JP7248761B2 - 抗brdu抗体および使用方法 - Google Patents
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Description
本発明はヒト化抗体BRDU抗体およびヒト化抗体BRDU誘導体抗体ならびにそれらの使用方法に関する。
ハプテン結合性抗体は、捕捉モジュールとして治療的応用および診断的応用に応用することができる。例えば、発蛍光団、キレート試薬、ペプチド、核酸、タンパク質、脂質、ナノ粒子、および他の多くの作用物質などのハプテン結合実体は、ハプテン結合性の抗体および抗体誘導体と反応することができる。これにより、そのような「ペイロード(payload)」の効果的検出、ならびに捕捉、所望の場所における蓄積、架橋および他の抗体媒介効果が可能になる。ハプテンの特徴および組成はハプテン結合実体の組成および「挙動」(サイズ、溶解度、活性、生物物理学的特性、PK、生物学的効果その他を含む)に影響を及ぼしうるので、多種多様なハプテン結合性実体を開発することが、極めて望ましい。それにより、選択したハプテンを所与のペイロードと対応させて、最適化されたハプテンコンジュゲートを生成させることが可能になる。次に、最適なハプテン結合性実体を、該コンジュゲートと組み合わせて、最適な抗体-ハプテン-ペイロード複合体を生成させることができる。ヒト化された抗体誘導体などのハプテン結合性実体があることは、さらに望ましい。これにより、治療的応用における免疫原性などといった干渉のリスクを著しく低減した応用が可能になる。本明細書に記載する抗体は、BRDUおよびBRDU誘導体に結合する。本明細書では、これらの抗体を「BRDU結合」抗体または「抗BRDU」抗体と呼ぶ。
本発明は抗BRDU抗体および抗BRDU誘導体抗体ならびにそれらの使用方法を提供する。
[本発明1001]
(a)SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに(a)SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL(位置はいずれもKabatに従う)
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1002]
(a)SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに(a)SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL(位置はいずれもKabatに従う)
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1003]
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、本発明1001または1002のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1004]
SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、本発明1001または1002のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1005]
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を有するVHを含む、本発明1001~1004のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1006]
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVLを含む、本発明1001~1005のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1007]
本発明1001~1006のいずれかのヒト化抗BRDU抗体と、BRDUを含む核酸とを含む、複合体。
[本発明1008]
本発明1002~1006のいずれかのヒト化抗BRDU抗体と、システイン残基にコンジュゲートされたBRDUとを含む、共有結合複合体。
[本発明1009]
本発明1001~1006のいずれかのヒト化抗BRDU抗体または本発明1007もしくは1008のいずれかの複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
[本発明1010]
細胞にBRDU含有核酸を送達するための抗体の使用であって、該抗体が、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の軽鎖、および
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の重鎖であって、そのC末端で、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来するscFvまたはscFabにコンジュゲートされている、重鎖
を含み、第1の抗体または第2の抗体のどちらか一方が本発明1001~1006のいずれかの抗BRDU抗体である、前記使用。
[本発明1011]
前記抗BRDU抗体が、SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、本発明1010の使用。
[本発明1012]
前記抗BRDU抗体が、SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、本発明1010または1011のいずれかの使用。
I.定義
本明細書において、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、これを本明細書では、「ナンバリングはKabatに従う」という。具体的に述べると、カッパおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)のKabatナンバリングシステム(647~660頁参照)を使用し、定常重鎖ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2およびCH3)には、Kabat EUインデックスナンバリングシステム(661~723頁参照)を使用する。
分率X/Y×100
ここで、Xは、配列整列プログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBとの整列において、完全一致(identical match)と記録したアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Aの、Bとのアミノ酸配列同一性%が、Bの、Aとのアミノ酸配列同一性%と等しくなくなることは、理解されるであろう。別段の明言がある場合を除き、本明細書において使用するアミノ酸配列同一性%値は全て、すぐ上の段落で説明したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得られる。
一局面において、本発明は、BRDUに結合するヒト化抗体に基づく。これらの抗体は本明細書において提供される。本発明の抗体は、例えばBRDU含有核酸を結合するための単一特異性抗体として有用であり、BRDU含有核酸に対する結合特異性を本抗体の汎用ペイロード化(payloading)特性として利用することによって、あらゆる種類の疾患を診断または治療するための多重特異性抗体として有用である。
一局面において、本発明は、BRDUに結合する単離された抗体を提供する。特定の態様において、本抗BRDU抗体はヒト化抗BRDU抗体である。特定の態様において、本明細書において報告する抗BRDU抗体は、BRDU含有核酸に、その核酸の生物学的活性を妨害することなく結合する。それゆえにこれらの抗体は、その抗体が単一特異性抗体であるなら、BRDU含有核酸の薬物動態特性を改良するために使用することができる。また、抗体が二重特異性抗体または多重特異性抗体であって、1つの結合特異性がBRDUを指向し、汎用ペイロード化特異性として使用することができ、一方、第2の結合特異性が例えば細胞表面分子に特異的に結合して、その二重特異性抗体または多重特異性抗体のターゲティング特性/構成要素になるのであれば、これらの抗体はBRDU含有核酸の標的送達にも使用することができる。
・重鎖可変ドメインの30位にP、および/または
・重鎖可変ドメインの58位にF、および/または
・重鎖可変ドメインの108位にT、および/または
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および/または
・軽鎖可変ドメインの98位にL(位置はいずれもKabatに従う)。
Kdは、以下のアッセイで説明するように、関心対象の抗体のFab型とその抗原とを使って行われる放射標識抗原結合アッセイ(RIA)によって測定され得る。例えば、抗原に対するFabの溶液結合親和性(solution binding affinity)は、非標識抗原のタイトレーション系列(titration series)の存在下でFabを最小濃度の(125I)-標識抗原と平衡させ、次に結合した抗原を抗Fab抗体被覆プレートで捕捉することによって測定される(例えばChen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照)。アッセイのための条件を確立するために、MICROTITER(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を、50mM炭酸ナトリウム(pH9.6)中、5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)で終夜コーティングし、次に室温(約23℃)で2~5時間、PBS中の2%(w/v)ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着性プレート(Nunc #269620)において、100pMまたは26pM [125I]-抗原を、関心対象のFabの段階希釈液と混合する(例えばPresta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599における抗VEGF抗体Fab-12の評価に準じる)。次に、関心対象のFabを終夜インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡に達することを保証するために、さらに長い期間(例えば約65時間)継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温で(例えば1時間)インキュベートする。次に、溶液を取り除き、PBS中の0.1%ポリソルベート20(TWEEN-20(登録商標))でプレートを8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント(MICROSCINT-20(商標);Packard)を加え、TOPCOUNT(商標)ガンマ線計数器(Packard)でプレートを10分間カウントする。最大結合の20%以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
特定の態様では、本明細書に規定する抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントには、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、およびscFvフラグメント、ならびに以下に述べる他のフラグメントがあるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体フラグメントを概観するには、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。scFvフラグメントを概観するには、例えばPlueckthun, A., In;The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp.269-315を参照されたい。また、WO 93/16185およびUS 5,571,894およびUS 5,587,458も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するFabおよびF(ab')2フラグメントに関する解説については、US 5,869,046を参照されたい。
特定の態様では、本明細書に規定する抗体が、キメラ抗体である。例えばUS 4,816,567、およびMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855には、一定のキメラ抗体が記載されている。一例では、キメラ抗体が、非ヒト可変領域(例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)とヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体が、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体にはその抗原結合性フラグメントが含まれる。
特定の態様では、本明細書に規定する抗体が多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性の一方がBRDUに対するものであり、他方が他の任意の抗原に対するものである。特定の態様では、二重特異性抗体が、BRDUの2つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体は、BRDUを発現する細胞に細胞毒性作用物質を局在化するためにも使用することができる。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b)定常ドメインCLとCH1とが互いに入れ替えられている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の改変重鎖および改変軽鎖
を含むことを特徴とする。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b)重鎖のN末端がペプチドリンカーを介して軽鎖のC末端に接続されている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の重鎖および軽鎖
を含むことを特徴とする。
特定の態様では、本明細書に規定する抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改良することが望ましい場合がありうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入するか、またはペプチド合成によって、調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/または抗体のアミノ酸配列への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列内での残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば抗原結合性を持つ限り、欠失、挿入および置換を任意に組み合わせて、最終構築物に到達することができる。
特定の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換変異導入のための関心対象の部位には、HVRおよびFRが含まれる。表1では保存的置換を「好ましい置換」という見出しの下に示す。より実質的な変化は、表1では「例示的置換」という見出しの下に掲載されており、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下にさらに詳しく説明するとおりである。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、生成物を所望の活性について、例えば保持/改良された抗原結合、減少した免疫原性、または改良されたADCCもしくはCDCなどについてスクリーニングすることができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
特定の態様では、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるために、本明細書に規定する抗体が改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、都合よく達成することができる。
特定の態様では、本明細書に規定する抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させることができる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域)を含みうる。
特定の態様では、システイン改変抗体(cysteine engineered antibody)、例えば抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb(thioMAb)」を作出することが望ましいかもしれない。特定の態様では、置換残基が抗体の接近可能部位に見いだされる。それらの残基をシステインで置換することによって抗体の接近可能部位に活性チオール基が置かれることになり、本明細書においてさらに説明するように、それを使って、抗体を他の部分、例えば薬物部分またはリンカー-薬物部分にコンジュゲートすることで、イムノコンジュゲートを作出することができる。特定の態様では、次に挙げる残基の任意の1つまたは複数をシステインで置換することができる:軽鎖のV205(Kabatナンバリング)、重鎖のA118(EUナンバリング)、および重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン改変抗体は、例えばUS 7,521,541に記載されているように生成させることができる。
特定の態様では、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、本明細書に規定する抗体をさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分には水溶性ポリマーがあるが、それらに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマー)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール(propropylene glycol)ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド(prolypropylene oxide)/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物などがあるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造時に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。抗体に取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、2つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子または異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、例えば限定するわけではないが、改良しようとする抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうかなどといった、考慮事項に基づいて決定することができる。
多重特異性抗体の生成には、ヘテロ二量体型重鎖ペアリングの形成を促進することが必要になりうる。ヘテロ二量体化を強制するためのCH3修飾にはいくつかのアプローチが存在し、それらは例えばWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291によく記述されている。そのようなアプローチのいずれにおいても、典型的には、各CH3ドメイン(またはそれを含む重鎖)がもはや自分自身とホモ二量体化することができず、工学的に改変された相補的な他のCH3ドメインとヘテロ二量体化することを強いられるように(第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメイン(そしてそれと共に第1の重鎖と第2の重鎖)とがヘテロ二量体化し、2つの第1のCH3ドメイン間または2つの第2のCH3ドメイン間のホモ二量体は形成されないように)、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとの両方を、相補的な形で工学的に操作する。
多重特異性抗体の第1の重鎖の第1のCH3ドメインおよび多重特異性抗体の第2の重鎖の第2のCH3ドメインがそれぞれ、抗体CH3ドメイン間の元の境界面を含む境界面において接し、
該境界面は多重特異性抗体の形成が促進されるように改変されていて、その改変は、
i)一方の重鎖のCH3ドメインが、
多重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面と接する一方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面内で、
あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの境界面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの境界面内のくぼみ中に配置されうる突起を生成するように、改変されていること、
および
ii)他方の重鎖のCH3ドメインが、
多重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の境界面と接する第2のCH3ドメインの元の境界面内で、
あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの境界面内に、第1のCH3ドメインの境界面内の突起が内部に配置されうるくぼみを生成するように、
改変されていること。
を特徴とする。
siRNAおよびハプテン含有siRNA誘導体
siRNAの設計と構築に関する一般原理は当業者には公知であり、ここで詳細には考察しない。
ハプテン結合(hapten-coupled)siRNAはbsAbと直接的に複合体を形成させることができる。これらの複合体は、各標的抗原をそれぞれの表面に発現している細胞に、siRNAを特異的に送達することができる。しかし、細胞内小胞上および細胞内小胞中(内部移行時)でのsiRNAの特異的蓄積だけでは、ほとんどの場合、特異的遺伝子ノックダウンは起こらない。その理由は、無修飾siRNAはエンドソームコンパートンメントに蓄積するものの、細胞質中にエスケープしないことである(13)。サイトゾルへの送達を可能にするために、それぞれの表面にハプテンを保持するナノ粒子中にsiRNAをパッケージングすることができる(1、2、26、27、3、28、29、30、5、31、32、9)。これらのハプテンは、(大きな)ナノ粒子の構造中に組み込んだ時に、bsAbにアクセス可能である必要がある。効果的なsiRNA送達のためのさまざまな種類のナノ粒子が記述されており、それらの多くはPEGを含有している。したがって、ハプテン含有ナノ粒子を生成させる一方法は、ハプテン結合PEG誘導体を、ナノ粒子生成のための構成要素として応用することである。製剤にこれらの試薬を組み込むとハプテン被覆(hapten-decorated)ナノ粒子(例えばDig-LNP中のsiRNA)が生成する。ハプテン被覆ナノ粒子は、場合によっては、ハプテン結合siRNAを標準的ナノ粒子に処方することによって生成させることもできる。驚いたことに、これは、それぞれの表面にハプテン分子を抗体のアクセスが可能な形で露出しているナノ粒子をもたらす。同じようにして蛍光標識siRNAをハプテン被覆ナノ粒子に蛍光シグナルを失うことなく組み込むことができる。これは、ハプテン含有bsAb誘導(bsAb-targeted)ナノ粒子の可視化および追跡に使用することができる。
抗体は、例えばUS 4,816,567に記載されているような組換え法および組換え組成物を使って生産することができる。一態様では、本明細書に記載の抗BRDU抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードしうる。さらなる態様では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。さらなる態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような態様の一つでは、宿主細胞が、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列と抗体のVHを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクターを含むか、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、前記ベクターで形質転換されている)。一態様では、宿主細胞が真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ球系細胞(例えばY0、NS0、Sp20細胞)である。一態様では、抗BRDU抗体を作成する方法であって、上に規定した抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養すること、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む方法が提供される。
本明細書に規定する抗BRDU抗体は、当技術分野において公知のさまざまなアッセイにより、それらの物理的/化学的特性および/または生物学的活性について、同定し、スクリーニングし、または特徴づけることができる。
一局面において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウェスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性が試験される。
本発明は、1つまたは複数の細胞毒性作用物質、例えば化学療法剤または薬物、成長阻害剤、毒素(例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント)、または放射性同位体にコンジュゲートされた、本明細書における抗BRDU抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。
本明細書において使用する用語「検出する」は、定量的検出または定性的検出を包含する。
本明細書に記載の抗BRDU抗体の薬学的製剤は、望ましい純度を有するそのような抗体を1つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体(Osol, A. (ed.) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980))と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えばZn-タンパク質複合体);および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)などがあるが、それらに限定されるわけではない。本明細書における、例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)が含まれる。rhuPH20を含む一定の例示的sHASEGPおよび使用方法は、US 2005/0260186ならびにUS 2006/0104968に記載されている。一局面では、sHASEGPが、1つまたは複数の追加グリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
本明細書に規定する抗BRDU抗体はいずれも治療方法に使用することができる。
本発明の別の局面では、上述の障害の治療、予防および/または診断に有用な材料が入っている製造品が提供される。製造品は、容器、および容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどがある。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな素材で形成されうる。容器は、組成物を単独で、またはその状態を治療、予防および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる)。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が選択された状態の治療に使用されることを示す。さらにまた、製造品は、(a)本発明の抗体を含む組成物が入っている第1の容器と、(b)さらなる細胞毒性作用物質または他の治療剤を含む組成物が入っている第2の容器とを含みうる。本発明のこの態様の製造品は、さらに、特定の状態を治療するためにその組成物を使用できることを示す添付文書を含みうる。これに代えて、またはこれに加えて、製造品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第2(または第3)の容器を含みうる。商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを、さらに含みうる。
1. (a)SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
2. (a)SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
3. (a)SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:03のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
4. (a)SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:03のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
5. (a)SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
6. (a)SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
7. (a)SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3をさらに含む、態様1~6のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
8. 重鎖の30位にプロリンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、態様1~7のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
9. 重鎖の58位にフェニルアラニンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、態様1~8のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
10. 重鎖の108位にスレオニンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、態様1~9のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
11. 軽鎖の49位にリジンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、態様1~10のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
12. 軽鎖の98位にロイシンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、態様1~11のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
13. 以下の1つまたは複数を含む、態様1~12のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体:
・重鎖可変ドメインの30位にP、および/または
・重鎖可変ドメインの58位にF、および/または
・重鎖可変ドメインの108位にT、および/または
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および/または
・軽鎖可変ドメインの98位にL(位置はいずれもKabatに従う)。
14. SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、態様1~13のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
15. SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインアミノ酸配列から派生したVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列から派生したVLアミノ酸配列を含む、態様1~13のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
16. SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、態様1~13のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
17. SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を有するVHを含む、態様1~16のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
18. SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVLを含む、態様1~17のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
19. 完全長IgG1抗体または完全長IgG4抗体である、態様1~18のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
20. モノクローナル抗体である、態様1~19のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
21. 二価抗体である、態様1~20のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
22. 二重特異性抗体である、態様1~21のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
23. a)第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b)定常ドメインCLとCH1とが互いに入れ替えられている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の改変重鎖および改変軽鎖
を含み、第1の抗原または第2の抗原のどちらか一方がBRDUである、態様1~22のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
24. a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の軽鎖、および
b)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の重鎖であって、そのC末端で、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来するscFvまたはscFabにコンジュゲートされている、重鎖
を含み、第1の抗原または第2の抗原のどちらか一方がBRDUである、態様1~22のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
25. BRDUに結合する抗体フラグメントである、態様1~20のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
26. 態様1~25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体と、BRDUを含む核酸とを含む、複合体。
27. 態様3~25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体と、システイン残基にコンジュゲートされたBRDUとを含む、共有結合複合体。
28. 態様1~25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体または態様26~27のいずれか一つに記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤
29. 細胞にBRDU含有核酸を送達するための、態様1~25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体の使用。
30. 血液脳関門を越えてBRDU含有核酸を送達するための、態様1~25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体の使用。
本発明の方法および組成物の例を以下に挙げる。上述した総論を考慮すれば、他にもさまざまな態様を実施しうると理解される。
マウスハイブリドーマからのマウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAの単離および特徴づけ
マウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインのタンパク質配列情報および(DNA)配列情報をハイブリドーマクローンから直接得た。引き続いて行った実験工程は(i)抗体産生ハイブリドーマ細胞からのRNAの単離、(ii)そのRNAのcDNAへの変換、VHおよびVL保因PCRフラグメントへの移入、ならびに(iii)大腸菌(E.coli)における増殖のためのプラスミドベクターへのこれらのPCRフラグメントの組み込み、およびそれらのDNA(および推定タンパク質)配列の決定である。
RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使ってハイブリドーマ細胞からmRNAを単離した。約106個の細胞をRLT緩衝液中で溶解し、溶解物をQiashredderカラムにのせた。RNeasy Miniカラムを使ってmRNAを濃縮し、洗浄した。
cDNAの生成および特異的抗体cDNA配列の増幅は、SMART Race cDNA Amplificationキット(Clontech)を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。特異的増幅には、キットの汎用プライマーと、それぞれ抗体軽鎖および抗体重鎖の定常領域からの特異的プライマーとを使用した。
マウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインのヒト化
マウスBRDU結合抗体を次のようにヒト化した。マウスハイブリドーマからのカッパ軽鎖を持つIgG1クラスのマウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインを含むコード配列およびアミノ酸配列の生成および特徴づけは、WO 2011/003557およびWO 2011/003780に記載されている。この情報に基づき、対応するヒト化抗BRDU抗体を、ヒト生殖細胞系フレームワークIGHV1-18-01とIGKV3-15-01の組み合わせに基づいて生成させた。ヒト化VHのアミノ酸配列をSEQ ID NO:09に示し、ヒト化VLのアミノ酸配列をSEQ ID NO:10に示す。
組換え抗BRDU抗体の組成、発現および精製
マウスおよび抗BRDU抗体可変領域をヒト起源の定常領域と組み合わせて、単一特異性または二重特異性キメラまたはヒト化抗体を形成させた。
重鎖および軽鎖を発現させるための発現カセットを含む発現プラスミドは、哺乳動物細胞発現ベクター中で別々に組み立てられた。これにより、個々の要素をコードする遺伝子セグメントは、上に概説したように接続された。
・ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'端にユニークBsmI制限部位を配し、3'端にスプライス供与部位およびユニークNotI制限部位を配した、クローン化可変軽鎖cDNA、
・イントロン2マウスIg-κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域(Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82)、および
・ヒト免疫グロブリンκ-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
・ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含む改変マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'端にユニークBsmI制限部位を配し、3'端にスプライス供与部位およびユニークNotI制限部位を配した、クローン化単一特異性可変重鎖cDNAまたはクローン化二重特異性融合scFv可変重鎖cDNA、
・マウスIgμ-エンハンサーを含む、ゲノムヒトγ1重鎖遺伝子定常領域(Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378)、および
・ヒトγ1-免疫グロブリンポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
・ハイグロマイシン耐性遺伝子、
・エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)の複製起点oriP、
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
クローニングは、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の標準的クローニング技法を使って行った。分子生物学用試薬は(別段の表示がない場合)全て市販されており、製造者の説明書に従って使用した。
配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図解には、Vector NTI Advanceスイート・バージョン9.0を使用した。
懸濁状態のヒト胎児腎臓293(HEK293)細胞の一過性トランスフェクションによって、抗BRDU抗体を発現させた。そのために、対応する単一特異性または二重特異性抗体の軽鎖および重鎖を、上に概説したように、原核生物選択マーカーおよび真核生物選択マーカーを保有する発現ベクター中に構築した。これらのプラスミドを大腸菌中で増幅し、精製した後、一過性トランスフェクションに応用した。細胞の取り扱いには、Current Protocols in Cell Biology (2000)、Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的細胞培養技法を使用した。
トランスフェクションの7日後にHEK293細胞上清を収穫した。そこに含有される組換え抗体を、プロテインA-Sepharose(商標)アフィニティクロマトグラフィー(GE Healthcare、スウェーデン)を使ったアフィニティクロマトグラフィーと、Superdex200サイズ排除クロマトグラフィーとにより、2段階で上清から精製した。簡単に述べると、抗体を含有する清澄化培養上清を、PBS緩衝液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaClおよび2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したMabSelect SuReプロテインA(5~50ml)カラムに適用した。結合していないタンパク質を平衡化緩衝液で洗い流した。抗体(または抗体誘導体)を50mMクエン酸緩衝液(pH3.2)で溶出させた。タンパク質含有画分を0.1mlの2Mトリス(pH9.0)で中和した。次に、溶出したタンパク質画分をプールし、Amicon Ultra遠心分離フィルタデバイス(MWCO:30K、Millipore)で濃縮し、20mMヒスチジン、140mM NaCl(pH6.0)で平衡化したSuperdex200 HiLoad26/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare、スウェーデン)にのせた。精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace et. al., Protein Science 4 (1995), 2411-2423に従いアミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光計数を使用し、280nmにおける光学密度(OD)を、バックラウンド補正としての320nmにおけるODと共に決定することによって決定した。単量体型の抗体画分をプールし、瞬間凍結し、-80℃で保存した。試料の一部を後続のタンパク質分析および特徴付けに供した。
BRDU結合性二重特異性抗体はBRDU含有ペイロードとの複合体を形成する
トランスフェリン受容体(TfR)結合性かつブロモデオキシウリジン(BRDU)結合性の二重特異性抗体(bsAb)がBRDU含有ペイロードに結合する能力を有するかどうか、そしてそれはどの程度かを評価するために、SEC-MALLS分析を応用した。それゆえに、BRDU-DNAをTfR-BRDU bsAbに2:1の化学量論比(350μg; 2.5mg/ml)で加え、bsAb/ペイロード複合体を形成させるために、室温で30分インキュベートした。対照試薬として、遊離bsAb(2.5mg/ml)および遊離BRDU-DNA(3.2mg/ml)を調製した。
は、DNA1分子につき1つのBRDUをそのDNAの5'端に含有していた。複合体および対照試薬を分析まで-80℃で保存した。
質量分析によるBRDU結合抗体の分析
ペプチド-N-グリコシダーゼF(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)を使った酵素処理によってN-グリカンを除去した後に、BRDU結合抗体ならびにその軽鎖および重鎖の実体および完全性を、事前に還元を行ってまたは事前の還元を行わずに、エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析によって確認した。還元はTCEPを使って行った。脱塩は、均一濃度ギ酸勾配(isocratic formic acid gradient)を使ってセルフパックG25-Sephadex-Superfineカラムで行った。ESIマススペクトル(+ve)は、ナノESIイオン源(TriVersa NanoMate、Advion)を装備したQ-TOF計器(maXis、Bruker)で記録した。MSパラメータ設定は次のとおりとした:導入(Transfer):ファンネルRF(Funnel RF)、400Vpp;ISCIDエネルギー(ISCID Energy)、0eV;マルチポールRF(Multipole RF)、400Vpp;四重極(Quadrupole):イオンエネルギー(Ion Energy)、3.0eV;下限分子量(Low Mass)、850m/z;イオン源(Source):ドライガス(Dry Gas)、8L/分;ドライガス温度(Dry Gas Temperature)、160℃;衝突セル(Collision Cell):衝突エネルギー、8eV;衝突RF(Collision RF):3800Vpp;イオン冷却装置(Ion Cooler):イオン冷却装置RF(Ion Cooler RF)、800Vpp;転送時間(Transfer Time):140μs;プレパルスストレージ(Pre Puls Storage)、20μs;スキャン範囲(scan range)m/z 600~2000。データ評価にはMassAnalyzerソフトウェア(自社開発)を使用した。脱グリコシル化BRDU結合抗体ならびにその軽鎖および重鎖の分子質量観測値はアミノ酸配列から算出される理論的分子質量と合致していた。
Claims (8)
- 非ヒト細胞にBRDU含有核酸を送達するための抗体の使用であって、該抗体が、
a)BRDUに特異的に結合する第1の抗体の軽鎖、および
b)BRDUに特異的に結合する第1の抗体の重鎖であって、そのC末端で、TfRに特異的に結合する第2の抗体に由来するscFvまたはscFabにコンジュゲートされている、重鎖
を含み、
該第1の抗体が、SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3、SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、およびSEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗BRDU抗体である、
前記使用。 - 非ヒト細胞にBRDU含有核酸を送達するための抗体の使用であって、該抗体が、
a)BRDUに特異的に結合する第1の抗体の軽鎖、および
b)BRDUに特異的に結合する第1の抗体の重鎖であって、そのC末端で、TfRに特異的に結合する第2の抗体に由来するscFvまたはscFabにコンジュゲートされている、重鎖
を含み、
該第1の抗体が、SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3、SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、およびSEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗BRDU抗体である、
前記使用。 - 抗BRDU抗体が、重鎖の30位にプロリンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、請求項1または2に記載の使用。
- 抗BRDU抗体が、重鎖の58位にフェニルアラニンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用。
- 抗BRDU抗体が、軽鎖の49位にリジンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用。
- 抗BRDU抗体が、軽鎖の98位にロイシンアミノ酸残基を有する(ナンバリングはKabatに従う)、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用。
- 抗BRDU抗体が、SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、請求項1および3~6のいずれか一項に記載の使用。
- 抗BRDU抗体が、
Kabatに従うSEQ ID NO:09のアミノ酸配列の53位のアミノ酸残基のシステインへの置換により生じるアミノ酸配列を有するVH配列と、
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVL配列と
を含む、請求項1および3~6のいずれか一項に記載の使用。
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