JPS5939297A - 微生物が産生するヒトインタ−フエロン−βの精製法 - Google Patents
微生物が産生するヒトインタ−フエロン−βの精製法Info
- Publication number
- JPS5939297A JPS5939297A JP57146071A JP14607182A JPS5939297A JP S5939297 A JPS5939297 A JP S5939297A JP 57146071 A JP57146071 A JP 57146071A JP 14607182 A JP14607182 A JP 14607182A JP S5939297 A JPS5939297 A JP S5939297A
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- JP
- Japan
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- interferon
- human interferon
- ionic strength
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子組換え技術により微生物が生産するヒ
トインターフェロンβを菌体抽出液から分離精製する方
法に関する。
トインターフェロンβを菌体抽出液から分離精製する方
法に関する。
近年、遺伝子組換え法により微生物を用いて有用なヒト
タンパク質を生産する研究が盛んになり、抗ウィルス剤
、抗悪性腫瘍剤としての薬効が期待され↓４ヒト細胞か
ら、の生産が難しいインターフェロンもその対象の一つ
である。
タンパク質を生産する研究が盛んになり、抗ウィルス剤
、抗悪性腫瘍剤としての薬効が期待され↓４ヒト細胞か
ら、の生産が難しいインターフェロンもその対象の一つ
である。
微生物が菌体内に産生するタンノ（り成分を分離精製す
る場合には通常、まず除核酸を行なう。
る場合には通常、まず除核酸を行なう。
最も一般的な除核酸法は塩基性の水溶性高分子例えばプ
ロタミンのようなタン／くり質やポリエチレンイミンの
ような合成高分子などを適当量添加することによって核
酸とのポリイオンコンプレックスを形成せしめ、その沈
殿を遠心分離することによって行なわれる。大腸菌が産
生ずるヒトインターフェロン−αの精製の際も０５％の
ポリエチレンイミンを添加して核酸を遠心分離し、残っ
た上清液から硫安塩析によりインターフェロンを沈殿回
収する方法がとられている 。 （Ｔ、５ｔａｅｈｌ
ｉｎ ５ 、Ｊ、Ｂｉｏ上ｃｈｅｍ、、２５６（１８）
、９７５０〜９７５４（１９８１））本発明者らは大腸
菌が生産するヒトインターフェロン−βの精製において
、−１−記ポリエチレンイミン沈殿法を適用しようとし
た所、全く意外にもヒトインターフェロン−βが核酸沈
殿部分に集まることを見出し、鋭意検討を重ねて本発明
を完成した。
ロタミンのようなタン／くり質やポリエチレンイミンの
ような合成高分子などを適当量添加することによって核
酸とのポリイオンコンプレックスを形成せしめ、その沈
殿を遠心分離することによって行なわれる。大腸菌が産
生ずるヒトインターフェロン−αの精製の際も０５％の
ポリエチレンイミンを添加して核酸を遠心分離し、残っ
た上清液から硫安塩析によりインターフェロンを沈殿回
収する方法がとられている 。 （Ｔ、５ｔａｅｈｌ
ｉｎ ５ 、Ｊ、Ｂｉｏ上ｃｈｅｍ、、２５６（１８）
、９７５０〜９７５４（１９８１））本発明者らは大腸
菌が生産するヒトインターフェロン−βの精製において
、−１−記ポリエチレンイミン沈殿法を適用しようとし
た所、全く意外にもヒトインターフェロン−βが核酸沈
殿部分に集まることを見出し、鋭意検討を重ねて本発明
を完成した。
すなわち本発明は、ヒトインターフェロン−βを含む微
生物菌体抽出液に塩基性水溶性高分子を低イオン強度条
件下で添加し上清液を除去した後、イオン強度を上げる
かまたは有機溶媒を添加してヒトインターフェロン−β
を抽出回収することを特徴とする微生物が産出するヒト
インターフェロン−βの精製法である。
生物菌体抽出液に塩基性水溶性高分子を低イオン強度条
件下で添加し上清液を除去した後、イオン強度を上げる
かまたは有機溶媒を添加してヒトインターフェロン−β
を抽出回収することを特徴とする微生物が産出するヒト
インターフェロン−βの精製法である。
本発明の要点は低イオン強度条件下ではヒトインターフ
ェロン−βはポリエチレンイミン−核酸の沈殿と共沈し
、イオン強度を上げたり、エチレングリコール、プロピ
レングリコール、グリセリン等の有機溶媒を加えること
によって上清部分にインターフェロン活性が回収される
点にある。
ェロン−βはポリエチレンイミン−核酸の沈殿と共沈し
、イオン強度を上げたり、エチレングリコール、プロピ
レングリコール、グリセリン等の有機溶媒を加えること
によって上清部分にインターフェロン活性が回収される
点にある。
本発明のヒトインターフェロン−βは、遺伝子組換え技
術によりヒトインターフェロン−βの遺伝子で組換えら
れた大腸菌等の微生物が産生ずるヒトインターフェロン
−βである。
術によりヒトインターフェロン−βの遺伝子で組換えら
れた大腸菌等の微生物が産生ずるヒトインターフェロン
−βである。
まだ、塩基性水溶性高分子としては、プロタミン等のタ
ンパク質、ポリエチレンイミン等の合成高分子などが挙
げられるがこれに限定されない。
ンパク質、ポリエチレンイミン等の合成高分子などが挙
げられるがこれに限定されない。
本発明では、最初の核酸と共沈する工程ではインターフ
ェロン−βおよびインターフェロン以外のタンパク質の
一部が共沈し、他のタンパク質成分は上清中に残るので
、これを遠心分離して除くことができ、部分精製効果も
あることが実用上非常に有利な点である。
ェロン−βおよびインターフェロン以外のタンパク質の
一部が共沈し、他のタンパク質成分は上清中に残るので
、これを遠心分離して除くことができ、部分精製効果も
あることが実用上非常に有利な点である。
イオン強度の調節は通常ＮａＣ１，ＮＨ４Ｃｌ等によっ
て行なうが勿論他の塩類でもよい。インターフェロンと
核酸を共沈させる場合のイオン強度は０．５Ｍ未満、好
ましくは０．２ Ｍ以下がよく、上清中にインターフェ
ロンを抽出回収する場合はイオン強度を０．５ Ｍ以上
、好ましくは１． ＯＭ以上とするのがよい。従って、
共沈工程では低イオン強度条件下で行ない、抽出回収工
程では高イオン強度条件下で行なうと効率良く分離精製
することができる。
て行なうが勿論他の塩類でもよい。インターフェロンと
核酸を共沈させる場合のイオン強度は０．５Ｍ未満、好
ましくは０．２ Ｍ以下がよく、上清中にインターフェ
ロンを抽出回収する場合はイオン強度を０．５ Ｍ以上
、好ましくは１． ＯＭ以上とするのがよい。従って、
共沈工程では低イオン強度条件下で行ない、抽出回収工
程では高イオン強度条件下で行なうと効率良く分離精製
することができる。
また、本発明では前記のイオン強度を−にげる方法の他
に、有機溶媒を添加する方法によっても、インターフェ
ロンを上清中に抽出算収することができる。有機溶媒と
しては、極性溶媒が好ましく、具体的にはエチレングリ
コールプロピレングリコールまたはグリセリン等が挙げ
られるが、特にこれらに限定され々い。各溶媒の最適の
添加濃度はインターフェロンの失活、粘性などの取り扱
い上の性質、核酸の再溶解性などを考慮して実験的に決
定することができる。
に、有機溶媒を添加する方法によっても、インターフェ
ロンを上清中に抽出算収することができる。有機溶媒と
しては、極性溶媒が好ましく、具体的にはエチレングリ
コールプロピレングリコールまたはグリセリン等が挙げ
られるが、特にこれらに限定され々い。各溶媒の最適の
添加濃度はインターフェロンの失活、粘性などの取り扱
い上の性質、核酸の再溶解性などを考慮して実験的に決
定することができる。
大体の目安を述べると、エチレングリコールの場合は１
０〜７５ ＶＯＩ、％、好ましくは２５〜５０ ＶＯＪ
％、グリセリンは１０〜４０％がよいＯ なお、抽出回収においては、イオン強度を上げさらに有
機溶媒を添加すると、インターフェロン活性の抽出率が
上昇するため、この方法は特に好ましい。また、イオン
強度の」１昇や有機溶媒の添加で一部再溶解される核酸
は値１安塩析法などでインターフェロンと分離できる。
０〜７５ ＶＯＩ、％、好ましくは２５〜５０ ＶＯＪ
％、グリセリンは１０〜４０％がよいＯ なお、抽出回収においては、イオン強度を上げさらに有
機溶媒を添加すると、インターフェロン活性の抽出率が
上昇するため、この方法は特に好ましい。また、イオン
強度の」１昇や有機溶媒の添加で一部再溶解される核酸
は値１安塩析法などでインターフェロンと分離できる。
インターフェロンは不安定であるので、本発明の操作は
、なるべくコールドル−ム内（４〜７℃）或いは水冷下
に行ない、インターフェロンの失活を防ぐためにチオク
ト酸、Ｎ−アセチルシスティン等のＳＨ基の酸化防止剤
を用いることもできる。
、なるべくコールドル−ム内（４〜７℃）或いは水冷下
に行ない、インターフェロンの失活を防ぐためにチオク
ト酸、Ｎ−アセチルシスティン等のＳＨ基の酸化防止剤
を用いることもできる。
以下に、実施例により本発明の実施態様を説明する。
実施例１
ヒトインターフェロン−βを含む大腸＋’１４ Ｒ４体
抽出液を０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む２０ ｍＭリ
ン酸バッファー、ＰＨ７，４（以下、ｐＢｓと略す）で
希釈し、１０％ポリエチレンイミン−ＨＣｌ水溶液（Ｐ
Ｈ７，４）をポリエチレンイミンが終濃度０２〜０５％
となるよう（２６ｏ、ｎｍの吸光度１００に対しておよ
そ０３％位）加え、均一に混合して３ ｍｌずつ小試験
管に分注し、４℃で３０分静置した。
抽出液を０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む２０ ｍＭリ
ン酸バッファー、ＰＨ７，４（以下、ｐＢｓと略す）で
希釈し、１０％ポリエチレンイミン−ＨＣｌ水溶液（Ｐ
Ｈ７，４）をポリエチレンイミンが終濃度０２〜０５％
となるよう（２６ｏ、ｎｍの吸光度１００に対しておよ
そ０３％位）加え、均一に混合して３ ｍｌずつ小試験
管に分注し、４℃で３０分静置した。
１、５００ ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿を回収
した。上清中にはインターフェロン活性は検出限界以下
なのでほぼ定量的に核酸と共沈していることがわかる。
した。上清中にはインターフェロン活性は検出限界以下
なのでほぼ定量的に核酸と共沈していることがわかる。
次で色々な組成の抽出ｍ媒を各３ ｍ’ｌずっ加え、ボ
ルナ）クスミミキサーで十分攪拌した後、４℃、１晩静
置して抽出した。翌日遠心上清についてインターフェロ
ン活性の回収率、蛋白量、紫外部吸収等を測定する。（
表１） 表１、各種抽出条件でのインターフェロン活性回収率タ
ンパク質と核酸との分離の目安になる２ ８０ ｎｍと
２６０ ｎｍでの吸光度の比は菌体抽出原液が０８５９
であり、表１に示すように沈殿から抽出回収されたイン
ターフェロン溶液ではこの吸光度の比が最大１．６倍に
」１昇しておりよく核酸が分離されている。最初の沈殿
工程で相当量のタンパク質が共沈しないで」１清に残っ
たのでこれを除くことにより比活性も３〜４倍に上昇し
た。
ルナ）クスミミキサーで十分攪拌した後、４℃、１晩静
置して抽出した。翌日遠心上清についてインターフェロ
ン活性の回収率、蛋白量、紫外部吸収等を測定する。（
表１） 表１、各種抽出条件でのインターフェロン活性回収率タ
ンパク質と核酸との分離の目安になる２ ８０ ｎｍと
２６０ ｎｍでの吸光度の比は菌体抽出原液が０８５９
であり、表１に示すように沈殿から抽出回収されたイン
ターフェロン溶液ではこの吸光度の比が最大１．６倍に
」１昇しておりよく核酸が分離されている。最初の沈殿
工程で相当量のタンパク質が共沈しないで」１清に残っ
たのでこれを除くことにより比活性も３〜４倍に上昇し
た。
実施例２
大腸菌抽出液２６０ ｍｌに１０％ポリエチレン−ＨＣ
ｌ水溶液（ＰＨ７，４）を３０ ｍｌ加え、均一に混合
して４℃、２時間放置後、６０００ｒｐｍで２０分遠心
分離した。」１清中のインターフェロン活性回収率は１
．６％であった。
ｌ水溶液（ＰＨ７，４）を３０ ｍｌ加え、均一に混合
して４℃、２時間放置後、６０００ｒｐｍで２０分遠心
分離した。」１清中のインターフェロン活性回収率は１
．６％であった。
従って抽出液中のインターフェロン活性はほぼ定量的に
核酸と共沈していることがわかる。
核酸と共沈していることがわかる。
また約６０％のタンパク質が上清中に残りインターフェ
ロンと分離されるので精製効果もある。沈殿部公約４０
ｍ１をＩＭＮａＣｌ及びエチレングリコール５’Ｏｖｏ
ｌ、含有する２０ｍＭリン酸バッファー（ＰＨ７，４，
）ｓｏｏｍｌで懸濁し、４℃で一晩静置してインターフ
ェロンを抽出した。次で６０００ｒｐｍ、２０分遠心し
て上清を回収した。この」１清を蒸留水で２４００ ｍ
ｌに希釈し固体の硫安を６０％飽和になるように加えて
溶解し、インターフェロンを塩析した。８０００ｒｐｍ
、２０分遠心してタンパク質の沈殿を集め２０ ｍＭリ
ン酸バッファーに溶かしてインターフェロン活性を分析
した所、活性回収率は４０％工で比活性は５倍上昇して
いた。この分画の０Ｄ２８ｏ１０Ｄ２６ｏの比は１．４
を越えており核酸はほぼ完全に除去されている。
ロンと分離されるので精製効果もある。沈殿部公約４０
ｍ１をＩＭＮａＣｌ及びエチレングリコール５’Ｏｖｏ
ｌ、含有する２０ｍＭリン酸バッファー（ＰＨ７，４，
）ｓｏｏｍｌで懸濁し、４℃で一晩静置してインターフ
ェロンを抽出した。次で６０００ｒｐｍ、２０分遠心し
て上清を回収した。この」１清を蒸留水で２４００ ｍ
ｌに希釈し固体の硫安を６０％飽和になるように加えて
溶解し、インターフェロンを塩析した。８０００ｒｐｍ
、２０分遠心してタンパク質の沈殿を集め２０ ｍＭリ
ン酸バッファーに溶かしてインターフェロン活性を分析
した所、活性回収率は４０％工で比活性は５倍上昇して
いた。この分画の０Ｄ２８ｏ１０Ｄ２６ｏの比は１．４
を越えており核酸はほぼ完全に除去されている。
Claims (1)
- （１） ヒトインターフェロン−βを含む微生物菌体
抽出液に塩基性水溶性高分子を低イオン強度条件下で添
加し、上清液を除去した後、イオン強度を上げるかまた
は有機溶媒を添加してヒトインターフェロン−βを抽出
回収することを特徴とする微生物が産生ずるヒトインタ
ーフェロン−βの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57146071A JPS5939297A (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | 微生物が産生するヒトインタ−フエロン−βの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57146071A JPS5939297A (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | 微生物が産生するヒトインタ−フエロン−βの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5939297A true JPS5939297A (ja) | 1984-03-03 |
Family
ID=15399430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57146071A Pending JPS5939297A (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | 微生物が産生するヒトインタ−フエロン−βの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5939297A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63501471A (ja) * | 1984-12-27 | 1988-06-09 | サントリー株式会社 | インタ−フェロンの精製方法 |
-
1982
- 1982-08-25 JP JP57146071A patent/JPS5939297A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63501471A (ja) * | 1984-12-27 | 1988-06-09 | サントリー株式会社 | インタ−フェロンの精製方法 |
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