WO2023153464A1

WO2023153464A1 - 多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法

Info

Publication number: WO2023153464A1
Application number: PCT/JP2023/004282
Authority: WO
Inventors: 淳中根; 賢司吉田; 佑佳青柳; 愛池田; 淳 ▲高▼橋; 大輔土井
Original assignee: 住友ファーマ株式会社; 国立大学法人京都大学
Priority date: 2022-02-09
Filing date: 2023-02-09
Publication date: 2023-08-17

Abstract

多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の培養上清における、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、測定した上記ＮＴ－３の濃度を、基準濃度と比較する工程と、上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、を含み、上記培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から２４０時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。

Description

多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法

　本発明は、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法に関する。

　パーキンソン病は、中脳黒質のドパミン神経細胞の脱落によって起きる神経変性疾患である。そのため、多能性幹細胞から分化誘導することにより上記ドパミン神経細胞またはドパミン神経前駆細胞を人工的に製造し、患者の脳内に移植することは、パーキンソン病に対する有効な治療法の一つとなると期待されており、細胞医薬品として製造する方法が検討されている。

　一方、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）は神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリーの一種であり、中枢神経系及びシナプスにおいて、神経細胞の生存と分化を促進することが知られている。ＮＴ－３は、多能性幹細胞からドパミン神経前駆細胞を製造する際に、中間体に相当する中脳底板領域の神経系細胞から、ドパミン神経前駆細胞へ成熟させる工程で使用されている（特許文献１）。また、生体においては、例えば、非特許文献１のように、ＮＴ－３遺伝子が神経系細胞に発現することを示す報告がなされている。しかし、これまでに、多能性幹細胞から神経前駆細胞、中脳底板領域の神経系細胞を経てドパミン神経前駆細胞を製造する初期の段階において、ＮＴ－３が分化誘導に関与するかどうかについては知られておらず、また、中脳底板領域の神経系細胞の分化過程において、培養上清中にＮＴ－３が分泌されるかどうかについても、知られていなかった。

米国特許第７２５０２９４号明細書

Ｂｅｒｎｄ　Ｐ．、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒ．　２００８；１４（４）：２４１－５０Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇｕｓｔ　２０２０，Ｖｏｌｕｍｅ　８，Ａｒｔｉｃｌｅ　７２９

　複数の研究グループにおいて、多能性幹細胞から分化誘導することによりドパミン神経前駆細胞を製造する方法が研究されている。しかし、多能性幹細胞をドパミン神経前駆細胞等の神経系細胞に分化誘導する方法については、工程が複雑で目的細胞が得られるのに長期間を要するという特徴がある。そのため、ドパミン神経前駆細胞を製造する方法において、分化誘導の早い段階において、分化誘導が順調に進行していること、そしてヒトに対する移植に適した目的細胞が一定割合以上含まれる正常なロットを与え得ることを予測する方法が望まれている。
　また、分化工程が正常に進行しているか経時的に確認するため、分化誘導過程における細胞の状態を非侵襲的にモニタリングするための指標が求められている。

　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、多能性幹細胞からドパミン神経前駆細胞への分化誘導の早い段階において判定が可能な、多能性幹細胞からドパミン神経前駆細胞へ分化する過程における中間体に相当する中脳底板領域の神経系細胞への分化能を判定する方法を提供することにある。

　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を進めた結果、多能性幹細胞からドパミン神経前駆細胞へ分化する過程における培養上清中に分泌されたニューロトロフィン－３（以下、「ＮＴ－３」と表記する場合がある。）の濃度をモニターすることによって、分化誘導の早い段階において、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化能を判定することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。

　［１］本発明の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する第一の方法は、
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の培養上清における、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　測定した上記ＮＴ－３の濃度を、基準濃度と比較する工程と、
　上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　上記培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から２４０時間（又は４８時間から９６時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である。

　［２］本発明の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する第二の方法は、
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清及び第二の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度から、上記ＮＴ－３の濃度の変化率を求める工程と、
　上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値を、基準変化率と比較する工程と、
　上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間（又は４８時間から９６時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　上記第二の培養上清は、上記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間（若しくは２４時間から７２時間）のいずれかの時点又は上記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間（若しくは２４時間から７２時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である。

　［３］本発明の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する第三の方法は、
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清、第二の培養上清及び第三の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度、上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第三の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度を比較する工程と、
　上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度が、上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第三の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度より高いとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、を含み、
　上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間（又は４８時間から９６時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　上記第二の培養上清は、上記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間（又は２４時間から７２時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　上記第三の培養上清は、上記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間（又は２４時間から７２時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である。

　［４］上記［１］から［３］のいずれかにおいて、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤は、少なくとも１種のＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を含むことが好ましい。

　［５］上記［４］において、上記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質は、少なくとも１種のＢＭＰシグナル伝達阻害物質及び少なくとも１種のＴＧＦβシグナル伝達阻害物質を含むことが好ましい。

　［６］上記［５］において、上記ＢＭＰシグナル伝達阻害物質は、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＭＨ１、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ－２１４１１７、ＬＤＮ－２１２８５４、ＭＬ３４７（ＬＤＮ１９３７１９）及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１種を含み、
　上記ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質は、ＳＢ－４３１５４２、Ａ－８３－０１、Ｌｅｆｔｙ－１、Ｌｅｆｔｙ－２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＳＢ－２０２１９０、ＳＢ－５２５３３４、ＳＢ－５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、Ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ（Ｓ－７７０１）、ＧＷ７８８３８８、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ２０８、ＴＰ０４２７７３６、ＢＩＢＦ－０７７５、ＬＹ３２００８８２、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ（ＴＥＷ－７１９７）、ＩＴＤ－１、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７及びＬＹ５８０２７６からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
　上記ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質は、ＳＢ－４３１５４２、Ａ－８３－０１、Ｌｅｆｔｙ－１、Ｌｅｆｔｙ－２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＳＢ－２０２１９０、ＳＢ－５２５３３４、ＳＢ－５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、Ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ（Ｓ－７７０１）、ＧＷ７８８３８８、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ２０８、ＩＴＤ－１、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７及びＬＹ５８０２７６からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが、より好ましい。

　［７］上記［１］から［６］のいずれかにおいて、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤は、ＳＨＨシグナル伝達活性物質及び／又はＷｎｔシグナル伝達活性物質を更に含むことが好ましい。

　［８］上記［１］から［６］のいずれかにおいて、上記培地は、ＳＨＨシグナル伝達活性物質及びＷｎｔシグナル伝達活性物質を更に含むことが好ましい。

　［９］上記［７］又は［８］において、上記ＳＨＨシグナル伝達活性物質は、ＳＨＨ及びその断片（例えば、Ｓｈｈ　（Ｃ２４ＩＩ）　Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｓｈｈ　（Ｃ２５ＩＩ）　Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ）並びに修飾体、ＳＨＨ受容体、ＳＨＨ受容体アゴニスト、Ｈｈ－Ａｇ１．５、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ、２０ａ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、並びに、ＳＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

　［１０］上記［７］、［８］又は［９］において、上記Ｗｎｔシグナル伝達活性物質は、ＷＮＴ３Ａ、及び、ＧＳＫ－３β阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

　［１１］上記［１０］において、上記ＧＳＫ－３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＫＬ２００１、ＳＢ２１６７６３、ＧＳＫ－３β　阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）及びＬ８０３－ｍｔｓからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

　［１２］上記［１］から［１１］のいずれかにおいて、上記多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましい。

　［１３］本発明に係るドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法は、
　多能性幹細胞から、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法であって、
　（Ａ）中脳底板領域の神経系細胞に分化誘導可能な培養条件で、上記多能性幹細胞の培養を開始する工程と、
　（Ｂ）上記多能性幹細胞の培養開始後０時間から２８８時間の間に、上記［１］から［１２］のいずれかに記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法を行う工程と、
　（Ｃ）上記工程（Ｂ）において上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定された上記培養液中の細胞を、更に継続して培養することを決定し、上記培養液中の細胞から上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化させる工程と、
　（Ｄ）上記中脳底板領域の神経系細胞を、上記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件で培養し、上記ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞へ分化させる工程と、
を含む。

　［１４］上記［１３］において、上記ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法は、
　工程（Ｃ）と工程（Ｄ）との間において、
　（Ｅ）上記工程（Ｃ）で得られる上記中脳底板領域の神経系細胞を回収する工程、
　を更に含むことが好ましい。

　［１５］上記［１３］又は［１４］において、上記ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法は、
工程（Ｄ）が、上記中脳底板領域の神経系細胞から中脳底板細胞を選別及び回収し、回収した上記中脳底板細胞を、上記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件で培養することで行われることが好ましい。すなわち、中脳底板領域の神経系細胞の細胞集団（中脳底板細胞を含む細胞集団）から、目的物である、適切に分化した中脳底板細胞を選択し回収した後、浮遊培養もしくは接着培養で、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞へと分化誘導することができる。

　本発明によれば、分化誘導の早い段階において判定が可能な、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化能を判定する方法を提供することが可能になる。また、本発明によれば、分化誘導の早い段階において細胞非侵襲的な分化能の判定が可能であるため、分化能に劣る分化培養ロットを継続することによるコスト削減も可能となる。

図１は、培養実験Ａとして、分化効率の異なる細胞群Ａ１とＡ２における、培養上清中ＮＴ－３濃度の経時変化を示すグラフである。横軸が分化誘導の培養日数、縦軸が上清中のＮＴ－３濃度であり、分化誘導効率の高い条件でＮＴ－３濃度が上昇していることを示すデータである。図２は、培養実験Ｂとして、分化効率の異なる細胞群Ｂ１とＢ２における、培養上清中ＮＴ－３濃度の経時変化を示すグラフである。横軸が分化誘導の培養日数、縦軸が上清中のＮＴ－３濃度であり、分化誘導効率の高い条件でＮＴ－３濃度が上昇していることを示すデータである。図３は、培養実験Ｃとして、分化効率の異なる細胞群Ｃ１とＣ２における、培養上清中ＮＴ－３濃度の経時変化を示すグラフである。横軸が分化誘導の培養日数、縦軸が上清中のＮＴ－３濃度であり、分化誘導効率の高い条件でＮＴ－３濃度が上昇していることを示すデータである。図４は、培養実験Ｄとして、分化効率の異なる細胞群Ｄ１とＤ２における、シングルセル遺伝子発現解析結果をバイオリンプロットで示したグラフである。横軸に分化誘導の培養日数と培養条件を記し、縦軸に平均ＲＮＡ発現量の指標であるＣｏｕｎｔ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＣＰＭ）を記した。当該グラフは、分化誘導効率の高い条件において、ＮＴ－３遺伝子（ＮＴＦ３）が高く発現している細胞が多いことを示すデータである。図５は、培養実験Ｅとして、センダイウイルスベクターを用いて樹立したｉＰＳ細胞株を用いた分化培養における、培養上清中ＮＴ－３濃度の経時変化を示すグラフである。横軸が分化誘導の培養日数、縦軸が上清中のＮＴ－３濃度であり、分化が進む過程においてＮＴ－３濃度が上昇していることを示すデータである。図６は、培養実験Ｄとして、分化効率の異なる細胞群Ｄ１とＤ２における、培養上清中ＮＴ－３濃度の経時変化を示すグラフである。横軸が分化誘導の培養日数、縦軸が上清中のＮＴ－３濃度であり、ＮＴ－３濃度が上昇していることを示すデータである。図７は、培養実験Ｆとして、培養条件の異なる細胞群Ｆ１とＦ２における、培養上清中ＮＴ－３濃度の経時変化を示すグラフである。横軸が分化誘導の培養日数、縦軸が上清中のＮＴ－３濃度であり、ＮＴ－３濃度が上昇していることを示すデータである。

　以下、本発明の一実施形態（以下「本実施形態」と記すことがある。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本明細書において「Ａ～Ｚ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｚ以下）を意味する。Ａにおいて単位の記載がなく、Ｚにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＺの単位とは同じである。

　≪多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法（１）≫
　本実施形態に係る多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する第一の方法は、
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の培養上清における、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　測定した上記ＮＴ－３の濃度を、基準濃度と比較する工程と、
　上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　上記培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から２４０時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である。以下詳細に説明する。

＜多能性幹細胞＞
　本実施形態において「多能性幹細胞」とは、生体に存在するすべての細胞、すなわち内胚葉、中胚葉及び外胚葉の三胚葉に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞を意味する。上記多能性幹細胞としては、特に制限されないが、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、***幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞からな群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。本実施形態の一側面において、多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましい。多能性幹細胞の由来となる生物に特に限定はないが、哺乳動物由来の多能性幹細胞が好ましく、霊長類由来の多能性幹細胞がより好ましい。具体的には、マウス由来、ヒト由来又はサル由来の多能性幹細胞が挙げられる。

　（Ａ）胚性幹細胞
　ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）、具体的には受精後１４日以内の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能とを有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞である。ＥＳ細胞は、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４－１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１１４５－１１４７；　Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４－７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔ　ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４－２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ａｎｄ　Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３－１６５）。

　ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、当該内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＵＳＰ５，８４３，７８０；Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ，ｅｔ　ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：７８４４－７８４８；Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ，ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２：１１４５－１１４７；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６－９３２；Ｍ．Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４－９５５９；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３－２７９；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０－１５８５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ　Ｉ，　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１－４８５などに記載されている。

　ＥＳ細胞作製のための培地として、例えば０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸、２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替品）および４ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地を使用し、３７℃、２％ＣＯ_２／９８％空気の湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（Ｏ．Ｆｕｍｉｔａｋａ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：２１５－２２４）。また、ＥＳ細胞は、３～４日おきに継代する必要がある。このとき、継代は、例えば１ｍＭ　ＣａＣｌ_２および２０％　ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％　トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。

　ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ－３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＤなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ．Ｋｒｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：４４３－４５２）。ヒトＥＳ細胞株は、所定の施設から入手可能である。例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能である。また、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。

　（Ｂ）***幹細胞
　***幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、***形成のための起源となる細胞である。上記***幹細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ．Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２－６１６；Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１－１０１２）。上記***幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培地で自己複製可能である。また上記***幹細胞は、ＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１～４６頁，羊土社（東京、日本））。

　（Ｃ）胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞である。上記胚性生殖細胞は、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１－８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０－５５１）。

　（Ｄ）人工多能性幹細胞
　人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３－６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１－８７２；Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７－１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１－１０６（２００８）；ＷＯ２００７／０６９６６６）。

　初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。

　初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、ＨｕａｎｇｆｕＤ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５－７９７、Ｓｈｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ　ＳｔｅｍＣｅｌｌ，２：５２５－５２８、Ｅｍｉｎｌｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７－２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９－１２７５、Ｓｈｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，５６８－５７４、Ｚｈａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３：４７５－４７９、Ｍａｒｓｏｎ　Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，１３２－１３５、Ｆｅｎｇ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１：１９７－２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９－４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ　ＣＡ，　ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１０６：８９１２－８９１７、Ｋｉｍ　ＪＢ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９－６４３、Ｉｃｈｉｄａ　ＪＫ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．５：４９１－５０３、Ｈｅｎｇ　ＪＣ，ｅｔ　ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．６：１６７－７４、Ｈａｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６－１００、Ｍａｌｉ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３－７２０、Ｍａｅｋａｗａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５－９．に記載の組み合わせが例示される。

　好適な初期化因子の組合せとして、具体的には、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２０１３；３１：４５８－４６６）、（３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８、１９１７－１９２０）等を挙げることが出来る。

　人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等により体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。

　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１　ｓｉＲＮＡ　Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ　２９ｍｅｒ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ－３阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ－０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ－ｃｈａｎｎｅｌ　ｃａｌｃｉｕｍ　ａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ－８３－０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５およびｍｉｒ－３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ　Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれている。本明細書における多能性幹細胞は、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた上述の因子を用いて樹立された人工多能性幹細胞も包含する。

　初期化因子がタンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって、上記初期化因子を体細胞内に導入してもよい。

　一方、初期化因子がＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターを、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することで上記初期化因子を導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３－６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１－８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７－１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５－９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（ＷＯ２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９－９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。上記ベクターは、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、初期化因子をコードする遺伝子、又は、プロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子の前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。このようにすることで、当該ベクターが体細胞への導入された後、上記初期化因子をコードする遺伝子、又は、上記プロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除することができる。

　また、初期化因子がＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって、上記初期化因子を体細胞内に導入してもよく、分解を抑制するため、５－メチルシチジンおよびｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いてもよい（Ｗａｒｒｅｎ　Ｌ，（２０１０）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．７：６１８－６３０）。

　ｉＰＳ細胞の樹立及び維持培養のための培地としては、例えば、１０～１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培地、または市販の培地［例えば、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞培養用培地（ＡＫ０３Ｎ、味の素社）、マウスＥＳ細胞培養用培地（ＴＸ－ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培地（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）］などが含まれる。上述のＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培地にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、２－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。

　培養法の例としては、たとえば、以下の方法が挙げられる。まず、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で体細胞と初期化因子とを接触させ約４～７日間培養する。その後、当該体細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養する。最後に、該接触から約３０～約４５日又はそれ以上の培養を行うことでｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。

　あるいは、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、２－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５～約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。

　望ましくは、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）でｉＰＳ細胞を製造することができる。具体的には、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ－５（ＷＯ２００９／１２３３４９）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。

　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Ｓｕｎ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１０６：１５７２０－１５７２５）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立してもよい（Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．５：２３７－２４１またはＷＯ２０１０／０１３８４５）。

　上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ^２あたり約５×１０^３～約５×１０^６細胞の範囲であることが好ましい。

　ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。マーカー遺伝子が発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。

　また、株化された人工多能性幹細胞を入手することも可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性幹細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞、Ｆｆ－Ｉ１４細胞及びＱＨＪＩ０１ｓ０４細胞が、京都大学より入手可能である。また、ｉＰＳ細胞は例えば体細胞を用いて製造することが可能である。

　本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞または多能性幹細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含される。また、体細胞には、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。

　また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、移植後の拒絶反応を抑制する観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲの３遺伝子座、またはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲおよびＨＬＡ－Ｃの４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。

　（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
　体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔ　ＥＳ細胞）は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０－７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２－９３６；Ｊ．Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７－５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ　ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＥＳ）細胞である。ｎｔ　ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２－６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７～５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。

　（Ｆ）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ（Ｍｕｓｅ細胞）
　Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞である。より詳細には、Ｍｕｓｅ細胞は線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ－３およびＣＤ１０５が陽性の細胞である。

＜神経系細胞＞
　本明細書において、神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｅｌｌ）としては、例えば中枢神経系の神経系細胞、末梢神経系の神経系細胞、自律神経系の神経系細胞、運動神経系や感覚器系の神経系細胞、中脳底板領域の神経系細胞及びこれらの幹細胞もしくは前駆細胞など、あらゆる神経系細胞が挙げられる。

＜ドパミン神経前駆細胞＞
　本明細書において、ドパミン神経前駆細胞は、ドパミン産生神経細胞（ドパミン神経細胞又はドパミン作動性ニューロンともいう）への分化が運命付けられた、ドパミン産生神経細胞の前駆細胞を意味する。前記ドパミン神経前駆細胞は、ＦＯＸＡ２陽性及びβＩＩＩ　Ｔｕｂｕｌｉｎ（ＴＵＪ１）陽性であり、好ましくは、更にＯＴＸ２、ＣＯＲＩＮ、ＣＤ１４２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＥＮ１、Ｎｕｒｒ１、ＰＩＴＸ３、ＤＡＴ、ＧＩＲＫ２及びＴＨからなる群より選択される１以上の遺伝子及びタンパク質（分化マーカー）が発現している細胞（陽性細胞ともいう）であってもよい。これらの遺伝子のうち１種類又は複数種類を組み合わせて発現している細胞であって、ドパミン産生神経細胞へ分化誘導され得る細胞をドパミン神経前駆細胞と判断することが可能である。
　本明細書において、ドパミン神経前駆細胞を含む細胞集団は、ドパミン産生神経細胞を含んでいてもよい。本明細書におけるドパミン神経前駆細胞を含む細胞集団は、好ましくはセロトニン神経細胞を含まない細胞集団である。

　ドパミン神経前駆細胞を含有する細胞集団は、ＦＯＸＡ２、βＩＩＩ　Ｔｕｂｕｌｉｎ（ＴＵＪ１）、ＯＴＸ２、ＣＯＲＩＮ、ＣＤ１４２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＥＮ１、Ｎｕｒｒ１、ＰＩＴＸ３、ＤＡＴ、ＧＩＲＫ２およびＴＨからなる群より選択される１以上のタンパク質を発現している細胞を含有する細胞集団であることが望ましい。
　ドパミン神経前駆細胞は、後述するとおり、生体における発生と共通のメカニズムで、多能性幹細胞から分化誘導することができる。まず、多能性幹細胞を神経系細胞へ誘導すること（Ｎｅｕｒａｌ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）により、神経前駆細胞が誘導される。神経前駆細胞は、例えばＳＯＸ１陽性、及び／又はＮＥＳＴＩＮ陽性であることを特徴とする。
　神経前駆細胞は、次に中間体である中脳底板（Ｍｉｄｂｒａｉｎ　Ｆｌｏｏｒ　Ｐｌａｔｅ）細胞へ分化誘導される。すなわち、中脳底板細胞の前駆細胞を経由し、後述する中脳底板細胞へ分化誘導される。中脳底板細胞は、中脳フロアプレート細胞とも言い、中脳ドパミン神経前駆細胞への分化が運命付けられた、ドパミン神経前駆細胞の前駆細胞に相当する。

　＜中脳底板領域（Ｍｉｄｂｒａｉｎ　Ｆｌｏｏｒ　Ｐｌａｔｅ）の神経系細胞＞
　「中脳底板領域」又は「中脳底板」とは、哺乳類胎児の脳及び脊髄の発生段階の一時期にのみ現れる領域である。すなわち、胎児の脳はその前後軸に沿って前脳、中脳、後脳に分類され、その背腹軸に沿って最も腹側の領域を底板という。ドパミン産生神経細胞（Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ、ドパミン神経細胞ともいう。）は、中脳底板領域から発生することが知られている。すなわち、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で多能性幹細胞からドパミン産生神経細胞又はその前駆細胞であるドパミン神経前駆細胞を分化誘導する場合においても、中脳底板領域の神経系細胞を経由して生成する。
　すなわち、本実施形態において「中脳底板領域の神経系細胞」とは、発生段階で中脳底板領域に現れる細胞のうち神経系細胞に分類される細胞であり、ドパミン神経前駆細胞、更にはドパミン神経細胞（ドパミン産生神経細胞）に分化可能な細胞を意味し、上述の中脳底板細胞を包含する。本明細書において、上記中脳底板領域の神経系細胞は、上記多能性幹細胞からｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で分化誘導させた中脳底板領域の神経系細胞である。
　上記中脳底板領域の神経系細胞又は中脳底板細胞としては、例えば、ＣＯＲＩＮ、ＬＲＴＭ１、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、ＮＧＮ２、ＤＤＣ、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ｂ及びＣＤ１４２からなる群より選択される１以上の遺伝子及びタンパク質陽性細胞が挙げられる。具体的には、ＣＯＲＩＮ陽性細胞、ＬＲＴＭ１陽性細胞、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａが共に陽性の細胞、又はＦＯＸＡ２が陽性であり、更にＣＯＲＩＮ、ＬＲＴＭ１、ＮＧＮ２、ＤＤＣ、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ及びＣＤ１４２からなる群より選択される１以上が陽性である細胞を挙げることができる。
　また、本実施形態において、上記中脳底板領域の神経系細胞又は中脳底板細胞を含む細胞集団は、好ましくは、ＦＯＸＡ２陽性細胞を含む集団であり、更に、例えばＣＯＲＩＮ、ＬＲＴＭ１、ＯＴＸ２、ＮＧＮ２、ＤＤＣ、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ及びＣＤ１４２からなる群より選択される１以上の遺伝子及びタンパク質を発現する細胞を含むことが望ましい。
　上記中脳底板領域の神経系細胞又は中脳底板細胞を含む細胞集団は、ドパミン神経前駆細胞を含んでいてもよい。本明細書における中脳底板領域の神経系細胞を含む細胞集団は、ＣＯＲＩＮ、ＬＲＴＭ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ及びＣＤ１４２からなる群より選択される１以上のタンパク質陽性細胞を含有する細胞集団であることが望ましい。

＜マーカー陽性細胞＞
　本実施形態において、「マーカー陽性細胞」とは、特定のマーカータンパク質が、当該マーカータンパク質に対する抗体により認識できる量で細胞表面又は細胞内に発現している細胞を意味する。

　本実施形態において「Ｃｏｒｉｎ陽性細胞」とは、Ｃｏｒｉｎタンパク質が、抗Ｃｏｒｉｎ抗体により認識できる量で細胞表面に発現している細胞を意味する。Ｃｏｒｉｎ陽性細胞としては、例えば、後述する「細胞を選択する方法」で細胞を認識可能な量のＣｏｒｉｎタンパク質を、細胞表面上に発現している細胞が挙げられる。上記Ｃｏｒｉｎ陽性細胞としては、中脳底板細胞が挙げられ、さらに、所定の培養条件において、中脳底板細胞及びドパミン神経前駆細胞に分化可能な細胞が挙げられる。

　＜ＮＴ－３の濃度を測定する工程＞
　本工程では、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の培養上清における、ＮＴ－３の濃度を測定する。

　（ＮＴ－３の濃度）
　本実施形態において「ＮＴ－３」とは、神経栄養因子の１種である、ニューロトロフィン－３を意味する。培養上清における上記ＮＴ－３の濃度を測定する方法は、特に制限されず、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）、免疫化学発光法（ＣＬＩＡ法）、ラテックス凝集法、ラジオイムノアッセイ法、免疫比濁法、酵素活性測定法、色素結合法、ウエスタンブロッティング、ＨｕｍａｎＭＡＰ法、質量分析法、イムノクロマトグラフィー法、及びマルチプレックスサスペンションアレイシステムを用いた方法等が挙げられる。上記マルチプレックスサスペンションアレイシステムとしては、例えば、株式会社ジェネティックラボ製のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）が挙げられる。

　本実施形態の一側面において、検出感度の高い測定方法によって、培養上清における上記ＮＴ－３の濃度を測定してもよい。検出感度の高い測定方法を用いることによって、低濃度範囲（例えば、５ｐｇ／ｍｌ～２０ｐｇ／ｍｌ）における上記ＮＴ－３の濃度変化を鋭敏に、かつ早期に検出することができる。このような検出感度の高い測定方法としては、例えば、デジタルＥＬＩＳＡ法、及びＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ法（ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。

　本実施形態の一側面において、上記ＮＴ－３の濃度を測定する方法については、用いる細胞株、製造スケール、及び評価目的等に応じて適宜選択できる。また、具体的な製造工程に応じて、ＮＴ－３の濃度の上昇のみをモニターする方法、ＮＴ－３の濃度の上昇に加えてＮＴ－３の濃度の下降をモニターする方法を選択すればよく、予め製造工程におけるＮＴ－３の濃度変化を計測し、それぞれの製造工程に適合する方法を採用すればよい。

　上記培養上清は、上記多能性幹細胞の分化誘導剤を含む培地での培養開始後（「分化誘導開始後」ともいう。）４８時間から２４０時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であることが好ましい。ここで、「培養開始後４８時間から２４０時間のいずれかの時点」とは、中脳底板領域の神経系細胞への分化が正常に進行する場合において、培養上清中にＮＴ－３が検出され得る限り特に限定はなく、任意に選択される。すなわち、培養液から培養上清を採取するタイミングは、培養開始後４８時間から２４０時間のいずれかの時点であって、ＮＴ－３が検出され得る時点において、基準濃度以上のＮＴ－３の濃度が検出され得ることに基づき、個々の中脳底板領域の神経系細胞、ドパミン神経前駆細胞等目的とする細胞の製造方法に応じて、適宜設定することができる。例えば、一態様において、上記培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であってもよく、本実施形態の他の側面においては上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から７２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であってもよい。本実施形態の他の側面において、上記培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後（分化誘導開始後）１２０時間から１９２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であってもよい。培養上清を採取する回数に特に限定はない。ここで、「多能性幹細胞の分化誘導剤を含む培地での培養開始」とは、後述する上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む、及び／又はｂＦＧＦ等の多能性維持に必要な因子を含まず多能性を維持することができない条件の培地での多能性幹細胞の培養開始を意味する。一態様として、多能性幹細胞の培養（例えば拡大培養）において使用する培地を、分化誘導に用いられる培地に交換することによる培養開始を意味する。

　分化誘導開始後、分化誘導工程において細胞培養が適切に行われるためには、ＮＴ－３の濃度を測定するか否かに関わらず培地交換が行われる。培地交換の頻度は、細胞に必要な分化誘導剤及び栄養源が適切に補充されれば特に限定はないが、通常約１２時間毎、約２４時間毎、４８時間毎、７２時間毎に培地交換が行われる。また、培地交換の方法としては、培地の全量を交換してもよいし、３／４量、半量、１／３量、１／４量等、一部の培地を交換してもよい。ここにおいて、同じ成分からなる培地で培養を継続する場合には、一般的には、当該培養の継続する期間を通じて、一定の方法での培地交換が行われる。従って、培養上清に含まれるＮＴ－３の濃度は培地交換の頻度、交換の方法の影響を受ける。そのため、個々の製造工程に応じて、検出されるＮＴ－３の濃度は変動するが、適切なタイミングで培養上清を採取することができる。また、製造工程ごとに適切な基準濃度を設定することができる。すなわち、基準濃度を設定する場合、培地交換の方法、スケジュールを考慮して製造工程で行われる培養上清の採取と合わせることが望ましい。
　なお、「ＮＴ－３の濃度」は、一定期間に細胞が産生するＮＴ－３の量と相関していることが望ましい。例えば、一定期間で全量を交換する培地交換により、採取された培養上清における濃度であれば、採取時点より前の培地交換から採取時点の培地交換までに分泌されたＮＴ－３濃度が測定され、本明細書における「ＮＴ－３の濃度」を意味する。従って、培地交換時に培養上清を採取する場合、培地交換操作において廃棄される培養上清におけるＮＴ－３の濃度に相当する。例えば、２４時間ごとに培地交換を行っている培養上清の廃液における「ＮＴ－３の濃度」は、先に培地交換を行った時点から次の培地交換のタイミングである２４時間経過後までの培養上清に細胞が分泌したＮＴ－３の量に相当する「ＮＴ－３の濃度」となる。
　一態様において、培地交換を行っていない培地中の、培養上清の一部サンプリングを行った場合、すなわち２回のサンプリングの間に一度も培地交換が行われない場合は、培養液に含まれる細胞が分泌するＮＴ－３の積算量を測定することになる。従って、２回のサンプリングのＮＴ－３の濃度の差分を算出すれば、２回目のサンプリング時の「ＮＴ－３の濃度」に相当する。
　培地を全量交換し、廃液を採取する際には、培地は全体が攪拌されるため問題ないが、培養容器から培地の一部を採取する場合には、細胞と培養上清のサンプリング位置の距離によってＮＴ－３の濃度が異なる可能性を考慮し、採取する位置を予め決定しておくか、培地を緩やかに攪拌しＮＴ－３濃度が均一になるようにしてから、培養上清を採取することが望ましい。

　「培養上清」とは、多能性幹細胞等の細胞及び培地を含む培養液における液体成分を意味する。本実施形態の一側面において、上記培養上清は、上記培養液から細胞を除去したものと把握することもできる。本実施形態の一側面において、上記培養上清は、（ＳＭＡＤ阻害剤による）神経系細胞への分化誘導と（後述するＳＨＨによる）腹側化を行っている段階の培養上清と把握することもできる。また、本実施形態の一側面において、上記培養上清は、（ＳＭＡＤ阻害剤による）神経系細胞への分化誘導と（後述するＳＨＨによる）腹側化を行っており、かつ（後述するＷＮＴシグナルの亢進による）後方化を行う２４時間前から２４時間後の段階にある培養上清と把握することもできる。本実施形態の他の側面において、上記培養上清は、（ＳＭＡＤ阻害剤による）神経系細胞への分化誘導と（後述するＳＨＨによる）腹側化を行っており、かつ（後述するＷＮＴシグナルの亢進による）後方化を行う２４時間前から１２０時間後の段階にある培養上清と把握することもできる。本実施形態の他の側面において、上記培養上清は、（ＳＭＡＤ阻害剤による）神経系細胞への分化誘導が開始され、（後述するＳＨＨによる）腹側化及び／又は（後述するＷＮＴシグナルの亢進による）後方化が進行している段階にある培養上清と把握することもできる。
　接着培養や細胞凝集体の培養を行っている場合であれば、遠心分離を行うことなくピペットなどを用いて培養液から培養上清を回収することが可能である。また、培地交換時に廃棄される培養上清を回収することもできる。

　（培地）
　本実施形態において、多能性幹細胞を中脳底板領域の神経系細胞へ分化誘導するための培地は、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む。上記培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。上記基礎培地はＧＭＥＭ培地であることが好ましい。培地には、血清が含有されていてもよいし、含有されていなくてもよい。血清が含まれていない培地を、無血清培地という場合がある。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。上記培地は、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質を含んでもよい。好ましい培地は、ＫＳＲ、２－メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびピルビン酸を含有するＧＭＥＭ培地である。この培地に対して適宜後述するＢＭＰシグナル伝達阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達活性物質、ＦＧＦ８（線維芽細胞増殖因子８）およびＷｎｔシグナル伝達活性物質（例えばＧＳＫ－３β阻害物質）からなる群より選択される１又は２以上の試薬（すなわち分化誘導剤）が、適切に組み合わされて加えられた１又は複数種類の培地を、適切な順番で組み合わせて順次用いることで培養することができる。

　（中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤）
　本実施形態において「中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤」とは、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化を誘導する薬剤（物質）、又は当該薬剤の組合せを意味する。すなわち、多能性幹細胞を中脳底板領域の神経系細胞へと分化を誘導するために必要な、薬剤と「当該薬剤を含む培地を用いる時期」の組合せも、「中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤」の概念に含まれる。上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤は特に限定されないが、例えば非特許文献２（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇｕｓｔ　２０２０，Ｖｏｌｕｍｅ　８，Ａｒｔｉｃｌｅ　７２９）に記載の分化誘導方法で利用されている分化誘導剤を用いることができる。また、一例としては、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を含む培養条件を用いることができ、少なくとも１種類のＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を含む培養条件が好ましい。言い換えると、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤は、少なくとも１種のＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を含むことが好ましい。一例としては、２種類以上のＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を使用する場合、使用する全てのＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を含む培地を使用して培養してもよいし、使用するＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質の一部を含む培地を、経時的に組合せて培養してもよい。言い換えると、使用する全てのＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を同時に培地に添加してもよいし、使用するＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質のそれぞれを、適切な時期に逐次培地に添加してもよい。

　本実施形態において、「ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質」とは、転写因子であるＳＭＡＤ（Ｓｍａｌｌ　Ｍｏｔｈｅｒｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）を介するシグナル伝達を阻害する物質を意味する。上記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質は、少なくとも１種のＢＭＰシグナル伝達阻害物質及び少なくとも１種のＴＧＦβシグナル伝達阻害物質を含むことが好ましい。

　本実施形態において「ＢＭＰシグナル伝達阻害物質」とは、シグナルタンパク質であるＢＭＰ（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を介するシグナル伝達を阻害する物質を意味する。上記ＢＭＰシグナル伝達阻害物質としては、例えば、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（すなわち、６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３－４１；Ｊ．Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）およびＬＤＮ－１９３１８９（すなわち、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＤＭＨ１、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ－２１４１１７、ＬＤＮ－２１２８５４、ＭＬ３４７（ＬＤＮ１９３７１９）が挙げられる。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ－１９３１８９は市販されており、それぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。上記ＢＭＰシグナル伝達阻害物質は、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＭＨ１、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ－２１４１１７、ＬＤＮ－２１２８５４、ＭＬ３４７（ＬＤＮ１９３７１９）及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

　培養液中におけるＬＤＮ－１９３１８９の濃度は、ＢＭＰを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ～５０μＭ、好ましくは１ｎＭ～１０００ｎＭ、より好ましくは５０ｎＭ～３００ｎＭであり、より具体的には、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。
　ＢＭＰシグナル伝達阻害物質として他の物質を使用する場合、上述のＬＤＮ－１９３１８９の濃度に相当するＢＭＰシグナル伝達阻害活性を示す濃度を適宜採用することができる。

　本実施形態において「ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質」とは、増殖因子であるＴＧＦβ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－β）を介するシグナル伝達を阻害する物質を意味する。上記ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質としては、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、またはＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられ、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、Ｌｅｆｔｙ－２、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００３，２：２０）、ＳＢ－５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（ＷＯ２００９／１４６４０８）、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＳＢ－５２５３３４、Ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ（Ｓ－７７０１）、ＧＷ７８８３８８、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ）、ＴＰ０４２７７３６、ＢＩＢＦ－０７７５、ＬＹ３２００８８２、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ（ＴＥＷ－７１９７）、ＩＴＤ－１およびこれらの誘導体などが例示される。上記ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質は、ＳＢ－４３１５４２、Ａ－８３－０１、Ｌｅｆｔｙ－１、Ｌｅｆｔｙ－２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＳＢ－２０２１９０、ＳＢ－５２５３３４、ＳＢ－５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、Ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ（Ｓ－７７０１）、ＧＷ７８８３８８、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ２０８、ＴＰ０４２７７３６、ＢＩＢＦ－０７７５、ＬＹ３２００８８２、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ（ＴＥＷ－７１９７）、ＩＴＤ－１、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７及びＬＹ５８０２７６からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましく、ＳＢ－４３１５４２、Ａ－８３－０１、Ｌｅｆｔｙ－１、Ｌｅｆｔｙ－２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＳＢ－２０２１９０、ＳＢ－５２５３３４、ＳＢ－５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、Ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ（Ｓ－７７０１）、ＧＷ７８８３８８、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ２０８、ＩＴＤ－１、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７及びＬＹ５８０２７６からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが、より好ましい。

　本実施形態の一側面において、上記ＢＭＰシグナル伝達阻害物質は、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＭＨ１、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ－２１４１１７、ＬＤＮ－２１２８５４、ＭＬ３４７及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１種を含み、上記ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質は、ＳＢ－４３１５４２、Ａ－８３－０１、Ｌｅｆｔｙ－１、Ｌｅｆｔｙ－２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＳＢ－２０２１９０、ＳＢ－５２５３３４、ＳＢ－５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、Ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ（Ｓ－７７０１）、ＧＷ７８８３８８、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ２０８、ＴＰ０４２７７３６、ＢＩＢＦ－０７７５、ＬＹ３２００８８２、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ（ＴＥＷ－７１９７）、ＩＴＤ－１、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７及びＬＹ５８０２７６からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

　培養液中におけるＡ－８３－０１の濃度は、ＡＬＫ５を阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１００ｎＭ～５μＭ、より好ましくは３００ｎＭ～１μＭであり、より具体的には、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。
　ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質として他の物質を使用する場合、上述のＡ－８３－０１の濃度に相当するＴＧＦβシグナル伝達阻害活性を示す濃度を適宜採用することができる。

　（ＳＨＨシグナル伝達活性物質及びＷｎｔシグナル伝達活性物質）
　本実施形態の一側面において、上記培地は、ＳＨＨシグナル伝達活性物質及びＷｎｔシグナル伝達活性物質を更に含むことが好ましい。

　「ＳＨＨシグナル伝達活性物質」とは、ＳＨＨ（Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ）により媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質を意味する。ＳＨＨシグナル伝達活性物質としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えば、ＳＨＨやＩＨＨ）及びその断片並びに修飾体・変異体、ＳＨＨ受容体、ＳＨＨ受容体アゴニスト、Ｈｈ－Ａｇ１．５（Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２１５～２２１（２００５）．）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ，ＳＡＧ（Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（３－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ）－１，４－ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）、２０ａ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅおよびこれらの誘導体などが挙げられる（Ｓｔａｎｔｏｎ　ＢＺ，Ｐｅｎｇ　ＬＦ．，Ｍｏｌ　Ｂｉｏｓｙｓｔ．６：４４－５４，２０１０）。上記ＳＨＨシグナル伝達活性物質は、ＳＨＨ及びその断片（例えば、Ｓｈｈ　（Ｃ２４ＩＩ）　Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｓｈｈ　（Ｃ２５ＩＩ）　Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ）並びに修飾体、ＳＨＨ受容体、ＳＨＨ受容体アゴニスト、Ｈｈ－Ａｇ１．５、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ、２０ａ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、並びに、ＳＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
　一例としては、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質とＳＨＨシグナル伝達活性物質を組み合わせて使用することができる。これらの薬剤を組み合わせて使用する場合、使用する全ての薬剤を含む培地を使用して培養してもよいし、使用する薬剤の一部を含む培地を、経時的に組合せて培養してもよい。言い換えると、使用する全ての薬剤を同時に培地に添加してもよいし、使用する薬剤のそれぞれを、適切な時期に逐次培地に添加してもよい。

　培養液中におけるＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅの濃度は、Ｇｌｉ２を活性化する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ～５０μＭ、好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ、より好ましくは５００ｎＭ～５μＭであり、より具体的には１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。ＳＨＨシグナル伝達活性物質として他の物質を使用する場合、上述のＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅの濃度に相当するＳＨＨシグナル伝達活性を示す濃度を適宜採用することができる。

　「Ｗｎｔシグナル伝達活性物質」とは、Ｗｎｔタンパク質がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合することにより生じるシグナル伝達を活性化する物質を意味する。上記Ｗｎｔシグナル伝達活性物質は、ＷＮＴ３Ａ、及び、ＧＳＫ－３β阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

　「ＧＳＫ－３β阻害物質」とは、ＧＳＫ－３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質を意味する。上記ＧＳＫ－３β阻害物質としては、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ－３β　阻害剤ＩＸ；６－ブロモインジルビン３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ－３β　阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ－３β　ペプチド阻害剤；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱｐＳＰ－ＮＨ_２（配列番号１））および高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅ　ｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＣＨＩＲ９８０１４、及びＳＫＬ２００１が挙げられる。これらの化合物は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社やＢｉｏｍｏｌ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。上記ＧＳＫ－３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＫＬ２００１、ＳＢ２１６７６３、ＧＳＫ－３β　阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）及びＬ８０３－ｍｔｓからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

　培養液中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、例えば、１ｎＭ～５０μＭ、好ましくは１０ｎＭ～２０μＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１０μＭであり、より具体的には１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達活性物質又はＧＳＫ３β阻害物質として他の物質を使用する場合、上述のＣＨＩＲ９９０２１の濃度に相当するＷｎｔシグナル伝達活性又はＧＳＫ３β阻害活性を示す濃度を適宜採用することができる。
　一例としては、Ｗｎｔシグナル伝達活性物質又はＧＳＫ３β阻害物質と、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質及びＳＨＨシグナル伝達活性物質を組み合わせて使用することができる。その場合、これらの薬剤全てを同時に培地に添加する必要はなく、適宜、分化誘導可能なように、経時的に組合せて培養してもよい。言い換えると、使用する薬剤のそれぞれを、適切な時期に逐次培地に添加してもよい。
　一例としては、（１）１以上、好ましくは２以上のＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を含む培地で培養する工程、及び（２）更にＳＨＨシグナル伝達活性物質を含む培地で培養する工程を経て、（３）更にＷｎｔシグナル伝達活性物質を含む培地で培養する工程、のように、経時的に培地に含まれる薬剤の種類を増やす又は減らす方法が挙げられる。

　本実施形態の一側面において、上記培地は、ＦＧＦ８（線維芽細胞増殖因子８）を含むことが好ましい。上記ＦＧＦ８は、特に限定されないが、ヒトＦＧＦ８の場合、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｅまたはＦＧＦ８ｆの４つのスプライシングフォームが例示され、より好ましくは、ＦＧＦ８ｂである。ＦＧＦ８は、例えばＷａｋｏ社やＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
　一例としては、ＦＧＦ８と、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達活性物質、及び、Ｗｎｔシグナル伝達活性物質又はＧＳＫ３β阻害物質を組み合わせて使用することができる。その場合、これらの薬剤全てを同時に培地に添加する必要はなく、適宜、分化誘導可能なように、経時的に組合せて培養してもよい。言い換えると、使用する薬剤のそれぞれを、適切な時期に逐次培地に添加してもよい。

　培養液中におけるＦＧＦ８の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬであり、より具体的には、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。

　＜測定したＮＴ－３の濃度を、基準濃度と比較する工程＞
　本工程では、測定した上記ＮＴ－３の濃度を、基準濃度と比較する。「基準濃度」とは、対象の多能性幹細胞が中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうるかどうかを判定するための基準となるＮＴ－３の濃度（カットオフ値）であり、任意に設定することができる。例えば、検出限界値と統計的に識別可能であれば、検出限界の値を含めて、任意の値を基準濃度として採用することができる。また、基準濃度は、多能性幹細胞を所定の条件で培養し、中脳底板領域の神経系細胞へ分化することに成功したときのＮＴ－３の濃度であってもよいし、あらかじめ設定された濃度であってもよい。あらかじめ設定された濃度は例えば、以下のようにして設定できる。すなわち、まず多能性幹細胞を分化誘導可能な培地及び培養条件で、すなわち中脳底板領域の神経系細胞の製造手順書（プロトコール）に沿って培養し、目標を達成する目的細胞が得られたとき、すなわち分化誘導効率が良好であったときの上記培養上清におけるＮＴ－３濃度を測定する。このような培養及び測定を複数回（少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回）行い、それぞれにおいて測定されたＮＴ－３濃度の平均値を、上記基準濃度として設定できる。又は、多能性幹細胞を、分化誘導可能な培地及び培養条件で培養したときの、目標を達成する目的細胞を得られたときの上記培養上清におけるＮＴ－３の濃度、及び目標を達成する目的細胞を得られなかったとき、すなわち分化誘導の効率が劣る場合の上記培養上清におけるＮＴ－３の濃度によって導かれるＲＯＣ曲線から推定される、基準濃度と感度及び特異度の関係とに基づき、使用者が必要とする感度と特異度となるような濃度を、上記基準濃度として設定できる。

　ここで、本明細書における、「目標を達成する目的細胞が得られたとき」または「分化誘導効率が良好であったとき」としては、目標に適合する量（割合）以上の目的細胞が得られた場合、すなわち製造の実績が挙げられる。「目標に適合する量（割合）」としては、適宜設定すればよく、例えば、培養している細胞全体を基準として２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上が挙げられる。

　本明細書における、「目標を達成する目的細胞を得られなかったとき」もしくは「分化誘導の効率が劣る場合」としては、ドパミン神経前駆細胞、又はその中間体である中脳底板細胞の細胞集団である中脳底板領域の神経系細胞の製造手順書（プロトコール）に沿って分化誘導を行ったにも関わらず、目標に適合する量（割合）の目的細胞が得られない場合が挙げられる。目標に適合する量の目的細胞が得られない「不適合」の結果を、少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回得た上で、それぞれにおいて測定されたＮＴ－３濃度の平均値を、「分化誘導の効率が劣る場合の上記培養上清におけるＮＴ－３の濃度」として設定することが望ましい。
　または、「目標を達成する目的細胞を得られなかったとき」もしくは「分化誘導の効率が劣る場合」として、例えば、基準値を設定すべく敢えて分化誘導効率が劣る培地又は培養条件で培養する場合、すなわち、目標に適合する量の目的細胞が得られない「不適合」のモデルケースを設定する場合が挙げられる。そのような不適合のモデルケースとして、目的細胞を得るために適切とされる、すなわちドパミン神経前駆細胞、又はその中間体である中脳底板細胞の細胞集団である中脳底板領域の神経系細胞やドパミン神経前駆細胞の製造手順書（プロトコール）で適切に管理されることが求められる条件（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を、一部製造手順書の規定から故意に逸脱させた条件で分化誘導を行うことが挙げられる。この場合、目標に適合する量の目的細胞が得られない「不適合」の結果を、前記規定から逸脱させた分化誘導で少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回得た上で、それぞれにおいて測定されたＮＴ－３濃度の平均値を、「分化誘導の効率が劣る場合の上記培養上清におけるＮＴ－３の濃度」として設定することが望ましい。ここで、「一部製造手順書の規定から逸脱させた条件」とは、目的細胞への分化誘導は適切に進行するものの目標に適合する量に到達できない条件を意味している。そもそも目的細胞への分化誘導が起こらないような条件及び、目的細胞への分化誘導に対して著しく影響を与える条件は基準値設定の目的で行われモデルケースとして適切ではなく、このような条件は、基準値を決定する目的で「一部製造手順書の規定から逸脱させた条件」に含まれない。例えば、目的細胞が、培養している細胞全体に占める割合が常に１５％以下、１０％以下、又は５％以下となるような培養条件は、上述の「一部製造手順書の規定から逸脱させた条件」に含まれないとすることが望ましい。例えば、上述の「目標に適合する量（割合）」として設定した細胞全体における目的細胞の割合に応じて、当該割合に対して、２０％以下（１５％以下、１０％以下、又は５％以下）となるような培養条件は上述の「一部製造手順書の規定から逸脱させた条件」に含まれないとすることもまた望ましい。

　ここで、製造手順書（プロトコール）で適切に管理されることが求められる条件（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）としては、基本的な分化誘導方法が維持されている前提で、目的細胞の生産効率に影響を与え得る培養条件が挙げられ、例えば、培地成分、培地の新鮮さ、培地温度、培地ｐＨ、二酸化炭素濃度等の培養条件、物理的なストレスが少ない細胞の取り扱い（ピペッティングや分離等の手技）、細菌やウイルスによるコンタミを起こさないこと、継代や培地交換の方法や頻度などが挙げられる。

　また、ＮＴ－３濃度の検出を行う適切なタイミングについても、多能性幹細胞を分化誘導可能な培地及び培養条件で培養し、すなわち中脳底板領域の神経系細胞やドパミン神経前駆細胞の製造手順書（プロトコール）に沿って培養し、効果的にＮＴ－３濃度を測定できるよう、適宜設定することができる。例えば、培養及び測定を経時的に複数回（例えば２回、好ましくは５回）行い、ＮＴ－３濃度を検出可能なタイミングを適宜設定できる。
　一態様として、培地交換時に、一部廃液を回収し、ＮＴ－３濃度を測定してもよく、適宜適切な測定頻度を設定できる。例えば、培地交換毎に測定してもよい。

　上記基準濃度として具体的には、０．１ｐｇ／ｍｌ以上１００００ｐｇ／ｍｌ以下の間で１点に設定されることが好ましく、０．３ｐｇ／ｍｌ以上３０００ｐｇ／ｍｌ以下、更に具体的には、０．３ｐｇ／ｍｌから１００ｐｇ／ｍｌの間で１点に設定されることがより好ましい。

　本実施形態の一側面において、基準濃度として、ＮＴ－３の分泌量が増加する前のＮＴ－３の濃度を用いてもよい。例えば、基準濃度として分化誘導開始後４８時間以内、好ましくは２４時間以内に測定したＮＴ－３の濃度を用いてもよい。

　＜培養液中の細胞が中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程＞
　本工程では、上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度以上であるとき、ＮＴ－３の濃度を計測した時点の培養液中の細胞（例えば、多能性幹細胞、当該多能性幹細胞に由来する細胞）が、上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうる、すなわち中脳底板領域の神経系細胞への分化能を有する、更にはドパミン神経前駆細胞への分化能を有すると判定する。本実施形態の一側面において、「分化しうる」とは「分化する可能性がある」と把握することもできる。
　また、本実施形態の一側面において、「分化しうる」とは、中脳底板領域の神経系細胞の製造において、分化誘導の工程で目標とする量の中脳底板領域の神経系細胞が得られると期待できることを意味してもよい。また、本実施形態の一側面において、「分化しうると判定する」とは、中脳底板領域の神経系細胞の製造において、分化誘導の工程を管理する上で、当該工程が順調に進捗すると判断することである。
　また、本実施形態の一側面において、中脳底板領域の神経系細胞の製造において、分化誘導の工程で目標とする量の中脳底板領域の神経系細胞が得られないと推定される場合が、「分化しうると判定できない」場合に相当する。
　さらに本発明の「ＮＴ－３の濃度」を用いることにより、培養液中の細胞が中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定するだけでなく、「細胞医薬品として治療に用いることができるレベル（グレード）の原薬であるドパミン神経前駆細胞」を製造するための中間体細胞として、求められる質と量を充足するか否かを製造工程の初期の段階で判定することにも応用することができる。

　本発明の方法により、多能性幹細胞からドパミン神経前駆細胞を分化誘導する初期の段階で、細胞が適切に目的細胞への分化を運命付けられていることを、早期に判断することができる。さらに、本発明の判定方法は、製造工程を管理する上で非常に有用である。また、多能性幹細胞の細胞株について、目的細胞への分化誘導に適していることを、本発明の判定方法を利用して判断することもできる。また、製造のスケールアップの条件を最適化する場合に、分化誘導効率を判定するために利用することもできる。

　本実施形態の一側面において、「上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度以上である」とは、上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度と同等である場合、及び、上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度より高い場合を含む概念である。例えば、上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度に対して１倍～１０００倍であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定することが好ましく、上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度に対して１．２倍～１０００倍であるとき、上記ＮＴ－３の濃度を計測した時点の培養液中に含まれる細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定することがより好ましい。

　本発明の判定方法で中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定された細胞集団が中脳底板領域の神経系細胞へ分化する割合は、培養条件、使用する多能性幹細胞によって変化し得るが、例えば、培養している細胞全体を基準として２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上の割合が中脳底板領域の神経系細胞へ分化すると考えられる。

　本実施形態の一側面において、効率的に分化誘導を行う観点から、上記ＮＴ－３の濃度が上記基準濃度未満であるとき、培養液中の細胞または培養液そのものを廃棄してもよい。上記廃棄を行うかどうかの判断及び廃棄のタイミングは、製造方法、培養のスケール、使用する細胞の種類・株、最終的に必要な細胞の量、目標とするグレード、予備的な培養の可否及びその進行状況、製造全体のスケジュール、他の判断方法の有無、判断までに要した日数、並びに、コスト等に応じて適宜変更することが望ましい。

　≪多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法（２）≫
　本実施形態に係る多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する第二の方法は、
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清及び第二の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度から、上記ＮＴ－３の濃度の変化率を求める工程と、
　上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値を、基準変化率と比較する工程と、
　上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　上記第二の培養上清は、上記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間のいずれかの時点又は上記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である。以下詳細に説明する。なお、多能性幹細胞は、上述した第一の方法で挙げられた細胞を用いることが可能である。

　＜ＮＴ－３の濃度を測定する工程＞
　本工程では、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清及び第二の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する。濃度の測定方法は、上述した第一の方法で挙げられた測定方法を採用することができる。

　上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、一態様において、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であってもよい。また別の態様においては、上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から７２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であってもよい。

　上記第二の培養上清は、一態様としては、分化開始時又はそれ以降のタイミングであって、かつ第一の培養上清の採取前の時点までの間、例えば、分化開始後２４時間～９６時間後（好ましくは、２４時間～７２時間後）であって、第一の培養上清採取前に上記培養液から採取される。すなわち、上記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間（好ましくは、２４時間から７２時間）のいずれかの時点が挙げられる。
　また、上記第二の培養上清は、一態様としては、第一の培養上清の採取後に上記培養液から採取される。すなわち、上記第一の培養上清の採取後２４時間以降であって中脳底板領域の神経系細胞への分化が完了するまでのいずれかの時点が挙げられる。
　ここで、「中脳底板領域の神経系細胞へ分化が完了する」とは、中脳底板領域の神経系細胞のマーカーを発現する程度まで細胞分化が進んだ状態を意味する。このとき、中脳底板領域の神経系細胞からさらに分化が進んだ神経系細胞が、上記培養液に含まれてもよい。具体的には、複数の中脳底板領域の神経系細胞のマーカーが検出される分化段階が挙げられる。当該マーカーとしては、Ｃｏｒｉｎ、Ｆｏｘａ２、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ及びＣＤ１４２等を例示することができる。
　上記第二の培養上清は、上記第一の培養上清の採取前２４時間から４８時間のいずれかの時点又は上記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間（より好ましくは、２４時間から７２時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であることが好ましい。ここで、「第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間のいずれかの時点」とは、第一の培養上清を採取する時点から２４時間前の時点と、第一の培養上清を採取する時点から９６時間前の時点と、に挟まれた期間におけるいずれかの時点を意味する。

　上記多能性幹細胞を培養する培地の組成は、上述した第一の方法で挙げられた組成を採用することができる。

　＜ＮＴ－３の濃度の変化率を求める工程＞
　本工程では、上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度から、上記ＮＴ－３の濃度の変化率を求める。上記ＮＴ－３の濃度の変化率は、以下の式で求めることが可能である。
　第二の培養上清が第一の培養上清よりも前に採取された場合
　（ＮＴ－３の濃度の変化率）＝｛（第一の培養上清におけるＮＴ－３の濃度）－（第二の培養上清におけるＮＴ－３の濃度）｝／｛（第一の培養上清を採取した時間）－（第二の培養上清を採取した時間）｝
　第二の培養上清が第一の培養上清よりも後に採取された場合
　（ＮＴ－３の濃度の変化率）＝｛（第二の培養上清におけるＮＴ－３の濃度）－（第一の培養上清におけるＮＴ－３の濃度）｝／｛（第二の培養上清を採取した時間）－（第一の培養上清を採取した時間）｝

　本実施形態の一側面において、培養上清中のＮＴ－３の濃度は、分化開始から１２日目までの期間（上記多能性幹細胞の培養開始から２８８時間後までの期間）において、一時的に上昇して２４時間又は４８時間で低下してもよい。本実施形態の他の側面において、培養上清中のＮＴ－３の濃度は、分化開始から１２日目までの期間において、一時的に上昇し、上昇した期間が１６８時間程度持続してもよい。ここで「上昇した期間」とは、ＮＴ－３の濃度がベースラインの値よりも高くなっている期間を意味しており、ベースラインの値よりも高ければ、一時的にＮＴ－３の濃度が一定であったり、低下したりしていても「上昇した期間」に含まれる。
　本実施形態の一側面において、培養上清中のＮＴ－３の濃度は、分化開始から１２日目までの期間（上記多能性幹細胞の培養開始から２８８時間後までの期間）において、継続的に上昇してもよい。
　第一の培養上清と第二の培養上清を採取するタイミングは、各分化誘導工程における上記ＮＴ－３の濃度変化の特徴に応じて、適宜設定することができる。

　＜ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値を、基準変化率と比較する工程＞
　本工程では、上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値を、基準変化率と比較する。「基準変化率」とは、対象の多能性幹細胞が中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうるかどうかを判定するための基準となるＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値（カットオフ値）であり、任意に設定することができる。基準変化率は、中脳底板領域の神経系細胞へ分化することが予め知られている多能性幹細胞を所定の条件で培養したとき求められたＮＴ－３の濃度における変化率の絶対値であってもよいし、あらかじめ設定された変化率の絶対値であってもよい。あらかじめ設定された変化率の絶対値は例えば、以下のようにして設定できる。すなわち、まず多能性幹細胞を分化誘導可能な培地及び培養条件で、すなわち中脳底板領域の神経系細胞の製造手順書（プロトコール）に沿って培養し、目標を達成する目的細胞が得られたとき、すなわち分化誘導効率が良好であったときの「ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値」を求める。このような培養及び測定を複数回（少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回）行い、それぞれにおいて求められた「ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値」の平均値を、上記基準変化率として設定できる。又は、多能性幹細胞を、分化誘導可能な培地及び培養条件で培養したときの、目標を達成する目的細胞を得られたときの「ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値」、及び目標を達成する目的細胞をえられなかったとき、すなわち分化誘導の効率が劣る場合の「ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値」によって導かれるＲＯＣ曲線から推定される、基準変化率と感度及び特異度の関係とに基づき、使用者が必要とする感度と特異度となるような変化率の絶対値を、上記基準変化率として設定できる。ここで、「目標を達成する目的細胞が得られたとき」および「分化誘導効率が良好であったとき」の意味、ならびに、「目標を達成する目的細胞を得られなかったとき」および「分化誘導の効率が劣る場合」の意味は、それぞれ上記第一の方法の＜測定したＮＴ－３の濃度を、基準濃度と比較する工程＞の欄において述べた意味と同様である。

　また、本実施形態の一側面において、第二の培養上清が第一の培養上清よりも前に採取される場合、第一の培養上清におけるＮＴ－３の濃度が、第二の培養上清におけるＮＴ－３の濃度よりも高くなることを検出できるように、それぞれの培養上清を採取するタイミングを設定すればよい。この場合において、上述の変化率を算出してもよいし、第一の培養上清におけるＮＴ－３濃度が、第二の培養上清のＮＴ－３濃度よりも高いことでもって判定してもよい。
　また、本実施形態の一側面において、第二の培養上清が第一の培養上清よりも後に採取される場合、第二の培養上清におけるＮＴ－３の濃度が、第一の培養上清におけるＮＴ－３の濃度よりも低くなることを検出できるように、それぞれの培養上清を採取するタイミングを設定すればよい。この場合において、上述の変化率を算出してもよいし、第二の培養上清におけるＮＴ－３濃度が、第一の培養上清のＮＴ－３濃度よりも低いことでもって判定してもよい。

　上記基準変化率は、０．１ｐｇ／ｍｌ・ｄａｙ以上５００ｐｇ／ｍｌ・ｄａｙ以下の間で１点に設定されることが好ましく、５ｐｇ／ｍｌ・ｄａｙ以上５０ｐｇ／ｍｌ・ｄａｙ以下の間で１点に設定されることがより好ましい。

　＜培養液中の細胞が中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程＞
　本工程では、上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する。

　本実施形態の一側面において、「上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率以上である」とは、上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率と同等である場合、及び、上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率より高い場合を含む概念である。例えば、上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率に対して１倍～１００００倍であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定することが好ましく、上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率に対して１倍～１０００倍であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定することがより好ましい。

　中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定された細胞集団が中脳底板領域の神経系細胞へ分化する割合は、培養条件、使用する多能性幹細胞によって変化し得るが、例えば、培養している細胞全体を基準として１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上の割合が中脳底板領域の神経系細胞へ分化すると考えられる。

　本実施形態の一側面において、効率的に分化誘導を行う観点から、上記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が上記基準変化率未満であるとき、培養液中の細胞または培養液そのものを廃棄してもよい。上記廃棄を行うかどうかの判断及び廃棄のタイミングは、製造方法、培養のスケール、使用する細胞の種類・株、最終的に必要な細胞の量、目標とするグレード、予備的な培養の可否及びその進行状況、製造全体のスケジュール、他の判断方法の有無、判断までに要した日数、並びに、コスト等に応じて適宜変更することが望ましい。

　≪多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法（３）≫
　本実施形態に係る多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する第三の方法は、
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清、第二の培養上清及び第三の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度、上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第三の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度を比較する工程と、
　上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度が、上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第三の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度より高いとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　上記第二の培養上清は、上記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　上記第三の培養上清は、上記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である。

　＜ＮＴ－３の濃度を測定する工程＞
　本工程では、上記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で上記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清、第二の培養上清及び第三の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する。濃度の測定方法は、上述した第一の方法で挙げられた測定方法を採用することができる。

　上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であってもよく、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であってもよい。上記第一の培養上清は、上記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から７２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であることがより好ましい。

　上記第二の培養上清は、一態様としては、分化開始時又はそれ以降のタイミングであって、かつ第一の培養上清の採取前の時点までの間、例えば、分化開始後２４時間～９６時間後（好ましくは、２４時間～７２時間後）であって、第一の培養上清採取前に上記培養液から採取される。すなわち、上記第二の培養上清は、上記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間（より好ましくは、２４時間から７２時間）のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、上記第一の培養上清の採取前２４時間から４８時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であることが好ましい。
　ここで、本実施形態の一側面において、第二の培養上清におけるＮＴ－３の濃度が、第一の培養上清におけるＮＴ－３の濃度よりも高くなることを検出できるように、それぞれの培養上清を採取するタイミングを設定すればよい。

　上記第三の培養上清は、上記第一の培養上清の採取後２４時間以降であって中脳底板領域の神経系細胞への分化が完了するまでのいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、上記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であることが好ましく、上記第一の培養上清の採取後２４時間から７２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であることが好ましい。
　また、本実施形態の一側面において、第三の培養上清におけるＮＴ－３の濃度が、第一の培養上清におけるＮＴ－３の濃度よりも低くなることを検出できるように、それぞれの培養上清を採取するタイミングを設定すればよい。
　ここで、「中脳底板領域の神経系細胞へ分化が完了する」とは、中脳底板領域の神経系細胞のマーカーを発現する程度まで細胞分化が進んだ状態を意味する。このとき、中脳底板領域の神経系細胞からさらに分化が進んだ神経系細胞が、上記培養液に含まれてもよい。具体的には、複数の中脳底板領域の神経系細胞のマーカーが検出される分化段階が挙げられる。当該マーカーとしては、Ｃｏｒｉｎ、Ｌｒｔｍ１、Ｆｏｘａ２、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ及びＣＤ１４２等を例示することができる。

　＜ＮＴ－３の濃度を比較する工程＞
　本工程では、上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度、上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第三の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度を比較する。

　＜培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程＞
　本工程では、上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度が、上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第三の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度より高いとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する。

　本実施形態の一側面において、上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度と、上記第二の培養上清及び上記第三の培養上清それぞれにおける上記ＮＴ－３の濃度のうち低い方との濃度差が５ｐｇ／ｍｌ以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定することが好ましく、上記濃度差が１０ｐｇ／ｍｌ以上であるとき、上記培養液中の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定することがより好ましい。

　本実施形態の一側面において、効率的に分化誘導を行う観点から、上記第一の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度が、上記第二の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度及び上記第三の培養上清における上記ＮＴ－３の濃度と同じである、またはそれより低いとき、培養液中の細胞または培養液そのものを廃棄してもよい。上記廃棄を行うかどうかの判断及び廃棄のタイミングは、製造方法、培養のスケール、使用する細胞の種類・株、最終的に必要な細胞の量、目標とするグレード、予備的な培養の可否及びその進行状況、製造全体のスケジュール、他の判断方法の有無、判断までに要した日数、並びに、コスト等に応じて適宜変更することが望ましい。

＜複数因子を用いる判定方法＞
　一実施態様において、本発明の判定方法は、判定の指標となる物質として、上述したＮＴ－３に加えて、中脳底板領域の神経系細胞への分化の過程において上記培養上清中で検出される、上記ＮＴ－３以外の１又は複数の物質と組合せて実施することもできる。

　「ＮＴ－３以外の１又は複数の物質」としては、特に限定はなく、培養上清に含まれる濃度と、中脳底板領域の神経系細胞への分化との相関関係が認められる物質に対して例えば、単変量ロジスティック回帰分析で、本発明の判定方法に対する有用性があると判断された物質を適宜選択することができる。

　上記ＮＴ－３と「ＮＴ－３以外の１又は複数の物質」とを組み合わせて、本発明の判定方法を行う場合、予め多変量ロジスティック回帰分析またはＣｏｘ回帰分析等を用いて、上記組み合わせにおいて中脳底板領域の神経系細胞への分化能を判定するのに最適なモデル式を求め、求められた上記モデル式に基づいて、中脳底板領域の神経系細胞への分化能を判定してもよい。

＜培養装置を用いた判定方法＞
　本実施形態の一側面において、上記判定方法は、多能性幹細胞を分化誘導するための培養装置において利用することができる。上記培養装置としては、例えば、目的の細胞を液体培地中で培養する培養槽と、上記培養槽に新鮮な液体培地を供給する培地供給部と、上記培養槽から液体培地を排出する培地排出部を備えている培養装置が挙げられる。上記培地排出部より採取された培地交換のために排出された液体培地は、上述の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法（１）～（３）における培養上清に相当する。当該培養装置としては、例えば、株式会社日立製作所製のｉＰＳ細胞大量自動培養装置「ｉＡＣＥ２」が挙げられる。
　また、上記培養装置は、目的の細胞を液体培地中で培養する培養槽と、上記培養槽に新鮮な液体培地を供給する培地供給部と、上記培養槽から液体培地を排出する培地排出部に加えて、排出された上記液体培地に含まれる上記ＮＴ－３の濃度を測定する測定部と、測定した上記ＮＴ－３の濃度に基づいて上記目的の細胞が上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうるかどうかを判定する分化能判定部とを備えてもよい。
　上記培養装置は、細胞培養中の培地交換を自動で行うためのシステムを備えており、培地を排出し新たな培地を注入することができる。そのため、排出される培地、すなわち廃液を非侵襲的に採取し、成分分析に供することで本発明の判定方法を実施することができる。例えば、採取された培地交換時の廃液に含まれるＮＴ－３を測定するための分析装置（測定部）を上記培養装置に組み込み、中脳底板領域の神経系細胞への分化能を有するロットのみ選別して培養を継続することもできる。

　上記培養装置は、細胞の播種、培養、観察を無菌環境で行えるようにする観点から、培養容器及び培地の流路には完全閉鎖系の流路モジュールが用いられていることが好ましい。

　以上、本実施形態に係る多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法について説明した。当該判定する方法は、細胞医薬品の有効成分となる、多能性幹細胞から分化誘導して得られるドパミン神経前駆細胞の確立された製造方法において有用である。当該判定する方法を実施する場合、予め、ドパミン神経前駆細胞の製造方法を実施して、ＮＴ－３の分泌パターンを把握した上で、個々の製造方法において、ＮＴ－３の分泌量を測定する最適なタイミングを決定することが望ましい。当該判定する方法は、少なくとも、中脳底板領域の細胞（中脳底板細胞ともいう）、すなわちＣｏｒｉｎ陽性細胞の製造方法として、一定以上のＣｏｒｉｎ陽性細胞を製造し得る製造方法に好適に適用され得る。

　上記判定する方法は、当業者に周知の方法で未分化維持培養されたｉＰＳ細胞を分化誘導する工程において好適に用いられる。すなわち、ｉＰＳ細胞の多能性を維持する培養方法として、適切な培養条件で培養された使用可能なｉＰＳ細胞を使用する限りにおいては、当該判定する方法を好適に適応することができる。

　≪ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法≫
　本実施形態に係るドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法は、
　多能性幹細胞から、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法であって、
　（Ａ）中脳底板領域の神経系細胞に分化誘導可能な培養条件で、上記多能性幹細胞の培養を開始する工程と、
　（Ｂ）上記多能性幹細胞の培養開始後０時間から２８８時間の間に、上記多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法を行う工程と、
　（Ｃ）上記工程（Ｂ）において上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定された上記培養液中の細胞を、更に継続して培養することを決定し、上記培養液中の細胞から上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化させる工程と、
　（Ｄ）上記中脳底板領域の神経系細胞を、上記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件で培養し、上記ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞へ分化させる工程と、
を含む。

　＜工程（Ａ）多能性幹細胞の培養を開始する工程＞
　工程（Ａ）では、中脳底板領域の神経系細胞に分化誘導可能な培養条件で、上記多能性幹細胞の培養を開始する。多能性幹細胞は、上述した細胞を用いることが可能である。

　（中脳底板領域の神経系細胞に分化誘導可能な培養条件）
　中脳底板領域の神経系細胞に分化誘導可能な培養条件（培地、温度、二酸化炭素濃度等）について以下説明する。上記多能性幹細胞を培養する培地の組成は、上記第一の方法で挙げられた組成を採用することができる。

　多能性幹細胞を培養するときの温度は、３０℃以上４０℃以下であることが好ましく、３６℃以上３８℃以下であることがより好ましい。

　多能性幹細胞を培養するときの二酸化炭素濃度は、２％以上５％以下であることが好ましく、４％以上５％以下であることがより好ましい。

　多能性幹細胞を培養するときの細胞密度は、１０細胞／ｃｍ^２以上１０００００００細胞／ｃｍ^２以下であることが好ましく、１００細胞／ｃｍ^２以上１００００００細胞／ｃｍ^２以下であることがより好ましい。

　本実施形態の一側面において、工程（Ａ）は、細胞外基質上にて多能性幹細胞を接着培養することが好ましい。「細胞外基質上にて接着培養する」とは、細胞外基質によりコーティング処理された培養容器を用いて培養することを意味する。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。

　＜工程（Ｂ）多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法を行う工程＞
　工程（Ｂ）では、上記多能性幹細胞の培養開始後０時間から２８８時間の間に、上記多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法を行う。本実施形態の一側面において、上記工程（Ｂ）は、上記多能性幹細胞の培養開始後０時間から２８８時間の間に、上記多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法によって、当該判定を完了させる工程と把握することもできる。本実施形態の一側面において、「上記多能性幹細胞の培養開始後０時間から２８８時間の間」とは、「上記多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞が、生成するまでの間」と把握することもできるし、「上記多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞が、全細胞数の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上生成するまでの間」と把握することもできる。

　工程（Ｂ）では、上述した第一の方法、第二の方法、及び第三の方法のいずれを用いてもよい。なお、工程（Ｂ）を行っている間も培養液中の細胞（多能性幹細胞及び当該多能性幹細胞に由来する細胞等）の培養は、継続して行われる。

　＜工程（Ｃ）培養液中の細胞から中脳底板領域の神経系細胞へ分化させる工程＞
　工程（Ｃ）では、上記工程（Ｂ）において上記中脳底板領域の神経系細胞への分化しうると判定された上記培養液中の細胞を、更に継続して培養することを決定し、上記培養液中の細胞から上記中脳底板領域の神経系細胞へ分化させる。なお、工程（Ｃ）を行っている間も培養液中の細胞（多能性幹細胞及び当該多能性幹細胞に由来する細胞等）の培養は、継続して行われる。

　上記培養液中の細胞（多能性幹細胞及び当該多能性幹細胞に由来する細胞等）を培養する培養期間は、工程（Ａ）～工程（Ｃ）の間の期間として、９日間以上２１日間以下であることが好ましく、９日間以上１６日間以下であることがより好ましい。

　本実施形態の一側面において、工程（Ａ）から工程（Ｃ）の期間における上記細胞の培養は、分化誘導剤として、１以上のＢＭＰシグナル伝達阻害物質、１以上のＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性物質及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性物質を使用する多段階の工程によって行われてもよい。上記細胞の培養における各段階においては、ＢＭＰシグナル伝達阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達活性物質及びＷｎｔシグナル伝達活性物質からなる群より選択される物質を少なくとも１つ含む培地で培養してもよく、それぞれ接着培養又は浮遊培養であってよい。前記多段階の工程の間に工程（Ｂ）が行われることが望ましい。
　本実施形態の一側面において、工程（Ａ）から工程（Ｃ）の期間における上記細胞の培養において使用される分化誘導剤は、更にＦＧＦ８を含むことが望ましい。すなわち、工程（Ａ）から工程（Ｃ）の期間における上記細胞の培養は、分化誘導剤として、１以上のＢＭＰシグナル伝達阻害物質、１以上のＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性物質、１以上のＷｎｔシグナル伝達活性物質及びＦＧＦ８を使用する多段階の工程によって行われてもよい。上記細胞の培養における各段階においては、ＢＭＰシグナル伝達阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達活性物質、Ｗｎｔシグナル伝達活性物質及びＦＧＦ８から選択される物質を少なくとも１つ含む培地で培養してもよく、それぞれ接着培養又は浮遊培養であってよい。前記多段階の工程の間に工程（Ｂ）が行われることが望ましい。

　本実施形態の一側面において、工程（Ａ）から工程（Ｃ）の期間における上記細胞の培養は、分化誘導剤として、１以上のＢＭＰシグナル伝達阻害物質、１以上のＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性物質及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性物質を使用する多段階の工程によって行われてもよい。一態様として、１以上のＢＭＰシグナル伝達阻害物質及び１以上のＴＧＦβシグナル伝達阻害物質が使用されるタイミングと同時に、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性物質及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性物質が使用されてもよい。また１以上のＳＨＨシグナル伝達活性物質及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性物質は、ＢＭＰシグナル伝達阻害物質及びＴＧＦβシグナル伝達阻害物質が含まれる培養液中での培養が開始されてから、数日経過したタイミングで使用されてもよい。ＳＨＨシグナル伝達活性物質及びＷｎｔシグナル伝達活性物質はそれぞれ、異なるタイミングで培養液中に使用されてもよく、同時に使用されてもよい。

　本実施形態の一側面において、工程（Ａ）から工程（Ｃ）は、次の多段階の工程によって多能性幹細胞の培養が行われ、上記培養の間に工程（Ｂ）が行われることが望ましい；（ａ）多能性幹細胞を細胞外基質上でＢＭＰシグナル伝達阻害物質およびＴＧＦβシグナル伝達阻害物質を含む培養液中で接着培養する工程、
（ｂ）上記工程（ａ）で得られた細胞をＢＭＰシグナル伝達阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達活性物質およびＦＧＦ８を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で得られた細胞をＢＭＰシグナル伝達阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達活性物質、ＦＧＦ８およびＷｎｔシグナル伝達活性物質を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で得られた細胞をＢＭＰシグナル伝達阻害物質およびＷｎｔシグナル伝達活性物質を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程。

　本実施形態の一側面において、工程（Ｂ）は、工程（ａ）から工程（ｃ）の間に行われることが好ましい。本実施形態の他の側面において、工程（Ａ）から工程（Ｃ）に係る培養のプロトコールは、公知のプロトコールを採用してもよい（例えば、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇｕｓｔ　２０２０，Ｖｏｌｕｍｅ　８，Ａｒｔｉｃｌｅ　７２９；Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２８，３４３－３５５，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　４，２０２１）。

　本実施形態において、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリンおよびラミニンといった物質またはこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ＢＤ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの細胞からの調製物であってもよい。上記細胞外基質は、好ましくは、ラミニンまたはその断片である。本実施形態においてラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４またはα５であり、β鎖は、β１、β２またはβ３であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２またはγ３であることが例示される。上記ラミニンは、より好ましくは、α５、β１およびγ１からなるラミニン５１１である。本実施形態では、ラミニンは断片であってもよい。上記ラミニンの断片は、インテグリン結合活性を有している断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるＥ８フラグメントであってもよい。従って、本実施形態では、ＷＯ２０１１／０４３４０５に記載されたラミニン５１１Ｅ８（好ましくはヒトラミニン５１１Ｅ８）が例示される。

　また工程（ａ）を行う日数は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。工程（ａ）を行う日数は、好ましくは、１日である。同様に、工程（ｂ）を行う日数は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。工程（ｂ）を行う日数は、好ましくは、２日である。同様に、工程（ｃ）を行う日数では、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。工程（ｃ）を行う日数は、好ましくは、４日である。同様に、工程（ｄ）を行う日数は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。工程（ｄ）を行う日数は、好ましくは、５日以上である。

　多能性幹細胞は、細胞を解離させて用いてもよい。細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（商標）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、トリプシンまたはその代替物（ＴｒｙｐＬＥ　ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が例示される）を用いてヒト多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。細胞を解離させた場合、ＲＯＣＫ阻害剤を適宜、解離後に添加して培養することが望ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、少なくとも１日間添加して培養すればよく、より好ましくは１日間である。

＜ＲＯＣＫ阻害剤＞
　本実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ－２７６３２（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６－９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３－２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８９：９９０－９９４（１９９７）参照）、Ｈ－１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５－２３２（２００２）参照）、Ｗｆ－５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９－３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本実施形態においてはこのような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本実施形態では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。本実施形態で使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、Ｙ－２７６３２であり得る。

　培養液中におけるＹ－２７６３２の濃度は、例えば、１００ｎＭ～５０μＭ、好ましくは１μＭ～１０μＭであり、より具体的には１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。

　＜工程（Ｄ）中脳底板領域の神経系細胞を、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞へ分化させる工程＞
　工程（Ｄ）では、上記中脳底板領域の神経系細胞を、上記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件で培養し、上記ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞へ分化させる。本実施形態の一側面において、工程（Ｄ）は、上記中脳底板領域の神経系細胞に分化誘導可能な培養条件から上記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件に変更して、上記中脳底板領域の神経系細胞を培養し、上記ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞へ分化させる工程と把握することもできる。

　ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件（培地、温度、二酸化炭素濃度等）について以下説明する。

　中脳底板領域の神経系細胞を培養する培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、核酸（例えば、Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃｙｃｌｉｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ））などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい培養液は、Ｂ２７サプリメント、アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍである。この培養液へ適宜神経栄養因子を加えて培養することができる。

　＜神経栄養因子＞
　本実施形態において、神経栄養因子とは、ニューロンの生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）、Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４／５（ＮＴ－４／５）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－６（ＮＴ－６）、ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ、ａｃｉｄｉｃ　ＦＧＦ、ＦＧＦ－５、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＥＧＦ）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＨＧＦ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　１（ＩＧＦ１）、Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　２（ＩＧＦ２）、Ｇｌｉａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）、ＴＧＦ－ｂ２、ＴＧＦ－ｂ３、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　６（ＩＬ－６）、Ｃｉｌｉａｒｙ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）およびＬＩＦなどが挙げられる。

　上記神経栄養因子として、好ましくは、Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）、Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４／５（ＮＴ－４／５）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－６（ＮＴ－６）、Ｇｌｉａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）、ＴＧＦ－ｂ３、およびＣｉｌｉａｒｙ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）などが挙げられる。
　上記神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ－３からなる群より選択されることが好ましい。上記神経栄養因子として、ＧＤＮＦ又はＢＤＮＦ、好ましくはＧＤＮＦ及びＢＤＮＦを用いることが好ましい。神経栄養因子は、例えばＷａｋｏ社やＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。

　培養液中におけるＧＤＮＦの濃度は、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５　ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬである。本実施形態の一側面において、培養液中におけるＧＤＮＦの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよいし、１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。

　培養液中におけるＢＤＮＦの濃度は、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５　ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、２０ｎｇ／ｍＬである。培養液中におけるＢＤＮＦの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよいし、１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。

　中脳底板領域の神経系細胞を培養するときの温度は、３０℃以上４０℃以下であることが好ましく、３５℃以上３８℃以下であることがより好ましい。

　中脳底板領域の神経系細胞を培養するときの二酸化炭素濃度は、２％以上５％以下であることが好ましく、４％以上５％以下であることがより好ましい。

　中脳底板領域の神経系細胞を培養するときの細胞密度は、５０細胞／ｍｌ以上１０００００細胞／ｍｌ以下であることが好ましく、５００細胞／ｍｌ以上５００００細胞／ｍｌ以下であることがより好ましい。

　中脳底板領域の神経系細胞を培養する培養期間は、工程（Ｄ）の期間として、７日間以上３０日間以下であることが好ましく、７日間以上２４日間以下であることがより好ましい。

　工程（Ｄ）は浮遊培養によって行われてもよい。浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－１２７等）またはリン脂質類似構造物（例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ））によるコーティング処理した培養容器を使用して行うことができる。

　本実施形態の一側面において、工程（Ｄ）は、上記中脳底板領域の神経系細胞から中脳底板細胞を選別及び回収し、回収した上記中脳底板細胞を、上記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件で培養することで行われることが好ましい。

　上記中脳底板領域の神経系細胞から中脳底板細胞を選別し回収する方法としては、細胞集団より中脳底板細胞を選択するために、中脳底板細胞の細胞表面に存在するマーカー分子に特異的に結合する物質を用いて行うことができる。マーカー分子に結合する物質は、抗体、アプタマーを用いることができ、好ましくは、抗体もしくはその抗原結合断片である。

　本実施形態において、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。これらの抗体は、当業者に周知の技術を用いて作成することが可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ　１１．１２－１１．１３）。一方、モノクローナル抗体の場合には、マーカー分子を免疫された非ヒト動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ　１１．４－１１．１１）。抗体の抗原結合断片としては、抗体の一部（たとえばＦａｂ断片）または合成抗体断片（たとえば、一本鎖Ｆｖ断片「ＳｃＦｖ」）が例示される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２断片などの抗体の断片もまた、遺伝子工学的に周知の方法によって作製することができる。

　マーカー分子を発現する中脳底板細胞を認識または分離することを目的として、当該結合する物質は、例えば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素、ビオチンまたはストレプトアビジン等の検出可能な物質またはプロテインＡ、プロテインＧ、ビーズまたは磁気ビーズ等の単離抽出を可能とさせる物質と結合または接合されていてもよい。当該結合する物質はまた、間接的に標識してもよい。当業者に公知の様々な方法を使用して行い得るが、例えば、当該抗体に特異的に結合する予め標識された抗体（二次抗体）を用いる方法が挙げられる。

　中脳底板細胞等、目的の細胞を検出する方法として、フローサイトメーターまたはプロテインチップ等を用いることが含まれる。

　中脳底板細胞等、目的の細胞を抽出する方法には、当該結合する物質へ粒子を接合させ沈降させる方法、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法（例えば、ＭＡＣＳ）、蛍光標識を用いてセルソーターを用いる方法、または抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等が例示される。

　本実施形態において、目的細胞を選別及び回収するために利用可能な中脳底板細胞のマーカー分子としては、ＣＯＲＩＮ、ＬＲＴＭ１又はＣＤ１４２等が挙げられる。中脳底板細胞は、中脳底板領域の神経系細胞に包含される概念である。

　本実施形態の一側面において、工程（Ｃ）と工程（Ｄ）との間において、
（Ｅ）上記中脳底板領域の神経系細胞を回収する工程、
　を更に含むことが好ましい。
　ここで回収とは、工程（Ｃ）で得られる細胞を集める工程を意味する。例えば、接着培養が行われていた場合や、浮遊培養において細胞凝集体が形成されていた場合、例えば、機械的分散処理（ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。）、又は細胞分散液処理（トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン等の酵素や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の処理が挙げられる。）を用いて、細胞を培養容器から剥がしたり、凝集している細胞を分散したりする操作も、回収に含まれる。
　工程（Ｅ）において回収された細胞を用いて、上述のとおり、中脳底板領域の神経系細胞の集団から、目的とする中脳底板細胞を選別し、細胞集団を精製することができる。

　工程（Ｄ）における中脳底板細胞の選別の一態様として、細胞集団より中脳底板領域の神経系細胞を選択するために、Ｃｏｒｉｎに特異的に結合する物質を用いて行うことができる。具体的な手段は、上述した中脳底板細胞を回収する方法と同様の方法を用いることが可能である。

　本実施形態に係るドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法によって製造されたドパミン神経前駆細胞及び／又はその前駆細胞（以下、「ドパミン神経前駆細胞等」と表記する場合がある。）は、移植用組織として使用することが可能である。当該移植用組織は、例えばパーキンソン病患者の脳内に移植するための移植用組織が挙げられる。上記移植用組織における、上記ドパミン神経前駆細胞等の細胞数は、特に制限されないが、例えば、５ｘ１０^５個以上３ｘ１０^７個以下の細胞を移植する態様が挙げられる。上記移植用組織の形状は、シート状であってもよいし、球状であってもよいし、移植する部位に合わせた形状であってもよい。また、上記移植用組織は、懸濁液の状態であってもよい。

　拒絶反応が起こらないという観点から、上記移植組織に含まれる細胞のＨＬＡ遺伝子型は、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型と同一又は実質的に同一であることが好ましい。

　上記ドパミン神経前駆細胞等を含む移植用組織の疾患部位への移植は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１１，３３６９（２０２０）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）、もしくはＮ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．；３４４：７１０－９（２００１）に記載されるような手法によって行うことができる。

　以下、本発明に係る実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　≪実験１≫
　≪未分化維持培養≫
　後述する分化誘導培養に先立って、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持しながら培養を行った。具体的には、培養実験Ａ、Ｂ及びＣの条件で未分化維持工程の最後段階の培養条件を２種類設定し、比較検討を行った。

　＜培養実験Ａ＞
　研究用株のｉＰＳ細胞株（正式名：１２３１Ａ３）を用いて、以下の組成を有する培地で培養を行った。分化培養開始１日前（Ｄａｙ　－１）から分化開始日（Ｄａｙ０）までの１日間ＳＡＧ（Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（３－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ）－１，４－ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ、終濃度３００ｎＭ）を培地に添加し（前処理有）、誘導効率の高い細胞群（細胞群Ａ１）を設けた。また、比較対象としてＳＡＧを培地に添加しなかったこと以外は、細胞群Ａ１と同じ条件で細胞培養した無処置細胞群（細胞群Ａ２）を設けた。
　培養実験Ａにおける培地については、分化開始前までは、味の素社製ＡＫ０３Ｎの基礎培地を使用し、分化開始時（Ｄａｙ０）以降は８％ＫＳＲを含むＧＭＥＭを基礎培地として使用した。

　＜培養実験Ｂ＞
　臨床研究用株のｉＰＳ細胞株（ＱＨＪＩ０１ｓ０４株）を用いて、培養実験Ａにおける細胞群Ａ２と類似の培養条件で培養を行った。培養実験Ｂでは細胞培養期間が異なる細胞群Ｂ１及びＢ２を設けた。細胞群Ｂ１は分化誘導効率が低かった細胞群であり、細胞群Ｂ２は分化誘導効率が高かった細胞群であった。

　＜培養実験Ｃ＞
　研究用株のｉＰＳ細胞株（正式名：２０１Ｂ７）を用いて、培養実験Ａにおける細胞群Ａ２と類似の培養条件で培養を行った。培養実験Ｃでは、培地成分が異なる細胞群Ｃ１及びＣ２を設けた。細胞群Ｃ１は分化誘導効率が低かった細胞群であり、細胞群Ｃ２は分化誘導効率が高かった細胞群である。

　≪中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導培養≫
　所定のプロトコールに従い、上記培養実験Ａ、Ｂ及びＣで準備した６種類の細胞群それぞれについて、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導を行った。すなわち、分化開始０日目に、Ａ－８３－０１（ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質の一種であるＴＧＦβシグナル伝達阻害物質、終濃度０．５μＭ）とＬＤＮ－１９３１８９（ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質の一種であるＢＭＰシグナル伝達阻害物質、終濃度０．１μＭ）を培地に添加し始めた。分化開始１日後に、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（ＳＨＨシグナル伝達活性物質、終濃度２μＭ）及びＦＧＦ８（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加し始めた。分化開始３日後にはＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル伝達活性物質、終濃度３μＭ）を添加し始めた。分化開始７日後にＡ－８３－０１、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ及びＦＧＦ８の添加を終了した。分化開始から１３日目にかけて、２４時間毎に培地の全量を交換することとし、上記プロトコールに従い、培地の組成を変える場合には、培地交換のタイミングで組成の異なる培地による培養に切り替えた。分化開始１２日目にセルソーター（ＢＤ　ＦＡＣＳＪａｚｚ、ＢＤ　ＡｃｃｕｒｉまたはＦｕｒｕｋａｗａ　ＰＥＲＦＬＯＷ　Ｓｏｒｔ）を用いて、各細胞群におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合を測定した。なお、各試薬のメーカーは以下のとおりである。
Ａ－８３－０１　：Ｗａｋｏ社製
ＬＤＮ－１９３１８９：ＳＴＥＭＧＥＮＴ社製
Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ：Ｗａｋｏ社製
ＦＧＦ８　　　　：Ｗａｋｏ社製
ＣＨＩＲ９９０２１：Ｗａｋｏ社製

　＜ＮＴ－３の濃度分析＞
　分化誘導培養の開始直後（すなわち、分化開始直後）から２４時間おき又は４８時間おきに、各細胞群における培養上清の一部を採取し、ＮＴ－３の濃度分析を行った。培養上清を採取するタイミングは、上記の培地交換のタイミングに合わせ、２４時間（１日）のうち定められた時刻とした。培養上清を採取する際には、培地の全量を一旦培養器とは別の容器に回収して、全体がよく攪拌された状態で、その中の一部を採取した。結果を図１～３に示す。ＮＴ－３の濃度分析には、ＢｉｏＲａｄ社製のＢｉｏｐｌｅｘ（登録商標）を用いた。

　≪結果≫
　＜培養実験Ａ＞
　細胞群Ａ１は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が９０％であった。一方、細胞群Ａ２は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が４１％であった。培養上清中のＮＴ－３の濃度分析については、細胞群Ａ１において、分化開始１日後、５日後に採取した培養上清サンプルからはＮＴ－３は検出されなかったが、３日後に採取したサンプルで特異的に増加していた（図１）。一方、細胞群Ａ２では、いずれの日に採取した培養上清サンプルからもＮＴ－３は検出されなかった。

　＜培養実験Ｂ＞
　細胞群Ｂ１は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が２９％であった。一方、細胞群Ｂ２は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が６５％であった。培養上清中のＮＴ－３の濃度分析については、細胞群Ｂ２において、分化開始１日後、４日後、５日後に採取した培養上清サンプルからはＮＴ－３は検出されなかったが、２日後及び３日後に採取した培養上清サンプルで特異的に増加していた（図２）。一方、細胞群Ｂ１では、いずれの日に採取した培養上清サンプルからもＮＴ－３は検出されなかった。

　＜培養実験Ｃ＞
　細胞群Ｃ１は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が２４％であった。一方、細胞群Ｃ２は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が８３％であった。ＮＴ－３の濃度については、細胞群Ｃ２において、分化開始１日後、５日後に採取した培養上清サンプルでは検出されなかったが、２日目、３日目及び４日目に採取したサンプルで特異的に増加していた（図３）。一方、細胞群Ｃ１では、いずれの日に採取した培養上清サンプルからもＮＴ－３は検出されなかった。

　上述の培養実験Ａ、Ｂ及びＣの結果から、上記第一の方法における基準濃度は、例えば１０ｐｇ／ｍｌに設定することが好ましいと考えられる。また、上記第二の方法における基準変化率は、例えば５ｐｇ／ｍｌ・ｄａｙに設定することが好ましいと考えられる。尚、基準濃度については、製造方法、使用する細胞の種類・株等の違い、実施する製造工程に応じて設定することが望ましい。

　＜培養実験Ｄ＞
　培養実験Ｃと同じ未分化維持培養条件及び分化誘導条件で培養を行った。細胞群Ｄ１が細胞群Ｃ１の培養条件（逸脱条件）と同一であり、細胞群Ｄ２が細胞群Ｃ２の培養条件（標準条件）と同一である。
　培養実験Ｄにおいて、ＮＴ－３の遺伝子発現を解析するため、細胞群Ｄ１とＤ２に対し、シングルセル遺伝子発現解析を行った。分化開始時（Ｄａｙ０）、分化開始後４日目、８日目、１２日目に細胞を回収し、シングルセル遺伝子発現ライブラリの調製を行った。シングルセル遺伝子発現ライブラリの調製には、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ　Ｎｅｘｔ　ＧＥＭ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　３’　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔｓ　ｖ３．１（１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ社）を用いた。シーケンス解析には、Ｎｏｖａｓｅｑ６０００を用いた。

　＜結果＞
　上記シングルセル遺伝子発現解析の結果を図４に示した。細胞群Ｄ２は、分化誘導培養の４日目におけるＮＴ－３遺伝子（ＮＴＦ３）陽性細胞の割合が７６％であったのに対し、細胞群Ｄ１は、分化誘導培養の４日目におけるＮＴＦ３陽性細胞の割合が６０％であった。また、平均ＲＮＡ発現量の指標であるＣｏｕｎｔ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＣＰＭ）は、細胞群Ｄ２で４９であったのに対し、細胞群Ｄ１では２８であった。以上のように、ｍＲＮＡレベルでも、ＮＴ－３の発現は培養上清中のＮＴ－３の含有量と相関した。またＮＴ－３の発現は、一部の亜集団でのみ認められるものではなく、分化誘導に伴って目的細胞への分化過程で一時的に大部分の細胞に認められることがわかった。このことから、分化誘導を早期に判定するモニタリング分子としてＮＴ－３が適切であることがわかった。

　以上の結果から、多能性幹細胞から培養上清中に分泌された、すなわち多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化過程において培養上清中に分泌されたＮＴ－３の濃度をモニターすることによって、分化誘導の早い段階において、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定することが可能であることが分かった。

　≪実験２≫
　≪未分化維持培養≫
　後述する分化誘導培養に先立って、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持しながら培養を行った。具体的には、培養実験Ｅ及びＦの条件で未分化維持工程の最後段階の培養条件を１種または複数種設定し、比較検討を行った。

　＜培養実験Ｅ＞
　成人末梢血単核球からセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ（商標）－２．０；ＩＤファーマ））を用いて樹立したｉＰＳ細胞株を用いて、培養実験Ａにおける細胞群Ａ２と類似の分化誘導条件で培養を行った。

　＜培養実験Ｆ＞
　ｉＰＳ細胞株（正式名：２０１Ｂ７）を用いて、培養実験Ａにおける細胞群Ａ２と類似の培養条件で培養を行った。培養実験Ｆでは、培地成分が異なる細胞群Ｆ１及びＦ２を設けた。

　≪中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導培養≫
　上述の実験１と同様のプロトコールに従い、上記培養実験Ｅ及びＦで準備した３種類の細胞群それぞれについて、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導を行った。

　＜ＮＴ－３の濃度分析＞
　分化誘導培養の開始直後（すなわち、分化開始直後）から２４時間おき又は４８時間おきに、各細胞群における培養上清の一部を採取し、ＮＴ－３の濃度分析を行った。このとき、上述の培養実験Ｄで得られた培養上清もＮＴ－３の濃度分析を行った。結果を図５～７に示す。培養実験ＥにおけるＮＴ－３の濃度分析には、ＢｉｏＲａｄ社製のＢｉｏｐｌｅｘ（登録商標）を用いた。培養実験Ｄ及び培養実験ＦにおけるＮＴ－３の濃度分析には、デジタルＥＬＩＳＡ法を用いた。

　≪結果≫
　＜培養実験Ｅ＞
　培養実験Ｅで用いた細胞群では、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が４４％であった。ＮＴ－３の濃度については、分化開始１日後～４日後、９日後～１２日後に採取した培養上清サンプルでは検出されなかったが、５日後～８日後のサンプルで特異的に増加していた（図５）。

　＜培養実験Ｄ及び培養実験Ｆ＞
　細胞群Ｄ１は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が３４％であった。一方、細胞群Ｄ２は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が５８％であった。ＮＴ－３の濃度については、細胞群Ｄ１及びＤ２において、分化開始１日後に採取した培養上清サンプルでは検出されなかったが、２日目以降、徐々に増加していた（図６）。また、細胞群Ｄ２の方が、細胞群Ｄ１よりもＮＴ－３の濃度が高い傾向を示しており、Ｃｏｒｉｎ陽性細胞の割合と相関していた。

　細胞群Ｆ１は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が５７％であった。一方、細胞群Ｄ２は、分化誘導培養の１２日目におけるＣｏｒｉｎ陽性細胞の割合が６７％であった。ＮＴ－３の濃度については、細胞群Ｆ１及びＦ２において、分化開始１日目以降、徐々に増加していた（図７）。また、細胞群Ｆ２の方が、細胞群Ｆ１よりもＮＴ－３の濃度が高い傾向を示しており、Ｃｏｒｉｎ陽性細胞の割合と相関していた。

　実験２の結果からも、多能性幹細胞から培養上清中に分泌されたＮＴ－３の濃度をモニターすることによって、分化誘導の早い段階において、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定することが可能であることが分かった。

　≪ドパミン神経前駆細胞への分化誘導培養≫
　上述の培養実験Ａ、Ｂ及びＣにおける６種類の細胞群それぞれを用いて以下の方法によって、ドパミン神経前駆細胞への分化誘導培養を行う。
　分化誘導開始後１２日目（ｄａｙ１２）に、抗Ｃｏｒｉｎ抗体を用いたフローサイトメトリー解析を実施して、Ｃｏｒｉｎ陽性細胞を回収する。回収したＣｏｒｉｎ陽性細胞をＰｒｉｍｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　９６Ｕ底プレート（住友ベークライト）に２００００個／ｗｅｌｌにて移し、基本培地Ｂ（Ｂ２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、２００ｍＭ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄおよび０．４ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて浮遊培養する。この時、最初の培地は、３０μＭのＹ－２７６３２を添加した培地を用い、３日に一度、半量ずつ培地交換する際には、Ｙ－２７６３２を添加しない培地を用いる。Ｃｏｒｉｎ陽性細胞を回収してから１６日後（ｄａｙ２８）まで浮遊培養を実施してＦｏｘＡ２、Ｎｕｒｒ１（何れも中脳マーカー）の染色を行い、ドパミン神経前駆細胞へ分化しているかどうかを確認する。

　以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。

　今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims

　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　前記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で前記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の培養上清における、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　測定した前記ＮＴ－３の濃度を、基準濃度と比較する工程と、
　前記ＮＴ－３の濃度が前記基準濃度以上であるとき、前記培養液中の細胞が前記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　前記培養上清は、前記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から２４０時間のいずれかの時点において前記培養液から採取された培養上清である、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　前記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で前記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清及び第二の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　前記第一の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度及び前記第二の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度から、前記ＮＴ－３の濃度の変化率を求める工程と、
　前記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値を、基準変化率と比較する工程と、
　前記ＮＴ－３の濃度の変化率の絶対値が前記基準変化率以上であるとき、前記培養液中の細胞が前記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　前記第一の培養上清は、前記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間のいずれかの時点において前記培養液から採取された培養上清であり、
　前記第二の培養上清は、前記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間のいずれかの時点又は前記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間のいずれかの時点において前記培養液から採取された培養上清である、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法であって、
　前記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤を含む培地で前記多能性幹細胞を培養して得られた培養液中の第一の培養上清、第二の培養上清及び第三の培養上清それぞれにおける、ＮＴ－３の濃度を測定する工程と、
　前記第一の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度、前記第二の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度及び前記第三の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度を比較する工程と、
　前記第一の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度が、前記第二の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度及び前記第三の培養上清における前記ＮＴ－３の濃度より高いとき、前記培養液中の細胞が前記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含み、
　前記第一の培養上清は、前記多能性幹細胞の培養開始後４８時間から１９２時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　前記第二の培養上清は、前記第一の培養上清の採取前２４時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清であり、
　前記第三の培養上清は、前記第一の培養上清の採取後２４時間から９６時間のいずれかの時点において上記培養液から採取された培養上清である、多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤は、少なくとも１種のＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質を含む、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害物質は、少なくとも１種のＢＭＰシグナル伝達阻害物質及び少なくとも１種のＴＧＦβシグナル伝達阻害物質を含む、請求項４に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記ＢＭＰシグナル伝達阻害物質は、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＭＨ１、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ－２１４１１７、ＬＤＮ－２１２８５４、ＭＬ３４７及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１種を含み、
　前記ＴＧＦβシグナル伝達阻害物質は、ＳＢ－４３１５４２、Ａ－８３－０１、Ｌｅｆｔｙ－１、Ｌｅｆｔｙ－２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＳＢ－２０２１９０、ＳＢ－５２５３３４、ＳＢ－５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、Ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ、ＧＷ７８８３８８、Ｅ－６１６４５２、ＳＤ２０８、ＴＰ０４２７７３６、ＢＩＢＦ－０７７５、ＬＹ３２００８８２、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ、ＩＴＤ－１、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７及びＬＹ５８０２７６からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項５に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記中脳底板領域の神経系細胞への分化誘導剤は、ＳＨＨシグナル伝達活性物質及び／又はＷｎｔシグナル伝達活性物質を更に含む、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記培地は、ＳＨＨシグナル伝達活性物質及びＷｎｔシグナル伝達活性物質を更に含む、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記ＳＨＨシグナル伝達活性物質は、ＳＨＨ及びその断片並びに修飾体、ＳＨＨ受容体、ＳＨＨ受容体アゴニスト、Ｈｈ－Ａｇ１．５、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ、２０ａ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、並びに、ＳＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項７又は請求項８に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記Ｗｎｔシグナル伝達活性物質は、ＷＮＴ３Ａ、及び、ＧＳＫ－３β阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項７、請求項８又は請求項９に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記ＧＳＫ－３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＫＬ２００１、ＳＢ２１６７６３、ＧＳＫ－３β　阻害剤ＶＩＩ及びＬ８０３－ｍｔｓからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１０に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　前記多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法。
　多能性幹細胞から、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法であって、
　（Ａ）中脳底板領域の神経系細胞に分化誘導可能な培養条件で、前記多能性幹細胞の培養を開始する工程と、
　（Ｂ）前記多能性幹細胞の培養開始後０時間から２８８時間の間に、請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法を行う工程と、
　（Ｃ）前記工程（Ｂ）において前記中脳底板領域の神経系細胞へ分化しうると判定された前記培養液中の細胞を、更に継続して培養することを決定し、前記培養液中の細胞から前記中脳底板領域の神経系細胞へ分化させる工程と、
　（Ｄ）前記中脳底板領域の神経系細胞を、前記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件で培養し、前記ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞へ分化させる工程と、
を含む、多能性幹細胞から、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法。
　工程（Ｃ）と工程（Ｄ）との間において、
　（Ｅ）前記工程（Ｃ）で得られる前記中脳底板領域の神経系細胞を回収する工程、
　を更に含む、請求項１３に記載の多能性幹細胞から、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法。
　工程（Ｄ）が、前記中脳底板領域の神経系細胞から中脳底板細胞を選別及び回収し、回収した前記中脳底板細胞を、前記ドパミン神経前駆細胞に分化誘導可能な培養条件で培養することで行われる、請求項１３又は請求項１４に記載の多能性幹細胞から、ドパミン神経前駆細胞又はその前駆細胞を製造する方法。