CN109880767A

CN109880767A - 一株用于预防或治疗对虾弧菌病的菌株

Info

Publication number: CN109880767A
Application number: CN201910220408.2A
Authority: CN
Inventors: 单洪伟; 于鹏; 马甡
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: CN109880767B

Abstract

本发明提供一株用于预防对虾弧菌病的芽孢杆菌，为芽孢杆菌BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17307。本发明所提供的芽孢杆菌能对凡纳滨对虾养殖过程中的常见弧菌起到有效的抑制作用，通过将芽孢杆菌添加至饲料中并饲喂对虾使其于对虾体内定殖从而起到预防凡纳滨对虾弧菌病的作用。

Description

一株用于预防或治疗对虾弧菌病的菌株

技术领域

本发明属于有益菌筛选及应用技术领域，具体涉及一株用于预防或治疗对虾弧菌病的菌株。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamai)因其肉质鲜美、生长速度快、抗逆性强等特点，自20世纪80年代引入中国后，迅速发展为我国对虾养殖的主要品种，目前其产量占对虾养殖产量的75％以上。近年来，随着凡纳滨对虾养殖业的迅速发展，病害问题日益凸显，严重损害着对虾养殖户的利益，阻碍对虾养殖业进一步的发展。

弧菌病是对虾养殖过程中的主要病害之一，具有流行广、发病率高、危害大和死亡率高等特点。目前，已被确定能引起对虾弧菌病的病原有哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、坎贝氏弧菌(V.campbelli)和霍乱弧菌(V.cholerae)等。抗生素等药物是防治对虾弧菌病的有效手段，但同样也会引起耐药细菌的出现并引起一系列环境问题甚至危害人类健康。因此，亟需找到一种新的环境友好的有效手段用于凡纳滨对虾养殖过程中弧菌病的防治。

益生菌已被证明能够通过多种作用机制对宿主起到保护作用，被认为是抗生素的良好替代品。目前，已有研究表明益生菌可以在对虾养殖过程中起到积极的作用，但益生菌的选择至关重要，许多商用益生菌的实际应用效果不理想，这与益生菌的种类及来源密切相关。而且，研究发现相对于陆地源益生菌，从水产养殖动物或环境中分离出的细菌具有更加显著的益生效果。因此，从健康对虾体内筛选得到具有弧菌拮抗活性的芽孢杆菌对于对虾养殖过程中弧菌病的防治至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一株用于预防对虾弧菌病的芽孢杆菌，能够有效的对对虾养殖过程中的常见弧菌起到抑制作用，从而有效降低因弧菌病引起的对虾的高死亡率。

本发明所提供的芽孢杆菌，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17307；

本发明的芽孢杆菌筛选自健康凡纳滨对虾体内，可以用于抑制对虾养殖过程中的常见弧菌；

本发明所提供的芽孢杆菌用于添加至饲料中，含芽孢杆菌的饲料用于预防凡纳滨对虾弧菌病。

本发明所提供的芽孢杆菌能对凡纳滨对虾养殖过程中的常见弧菌起到有效的抑制作用，通过将芽孢杆菌添加至饲料中并饲喂对虾使其于对虾体内定殖从而起到预防凡纳滨对虾弧菌病的作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：具有抑菌效果的芽孢杆菌的筛选与鉴定

1、样品采集

样品为发生弧菌病后存活的凡纳滨对虾，将凡纳滨对虾进行表面消毒后，取肝胰腺及肌肉在无菌生理盐水中研磨并稀释至合适浓度，然后用无菌枪头吸取适量匀浆液涂布于LB固体培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母粉5g、琼脂20g、NaCl 30g、pH 7.2～7.4)上，28℃下培养24h，准备进一步筛选。

2、细菌富集

用无菌接种环在LB固体培养基上挑取形态大小不同的单菌落置于10mL的LB液体培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 30g、pH 7.2～7.4)中，放在摇床(28℃，180r/min)上进行好氧培养，培养24h后，获得纯菌株。最终从LB固体培养基上挑取并能成功富集的细菌有37株，分别编号为：BD1、BD2、BD3、BD4、BD5、BD6、BD7、BD8、BD9、BD10、BD11、BD12、BD13、BD14、BD15、BD16、BD17、BD18、BD19、BD20、BD21、BD22、BD23、BD24、BD25、BD26、BD27、BD28、BD29、BD30、BD31、BD32、BD33、BD34、BD35、BD36、BD37。

3、芽孢杆菌的分离

配置刺激芽孢产生培养基，配方为：海水1000mL、蛋白胨10g、酵母膏3g、淀粉3g、MgSO₄ 0.1g、KH₂PO₄ 1.5g、Na₂HPO₄ 2g、NaCl30g、pH 7.8。

将分离出的单菌落接种于刺激芽孢产生的培养基中，于恒温摇床(28℃，180r/min)培养24h。培养好的菌液置于80℃条件下水浴20min以筛选能够产生芽孢的菌株。将水浴后的菌液用无菌生理盐水稀释至合适浓度后涂布于LB固体培养基上，于28℃条件下培养24h。

经过筛选，共分离出15株疑似芽孢杆菌，分别为BD1、BD2、BD3、BD4、BD15、BD18、BD19、BD22、BD23、BD24、BD27、BD28、BD31、BD36、BD37。

4、具有抑菌效果的芽孢杆菌的筛选

以坎贝氏弧菌C-L株、副溶血弧菌LY-L株、哈维氏弧菌HAH株、新喀里多尼亚弧菌(V.neocaledonicus)W-B株、木糖葡萄球菌(Staptococcus xylosus)W-S株、荧光弧菌Y-1、Y-2、Y-92株等实验室前期筛选得到的能够引起凡纳滨对虾弧菌病的菌株做为病原菌。

采用滤纸片法筛选得到具有抑菌效果的芽孢杆菌。将病原菌和芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，于恒温摇床(28℃，180r/min)培养24h后，取200μl病原菌菌液均匀涂在LB固体培养基表面。菌液干燥后，将无菌滤纸片(6mm)贴于上方，并将10μL芽孢杆菌菌液添加至滤纸片上，空白对照组添加相同体积的无菌LB液体培养基。于30℃条件下培养24h后，观察是否产生抑菌圈并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

实验结果表明有3株芽孢杆菌(BD4、BD22、BD28)能对至少1种病原菌具有抑菌效果，其中BD28效果最好，对C-L、HAH、W-S、Y-1、Y-2、Y-92均有明显的抑制效果，抑菌圈直径分别为6.51mm、13.76mm、10.29mm、6.71mm、8.77mm、7.60mm。其次是BD22，对Y-2和Y-92具有明显的抑制效果，抑菌圈直径分别为7.96mm和7.02mm；而BD4只对W-S具有抑制效果，抑菌圈直径为8.07mm。

5.细菌鉴定

选取抑菌效果最好的菌株BD28在LB固体培养基上呈白色，不透明，表面光滑且边缘整齐。革兰氏染色结果为阳性，直杆状，有芽孢无荚膜。

对菌株BD28进行16S rDNA的基因序列测定，并在NCBI中用BLAST进行同源序列比对，然后用MEGA 5.0对测序结果进行***发育分析以确定菌株种类。

经鉴定，菌株BD28与沙福芽孢杆菌具有最高的相似性，命名为芽孢杆菌(Bacillussp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17307。

实施例2：不同源芽孢杆菌对对虾生长、成活率及应激的影响

以来自于健康对虾体内的芽孢杆菌BHK201801株和陆地源芽孢杆菌LD05做为实验菌株。将芽孢杆菌BHK201801株和LD05接种于LB液体培养基中培养24h后，离心(2392×g,10min)并用无菌生理盐水稀释至合适浓度，均匀地搅拌到对虾配合饲料中，使其终浓度为1×10⁷cfu/g。将饲料于35℃条件下烘干并保存在4℃条件下，备用。以只添加等量无菌生理盐水的饲料做为对照组饲料。以相应饲料饲喂对虾共50天，随时观察对虾的状态，记录对虾生长情况及成活率。对虾养殖过程中的日常管理包括人工投饵、换水吸底、日常捞池、生长监测等。

养殖过程中维持温度26-28℃、盐度26-30、pH 7.8-8.3、溶氧>5mg/L，每天投喂4餐，饱食投喂，喂食1h后吸出残饵及***物并补充新鲜海水。每天进行捞池操作，捞出死虾。

对虾养殖在循环水***中先停食1天，待对虾对环境适应后开始进行投喂。先投喂对虾配合饲料，每天投喂4餐，时间分别为每天的7:00、11:00、14:00、18:00。饲喂配合饲料7天后开始向实验组对虾投喂含不同源芽孢杆菌的配合饲料。养殖过程中观察对虾免疫应激反应，50天后测量各组对虾的体长、体重、成活率及免疫酶活性等。

对养殖效果分析如下：

1.饲喂芽孢杆菌BHK201801株显著提高对虾生长：养殖50天后测量对虾体长和体重并计算特定生长率，结果表明，相对于对照组，饲喂芽孢杆菌BHK201801株使对虾体长增加3.1％，体重增加15.5％，特定生长率增加28.5％。饲喂陆地源芽孢杆菌LD05的对虾的体长、体重等较对照组均有不同程度的降低。

2.芽孢杆菌BHK201801株利于对虾的成活：饲喂芽孢杆菌BHK201801株使对虾成活率较对照组提高25％，而饲喂陆地源的芽孢杆菌LD05使对虾成活率较对照组提高5％。

3.芽孢杆菌BHK201801株可减少对虾应激反应：养殖过程中，饲喂芽孢杆菌的对虾未显示出明显的应激反应，而对照组和陆地源芽孢杆菌LD05组的部分对虾在养殖实验的前期，显示出了较明显的应激反应，包括触须及尾扇发红，空肠空胃等，在养殖中期应激反应逐渐消失。

实施例3：芽孢杆菌用于预防由哈维氏弧菌引起的对虾弧菌病

以实施例2中的方法制备含有芽孢杆菌的配合饲料投喂对虾(芽孢杆菌组)，以不含芽孢杆菌的配合饲料对对照，两组对虾饲喂15天后，以哈维氏弧菌HAH株为病原菌进行注射攻毒实验，该菌株被证明能够引起对虾肝胰腺病变。病原菌在LB培养基中培养24h后，离心(2392×g,10min)并用无菌生理盐水稀释成浓度为1×10⁷cfu/mL的菌悬液。注射部位为对虾腹部第4和第5腹节之间，注射剂量为50μL。对虾养殖过程中的日常管理包括人工投饵、换水吸底、日常捞池、生长监测等，注射攻毒过程中观察对虾发病情况并记录对虾累积死亡率。

养殖过程中维持温度24-26℃、盐度26-30、pH 7.7-8.1、溶氧>5mg/L，每天投喂4餐，饱食投喂，喂食1h后吸出残饵及***物并补充新鲜海水。每天进行捞池操作，捞出死虾。攻毒过程中，水质条件与养殖过程中一致，持续充气，不投喂。

攻毒结果分析如下：

1.饲喂芽孢杆菌BHK201801株降低肝胰腺病变程度：攻毒过程中发现饲喂芽孢杆菌BHK201801株的对虾肝胰腺病变程度明显较轻，肝胰腺及虾体轻微变色，而对照组对虾肝胰及虾体明显变黄，肝胰腺糜烂模糊，空肠空胃。

2.饲喂芽孢杆菌BHK201801株降低对虾死亡率：注射病原菌HAH后，前6h时两组对虾死亡情况无明显区别，9h时对照组对虾累积死亡率明显高于饲喂芽孢杆菌的对虾，到了12h时，饲喂芽孢杆菌的对虾累积死亡率显著低于对照组。相较于对照组，饲喂芽孢杆菌BHK201801株使对虾累积死亡率下降了36.8％。

上述的结果表明本发明所提供的芽孢杆菌能对凡纳滨对虾养殖过程中的常见弧菌起到有效的抑制作用，通过将芽孢杆菌添加至饲料中并饲喂对虾使其于对虾体内定殖从而起到预防凡纳滨对虾弧菌病的作用。

Claims

1.一种芽孢杆菌，其特征在于，所述的芽孢杆菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17307。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌筛选自健康凡纳滨对虾体内。

3.权利要求1所述的芽孢杆菌在抑制对虾养殖过程中的常见弧菌病的应用。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌作为饲料添加剂的应用。

5.一种凡纳滨对虾的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂是使用权利要求1所述的芽孢杆菌制备的。

6.一种凡纳滨对虾的饲料，其特征在于，所述的饲料中添加了权利要求5所述的饲料添加剂。