CN115992080B - 一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂、饲料及其使用方法和应用 - Google Patents

一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂、饲料及其使用方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂、饲料及其使用方法和应用，属于饲料领域，所述复合菌剂包括沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和灭活大肠杆菌；所述沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和灭活大肠杆菌的数量比为106～109:104～106:105～108。将本发明提供的饲料饲喂黑水虻幼虫，增重率为1193.33％，抗菌肽含量为0.145mg/ml。

Description

一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂、饲料及其使用 方法和应用
技术领域
本发明涉及饲料领域，特别是涉及一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂、饲料及其使用方法和应用。
背景技术
目前黑水虻幼虫的诱导研究主要利用病原菌针刺的方法(夏嫱等,黑水虻抗菌肽诱导条件优化及粗提物活性研究.环境昆虫学报.2013,35(01)：44-48)，经针刺处理后，虽然黑水虻幼虫的抗菌肽能够被大量诱导，但该方法不具备实际生产的可操作性。在自然环境下，黑水虻幼虫作为腐食性昆虫，在进食时，会食进大量的微生物，黑水虻幼虫表达产生大量的抗菌肽就是通过进食高细菌含量的食物而被诱导产生的。有研究发现，饲料添加磺化木质素、纤维素、甲壳素、啤酒颗粒或葵花籽油后，抗菌肽在幼虫体内的表达谱具有基质饲料依赖性(张杰等,黑水虻的资源化利用研究现状[J].应用昆虫学报.2019,56(05):997-1006)。饲料添加蛋白质或葵花籽油饲喂黑水虻幼虫，可诱导幼虫最高的抗菌肽数量和表达水平(Vogel H,MullerA,Heckel DG,et al.Nutritional immunology:diversificationand diet-dependent expression of antimicrobial peptides in the black soldierfly Hermetia illucens[J].Developmental&Comparative Immunology.2018,78:141-148)。经过微生物发酵的饲料还能显著促进黑水虻幼虫的生长(徐健，发酵饲料对黑水虻生长性能的影响及黑水虻消化酶活和肠道菌群的特征研究.华南农业大学,2016)。现有技术中还未有关于在黑水虻幼虫的饲料中添加菌剂以诱导抗菌肽的大量产生的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂、饲料及其使用方法和应用，提高了黑水虻幼虫抗菌肽的产生，同时也促进了黑水虻幼虫的生长。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂，所述复合菌剂包括沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和灭活大肠杆菌；
所述沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和灭活大肠杆菌的数量比为106～109:104～106:105～108。
优选的，所述灭活大肠杆菌的制备方法包括：将大肠杆菌在100℃下处理5～10min。
本发明还提供了一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的饲料，包括上述技术方案所述的复合菌剂和基础饲料。
优选的，所述基础饲料包括***。
优选的，所述饲料还包括低聚壳聚糖。
优选的，所述基础饲料的质量与沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、灭活大肠杆菌的数量比为1g:106～109CFU:104～106CFU:105～108CFU。
优选的，所述基础饲料与低聚壳聚糖的质量比为1000:0.2～0.6。
本发明还提供了一种上述技术方案所述饲料的使用方法，将所述饲料投喂黑水虻幼虫6d。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合菌剂或所述的饲料在促进黑水虻幼虫生长中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合菌剂或所述的饲料在提高黑水虻幼虫抗菌肽含量中的应用。
本发明提高黑水虻幼虫抗菌肽含量和促生长的机理是：
所述沼泽红假单胞菌的作用是在饲料中可初步对饲料进行发酵分解，有利于营养吸收利用，其在肠道中定殖，可抑制有害微生物的生长，优化肠道微生物群落结构，改善消化功能，其富含类胡萝卜素、维生素B等营养元素，可维护虫体在免疫刺激作用下的健康，其富含辅酶Q等促生长因子，可促进黑水虻幼虫生长，沼泽红假单胞菌繁殖速度快，死亡菌体释放的细胞壁成分肽聚糖，可持续刺激虫体免疫力、产生抗菌肽。所述啤酒酵母的作用是在饲料中可初步对饲料进行发酵分解，有利于营养吸收利用，其在肠道中定殖，可抑制有害微生物的生长，优化肠道微生物群落结构，改善消化功能，其死亡菌体释放的细胞壁成分酵母聚糖，可刺激虫体免疫力、产生抗菌肽。所述灭活大肠杆菌的作用是作为主要的抗原物质，可快速刺激虫体免疫力、产生抗菌肽。所述低聚壳聚糖的作用是促进沼泽红假单胞菌、啤酒酵母的定殖及生长，优化肠道微生物群落结构，提高消化吸收能力，从而促进黑水虻幼虫生长，维持虫体在免疫刺激下的健康。
本发明的有益效果为：
将本发明提供的饲料饲喂黑水虻幼虫，增重率为1193.33％，抗菌肽含量为0.145mg/ml。
具体实施方式
本发明提供了一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的复合菌剂，所述复合菌剂包括沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和灭活大肠杆菌；所述沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和灭活大肠杆菌的数量比为106～109:104～106:105～108。
本发明对所述沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和大肠杆菌的来源和制备方法没有特殊限定，按照常规即可。在本发明中，所述灭活大肠杆菌的制备方法优选包括：将大肠杆菌在100℃下处理5～10min。在本发明中，所述沼泽红假单胞菌的作用是在饲料中可初步对饲料进行发酵分解，有利于营养吸收利用，其在肠道中定殖，可抑制有害微生物的生长，优化肠道微生物群落结构，改善消化功能，其富含类胡萝卜素、维生素B等营养元素，可维护虫体在免疫刺激作用下的健康，其富含辅酶Q等促生长因子，可促进黑水虻幼虫生长，沼泽红假单胞菌繁殖速度快，死亡菌体释放的细胞壁成分肽聚糖，可持续刺激虫体免疫力、产生抗菌肽。所述啤酒酵母的作用是在饲料中可初步对饲料进行发酵分解，有利于营养吸收利用，其在肠道中定殖，可抑制有害微生物的生长，优化肠道微生物群落结构，改善消化功能，其死亡菌体释放的细胞壁成分酵母聚糖，可刺激虫体免疫力、产生抗菌肽。所述灭活大肠杆菌的作用是作为主要的抗原物质，可快速刺激虫体免疫力、产生抗菌肽。
本发明还提供了一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的饲料，包括上述技术方案所述的复合菌剂和基础饲料。
在本发明中，所述基础饲料优选包括***，本发明对所述***的来源没有特殊限定。在本发明中，所述基础饲料的质量与沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、灭活大肠杆菌的数量比优选为1g:106～109CFU:104～106CFU:105～108CFU。本发明对所述饲料的制备方法没有特殊限定，混合均匀即可。在本发明中，所述饲料还优选包括低聚壳聚糖。在本发明中，所述基础饲料与低聚壳聚糖的质量比优选为1000:0.2～0.6。在本发明中，所述低聚壳聚糖的作用是促进沼泽红假单胞菌、啤酒酵母的定殖及生长，优化肠道微生物群落结构，提高消化吸收能力，从而促进黑水虻幼虫生长，维持虫体在免疫刺激下的健康。
本发明还提供了一种上述技术方案所述饲料的使用方法，将所述饲料投喂黑水虻幼虫6d。在本发明中，所述黑水虻幼虫自由采食。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合菌剂或所述的饲料在促进黑水虻幼虫生长中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合菌剂或所述的饲料在提高黑水虻幼虫抗菌肽含量中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的饲料：以***作为黑水虻幼虫基础饲料，每g黑水虻幼虫基础饲料添加沼泽红假单胞菌的数量为109CFU，啤酒酵母的数量为106CFU，灭活大肠杆菌的数量为108CFU，低聚壳聚糖0.6mg。灭活大肠杆菌的制备方法为：将大肠杆菌在100℃下处理5min。将上述原料混合，得到饲料。
实施例2
对照组：在***中添加等量水，饲料湿度30％；
虫卵孵化后开始投喂试验，用塑料盒进行养殖，每个饲料组3个重复，每个重复100只幼虫，分别将实施例1制备的诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的饲料和对照组投喂黑水虻幼虫6天，称重计算增重率。
黑水虻幼虫抗菌肽的提取：分别将不同饲料喂养的全部黑水虻幼虫，用蒸馏水反复冲洗，并用75％乙醇消毒，吸干虫体表面液体，放入超低温冰箱急冻处死备用。称量后置于研钵中，按重量/体积比为1：3加入提取液(0.05mol/L pH＝5的乙酸铵缓冲液，35μg/mL苯甲基磺酰氟PMSF，2‰巯基乙醇)，充分研磨，匀浆液在4℃，12000r/min高速冷冻离心30min取上清液，重复3次，合并上清液，随后放至100℃的恒温水浴箱中水浴5min，然后以4800r/min(4℃)离心30min，去除变性蛋白，用灭菌好的注射器抽取不含油层的上清液即为抗菌肽粗提物。
抗菌肽的浓度测定：用考马斯亮蓝法测定黑水虻幼虫抗菌肽粗提液蛋白浓度，以标准蛋白浓度(mg/ml)为横坐标，吸光值OD595为纵坐标作标准曲线，通过测定样品的OD595计算蛋白浓度即抗菌肽浓度。
表1黑水虻幼虫生长和抗菌肽含量的结果
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种诱导黑水虻幼虫抗菌肽产生的饲料，其特征在于，包括复合菌剂、基础饲料和低聚壳聚糖；
所述复合菌剂包括沼泽红假单胞菌、啤酒酵母和灭活大肠杆菌；
所述基础饲料为***；
所述基础饲料的质量与沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、灭活大肠杆菌的数量比为1g:106～109CFU:104～106CFU:105～108CFU；
所述基础饲料与低聚壳聚糖的质量比为1000:0.2～0.6。
2.根据权利要求1所述的饲料，其特征在于，所述灭活大肠杆菌的制备方法包括以下步骤：将大肠杆菌在100℃下处理5～10min。
3.一种权利要求1～2任一项所述饲料的使用方法，其特征在于，将所述饲料投喂黑水虻幼虫6d。
4.权利要求1～2任一项所述的饲料在促进黑水虻幼虫生长中的应用。
5.权利要求1～2任一项所述的饲料在提高黑水虻幼虫抗菌肽含量中的应用。
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发酵饲料对黑水虻生长性能的影响及黑水虻消化酶活和肠道菌群的特征研究;徐健;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;D051-43，参见全文 *

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