはそれぞれ、細胞培養収得物、濃縮された
培養物、破砕物、及びダイアフィルトレートからの２０
μｇの蛋白質を含む。レーンＦ　−Ｈはそれぞれ、第１
遠心分離からの２つの上清画分（５μｇずつの第１屈折
体ペレットはレーンＩ及び、Ｊ中に示す）、及び第２遠
心分離からの上清（５μｇの第２屈折体ペレットはレー
ンＫに示す）の１５μｇの蛋白質を含む。レーンＩＬＭ
、及びＮはそれぞれ３．６，１．８．及び０．９　μｇ
　ノ標準としての精製されたＩＩ、−２を含む、、５Ｉ
ＩＳ−ＰＡＧＥは、第１屈折体ペレットを示すレーン１
及びＪにより、ＩＬ−２が高分子量汚染物を含有しない
ことが非常に顕著であることを示している。

回収の％は、スケールアップされた方法におけるＩＬ−
２のわずかに低い収率を示し、これはこのような大写￥
を処理するのに使用される大規模な装置のために予想外
である。方法を一層精密にすることによって収率が改善
されると予想される。例えば、第４表及び第５表中に記
載されている発酵及び精製から５ＩＩＳ−ＰＡＧＥによ
り得られた予備的結果は、シュークロースト清の第２遠
心分離が追加の屈折体を含有するペレットをもたらした
。第１ペレツトの５０〜８０％という多くが追加の遠心
分離により得られる。この材料の最初の特徴付けは、第
１ペレツトの純度に匹敵する純度を有することを示した
（第３図、レーン、■及びＫを参照のこと）。

この図は、ＩＬ−２が破砕物ペレット中で非常に純粋で
あることを示している。＋１．−２のおよその回収率は
約５０％と高い。汚染Ｅ、コリ蛋白質の多くは非常に高
分子量を有し、従って、目的生成物の一層の精製が促進
される。従来使用されている方法に比べてこの発現の屈
折体精製法により実現されるコストの低下及び取扱の容
易さが、その価値を一層増大せしめる。

以１ζ余白 第□□づ一表 １０００　ｆ規模の回収（第１試行） 収得物　ＩＬ３００　１５００　　９．９ＸＩＯ”　　
１００　　１第−−−，５−−−表 １０００１規模の回収（第２試行） 収得物　９，０９０　１１４０　　１．７Ｘ］０１２１
（ｉ０１例３．　精製さ−れ−なインター駐−イキン−
ｇ　、、　（ＩＩ、−２）−の製剤化 例２．Ｃに記載した屈折体を含有するＲ　（ペーストの
＋１１離に続き、ベレットをさらに処理して高度に精製
された＋１．−２蛋白質を得た。まず、ペーストを５％
のＳ　Ｄ　Ｓを含有するリン酸緩衝化塩溶液中に可溶化
した。可溶化した材料を２５，０００〜３５，０００×
ｇにて遠心して不溶物を除去した。遠心分前からの子端
を、固体Ｄ　Ｔ　ｌ’の添加により最終１農造５０ｍＭ
に、そしてｌ’：ＩＩＴＡの添加により２ｍＭにした。

このン容液のｐＨをＮ　ａ　Ｏｔｌにより８．５±０．
１に調整し、そして次に窒素の存在下で５０會５°（゛
にで２０分間加熱した。還元の後、反応７１ｔ合物を約
２５℃に冷却し、そして氷酢酸を用いてｐＨを５．５±
０．１に再調整した。

次に、セファクリルＳ−２００カラムを用いて高分子量
ｔη染物のクロマトグラフ分離を行った。６■溶化され
そして還元された屈折体蛋白質をカラＪ、に負荷し、そ
して５０ｍＭ酢酸（ｐＨ５，５）　、１　ｍＭＥＤＴＡ
及びＯ，１％５Ｆ）Ｓを含有する溶出緩衝液を用いて、
清浄なパイロジエン除去された容器に画分を集めた。ピ
ーク画分く最高のピークの高さの７０％に入る画分）を
プールし、そして次のようにして制御された酸化にかけ
た。Ｓ−２００蛋白質プール及びヨードソ安息香酸のそ
れぞれを１＝１．６の分子比で、１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、０．１％ＳＤＳ及びＩｍＭＥＤＴＡを含有する反
応容器に加えた。酸化の間ｐｌ＋を０．５　Ｎ　Ｎａ０
ｔｌにより７．８±０．２に調節し、そして酸化が完了
した時５．５±０．２に調整した。酸化されたＩＩ、−
２は還元されたＩＬ−２より親水性である。酸化反応の
進行はＲＰ−Ｈ円、Ｃによりモニターした。

酸化された＋１−２を１０，０００分子量カットオフを
有する中空繊維限外濾過を用いて濃縮した。次に、蛋白
質を０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭアセテート（ｐＨ５，５
）及びＩｍＭＥＤＴＡに対して３容量交換にわたりダイ
アフィルトレートした。次のＨＰｌ、Ｃ精製のための調
製において、ダイアフィルトレートされた蛋白質のｐＨ
を氷酢酸を用いて３以下に下げ、そして０．４５μｍの
フィルターを通して濾過した。

ＩＬ−２の精製方式の次の段階は２種類の溶剤と共にバ
イダックＣ４結合相シリカゲルカラムを用いる調製用Ｈ
ＰＩＬであった。溶剤１は蒸留水中６％の酢酸及び１０
％の２−プロパツールであり、そして溶剤２は蒸留水中
６％の酢酸及び９４％の２−プロパツールであった。溶
剤１を３０分間ポンプ輸送した後、酸性化されたＩＬ−
２蛋白質を負荷した。

カラムを溶剤１及び２のグラジェントにより展開し、そ
して約４０％の溶剤２において溶出する蛋白質をパイロ
ジエン除去した目盛付シリンダー中にプールした。５０
ｍＭアセテート（ｐ）ｌ　５．５　）、１　ｍ　Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳを含む、ｌＩＰ＋、ｃプール
の１４倍容量の攪拌された緩衝液に、プールされた蛋白
質をゆっくり添加することによりそれを稀釈した。ＨＰ
ＬＣプール中に存在する有機溶剤に対する、次の段階で
使用する中空繊維限外濾過ユニットの感受性のために、
前記の稀釈が必要であった。

稀釈された１（ＰＬＣプールを、１０．０００分子量カ
ットオフを有する中空繊維限外濾過ユニットを用いて？
１４縮した。ごの（ａ）宿物を５０ｍＭアセテート（ｐ
１１５．５）　、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ及びＯ，］％Ｓ　
Ｄ　Ｓに対して３容璽の交換でダイアフィルトレーショ
ンした。

＋１．−２の精製における最終クロマトグラフ段階は第
２のセファクリルＳ−２００カラムを用いて行った。

このカラムの第１の［１的は、ＩＬ−２千ツマ−画分を
蛋白質の高分子量オリゴマーから分離することであった
。カラムを５０ｍＭアセテート（ｐＨ５，５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ及び０．１％Ｓ　Ｉ）　Ｓを含有する緩衝液で
溶出し、そしてＩＬ−２モノマ一画分をプールした。

製剤化の直前に、ＳＤＳのレベルが１００〜２００μｇ
７ｍｌ蛋白質の範囲になるまで１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ρ１１７．５　＞　に対してダイアフィルトレーシ
ョンした。

精製されたＩＬ−２を５％（Ｗ／Ｖ）のマンニトールを
含有するｌ０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）中に
配合した。これを０．４５μｍのフィルターをｉ山して
前濾過し、そして０．２２μｍのフィルターをｉｌｌし
て無菌＋１１遇した。最後に、律酸物を容器バイアル中
で凍結乾燥し、４℃で貯蔵した。このようにして調製さ
れた、精製されそして製剤化された＋１．−２蛋白質は
、ＩＩ　Ｐ　１．Ｃにより９７％純度であり、そして還
元又は非還元５ＩＩＳ−ＰＡＧＥによりＩＬ−２モノマ
一純度ミ）９％であることがμ出された。比活性は２．
３Ｘ１０’ユニット／ｍｇ蛋白質であり、残留ｓｎｓの
レベルは１８１μｇｓＤｓ／ｍｇＩＬ−２であった。望
ましいＩＬ−２の溶解性を維持するためには１００〜２
００　μｇ　Ｓ　Ｄ　Ｓ　／　ｍ　ｇ　ＩＬ−２が必要
である。

最終住酸物のアミノ末端アミノ酸配列及びアミノ酸組成
は理論的予想と一致する。

例３、　キー上−綿維芽細胞−イ良りタ−７５（ローン
　＜ＩＦＮ−β）−含有屈折体の一精製 シタス・コーポレイションの米国特許Ｍ４．５１８，５
８４に記載されているｐｓＹ２５０］　（ＡＴＣＣ＃３
９．５１７）を担持するＥ、コリＫ　１２／ＭＭ２９４
−１細胞を例１　（Ａ）に記載したようにして増殖せし
めた。

Ａ、屈折体の精製 例１　　（Ｂ）（ｉ）に記載した方法に若干の変更を加
えて屈折体を精製した。細胞をホモジナイザー中で７５
００ｐｓ　ｉにて３回通すことにより、破砕した。

この系を脱イオン水ですすぎ、そして細胞溶解物を脱イ
オン水により５１の最終容量とした（破砕物１）。５倍
量の脱イオン水に対するダイアフィルトレーション（ダ
イアフィルトレーションされた破砕物）に続き、細胞粒
子材料を濃縮し、そして０．７５ρのｌ　ＯｍＭ　ＥＤ
ＴＡを用いて系をすすいだ。

このダイアフィルトレーションされた細胞性濃縮物の最
終容量は２．ｌｌであった。この濃縮物を、ホモジナイ
ザー中で７５００ｐｓ　ｉにて３回通すことにより再破
砕し、そして等容量の６３％シュークロース及び２ｍＭ
ＥＤＴＡを添加して５．０１の容量とした（破砕物２）
。この混合物を、シャープレス遠心分離機中４０．００
Ｏｒｐｍにて、約１００ｍ１ｌ／分で遠心分離した。１
．ＯＲのｌ　ＯｍＭ　ＥＤＴＡにより系をすすいだ。精
製された屈折体粒子を含有する最終ベレ・７トを凍結ペ
ーストとして一８０℃にて貯蔵した。

Ｂ、ＭｉＬＪ斤イも１周裂−物ヌ４１１イ寸」す−屈折
体調製物を第６表の各精製段階において特徴付けた。

インターフェロンは精製された粒子中の全蛋白質の約１
７％を占めるようである。その他の８３％はおそら（Ｅ
、コリ細胞蛋白質であった。細胞収得物から屈折体を含
有する粒子ペーストまでのＩＦＮ−βの回収は８５％で
あり、ｐｓＹ２５０１を１１持するＥ、コリにより生産
されたＩＦＮ−βのほとんどすべてが屈折体に含まれて
いることが示された。これらの屈折体の他の内容物が、
屈折体の単なる単離によって達成されるであろうＩＦＮ
−βの精製を限定した。しかしながら、はとんどの汚染
物が非常に高分子量のものであり、そしてそれ故に他の
方法により一層容易に除去され得る。さらに、組換ＩＦ
Ｎ−βを回収するためのこの簡単で高収率の“フロント
エンド”法は、この親脂性蛋白質を、それが生産される
水性媒体から抽出するために脂肪族フルコールの使用を
必要としない。

次の例は、さらに開発された高収率の“フロントエンド
”法を例示し、この方法においては有機抽出を用いる。

以１ζ余白 一例ｉ　湛」り閑■３耕讃１，４７り：−フｊ辷町ン−
（、ＨＰＮ＝β−）この例は、約８０％（８１，４％）
のＩＦＮ−βを有する屈折体を含有する最終ベレットの
回収のための延長されたフロント−エンド法を示す。シ
タス・コーポレイションの米国特許ＮＱ４，５１８．５
８４中に記載されているｐｓＹ２５０１　（ＡＴＣＣ６
３９，５１７）を担持するＥ、コリＫ　１２／　Ｍ　Ｍ
２９４−１細胞を、例１　（Ａ）に記載されているのと
本質的に同様にして、１０００１発酵試行として増殖せ
しめた。例１　（Ａ）とこの例の細胞増殖との相違は次
のＪりであった。

１、発酵槽に水を実働容積まで満たした後次の微量元素
を添加した。

（ｉ　）　　Ｚｎ５Ｏｎ　・７Ｈ２Ｏ ＭｎＳＯ，・Ｈ，０ ＣＬＩＳＯ４・５８ｚＯ （ｉｉ）　　ＮＢ３サイドレー）・２＋１１０（ｉｉｉ
　）　　ＫＨｚＰＯ４ （ｉｖ）　　（ＮＪ）ｚｓＯ４ ２、次に、発酵槽フィード及び添加容器を標準的操作法
に従って殺菌した。

３．　発酵槽を冷却し、そして凍結培養物又は種母Ｅ、
コリ培養物を接種した。

４、　発酵液中にテトラサイタリンを添加しなかった。

５．７２４Ｍではなく　　１００．ＩＪＭのＦｅＳＯ４
’　ＩＨｚＯを使用した。

６．３ｍＭではなく２０ｍＭのＭｇＳＯ４・ＩＨｚＯを
使用した。

７、　発酵を開始して約１５時間後にｐＨを６．８に調
撃した。

８、　サンプルの光学濃度の測定及び残留グルコースの
測定を１４〜１６時間後、及びその後１時間の間隔で行
った。

９、　グルコースの消費が４０±６ｇ／ｌに達した時、
培養物の収得を行った。

延長−さ−れｔζフ−ワ　ンー１−ニニ□；１□）（□
ト　れ１屈折体の単離のために延長されたフロント・エ
ンド法を用いる異種性蛋白質の一般的精製方式を第２園
に示す。例１　（Ｂ）に前記したように、封人体調製物
から目的の蛋白質を可溶化するための変性剤の選択、及
び精製法において必要とされる追加の段階は蛋白質の性
質に依存し、そしてＭａｒｓｔｏｎ等、前掲、及びＫｌ
ｅｉｄ等、前掲によりあル程度記載されている。

この例において使用する延長されたフロント−エンド法
の種々の段階を、全蛋白質のローリ−アッセイ、住物活
性、５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びリボボリサ・２カライドアツ
セイにより特徴付けた。第７表は最後ペレットまでの精
製の種々の段階における屈折体の調製を特徴付ける。５
ＩＩＳ−ＰＡＧ［！のデンシトメーターの結果から、Ｉ
ＦＮ−βは最終ペレット中の全蛋白質の約８１．４％を
占める。

収得材料を加圧下で１００　Ｋ分子量カットオフのｔＪ
Ｆクロス−フロー濾過カートリッジを１ｌｌｌＬで循環
せしめることにより約５〜ｌＯ倍に濃縮した（濃縮物）
。細胞を６０００〜＋１１０００ｐｓｉに°ζζマント
ン−ガラリン圧ホモジナイザーに３回ｉｔ！ｌずことに
より破砕した（破砕物１）。

この破砕物にＥＩＩＴＡを加えて最終濃度を５ｍＭとし
た。次に、懸濁液を５容量の脱イオン水に対してダイア
フィルトレーションした（ダイアフィルトレーションさ
れた破砕物）。

次に、ＥＩＩＴＡを２ｍＭの最ｖ！濃度まで加えた。

オクタツールをｌ　ｖ　／　ｖ％に加え、ダイアフィル
トレーションされた生成物中のすべての残留生存細菌を
殺した。懸濁液を６，０００〜８．０００ρｓｉｇにて
マントン−ガうリン高圧ホモジナイザーに２回ｊｍすこ
とにより再破砕した（破砕物２）。

シュークロースを再破砕物に添加して最終濃度を２３ｗ
／ｗ％とし、１．１ｇ／ｍ１と１．２５ｇ／ｍ１の間の
最終密度グラジェントを形成せしめた（シュークロース
懸濁液）。この混合物を１０，０００〜１５．０ＯＯＸ
　ｇにて遠心分離し、そして粒子ペレット又はペースト
を集めた（粒子ペレット）。デンシトメータースキャン
により示されるように、この粒子ペレットは約２０．４
％のＩＦＮ−βを含有していた。

次に、粒子ペレットを２％のＳＤＳを含有するリン酸緩
衝化塩溶液中に可溶化した。固体Ｄ　Ｔ　Ｔ及びＥｒ１
ＴＡをそれぞれ最終濃度が１０ｍＭ及び２ｍＭとなるよ
うに加えた。懸濁液を窒素のもとで５０±５℃にて１０
分間加熱した。次に、反応混合物を約２５℃に冷却し、
そして次にこの混合物のｐＨを７．４に調製した。

懸濁液の全量と同じ容量の２−ブタノールを秤った。懸
濁液及び有機溶液を別々にしかし同時に１．１〜１．３
７！／分の流速で静置ミキサーにポンプ輸送し、そして
次に連続遠心機（ウエストファリア、約ＩＬ７７０ｘ　
ｇ　）に輸送して相分離した。ＩＦＮ−βを含有する２
−ブタノール・リッチ相を集めたく有機抽出液）。

２−ブタノール抽出液を、２．５容量のリン酸緩衝化塩
溶液中０．１％Ｓｒ’）Ｓと混合した。固体Ｄ′ＦＴを
２ｍＭの最終濃度に添加した。有機抽出液／緩衝液のｐ
Ｈを氷酢酸により６．２±０．１に調製した（酸沈澱物
）。

次に、混合物を約２〜６時間遠心分離した（シャープレ
ス遠心器、１３，２００ｘ　ｇ　）。次に、約８１％の
ＩＦＮ−βを含有する最終ペレットを集めた（最終ペレ
ット）。

予ｐ−後−の処運 次に、最終ペレットを５０ｍＭリン酸緩衝液（５ｍ　Ｍ
　Ｅｒ１ＴＡ）中５％５ｒｌＳに再懸濁した。固体ｒ）
ＴＴを２０ｍＭの最終濃度に添加し、そしてｐＨをＮａ
ＯＨにより８．５に調整した。懸′／＠液を窒素のもと
で５０±５℃にて１０分間加熱し、そして約２５℃に冷
却した。次に氷酢酸によりｐＨを５．５に調整し、そし
て溶液を０．６５μｍのフィルターを通して濾過した。

次に、濾液を、前カラムクロマトグラフィーにより、セ
ファクリル８２００カラムに負荷し、そして５０ｍＭア
セテート（ｐＨ５，５）　、１　ｍＭ　ＥＩ〕ＴＡ及び
１％ＳＤＳから成る溶出緩衝液を用いて清浄なパイロジ
エン除去した容器に集めた。ＩＦＮ−βモノマーを含有
する画分をプールした。

次に、前カラムプールをＩＯＫ分子量カットオフの中空
繊維濾過ユニットを用いて濃縮した。

次に、濃縮された前カラムプールをヨードソ安息香酸（
ＩＲＡ）を用いて酸化した。この酸化は等モル量の蛋白
質及びＩＢＡを２ｍＭビロリン酸ナトリうム、Ｏ，１％
ＳＤＳ及び１ｍＭＥＩ］Ｔ八を収容する反応容器に添加
するごとに、Ｆ、り行った。

２０μＭ過剰のＩＨＡが酸化の紡点においで存在した。

酸化中ＮａＯＨによりｐｌ＋を９．０１０．１に調節し
、そして酸化が完ｒした時、氷酢酸に、Ｌす５，５１０
．２に言周整した。

次に、ＩＯＫ分子量カッ１−オフの中空繊維限外濾過ユ
ニットを用いて蛋白質をン珊審宿した。

次に、蛋白質を十カラム〔七フアクリルＳ　２００−Ａ
〕−トに負荷し、そして５０ｍＭアセテート（ｐＨ５，
５）　、１　ｍＭ　ＦＤＴＡ及び０．１％Ｓ　ｌ）　Ｓ
から成る溶出緩衝液を用いて清浄なパイロジエン除去さ
ねた容器に集めた。

プールすべきピークの最初から始まってピークの終りま
で各分画チューブからのサンプルにつき５ｒｌＳ−ＰＡ
ＧＥを行った。５ｒｌＳ−ＰＡＧＥ（７）結果を用イテ
高分子量汚染物を含有しない画分を決定した。次に、こ
れらの画分をプールした。

次に、主カラムプールをＩＯＫ分子量力、トオフの中空
繊維限外濾過を用いて濃縮した。

次に、セファデックスＧ−２５カラムを１ｍＭＮａＯＨ
で平衡化し、そしてセファデックスＧ−７５プールを負
荷した。この工程クロマトグラムを用いてＩＦＮ−βピ
ークを集めた。生成分をその脱塩工程から１５分間以内
に製剤化した。

精製されたＩＦＮ−βを正常血清アルブミン（ヒト）Ｕ
　Ｓ　Ｐ　（ＮＳＡ）及び５０％デキストロース−水和
物と共に製剤化した。正常血清アルブミンを注射用水で
稀釈してその最終濃度を、０．０５及び０．２５ｍ　ｇ
／ｍｌのＩＦＮ−β製剤については１．２５％に、又は
１．００ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ−β製剤については５．０
％にした。稀釈されたＮＳＡのｐＨを１０％ＮａＯＨに
より１２．０±０．５に調整した。

ＩＦＮ−βをＮＳＡ溶液にすぐに加え、そして混合物の
ｐＨを３〜６ＮＨＣ１により７．５±０．３に調節した
。次に計算量のデキストロースを加えた。

製剤化生成物を０．４５μｍのフィルターで前濾過し、
そして次に無菌０．２２μｍフィルターを通して４時間
以内に濾過した。

殺菌された栓を有する殺菌されたバイアルに、周囲から
モニターされた衛生約１つ無菌的条件下でＩＦＮ−β製
剤を無菌的に充填した。

バイアルを適当な熱電対を取り付けた凍結乾燥器中に置
いた。次にバイアルを一３５℃〜−４５℃にて凍結した
。凍結乾燥サイクルを完了し、そしてバイアルを機械的
に真空下で密封した。

以下糸白 要約すれば、この発明は、異種性蛋白質を含有する屈折
体を、該屈折体を含有する宿主破砕物から単離するため
の効果的な方法を桿供することがわかる。この発明の方
法において、コストの低減及び取扱易さが実現される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、異種性蛋白質を単離するために例１〜４にお
いて使用される一般的系統図である。 第２図は、異種性蛋白質を単離するために例５において
使用される他の一般的系統図である。 第３図は、この発明の方法の種々の段階において得られ
るインターロイキン−２の量を示す５Ｏ３−ＰＡＧＥ還
元ゲルである。 第４図は、宿主培養物の発酵から精製され製剤化された
蛋白質生成物の凍結乾燥までの好ましい全工程の１つの
各段階の詳細を例示する流れ図である。 第５Ａ図及び第５Ｂ図は、宿主培養物の発酵から精製さ
れ配合された蛋白質生成物の凍結乾燥までの他の好まし
い全工程の各段階の詳細を示す流れ図である。これらの
図は例５に従う方法に対応する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、異種性蛋白質を生産するために形質転換された宿主
   微生物細胞培養物から該蛋白質を含有する屈折性材料を
   回収する方法であって、 （ａ）該微生物の細胞壁及び細胞膜を破砕し； （ｂ）この破砕物から９９重量％以上の塩を除去し； （ｃ）この脱塩された破砕物を再破砕し； （ｄ）この破砕物中の液の密度もしくは粘度を上昇せし
   めるため、又は該液中の密度もしくは粘度の勾配を生じ
   させるために該破砕物に物質を添加し；そして （ｅ）高速遠心分離により細胞破片から屈折性材料を分
   離する； ことを含んで成る方法。 ２、前記段階（ａ）を１−オクタノールの存在下で行う
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記段階（ａ）の後及び段階（ｂ）中に前記破砕物
   に蒸留水又は脱イオン水を添加する段階をさらに含んで
   成る特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、前記段階（ｂ）をダイアフィルトレーションにより
   行う特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、前記段階（ｂ）を、細胞膜を遠心分離しそして脱イ
   オン水又は蒸留水に再懸濁することにより行う特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ６、前記段階（ｄ）を、液の密度を約１．１〜１．３ｇ
   ／ｃｍ＾３のρに上昇せしめるように物質を加えること
   により行う特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７、液の密度を１．１３〜１．１７ｇ／ｃｍ＾３のρに
   上昇せしめる特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、前記物質が１又は複数の糖である特許請求の範囲第
   ７項に記載の方法。 ９、前記糖がシュークロースである特許請求の範囲第８
   項に記載の方法。 １０、シュークロース及びグリセリンの混合物を加えて
   ２相系を形成する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １１、前記段階（ｄ）を、物質を加えて液の粘度を５〜
   １０ｃｐｓに上昇せしめることにより行う特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 １２、前記蛋白質がインターフェロン−β又はインター
   ロイキン−２である特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。 １３、前記蛋白質がインターロイキン２である特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 １４、前記インターロイキン−２がｄｅｓ−ａｌａ−ｓ
   ｅｒ＿１＿２＿５ＩＬ−２である特許請求の範囲第１３
   項に記載の方法。 １５、さらに次の段階、すなわち （ｆ）前記屈折性材料を還元条件下で可溶化し； （ｇ）前記可溶化された屈折性材料を有機抽出し；そし
   て、 （ｈ）この屈折性材料を抽出物から分離する；を含んで
   成る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １６、前記段階（ｆ）を、還元剤の存在下で、水性緩衝
   液中可溶化剤により行う特許請求の範囲第１５項に記載
   の方法。 １７、前記可溶化剤がＳＤＳであり、そして前記水性緩
   衝液がリン酸緩衝化塩溶液である特許請求の範囲第１６
   項に記載の方法。 １８、前記段階（ｇ）を、有機抽出剤として２−ブタノ
   ールを用いて行う特許請求の範囲第１５項に記載の方法
   。 １９、前記段階（ｇ）を、酸沈澱段階及びこれに続く遠
   心分離により行う特許請求の範囲第１５項に記載の方法
   。 ２０、異種性蛋白質を含有する屈折性材料であって、 （ａ）該微生物の細胞壁及び細胞膜を破砕し； （ｂ）この破砕物から９９重量％以上の塩を除去し； （ｃ）この脱塩された破砕物を再破砕し； （ｄ）この破砕物中の液の密度もしくは粘度を上昇せし
   めるため、又は該液中の密度もしくは粘度の勾配を生じ
   させるために該破砕物に物質を添加し；そして （ｅ）高速遠心分離により細胞破片から屈折性材料を分
   離する； ことを含んで成る方法により製造された屈折性材料。 ２１、前記材料が１５〜７０重量％の所望の異種性蛋白
   質を含んで成る特許請求の範囲第２０項に記載の屈折性
   材料。 ２２、前記の製造方法がさらに、 （ｆ）前記屈折性材料を還元条件下で可溶化し； （ｇ）前記可溶化された屈折性材料を有機抽出し；そし
   て、 （ｈ）この屈折性材料を抽出物から分離する；をさらに
   含んで成る特許請求の範囲第２０項に記載の屈折性材料
   。 ２３、前記材料が７０〜８５重量％の所望の異種性蛋白
   質を含有する特許請求の範囲第２２項に記載の屈折性材
   料。 ２４、前記蛋白質がインターフェロン−β、又はインタ
   ーロイキン−２である特許請求の範囲第１５項に記載の
   方法。 ２５、約５０重量％の組換インターロイキン−２（ＩＬ
   −２）、又は約２０重量％の組換インターフェロン−β
   （ＩＦＮ−β）を含有する特許請求の範囲第２０項に記
   載の屈折性材料。 ２６、約８０重量％の組換インターロイキン−２（ＩＬ
   −２）又は組換インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）を
   含有する特許請求の範囲第２０項に記載の屈折性材料。 ２７、組換インターロイキン−２（ＩＬ−２）又は組換
   インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）を生産するために
   形質転換されたＥ．コリ（￥Ｅ．Ｃｏｌｉ￥）からＩＬ
   −２又はＩＦＮ−βを含有する屈折性材料を回収する方
   法であって、 （ａ）クロス−フロウ（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ）濾過に
   より宿主Ｅ．コリ細胞を濃縮し； （ｂ）該Ｅ．コリの細胞壁及び細胞膜を１％の１−オク
   タノールの存在下で破砕手段により破砕し； （ｃ）この破砕物に蒸留水又は脱イオン水を添加し； （ｄ）水の添加速度がダイアフィルトレーションの速度
   と等しくなるように蒸留水又は脱イオン水を連続的に添
   加して９９％以上の塩が除去されるまで前記破砕物をダ
   イアフィルトレーションし； （ｅ）この脱塩された破砕物を再破砕し、 （ｆ）液の密度が１．１３〜１．１７ｇ／ｃｍ＾３のρ
   となるまでシュークロースを添加し；そして、 （ｇ）高速遠心分離により細胞破片から屈折性材料を分
   離する； ことを含んで成る方法。 ２８、さらに次の段階、すなわち （ｈ）ＩＬ−２又はＩＦＮ−βと水溶性複合体を形成す
   る可溶化剤の水性溶液により前記屈折性材料中ＩＬ−２
   又はＩＦＮ−βを可溶化し、ここで前記水性溶液は還元
   剤を含有しており； （ｉ）還元剤の存在下で、得られた溶液からＩＬ−２又
   はＩＦＮ−βを分離し； （ｊ）前記段階（ｉ）の生成物を酸化し；そして（ｋ）
   この酸化生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーによ
   り精製する； ことを含んで成る特許請求の範囲第２７項に記載の方法
   。 ２９、前記可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウム又はナト
   リウムラウレートサルコシンであり、前記還元剤がジチ
   オスレイトールであり、段階（ｉ）をゲル濾過又は逆相
   高速液体クロマトグラフィーにより行い、そして段階（
   ｊ）をヨードソ安息香酸を用いて行う特許請求の範囲第
   ２８項に記載の方法。 ３０、前記段階（ｉ）を、ゲル濾過により前記溶液から
   ＩＬ−２又はＩＦＮ−β含有画分を分離しそしてこの画
   分からＩＬ−２又はＩＦＮ−βを逆相高速液体クロマト
   グラフィーにより精製することにより行い、そして前記
   段階（ｋ）の後に精製された生成物を製剤化しそして凍
   結乾燥する、特許請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１、さらに次の段階、 （ｈ）前記段階（ｇ）からの屈折性材料を還元条件下で
   可溶化し； （ｉ）この可溶化された屈折性材料を２−ブタノールに
   より抽出し；そして、 （ｊ）この抽出された屈折性材料を、酸沈澱及びそれに
   続く遠心分離により単離する； を含んで成る特許請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３２、さらに次の段階、 （ｋ）前記段階（ｊ）からの抽出された屈折性材料を、
   還元条件下、アルカリ性ｐＨにおいて可溶化し； （ｌ）ｐＨを約５．５に調整し； （ｍ）還元剤の存在下で前記溶液からＩＬ−２又はＩＦ
   Ｎ−βを分離し； （ｎ）段階（ｍ）の生成物を酸化し；そして、 （ｏ）この酸化生成物を蛋白質精製法により精製する； 段階を含んで成る特許請求の範囲第３１項に記載の方法
   。 ３３、前記段階（ｎ）をヨードソ安息香酸を用いて行い
   、そして前記段階（ｏ）をゲル濾過、逆相高速液体クロ
   マトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、又はゲル濾過とＲ
   Ｐ−ＨＰＬＣとの組合わせにより行う、特許請求の範囲
   第３２項に記載の方法。 ３４、前記段階（ｏ）からの精製された生成物を製剤化
   しそして凍結乾燥する特許請求の範囲第３３項に記載の
   方法。