CN104988183A - 糙皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒素b1中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵，特别是指一种糙皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。将糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)CICC 14012接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵培养制成发酵液，该发酵液可用于降解黄曲霉毒素B₁的毒性。本发明解决了现有去除黄曲霉毒素B₁方法中需要特定条件、特有材料和劳动强度大，脱毒不完全，对被处理饲料营养成分有破坏作用，要求条件剧烈，易产生化学残留，造成二次污染等技术问题。采用本发明方法制备糙皮侧耳发酵液制剂具有工艺简便、对环境无污染、产品安全性高，用于降解黄曲霉毒素B₁具有降解速度快，降解率高，添加量小等优点。

Description

糙皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒素B1中的应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵，特别是指一种糙皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。

背景技术

糙皮侧耳俗称平菇，是一种形成子实体的真菌，其生长环境不同分为野生和人工栽培两种。因子实体中含有丰富营养成分可以食用，又称为食用菌。由大量测定数据得知，每100克干菇中约含有粗蛋白20克、粗脂肪4克、碳水化合物50克、粗纤维6克，还含有矿物质、多种维生素和多种微量元素等。其蛋白质含量是鸡蛋的2.6倍，猪肉的4倍；碳水化合物含量占总量的65.61％，其中还原糖占54.73％；氨基酸约有18种，其中人体必需的8种氨基酸含量较高，占氨基酸总量的35％以上，尤其作为病人的营养品为佳。

中医学认为，平菇性平，味甘，具有补虚、抗癌的功效，能改善人体新陈代谢，增强体质，调节植物神经。平菇含有多糖体，对肿瘤细胞有很强的抑制作用，且具有免疫特性。平菇还有追风散寒、舒筋活络的作用，可治腰腿疼痛，手足麻木，经络不适等症，此外，平菇还对肝炎、慢性胃炎、胃及十二脂肠溃疡，软骨病、高血压等都有疗效，对降低血胆固醇和防治尿道结石也有一定疗效，对女性更年期综合症可起到调理作用。

糙皮侧耳菌在含有营养的固形物上生长可以形成子实体供食用，还可进行菌丝深层液体发酵，培养液中分泌有大量多糖、酶、氨基酸及生理活性物质。多糖以酸性多糖为主，含有β-1,3-葡聚糖，半乳糖，甘露糖，葡萄糖醛酸等。经科学研究证实，液体发酵复合产物对肉瘤S180抑制率为91％，提取的糖蛋白对体外S180有较强的抑制作用。糙皮侧耳糖肽组分有促进淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞和自然杀伤(NK)细胞杀伤肿瘤作用。还具有降血脂及防治动脉粥样硬化，可明显减轻血清及肝胆固醇和甘油三酯。在发酵液中的多种酶，尤其以三种酚氧化酶含量较高。这些酶可用于食品保鲜和稳定，可催化多项化学反应，改变原分子结构合成新物质，改变分子物质化学性质，利用这一特点进行污水处理保护环境。

黄曲霉毒素是一类对人和动物毒性极强物质，是黄曲霉和寄生曲霉菌生长过程中的次级代谢产物。1993年被世界卫生组织(WHO)癌症机构划定为1类致癌物。产生黄曲霉毒素的真菌普遍存在于自然界的土壤、农作物及果实、牧草、饲料中，特别在大豆、稻谷、玉米、花生中，在牛奶及奶制品中也经常检出其毒素。在每年的夏秋季节，温度较高，空气湿度大，粮食作物在成熟前期很容易被霉菌污染，尤其是病变早熟的种粒极易生长霉菌并产生霉菌毒素。人食用后可直接危害生命，动物采食后危害动物生命或降低动物生产性能。人接触黄曲霉毒素的主要来源是膳食污染的食物，污染食物有两种类型，一是由被黄曲霉毒素污染的植物种子食物中摄入；二是被黄曲霉毒素污染的饲料进入畜、禽体内再转入奶、蛋及肉制品中被人摄入，最终危害人类生命健康。高秀芬等人在2010年抽查了吉林、河南、湖北、四川、广东、广西6省的玉米饲料样品279份，黄曲霉毒素阳性率为75.63％，平均浓度44.04μg/kg,浓度范围0.20-888.30μg/kg；四川农大张自强2008年-2009年测定了全国11个省份共计1013份饲料样品，其中黄曲霉毒素B₁(AFB₁)检出率高达99.51％，尤其以棉粕、菜粕、玉米含量较高。

黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织的破坏作用，发生肝炎，肝硬化，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食物中以黄曲霉毒素B₁最多见，其毒性和致癌性也最强。经研究得知，黄曲霉毒素B₁大鼠的半致死量雄性(100g)为7.2毫克/公斤体重、雌性(150g)为17.9毫克/公斤体重，属特剧毒的毒物范围(它的毒性比***大10倍，比砒霜大68倍)。中毒后临床表现有胃部不适，食欲减退，恶心，呕吐，腹胀及肝区触痛等，严重者出现水肿，昏迷，抽搐而死。黄曲霉毒素B₁(AFB₁)是目前发现的最强致癌物，其致癌力是奶油黄的900倍，比二甲基亚硝胺诱发胃、肾、直肠、乳腺、卵巢及小肠等部位癌变几率高75倍。黄曲霉毒素B₁(AFB₁)与其它有毒无机化合物，如***的毒性相比，其毒性机理更为复杂，它主要是通过抑制核酸和蛋白合成，干扰糖类、脂类代谢，抑制免疫，降低激素活性，抑制细胞ATP合成等，从而导致碳水化合物和脂类代谢及蛋白合成的抑制，使细胞失去活性，造成中毒。所以它又是一种细胞毒素。为此，黄曲霉毒素B₁危害已经成为人们关注的焦点。

黄曲霉毒素B₁(AFB₁)难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，耐高温，分解温度为268℃，以上特点决定黄曲霉毒素的分离、降解难度大。解除黄曲霉毒素危害的型式为分离去除和分解化学结构失去毒性。近年来人们采用的解毒方法分为物理方法、化学方法和生物方法。物理法为水洗、矿物质吸附、射线辐照等，此法劳动强度大，矿物质吸附饱和度限制了对饲料的处理量，辐照解毒不彻底；化学法均采用强酸、强碱和强氧化剂等化学试剂降解毒素，其特点是降解毒素彻底，饲料营养成分有不同程度破坏，均有化学残留，给家禽、家畜带来二次伤害(二次污染)；生物学法是近年来研究较多方法，也是人们最重视的方法。大量研究结果表明，生物学法是最可靠最科学的解毒方法，其特点是条件温和，副作用小，不产生二次污染，不破坏营养成分等，越来越受到人们的重视。食用真菌菌丝体深层液体发酵产物多含有降解黄曲霉毒素的活性成分，也是人们研究较多的菌种。

微生物发酵制剂降解黄曲霉毒素主要采用细菌和真菌，国外大量资料研究显示结果为，真菌多但细菌报道较少。

发明内容

本发明的目的在于提供糙皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。

本发明的整体技术构思是：

糙皮侧耳发酵液的制备方法，是将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CICC14012接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌发酵培养基中进行通气发酵制成发酵液；

发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

土豆淀粉6.0％-7.0％，蔗糖1.8％-2.2％，酵母膏0.18％-0.22％，硫酸铵0.29％-0.33％，磷酸二氢钾0.25％-0.30％，硫酸镁0.15％-0.18％，维生素B₁0.0001％-0.0003％，微量元素溶液5.0％-6.0％，藜芦醇430μL/L-470μL/L，吐温80 0.1％-0.13％，余量为无菌水，pH＝4.9-5.3；

微量元素溶液由以下原料组成：

氯化钙1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锌100mg，硫酸铜150mg，硫酸锰1000mg，硫酸钴200mg，硫酸铝钾20mg，硼酸10mg，钼酸钠20mg，定容至1000mL；

通气发酵的工艺条件如下：

接种量为体积比＝6-8∶100，温度为26℃-28℃,通气量为1∶0.7-1.2vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养周期为不低于240小时。

可以显而易见的是发酵终点的控制除时间因素外，应结合722可见光分光光度计，采用考马斯亮蓝法监测发酵液中蛋白质浓度，确定发酵终点。

采用上述方法制备的糙皮侧耳发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。

本发明的具体技术构思还有：

出于工业化生产的需要，优选的技术方案是，所述的糙皮侧耳菌种在接入无菌发酵培养基前经过扩大培养。

更为优选的技术方案是，所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、平皿菌种制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。

斜面菌种的制备采用马铃薯培养基，平皿菌种的制备采用葡萄糖培养基，温度为25℃-27℃，培养周期为4-5天。

一级种子的制备以及二级种子的制备中种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：

土豆汁18％-21％，葡萄糖1.8％-2.2％，酵母膏0.25％-0.30％，硫酸铵0.29％-0.33％，磷酸二氢钾0.25％-0.30％，硫酸镁0.15％-0.18％，维生素B₁0.0001％-0.0003％，微量元素溶液3.5％-4.5％，余量为无菌水，pH＝5.0-5.5；

微量元素溶液由如下质量的原料组成：

氯化钙1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锌100mg，硫酸铜150mg，硫酸锰1000mg，硫酸钴200mg，硫酸铝钾20mg，硼酸10mg，钼酸钠20mg，定容至1000mL。

一级种子的制备采用如下工艺步骤：

挑选生长旺盛、健壮的平皿菌种，在菌丝生长旺盛部位切成直径7mm-13mm圆片，按每瓶3-5片接种量将其接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在温度为26℃-28℃条件下振荡培养85-96小时制成一级种子；装量为1000ml的三角瓶装入160-200ml一级种子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为一级种子培养终点。

二级种子的制备采用如下工艺步骤：

按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝9-11∶100的比例，将一级种子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝60-70:100，在温度为26℃-28℃，通气量为1∶0.5-0.7vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为二级种子培养终点。

采用本发明的方法所获得的发酵液，按常规方法进行固液分离后得到的液体即为糙皮侧耳发酵液制剂，固液分离的方法包括但不局限于采用板框分离、离心机分离等现有技术，均不脱离本发明的技术实质。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、本发明工艺简便、成熟，仅需深层发酵设备，尤其是固液分离后的液体即可用于解毒，固液分离后的菌丝体可作饲料应用，制备过程无三废污染。

2、本发明中所使用的糙皮侧耳菌，不在致病菌种范围(食用平菇)，安全可靠。

3、本发明中培养基的主要原料为土豆淀粉和食用蔗糖，具有安全、无毒、绿色的特点。

4、该糙皮侧耳菌发酵液制剂用于降解黄曲霉毒素B₁，降解速度快，降解率高，条件温和，选择性好，性能稳定。用于降解自然条件下被污染的玉米饲料(AFB₁含量≤97.7μg/kg)和豆粕饲料(AFB₁含量≤93.5μg/kg)中黄曲霉毒素B₁、，按饲料重量≤9‰比例添加，对毒素降解率≥73.29％。

5、采用本发明制备的产品降解黄曲霉毒素B₁，使用方法简单，具有良好的可操作性，解毒过程不会造成二次危害。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

实施例1

糙皮侧耳发酵液的制备方法，将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CICC14012接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液；

发酵培养基由如下质量百分数的原料组成：

土豆淀粉6.5％，蔗糖2.0％，酵母膏0.18％，硫酸铵0.31％，磷酸二氢钾0.28％，硫酸镁0.17％，维生素B₁0.0001％，微量元素溶液6.0％，藜芦醇450μL/L，吐温80 0.13％，余量为无菌水，pH＝5.0；

微量元素溶液：氯化钙1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锌100mg，硫酸铜150mg，硫酸锰1000mg，硫酸钴200mg，硫酸铝钾20mg，硼酸10mg，钼酸钠20mg，定容至1000mL。

通气发酵的工艺条件如下：

接种量为体积比＝7∶100，温度26℃,通气量1∶0.8vvm，压力为0.03Mpa，培养周期为不低于250小时。

发酵终点的控制除时间因素外，应结合722可见光分光光度计，采用考马斯亮蓝法监测发酵液中蛋白质浓度，确定发酵终点。

所述的糙皮侧耳菌种在接入无菌发酵培养基前经过扩大培养。

所述的扩大培养包括斜面菌种、平皿菌种的制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。

所述的斜面菌种的制备采用马铃薯培养基，平皿菌种的制备采用葡萄糖培养基，温度为26℃，培养周期4.5天。

所述的一级种子的制备包括如下工艺步骤：

将斜面菌种接种到平皿中的固体培养基上，在26℃条件下培养4.5天，挑选生长健壮的平皿菌种，在菌丝生长旺盛部位切成10mm圆片，按每瓶3片接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在27℃条件下振荡培养90小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入200ml一级种子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为一级种子培养终点。

所述的二级种子的制备包括如下工艺步骤：

按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝10∶100的比例，将一级种子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝70:100，在温度为27℃，通气量为1∶0.7vvm，压力为0.05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为二级种子培养终点。

所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：

土豆汁21％，葡萄糖1.9％，酵母膏0.28％，硫酸铵0.29％，磷酸二氢钾0.25％，硫酸镁0.17％，维生素B₁0.0002％，微量元素溶液4.0％，余量为无菌水，pH＝5.3；

微量元素溶液：氯化钙1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锌100mg，硫酸铜150mg，硫酸锰1000mg，硫酸钴200mg，硫酸铝钾20mg，硼酸10mg，钼酸钠20mg，定容至1000mL。

采用本实施例的方法所获得的发酵液按常规方法进行固液分离即可制成发酵液制剂，固液分离包括但不局限于采用板框分离、离心机分离等。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

土豆淀粉7.0％，蔗糖1.8％，酵母膏0.20％，硫酸铵0.29％，磷酸二氢钾0.25％，硫酸镁0.18％，维生素B₁0.0002％，微量元素溶液5.0％，藜芦醇430μL/L，吐温80 0.10％，余量为无菌水，pH＝4.9。

通气发酵过程中接种量为体积比＝6∶100，温度28℃,通气量1∶0.7vvm，压力为0.04Mpa，培养周期为不低于265小时。

斜面菌种和平皿菌种的制备中培养温度为25℃，培养周期5天。

一级种子的制备包括如下工艺步骤：

将斜面菌种接种到平皿中的固体培养基上，在25℃条件下培养5天，挑选生长健壮的平皿菌种，在菌丝生长旺盛部位切成13mm圆片，按每瓶4片接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在28℃条件下振荡培养85小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入180ml一级种子培养基。

二级种子的制备包括如下工艺步骤：

按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝9∶100的比例，将一级种子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝65:100，在温度为26℃，通气量为1∶0.6vvm，压力为0.03Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子。

所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：

土豆汁18％，葡萄糖2.2％，酵母膏0.30％，硫酸铵0.31％，磷酸二氢钾0.28％，硫酸镁0.15％，维生素B₁0.0001％，微量元素溶液4.5％，余量为无菌水，pH＝5.5。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

土豆淀粉6.0％，蔗糖2.2％，酵母膏0.22％，硫酸铵0.33％，磷酸二氢钾0.30％，硫酸镁0.15％，维生素B₁0.0003％，微量元素溶液5.5％，藜芦醇470μL/L，吐温80 0.12％，余量为无菌水，pH＝5.3。

通气发酵过程中接种量为体积比＝8∶100，温度27℃,通气量1∶1.2vvm，压力为0.05Mpa，培养周期为不低于280小时。

斜面菌种和平皿菌种的制备中培养温度为27℃，培养周期4天。

一级种子的制备包括如下工艺步骤：

将斜面菌种接种到平皿中的固体培养基上，在27℃条件下培养4天，挑选生长健壮的平皿菌种，在菌丝生长旺盛部位切成7mm圆片，按每瓶5片接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在26℃条件下振荡培养96小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入160ml一级种子培养基。

二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：

按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝11∶100的比例，将一级种子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝60:100，在温度为28℃，通气量为1∶0.5vvm，压力为0.04Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子。

一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：

土豆汁19％，葡萄糖1.8％，酵母膏0.25％，硫酸铵0.33％，磷酸二氢钾0.30％，硫酸镁0.18％，维生素B₁0.0003％,，微量元素溶液3.5％，余量为无菌水，pH＝5.0。应用试验

申请人就上述实施例制备的糙皮侧耳发酵液制剂分别用于含有黄曲霉毒素B₁的水溶液、玉米饲料和豆粕饲料，进行降解黄曲霉毒素B₁的能力和添加量试验。试验结果如下：

解毒试验1

利用实施例1-3的方法获得的糙皮侧耳发酵液制剂，按质量比为3‰、6‰、9‰比例分别添加到不同浓度黄曲霉毒素B₁(含量在5-100μg/L)的水溶液中充分混匀，在37℃条件下保温降解毒素72小时以上，按照GB/17480-2008饲料中黄曲霉毒素B₁的测定方法-酶联免疫吸附法，测定降解后黄曲霉毒素B₁含量。降解毒性试验结果如表1。

表1糙皮侧耳发酵液制剂降解水溶液中黄曲霉毒素B₁结果

注：表中结果数据单位为μg/kg。

由表1中试验结果说明，在黄曲霉毒素B₁含量为10.9μg/kg溶液中，添加3‰糙皮侧耳发酵液制剂，对黄曲霉毒素B₁降解率≥85.32％；黄曲霉毒素B₁含量为50.6μg/kg溶液中，添加6‰糙皮侧耳发酵液制剂，对黄曲霉毒素B₁降解率≥83.8％；黄曲霉毒素B₁含量为98.9μg/kg溶液中，添加9‰糙皮侧耳发酵液制剂，对黄曲霉毒素B₁降解率≥81.5％。汇总表1试验结果，水溶液中黄曲霉毒素B₁含量≤98.9μg/kg时，分别添加≤9‰糙皮侧耳发酵液制剂，对毒素降解率可达81.5％以上。

解毒试验2

同样，分别取玉米饲料的3‰、6‰、9‰比例(W:W)糙皮侧耳发酵液制剂，加入一定量水稀释后，再分别与含11.0μg/kg、54.3μg/kg、97.7μg/kg黄曲霉毒素B₁的玉米饲料混匀，以玉米饲料表面湿润为好(带有一定水珠)，密闭在37℃条件下，保温降解72小时以上，按照GB/17480-2008饲料中黄曲霉毒素B₁的测定方法-酶联免疫吸附法，测定降解后玉米饲料中黄曲霉毒素B₁含量，测定结果如表2。

表2糙皮侧耳发酵液制剂降解玉米饲料中黄曲霉毒素B₁结果

注：表中结果数据单位为μg/kg。

由表2结果得出：采用糙皮侧耳发酵液制剂，降解玉米饲料中黄曲霉毒素B₁含量在11.0μg/kg时，加糙皮侧耳发酵液制剂量3‰，其解毒率≥80.00％；黄曲霉毒素B₁含量在54.3μg/kg时，加糙皮侧耳发酵液制剂量6‰，其解毒率≥68.32％；黄曲霉毒素B₁含量在97.7μg/kg时，加糙皮侧耳发酵液制剂量9‰，其解毒率≥73.29％。

解毒试验3

分别取豆粕饲料的3‰、6‰、9‰比例(W:W)糙皮侧耳发酵液制剂，加入水稀释后重量与豆粕重量相同的，再分别与含13.3μg/kg、44.1μg/kg、93.5μg/kg黄曲霉毒素B₁的豆粕饲料混匀，密闭在37℃条件下，保温解毒72小时以上，按照GB/17480-2008饲料中黄曲霉毒素B₁的测定方法-酶联免疫吸附法，测定降解后豆粕饲料中黄曲霉毒素B₁含量，测定结果见表3。

表3糙皮侧耳发酵液制剂降解豆粕饲料中黄曲霉毒素B₁结果

注：表中结果数据单位为μg/kg。

结果显示，糙皮侧耳发酵液制剂用于降解豆粕饲料中黄曲霉毒素B₁,在加大了豆粕的湿度后，黄曲霉毒素含量13.4μg/kg，添加3‰发酵制剂，降解率≥81.34％；黄曲霉毒素B₁含量44.1μg/kg，添加6‰比例，降解率≥71.43％；黄曲霉毒素B₁含量93.5μg/kg，添加9‰比例，降解率≥75.40％。比较降解试验2和3实验结果，对于固体饲料中黄曲霉毒素B₁降解，增加体系含水量有利于发酵液制剂降解黄曲霉毒素B₁的作用效果。

由解毒试验1、2、3结果得出，采用糙皮侧耳发酵液制剂降解黄曲霉毒素B₁毒性，在水溶液中解毒效果好于固体玉米、豆粕饲料中，在水溶液体系中更有利于催化反应进行。固体饲料中黄曲霉毒素B₁污染量≤15μg/kg，该发酵制剂按3‰添加，解毒率≥80％；污染量≤54.3μg/kg，添加6‰发酵液制剂，解毒率≥68.32％；污染量≤97.7μg/kg，添加9‰发酵液制剂，解毒率≥73.29％。按照实际情况，一般饲料中黄曲霉毒素B₁污染≤54.3μg/kg，按≥6‰比例添加糙皮侧耳发酵液制剂，降解后均符合国家对饲料中黄曲霉毒素B₁限量要求(≤20μg/kg)。增大发酵制剂添加比例，解毒效果更好。

Claims (8)

1.糙皮侧耳发酵液的制备方法，是将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CICC 14012接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌发酵培养基中进行通气发酵制成发酵液；其特征在于：

发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

土豆淀粉6.0％-7.0％，蔗糖1.8％-2.2％，酵母膏0.18％-0.22％，硫酸铵0.29％-0.33％，磷酸二氢钾0.25％-0.30％，硫酸镁0.15％-0.18％，维生素B₁0.0001％-0.0003％，微量元素溶液5.0％-6.0％，藜芦醇430μL/L-470μL/L，吐温800.1％-0.13％，余量为无菌水，pH＝4.9-5.3；

微量元素溶液由以下原料组成：

氯化钙1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锌100mg，硫酸铜150mg，硫酸锰1000mg，硫酸钴200mg，硫酸铝钾20mg，硼酸10mg，钼酸钠20mg，定容至1000mL；

通气发酵的工艺条件如下：

接种量为体积比＝6-8∶100，温度为26℃-28℃,通气量为1∶0.7-1.2vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养周期为不低于240小时。

2.根据权利要求1所述的糙皮侧耳发酵液的制备方法，其特征在于所述的糙皮侧耳菌种在接入无菌发酵培养基前经过扩大培养。

3.根据权利要求2所述的糙皮侧耳发酵液的制备方法，其特征在于所述的扩大培养包括斜面菌种、平皿菌种的制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。

4.根据权利要求3所述的糙皮侧耳发酵液的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种的制备采用马铃薯培养基，平皿菌种的制备采用葡萄糖培养基，温度为25℃-27℃，培养周期为4-5天。

5.根据权利要求3所述的糙皮侧耳发酵液的制备方法，其特征在于所述的一级种子的制备以及二级种子的制备中种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：

土豆汁18％-21％，葡萄糖1.8％-2.2％，酵母膏0.25％-0.30％，硫酸铵0.29％-0.33％，磷酸二氢钾0.25％-0.30％，硫酸镁0.15％-0.18％，维生素B₁0.0001％-0.0003％，微量元素溶液3.5％-4.5％，余量为无菌水，pH＝5.0-5.5；

微量元素溶液由如下质量的原料组成：

氯化钙1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锌100mg，硫酸铜150mg，硫酸锰1000mg，硫酸钴200mg，硫酸铝钾20mg，硼酸10mg，钼酸钠20mg，定容至1000mL。

6.根据权利要求3或5所述的糙皮侧耳发酵液的制备方法，其特征在于所述的一级种子的制备采用如下工艺步骤：

挑选生长旺盛、健壮的平皿菌种，在菌丝生长旺盛部位切成直径7mm-13mm圆片，按每瓶3-5片接种量将其接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在温度为26℃-28℃条件下振荡培养85-96小时制成一级种子；装量为1000ml的三角瓶装入160-200ml一级种子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为一级种子培养终点。

7.根据权利要求3或5所述的糙皮侧耳发酵液的制备方法，其特征在于所述的二级种子的制备采用如下工艺步骤：

按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝9-11∶100的比例，将一级种子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝60-70:100，在温度为26℃-28℃，通气量为1∶0.5-0.7vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为二级种子培养终点。

8.根据权利要求1所述的方法制备的糙皮侧耳发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。