KR20170031254A - 췌장 전구 세포의 증식 방법 - Google Patents

췌장 전구 세포의 증식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포를 소스로 췌장 전구 세포를 분화 유도하고, 이를 배양/증식하여, 고순도 췌장 전구 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 췌장 전구 세포를 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는 췌장 전구 세포의 증식 방법에 관한 것이다.

Description

췌장 전구 세포의 증식 방법 {METHOD FOR PROLIFERATION OF PANCREATIC PROGENITOR CELLS}
관련 출원
본 출원은 일본 특허 출원 2014-158470 호 (2014 년 8 월 4 일 출원) 에 기초한 우선권을 주장하며, 이 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 췌장 전구 세포의 증식 방법, 및 췌장 전구 세포 증식용 시약 및 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 췌장 전구 세포를 EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자, 및 ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 췌장 전구 세포의 증식 방법, 및 상기 방법용 시약 및 키트에 관한 것이다.
췌장은 내분비선 (내분비 세포) 과 외분비선 (외분비 세포) 을 갖는다. 내분비 세포인 췌장 α 세포, 췌장 β 세포, 췌장 δ 세포, 및 PP 세포에서 각각 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드 등 췌장 호르몬이 분비되고, 외분비 세포에서 췌장 리파아제, 트립신, 엘라스타제, 및 췌장 아밀라아제 등의 소화 효소가 분비된다.
당뇨병은 I 형 당뇨병 (인슐린 의존성 당뇨병) 및 II 형 당뇨병 (인슐린 비 의존성 당뇨병) 의 2 가지로 크게 분류된다. 이 중, I 형 당뇨병은 인슐린을 생산하는 췌장 β 세포의 파괴에 의한 인슐린 분비 부전에 의해 발생한다. I 형 당뇨병에 최근 시도되고 있는 치료법으로 환자 유래의 췌장 β 세포를 재생하여 이식하는 방법과, ES 세포나 iPS 세포에서 분화 유도한 췌장 β 세포를 이식하는 방법 이외에, 췌장 전구 세포를 이식해 당뇨병을 감약시키는 방법이 알려져 있다.
상기 치료법에 관련하여, 내배엽 세포의 증식 방법, 얻어진 내배엽 세포에서 β 세포의 유도 방법 (특허문헌 1), 인간 다능성 줄기 세포에서 증식성 내배엽 세포의 유도 방법 (비특허문헌 1), 및 인간 다능성 줄기 세포에서 증식성 전장 내배엽 세포의 유도 방법 (비특허문헌 2) 에 관한 보고가 있다.
췌장 전구 세포에서 분화시킨 췌장 내분비 전구 세포를 증식하는 방법 (비특허문헌 3) 에 관한 보고도 있지만, 이러한 췌장 내분비 전구 세포를 간충 세포와 공배양하므로, 얻을 수 있는 췌장 내분비 전구 세포의 순도는 그다지 높지 않은 것으로 예상된다. 또한, 이 보고서에는 췌장 전구 세포의 증식 방법은 기재되어 있지 않다.
인간 ES 세포를 이용한 NKX6.1 양성 췌장 전구 세포의 유도 방법, 및 NKX6.1 고발현 췌장 전구 세포에 의한 당뇨병의 치료 (비특허문헌 4) 에 관한 보고가 있지만, 이 보고에 췌장 전구 세포의 증식 방법은 기재되어 있지 않다. 또한, 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포에서 인슐린 생산 세포를 분화 유도해, 마우스에 이식하여 당뇨병 치료에의 응용을 검토한 보고도 있지만, 이 보고에 췌장 전구 세포의 증식 방법은 나와 있지 않다 (비특허문헌 6 및 7).
생체에서 분리된 췌장 전구 세포는 계대 배양시에 증식을 정지하는 경우가 많으므로, 췌장 전구 세포를 생체 외에서 효율적으로 증식시키는 것은 어렵다. Sui들은 ES 세포 유래의 췌장 전구 세포를 B-27 (등록 상표) 서플리먼트, FGF10, EGF, 및 SB431542 (TGFβ 저해제) 를 포함하는 DMEM/F12 배지를 이용하여 증식시키는 방법에 대해 보고하고 있다 (비특허문헌 5). 그러나, 이 방법은 증식 스피드가 10 주에 약 30 배이고, 얻어지는 췌장 전구 세포의 순도는 약 50 % 이므로, 아직 충분하다고는 말할 수 없다.
특허문헌 1: US2010/0041150
비특허문헌 1: Xin Cheng et al., Cell Stem Cell 10 (2012), 371-384 비특허문헌 2: Hannan et al., Stem Cell Reports 1 (2013), 293-306 비특허문헌 3: Sneddon et al., Nature 491 (2012), 765-770 비특허문헌 4: Rezania et al., Stem Cells 31 (2013), 2432-2442 비특허문헌 5: Lina Sui et al., Stem Cell Rev and Rep 9 (2013), 569-577 비특허문헌 6: Rezania et al., Nature Biotechnology 32 (2014), 1121-1133 비특허문헌 7: Pagliuca et al., Cell 159 (2) (2014), 428-439
본 발명의 과제는 췌장 전구 세포를 그의 기능을 유지하면서 생체 외에서 효율적으로 증식시키는 것에 있다. 특히, 본 발명의 과제는 ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포를 소스로 이용해 췌장 전구 세포를 분화 유도하고, 이를 배양·증식하여, 순도가 높은 췌장 전구 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 췌장 전구 세포를 EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자, 및 ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양함으로써, 고효율로 고순도의 췌장 전구 세포를 얻을 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성시켰다.
구체적으로, 본 발명은 다음의 [1] ~ [8] 에 관한 것이다.
[1] 췌장 전구 세포를 이하의 공정 (1) 에 적용하는 것을 포함하는, 췌장 전구 세포의 증식 방법 (본 명세서에서, 본 발명의 증식 방법이라고 칭하는 경우도 있다):
(1) 췌장 전구 세포를 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;
[2] 배지가 추가로 (iii) Wnt 시그널 저해제를 포함하는, 상기 [1] 기재의 증식 방법;
[3] 췌장 전구 세포가 PDX1 양성 세포를 (a) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (b) Wnt 시그널 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 유도된 췌장 전구 세포인, 상기 [1] 또는 [2] 기재의 증식 방법;
[4] (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는, 췌장 전구 세포의 증식용 시약;
[5] (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는, 췌장 전구 세포의 증식용 키트;
[6] 췌장 전구 세포를 증식시키기 위한, (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제의 용도;
[7] 췌장 전구 세포를 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 증식시키는 공정; 및 배양물 중에서 췌장 전구 세포를 채취하는 공정을 포함하는, 췌장 전구 세포의 제조 방법;
[8] PDX1 양성 세포를 (a) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (b) Wnt 시그널 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여, 췌장 전구 세포로 분화 유도시키는 단계를 추가로 포함하는, 상기 [7] 기재의 제조 방법.
또한, 상기 [1] ~ [8] 에서, 췌장 전구 세포 및 PDX1 양성 세포는 바람직하게는 인간 췌장 전구 세포 및 인간 PDX1 양성 세포이다.
본 발명에 의하면, 생체 외에서 증식시키는 것이 어려운 췌장 전구 세포를 고효율 및 고순도로 제조할 수 있다. 본 발명의 방법은 생체 유래의 췌장 전구 세포 이외에 ES 세포와 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포에서 분화 유도한 췌장 전구 세포에도 적용할 수 있다. 얻어진 췌장 전구 세포는 그대로 또는 췌장 β 세포 등으로 분화 유도하여 당뇨병의 치료와 당뇨병 치료약의 시험 방법 등에 이용할 수 있다.
[도 1] 도 1 은 실시예 1 에서 유도한 췌장 전구 세포의 염색 이미지이다. 보여지는 결과는 (i) 컨트롤 및 (ii) XAV939, (iii) bFGF, 및 (iv) XAV939 + bFGF 의 첨가에 관한 것이다. NKX6.1 양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색을, PDX1 양성 세포는 Alexa 488 에 의해 녹색을 나타내고, 세포의 핵은 회흐스트 33342 에 의해 청색을 나타냈다. XAV939 와 bFGF 를 함께 첨가한 경우에 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 세포의 비율이 가장 높았다.
[도 2] 도 2 는 실시예 2 에서 유도한 췌장 전구 세포의 염색 이미지이다. 보여지는 결과는 (i) XAV939, (ii) XAV939 + EGF, (iii) XAV939 + 베타셀룰린, 및 (iv) XAV939 + bFGF 의 첨가에 관한 것이다. NKX6.1 양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색을, PDX1 양성 세포는 Alexa 488 에 의해 녹색을 나타내고, 세포의 핵은 회흐스트 33342 에 의해 청색을 나타냈다. bFGF 와 XAV939 를 함께 첨가한 경우 이외에, EGF 와 XAV939 를 함께 첨가한 경우와 베타셀룰린과 XAV939 를 함께 첨가한 경우에 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 세포의 비율이 높았다.
[도 3] 도 3 은 실시예 3 에서 297L 세포에서 유도된 췌장 전구 세포의 염색 이미지이다. NKX6.1 양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색을, PDX1 양성 세포는 Alexa 488 에 의해 녹색을 나타내고, 세포의 핵은 회흐스트 33342 에 의해 청색을 나타냈다. 297L1 세포주를 이용한 경우에도 XAV939 와 bFGF 를 함께 첨가함으로써 대부분의 세포를 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 세포로 유도할 수 있었다.
[도 4] (A) 계대 1 일 후 (왼쪽) 와 계대 4 일 후 (오른쪽) 의 세포의 사진을 보여준다. 췌장 전구 세포 (297L1 유래, 계대수: 4) 를 배양 용기에서 떼어낸 후, 세포의 일부를 다른 배양용기에 계대 배양했다. 배양 1 일째에는 세포 밀도가 낮은 상태이지만, 배양 4 일째에는 세포 밀도가 높아졌다. 도 4 (B) 는 계대수와 세포량의 관계를 나타낸다. 췌장 전구 세포를 증식시킨 후, 일부 세포를 계대하고 또한 증식시키는 조작을 21 회 계속했다. 각 계대시의 세포량을 측정하는 것으로, 하나의 세포가 계대수가 증가함에 따라 몇 개의 세포수로 증식했는지를 산출했다. 세포는 안정적인 스피드로 증식했으며, 계대를 21 회 거듭하면서 하나의 세포가 1x1018 개의 세포로 증가하는 스피드로 증식한 것으로 밝혀졌다.
[도 5] 5 회 계대한 췌장 전구 세포 (왼쪽) 와 66 회 계대한 췌장 전구 세포 (오른쪽) 에 대해 항 PDX1 항체와 항 NKX6.1 항체를 이용한 면역 형광 염색을 했다. NKX6.1 양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색을, PDX1 양성 세포는 Alexa 488 에 의해 녹색을 나타내고, 세포의 핵은 회흐스트 33342 에 의해 청색을 나타냈다. 5 회 계대한 세포에서도 66 회 계대한 세포에서도 대부분의 세포는 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성임을 알 수 있다.
[도 6] 도 6 은 계대를 28 회 반복한 후의 췌장 전구 세포에 카르누아 고정후, Q 밴드의 핵형 분석을 실시한 결과를 나타낸다. 세포가 모든 염색체를 정상적으로 갖추고 있는 것을 알 수 있다.
[도 7] 도 7 은 계대수 44 의 췌장 전구 세포를 단일 세포 상태로 한 후, 도면의 인자를 포함하는 배양액 중에 파종하여 2 일간 배양한 후, 항 PDX1 항체와 항 NKX6.1 항체를 이용하는 면역 형광 염색을 실시한 결과를 나타낸다. 보여지는 결과는 (i) 컨트롤 및 (ii) Y27632, (iii) bFGF, (iv) XAV939, (v) bFGF + Y27632, (vi) Y27632 + XAV939, (vii) bFGF + XAV939, 및 (viii) bFGF + Y27632 + XAV939 의 첨가에 관한 것이다. NKX6.1 양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색을, PDX1 양성 세포는 Alexa 488 에 의해 녹색을 나타내고, 세포의 핵은 회흐스트 33342 에 의해 청색을 나타냈다. bFGF 와 Y27632 와 XAV939 를 함께 첨가한 경우 이외에 Y27632 와 bFGF 를 함께 첨가한 경우와 bFGF 와 XAV939 를 함께 첨가한 경우에도 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 세포가 증식하고 있는 모습이 관찰되었다.
[도 8] 도 8 은 실시예 6 에서 NTE-1-7 (왼쪽), NTE-1-8 (중간), 및 NTE-1-9 (오른쪽) 의 각 iPS 세포주에서 유도한 췌장 전구 세포의 염색 이미지이다. NKX6.1 양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색을, PDX1 양성 세포는 Alexa 488 에 의해 녹색을 나타내고, 세포의 핵은 회흐스트 33342 에 의해 청색을 나타냈다. 어떤 인간 iPS 세포에서 분화 유도시켜 2 회 계대한 경우에도 대부분의 세포가 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성이 되는 것을 알 수 있다.
[도 9] 도 9 는 참고예 3 에서 유도한 인슐린 양성 세포의 염색 이미지이다. 보여지는 결과는 컨트롤 (왼쪽) 및 Alk5 저해제 II 를 포함하는 배지를 이용하여 배양한 세포 (오른쪽) 이다. 인슐린 양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색을, NKX6.1 양성 세포는 Alexa 488 에 의해 녹색을 나타내고, 세포의 핵은 회흐스트 33342 에 의해 청색을 나타냈다. 분화 유도 인자인 Alk5 저해제 II 를 포함하는 배지를 이용하여 배양함으로써, 췌장 전구 세포에서 인슐린 양성 세포가 분화 유도되는 것을 알 수 있다.
발명을 실시하기 위한 형태
1. 용어의 설명
이하, 본 발명 및 본 명세서에서 사용되는 용어에 대하여 설명한다.
본 발명에 따른 "췌장 전구 세포" 는 췌장 내분비 세포 및 췌장 외분비 세포로 분화할 수 있는 내중배엽계 세포이며, PDX1 양성, NKX6.1 양성 및 INS (인슐린) 음성에 의해서 특징지어진다. 본 발명에 따른 "췌장 전구 세포" 는 포유 동물 유래이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인간 췌장 전구 세포이다.
췌장 전구 세포는 적당한 조건에서 배양함으로써 인슐린 생산능을 가지는 "췌장 β 세포 (본 명세서에서, "인슐린 분비 세포" 와 동의어)" 로 분화 유도할 수 있다. "췌장 β 세포" 는 PDX1 양성, NKX6.1 양성 및 INS 양성으로 특징지어진다.
본 발명에 따른 "PDX1 양성 세포" 는 PDX1 양성, NKX6.1 음성 및 INS 음성에 의해서 특징지어진다. "PDX1 양성 세포" 는 예를 들어, ES 세포 (배아 줄기 세포) 나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포에서 내배엽 세포를 거쳐 분화 유도할 수 있다. "내배엽 세포" 는 내배엽계의 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는 세포로서 내배엽 마커인 SOX17 및 FOXA2 양성에 의해서 특징지어진다. 본 발명에 따른 "PDX1 양성 세포" 는 포유 동물 유래이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인간 PDX1 양성 세포이다.
"다능성 줄기 세포" 는 ES 세포와 비슷한 분화 다능성, 즉 생체의 다양한 조직 (내배엽, 중배엽, 외배엽 전부) 으로 분화하는 능력을 잠재적으로 갖는 세포이며, 다능성 세포에서 특이적으로 발현하는 전사 인자인 Oct3/4 양성 및 Nanog 양성에 의해서 특징지어진다.
특히, 포유 동물 체세포 또는 미분화 줄기 세포에 특정 인자 (핵 초기화 인자) 를 도입하여, ES 세포와 비슷한 분화 다능성을 가지도록 재프로그래밍된 세포를 "인공 다능성 줄기 세포" 라고 부른다.
현재, "인공 다능성 줄기 세포" 에는 여러 가지가 있으며, Yamanaka들에 의해 마우스 섬유 아세포에 4 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc) 를 도입함으로써 처음 수립된 iPS 세포 (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006), 126: 663-676) 외에도, 유사한 4 가지 인자를 인간 섬유 아세포에 도입하여 수립된 인간 iPS 세포 (Takahashi K, Yamanaka S., et al., Cell, (2007), 131: 861-872), 상기 4 가지 인자의 도입 후 Nanog 의 발현을 지표로 선별하여 수립한 Nanog-iPS 세포 (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S, (2007), Nature 448, 313-317), 및 c-Myc 를 포함하지 않는 방법으로 제작된 iPS 세포 (Nakagawa M, Yamanaka S., et al., Nature Biotechnology, (2008), 26, 101-106) 도 사용할 수 있다.
또한, 위스콘신대 Thomson들에 의해 제작된 인공 다능성 줄기 세포 (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007), 318: 1917-1920), 하버드대 Daley들에 의해 제작된 인공 다능성 줄기 세포 (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007), 451: 141-146), 및 Sakurada들에 의해 제작된 인공 다능성 줄기 세포 (특개 2008-307007 호) 등도 사용할 수 있다.
이 밖에, 공개되는 모든 논문 (예를 들어, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008), Vol. 3, Issue 5, 568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008), 454, 646-650; 및 Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008), 26, No. 7,795-797) 또는 특허 (예를 들어, 일본 특허 공개 2008-307007 호, 일본 특허 공개 2008-283972 호 US2008-2336610, US2009-047263, WO2007-069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009-006930, WO2009-006997, WO2009-007852) 에 기재된 해당 분야에서 공지된 인공 다능성 줄기 세포도 이용할 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포는 본 발명에 따른 PDX1 양성 세포의 소스로서 바람직하게 사용할 수 있다. PDX1 양성 세포는 예를 들어, WO2011-081222 에 기재된 방법에 따라 인공 다능성 줄기 세포에서 분화 유도함으로써 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "다능성 줄기 세포" 와 "인공 다능성 줄기 세포" 는 포유 동물 유래이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포이다.
본 발명에 따른 세포는 여러 마커의 발현에 의해서 특징지어진다.
　이 중, "PDX1 (췌장-십이지장 호메오박스 1 (pancreatic-duodenal homeobox 1))" 는 인슐린 프로모터 인자 1 로도 알려져 있고, 췌장의 발생 및 β 세포 분화에 중요한 역할을 갖는 동시에 생체 내의 췌장 β 세포의 기능 유지에 관여하는 전사 인자이다. "NKX6.1" 도 PDX1 과 마찬가지로 β 세포 분화에 중요한 역할을 갖는 동시에 생체 내의 췌장 β 세포의 기능 유지에 관여하는 전사 인자이다. 한편, "INS (인슐린)" 는 세포내 인슐린을 나타내며, 췌장 전구 세포에서 췌장 β 세포 (인슐린 생산 세포) 로 분화되면서 발현이 항진한다.
상기 마커의 발현은 항체를 이용한 면역 염색과 RT-PCR 등에 의해 정량적으로 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 "EGF 시그널 전달 활성화인자" 는 EGF (상피 세포 증식 인자) 수용체 패밀리를 통한 시그널 전달 경로를 활성화하는 모든 물질을 포함하고, 예를 들어, EGF (특히, 인간 EGF), 그의 기능적 아날로그, TGFα, HB-EGF, 암피레굴린, 베타셀룰린, 및 에피레굴린 등을 들 수 있다. 바람직하게는 EGF 시그널 전달 활성화인자는 EGF (특히, 인간 EGF) 또는 베타셀룰린이다.
본 발명에 따른 "FGF 시그널 전달 활성화인자" 는 FGF (섬유 아세포 증식 인자) 수용체 패밀리를 매개하여 시그널 전달 경로를 활성화하는 모든 물질을 포함하고, 예를 들어, aFGF (FGF1), bFGF (FGF2), FGF3 ~ 23 및 이의 기능적 아날로그 등을 들 수 있다. 바람직하게는 FGF 시그널 전달 활성화인자는 bFGF, 특히 인간 bFGF 이다.
본 발명에 따른 "ROCK 저해제" 는 Rho 키나제 (ROCK: Rho-관련, 코일드-코일 함유 단백질 키나제 (Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase)) 를 저해하는 물질을 의미하며, ROCK I 과 ROCK II 중 어느 것을 저해하는 물질일 수 있다. ROCK 저해제는 위의 기능을 갖는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, N-(4-피리디닐)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르복사미드 (본 명세서에서, Y-27632 라고 칭하는 경우도 있다), Fasudil (HA1077), (2S)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 (즉, H-1152), 4β-[(1R)-1-아미노에틸]-N-(4-피리딜)벤젠-1α-카르복사미드 (즉, Wf-536), N-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4PER(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르복사미드 (즉, Y-30141), N-(3-{[2-(4-아미노-1,2,5-옥사 디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시}페닐)-4-{[2-(4-모르폴리닐)에틸]-옥시}벤즈아미드 (즉, GSK269962A), 및 N-(6-플루오로-1H-이미다졸-5-일)-6-메틸-2-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-3,4-디히드로-1H-피리딘-5-카르복사미드 (즉, GSK429286A); ROCK 에 대한 항체 (기능적 단편 포함), 안티센스 핵산 및 siRNA; ROCK 의 안타고니스트 및 도미넌트 네가티브 형; 및 기타 공지의 ROCK 저해제 (예를 들어, US2005-0209261, US2005-0192304, US2004-0014755, US2004-0002508, US2004-0002507, US2003-0125344, WO2003/082808, US2003-0087919, WO2005/035506, WO2005/074643, WO2004/039796, WO2003/062227, WO2003/062225, WO2003/059913, WO2002/076976, WO2002/076977, WO01/17562, WO00/78351, WO98/06433 참조) 를 이용할 수 있다. 바람직하게는 ROCK 저해제는 N-(4-피리디닐)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르복사미드 (즉, Y-27632) 이다.
본 발명에 따른 "Wnt 시그널 저해제" 는 Wnt 로 매개되는 시그널 전달 경로를 저해하는 물질로서, 예를 들어 IWP2, IWP3, IWP4, 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-7,8-디히드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4(3H)-온 (본 명세서에서, XAV939 라고 칭하는 경우도 있다), IWR1, G-CSF, IGFBP4, Dkk1, Cerberus, 항 Wnt 항체, Wnt 아고니스트 (Wnt 수용체 저해제), 가용형 Wnt 수용체 단백질 (Frzb-1 등), 및 도미넌트 네거티브체 등을 들 수 있다. 바람직하게는 Wnt 시그널 저해제는 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-7,8-디히드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4(3H)-온 (즉, XAV939) 이다.
2. 췌장 전구 세포의 증식 방법
본 발명의 췌장 전구 세포의 증식 방법은 췌장 전구 세포를 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 또한, 상기 증식 방법으로 췌장 전구 세포를 증식시키는 공정을 본 명세서에서는 증식 공정이라고 부를 수 있다.
증식 공정에서 사용되는 "배지" 는 줄기 세포의 배양에 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 기초 배지로는 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 무혈청 DMEM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지를 들 수 있다. 기초 배지는 바람직하게는 무혈청 DMEM/F12 배지, RPMI 1640 배지, 또는 Improved MEM Zinc Option 배지, 특히 바람직하게는 Improved MEM Zinc Option 배지이다.
배지는 혈청 및/또는 혈청 추출물을 실질적으로 포함하지 않는 배지가 바람직하고, 무혈청 배지가 보다 바람직하다. "실질적으로 포함하지 않는" 은 혈청의 함량이 약 1 용량% 미만, 바람직하게는 약 0.1 용량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 용량% 미만임을 의미한다. "무혈청 배지" 는 무조정 또는 미정제의 혈청이 포함되지 않은 배지를 의미하고, 정제된 혈액 유래 성분과 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 증식 인자) 이 혼입되어 있는 배지는 무혈청 배지에 해당한다.
배지는 "혈청 대체물" 을 포함할 수도 있다. 혈청 대체물로서, 예를 들어 알부민 (예를 들어, 지질 리치 알부민), 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어, 아연, 및 셀레늄), B-27 (등록 상표) 서플리먼트, N2 서플리먼트, 녹아웃 세럼 리플레이스먼트 (Invitrogen 사제), 2-메르캅토에탄올, 및 3'-티오글리세롤 등을 들 수 있다. 배지 중의 농도는 혈청 대체물이 B-27 (등록 상표) 서플리먼트인 경우 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다.
배지는 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함한다.
배지 중의 EGF 시그널 전달 활성화인자의 농도는 사용되는 물질 (인자) 의 종류에 따라 적절히 설정되지만, 통상적으로 약 0.01 nM ~ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ~ 100 μM 이다. EGF 의 경우, 그의 배지 중의 농도는 약 0.005 ~ 2.0 μg/ml (즉, 약 0.8 ~ 320 nM), 바람직하게는 약 0.005 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 0.8 ~ 160 nM), 더욱 바람직하게는 약 0.01 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 1.6 ~ 160 nM) 이다.
배지에 포함된 FGF 시그널 전달 활성화인자의 예로는 앞서 예시한 "FGF 시그널 전달 활성화인자" 를 들 수 있고, 바람직하게는 bFGF (특히, 인간 bFGF) 이다. 배지 중의 FGF 시그널 전달 활성화인자의 농도는 사용되는 물질 (인자) 의 종류에 따라 적절히 설정되지만, 통상적으로 약 0.01 nM ~ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ~ 100 μM 이다. FGF 의 경우, 그의 배지 중의 농도는 약 0.005 ~ 2.0 μg/ml (즉, 약 0.3 ~ 116 nM), 바람직하게는 약 0.005 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 0.3 ~ 58 nM), 더욱 바람직하게는 약 0.01 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 0.6 ~ 58 nM) 이다. 또한 EGF 시그널 전달 활성화인자와 FGF 시그널 전달 활성화인자를 함께 사용하는 경우, 각 인자를 상기한 농도 범위에 기초하여 적절히 증감하여 사용한다.
배지에 포함된 ROCK 저해제의 예로는 앞서 예시한 "ROCK 저해제" 를 들 수 있고, 바람직하게는 N-(4-피리디닐)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르복사미드 (즉, Y-27632) 이다.
배지 중의 ROCK 저해제의 농도는 사용되는 물질 (에이전트) 의 종류에 따라 적절히 설정되지만, 통상적으로 약 0.01 nM ~ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ~ 100 μM 이다. Y-27632 의 경우, 그의 배지 중의 농도는 약 0.1 ~ 100 μM, 바람직하게는 약 1.0 ~ 30 μM, 보다 바람직하게는 약 2.0 ~ 20 μM 이다.
배지는 Wnt 시그널 저해제를 추가로 포함할 수 있다.
배지에 포함된 Wnt 시그널 저해제의 예로는 앞서 예시한 "Wnt 시그널 저해제" 를 들 수 있고, 바람직하게는 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-7,8-디히드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4(3H)-온 (즉, XAV939) 이다.
배지 중의 Wnt 시그널 저해제의 농도는 사용되는 물질 (에이전트) 의 종류에 따라 적절히 설정되지만, 통상적으로 약 0.01 nM ~ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ~ 100 μM 이다. XAV939 의 경우, 그의 배지 중의 농도는 약 0.1 μM 이상, 바람직하게는 약 0.1 ~ 10 μM, 보다 바람직하게는 약 0.2 ~ 5 μM 이다.
배지에 사용되는 물질 (인자 또는 에이전트) 로서, FGF 시그널 전달 활성화인자가 bFGF (특히, 인간 bFGF) 이며, ROCK 저해제가 N-(4-피리디닐)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르복사미드 (즉, Y-27632) 인 것이 바람직하다.
배지는 또한 Wnt 시그널 저해제를 추가로 포함하여도 좋고, 그 경우 Wnt 시그널 저해제가 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-7,8-디히드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4(3H)-온 (즉, XAV939) 인 것이 바람직하다.
EGF 시그널 전달 활성화인자, FGF 시그널 전달 활성화인자, ROCK 저해제, 또는 Wnt 시그널 저해제는 어느 것이나 복수 종을 함께 사용하는 경우 각 인자 또는 저해제를 상기한 농도 범위에 기초하여 적절히 증감하여 사용한다.
상기 증식 공정에서의 세포 배양에서, 배지가 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다. "실질적으로 포함하지 않는" 은 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물의 배지 중의 함량이 약 5 용량% 미만, 바람직하게는 약 1 용량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 용량% 미만인 것을 의미한다. 그러면 피더 세포에서 유래하는 이물의 혼입을 방지하고 거부 반응의 리스크를 회피할 수 있다.
상기 증식 공정에서 사용되는 용기는 췌장 전구 세포의 배양이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않는다. 용기로는 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로슬라이드, 챔버 슬라이드, 페트리 디쉬, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 보틀을 들 수 있다. 부유 배양의 경우, 용기는 소수성의 재질을 이용한 것이나, 하이드로겔 및 지질 등 세포나 단백질의 흡착을 방지하는 소재를 코팅한 것이 바람직하다. 세포의 응집괴를 효율적으로 형성시키기 위해서는, 용기는 U 자 또는 V 자 형상의 저면을 갖는 것이 바람직하다. 한편, 접착 배양의 경우에는, 후술하는 대로 용기는 세포 접착성인 것이 바람직하다.
본 발명의 증식 방법에서, 췌장 전구 세포는 접착 배양 또는 부유 배양으로 유도될 수 있다. 접착 배양의 경우, 디쉬, 플라스크, 마이크로플레이트, 또는 OptiCell (등록 상표) (Nalge Nunc International) 등의 세포 배양 시트 등이 사용되지만, 용기는 세포와의 접착성 (친수성) 을 향상시키기 위해 표면 처리되거나, 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 라미닌, 또는 피브로넥틴 등의 세포 지지용 기질로 코팅되는 것이 바람직하다. 특히 Type I-콜라겐, BD 마트리겔 (일본 백톤 디킨슨 사), 피브로넥틴, 비트로넥틴 등이 바람직하게 사용된다.
배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 약 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 일 수 있다. CO2 농도는 약 1 ~ 10 %, 바람직하게는 약 3 ~ 8 % 일 수 있다. 산소 분압은 1 ~ 10 % 일 수 있다.
증식된 세포가 췌장 전구 세포인 것은 상술한 PDX1 과 NKX6.1 의 발현을 면역 염색 등을 이용하여 검출함으로써 확인할 수 있다.
증식 공정에서, 배지 중의 ROCK 저해제를 Wnt 시그널 저해제로 대체한 경우에도 췌장 전구 세포를 증식시킬 수 있다.
3. PDX1 양성 세포에서 췌장 전구 세포의 유도
췌장 전구 세포로는 PDX1 양성 세포를 (a) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (b) Wnt 시그널 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 유도된 췌장 전구 세포를 사용할 수 있다. 또한 PDX1 양성 세포를 상기 배지에서 배양함으로써 췌장 전구 세포를 유도하는 공정을 본 명세서에서는 췌장 전구 세포의 분화 유도 공정이라고 부를 수 있다.
췌장 전구 세포의 분화 유도 공정에서 사용되는 배지 (본 명세서에서, 유도 배지라고 칭하는 경우가 있다) 는 줄기 세포의 배양에 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 기초 배지로는 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 무혈청 DMEM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이들의 혼합 배지를 들 수 있다. 바람직하게는 기초 배지는 무혈청 DMEM/F12 배지, RPMI 1640 배지, 또는 Improved MEM Zinc Option 배지, 특히 바람직하게는 Improved MEM Zinc Option 배지다.
유도 배지는 혈청 및/또는 혈청 추출물을 실질적으로 포함하지 않는 배지가 바람직하고, 무혈청 배지가 보다 바람직하다. "실질적으로 포함하지 않는" 은 혈청의 함량이 약 1 용량% 미만, 바람직하게는 약 0.1 용량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 용량% 미만임을 의미한다. "무혈청 배지" 는 무조정 또는 미정제 혈청이 포함되지 않은 배지를 의미하고, 정제된 혈액 유래 성분 또는 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 증식 인자) 이 혼입되어 있는 배지는 무혈청 배지에 해당한다.
유도 배지는 "혈청 대체물" 을 포함할 수도 있다. 혈청 대체물로서, 예를 들어 알부민 (예를 들어, 지질 리치 알부민), 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어, 아연, 및 셀레늄), B-27 (등록 상표) 서플리먼트, N2 서플리먼트, 녹아웃 세럼 리플레이스먼트 (Invitrogen 사제), 2-메르캅토에탄올, 및 3'-티올글리세롤 등을 들 수 있다. 배지 중의 농도는 혈청 대체물이 B-27 (등록 상표) 서플리먼트인 경우 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다.
유도 배지는 (a) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (b) Wnt 시그널 저해제를 포함한다.
유도 배지 중의 EGF 시그널 전달 활성화인자의 예로는 앞서 예시한 "EGF 시그널 전달 활성화인자" 를 들 수 있고, 바람직하게는 EGF (특히, 인간 EGF) 및 베타셀룰린이다.
유도 배지 중의 EGF 시그널 전달 활성화인자의 농도는 사용되는 물질 (인자) 의 종류에 따라 적절히 설정되지만, 통상적으로 약 0.01 nM ~ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ~ 100 μM 이다. EGF 의 경우 유도 배지 중의 농도는 약 0.005 ~ 2.0 μg/ml (즉, 약 0.8 ~ 320 nM), 바람직하게는 약 0.005 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 0.8 ~ 160 nM), 더욱 바람직하게는 약 0.01 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 1.6 ~ 160 nM) 이다.
유도 배지 중의 FGF 시그널 전달 활성화인자의 예로는 앞서 예시한 "FGF 시그널 전달 활성화인자" 를 들 수 있고, 바람직하게는 bFGF (특히, 인간 bFGF) 이다.
유도 배지 중의 FGF 시그널 전달 활성화인자의 농도는 사용되는 물질 (인자) 의 종류와 PDX1 양성 세포의 타입에 따라 적절히 설정되지만, 통상적으로 약 0.01 nM ~ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ~ 100 μM 이다. FGF 의 경우 유도 배지 중의 농도는 약 0.005 ~ 2.0 μg/ml (즉, 약 0.3 ~ 116 nM), 바람직하게는 약 0.005 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 0.3 ~ 58 nM), 더욱 바람직하게는 약 0.01 ~ 1.0 μg/ml (즉, 약 0.6 ~ 58 nM) 이다. 또한 EGF 시그널 전달 활성화인자와 FGF 시그널 전달 활성화인자를 함께 사용하는 경우, 각 인자를 상기한 농도 범위에 기초하여 적절히 증감하여 사용한다.
유도 배지 중의 Wnt 시그널 저해제의 예로는 앞서 예시한 "Wnt 시그널 저해제" 를 들 수 있고, 바람직하게는 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-7,8-디히드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4(3H)-온 (즉, XAV939) 이다.
유도 배지 중의 Wnt 시그널 저해제의 농도는 사용되는 물질 (에이전트) 의 종류와 PDX1 양성 세포의 타입에 따라 적절히 설정되지만, 통상적으로 약 0.01 nM ~ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ~ 100 μM 이다. XAV939 의 경우, 유도 배지 중의 농도는 약 0.01 μM 이상, 바람직하게는 약 0.01 ~ 10 μM, 보다 바람직하게는 약 0.2 ~ 5 μM 이다.
유도 배지에 사용되는 물질 (인자 또는 에이전트) 로는 EGF 시그널 전달 활성화인자가 EGF (특히, 인간 EGF) 또는 베타셀룰린이며, FGF 시그널 전달 활성화인자가 bFGF (특히, 인간 bFGF) 이며, Wnt 시그널 저해제가 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-7,8-디히드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4(3H)-온 (즉, XAV939) 인 것이 바람직하다.
EGF 시그널 전달 활성화인자, FGF 시그널 전달 활성화인자, 또는 Wnt 시그널 저해제는 어느 것이나 복수 종을 함께 사용하는 경우 각 인자 또는 저해제를 상기한 농도 범위에 기초하여 적절히 증감하여 사용한다.
췌장 전구 세포의 분화 유도 공정에서의 세포 배양은 증식 공정과 마찬가지로, 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 사용하지 않는 것이 바람직하다. 또한 세포 배양에 사용되는 용기도 증식 공정에서 기재한 것을 사용할 수 있다.
췌장 전구 세포의 분화 유도 공정에서, PDX1 양성 세포는 접착 배양 또는 부유 배양으로 유도될 수 있다. 접착 배양의 경우, 디쉬, 플라스크, 마이크로플레이트, 또는 OptiCell (등록 상표) (Nalge Nunc International) 등의 세포 배양 시트 등이 사용되지만, 용기는 세포와의 접착성 (친수성) 을 향상시키기 위해 표면 처리되거나 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 라미닌, 또는 피브로넥틴 등의 세포지지용 기질로 코팅되는 것이 바람직하다. 특히 Type I-콜라겐, BD 마트리겔 (일본 백톤 디킨슨 사), 피브로넥틴, 비트로넥틴 등이 바람직하게 사용된다.
배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 약 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 일 수 있다. CO2 농도는 약 1 ~ 10 %, 바람직하게는 약 3 ~ 8 % 일 수 있다. 산소 분압은 1 ~ 10 % 일 수 있다.
분화 유도된 세포가 췌장 전구 세포인 것은 상술한 PDX1 과 NKX6.1 의 발현을 면역 염색 등을 이용하여 검출함으로써 확인할 수 있다.
4. 췌장 전구 세포의 증식용 시약 및 키트
본 발명은 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 췌장 전구 세포의 증식용 시약 또는 키트를 제공한다.
본 발명의 시약은 상기 (i) 및 (ii) 를 미리 혼합하여 포함해도 되고, 사용시 조제할 수 있도록 별개의 포장 상태로 포함해도 된다. 본 발명의 시약은 또한 (iii) Wnt 시그널 저해제를 포함할 수 있다. 또한 필요에 따라 본 발명의 시약은 사용 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 (i) 및 (ii) 를 포함하는 시약을 필수 구성 요소로 포함한다. 본 발명의 키트는 상기 (i) 및 (ii) 를 사용시 조제할 수 있도록 별개의 상태로 포함하는 것이 바람직하지만, 미리 혼합된 상태로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 (i) 및 (ii) 이외에, (iii) Wnt 시그널 저해제를 추가로 포함할 수 있다. 또한 필요에 따라 배양용 용기, 배양용 용기의 코팅제, 배지, 배지 첨가 성분, 기타 기구, 췌장 전구 세포 확인용 시약 (항 PDX1 항체, 항 NKX6.1 항체 등), 사용 설명서 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 시약 및 키트의 대상이 되는 췌장 전구 세포는 환자 유래의 세포 또는 환자 유래의 세포에서 재생시킨 췌장 전구 세포 또는 ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포에서 유도된 췌장 전구 세포일 수 있다.
5. 췌장 전구 세포를 증식시키기 위한 용도
본 발명은 췌장 전구 세포를 증식시키기 위한 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제의 용도도 제공한다.
상기 용도는 성분 (i) 과 (ii) 를 조합하여 췌장 전구 세포를 증식시키는데 사용한다는 점에 특징이 있다. 또한, 상기 용도는 (i) 과 (ii) 에 Wnt 시그널 저해제를 조합하는 용도일 수 있다. 사용되는 췌장 전구 세포는 특별히 한정되지 않고, 환자 유래의 세포 또는 환자 유래의 세포에서 재생시킨 췌장 전구 세포 또는 ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포에서 유도된 췌장 전구 세포일 수 있다.
6. 췌장 전구 세포의 제조 방법
본 발명은 췌장 전구 세포를 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 증식시키는 공정; 및 배양물 중에서 췌장 전구 세포를 채취하는 공정을 포함하는, 췌장 전구 세포의 제조 방법을 제공한다.
췌장 전구 세포 배양 및 증식 공정은 상기 "2. 췌장 전구 세포의 증식 방법" 에 기재된 대로 실시할 수 있다. 따라서 배지는 또한 Wnt 시그널 저해제를 포함할 수 있다.
배양물 중에서의 췌장 전구 세포의 채취 (회수) 는 배양에 사용되는 용기에 따라 통상의 방법에 따라 실시한다. 예를 들어, 배양물 중의 췌장 전구 세포를 PBS 등의 버퍼로 세정한 후, 세포를 박리하는 효소액 (트립신 용액, 아큐타제 용액 등) 을 첨가하여 일정 시간 반응시킨다. 상기 반응 후, 배양액 등을 첨가한 후, 배양액을 여러 번 피펫팅하여 췌장 전구 세포를 배양 용기에서 박리시켜 회수할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 또한, 상기 증식 공정 전에 PDX1 양성 세포를 (a) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (b) Wnt 시그널 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 전구 세포로 분화 유도시키는 단계를 포함할 수도 있다. PDX1 양성 세포에서 췌장 전구 세포의 분화 유도는 상기 "3. PDX1 양성 세포에서 췌장 전구 세포의 유도 방법" 에 기재된 대로 실시할 수 있다.
7. 췌장 전구 세포의 이용
본 발명의 증식 방법 또는 제조 방법으로 얻어진 췌장 전구 세포는 증식능이 높고, 기능도 유지되고, 순도도 높다. 또한 피더 세포와 다른 세포와 공배양을 하지 않고 실질적으로 혈청 및 혈청 추출물을 포함하지 않는 배지를 사용하여 배양할 경우, 불순물을 포함하지 않고 안전성이 높은 췌장 전구 세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 췌장 전구 세포가 게놈에의 유전자 삽입을 수반하는 수법으로 제작된 인공 다능성 줄기 세포에서 유도된 세포인 경우, 당해 췌장 전구 세포는 인공 다능성 줄기 세포 유래의 핵 초기화 인자를 유지한다는 점에서 자연의 췌장 전구 세포와는 구별되지만, 그 기능은 자연의 췌장 전구 세포와 다른 것은 아니다.
이상과 같은 특성에서, 본 발명의 방법으로 얻어진 췌장 전구 세포는 당뇨병의 세포 치료에 유용하다. 예를 들어, 췌장 전구 세포를 당뇨병 환자에게 투여함으로써 당뇨병을 감약시키는 것이 가능하다 (Stem Cells. 2013 Nov; 31 (11): 2432-42).
또한, 본 발명의 방법으로 제조한 췌장 전구 세포는 종래 공지의 방법 (Stem Cell Research 2012, 8, 274-284) 을 사용하여 INS 양성의 인슐린 생산 세포 (췌장 β 세포) 로 분화 유도할 수 있으며, 얻은 췌장 β 세포를 당뇨병 환자에게 투여하여 당뇨병을 치료하는 것이 가능하다. 이러한 본 발명의 췌장 전구 세포와 본 발명의 췌장 전구 세포에서 유도된 췌장 β 세포를 포함하는 의약 (당뇨병 치료를 위한 세포 제제) 도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명의 방법으로 얻어진 췌장 전구 세포 또는 췌장 전구 세포에서 유도된 췌장 β 세포는 생체 내의 세포와 유사한 기능을 유지하고 있기 때문에 당뇨병 치료제의 스크리닝 또는 평가 시스템에서도 유용하다.
예를 들어, 시험 화합물의 존재 하에서 및 비존재 하에서 본 발명의 췌장 전구 세포 또는 췌장 전구 세포에서 유도된 췌장 β 세포를 배양하여, 상기 세포에서 인슐린 또는 그 mRNA 의 발현량 또는 세포외 인슐린 분비량을 측정하고, 시험 화합물의 존재 하에서의 상기 발현량 또는 분비량이 시험 화합물의 비존재 하에서와 비교하여 유의하게 증가하는 경우에, 당해 시험 화합물을 당뇨병 치료약 후보로 선택 (스크리닝) 할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법 또는 평가 시스템도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 스크리닝의 다른 예로는 본 발명의 췌장 전구 세포에서 유도된 췌장 β 세포에 당뇨병 상태를 모방하는 스트레스를 부하하여 β 세포의 기능을 저하시킨 상태에 대한 시험 화합물의 효과를 평가하는 방법 등을 들 수 있다. 여기에서는 β 세포의 기능이 회복된 경우 또는 β 세포의 기능 회복과 관련성이 있는 마커 발현이 변동한 경우, 당해 시험 화합물을 당뇨병 치료약 후보로 선택 (스크리닝) 할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법 또는 평가 시스템도 본 발명의 범위에 포함된다.
실시예
이하, 참고예 및 실시예에 의해 본 발명에 대해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(참고예 1) 인간 iPS 세포주 253G1 세포를 이용한 PDX1 양성 세포의 유도
인간 iPS 세포는 253G1 세포 (레트로 바이러스에 의해 OCT4, SOX2, 및 KLF4 를 발현시켜 만든 iPS 세포주; Nature Biotechnology 26, 101-106) 를 사용했다.
인간 iPS 세포의 배양은 Essential 8 배지 (Life Technologies Corp.) 를 사용하여 비트로넥틴 (Life Technologies Corp.) 을 코팅한 6-cm 디쉬 또는 10-cm 디쉬 (본 명세서에서, 비트로넥틴 코트 디쉬라고 칭하는 수가 있다) 상에서 실시했다. 계대시는 인간 iPS 세포를 0.5 mM EDTA/PBS 로 처리하여 작은 세포괴 상태로 분산시켜 비트로넥틴 코트 디쉬에 파종했다. 계대의 비율은 세포의 상태에 따라 1 : 5 ~ 1 : 100 으로 실시하고, 계대 직후만은 Essential 8 배지에 10 μM Y27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 을 첨가한 배지를 사용하였다. 배양 2 일째 이후는 Essential 8 배지만을 사용하여 매일 배지를 교환하고, 계대는 3-7 일마다 실시했다.
분화 유도를 할 때, 먼저, 미분화된 iPS 세포를 96 웰 플레이트에 파종했다. 세포괴 상태를 유지하던 iPS 세포를 EDTA 용액으로 처리하여 단일 세포가 될 때까지 해리시켰다. 이어서, 배지에 분산시킨 iPS 세포를 마트리겔 코트 처리된 96 웰 플레이트에 2 × 104 개 세포/웰의 밀도로 파종하여 37 ℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 파종시 배양액으로는 10 μM 의 Y27632 를 첨가한 Essential 8 배지를 사용했다. 파종 1 일 후에 Essential 8 만의 배지로 교환하고, 컨플루언트 상태가 될 때까지 1 일 더 배양하였다.
다음으로, iPS 세포에서 내배엽 세포로의 분화를 유도했다. 먼저, 컨플루언트 상태가 된 세포를 RPMI 배지 (Life Technologies Corp.) 로 세정한 후, 액티빈 A (100 ng/ml) (PeproTech), GSK3β 저해제인 CHIR99021 (3 μM) (Axon), 및 1% 인슐린 불포함 B-27 (등록 상표) (Life Technologies Corp.) 을 포함하는 RPMI 배지를 첨가하여 4 일간 배양하였다.
다음으로, 내배엽 세포에서 PDX1 양성 세포로의 분화 유도를 실시했다. iPS 세포에서 내배엽 세포로 분화 유도한 세포를 Improved MEM Zinc Option 배지 (Life Technologies Corp.) (본 명세서에서, IMEM-option Zn++ 배지라고 칭하는 경우가 있다.) 로 세정한 후, 도르소모르핀 (1 μM) (Calbiochem), 레티노산 (2 μM) (Sigma) 및 SB431542 (10 μM) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 을 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 을 포함) 로 교환하였다. 상기 교환 후 3 또는 4 일째에 동일한 배지로 배지 교환을 실시하고, 내배엽 세포에서 PDX1 양성 세포로의 분화 유도를 총 7 일간 실시했다.
(실시예 1) PDX1 양성 세포를 이용한 췌장 전구 세포의 유도 - 1
참고예 1 에 따라 마트리겔 코트 디쉬 상에서 분화 유도한 PDX1 양성 세포를 IMEM-option Zn++ 배지로 세정한 후, XAV939 (1 μM) 및/또는 bFGF (100 ng/ml) (PeproTech) 을 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 를 포함) (PeproTech, Inc.) 에서 또한 7 일간 배양하였다.
배양 후 세포에서의 PDX1 과 NKX6.1 단백질의 발현을 조사하기 위해, 항 PDX1 항체와 항 NKX6.1 항체를 이용한 면역 형광 염색을 실시했다. 구체적으로는, 배양 후 세포에 대해 4 % 파라포름알데히드 인산 완충액 (4 % PFA) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 을 첨가하여 30 분간 실온에서 세포의 고정을 실시했다. 그 후, 1 차 항체로서의 항 PDX1 항체 (AF2419, R & D Systems, Inc.) 및 항 NKX6.1 항체 (55F55A12-c, Developmental Studies Hybridoma Bank), 및 또한 2 차 항체로서의 Alexa 488 표식 2 차 항체 또는 Alexa 568 표식 2 차 항체 (모두, Life Technologies) 와 순차적으로 반응시킨 후, 형광 현미경으로 관찰했다. 결과를 도 1 에 나타낸다.
분화 유도 인자로 XAV939 와 bFGF 를 함께 첨가한 경우 (도 1 (iv)) 에, 대부분의 세포가 PDX1 과 NKX6.1 을 발현하고 있는 모습이 관찰되었다. 한편, XAV939 를 단독으로 첨가한 경우 (도 1 (ii)) 와 bFGF 를 단독으로 첨가한 경우 (도 1 (iii)) 에는, PDX1 과 NKX6.1 을 동시에 발현하는 세포는 적었다.
이상의 검토에 의해 XAV939 와 bFGF 를 첨가한 배지에서 배양함으로써 효율적으로 췌장 전구 세포를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
(실시예 2) PDX1 양성 세포를 이용한 췌장 전구 세포의 유도 - 2
참고예 1 에 따라 마트리겔 코트 디쉬에서 분화 유도한 PDX1 양성 세포를 IMEM-option Zn++ 배지로 세정한 후, EGF (500 ng/ml), 베타셀룰린 (40 ng/ml) 또는 bFGF (100 ng/ml) 를 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 및 1 μM XAV939 를 포함) 로 교환하여 8 일간 배양하였다. 배양 후 세포를 실시예 1 에 기재된 면역 형광 염색을 실시하여 형광 현미경으로 관찰했다. 결과를 도 2 에 나타낸다.
bFGF 와 XAV939 를 함께 첨가한 경우 (도 2 (iv)) 와 마찬가지로, EGF 와 XAV939 (도 2 (ii)) 또는 베타셀룰린과 XAV939 (도 2 (iii)) 를 함께 첨가한 경우에도 많은 췌장 전구 세포가 유도되었다.
이러한 결과로부터 EGF 시그널 활성화 촉진제 또는 FGF 시그널 활성화 촉진제 및 XAV939 등의 Wnt 시그널 저해제를 첨가한 배지를 이용하여 효율적으로 췌장 전구 세포를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
(실시예 3) 인간 iPS 세포주 297L1 세포를 이용한 췌장 전구 세포의 유도
297L1 세포 (NHDF-iPS; 신생아 남성의 피부 섬유 아세포에서 OCT4, SOX2, KLF4, 및 c-MYC 를 발현시켜 제작된 인간 iPS 세포주) (PLoS ONE 2009; 4 (12) p.e8067 참조) 를 이용하여 참고예 1 에 따라 PDX1 양성 세포를 유도했다. PDX1 양성 세포를 IMEM-option Zn++ 배지로 세정한 후, XAV939 (1 μM) 와 bFGF (50 ng/ml) 을 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 를 포함) 를 사용하여 7 일간 배양하였다. 배양한 세포에 실시예 1 에 기재된 면역 형광 염색을 실시하여 형광 현미경으로 관찰했다. 결과를 도 3 에 나타낸다.
297L1 세포를 이용한 경우에도 참고예 1, 실시예 1 및 실시예 2 에 기재한 방법에 따라 효율적으로 췌장 전구 세포를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다.
(실시예 4) 췌장 전구 세포의 계대
실시예 3 에서 유도한 췌장 전구 세포를 이하의 절차로 계대했다. 즉, PBS 로 세정한 후, 아큐타제 (Innovative Cell Technologies, Inc.) 를 첨가하여 4 분간 인큐베이트하고, 피펫팅을 하여 단일 세포 상태로 했다. IMEM-option Zn++ 배지로 세포를 세정한 후, 계대 전에 1/4 ~ 1/10 의 세포 농도에서 새로운 배양용기에 파종했다. 또한, 배지로는 Y27632 (10 μM), XAV939 (1 μM) 및 bFGF (50 ng/ml) 를 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 를 포함) 를 이용하고, 배양용기로는 마트리겔 코팅 처리를 한 것을 이용하였다. 상기 파종 후, 배지 교환을 매일 실시했다.
상기 파종 후 3 ~ 6 일 동안 세포는 80 ~ 90 % 컨플루언트에 도달했다. 세포가 80 ~ 90 % 컨플루언트에 도달한 단계에서, 다시 상기의 절차를 반복하여 계대를 실시했다. 계대수 4 의 단계에서 계대후 1 일째의 세포의 모습과 계대후 4 일째의 세포의 모습을 도 4A 에 나타낸다. 계대 1 일째에는 세포 밀도가 낮지만, 계대 4 일째가 되면 세포 밀도가 높아지는 모습을 알 수 있다. 이렇게 하여 계대를 반복했는데, 21 회의 계대를 통해 하나의 세포가 1x1018 개의 세포로 증식한 것으로 밝혀졌다 (도 4B).
이 결과에서 계대수가 20 을 넘어도 췌장 전구 세포가 높은 증식능을 유지하고 있는 것으로 밝혀졌다.
계대를 거듭한 세포에서 PDX1 및 NKX6.1 의 발현이 유지되고 있는지 관찰하기 위해, 계대수 5 또는 계대수 66 의 세포를 실시예 1 에 기재된 면역 형광 염색을 실시하여 형광 현미경으로 관찰했다. 결과를 도 5 에 나타낸다.
계대수 5 의 세포 및 계대수 66 의 세포 둘다 대부분이 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성이었다.
이상의 결과에서 본 발명의 방법을 이용하는 것으로, PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 췌장 전구 세포의 상태 그대로 증식시킬 수 있고, 또 계대하는 것이 가능하다는 것을 밝혀졌다.
(참고예 2) 증식시킨 췌장 전구 세포의 핵형 분석
계대를 거듭한 증식시킨 췌장 전구 세포가 정상적인 핵형을 유지하고 있는지 분석했다. 28 회 계대한 췌장 전구 세포를 카르누아 고정한 후 간이 핵형 분석 (Q-Band) 을 실시했다 (주식회사 Chromocenter). 그 결과를 도 6 에 나타낸다. 그 결과, 췌장 전구 세포는 정상 핵형을 유지하고, 장기적으로 배양하여 계대를 거듭해도 정상적인 핵형을 유지하고 있는 것으로 밝혀졌다.
(실시예 5) 췌장 전구 세포의 증식에서 첨가 인자의 관여
실시예 4 에서 볼 수 있듯이, Y27632, XAV939, 및 bFGF 를 첨가한 배지를 이용하여 배양함으로써 췌장 전구 세포를 안정적으로 증식시키는 것이 가능하였다. 그래서 이러한 인자 중 어느 인자의 조합이 췌장 전구 세포의 증식에 필요한지를 검토했다.
단일 세포 상태로 한 계대수 44 의 췌장 전구 세포를 마트리겔 코트 처리를 한 플레이트에 파종하여, 각 인자 또는 에이전트 (bFGF (50 ng/ml), XAV939 (1 μM), 및 Y27632 (10 μM)) 를 함께 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 를 포함) 에서 2 일간 배양했다. 배양 시작 후 배지 교환을 매일 실시했다. 배양 후 세포에 실시예 1 에 기재된 면역 형광 염색을 실시하여 형광 현미경으로 관찰했다. 그 결과를 도 7 에 나타낸다.
bFGF, XAV939, 및 Y27632 를 함께 첨가한 경우 (도 7 (viii)) 이외에 Y27632 와 bFGF 를 함께 첨가한 경우 (도 7 (v)) 와 bFGF 와 XAV939 를 함께 첨가한 경우 (도 7 (vii)) 에서도 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 세포가 증식하는 모습이 관찰되었다.
(실시예 6) 다른 사람 iPS 세포주를 이용한 증식 가능한 췌장 전구 세포의 유도
다른 사람 iPS 세포에서 증식 가능한 췌장 전구 세포를 유도할 수 있는지 여부 검토했다. 우선, 새로운 인간 iPS 세포를 이하의 방법으로 제작했다. 헤파린 나트륨 함유 채혈관 (텔모) 에 채혈한 혈액을 PBS 로 2 배 희석한 후, Ficoll-Paque PREMIUM (GE healthcare Japan Corp.) 에 중층하고, 20 ℃, 400g 에서 30 분간 원심 분리하고, 말초 혈액 단핵화 세포 (peripheral blood mononucleated cell) (PBMC) 를 분리하였다. Ficoll 과 희석 혈액은 3 : 4 의 비율로 사용했다. 회수한 PBMC 는 PBS 를 이용하여 원심 분리하여 세정을 실시한 후, StemSpan H3000 (STEMCELL Technologies Inc.) 에 재현탁했다. 또는 셀 벙커 3 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) 를 이용하여 동결 보존을 실시했다. 그 다음, PBMC 를 6 웰 플레이트에 3 × 106 세포/웰의 농도로 파종하여 10 ng/ml IL-3 (PeproTech, Inc.), 100 ng/ml IL-6 (PeproTech, Inc.), 300 ng/ml SCF (PeproTech, Inc.), 300 ng/ml TPO (PeproTech, Inc.), 및 300 ng/ml Fit3 리간드 (PeproTech, Inc.) 를 첨가 (이하, 비-T 세포용 배지) 하여 6 일간 배양하였다. 배양 후, 증식된 비-T 세포를 회수하고 (약 1.3 × 106 세포/웰), Human CD34 Cell Nucleofector (등록 상표) Kit (Lonza Group Ltd.) 를 이용하여 Plasmids Epi5TM Episomal iPSC Reprogramming Kit (Life Technologies Corp.) 의 에피소말 벡터를 도입했다. 벡터 양으로는 1.3 × 106 개 세포 당 Reprogramming kit 내의 Epi5TM Reprogramming Vectors 및 Epi5TM p53 & EBNA Vectors 을 각각 1.5 μg (총 3 μg) 사용하고, Nucleofector (Lonza Group Ltd.) 의 도입 프로그램은 U-008 을 사용했다. 도입 후, 세포를 비-T 세포용 배지에 재현탁하고, Geltrex (Life Technologies Corp.) 를 코팅한 10-cm 디쉬 (배지량 10 ml) 에 파종하여 24 시간 배양하였다. 다음날 (Day 1), 1% N2 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2% B-27 (등록 상표), 1 x GlutaMax I (Life Technologies Corp.), 1 x NEAA (Life Technologies Corp.) 및 100 ng/ml bFGF 를 포함하는 DMEM/F12 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 배지를 5ml/10-cm 디쉬 (총 15 ml) 로 가한 후, 5 일간은 같은 배지로 매일 반량 교환했다. Day 9 에서 Essential 8 배지로 전량 치환한 후, 격일마다 같은 배지로 배지 교환을 행했다. iPS 세포의 콜로니가 관찰된 후, 세포를 적절히 픽업하고, 배양을 계속하여 iPS 세포주를 수립했다.
수립한 3 개의 인간 iPS 세포주 (NTE-1-7, NTE-1-8, 및 NTE-1-9) 를 참고예 1 에 나타낸 방법에 적용하여, PDX1 양성 세포를 유도했다. 유도 후 세포를 IMEM-option Zn++ 배지로 세정한 후, XAV939 (1 μM) 및 bFGF (50 ng/ml) 을 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 를 포함) 를 이용하여 또한 7 일간 배양하여 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 췌장 전구 세포를 유도했다. 이렇게 유도된 세포를 PBS 로 세정한 후, 아큐타제를 더해 4 분간 인큐베이트한 후, 피펫팅을 하여 단일 세포 상태로 했다. IMEM-option Zn++ 배지로 세포를 세정한 후, 계대 전의 1/4 ~ 1/10 의 세포 농도에서 마트리겔 코트 처리를 한 새로운 배양 용기에 파종했다. 배지는 1% B-27 (등록 상표), Y27632 (10 μM), XAV939 (1 μM), 및 bFGF (50 ng/ml) 를 포함하는 IMEM-option Zn++ 배지를 사용하였다. 계대후 매일 배지를 교환했다. 2 회 계대를 반복한 세포에 실시예 1 에 기재된 면역 형광 염색을 실시하여 형광 현미경으로 관찰했다. 그 결과를 도 8 에 나타낸다.
어느 세포주를 이용한 경우에도, 계대후의 세포는 대부분 PDX1 양성 및 NKX6.1 양성 췌장 전구 세포이었기 때문에, 본 발명의 방법의 효과는 297L1 세포 이외의 세포주에서도 볼 수 있는 것으로 밝혀졌다.
(참고예 3) 증식시킨 췌장 전구 세포에서 인슐린 생산 세포로의 분화 유도
증식 계대를 거듭한 췌장 전구 세포가 인슐린 생산 세포로 분화할 수 있는 능력이 있는지 검토했다. 세포로 297L1 세포 유래의 췌장 전구 세포 (계대수: 7) 를 사용하였다. 아큐타제를 이용하여 단일 세포 상태로 한 췌장 전구 세포를 6x104 세포/웰로, 마트리겔 코트 처리된 96 웰 플레이트에 파종했다. 배양액은 XAV939 (1 μM), Y27632 (10 μM), 및 bFGF (50 ng/ml) 을 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 를 포함) 를 사용하였다. 세포를 2 일간 배양하여 세포 밀도를 컨플루언트가 되게 했다. 그 후, 세포를 IMEM-option Zn++ 배지로 세정한 후, ALK5 저해제 II 를 첨가한 IMEM-option Zn++ 배지 (1% B-27 (등록 상표) 를 포함) 를 이용하여 9 일간 배양한다. ALK5 저해제 II 는 인슐린 양성 세포를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Stem Cell Research 20128, 274-284). 배양 후의 세포에 4 % PFA 를 첨가하여 실온에서 30 분간 고정하였다. 또한, 1 차 항체로서의 항 NKX6.1 항체 및 항 인슐린 항체 (DAKO, A0564) 와 반응시키고, 또한 2 차 항체로서의 Alexa 488 표식 2 차 항체 또는 Alexa 568 표식 2 차 항체와 순차적으로 반응시킨 후, 형광 현미경으로 관찰했다. 그 결과를 도 9 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 배지에서 배양함으로써 인슐린 양성 세포가 출현하는 모습이 관찰되었다. 이러한 결과로부터, 증식시킨 췌장 전구 세포는 인슐린 양성 세포로의 분화능을 가진 세포임이 확인되었다.
본 발명은 췌장 전구 세포를, 그의 기능을 유지하면서, 고효율 고순도로 증식시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 생체 유래의 췌장 전구 세포 이외에, ES 세포와 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포에서 분화 유도한 췌장 전구 세포에도 적용할 수 있다. 얻어진 췌장 전구 세포는 고기능, 고순도에 안전성이 높고, 그대로 또는 췌장 β 세포 등으로 분화 유도하여, 당뇨병의 치료와 당뇨병 치료약의 시험 방법 등에 이용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 본 명세서에 도입한다.

Claims (8)

  1. 췌장 전구 세포를 이하의 공정 (1) 에 적용하는 것을 포함하는, 췌장 전구 세포의 증식 방법:
    (1) 췌장 전구 세포를 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정.
  2. 제 1 항에 있어서, 배지가 추가로 (iii) Wnt 시그널 저해제를 포함하는, 증식 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 췌장 전구 세포가 PDX1 양성 세포를 (a) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (b) Wnt 시그널 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 유도된 췌장 전구 세포인, 증식 방법.
  4. (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는, 췌장 전구 세포의 증식용 시약.
  5. (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는, 췌장 전구 세포의 증식용 키트.
  6. 췌장 전구 세포를 증식시키기 위한 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제의 용도.
  7. 췌장 전구 세포를 (i) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (ii) ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 증식시키는 공정; 및 배양물 중에서 췌장 전구 세포를 채취하는 공정을 포함하는, 췌장 전구 세포의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, PDX1 양성 세포를 (a) EGF 시그널 전달 활성화인자 및/또는 FGF 시그널 전달 활성화인자 및 (b) Wnt 시그널 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 전구 세포로 분화 유도시키는 공정을 추가로 포함하는, 제조 방법.
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