HU201775B

HU201775B - Process for purifying interferon

Info

Publication number: HU201775B
Application number: HU86770D
Authority: HU
Inventors: Naoki Higashi; Tattanakali L Nagabushan; Tsutomu Okada; Hounai Shirasawa; Shunjiro Sugimoto; Paul Phillip Trotta; Masafumi Tsujimoto; Kazumori Yamamoto
Original assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1984-12-27
Filing date: 1985-12-26
Publication date: 1990-12-28
Also published as: NO863424L; FI863378A0; AU5304886A; EP0227834A1; WO1986004067A1; FI863378A; DK407386D0; KR930007429B1; US4828990A; JPS63501471A; DK407386A; AU598455B2; NO863424D0; HUT41812A; KR870700635A

Description

A találmány rekombináns DNS technológiával előállított interferon hatású polipeptid tisztítási eljárására vonatkozik, amely tisztítás során a polipeptid nem denaturálódik és proteázok okozta bomlást sem szenved; még részletesebben, az említett poli- 5 peptidet olyan mikroorganizmus állítja elő, amelyet egy interferon hatással rendelkező polipeptidet kódoló gént tartalmazó plazmid vektorral transzformálunk. A találmány különösen hatékony módszert szolgáltat egy kívánt polipeptidnek valamely mikro- 10 organizmus tenyészetéből való tisztításához, ahol az illető mikroorganizmus interferon aktivitást — különösen humán immun (vagy gamma) interferon aktivitást — kifejtő polipeptid előállítására képes.

Az interferon proteinek három típusra osztha- 15 tők fel, alfa, béta és gamma típusú interferonokra (rövidítve: IFN-a, IFN-β, illetve IFN-7), antigenitási és szerkezeti különbségeik alapján. A gamma interferonnak számos olyan jellemzője van, amely megkülönbözteti az alfa- és béta-interferontól. 20 Ezen különbségek közt szerepel az antigenitás különbözősége, továbbá nagyobb hatást fejt ki az immunfolyamatok szabályozásában és tumor ellenes aktivitása is nagyobb. A humán gamma interferont (a továbbiakban h-IFN-^y) olyan T limfociták tér- 25 melik, amelyek mutagénekkel vagy olyan antigénekkel stimuláltak, amikkel szemben a T limfociták szenzitizálódtak. A szakterületen jól ismert klónozási és expressziós módszerekkel is elő lehet állítani h-IFN-^y-t. 30

Legújabban a génmanipulációs módszerek fejlődése lehetővé tette számos fiziológiailag aktív polipeptid termelését mikroorganizmusok és állati sejtek segítségével úgy, hogy ezeket az anyagokat az illető szervezetből elválasztással és tisztítással állít- 35 ják elő. Mindazonáltal még nem mondható el, hogy kialakult volna olyan módszer egy kívánt anyag kivonására és tisztítására, amely gyógyszerként való felhasználáshoz megfelelő tisztaságot biztosítana és amely nem okoz denaturációt vagy lebomlást. 40

A kapott gamma interferon tartalmú sejteket összegyűjtik és különböző módon roncsolják, például ozmotikus sokkal, ultrahangos feltárással, őrléssel, nagy nyíróerővel való roncsolással. Ezután az elroncsolt sejt és a gamma interferon keverékét 45 feldolgozzák a gamma interferon izolálása céljából.

Az oldhatatlan anyagokat centrifugálással választják el és a gamma interferon tartalmú felülúszót elkülönítik és tisztítják.

Bár ilyen előállítási eljárások szerepelnek már 50 szabadalmi leírásokban, ilyen például a rekombináns mikroorganizmusban termelt polipeptid kivonása és tisztítása guanidin-hidroklorid és karbamid felhasználásával (161321/1984. számú japán közrebocsátási irat és 4.476.049. számú amerikai egyesült 55 államokbeli szabadalmi leírás), vagy tisztítási módszer monoklonális antitest felhasználásával (186995/1984. számú japán közrebocsátási irat), azonban a kívánt anyag nem volt mindig megfelelően tiszta, denaturáció lépett fel és inaktiválódott. 60

A 0.087.686. számú európai közrebocsátási irat egy háromlépcsős eljárást ír le, amely humán immun interferon tisztítására vonatkozik sejtmentes felülúszóból vagy nyers interferon alapanyag kivonatából. Az első lépésben (természetben előfordu- 65 ló interferon esetén) affinitás oszlopot — ilyen a ConcanavalinA-Sepharose — használnak; ezután egy karboximetil-szilika oszlopon való kromatografálás következik, növekvő sótartalmú grádiens alkalmazásával, végül egy szilikagél töltetű oszlop. Az esetben, ha megfelelő tisztaságot úgy nem érnek el, vagy TSK vagy CM oszlop kromatográfíát alkalmaznak.

A 0.063.482. számú európai közrebocsátási irat olyan tisztítási eljárásra vonatkozik, amely kromatográfiás módszereket alkalmaz: 1) CPG (Controlled Poré Glass= ellenőrzött üvegszemcsék); 2) ConcanavalinA-Sepharose; 3) Heparin-Sepharose vagy Procion Red-Agarose; és 4) gélszűrés.

A 0.107.498. és 0.077.670. számú két európai közrebocsátási irat a következő lépésekből álló tisztítási eljárásra vonatkozik: 1) kicsapás polietiléniminnel; 2) bakteriális proteinek kicsapása pH beállítással; 3) koncentrálás és dialízis; 4) kromatografálás a) karboxi-metil-cellulózon, b) kalciumfoszfát gélen, c) karboximetil-cellulózon és d) gélszűrő gyantákon.

Minthogy ezek a tisztítási eljárások sok lépést igényelnek, bekövetkezik az interferon bomlása, azaz az interferon molekula degradálódik vagy aggregálódik, vagy az lesz az eredmény, hogy a kapott interferon termék kitermelése és aktivitása alacsony lesz.

Magától értetődik tehát, hogy egy kívánt polipeptid izolálása és tisztítása a kívánt polipeptidet előállító mikroorganizmus tenyészetéből úgy, hogy a kívánt anyag ne veszítsen aktivitásából és ne kísérje denaturálódás, nagyon fontos lenne olyan esetben, amikor ezek az anyagok gyógyszerként kerülnek felhasználásra, de az ipar szempontjából is lényeges lenne ilyen technológiának a kidolgozása.

Egy ilyen tisztítási módszer különösen kívánatos lenne az interferon esetében, tekintve, hogy gyógyszerként való alkalmazása most van folyamatban. Az interferonok vírus ellenes aktivitást fejtenek ki, de az IFN-^y-nál várható, hogy mint tumor ellenes szer és mint immunregulátor is felhasználható lesz, mivel különlegesen erősen gátolja a sejtek növekedését. Ezenfelül az interferon aktivitásnak többféle specificitása van. Például, ha az interferont gyógyszerként használják, előnyösebb olyan interferont használni, amely humán eredetű. Ezenfelül kívánatos, hogy a géntechnológiával előállított interferon izolálására és tisztítására rendelkezésre álljanak módszerek.

Rekombináns mikroorganizmusok révén kapott polipeptidek izolálásakor és tisztításakor rendszerint először elölik a tenyésztett mikroorganizmusokat valamilyen baktericid anyaggal (ez a biztonság szempontjából szükséges eljárás), majd ezután az elpusztult sejteket feltárják és ezt követi a kivonás. Ezen kezelések folyamán az előállítandó polipeptid gyakran denaturálódik és aktivitását is elvesztheti. Ezen felül ezek a kezelések aktiválhatják a sejten belüli proteázokat, amelyek gyakran elbontják a kívánt polipeptidet.

Egy ismert módszer, amelyben denaturáló szerrel —ilyen a karbamid vagy a guanidin-hidroklorid — denaturált és oldatba vitt proteint izolálnak és a denaturáló szert a tisztítás folyamán eltávolítják,

-2HU 201775 Β sejtekből vagy rekombináns mikroorganizmusokból kivont és tisztított polipeptidekre vonatkozik (161321/1984. számú japán közrebocsátási irat, 4.476.049. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás stb.). Azonban igen nehéz a kívánt polipeptidet biztosan renaturálni, még az esetben is, ha a denaturáló szert eltávolították. Ezért, ha az előállítandó polipeptidet gyógyszerként használják fel, ez a módszer nem előnyös, ugyanis ha a gyógyszer részlegesen denaturált polipeptiddel van keverve, akkor antigénné válhat. Másrészt, ha a tisztítási módszerben monoklonális antitestet használnak (előzőleg közlésre került a 186995/1984. számú közrebocsátási iratban stb.) fel lehet tételezni, hogy egy denaturált polipeptid dimer és trimer formája hozzákapcsolódhat a monoklonális antitesthez, az alkalmazott monoklonális antitest által felismert antigén determinánstól függően. A fent emI lített amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy olyan módszert ismertetnek, amely rekombináns Escherichia coli-ban termelt h-IFN-γ kivonására vonatkozik proteáz inhibitor jelenlétében azért, hogy meggátolják a polipeptid proteáz hatására bekövetkező bomlását, de az eljárásban használt guanidin-hidrokloridról tudjuk, hogy szintén protein denaturáló szer (lásd például a 161321/1984. számú japán közrebocsátási iratot). Ennélfogva várható, hogy bár meggátolható a polípeptid proteáz általi bomlása, mégis előfordul, hogy az előállítás eredménye denaturált protein lesz.

Kívánatos lenne tehát egy olyan tisztítási eljárás kidolgozása, amellyel 1) gamma interferont el lehet különíteni a gamma interferont termelő feltárt sejtek sejtmaradványaitól; 2) amellyel a gamma interferont nagy kitermeléssel, nagy tisztaság és aktivitás mellett el lehet választani a sejtszennyezésektől; 3) amellyel a rekombináns gamma interferont el lehet választani a sejtből származó szennyezésektől; és 4) amellyel lényegében az interferon degradáció nélkül választható el a sejtből származó szennyező anyagoktól. Az alábbiakban leírt tisztítási eljárás egy ilyen módszert foglal magába.

A jelen találmány szerinti hatékony tisztítási módszer egy lényegében tiszta, és a kívánt fiziológiai aktivitással rendelkező polipeptidet eredményez. E módszerre] meggátolható a polipeptid proteáz hatásra történő bomlása és elkerülhető a polipeptid denaturálódása. Ezenfelül, bár a jelen találmány a h-IFN-γ aktivitású polipeptid tisztítására vonatkozik, a jelen találmány szerinti módszer nemcsak a h-IFN—γ, hanem más olyan polipeptidek kivonására és tisztítására is felhasználható, amelyeknek proteáz bontásra érzékeny csopor tj aik vannak, mint az Arg-Lys és Ag-Arg és amelyeket rekombináns mikroorganizmusok termelnek.

A jelen találmány szerint úgy oldjukmeg a fent leírt problémákat, htjgy a kivonáá lépésbep egy vagy több cink- vagy réz-sót és poliétilén-iminí (PEI) adagolunk. Még részletesebben, a találmányban foglalt eljárás szerint a rekombináns mikroorganizmus sejt-tenyészetét egy olyan puffer oldatban szuszpendáljuk, amely egy vagy több cink- vagy réz-sót tartalmaz, a sejteket feltárjuk, majd PEI-t adunk a centrifugált felülúszóhoz, amelyet ezután megfelelő tisztítási eljárásnak vetünk alá.

Cink- vagy réz-só gyanánt számos vegyület használható, ezek közé tartozik a cink-klorid, cink-szulfát, cink-acetát, cink-acetil-acetonát és réz-szulfát, de a cink-klorid, cink-acetát és réz-szulfát a legelőnyösebb. A sókoncentrációk optimuma különböző a peptid termelő törzstől függően, de a cink sók esetében általában 0,5-5 mmól közt van, még előnyösebben 1-3 mmól között és a réz sók esetében

0,01-3 mmól között, még előnyösebben 0,251 mmól között.

Ezeket a sókat a fenti koncentrációkban bekeverjük egy puffer oldatba, a sejt tenyészetet a kapott oldatban szuszpendáljuk, majd a sejteket feltárjuk és centrifugálással kapjuk a felülúszót. A felülúszóhoz PEI-t adunk 0,5-1,1% végső koncentrációig. A PEI hozzáadására a szennyező proteinek tekintélyes része is kicsapódik. A PEI hozzáadása után a felülúszót állni hagyjuk alacsony hőmérsékleten, például 4 °C-on. Centrifugálás után a csapadékot eltávolítjuk, majd a kívánt anyagot szokványos módszerekkel tisztítjuk. A tisztítást könnyen elvégezhetjük, ha számos oszlop- és dializáló módszert kombinálunk. Bizonyos esetekben a kisózásos módszert is beiktathatjuk az eljárásba. A speciális kisózásos módszert is beiktathatjuk az eljárásba. A speciális kiviteli módot a példákban alább ismertetjük.

A jelen bejelentést megelőzően már közlésre került, hogy IFN-β termelésnél egy cink sót adnak a táptalajhoz a kitermelés növelése érdekében (146597/1984. számú japán közrebocsátási irat). Azonban a leírás szerint itt arra törekedtek, hogy a tenyésztés alatt a liter növekedjék és nincs arról szó, hogy az extrakciós lépésben a sót PEI-vel együtt adják, mint a jelen találmányban. A tisztítási eljárásnál réz vegyületnek a használatára vonatkozik például egy réz-kelát gyanta oszlop alkalmazása, amely a 167597/1984. számú japán közrebocsátási iratban szerepel, ámbár ez a találmány egy előzőleg tisztított EFN oldat tisztítási módszerére vonatkozott. A megelőző közlemények, mint a fent említett találmányok is, lényegükben különböznek a jelen találmánytól, amelyet az jellemez, hogy az extrakci45 ós lépésben szerepel a sók adagolása abból a célból, hogy a tisztítás ne okozza a protein denaturálódását vagy lebomlását. A jelen találmány egy másik tárgya egy h-IFN-γ aktivitású, alapjában véve tiszta polipeptid izolálása, amely a jelen találmány szerinti tisztítási és kivonási módszerrel állítható elő.

A W3110/pIN5T4 egyike a h-IFN—y aktivitású polipeptid termelésére képes törzseknek. Az E.coli W3110/pIN5T4 a 0234673. számú európai közrebocsátási iratban leírtak szerint az ATCC 27325. szá55 mon szereplő E. coli W3110-nek a pIN5T4 plazmiddal végzett transzformálásával állítható elő. A pIN5T4 plazmidot (amelyet a 0134673. számú európai közrebocsátási irat 7. ábrája mutat be) a pIN5G!F54 plazmidban egy ampicillin rezisztencia gén (ÁP¹) tetraciklin rezisztencia génnel (Te¹) való helyettesítésével állítják elő. A pIN56IF54 plazmid a pINI-A2 és a p61F54 plazmidokból pIN46IF54en keresztül állítható elő a 0134673. számú európai közrebocsátási irat szerint. A pINI-A2 FERM BP65 320 számon, a P6F54, amely lényegében azonos a

-3HU 201775 Β

P6F4 plazmiddal, FERM BP-282. számon lett letétbe helyezve 1983.07.18-án, illetve 1983.05.02-án a Budapesti Egyezmény szerint. A transzformált törzs az alábbi I képletű aminosavszekvenciával rendelkező GIF146 nevű polipeptidet termeli:

10 Cys Tyr Cys Gin Ysp Pro Tyr Val Lys Glu

Alá Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Alá

Gly His Ser Asp Val Alá Asp Asn Gly Thr

Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys

Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gin Ser

Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Lue Pha

Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser He Gin

Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met

Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys

100

Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn

110

Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg

120

Lys Als Ile His Glu Leu Ile Gin Val Met

130

Alá Glu Leu Ser Pro Alá Alá Lys Thr Gly

140

Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg

146

Gly Arg Arg Alá Ser Gin

A GIF 146-ot termelő törzs tehát egy olyan Escherichia coli W3110 törzs, amelyet a fenti képletű GIF146-ot kódoló DNS fragmentumot tartalmazó pIN5T4 plazmiddal transzformálunk. E vektor DNS szekvenciáját a II képlettel fejezzük ki:

TGC TAC TGC CAG GAC CCA TÁV GTG AAGGAA

ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTCCTT

GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC AACGCT

CGA CTT TTG GAC TTC TTT ATG AAG TTG CGA

GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC AAC GGTACT

CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG TTG CCATGA

CTG TTC CTG GGT ATC CTG AAA AAC TGGAAA

GAC AAG GAC CCA TAG GAC TTT TTG ACCTTT

GGA GGA TCT GAC CGT AAA ATC ATG CAG TCT

CTT CTT AGA CTG GCA TTT TAG TAC GTC AGA

CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAG CTG TTC

GTC TAG CCA AGA AAG ATB AAG TTC

GAC AAG

AAA AAC TTC AAG GAC GAC CAG TCT

ATC CAG

TTT TTG AAG TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC

AAA TCT GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAGATB

TTT AGA CAA CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC

AAC GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA

TTG CCA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT

AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT AAC

TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA TTG

TAC TCT GTT ACT GAC CTT AAT GTA CAG CGT

ATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT GTC GCA

AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC CAG GTT ATG

TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG GTC CAA TAC

GCT GAA CTG TCC CCG GCT GCT AAA ACT GGT

CGA CTT GAC AGG GGC CGA CGA TTT TGA CCA

AAG CGT AAA AGA TCT CAG ATG CTG TTC CGT

TTC GCA TTT TCT AGA GTC TAC GAC AAC GCA

GGT CGT CGT GCT TCT CAG TAA CCA GCA GCA CGA AGA GTC ATT

Másrészt a W3110/pIN5T4N143 törzset, amely h-IFN-^γ aktivitású polipeptid termelésére képes — a polipeptidet a III képlet szerinti aminosav szekvencia jellemzi — az alább leírt referencia példa szerint állítjuk elő. E polipeptid neve: GIF143.

í 10

Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Alá Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Alá Gly His Ser Asp Val Alá Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser

Asp Arg Lys Ile Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp

100

Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Ásn Val Gin Arg Lys Alá Ile His Glu Leu Ile Gin Val Met Alá Glu Leu Ser Pro Alá Alá Lys Thr Gly Lys Arg Lys

140

Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg

143

Alá Ser Gin β

Ebben az aminosav szekvenciában a Gin Gin

-4HU 201775 Β

Ί •vagy p-Gln lehet.

A GIF143 polipeptidet kódoló, következő DNS szekvenciájú DNS fragmentumot a kívánt plazmid vektor szerkesztésére lehet felhasználni:

GAG GAC CCA TAG GTG AAG GAA GCT GAAAAC

GTC CTG GGT ATG CAC TTC CTT CGA CTTTTG

CTG AAG AAA TAC TTC AAC GCT GGT CATTCT

GAC TTC TTT ATG AAG TTG CGA CCA GTAAGA

GAC GTT GCT GAC AAC GGT ACT CTG TTC CTG

CTG CAA CGA CTG TTG CCA TGA GAC AAG GAC

GGT ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAATCT

CCA TAG GAC TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA

GAC CGT AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT

AGA AAG ATG AAG TTC GAC AAG TTT TTG AAG

AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT GTT

TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA CAA

GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC GTTAAG

CTT TGA TAG TTC CTT CTG TAC TTG CAA TTC

TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA AAG CGT GAC

AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT TTC GCACTG

GAC TTC GAA AAG CTT ACT AAG TAC TCT GTT

CTG AAG CTT TTC GAA TGA TTG ATG AGA CAA

ACT GAC CTT AAT GTA CAG CGT AAA GCT ATC

TGA CTG GAA TTA CAT GTC GCA TTT CGA TAG

CAT GAA CTG ATC CAG GTT ATG GCT GAA CTG

CTA CTT GAC TAG GTC CAA TAC CGA CTT GAC

TCC CCG GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA

AGG GGC CGA CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT

AGA TCT CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT

TCT AGA GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA

GCT TCT CAG TAA

CGA AGA GTC ATT

Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat:

Az 1. ábra a pIN5T4N143 plazmid vektor szerkesztési sémáját ábrázolja. A vektorral Escherichia coli sejteket transzformálunk GIF143 termelése céljából, amelyet a jelen találmány szerint tisztítunk.

A 2. ábrán folyamat ábra látható, amely a gamma interferon tisztítási eljárásának a jelen találmány szerinti előnyös kiviteli módját mutatjuk be.

A 3. ábra szeintén folyamat ábra, amelyben ennek a tisztítási eljárásnak egy még előnyösebb megvalósítási módja szerepel és amely elsődlegesen a kromatográfiás tisztítási módszereket foglalja magába.

A 4. ábra a jelen találmánynak egy különösen előnyös kiviteli módját mutatja be folyamat ábrán keresztül.

Az 5. ábrán fénykép látható, amin egy SDS-PAGE protein sávjait látjuk. Ezt úgy kaptuk, hogy különböző koncentrációjú cink-kloridot tartalmazó puffer oldatban feltárjuk a W3110/pIN5T4N146 sejteket és a felülúszót SDS-PAGE vizsgálatnak vetjük alá.

A 6. ábra fénykép, amin egy SDS-PAGE protein sávjait mutatjuk be, itt a cink-klorid helyett rézszulfátot használtunk.

A 7. ábra fénykép, ezen egy SDS-PAGE protein sávjai láthatók, amelyeket úgy kaptunk, hogy különbözhő koncentrációjú cink-kloridot tartalmazó puffer oldatban feltárjuk a W3110/pIN5T4N143 sejteket és elvégezzük a felülúszó SDS-PAGE analízisét.

A termelés menetét az 1. ábra magyarázza. A pGIF54 plazmidot — amely lényegében megegyezik a 201995/1983. számú japán közrebocsátási iratban szereplő pGIF4 plazmiddal (FERM BP-282 — AatlI-vel és BglII-vel emésztjük és a kapott DNS fragmentumot a továbbiakban Avall-vel kezeljük, miáltal egy AcalI-BglII DNS fragmentumhoz jutunk, s ezt az 1. ábrán bemutatjuk. Ezután a kívánt pIN5T4N143 plazmidot úgy kapjuk meg, hogy DNS ligáz jelenlétében az

5’-AATTCATGCAG-3’

3’-GTACGTCCTG-5’ képletű szintetikus dns linkért beépítjük a fenti AvalI-BglII fragmentum Avall helye és egy hosszabb, tetraciklin rezisztencia gént (Te¹) hordozó DNS fragmentum EcoRI helye közé. (Ez utóbbi fragmentumot úgy kapjuk, hogy a pIN5T4 plazmidot, amely a 0.143.673. számú európai közrebocsátási iratban szerepel, BglII-vel és EcoRI-vel kezeljük). A keletkező plazmid egy olyan gént tartalmaz, ami a GIF143 polipeptidet kódolja. Ez apolipeptid olyan, mint a GIF146, azonban N-terminális részéről 3 aminosav csoportot, a Cys-Tyr-Cys csoportot eltávolítottunk. Ezután E. coli W3110 sejteket transzformálunk a plazmiddal hagyományos mó5

-5HU 201775 Β dón, s így egy GIF-termelő, transzformált Escherichia coU törzset kapunk, jele W3110/pIN5T4N143.

A tisztítási eljárás minden ábrán úgy kezdődik, hogy eltávolítjuk a nukleinsavakat a homogenizált, gamma interferont tartalmazó sejtek centrifugálás után kapott felülúszójából. A megelőző lépéseket az érthetőség kedvéért mutatjuk be, de ezek nem tartoznak a találmány oltalmi körébe.

Bár a példákban leírt tisztítási eljárásban cinkklorid szerepel cink sóként, azonban a találmány nem korlátozódik ennek a sónak a használatára. Más cink sók, mint a cink-szulfát és cink-acetát és réz sók, mint például a réz-szulfát, szintén előnyösen használhatók. Az I. táblázatban a különböző fémsó vegyületek proteáz gátló hatását mutatjuk be. A hatást úgy vizsgáljuk, hogy a rekombináns baktériumsejteket 1 mmól vagy 0,2 mmól illető fémvegyületet tartalmazó puffer oldatban feltárjuk és a hatás indikátoraként a felülúszó folyadékban lévő h-INF-γ aktivitású polipeptid stabilitását mérjük. Mint ahogy az I. táblázatból kitűnik, azt találtuk, hogy a cink-szulfát, cink-acetát, cink-acetil-acetonát és a réz-szulfát ugyanolyan hatást eredményez, mint a cink-klorid.

I. táblázat

Proteázos bomlást gátló hatás vizsgálata polipeptiden Zn, Cu és más fémsók hozzáadása után

Fém só Bomlást gátló hatás polipeptiden

	1 mmól	0,2 mmól
Fém só nélkül
Cink-klorid	+	—
Cink-szulfát	+	—
Cink-acetát	+	—
Cink-acetil-acetonát	+
Cink-szalicilát	±	-
Réz-szulfát	+ +	+
Vas-szulfát	—	—
Kobalt-klorid	—
Ammónium-molibdát		-
⁺bomlást gátló hatása van “nincs bomlást gátló hatása

Az 5. ábra (foto) egy SDS-PAGE képet ábrázol, amely a h-INF-γ aktivitású polipeptid stabilitását mutatja be (a protein sávot a GIF146-tal jelzett nyű mutatja). A vizsgálandó mintákat úgy készítjük, hogy a sejteket különböző koncentrációjú cink-kloridot tartalmazó megfelelő pufferben roncsoljuk. Az 5. ábrából látható, hogy a h-INF-γ aktivitású polipeptid 0,5-2 mmól cink-klorid jelenlétében stabil, ennél alacsonyabb koncentráció mellett, vagy cink-klorid nélkül, hajlamos a bomlásra. A „B” nyíllal jelölt protein sáv a GIF146 tisztítása során a proteázos bomlást szenvedett polipeptidet mutatja. A 2-1 jelű mintát a fent leírt módon készítettük 2 mmól cink-kloriddal és ezután tisztítottuk. A 2-2 jelű mintánál cink-kloridos kezelést nem végeztünk, csak tisztítottunk. Egy hasonló kísérlet eredményeit, amelyben a cink-klorid helyett réz-szulfá6 tót használtunk, a 6. ábrán mutatunk be (foto). Ebben az esetben a kívánt eredményeket a 0,14 mmól közti koncentrációknál kaptuk. Bár ezek a sók a nagyobb koncentrációknál adják a megfelelő proteáz gátlást, mégis előnyösebb olyan alacsony koncentrációban használni e sókat, amennyire csak lehetséges, mivel a tisztítás során el kell ezeket távolítani. Előnyös, ha a cink-kloridot 1-3 mmól koncentráció határok közt és a réz-szulfátot 0,261 mmól közt használjuk.

A 7. ábrához (foto) a minta ugyanúgy készült, ahogy az 5. ábrához, de GIF143-termelő baktériumok kezelésével. Az ábrán a GIF143 feliratú nyíllal jelölt protein sáv a h-INF-γ aktivitású polipeptidet mutatja és „E” egy olyan polipeptidet ábrázol, amely a GIF143 részleges proteázos bomlásakor keletkezett.

A roncsolt sejt/gamma interferon keverékben lévő szennyezések közül legfontosabbak a kisméretű részecskék és a vízoldható frakciók, ilyenek a nukleinsavak, proteázok, sejtfehérjék, szénhidrátok, lipidek, lehasadt interferon fragmentumok, interferon aggregátumok és más olyan fragmentumok, amelyek az interferon termelő sejtek felbomlása következtében keletkeznek. Kidolgoztuk azt a módszert, amivel a gamma interferont elő lehet állítani nagy tisztaságban, biológiai aktivitásának megtartása mellett és jó kitermeléssel. Eszerint az interferon tartalmú keverék feldolgozását az alant leírt speciális sorrendben végezzük annak érdekében, hogy az interferon degradációja minimálisra csökkenjen és az interferon tartalmú keverékből a szennyezések eltávolítását meghatározott rendben végezzük el.

Lényegesen nagyobb tisztaságot és aktivitást kapunk, ha az interferont tartalmazó keverékből a szennyezéseket a következő sorrendben távolítjuk el:

1) nukleinsavak;

2) negatív töltésű proteázok és szennyezett sejt proteinek;

3) pozitív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek;

4) hasadt és aggregálódott interferon.

A lépéseknek ez a sorrendje meghatározó abból a szempontból, hogy a találmány által megkívánt eredményeket kapjuk meg. Amennyiben a felsorolt szennyezéseket a meghatározott sorrendben távolítjuk el, kiegészítő lépéseket is használhatunk a többi szennyező anyag—például a nagy molekulatömegű hidrofób anyagok—eltávolítására, ha ilyenek jelen lennének. Ezeket az anyagokat a 3. vagy a 4. lépés után kényelmesen eltávolíthatjuk.

Számtalan módszer ismert ezen a szakterületen, amelyekkel minden egyes ilyen elválasztást el lehet végezni. Ahogy fent megállapítottuk, azok a módszerek a legmegfelelőbbek, amelyekkel az interferon degradációjának minimálisra való csökkentése érdekében a legkíméletesebben lehet az elválasztásokat keresztülvinni.

Úgy találtuk, hogy igen kedvező módszer, ha egy kezdeti kicsapást végzünk polietilén-iminnel, amelyet a szennyezések eltávolítása céljából, számos kromatográfiás elválasztási módszer követ, a fent meghatározott sorrendben. A kromatográfiás elvá-6HU 201775 Β lasztásoknál alkalmazott gyanták és használatuk sorrendje a következő:

1) anioncserélő gyanta;

2) kationcserélő gyanta;

3) molekula szita.

A kromatográfiás elválasztásokon felül a következő eljárások alkalmazása hasznos: kicsapás, szűrés, koncentrálás és dializálás.

Egyik előnyös eljárásban a gamma interferont tartalmazó keveréket az alábbi kezeléseknek vetjük alá:

1) nukleinsav eltávolítás polietilén-iminnel való kicsapással;

2) a negatív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása gyengén bázisos anioncserélő gyanta használatával;

3) a pozitív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása gyengén savas kationcserélő gyantával;

4) a hasadt és aggregálódott interferon és a sejt fragmentumok eltávolítása molekula szita segítségével.

Hasznos kiegészítő eljárások: szűrés minden lépés után, a 3. és/vagy 4. lépés után koncentrálás, az 5. lépés után dialízis.

Ezzel az új eljárással rendszeresen termelünk legalább 95% tisztaságú gamma interferont 5%-ot meghaladó kitermeléssel.

A jelen találmánynak egyik fontos sajátossága az új tisztítási séma, amely minden esetben használható gamma interferonra, a számos módszer közül bármelyikkel is volt előállítva, akár szövet tenyészetben szaporított humán sejtekből, akár vérmintákból gyűjtött leukocitákból, akár az ezen a szakterületen jól ismert klónozási módszerekkel. A tisztítási séma különösen az E. coli sejtekből nyert rekombináns gamma interferon tisztítására alkalmas. A sejteket a standard módszerek egyikével inaktiváljuk, ilyen a kémiai elölés módszere, például klór-hexidin-glukonáttal. Az inaktivált sejteket lecentrifugáljuk, pufferben reszuszpendáljuk és homogenizáljuk. A gamma interferon tartalmú sejtek homogenizálására alkalmas módszer a nagy nyíróerővel való feltárás Manton-Gaulin homogenizátorban. Az elroncsolt sejtek komponenseit centrifugálással csapadékra és felülúszóra különítjük el. Az itt kapott felülúszó megfelelő forrása az interferonnak, ahonnan a jelen találmány szerint izoláljuk és tisztítjuk.

A lizált sejt szuszpenzió proteineket, lipideket, szénhidrátokat, nukleinsavakat és oldhatatlan sejt törmelékeket tartalmaz. Szokásos eljárásokkal a sejt vízben oldhatatlan alkotórészeit a sejt vízben oldódó frakcióitól elkülönítjük, ezek a felülúszóban maradnak.

Néha előnyös, ha a gamma interferonnak a sejtekből való kivonása előtt bizonyos előzetes feldolgozási lépéseket alkalmazunk, például olyan módszereket, amelyek csökkentik az interferon degradálódását az eljárás folyamán. Bármilyen ilyen előzetes eljárás alkalmazható, feltéve, ha ezek nem zavarják az itt leírt tisztítási sémát.

A soklépéses tisztítási sémával a tiszta interferont nagyobb kitermeléssel állítjuk elő, biológiai aktivitásának megtartása mellett. Az elválasztási lépések szekvenciája nagyon lényeges és meghatározó abból a szempontból, hogy a találmány szerint kívánt eredményeket elérhessük.

Az interferont tartalmazó keverékből a következő sorrendben távolítjuk el a szennyezéseket:

a) nukleinsavak eltávolítása;

b) a negatív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása;

c) a pozitív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása;

d) a kis és nagy molekulatömegű szennyező anyagok, az interferon törmelékek és interferon aggregátumok eltávolítása.

Jelenleg nem ismerjük az okát, de a szennyező anyagoknak a megállapított sorrendben való eltávolítása határozza meg, hogy nagy kitermelést érjünk el a tisztított gamma interferonnál amellett, hogy biológiai aktivitását is megőrzi. A különböző típusú szennyező anyagok eltávolítására használt egyedi lépések rutin módszerek és a szakterületen ismertek. Mivel durva feldolgozási körülmények között a gamma interferon hajlamos inaktív formákká való átalakulásra, egyrészt a molekula hasadása, másrészt aggregálódása következtében, azok a tisztítási lépések az előnyösek, amelyeket kíméletes feldolgozási módszerekkel lehet végrehajtani.

A találmányban ezenkívül olyan specifikus feldolgozási lépéseket és körülményeket is leírtunk, amelyekről azt találtuk, hogy minimálisra csökkentik az interferon degradációját, azonban el kell ismerjük, hogy más hagyományos feldolgozási lépésekkel is lehet helyettesíteni a találmányban említetteket, feltéve, ha a szennyezések eltávolításának sorrendje ugyanaz marad, ahogy leírtuk.

Ha az ezután következő leírásban másként nem állítjuk, az adott pH-értékektől való eltérés általában ±0,5 lehet, előnyösebb a ± 0,25, de legelőnyösebb a ± 0,1 eltérés. A vezetőképesség méréseknél az eltérés általában ± 5 mS lehet, de előnyösebb, ha a ±3 mS tartományban marad. A műveleteket 215 °C hőmérsékleti tartományban végezzük.

A feldolgozási séma első lépése a nukleinsavak eltávolítását foglalja magába. Az eltávolítást úgy lehet könnyen keresztülvinni, hogy a lizált sejtek keverékének centrifugálás után kapott felülúszójához polietilén-imint adunk. Egy másik megoldás szerint a polietilén-imin oldatot, ha kívánt, a homogenizálás előtt is hozzá lehet adni a sejtekhez. A polietilén-imint lassan, keverés közben adagoljuk, legfeljebb 0,8% maximális koncentrációig. Ezután a keveréket megfelelő ideig, általában 30-90 percig ülepedni hagyjuk. A keveréket ezután lecentrifugáljuk és a felülúszót felfogjuk. Kiváló eredményeket kapunk, ha a polietilén-imint 10%-os (térf/térf.) vizes oldatként adagoljuk és ez a koncentráció elég ahhoz, hogy a polietilén-imin tartalmú oldat végső koncentrációja körülbelül 0,7-0,8%-os (térf/térf.) legyen. Az oldat pH-ja 8®0,5, előnyösen ±0,1 és a hőmérsékletet 2-15 ’C között tartjuk. Ennél a lépésnél meghatározzuk a felülúszó protein koncentrációját a standard coomassie blue módszerrel és az előállítás minden további szakaszánál ugyanígy járunk el.

Egy másik eljárás a nukleinsav eltávolítására hidroxilapatiton vagy immobilizált PEI-n való kro7

-7HU 201775 Β matografálást alkalmaz. Egy további hasznos eljárás a protamin-szulfátos kicsapás.

A nukleinsavak eltávolítása után a gamma interferont tartalmazó keveréket az első proteáz eltávolítás! lépésnek vetjük alá. A legegyszerűbb módja a proteázok eltávolításának, ha a nukleinsav eltávolítást lépésből származó felülüszót anioncserélő gyantán kromatografáljuk. Kvaterner amino-etil, vagyes amin vagy más intermedier bázisos gyanta vagy gyengén bázisos gyanta, mint a p-amino-benzil-cellulóz különösen jól használható.

A kvaterner amino-etil gyanta igen alkalmas anioncserélő. A kvaterner amino-etil csoportot hozzá lehet kapcsolni térhálós dextrán, cellulóz, agaróz vagy akril hordozóhoz. A felülúszó folyadék pH-ját

8,7 ±0,5, előnyösen ±0,1 értékre állítjuk be nátrium-hidroxiddal vagy valamilyen más alkalmas bázissal. Az oldat vezetőképességét úgy állítjuk be ionmentes víz hozzáadásával, hogy 10 mS alatt, előnyösen 4-8 mS tartományban legyen.

A kioldó puffer 20 mmól nátrium-4-(2-hidroxietil)-l-piperazin-propán-szulfonátot és 0,1% (térf/térf.) 2-merkapto-etanolt tartalmaz. A puffer pH-ját körülbelüól 8,7-re állítjuk be nátrium-hidroxiddal vagy más bázissal. Más alkalmas pufferekkel — ugyanezen pH tartományban — is helyettesíthetjük a piperazin-puffert és más antioxidánst is használhatunk a 2-merkapto-etanol helyett.

A kvaterner amino-etil-oszlopot a puffer oldattal először kiegyensúlyozzuk, rávisszük a gamma interferon tartalmú oldatot és az adszorbeált anyagot ugyanezen pufferrel oldjuk le. A leoltott protein oldat első kétharmadát, azaz az eluátum első kétharmad térfogatrészét egyesítjük és ezt visszük át a következő tisztítási lépésbe. Az eluátum visszamaradt egyharmadát újra kromatografálhatjuk ugyanazon — hasonló módon kiegyensúlyozott — oszlopon. Az átfolyt protein oldat első kétharmadát újra egyesítjük. A visszamaradt oldatot újra feldolgozhatjuk azonos módon. Mint előbb, a protein koncentráció meghatározását Coomassie blue módszerrel végezzük el.

Egy tetszés szerinti koncentrálási lépést vezethetünk be a tisztítás e pontjánál. Egyik egyszerű módja az oldat koncentrálásának az ammónium-szulfátos kicsapás. A kvaterner amino-etil oszlop eluátumát egy 0,2 μ-os szűrőn átszűrjük és keverés közben, 5-10 perc alatt ammónium-szulfátot adunk hozzá 40-60% telítésig. A szuszpenziót több órán át állni hagyjuk jégfürdőben. A csapadékot ezután centrifugálással gyűjtjük össze, amelyet körülbelül -20 °C-on tárolhatunk, amíg a további feldolgozásnál szükség lesz rá.

Amikor szükséges, a csapadékot feloldjuk 20 mmól trisz.HCl és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú oldatban — körülbelül 7,5 pH mellett — amelyet előzőleg átszűrtünk olyan szűrőn, amelynek kizárási molekulatömege 10.000. Az oldat vezetőképességét körülbelül 3-5 mS-re csökkentjük azáltal, hogy hozzáadunk 10 mmól trisz.HCl és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú oldatot (az oldat pH-ja körülbelül 7,5). Az oldatot 0,2 μ-os szűrőn átszűrjük és ezzel készen áll a további feldolgozásra. Más pufferek is alkalmasak arra, hogy ugyanezen pH tartományban helyettesítsék a trisz.HCl-t és a merkapto-etanol helyett is használhatunk más antioxidánst.

Az oldatban lévő pozitív töltésű proteázokat és más proteineket az eljárás következő lépésében távolítjuk el, s ezt legegyszerűbben kationcserélő gyantával végezhetjük el.

Kiváló eredményeket kaptunk karboxi-metil kationcserélő gyantával (a karboxi-metil csoport térhálós dextránhoz, cellulózhoz, agarózhoz vagy akril hordozóhoz van kapcsolva). Az előző lépésből származó oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be sósavval vagy más alkalmas savval. Az oldathoz 2-merkaptoetanolt vagy más megfelelő antioxidánst adunk körülbelül 0,1%-os (térf/térf) koncentrációban. Ugyancsak hozzáadunk 0,1% (térf/térf) 2-merkapto-etanol tartalmú ionmentes vizet, hogy vezetőképességét 20 mS alá vigyük, lehetőleg 3-5 mS közé. Az oldatot 0,2 μβ-οβ szűrőn átszűrjük és így készítjük elő a kromatografáláshoz.

A kationcserélő gyantával töltött oszlopot megfelelő pufferrel, például 20 mmól trisz.HCl-t és 0,1% 2-merkapto-etanolt tartalmazó oldattal (pH = 7,5) egyensúlyozzuk ki. Az oszlop kiegyensúlyozása úgy történik, hogy két-háromszor mossuk a kiegyensúlyozó pufferrel és ezután visszük rá a gamma interferon tartalmú oldatot. Az oldat elucióját 13-15 oszlop-térfogatnak megfelelő kiegyensúlyozó pufferben oldott nátrium-klorid grádienssel végezzük. A pufferben a nátrium-klorid tartalom O-tól maximum 0,5 mólig nő.

A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, gél-elektroforézissel (SDS-PAGE) és analitikai HPLC-vel vizsgáljuk, majd megmérjük vírus ellenes aktivitását. A legtisztább frakciókat elegyítjük és ezt használjuk a további feldolgozásnál. Az alacsony tisztaságú interferon tartalmú frakciókat kicsaphatjuk ammónium-szulfáttal, 40-60% telítéssel. A csapadékot visszaoldjuk, szűrjük és karboxi-metil oszlopon kromatografáljuk úgy, ahogy az előzőekben leírtuk.

Az újbóli kromatografálásnál gyűjtött frakciók analízise után a legtisztább frakciókat egyesítjük a karboxi-metil oszlopról először eluált frakciókkal.

Ha SDS-PAGE vagy más alkalmas módszer révén nagy molekulatömegű hidrofób szennyező anyagok jelenlétét észleljük a tisztítási eljárásnak ebben a szakaszában, az eluátumból az adott esetnek megfelelő kromatográfiás eljárással távolítjuk el az ilyen szennyezéseket. Úgy találtuk, hogy a fenil gyanta szolgáltat kielégítő eredményeket. Oktil és butil gyanták szintén használhatók. Az előző feldolgozási lépésben kapott oldatot 0,2 μ-os szűrőn megszűrjük és nátrium-kloridot (0,5-0,75 mól) adunk a szűrlethez, hogy vezetőképességét körülbelül 50-75 mS-re növeljük.

A puffer oldat 20 mmól trisz.HCl-t, 0,1% (térf/térf.), 2-merkapto-etanolt és 500-850 mmól, előnyösen 500-700 mmól nátrium-kloridot vagy más sót tartalmaz, hogy vezetőképessége a megfelelő tartományban legyen.

Az oszlopot előzőleg kiegyensúlyozzuk a pufferrel, majd rávisszük a szűrletet. Körülbelül 2-4 oszloptérfogatnak megfelelő puffer oldatot adunk az oszlopra. Az adszorbeálódott anyagot ezután 510 oszlop töltetnek megfelelő mennyiségű olyan ol-8HU 201775 Β dattal eluáljuk, amely 20 mmól trisz.HCl-t, 100 mmól nátrium-kloridot és 0,1% (térf/térf.) 2merkapto-etanolt tartalmaz, s pH-ja körülbelül 7,5. Megfelelő térfogatú frakciókat szedtünk, amelyeknek vizsgálatát SDS-PAGE és analitikai HPLC alkalmazásával végezzük el és meghatározzuk e frakciók vírus ellenes aktivitását. A legtisztább frakciókat egyesítjük.

Általában helyes, ha a fenilgyanta oszlopon történő kromatográfia után kapott interferon tartalmú oldatot koncentráljuk. Általában az is kívánatos, ha az interferon tartalmú oldatot ebben a lépésben akkor koncentráljuk, amikor még nem végeztük el a kiegészítő hidrofób oszlopos kromatografálást.

Az oldat protein koncentrációját Coomassie blue módszerrel határozzuk meg. Ha a protein koncentráció 0,2 mg/ml-nél alacsonyabb, előnyös, ha az oldatot ultraszűréssel—a membrán kizárási mole1 kulatömege 10.000 — bekoncentráljuk.

További koncentrálást úgy érünk el, ha az oldathoz ammónium-szulfátot adunk 40-60% telítésig, miközben 5-10 percig keverjük az oldatot. A szuszpenziót jégfürdőben állni hagyjuk és ezután a centrifugálással gyűjtjük össze a csapadékot. A csapadékot 20 mmól trisz.HCl, 500 mmól nátrium-klorid és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú oldatban — pH körülbelül 7,5 — oldjuk fel, amelyet előzőleg olyan szűrőn szűrünk át, amelynek kizárási molekulatömege 10.000. A koncentrált oldatot 0,2 μ-os szűrőn szűrjük, előkészítvén a következő tisztítási lépéshez.

A kis és nagy molekulatömegű szennyező anyagokat, a hasadt és aggregálódott gamma interferont egy véső kromatográfiás tisztítási lépésben távolítjuk el oly módon, hogy az előző feldolgozási lépésnél kapott gamma interferon tartalmú oldatot gélszűrőre visszük. A hidrofil gélszűrő úgy viselkedik, mint molekula-szita, amely elkülöníti a megfelelő méretű frakciókat az oldatban lévő nagyobb és kisebb molekulatömegű szennyező anyagoktól. Különösen előnyösen alkalmazható a térhálós dextrán alapú gél, amelynek márka jele Sephadex G-100, gyártja a Pharmacia Fine Chemicals. A gyanta 4.000-150.000 molekulasúly tartományban frakcionálja a globuláris proteineket és peptideket és 1.000-100.000 molekulatömeg tartományban a poliszacharidokat. Más olyan gyanták is használhatók, amelyeknek kizárási molekulatömege proteinekre 1.000-200.000 tartományban van.

A Sephadex G-100 oszlopot 20 mmól trisz.HCl, 500 mmól nátrium-klorid és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú puffer oldattal (pH körülbelül 7,5) egyensúlyozzuk ki. Az adszorbeált anyagot a pufferrel eluáljuk és megfelelő frakciószedést alkalmazunk. Minden frakcióban meghatározzuk a protein koncentrációt Coomassie blue módszerrel. A frakciókat SDS-PAGE és antivirális aktivitásuk alapján egyesítjük.

Egy másik módszer szerint az ammónium-szulfátos koncentrálási lépésnél kapott csapadékot feloldhatjuk egy 20 mmól nátrium-foszfátot, 500 mmól nátrium-kloridot és 0,1% (térfTérf.) 2-merkaptoetanolt tartalmazó puffer oldatban (pH körülbelül 7,5). A gamma interferon tartalmú oldatot felvisszük Sephacryl S-200 géllel töltött oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezen pufferrel kiegyensúlyoztunk (a Sephacryl S-200 — a Pharmacia Fine Chemicals márkaje'e — egy olyan agaróz gyanta, amelyet akrilamidd;J térhálósítottak). A végső termék egy tiszta, legfeljebb enyhén zavaros oldat, amely színtelen vagy legfeljebb kissé sárgás színű. A termék molekulatömege 17.000-19.500, SDSPAGE-el meghatározva.

A tisztított gamma interferont felhasználás előtt pufferrel szemben dializáljuk. Az alkalmas puffer 20 mmól nátrium-foszfátot, 6 mmól L-ciszteint tartalmaz, pH-ja körülbelül 6,8. Egy másik megfelelő puffer 15 mmól nátrium-foszfátot, 8 mmól nátriumcitrátot és 6 mmól L-ciszteint tartalmaz, pH-ja 5,0. Előnyös, ha a dialízist 8 órán át vagy ennél tovább folytatjuk, közben állandóan nitrogént áramoltatunk át a rendszeren, hoy minimálisra csökkentsük az oxidálást.

Ha szükséges, a tisztított gamma interferon oldatot a fent leírt módon koncentrálhatjuk.

A jelen találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül azonban, hogy a találmány oltalmi körét e példákra korlátoznánk.

Referencia példa

A GIF143 kifejező vektor szerkesztése

A GIF143 expressziós vektort az alábbi eljárással állítjuk elő.

A pGIF54 plazmidot (ez a plazmid egyenlő a pGIF4-gyeI, amely a GIF14ó-ot kódoló gént hordozza) a WA802/pGIF54 transzformált dcm Esherichia coli törzsből (a törzs nem metilezi a citozint) állítjuk elő hagyományos módszerrel. A pGIF54 5 μg-ját 20 egység AatlI-vel és 20 egység BglII-vel kezeljük és így egy 600 bp (bázis pár) hosszú DNS fragmentumhoz jutunk, amely a GIF146 gén egy részét és a lacUV5 promotert tartalmazza. Ezután a DNS fragmentum 0,5 μg-ját 5 egység Avall-vel hasítjuk, s ekkor egy 400 bp hosszú fragmentumot kapunk, amely a GIF146 gén egy részét hordozza. Másrészt, 5 pg pIN5T4-et emésztünk 20 egység EcoRI-vel és 20 egység BglII-vel, s a kapott DNS fragmentum tetraciklin rezisztencia gént, lpp promotert és a replikáció kezdőpontját tartalmazza. A két DNS fragmentumot és az 1. ábrán szereplő kémiai úton szintetizált linkerből 0,5 μg-ot (a szintetizálást egy DNS szintetizátorral végezzük; Applied Biosystems 380A) ligáz reakcióval kapcsoljuk össze, s ekkor kapjuk a pIN5T4N143-at, amellyel W3110 sejteket transzformálunk a szokásos módon — például egy ilyen módszert tartalmaz a 63395/1983. számú japán közrebocsátási irat — s ekkor jutunk a W3110/pIN5T4N143 sejtekhez.

A következő eljárással bizonyítjuk, hogy a kapott transzformált törzs GIF143 termelő törzs.

A W3110/pIN5T4N143 sejteket rázott tenyészetben tenyésztjük 1,5 ml táptalajban, 16,5 mm-es kémcsőben 30 °CX-on (ODőoo = 8). A táptalaj 3% polipeptont, 2% élesztő kivonatot, 2% glükózt, 0,5% KH₂PO4-et, 0,010% MgSO₄ . 7H₂O-t és 20 μg/ml tetraciklint tartalmaz. A tenyészetből 0,5 ml-t átviszünk egy 1,5 ml-es Eppendorf csőbe és lecentrifugáljuk a sejteket (5 perc; 10.000 ford/perc). A sejt-üledéket 1 mg/ml lizozim és 1 mmól EDTA tartalmú 0,5 ml PBS-ben (0,8% NaCl,

-9HU 201775 Β

0,02% KC1, 0,115% Na₂HPO4, 0,02% NaHfePCU) szuszpendáljuk. A reagáltatást 0 °C-on 30 percig végezzük. A sejteket ezután háromszor ismételt fagyasztással-olvasztással tárjuk fel. Ezután 10 percig centrifugálunk 10.000 ford/perc mellett. A kapott felülúszó vírus ellenes aktivitását a 201995/1983. számú japán közrebocsátási iratban foglaltak szerint határozzuk meg. Az eredmény 6.10⁴ egység/ml anti-vírus aktivitás volt. Emellett, az előbbiekkel azonos módon gyűjtött sejteket 200 μΐ SDS reagens oldatban (10 mmólos foszfát puffer /pH= 7,2/, amely 7 mól karbamidot, 1% SDS-t, 1% 2-merkaptoetanolt tartalmaz) oldjuk fel, majd az oldatot forró vízfürdőben hevítjük 10 percen át. SDS-PAGE (13%-os) segítségével 20 μΐ anyagot izoláltunk, amelynek protein tartalmát Coomassie blue R250-nel festettük meg. Megállapítottuk, hogy a termék a GIF143 proteinnek felel meg (molekulatömege körülbelül 18 kd). A kitermelés az Escherichia coli össz-proteinjének mintegy 20%-át tette ki.

1. példa

A GIF146 kivonása és tisztítása A W3110/pIN5T4 elnevezésű GIF146 termelő törzset levegőztetett, rázott tenyészetben tenyésztjük 24 órán át. A táptalaj 3% polipeptont, 2% élesztő kivonatot, 2% glükózt, 0,5% KH2PO4-et, 0,01% MgSO4.7H2O-t és 20 pg/ml tetraciklint tartalmaz. A tenyészetben lévő sejteket klórhexidinglukonáttal elöljük és lecentrifugáljuk (10 perc; 8.000 ford/perc). A W3110/pIN5T4 sejtek nedves súlya 800 g. A sejteket 5,1 liter hűtött, 1 mmól ZnCh tartalmú 20 mmólos trisz.HCl pufferben (pH=7,4; a következőkben „THB” rövidítést használunk) szuszpendáljuk. A szuszpenziót M15 homogenizátorban (gyártja Manton-Gaulin Co., Ltd.) roncsoljuk, jéggel lehűtjük és ezután centrifugáljuk (20 perc; 7.000 ford/perc). A kapott felülúszóhoz annyi 15%-os polietilén-imint (vizes oldat; a következőkben „PEI” rövidítést használunk) adunk — amelynek pH-ját 8,0-ra állítottuk be sósavval—hogy véső koncentrációja 0,75% legyen. A kapott oldatot 10 percig keverjük, majd állni hagyjuk 4 °C-on 2 óra hosszat. A keletkezett csapadékot centrifugálással (20 perc; 7.000 ford/perc) távolítjuk el. A kapott felülúszó 4,7 liter. A felülúszót egy 20 mmólos N-2hidroxi-etil-piperazinil-N’-3-propán-szulfonát pufferrel (pH= 8,6; EPPS puffer) kiegyensúlyozott QAE Sephadex A-25 (gyártja Pharmacia Co., Ltd.) oszlopra visszük fel, majd a kapott nem-abszorbeált frakciót 0,1% 2-merkapto-etanol (”2ME”) tartalmú 20 mmólos THB-vel (pH= 7,4) kiegyensúlyozott CM Sepharose CL6B (gyártja Pharmacia Co., Ltd.) oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopra abszorbeálódott aktív frakciót lineáris nátrium-klorid koncentráció grádienssel (0-0,5 mól) eluáljuk. A magas interferon aktivitású frakciókat összegyűjtjük. Az interferon aktivitást a 201995/1983. számú japán közrebocsátási irat szerint határozzuk meg. E frakcióhoz ammóniumszulfátot adunk 50% telítésig. A kisózás után centrifugáláj következik 20 percig, 7.000 ford/perc mellett. A kapott csapadékot 20 mmólos nátrium-foszfát pufferben (pH = 7,4; a következőkben „20 mM

PBS rövidítést használunk) oldjuk fel. A puffer 0,3 mmól NaCl-t és 0,1% 2-Me-t tartalmaz. Az oldatot ugyanezen pufferrel kiegyensúlyozott Sephacryl S-200 (gyártja Pharmacia Co., Ltd.) oszlopon kromatografáljuk. Az eljárással 298 mg GIF146 polipeptidet kaptunk, mint végső tisztított terméket (az interferon specifikus aktivitása: 1,61.7.10⁶ egység/mg). A polipeptid SDS-PAGE analízis szerint az anyag 99%-osnál nagyobb tisztaságú és ugyanezen SDS-PAGE vizsgálatban a sáv helyzete ugyanolyan volt, mint a bomlatlan GIF146 polipeptidé. Ezenfelül aminosav analízissel megállapítottuk, hogy a kapott polipeptid aminosav szekvenciája megegyezik az I képlet szerinti aminosav szekvenciával. Ez mutatja a jelen találmány szerinti tisztítási módszer eredményességét.

Ha az előbbiekben leírt tisztítási eljárásban használt Sephacryl S-200 helyett Sephadex G-100at (gyártja: Pharmacia Co., Ltd.) használunk, hasonló eredményeket kapunk.

2. példa

A GIF143 kivonása és tisztítása

W3110/pIN5T4N143 sejteket (lásd a referencia példát) tenyésztünk ugyanúgy, ahogy azt az 1. példában leírtuk. A sejteket Idórhexidin-glukonáttal elöljük és összegyűjtjük. A nedves sejt-tömeget (300 g) 2,1 liter 3 mmól ZnCl₂ tartalmú 20 mM THB (pH = 7,4) oldatban szuszpendáljuk, homogenizátorban roncsoljuk, majd centrifugáljuk (20 perc; 7000 fordulat/perc). A kapott felülúszót PEI-vel kezeljük, ugyanúgy, ahogy az 1. példában, s így 1.000 ml felülúszóhoz jutunk. A folyadékot 0,1% 2-ME tartalmú 20 mM THB-vel (pH= 7,4) kiegyensúlyozott CM Sepharose CL6B oszlopra adszorbeáljuk, majd lineáris nátrium-klorid koncentráció grádienssel, 0,1-0,8 mól közt végezzük a leoldást. Az aktív frakciót az eredeti térfogat tízszeresére hígítjuk 0,1% 2-ME tartalmú 20 mM THB-vel, az oldatot ugyanezen pufferrel kiegyensúlyozott CM Toyopearl (gyártja Toyo Soda Co., Ltd.) oszlopra abszorbeáljuk, majd 0,1-0,8 mól tartományban lineáris nátrium-klorid koncentráció grádienssel eluáljuk. Az interferon aktivitású frakciókat egyesítjük, hozzáadunk ammónium-szulfátot 20% telítésig, majd Butyl Toyopearl (gyártja Toyo Soda Co., Ltd.) oszlopon folytatjuk át. Az oszlopon átfolyó frakciókat leszedjük és desztillált vízzel szemben dializáljuk. Végső termék gyanánt 396 mg proteint kapunk (az interferon specifikus aktivitása:

4.8.10⁶ egység/mg protein).

Aminosav analízis és SDS-PAGE eredményeként — miként az 1. példában — azt találtuk, hogy a kapott polipeptid (GIF143) 99%-osnál nagyobb tisztaságú és aminosav szekvenciája megegyezik a fenti III képlet szerinti aminosav szekvenciával. Ezenkívül az extrakciós lépés folyamán hozzáadott cink vegyületet még atomabszorpciós spektrofotometriával sem lehetett kimutatni.

3. példa

I. Sejt termelés, protein elválasztás és kicsapás polietiléniminnel

Rekombináns gamma interferont tartalmazó inaktivált E.coli (W3110/pIN5T4) sejteket centrifu-10HU 201775 Β gálással gyűjtjük össze. A sejteket 1 mmól cink-kloridot tartalmazó 20 mmólos trisz.HCl pufferben (pH= 7,5) reszuszpendáljuk. A sejteket magasnyomású homogenizátorban roncsoljuk el. A sejt homogenizátumot lecentrifugáljuk és a felülúszót összegyűjtjük. A felülúszóhoz annyi sósavval pH= 8-ra beállított 10%-os (térf/térf.) polietilén-imint (PEI) adunk, hogy a végső PEI koncentráció maximum 0,8% legyen. Az anyagot lecentrifugáljuk és a felülúszót összegyűjtjük.

II. Kromatografálás kvatemer aino-etil (QAE) oszlopon

A PEI felülúszó pH-ját 8,7-re állítjuk be 4 n nátrium-hidroxiddal. Az oldathoz ionmentes vizet adunk, hogy vezetőképességét 10 mS alá vigyük. Az anyagot QAE oszlopra visszük fel úgy, hogy 1 liter gél terhelése 50 g proteinnél több ne legyen. Az oszlopot előzőleg20 mmólos nátrium-4-(2-hidroxietil)-l-piperazin-propán-szulfonát pufferrel, amely 0,1% 2-ME-t tartalmaz és pH-ja 8,7, egyensúlyozzuk ki. Az összegyűjtött protein oldatot a III. lépcsőben kromatografáljuk.

III. Kromatografálás karboci-metil (CM) oszlopon

A 2. lépésből származó protein eluátum pH-ját 7,5-re állítjuk be 4 n sósavval és 2-ME-t adunk hozzá 0,1% végkoncentrációig. Az oldat vezetőképességét 20 mS-re állítjuk be vagy ez alá visszük úgy, hogy 0,1% 2-ME tartalmú ultraszűrt vízzel hígítjuk. Az oldatot 0,2 μ-os megszűrjük, majd CM oszlopra visszük fel úgy, hogy 1 liter gélre legfeljebb 35 g proteint terhelünk rá. Az oszlopot előzőleg 20 mmól trisz.HCl-t és 0,1% 2-ME-t tartalmazó pufferrel (pH= 7,5) egyensúlyoztuk ki, amelynek vezetőképességét nátrium-klorid hozzáadásával 20 mS-re, vagy ennél alacsonyabb értékre állítottuk be. Az oszlopot legalább 2 oszlop-térfogatnyi kiegyensúlyozó pufferrel mossuk. A gamma interferont nátrium-klorid grádienssel eluáljuk 0-0,5 mól tartományban. A nátrium-klorid a kiegyensúlyozó pufferben van oldva. A frakciókat egyesítjük és SDS-PAGE-el vizsgáljuk.

IV. Kromatografálás fenil oszlopon

Fenil oszlopon akkor kromatografálunk, ha az SDS-PAGE magasabb molekulatömegű szennyezések jelenlétét mutatja ki. Az oldat vezetőképességét 50-75 mS-re állítjuk be nátrium-klorid hozzáadásával, mielőtt felvisszük a fenil oszlopra. A terhelés nem lehet nagyobb, mint 15 g protein/1 liter gél. Az oszlopot előzőleg 20 mmól trisz.HCl, 0,5 mól nátrium-klorid és 0,1% 2-ME tartalmú pufferrel (pH= 7(5) egyensúlyozzuk ki. Miután az anyagot rávittük az oszlopra, legalább egy töltettérfogatnak megfelelő mennyiségű kiegyensúlyozó puffért folyatunk át rajta. Az oszlopot 20 mmól trisz.HCl, 0,15 mól nátrium-klorid és 0,1% 2-ME tartalmú pufferrel (pH·» 7,5) eluáljuk. Az aktív frakciókat az SDS-PAGE és a vírus ellenes aktivitás meghatározása alapján egyesítjük.

V. Kicsapás ammónium-tzidfáttai

Abban az esetben, ba knrbóximetil (III. lépés) vagy fenil (IV. lépcső) oszlop kromatografálás után az egyesített frakciók protein koncentrációja 0,2 mg/ml-nél alacsonyabb, az oldatot ultraszűréssel koncentráljuk, ahol a membrán kizárási molekulatömege 10.000 . Az oldathoz ammónium-szulfátot adunk 40-60% telítésig. A csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze és ha szükséges, -20 ’C-on tároljuk.

VI. Kromatografálás Sephadex G-100 oszlopon

Az ammónium-szulfátos csapadékot 20 mmól trisz.HCl, 0,5 mól NaCl és 0,1% 2-ME tartalmú pufferben (pH = 7,5) oldjuk fel. Az oldatot lecentrifugáljuk, majd 0,2 μ-os szűrőn szűrjük. A szűrt oldatot Sephadex G-100 oszlopra visszük fel. Az oszlopot előzőleg ugyanezen pufferrel egyensúlyozzak ki. A terhelés nem lehet több, mint 3,5 g protein/1 liter gél. Az oszlopot ugyanezen pufferrel eluáljuk és a frakciókat az elvégzett SDS-PAGE eredménye alapján egyesítjük.

VII. A tisztított gamma interferon dializálása

Az egyesített Sephadex G-100 frakciókat 15 mmól nátrium-foszfát, 8 mmól nátrium-citrát és 6 mmól L-cisztein.HCl tartalmú oldattal (pH = 5,0) szemben dializáljuk. A dialízist úgy végezzük, hogy a pufferen keresztül állandóan nitrogént áramoltatunk át és 5 órán belül minimum kétszer cseréljük a puffért. Ha szükséges, a dializált oldatot ultraszűréssel (a membrán kizárási molekulatömege 10.000) koncentráljuk úgy, hogy protein koncentrációja 1 mg/ml-nél nagyobb legyen. A tisztított gamma interferon oldatát 0,2 μ-os szűrőn szűrjük és -20 'C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk.

A tisztított gamma interferont több hónapon át lehet tárolni -20 ’C és -30 ’C között, ha a gamma interferon tartalmú oldathoz 50% glicerint adunk.

A gamma interferont úgy készítjük el felhasználásra, hogy0,2 μ-os szűrőn megszűrjük és azoldatot 20 mmól nátrium-foszfát és 6 mmól L-cisztein tartalmú oldattal (pH = 6,8) szemben dializáljuk. Egy másik dializáló oldat 15 mmól nátrium-foszfátot, 8 mmól nátrium-citrátot és 6 mmól L-cisztein.HClt (pH körülbelül 5) tartalmaz. Egy 8 órás dializálási időtartam után — mialatt állandóan nitrogént áramoltatunk át a rendszeren—előnyös, ha az oldatot membrán (kizárási molekulatömege 10.000) szűrjük.

A kapott termék legalább 95%-os tisztaságú gamma interferon és a kitermelés meghaladja a körülbelül 5%-ot.

Claims

1. Eljárás rekombináns DNS-technikával előállított és interferon termelésére képes mikroorganizmusok által termelt interferon hatású polipeptid kivonására és tisztítására a polipeptidet termelő mikroorganizmusok tenyészetéből nyert sejtek feltárása és a sejthomogenízátum cink- vagy rézsójával, majd poli(etilén-imin)-nel végzett kezelésével történő előtisztítása után kapott oldatból, azzal jellemezve, hogy az interferont tartalmazó oldatból

-11HU201P5B

i) a negatív töltésű szennyező proteineket gyengén bázisos aníoncserélő gyantával eltávolítjuk, és adott esetben az oldatot koncentráljuk;

ii) a pozitív töltésű szennyező proteineket gyengén savas kationcserélő gyantával eltávolítjuk, és adott esetben az oldatot koncentráljuk;

iii) a kisebb és nagyobb molekulatömegű anyagokat gélszűréssel eltávolítjuk;

és kívánt esetben az így kapott interferon hatású tisztított polipeptidet tartalmazó oldatot dializáljuk, és kívánt esetben koncentráljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interferon hatású polipeptidként GIF146 vagy GIF143 jelű, humán gamma interferon aktivitással rendelkező polipeptidet vonunk ki.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hpgy az interferon hatású polipeptidet a W3110/pIN5T4N143 jelű törzs vagy a W3flO/pIN5T4 jelű törzs tenyészetéből vonjuk ki.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cinksóként 0,5- mmól/liter cink-kloridot vagy rézsóként 0,05-3 mmól/liter réz-szulfátot alkalmazunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poli(etilén-imin)-t 0,5—

1,5 tömeg/térfogat% koncentrációban használjuk.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anioncserélő gyantaként egy kvatemer amino-etil gyantát, kationcserélő gyantaként egy karboxi-metil gyantát, gélszűrőként Sephadex G-100-at vagy Sephacryl S-200-at használunk.

7. Az l-ő. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ioncseréket és a gélszűrést oszlopkromatográfiás módszerrel végezzük.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a negatív és/vagy pozitív töltésű szennyező proteinek eltávolítása után az interferon hatású polipeptidet tartalmazó oldatot ammónium-szulfátos kicsapással vagy ultraszűréssel koncentráljuk.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dialízist ciszteint tartalmazó pufferral szemben oxigénmentes körülmények között végezzük.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dializált oldatot ultraszűréssel koncentráljuk.