BR112014030844A2 - anticorpo anti-biotina humanizado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo - Google Patents

anticorpo anti-biotina humanizado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo Download PDF

Info

Publication number
BR112014030844A2
BR112014030844A2 BR112014030844A BR112014030844A BR112014030844A2 BR 112014030844 A2 BR112014030844 A2 BR 112014030844A2 BR 112014030844 A BR112014030844 A BR 112014030844A BR 112014030844 A BR112014030844 A BR 112014030844A BR 112014030844 A2 BR112014030844 A2 BR 112014030844A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
biotin
amino acid
seq
hvr
Prior art date
Application number
BR112014030844A
Other languages
English (en)
Inventor
Hoffmann Eike
Georges Guy
Grote Michael
Brinkmann Ulrich
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of BR112014030844A2 publication Critical patent/BR112014030844A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

anticorpos, formulação farmacêutica e uso do anticorpo a invenção fornece anticorpos anti-biotina e métodos de uso dos mesmos.

Description

“ANTICORPOS, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO ANTICORPO”
Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-biotina e métodos de uso dos mesmos.
Antecedentes da Invenção [002] Anticorpos de ligação a hapteno podem ser aplicados como módulos de captura para aplicações terapêuticas e aplicações de diagnóstico. Por exemplo, entidades ligadas a hapteno, como fluoróforos, reagentes quelantes, peptídeos, ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, nanopartículas e muitos outros agentes podem reagir com anticorpos de ligação a hapteno e derivados de anticorpos. Isso permite a detecção efetiva dessas cargas úteis, bem como captura, acúmulo em locais desejados, reticulação e outros efeitos mediados por anticorpo. Visto que as características e a composição de haptenos podem influenciar a composição e o “comportamento” de entidades ligadas a hapteno (incluindo tamanho, solubilidade, atividade, propriedades biofísicas, PK, efeitos biológicos e outros), é altamente desejável desenvolver uma variedade de diferentes entidades de ligação a hapteno. Dessa forma, é possível combinar um hapteno selecionado com uma determinada carga útil para gerar conjugados a hapteno otimizados. Subsequentemente, entidades de ligação a hapteno ótimas podem ser combinadas com os ditos conjugados para gerar complexos anticorpo-hapteno-carga útil ótimos. É ainda desejável ter entidades de ligação a hapteno como derivados de anticorpo que são humanizados. Isso permite aplicações com risco significativamente reduzido de interferência, como imunogenicidade em aplicações terapêuticas. Os anticorpos que são descritos no presente pedido se ligam a derivados de biotina (mas não à biotina modificada). Esses anticorpos são denominados neste documento de “ligação à biotina” ou “anticorpos de ligação à biotina”.
[003] No documento WO 00/50088 são relatados complexos de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 9/104
2/90 anticorpo-quimocina biotinilada.
[004] Kohen, F., et al., relatam a preparação e propriedades de anticorpos anti-biotina (Métodos Enzymol. 279 (1997) 451-463. Anticorpos antibiotina monoclonais que simulam avidez no reconhecimento de biotina são relatados por Bagci, H., et al. (FEBS Lett. 322 (1993) 47-50). Cao, Y., et al., relatam o desenvolvimento de um anticorpo monoclonal biespecífico como uma imunosonda universal para detecção de macromoléculas biotiniladas (J. Immunol. Meth. 220 (1998) 85-91).
[005] No documento WO 01/34651 são relatados anticorpos de ligação a um enantiômero que ocorre naturalmente (L-biotina) e seus usos como agentes de direcionamento.
[006] Dakshinamurti et al. relatam a produção e caracterização de anticorpo monoclonal para biotina (Biochem. J. 237 (1986) 477-482). Uma comparação da ligação de biotina e ligantes macromoleculares biotinilados a um anticorpo monoclonal anti-biotina e à estreptavidina é relatado por Vincent, P., etal. (J. Immunol. Meth. 165 (1993) 177-182). Berger, M., et al. Biochem. 14 (1975) 2338-2342) relatam a produção de anticorpos que se ligam à biotina e inibem enzimas contendo biotina.
Descrição Resumida da Invenção [007] A invenção fornece anticorpos anti-biotina e anticorpos derivados anti-biotina, bem como métodos de uso dos mesmos.
[008] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um anticorpo anti-biotina humanizado, em que o anticorpo compreende (a) HVRH3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID: 11, (b) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, e (c) HVRH2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Esse anticorpo se liga especificamente à biotina.
[009] Em uma realização, o anticorpo ainda compreende (a)
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 10/104
3/90
HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 09, (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
[0010] Em uma realização, o anticorpo ainda compreende (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[0011] Em uma realização, o anticorpo compreende na posição 24 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido serina e/ou compreende na posição 73 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido treonina.
[0012] Em uma realização, o anticorpo compreende na posição 60 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido alanina e/ou compreende na posição 61 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido glutamina.
[0013] Em uma realização, o anticorpo (1) compreende na posição 24 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido serina e/ou compreende na posição 73 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido treonina, (2) compreende na posição 60 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido alanina, e (3) compreende na posição 61 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido glutamina.
[0014] Em uma realização, o anticorpo compreende (a) uma sequência de VH que tem pelo menos 95% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (b) uma sequência de VL que
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 11/104
4/90 tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; ou (c) uma sequência de VH como em (a) e uma sequência de VL como em (b), em que o resíduo de aminoàcido na posição 24 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, é serina e/ou o resíduo de aminoàcido na posição 73 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, é treonina e o resíduo de aminoàcido na posição 60 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, é alanina, e o resíduo de aminoàcido na posição 61 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, é glutamina.
[0015] Em uma realização, o anticorpo compreende uma sequência de VH da SEQ ID NO: 12.
[0016] Em uma realização, o anticorpo compreende uma sequência de VL da SEQ ID NO: 16.
[0017] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um anticorpo que compreende uma sequência de VH da SEQ ID NO: 12 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 16.
[0018] Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo lgG1 inteiro ou um anticorpo lgG4 inteiro.
[0019] Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0020] Em uma realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que se liga à biotina.
[0021] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é uma formulação farmacêutica que compreende o anticorpo, conforme relatado no presente pedido, e um veículo farmaceutícamente aceitável.
[0022] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o anticorpo, conforme relatado no presente pedido, para uso como um
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 12/104
5/90 medicamento.
[0023] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o uso do anticorpo, conforme relatado no presente pedido, na fabricação de um medicamento.
Descrição das Figuras [0024] Figura 1: Expressão do anticorpo humanizado que se liga à biotina e derivados da biotina com ou sem mutação em cys para acoplamento de carga útil covalente: SDS PAGE de redução e não redução mostra composição e homogeneidade de anticorpos humanizados após purificação com proteína A e SEC. Cadeias H do anticorpo (banda superior a 50 k) e cadeias L (banda inferior a 25 k) são detectáveis como bandas exclusivas nas frações purificadas SEC de ambos os derivados de anticorpo sem a presença de quantidades visíveis de combinações de proteínas adicionais.
[0025] Figure 2: A estrutura da proteína de anticorpo anti-biotinafragmento Fab murino foi determinada no complexo com biocitinamida: o hapteno complexado é posicionado em estreita proximidade a um agrupamento de aminoácidos carregado negativamente; a biotina que, como hapteno, é derivada para acoplamento de carga útil em seus grupos carboxila se liga com boa eficácia como se não houvesse nenhuma carga de repulsão nessa posição (devido à falta do grupo COOH); ao contrário, a biotina livre não pode se ligar de maneira eficiente ao anticorpo porque seu grupo carboxila estaria em estreita proximidade com esse agrupamento negativamente carregado, e então seria repelido.
Descrição Detalhada das Realizações da Invenção Definições [0026] Uma “estrutura humana aceitante” para os propósitos no presente pedido é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável da cadeia leve (VL) ou uma estrutura de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 13/104
6/90 domínio variável da cadeia pesada (VH) derivada a partir de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitante “derivada a partir de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos desta ou pode conter trocas na sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, o número de trocas de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas realizações, a estrutura humana aceitante VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana VL ou sequência de estrutura consenso humana.
[0027] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado no presente pedido, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X em relação ao seu parceiro Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os descritos no presente pedido. Ilustrativo específico e realizações exemplares para medir afinidade de ligação são descritos a seguir.
[0028] Um anticorpo de “afinidade madura” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis do mesmo, em comparação a um anticorpo parental que não possui essas alterações, como alterações que resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno.
[0029] Os termos “anticorpo anti-biotina” e “um anticorpo que se
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 14/104
7/90 liga à biotina” refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar à biotina com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento de biotina. Em uma realização, o grau de ligação de um anticorpo anti-biotina a uma proteína biotina não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo à biotina conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga à biotina tem uma constante de dissociação (Kd) < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10'8 M ou menos, por exemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por exemplo, de 10'9 M a 10'13 M).
[0030] O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.
[0031] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(abj2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0032] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo”, como um anticorpo de referência, refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste competitivo em 50% ou mais, e inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Um ensaio de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 15/104
8/90 competição exemplar é fornecido no presente pedido.
[0033] O termo de anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[0034] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem, ainda, ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, lgG2, IgGs, lgG4, IgAi e lgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de oc, δ, ε,γθμ, respectivamente.
[0035] O termo “agente citotóxico”, como usado no presente pedido, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função celular e/ou causa morte ou destruição das células. Agentes citotóxicos incluem, mas não se limitam a, isotopes radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterapêuticos ou drogas, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucila, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos dos mesmos como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos; e os vários agentes antitumor ou anticâncer divulgados abaixo.
[0036] “Funções efetoras” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com a classe do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação C1q e
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 16/104
9/90 citoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação do receptor Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, infrarregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B.
[0037] Uma “quantidade efetiva” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade efetiva nas dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.
[0038] O termo “região Fc” no presente pedido é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma realização, uma região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina humana se estende a partir de Cys226 ou de Pro230 até a terminação carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina Cterminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma no presente pedido, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ã ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.
[0039] “Região de estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)FR4.
[0040] Os termos “anticorpo inteiro,” “anticorpo intacto” e
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 17/104
10/90 “anticorpo completo” são usados de forma intercambiável no presente pedido para se referir a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que tem cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente pedido.
[0041] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira” e “cultura celular hospedeira” são usados de forma intercambiável e referem-se às células em que o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir das mesmas sem consideração ao número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica a uma célula parental no conteúdo de ácido nucleico, mas pode conter mutações. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como as tríadas ou selecionadas para a célula originalmente transformada são incluídas no presente pedido.
[0042] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou uma célula humana derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.
[0043] Uma “estrutura consenso humana” é uma estrutura que representa a maioria dos resíduos de aminoácidos que ocorrem comumente em uma seleção de sequências de estrutura de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat, E.A.,
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 18/104
11/90 et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ã ecL, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), NIH Publication 913242, Vols. 1-3. Em uma realização, para a VL, o subgrupo é subgrupo kappa I, como em Kabat et al., acima. Em uma realização, para a VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat etal., acima.
[0044] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs correspondem àquelas de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivada a partir de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.
[0045] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado no presente pedido, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formas estruturalmente definidas como alças (“alças hipervariáveis”). Geralmente, anticorpos de quatro cadeias nativas compreendem seis HVRs, três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo essa última de variabilidade de sequência mais alta e/ou envolvida no reconhecimento de antígeno. Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3). (Chothia, C. e Lesk, A.M., J. Mol.
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 19/104
12/90
Biol. 196 (1987) 901-917). CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 de L1, 50 a 56 de L2, 89 a 97 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 65 de H2, e 95 a 102 de H3. (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ã ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.) Com exceção de CDR1 na VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. CDRs também compreendem “resíduos determinantes de especificidade,” ou “SDRs,” que são resíduos que entram em contato com o antígeno. Os SDRs são incluídos nas regiões das CDRs chamadas CDRs abreviadas ou a-CDRs. As a-CDRs exemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDRL3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31 a 34 de L1,50 a 55 de L2, 89 a 96 de L3, 31 a 35B de H1,50 a 58 de H2, e 95 a 102 de H3. (Consulte Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que indicado de outra forma, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados no presente pedido de acordo com Kabat etal., acima.
[0046] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado a uma ou mais molécula(s) heteróloga(s) incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.
[0047] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o indivíduo ou sujeito é um humano.
[0048] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado de um componente de seu ambiente natural. Em algumas realizações, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 20/104
13/90 exemplo, por eletroforética (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese por capilaridade) ou cromatografia (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para avaliação de pureza de anticorpo consulte, por exemplo, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.
[0049] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Uma molécula isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente fora do cromossomo ou em um local do cromossomo diferente daquele de localização natural no cromossomo.
[0050] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo antibiotina” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo (ou fragmentos do mesmo), incluindo molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou vetores separados, e essa(s) molécula(s) de ácido nucleico(s) se apresenta(m) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.
[0051] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente pedido, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, que contêm mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigida contra um único determinante
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 21/104
14/90 em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo tudo ou parte dos loci da imunoglobulina humana, esses métodos e outros métodos exemplares para produção de anticorpos monoclonais são descritos no presente pedido.
[0052] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo que não é conjugado a um componente heterólogo (por exemplo, componente citotóxico) ou radiomarcado. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.
[0053] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com diferentes estruturas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por bissulfeto. A partir da terminação N até C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou um domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De maneira similar, a partir da terminação N a C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída para um dos dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos de seu
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 22/104
15/90 domínio constante.
[0054] O termo “bula” é usado para se referir às instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contra indicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.
[0055] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeos de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após alinhamento das sequências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar o percentual máximo de identidade de sequência, e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequência. Alinhamento, para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos, pode ser alcançado de várias maneiras, as quais estão dentro da técnica, por exemplo, com o uso de programas de computação disponíveis publicamente, como os programas de computação BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo das sequências inteiras sendo comparadas. Para os propósitos no presente pedido, no entanto, valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são obtidos com o uso do programa de computação de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computação de comparação de sequência ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação de usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado mediante U.S. Copyright Registration nQ TXU510087. O programa
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 23/104
16/90
ALIGN-2 está publicamente disponível junto à Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, inclusive UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[0056] Nas situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A a, com ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácidos a, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:
100 vezes a fração X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como comparações idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento de programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Considera-se que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos A em relação a B não é igual à % de identidade de sequência de aminoácidos B em relação a A. A menos que especificamente declarado de outra forma, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos usados no presente pedido são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, com o uso do programa de computação ALIGN-2.
[0057] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma a permitir a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma ser efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 24/104
17/90 qual a formulação seria administrada.
[0058] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, exceto um ingrediente ativo, que é não tóxico a um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[0059] O termo “biotina”, como usado no presente pedido, denota ácido 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]pentanoico. A biotina também é conhecida como vitamina H ou coenzima R.
[0060] Como usado no presente pedido, “tratamento” (e variações gramaticais do mesmo como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado, e pode ser realizado tanto para profilaxia como durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluem, mas não se limitam a, prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença e remissão ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, os anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a progressão de uma doença.
[0061] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Consulte, por exemplo, Kindt, T.J., et a!., Kuby Immunology, 6ã ed., W.H. Freeman e Co.,
N.Y. (2007), página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 25/104
18/90 conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados com o uso de um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para selecionar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Consulte, por exemplo, Portolano, S., et a!., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T„ et a!., Nature 352 (1991) 624-628).
[0062] O termo “vetor”, como usado no presente pedido, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de reproduzir outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual este foi introduzido. Certos vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos para os quais eles são ligados de maneira funcional. Esses vetores são denominados no presente pedido de “vetores de expressão”.
[0063] O termo “hapteno” denota uma molécula pequena que pode obter uma resposta imune somente quando fixado a um grande veículo como uma proteína. Haptenos exemplares são anilina, ácido o-, m-, e paminobenzoico, quinona, hidralazina, halotano, fluoresceína, biotina, digoxigenina, teofilina e dinitrofenol. Em uma realização, o hapteno é biotina, digoxigenina, teofilina, carborane.
[0064] O termo “um hapteno que é conjugado a” ou “composto haptenilado” denota um hapteno que é ligado covalentemente a um componente adicional como um polipeptídeo ou um marcador. Derivados de hapteno ativado são com frequência usados como materiais de partida para a formação desses conjugados. Em uma realização, o hapteno é digoxigenina e é conjugado (em uma realização através do seu grupo 3-hidróxi) ao componente através de um ligante. Em uma realização, o ligante compreende a) um ou mais (em uma realização três a seis) grupos metileno-carbóxi-metil (
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 26/104
19/90
CH2-C(O)-), e/ou b) de 1 a 10 (em uma realização de 1 a 5) resíduos de aminoácidos (em uma realização selecionado a partir de glicina, serina, glutamate, β-alanina, ácido γ-aminobutírico, ácido ε-aminocaproico ou lisina), e/ou c) um ou mais (em uma realização um ou dois) compostos que têm fórmula estrutural NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH em que n é 2 ou 3 exé 1 a 10, em uma realização 1 a 7. O último elemento resulta (pelo menos em parte) em um ligante (parte) da fórmula -NH-((CH2)nO)xCH2-CH2-C(O)-. Um exemplo desse composto é, por exemplo, ácido 12-amino-4,7,10-trioxadodecanoico (resultados em um ligante TEG (trietilenoglicol)). Em uma realização, o ligante compreende ainda um grupo maleimido. O ligante tem um efeito estabilizante e solubilizante, visto que contém cargas e/ou pode formar pontes de hidrogênio. Além disso, pode facilitar estericamente a ligação do anticorpo anti-hapteno ao polipeptídeo conjugado ao hapteno. Em uma realização, o ligante está localizado em uma cadeia lateral de um aminoácido do polipeptídeo (por exemplo, conjugado a uma cadeia lateral de lisina ou cisteína, através de um grupo amino ou tiol). Em uma realização, o ligante está localizado na terminação amino ou no terminal carbóxi do polipeptídeo. O posicionamento do ligante no polipeptídeo é tipicamente escolhido em uma região onde a atividade biológica do polipeptídeo não é afetada. Portanto, a posição de fixação do ligante depende da natureza do polipeptídeo e dos elementos de estrutura relevantes, que são responsáveis pela atividade biológica. A atividade biológica do polipeptídeo ao qual o hapteno se fixou, pode ser testada em um ensaio in vitro.
[0065] O termo “formação de complexo covalente” denota que após a formação de um complexo não covalente, por exemplo, entre um anticorpo anti-teofilina e teofilina, uma ligação covalente é formada entre os dois parceiros no complexo. A formação da ligação covalente ocorre sem a necessidade de adicionar mais reagentes.
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 27/104
20/90
II. Composições e Métodos [0066] Em um aspecto, a invenção é baseada em anticorpos que se ligam à biotina. Esses anticorpos são fornecidos no presente pedido. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, como anticorpos monoespecíficos para a ligação de compostos biotinilados e como anticorpos multiespecíficos para o diagnóstico ou tratamento de todos os tipos de doenças com o uso da especificidade de ligação ao composto biotinilado como característica de carga útil do anticorpo.
Anticorpos Anti-Biotina Exemplares [0067] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos isolados que se ligam à biotina. Em certas realizações os anticorpos anti-biotina são anticorpos humanizados anti-biotina. Em certas realizações, os anticorpos antibiotina, conforme relatado no presente pedido, se ligam a compostos biotinilados sem interferir com a atividade biológica do composto que é conjugado à biotina e especificamente ligado pelo anticorpo através do resíduo de biotina. Portanto, esses anticorpos podem ser usados para aprimorar as propriedades farmacocinéticas de compostos conjugados à biotina (compostos biotinilados) se o anticorpo é um anticorpo monoespecífico. Além disso, esses anticorpos podem ser usados para a distribuição direcionada de um composto biotinilado se o anticorpo é um anticorpo bi ou multiespecífico conforme uma especificidade de ligação é direcionada contra biotina e pode ser usada como especificidade de carga útil universal enquanto que uma segunda especificidade de ligação se liga especificamente, por exemplo, a uma molécula de superfície celular e determina o direcionamento da característica/componente do anticorpo bi ou multiespecífico.
[0068] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 28/104
21/90 aminoácidos da SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 06 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 07.
[0069] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03. Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03 e HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 07. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03, HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 07, e HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03.
[0070] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 que
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 29/104
22/90 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 06; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 07. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 06; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 07.
[0071] Em outro aspecto, um anticorpo anti-biotina da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: (01), (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 05; (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 06; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 07.
[0072] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 06; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 07.
[0073] Em uma realização, o anticorpo anti-biotina é humanizado.
[0074] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina humanizado que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 30/104
23/90 ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[0075] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina humanizado que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e (c) HVRH3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em outra realização, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, e HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
[0076] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina humanizado que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 31/104
24/90 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em uma realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[0077] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (I) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: (09), (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e (ill) HVRH3 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (I) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[0078] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina humanizado que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15.
[0079] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antibiotina humanizado que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 32/104
25/90 de aminoácidos da SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 06; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 07, em que o resíduo de aminoácido na posição 60 na HVR-H2 é A e o resíduo de aminoácido na posição 61 na HVR-H2 é Q.
[0080] O anticorpo anti-biotina humanizado compreende na posição 60 de Kabat um A e na posição 61 de Kabat um Q. Essas alterações (mutações forward) foram introduzidas para aumentar a afinidade de ligação do anticorpo anti-biotina humanizado.
[0081] Em uma realização, um anticorpo anti-biotina humanizado compreende HVRs como em qualquer uma das realizações acima, e ainda compreende uma estrutura humana aceitante, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura consenso humana. Em uma realização, um anticorpo anti-biotina humanizado compreende uma VH que compreende HVR-Hs como em qualquer uma das realizações acima, e ainda compreende um ou mais dos seguintes:
- S na posição 24, e/ou
- T na posição 73.
posição 24 de Kabat corresponde ao número de resíduo 24 da
SEQ ID NO: 04, 12 e 20.
posição 60 de Kabat corresponde ao número de resíduo 61 da
SEQ ID NO: 04, 12 e 20.
posição 61 de Kabat corresponde ao número de resíduo 62 da SEQ ID NO: 04, 12 e 20.
posição 71 de Kabat corresponde ao número de resíduo 72 da
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 33/104
26/90
SEQ ID NO: 04, 12 e 20.
[0082] Essas alterações (mutações forward) foram introduzidas para aumentar a afinidade de ligação do anticorpo anti-biotina humanizado.
[0083] Em outro aspecto, um anticorpo anti-biotina compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 04. Em certas realizações, uma sequência de VH que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-biotina que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar à biotina. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 04. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-biotina compreende a sequência de VH na SEQ ID NO: 04, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 01, (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 02, e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 03.
[0084] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-biotina, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 08. Em certas realizações, uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 34/104
27/90 substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-biotina que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar à biotina. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 08. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-biotina compreende a sequência de VL na SEQ ID NO: 08, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir da (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 06 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
[0085] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-biotina, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer uma das realizações fornecidas acima, e uma VL como em qualquer uma das realizações fornecidas acima. Em uma realização, o anticorpo compreende as sequências de VH e VL na SEQ ID NO: 04 e SEQ ID NO: 08, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.
[0086] Em outro aspecto, um anticorpo anti-biotina humanizado compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Em certas realizações, uma sequência de VH que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-biotina que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar à biotina. Em
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 35/104
28/90 certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 12. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-biotina compreende a sequência de VH na SEQ ID NO: 12, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 09, (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
[0087] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-biotina humanizado, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em certas realizações, uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-biotina que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar à biotina. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 16. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo antibiotina compreende a sequência de VL na SEQ ID NO: 16, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir da (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 36/104
29/90 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[0088] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-biotina humanizado, em que o anticorpo compreende um VH como em qualquer uma das realizações fornecidas acima, e um VL como em qualquer uma das realizações fornecidas acima. Em uma realização, o anticorpo compreende as sequências de VH e VL na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.
[0089] Em um aspecto adicional da invenção, um anticorpo antibiotina de acordo com qualquer uma das realizações acima é um anticorpo monoclonal, que inclui um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em uma realização, um anticorpo anti-biotina é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacorpo ou F(abj2. Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo inteiro, por exemplo, um anticorpo lgG1 ou lgG4 intacto ou outra classe de anticorpo ou isotipo conforme definido no presente pedido.
[0090] Em um aspecto adicional, um anticorpo anti-biotina de acordo com qualquer uma das realizações acima pode incorporar qualquer uma das características individualmente ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1 a 5 abaixo:
1. Afinidade de Anticorpo [0091] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido tem uma constante de dissociação (Kd) < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10'8 M ou menos, por exemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por exemplo, de 10'9 M a 10'13 M).
[0092] Em uma realização, Kd é medida por um ensaio de ligação de antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno, conforme descrito pelo ensaio a seguir. A afinidade de ligação da solução de FABs para o antígeno é medida por
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 37/104
30/90 equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (125l) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado e então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (consulte, por exemplo, Chen, Y. et a!., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas multipoços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 pg/mL de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6), e subsequentemente bloqueadas com albumina de soro bovino 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23QC). Em uma placa não adsorvente (Nunc nQ 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno (125l) são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta, L.G., et a!., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período maior (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com polissorbato 20 0,1% (TWEEN-20®) em PBS. Quando as placas estiverem secas são adicionados 150 pL/poço de cintilante (MICRQSCINT-20™; Packard) e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que fornecem ligação máxima menor ou igual a 20% são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva.
[0093] De acordo com outra realização, Kd é medido com o uso de ensaios de ressonância plasmônica de superfície com o uso de um BIACQRE®-2000 ou um BIACQRE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25QC com chips CM5 de antígeno imobilizado a aproximadamente 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biossensor dextrano carboximetilado
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 38/104
31/90 (CM5, BIACORE Inc.) são ativados com hidrocloreto de AZ-etil-ZV- (3dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e AZ-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/mL (aproximadamente 0,2 μΜ) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 pL/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições em série duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com tensoativo polissorbato 20 0,05% (TWEEN-20™) (PBST) a 25QC a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 pL/min. As taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Computação de Avaliação BIACORE® versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Consulte, por exemplo, Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881. Se a taxa de associação exceder 106 M'1 s'1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de bandas de passagem) a 25QC de um anticorpo anti-antígeno 20nM em PBS (forma Fab), pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em um espectrômetro, como um espectrofotômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLMAMINCO™ série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho misturador.
2. Fragmentos de Anticorpos [0094] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpos incluem, mas
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 39/104
32/90 não se limitam a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(abj2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, consulte Hudson, P.J., etal., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para uma revisão de fragmentos scFv, consulte, por exemplo, Plueckthun, A., em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore (eds.), Springer-Verlag, Nova York (1994), páginas 269-315; consulte também documento WO 93/16185; e patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(abj2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate e têm meia vida aumentada in vivo, consulte patente US 5.869.046.
[0095] Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consulte, por exemplo, patente EP 0 404 097; documento WO 1993/01161; Hudson, P.J., et a!., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Holliger, P., etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) 6444-6448. Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson, P.J., etal., Nat. Med. 9 (2003) 129-134).
[0096] Anticorpos com domínio único são fragmentos que compreendem todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo com domínio único é um anticorpo com domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, patente US 6.248.516 B1).
[0097] Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coliou fago), conforme descrito no presente pedido.
3. Anticorpos Quiméricos e Humanizados [0098] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 40/104
33/90 pedido é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente US 4.816.567; e Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 6851-6855). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “mudança de classe” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.
[0099] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, em que, por exemplo, HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[00100] Anticorpos humanizados e métodos para produzir são revisados, por exemplo, em Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, e ainda são descritos, por exemplo, em Riechmann, I. etal., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 41/104
34/90 (1989) 10029-10033; patentes US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321, US 7.087.409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que descreve enxerto SDR (a-CDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que descreve “resurfacing”); Dall’Acqua, W.F., etal., Methods 36 (2005) 43-60 (que descreve “embaralhamento de FR”); e Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 e Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que descreve a abordagem “seleção guiada” para embaralhamento de FR).
[00101] Regiões de estrutura humana que podem ser usadas para humanização incluem, mas não se limitam a: regiões de estrutura selecionadas com o uso do método de “melhor ajuste” (consulte, por exemplo, Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiões de estrutura derivadas a partir da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis da cadeia leve ou pesada (consulte, por exemplo, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 4285-4289; e Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiões de estrutura maduras humanas (mutadas somaticamente) ou regiões de estrutura de linhagem germinativa humana (consulte, por exemplo, Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); e regiões de estrutura derivadas de bibliotecas de seleção de FR (consulte, por exemplo, Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 e Rosok, M.J., etal., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618).
4. Anticorpos Multiespecíficos [00102] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para biotina e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes de biotina. Anticorpos biespecíficos
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 42/104
35/90 também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam biotina. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos.
[00103] As técnicas para fabricação de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares da cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm especificidades diferentes (consulte, Milstein, C. e Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, documento WO 93/08829, e Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 36553659), e “protuberância em orifício” elaborada geneticamente (consulte, por exemplo, patente US 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por elaboração genética de efeitos de direcionamento eletrostático para produzir moléculas de anticorpo Fc-heterodiméricas (documento WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente US 4.676.980, e Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83); com o uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; com o uso de tecnologia “diacorpo” para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) 6444-6448); e com o uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) (consulte, por exemplo, Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
[00104] Anticorpos elaborados geneticamente com três ou mais sítios de ligação de antígeno funcionais, incluindo “anticorpos polvo”, também são incluídos no presente pedido (consulte, por exemplo, patente US 2006/0025576).
[00105] O anticorpo ou fragmento no presente pedido também
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 43/104
36/90 inclui um “Fab de ação dupla” ou “DAF” que compreende um sítio de ligação de antígeno que se liga à biotina bem como a um outro antígeno diferente (consulte, patente US 2008/0069820, por exemplo).
[00106] O anticorpo ou fragmento no presente pedido também inclui anticorpos multiespecíficos descritos nos documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 e WO 2010/145793.
5. Anticorpos Variantes [00107] Em certas realizações, são contempladas sequências de aminoácidos variantes dos anticorpos fornecidos no presente pedido. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas por introdução apropriada de modificações na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por síntese peptídica. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções, inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar ao constructo final, contanto que o constructo final possua as características desejadas, por exemplo, ligação de antígeno.
a) Substituições, Inserções e Deleções Variantes [00108] Em certas realizações, são fornecidos anticorpos variantes que têm uma ou mais substituições de aminoácidos. Sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de substituições preferidas. Mais mudanças substanciais são fornecidas na Tabela 1, sob o título de “substituições exemplares”, e conforme mais adiante descritas abaixo, em referência às classes de cadeia laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 44/104
37/90 interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno retida/apri morada, diminuição de imunogenicidade e ADCC ou CDC aprimorada.
Tabelai
Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferenciais
Ala (A) Vai; Leu; lie Vai
Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
lie (1) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
Leu (L) Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe lie
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; lie Leu
Phe (F) Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Vai; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Vai (V) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
[00109] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 45/104
38/90 propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
(2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) ácido: Asp, Glu;
(4) básico: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro;
(6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[00110] Substituições não conservativas irão implicar na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[00111] Um tipo de variante substitucional envolve substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para mais adiante estudar se terá modificações (por exemplo, aprimoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou se terá certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental. Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo de afinidade madura, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, com o uso de técnicas de maturação de afinidade com base na exibição por fago conforme essas descritas no presente pedido. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos variantes exibidos em fago e selecionados para uma atividade biológica específica (por exemplo, afinidade de ligação).
[00112] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para aprimorar a afinidade do anticorpo. Essas alterações podem ser produzidas em “hotspots” de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que são submetidos a mutação em alta frequência durante o processo somático de maturação (consulte, por exemplo,
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 46/104
39/90
Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), e/ou SDRs (aCDRs), com a VH ou VL variante resultante sendo testada quanto à afinidade de ligação. A maturação de afinidade por construção e nova seleção a partir das bibliotecas secundárias foi descruta, por exemplo, em Hoogenboom, H.R., et a!., em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. Em algumas realizações de maturação de afinidade é introduzida diversidade nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, mistura de cadeia ou mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então selecionada para identificar quaisquer anticorpos variantes com a afinidade desejada. Qualquer método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, na qual diversos resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de uma vez) são randomizados. Resíduos de HVR envolvidos em ligação de antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, com o uso de mutagênese ou modelagem de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular, são muitas vezes alvo.
[00113] Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas conforme fornecidas no presente pedido) que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Essas alterações podem estar fora de “hotspots” de HVR ou SDRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR tanto não é alterada como contêm não mais que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[00114] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 47/104
40/90 de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado de “mutagênese de varredura de alanina” conforme descrito por Cunningham, B.C. e Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoàcido carregado negativamente ou neutro (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Além disso, podem ser introduzidas substituições nas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. De maneira alternativa ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser selecionadas para determinar se contêm as propriedades desejadas.
[00115] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carbóxi terminal, variando, de comprimento, de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão à terminação N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia vida no soro do anticorpo.
[00116] Uma variante preferencial é uma variante de cisteína única em que o resíduo de aminoàcido na posição 53 de acordo com Kabat no domínio variável da cadeia pesada é cisteína.
b) Glicosilações Variantes [00117] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 48/104
41/90 presente pedido é alterado para aumentar ou diminuir a medida na qual o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos, como aquela em que um ou mais dos sítios de glicosilação são criadas ou removidas.
[00118] Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato fixado ao mesmo pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Consulte, por exemplo, Wright, A. e Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a uma GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas realizações, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar anticorpos variantes com certas propriedades aprimoradas.
[00119] Em uma realização, anticorpos variantes são fornecidos tendo uma estrutura de carboidrato desprovida de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose nesse anticorpo pode ser de 1 % a 80%, de 1 % a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo da quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas do tipo complexo, alta manose e híbridas) conforme medido por espectrometria de massa MALDITOF, conforme descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de mais ou menos 3 aminoácidos a
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 49/104
42/90 montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência em anticorpos. Essas fucosilações variantes podem ter função ADCC melhorada. Consulte, por exemplo, patentes US 2003/0157108, US 2004/0093621. Exemplos de publicações relacionadas a anticorpos variantes “defucosilados” ou “deficientes em fucose” incluem: patente US 2003/0157108, documento WO 2000/61739, documento WO 2001/29246, patente US 2003/0115614, patente US 2002/0164328, patente US 2004/0093621, patente US 2004/0132140, patente US 2004/0110704, patente US 2004/0110282, patente US 2004/0109865, documento WO 2003/085119, documento WO 2003/084570, documento WO 2005/035586, documento WO 2005/035778, documento WO 2005/053742, documento WO 2002/031140, Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células CHO Led 3 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; patente US 2003/0157108 e documento WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (consulte, por exemplo, Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; e documento WO 2003/085107).
[00120] Anticorpos variantes são fornecidos mais adiante com oligossacarídeos divididos, por exemplo, na qual um oligossacarídeo biantenário ligado a região Fc do anticorpo é dividido por GlcNAc. Esses anticorpos variantes podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Exemplos desses anticorpos variantes são descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878, patentes US 6.602.684 e US 2005/0123546. Também são fornecidos anticorpos variantes com pelo menos um resíduo de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 50/104
43/90 galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Esses anticorpos variantes podem ter função CDC melhorada. Esses anticorpos variantes são descritos, por exemplo, nos documentos WO 1997/30087, WO 1998/58964 e WO 1999/22764.
c) Regiões Fc Variantes [00121] Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas dentro da região Fc de um anticorpo fornecido no presente pedido, através disso gerando uma região Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido.
[00122] Em certas realizações, a invenção contempla um anticorpo variante que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, que fazem desse um candidato desejável para aplicações em que a meia vida do anticorpo in vivo é ainda importante para certas funções efetoras (como complemento e ADCC) não necessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação do receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo é desprovido de ligação ao FcyR (então provavelmente sendo desprovido de atividade ADCC), mas mantém capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch, J.V. e Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457492. Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na patente US 5.500.362
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 51/104
44/90 (consulte, por exemplo, Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 7059-7063; e Hellstrom, I., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 1499-1502); patente US 5.821.337 (consulte Bruggemann, M., et ai., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). De modo alternativo, os métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (consulte, por exemplo, ACTI™ ensaio de citotoxicidade não radioativo para fluxo citométrico (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e CytoTox 96® ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, Wl). Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (Natural Killer-NK). De maneira alternativa ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes, R., et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95 (1998) 652-656. Ensaios de ligação C1q também podem ser realizados para confirmar se o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, então, desprovido de atividade CDC. Consulte, por exemplo, ELISA de ligação C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (consulte, por exemplo, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Ligação ao FcRn e determinações de liberação/meia vida in vivo também podem ser realizadas com o uso de métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Petkova, S.B., et a!., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).
[00123] Anticorpos com função efetora reduzida incluem os com substituições de um ou mais dentre os resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (patente US 6.737.056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições dos aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o também conhecido como mutante Fc
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 52/104
45/90 “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 para alanina (patente US 7.332.581).
[00124] São descritos certos anticorpos variantes com ligação melhorada ou reduzida para FcRs. (consulte, por exemplo, patentes US 6.737.056; documento WO 2004/056312, e Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
[00125] Em certas realizações, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).
[00126] Em algumas realizações, são feitas alterações na região Fc que resultam em ligação C1q alterada (isto é, tanto melhorada como reduzida) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na patente US 6.194.551, documento WO 99/51642 e Idusogie, E.E., etal., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
[00127] Anticorpos com meia vida aumentada e ligação aprimorada para o receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternas para os fetos (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, e Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), são descritos na patente US 2005/0014934. Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesse, que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Essas Fc variantes incluem as com substituições em um ou mais dentre os resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região Fc (patente US 7.371.826).
[00128] Consulte também, Duncan, A.R. e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; patente US 5.648.260; patente US 5.624.821; e documento WO 94/29351 com respeito a outros exemplos de regiões Fc variantes.
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 53/104
46/90
d) Anticorpos Variantes Elaborados Geneticamente com Cisteína [00129] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos elaborados geneticamente com cisteína, por exemplo, “thioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em realizações específicas, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Mediante a substituição desses resíduos por cisteína, os grupos tióis reativos são, através disso, posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outros componentes, como componentes droga ou componentes ligante-droga, para criar um imunoconjugado, conforme ainda descrito no presente pedido. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada. Anticorpos elaborados geneticamente com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na patente US 7.521.541.
e) Anticorpos Derivados [00130] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido pode ser mais adiante modificado para conter componentes não proteináceos adicionais que são conhecidos na técnica e prontamente disponíveis. Os componentes adequados para derivatização do anticorpo incluem, mas não se limitam a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno,
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 54/104
47/90 polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação, devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados ao anticorpo pode variar, e se mais que um polímero for fixado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base nas considerações que incluem, mas não se limitam a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a serem melhoradas, se o anticorpo derivado for usado em uma terapia mediante condições definidas, etc.
[00131] Em outra realização, são fornecidos conjugados de um anticorpo e componentes não proteináceos que podem ser seletivamente aquecidos por exposição à radiação. Em uma realização, o componente não proteináceo é um nanotubo de carbono (Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ter qualquer comprimento de onda e inclui, mas não se limita a, comprimentos de onda que não são prejudiciais às células comuns, mas que aquecem o componente não proteináceo a uma temperatura na qual as células próximas ao componente não proteináceo do anticorpo são destruídas.
B. Métodos Recombinantes e Composições [00132] Anticorpos podem ser produzidos com o uso de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descritos na patente US 4.816.567. Em uma realização, é fornecido o ácido nucléico isolado que codifica um anticorpo anti-biotina descrito no presente pedido. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma realização adicional, são fornecidos um ou mais vetores (por exemplo, vetores de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 55/104
48/90 expressão) que compreendem esse ácido nucleico. Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Nessa realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é eucarionte, por exemplo, célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NSO, Sp20). Em uma realização, é fornecido um método de produção de um anticorpo anti-biotina, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições adequadas para expressão do anticorpo e opcionalmente recuperação do anticorpo a partir das células hospedeiras (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[00133] Para produção recombinante de um anticorpo anti-biotina, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagens adicionais e/ou expressão em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[00134] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procariontes ou eucariontes descritas na presente invenção. Por exemplo, os anticorpos podem
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 56/104
49/90 ser produzidos em bactérias, em particular quando não é necessária glicosilação e função efetora de Fc. Para expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, patentes US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. (Consulte também Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), páginas 245-254, que descreve expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli.) Após expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser purificado.
[00135] Além de procariontes, micróbios eucariontes como fungos filamentosos ou leveduras estão clonagens ou expressões adequadas em hospedeiros para vetores que codificam anticorpos, incluindo fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Consulte Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 14091414; e Li, H„ etal., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
[00136] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também são derivadas a partir de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[00137] Culturas celulares de plantas também podem ser usadas como hospedeiras. Consulte, por exemplo, patentes US 6.040.498, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descreve tecnologia PLANTIBODIES™ para produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[00138] Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamíferos que são
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 57/104
50/90 adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7), linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham, F.L., et at., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de rim de filhote de hamster (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., et a!., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamífero incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR' (Urlaub, G., et a!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); e linhagens celulares de mieloma, como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de determinadas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos para produção de anticorpos, consulte, por exemplo, Yazaki, P. e Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), páginas 255-268.
C. Ensaios [00139] Os anticorpos anti-biotina fornecidos no presente pedido podem ser identificados, selecionados ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.
Ensaios de Ligação e Outros Ensaios [00140] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação de antígeno, por exemplo, por métodos
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 58/104
51/90 conhecidos como ELISA, Western blot, etc.
[00141] Em outro aspecto, ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com os anticorpos, conforme relatado no presente pedido, quanto a ligação à biotina.
[00142] Em um ensaio de competição exemplar, a biotina imobilizada é incubada em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga à biotina e um segundo anticorpo não marcado que é testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo para ligação à biotina. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como um controle, a biotina imobilizada é incubada em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação sob condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo à biotina, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associado à biotina imobilizada é medida. Se a quantidade de marcador associado à biotina imobilizada é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação à biotina. Consulte Harlow, E. e Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1998).
D. IMUNOCONJUGADOS [00143] A invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-biotina no presente pedido conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, como agentes quimioterapêuticos ou drogas, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou isotopes radioativos.
[00144] Em uma realização, um imunoconjugado é um conjugado
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 59/104
52/90 anticorpo-droga (ADC), no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas incluindo, mas não se limitando a, um maitansinoide (consulte patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente europeia EP 0 425 235 B1); uma auristatina como componentes droga monometil auristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (consulte patentes US 5.635.483 e 5.780.588 e 7.498.298); uma dolastatina; uma caliqueamicina ou derivados das mesmas (consulte patentes US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 e US 5.877.296; Hinman, L.M., etal., Cancer Fies. 53 (1993) 3336-3342; e Lode, H.N., etal., Cancer Fies. 58 (1998) 2925-2928); uma antraciclina, como daunomicina ou doxorrubicina (consulte Kratz, F., et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C., etal., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717721; Nagy, A., etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M., etal., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343; e patente US 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricoteceno; e CC1065.
[00145] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo, conforme descrito no presente pedido, conjugado a uma toxina ativa enzimaticamente ou fragmento da mesma incluindo, mas não se limitando a toxina de difteria, cadeia A da exotoxina (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Carantia momordica, curcina, cretina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[00146] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente pedido, conjugado a um átomo
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 60/104
53/90 radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para detecção, este pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, TC99m ou I123, ou um marcador de spin para formação de imagens por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem por ressonância magnética, MRI), como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[00147] Conjugados de um anticorpo e agentes citotóxicos podem ser produzidos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais como propionate de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato, iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta, E.S., et a!., Science 238 (1987) 1098-1104. O ácido triamino penta-acético 1isotiocianatobenzil-3-metildietileno marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari, R.V., et ai., Cancer Fies. 52 (1992) 127131; patente US 5.208.020) pode ser usado.
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 61/104
54/90 [00148] Os imunoconjugados ou ADCs no presente pedido contemplam expressamente, mas não se limitam a esses conjugados preparados com reagentes reticulantes incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoate) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., E.U.A).
E. Métodos e Composições para Diagnósticos e Detecção [00149] O termo “detecção”, como usado no presente pedido, engloba detecção quantitativa ou qualitativa.
[00150] Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-biotina para uso em um método de diagnóstico ou detecção. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo.
[00151] Em certas realizações, são fornecidos anticorpos antibiotina marcados. Os marcadores incluem, mas não se limitam a, marcadores ou componentes que são detectados diretamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos), bem como componentes, como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam aos radioisotopes 32P, 14C, 125l, 3H e 1311, fluoróforos como os quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luciferases, por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana (patente US 4.737.456), luciferina, 2,3-desidroftalazinedionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeos oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 62/104
55/90 como uricase e xantina oxidase, acopladas com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um corante precursor como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.
F. Formulações Farmacêuticas [00152] Formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-biotina conforme descrito no presente pedido são preparadas por mistura desse anticorpo que tem o grau desejado de pureza com um ou mais Veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Osol, A. (ed.) Flemington’s Pharmaceutical Sciences, 16ã edição (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente são não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não se limitam a: tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menor que cerca de 10 resíduos); polipeptídeos, proteínas, como albumina no soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons como sódio; complexos de metal (por exemplo,complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares no presente pedido ainda incluem agentes de dispersão de drogas intersticiais como glicoproteínas hialuronidase
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 63/104
56/90 neutra ativa solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH20 solúvel humana, como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rhuPH20, são descritos nas publicações de patentes US 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais como condroitinases.
[00153] As formulações exemplares de anticorpos liofilizados são descritas na patente US 6.267.958. As formulações de anticorpos aquosos incluem as descritas na patente US 6.171.586 e no documento WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão acetato de histidina.
[00154] A formulação no presente pedido também pode conter mais de um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação específica a ser tratada, preferencialmente aquela com atividades complementares que não afetem contrariamente uma a outra. Por exemplo, pode ser desejável para ainda fornecer (lista de drogas que podem ser combinadas com o anticorpo anti-biotina). Esses ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[00155] Os ingredientes ativos podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Flemington’s Pharmaceutical Sciences, 16ã edição, Osol, A. (ed.) (1980).
[00156] Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 64/104
57/90 contêm o anticorpo, cujas matrizes estão sob a forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
[00157] As formulações a serem usadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.
G. Métodos Terapêuticos e Composições [00158] Qualquer um dos anticorpos anti-biotina fornecidos no presente pedido pode ser usado em métodos terapêuticos.
[00159] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-biotina para uso como um medicamento. Em certas realizações, é fornecido um anticorpo anti-biotina para uso em um método de tratamento.
[00160] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-biotina na fabricação ou preparação de um medicamento.
[00161] Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos anti-biotina fornecidos no presente pedido. Em uma realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-biotina fornecidos no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00162] Anticorpos da invenção podem ser usados tanto sozinhos como em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00163] Essas combinações de terapia apontadas acima englobam administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou separados), e administração separada, nesse caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Anticorpos da invenção também podem
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 65/104
58/90 ser usados em combinação com radioterapia.
[00164] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e se desejado, para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração por via intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosa ou subcutânea, dependendo em parte, se a administração é breve ou contínua. Várias programações de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas durante vários pontos no tempo, administração em bolus e infusão de pulso são contempladas no presente pedido.
[00165] Anticorpos da invenção seriam formulados, dosados e administrados de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração nesse contexto incluem a disfunção específica a ser tratada, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da disfunção, o local de distribuição do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos especialistas. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento e dos outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com rotas de administração conforme descritas no presente pedido, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente pedido, ou em qualquer dosagem e por qualquer rota que seja empiricamente/clinicamente determinada a ser apropriada.
[00166] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 66/104
59/90 apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo, e do diagnóstico do médico. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,5 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administrar ao paciente, por exemplo, tanto por uma ou mais administrações separadas como por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo seria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Dessa forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[00167] Entende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser executados com o uso de um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo antiPetição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 67/104
60/90 biotina.
III. Artigos de Fabricação [00168] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo, ou uma bula associada ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas para solução IV, etc. Os recipientes podem ser fabricados a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si mesma ou combinada com outra composição, eficaz para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável para uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou bula indicam que a composição é usada para tratar a condição recomendada. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou de outro modo um agente terapêutico. O artigo de fabricação nessa realização da invenção pode, além disso, compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica. De maneira alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato tamponado salino, solução de Ringer e solução de dextrose. Além disso, pode incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 68/104
61/90 outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[00169] Entende-se que qualquer um dos artigos de fabricação acima podem incluir um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo anti-biotina.
IV. Exemplos [00170] A seguir estão os exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.
Exemplo 1
Isolamento e Caracterização de cDNAs que Codificam os Domínios VH e VL de um Anticorpo Anti-Biotina Murino da Classe IgG1 com Cadeia Leve Kappa de Hibridoma de Camundongo [00171] A proteína e informações de sequência (DNA) dos domínios VH e VL do anticorpo hapteno-biotina murino foram obtidas diretamente de clones de hibridoma. As etapas experimentais realizadas subsequentemente foram (i) o isolamento do RNA a partir do anticorpo que produz células de hibridoma, (ii) conversão desse RNA em cDNA, a transferência em VH e VL que abriga os fragmentos de PCR, e (iii) integração desses fragmentos de PCR nos vetores dos plasmídeos para propagação em E. co//e determinação de suas sequências de DNA (e proteína deduzida).
Preparação de RNA a partir de Células de Hibridoma [00172] O RNA foi preparado a partir de 5x106 anticorpos que expressam células de hibridoma aplicando o Rneasy-Kit (Qiagen). Resumidamente, as células sedimentadas foram lavadas uma vez em PBS, sedimentadas e subsequentemente ressuspensas para lise em 500 pL de tampão RLT (+B-ME). As células foram completamente lisadas passando através de um Qiashredder (Qiagen) e, então, submetidas a um procedimento de purificação mediado pela matriz (ETOH, colunas de RNeasy) conforme
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 69/104
62/90 descrito no manual do fabricante. Depois da última etapa de lavagem, o RNA foi recuperado das colunas em 50 uL de água sem RNAse. A concentração do RNA recuperado foi determinada por quantificação de A260 e A280 de amostras diluídas a 1:20. A integridade (qualidade, grau de degradação) das amostras de RNA isoladas foi analisada pela eletroforese em gel de desnaturação do RNA em géis de Formamida-Agarose (consulte Maniatis Manual). As discretas faixas que representam os RNAs ribossomais 18s e 28s intactos foram obtidas e integras (e aproximadamente razões de intensidade 2:1) dessas faixas indicaram uma boa qualidade das preparações de RNA. Os RNAs isolados do hibridoma foram congelados e armazenados a -80QC em alíquotas.
Geração de Fragmentos de DNA que Codificam VH e VH por PCR RACE, Clonagem desses Fragmentos de DNA em Plasmídeos e Determinação de suas Sequências de DNA e Aminoácidos [00173] O cDNA para subsequentes reações de PCR (RACE-) foi preparado a partir de preparações de RNA, aplicando as tecnologias conforme descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2011/074273. Subsequentemente, os fragmentos de PCR que codificam VH e VL foram isolados por extração em gel de agarose e subsequente purificação por técnicas padrão de biologia molecular. Os fragmentos de PCR purificados que geraram PWO foram inseridos no vetor pCR bluntll topo aplicando o Kit pCR bluntll topo (Invitrogen) exatamente seguindo as instruções do fabricante. As reações de ligação de Topo foram transformadas em células competentes TopoW-one-shot de E.coli. Desde então, clones de E. coli que continham vetores tanto VL como VH contendo os insertos foram identificados como colônias nas placas de ágar LB-canamicina. Os plasmídeos foram preparados a partir dessas colônias e a presença do inserto desejado no vetor foi confirmada por digestão de restrição com EcoRI. Devido ao esqueleto do vetor
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 70/104
63/90 conter sítios de reconhecimento de restrição EcoRi que flanqueiam cada lado do inserto, insertos que ancoram plasmídeos foram definidos por terem insertos removíveis EcoRI de aproximadamente 800 bp (para VL) ou 600 bp (para VH). A sequência de DNA e a sequência proteica deduzida do VL e VH foram determinadas por sequenciamento de DNA automatizado em vários clones para VH e VL.
[00174] A sequência de VL murina do anticorpo anti-biotina é representada na SEQ ID NO: 08. A sequência de VH murina do anticorpo antibiotina é representada na SEQ ID NO: 04.
Exemplo 2
Humanização dos Domínios VH e VL do Anticorpo Anti-Biotina Murino [00175] O anticorpo de ligação à biotina murino muM33 foi humanizado da seguinte forma: A geração e caracterização de sequências codificadoras e sequências de aminoácidos que compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo anti-biotina murino da classe lgG1 com cadeia leve kappa de hibridoma de camundongo são descritas nos documentos WO 2011/003557 e WO 2011/003780. Com base nessa informação, um anticorpo anti-biotina humanizado correspondente foi gerado (huM33) com base na combinação de IGHV1-69-02 e IGKV1-27-01 da estrutura de linhagem germinativa humana. Para VL, não foi necessário integrar qualquer retromutação na estrutura do IGKV1-27-01 humano e do elemento J humano da linhagem germinativa IGKJ2-01. O VH humanizado é baseado na linhagem germinativa IGHV1-69-02 humana e o elemento J humano da linhagem germinativa IGHJ4-01-3. Foram introduzidas duas retromutações na região de estrutura 1 na posição 24 (A24S) e na região de estrutura 3 na posição 73 (K73T). A sequência de aminoácidos do VH humanizado é representada na SEQ ID NO: 12 e a sequência de aminoácidos do VL humanizado é representada na SEQ ID NO: 16.
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 71/104
64/90
Exemplo 3 Cristalização e Determinação da Estrutura de Raio-X da Região de Ligação da Região Fv Anti-Biotina Murina na Presença de Biotina [00176] Foi determinada a estrutura do anticorpo anti-biotina murino. Portanto, os fragmentos Fab foram gerados por digestão de protease das IgGs purificadas e subsequentemente purificado, aplicando os métodos bem conhecidos da técnica (digestão por papaína).
[00177] Para cristalização do fragmento Fab apo (Fabs purificados) em His-HCI 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0 foram concentrados a 13 mg/mL. As gotas de cristalização foram formadas a 21QC, misturando 0,2 pL de solução proteica com 0,2 pL de solução reservatório em experimentos de difusão de vapor em gota sentada. Cristais apareceram fora de Tris 0,1 M, pH 8,5, cloreto de cobalto 0,01 M, polivinilpirrolidona K15 20% dentro de 5 dias e cresceram a um tamanho final de 0,3 mm x 0,06 mm x 0,03 mm dentro de 8 dias.
[00178] Os cristais foram coletados com glicerol 15% como crioprotetor e, em seguida, rapidamente congelados em N2 líquido. Imagens de difração foram coletadas com um detector Pilatus 6M a uma temperatura de 100K na linha do feixe X10SA da fonte de luz suíça e processadas com os programas XDS (Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800) e dimensionadas de acordo com SCALA (obtido junto à BRUKER AXS), gerando dados para resolução de 2,22 Â. Esse cristal de fragmento Fab pertence ao grupo P21 de espaço monoclínico com dimensões celulares de a=90,23Â b=118,45Â c=96,79Â e β=117,53Q e contém quatro moléculas Fab por unidade assimétrica de cristalografia (consulte Tabela 2).
[00179] Programas cristalográficos padrão do conjunto de programa de computação CCP4 foram usados para solucionar a estrutura por substituição molecular com o PDB entrada 3PQP como modelo de busca, para
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 72/104
65/90 o cálculo da densidade de elétrons e para refinar a estrutura de raio X (Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D (1994) 760-763). Os modelos estruturais foram reconstruídos na densidade de elétron com o uso de COOT (Emsley, P., et a!., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501). As coordenadas foram refinadas com REFMAC5 (Murshudov, G.N., et a!., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255) e com autoBUSTER (Global Phasing Ltd.).
Tabela 2
Coleta de Dados e Estatísticas de Refinamento de Estrutura para
Fragmento muM33 Fab Apo-Cristal Monocíclico
Coleta de Dados
Comprimento de onda (Â) 1,0
Resolução1 (Â) 2,22 (2,34 a 2,22)
Reflexões únicas1 77716 (11301)
Integridade (%)1 98,0 (100)
Rmerge (%)1’2 6,4 (44,4)
<Ι/σ>1 8,3 (1,7)
Unidade Celular (Grupo espacial C2) a=90,23À b=118,45À c=96,73À e β=117,532
Refinamento
Resolução (Â) 2,2 (2,28 a 2,22)
R 1 ’3 r>cryst 20,66 (21,84))
R 1>4 rtfree 25,23 (26,47)
Número de Átomos em refinamento 13314
Desvios r.m.s. de comprimentos (À) / ângulos (2) de ligação ideais 0,01 /1,21
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 73/104
66/90
Coleta de Dados
Ângulos diédricos da cadeia principal (em %) Mais favorecido/ permitido/ generoso/ desaprovado 5 90,4/9,1 /0,3/0,2
1 Os valores entre parênteses referem-se às caixas de resolução mais altas.
2 Rmerge=s| l-<l> I /ΣΙ em que I é intensidade.
3 Rcryst=S I FO-<FC>I/EFO onde Fo é o observado e Fc é a amplitude do fator de estrutura calculada.
4 Rfree foi calculado com base em 5% do total de dados omitidos durante o refinamento.
5 Calculado com PROCHECK (Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. & Thornton, J.M. PROCHECK: um programa para verificar a qualidade estereoquímica da estrutura da proteína. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291 (1993)).
[00180] Para a cristalização do fragmento Fab no complexo com um Cristal apo derivado de biotina do fragmento Fab usado para experimentos de absorção foram derivados do ácido succínico 0,8 M em 3 dias após a triagem e crescimento até um tamanho final de 0,25 mm x 0,04 mm x 0,04 mm em 5 dias. A biocitinamida foi dissolvida a 100 nM em água. Subsequentemente, o composto foi diluído em 10 mM de concentração de trabalho na solução de cristalização e aplicado aos cristais em gotas de cristalização. Os cristais foram lavados três vezes com 2 pL de solução de composto 10 mM e foram finalmente incubados por 16 h com biocitinamida a 21QC.
[00181] Os cristais foram coletados com glicerol 15% como crioprotetor e, em seguida, rapidamente congelados em N2 líquido. Imagens de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 74/104
67/90 difração foram coletadas com um detector Pilatus 6M a uma temperatura de 100 K na linha do feixe X10SA da fonte de luz suíça e processadas com os programas XDS (Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800) e dimensionadas de acordo com SCALA (obtido junto à BRUKER AXS), gerando dados para resolução de 2,35 Â. Esse cristal de fragmento Fab pertence ao grupo P21 de espaço monoclínico com dimensões celulares de a=89,09Â b=119,62Â c=96,18Â e β=117,15Q e contém quatro moléculas Fab por unidade assimétrica de cristalografia (consulte Tabela 3).
[00182] Programas cristalográficos padrão do conjunto de programa de computação CCP4 foram usados para solucionar a estrutura por substituição molecular com as coordenadas do fragmento apo Fab como modelo de busca, para calcular a densidade de elétrons e para refinar a estrutura de raio X a uma resolução de 2,5Â (CCP4 (Collaborative Computational Project)). Os modelos estruturais foram reconstruídos na densidade de elétron com o uso de COOT (Emsley, P., et al., Acta Crystallogr. D Biot. Crystallogr. 60 (2010) 486-501). As coordenadas foram refinadas com REFMAC5 (Murshudov, G.N., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255) e com autoBUSTER (Global Phasing Ltd.).
Tabela 3
Coleta de Dados e Estatísticas de Refinamento de Estrutura para
Fragmento Fab muM33 de Complexo Cristalino de Biocitinamida
Coleta de Dados
Comprimento de onda (Â) 1,0
Resolução1 (Â) 2,35 (2,45 a 2,35)
Reflexões únicas1 74645 (8714)
Integridade (%)1 99,9 (99,9)
Rmerge (%) 6,30 (65,00)
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 75/104
68/90
Coleta de Dados
<Ι/σ>1 10,29 (1,18)
Unidade Celular (Grupo espacial C2) a=89,09Â b=119,62Â c=96,18Â e 3=117,152
Refinamento
Resolução (Â) 2,5 (2,565 a 2,500)
R 1’3 r>cryst 20,92 (36,86))
Refinamento
R 1’4 rífree 27,56 (47,5)
Número de Átomos em refinamento 13656
Desvios r.m.s. de comprimentos (À) / ângulos (Q) de ligação ideais 0,009/ 1,43
Ângulos diédricos da cadeia principal (em %) Mais favorecido/permitido/generoso/ desaprovado 5 87,5/12,0/0,2/0,3
1 Os valores entre parênteses referem-se às caixas de resolução mais altas.
2 Rmerge=£ I l-<l> I /ΣΙ em que I é intensidade.
3 RCryst=£ I FO-<FC>I/EFO onde Fo é o observado e Fc é a amplitude do fator de estrutura calculada.
4 Rfree foi calculado com base em 5% do total de dados omitidos durante o refinamento.
5 Calculado com PROCHECK (Laskowski, R.A., et al., J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283-291).
[00183] A forma cristalina do complexo continha quatro complexos
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 76/104
69/90
Fab biocitinamida:anti-biotina independentes na unidade assimétrica, com biocitinamida ligada de maneira similar por todas as moléculas Fab. A biocitidinamida está ligada em um bolso formado pelas CDRs 1 e 3 da cadeia pesada e todas as 3 CDRs das cadeias leves. O bolso de ligação do ligante é definido por resíduos ASN29, ASP31, THR32, PHE33, GLN35, TRP99 e TRP106 da cadeia pesada e ASN31, TYR32, LEU33, SER34, TYR49, SER50, PHE91 e TYR96 da cadeia leve. O grupo cabeça de biotina forma pontes de hidrogênio com resíduos de CDR2 e CDR1 em uma extremidade do bolso: N3 de biocitinamida está interagindo com a hidroxila-oxigênio de SRE50 considerando que 022 está em contato com o esqueleto de nitrogênio da amida do mesmo resíduo. Além disso, 022 de biocitinamida também ligada ao hidrogênio para o grupo oxigênio de hidroxila de Ser34. Além disso, interações hidrofóbicas são observadas entre biocitinamida e as cadeias laterais aromáticas que alinham o bolso de ligação. A ligação amida na extremidade da cauda alifática (CH2)4 de pilhas de biotina no PHE33 da CDR1 da cadeia pesada é estabilizada por uma ligação de hidrogênio adicional do nitrogênio no esqueleto de amida de PHE33 e para Asp31. Nessas posições, o nitrogênio da amida, que é o local de ligação à entidade ativa, os átomos que estão após o nitrogênio são apontando para longe do bolso de ligação em direção ao solvente.
[00184] Os resultados da determinação experimental da região de ligação a uma resolução de 2,5 Â permite a caracterização do modo de ligação do ligante ao seu anticorpo, que é um pré-requisito para modelagem detalhada e aprimoramento adicional através de elaboração genética de proteína de módulos de ligação de biotina recombinante.
Exemplo 4
Composição, Expressão e Purificação de Anticorpos Anti-Biotina Recombinantes
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 77/104
70/90 [00185] Regiões variáveis de anticorpos anti-biotina murinos e humanizados foram combinadas com regiões constantes de origem humana para formar anticorpos mono ou biespecíficos quiméricos ou humanizados.
[00186] A geração de anticorpos anti-biotina monoespecíficos humanizados e anticorpos anti-biotina biespecíficos humanizados que se ligam especificamente à biotina, bem como a um alvo não biotina diferente (por exemplo, receptor tirosina quinase ou IGF-1R) necessitou de (i) projeto e definição de sequências amino e de nucleotídeos para essas moléculas, (ii) expressão dessas moléculas em células de mamíferos cultivadas transfectadas, e (iii) purificação dessas moléculas a partir dos sobrenadantes de células transfectadas. Essas etapas foram realizadas conforme descrito anteriormente em PCT/EP2011/074273.
[00187] Em geral, para gerar um anticorpo humanizado da classe IgG que tem a especificidade de ligação (original) do anticorpo anti-biotina murino, a sequência de VH humanizada foi fusionada na estrutura à terminação N de CH1-dobradiça-CH2-CH3 de uma região Fc humana da subclasse lgG1. De maneira similar, a sequência de VL humanizada foi fusionada na estrutura à terminação N da região constante humana CLkappa.
[00188] Para gerar derivados de anticorpos biespecíficos que contenham a especificidade de ligação à biotina, bem como especificidades a outros alvos, o anticorpo anti-biotina, um fragmento scFv ou Fab foi fusionado na estrutura à terminação C da cadeia pesada de anticorpos anteriormente descritos. Em muitos casos, o scFv anti-hapteno aplicado foi ainda estabilizado por introdução de uma ponte bissulfeto VH44-VL100 que foi anteriormente descrito (por exemplo, Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 12391245).
Plasmídeos de Expressão [00189] Os plasmídeos de expressão compreendem cassetes de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 78/104
71/90 expressão para a expressão das cadeias pesada e leve foram montados separadamente em vetores de expressão de células de mamíferos.
[00190] Assim, os segmentos do gene que codificam os elementos individuais foram unidos conforme descrito acima.
[00191] Informações gerais em relação as sequências de nucleotídeos das cadeias leve e pesada humana a partir do qual o uso do códon pode ser deduzido é dada em: Kabat, E.A., etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication nQ 91-3242.
[00192] A unidade de transcrição da cadeia leve κ é composta dos seguintes elementos:
- o enhancer inicial imediato e o promotor do citomegalovírus humano (hCMV),
- uma 5’-UT sintética incluindo uma sequência de Kozak,
- uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina incluindo o íntron da sequência sinal,
- o cDNA da cadeia leve variável clonado organizado com um único sítio de restrição Bsml na extremidade 5’ e um sítio doador de junção e um único sítio de restrição Notl na extremidade 3’,
- a região constante do gene κ humano genômico, incluindo o enhancer de lg-κ de camundongo íntron 2 (Picard, D., e Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), e
- a sequência sinal de poliadenilação κ (“poli A”) de imunoglobulina humana.
[00193] A unidade de transcrição da cadeia pesada γΙ é composta dos seguintes elementos:
- o enhancer inicial imediato e o promotor do citomegalovírus humano (hCMV),
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 79/104
72/90
- uma 5’-UT sintética incluindo uma sequência de Kozak,
- uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina modificada incluindo o íntron da sequência sinal,
- o cDNA da cadeia pesada variável monoespecífico clonado ou o cDNA da cadeia pesada scFv variável de fusão biespecífico clonado organizado com um único sítio de restrição Bsml na 5’ e um sítio doador de junção e um único sítio de restrição Notl na extremidade 3’,
- a região constante do gene da cadeia pesada γΙ humana genômica, incluindo o enhancer μ de lg de camundongo (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), e
- a sequência sinal de poliadenilação (“poli A”) de imunoglobulina γΙ humana.
[00194] Ao lado do cassete de expressão da cadeia leve κ ou cadeia pesada γ1 esses plasmídeos contêm
- um gene de resistência à higromicina,
- uma origem de replicação, oriP, de vírus Epstein-Barr (EBV),
-uma origem da replicação do vetor pUC18 que permite replicação desse plasmídeo em E. coli, e
- um gene de B-lactamase que confere resistência à ampicilina em
E. coli.
TÉCNICAS DE DNA Recombinante [00195] A clonagem foi realizada com o uso de técnicas de clonagem padrão, conforme descrito em Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Todos os reagentes biológicos moleculares eram comercialmente disponíveis (se não indicado de outro modo) e foram usados de acordo com as instruções do fabricante.
[00196] O DNA que contém as sequências codificadoras,
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 80/104
73/90 mutações ou elementos genéticos adicionais foi sintetizado por Geneart AG, Regensburg.
[00197] As sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de fita dupla realizado em SequiServe (SequiServe GmbH, Alemanha).
Análise da Sequência de DNA e de Proteína e Gerenciamento de Dados da Sequência [00198] O conjunto Vector NTI Advance versão 9.0 foi usado para criação de sequência, mapeamento, análise, anotação e ilustração.
Expressão de Anticorpos Anti-Biotina e Derivados [00199] Os anticorpos anti-biotina foram expressos por transfecção temporária de células 293 de rim embrionário humano (HEK293) em suspensão. Para isso, as cadeias leve e pesada dos anticorpos monoespecíficos ou biespecíficos correspondentes foram construídas em vetores de expressão que carregam marcadores de seleção procariontes e eucariontes conforme descrito acima. Esses plasmídeos foram amplificados em E. coli, purificados e posteriormente aplicados para as transfecções transitórias. As técnicas de cultura celular padrão foram usadas para a manipulação das células conforme descrito em Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
[00200] As células foram cultivadas em meio de expressão apropriado a 37QC/8% de CO2. No dia da transfecção, as células foram semeadas em meio fresco a uma densidade de 1 a 2 χ 106 células viáveis/mL. Os complexos de DNA com reagentes de transfecção foram preparados em meio Opti-MEM I (Invitrogen, EUA) que compreende 250 pg de DNA de plasmídeo da cadeia pesada e leve em razão molar de 1:1 para um volume de transfecção final de 250 mL. O anticorpo monoespecífico ou biespecífico que
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 81/104
74/90 contém os sobrenadantes de cultura celular foram clarificados 7 dias depois da transfecção por centrifugação em 14.000 g por 30 minutos e filtração através de um filtro estéril (0,22 pm). Os sobrenadantes foram armazenados a -20QC até a purificação.
[00201] Para determinar a concentração dos anticorpos e os derivados nos sobrenadantes da cultura celular, foi aplicado a cromatografia HPLC de afinidade. Para isso, o sobrenadante de cultura celular contendo anticorpos monoespecíficos ou biespecíficos ou derivados dos mesmos que se ligam à proteína A foi aplicado a uma coluna Applied Biosystems Poros A/20 em uma solução que compreende KH2PO4, citrato de sódio 100 mM, pH 7,4. A eluição do material de cromatografia foi realizada por aplicação de uma solução que compreende NaCI 200 mM, ácido cítrico 100 mM, em pH 2,5. Foi usado um sistema de HPLC Ultimate 3000 (Dionex). A proteína diluída foi quantificada por absorbância UV e integração das áreas de pico. Um anticorpo lgG1 purificado serviu como um padrão.
Purificação de Anticorpos Anti-Biotina [00202] Sete dias após a transfecção os sobrenadantes de células HEK 293 foram coletados. Os anticorpos recombinantes contidos nesses foram purificados a partir do sobrenadante em duas etapas por cromatografia de afinidade com o uso de cromatografia de afinidade de proteína A Sefarose™ (GE Healthcare, Suécia) e cromatografia de exclusão por tamanho Superdex200. Resumidamente, o anticorpo contendo sobrenadantes de cultura celular clarificada foi aplicado em uma coluna MabSelectSuRe Protein A (5 a 50 mL) equilibrada com tampão PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCI 137 mM e KCI 2,7 mM, pH 7,4). As proteínas não ligadas foram lavadas com tampão de equilíbrio. Os anticorpos (ou derivados) foram eluídos com tampão citrato 50 mM, pH 3,2. As proteínas contendo frações foram neutralizadas com 0,1 mL de tampão Tris 2 M, pH 9,0. Em seguida, as frações de proteína eluída
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 82/104
75/90 foram agrupadas com um dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) e carregadas em uma coluna de filtração em gel Superdex200 HiLoad 26/60 (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com Histidina 20mM, NaCI 140 mM, em pH 6,0. A concentração de proteína de anticorpos e derivados purificados foi obtida por determinação da densidade óptica (OD) em 280 nm com a OD em 320 nm como a correção de fundo, com o uso de coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace etal., Protein Science A- (1995) 2411-2423. As frações de anticorpos monoméricos foram agrupadas, congeladas rapidamente e armazenadas a 80QC. Parte das amostras foi fornecida para subsequente análise e caracterização proteica.
[00203] A homogeneidade dos anticorpos foi confirmada por SDSPAGE na presença e ausência de um agente redutor (1,4-ditiotreitol 5 mM) e coloração com azul de Coomassie brilhante. O sistema de gel NuPAGE® PreCast (Invitrogen, EUA) foi usado de acordo com as instruções do fabricante (géis de Tris-Glicina 4 a 20%).
[00204] Sob condições redutoras, as cadeias polipeptídicas relacionadas à IgG mostradas no SDS-PAGE em tamanhos moleculares aparentes análogos aos pesos moleculares calculados. Os níveis de expressão de todos os constructos foram analisados por proteína A. O rendimento médio das proteínas foi entre 6 mg e 35 mg de proteína purificada por litro de sobrenadante de cultura celular nesses experimentos de expressão temporários não otimizados.
[00205] A Figura 1 mostra os resultados de expressão e purificação do anticorpo humanizado que se liga à biotina e derivados de biotina. O SDS PAGE redutor e não redutor mostra a composição e homogeneidade de anticorpos humanizados com e sem cisteína na posição 53 de acordo com Kabat depois da purificação com proteína A (MabSelect) e SEC.
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 83/104
76/90
O marcador de peso molecular está nas pistas não marcadas. Cadeias H do anticorpo (banda superior a 50 k) e cadeias L (banda inferior a 25 k) são detectáveis sob condições reduzidas como bandas exclusivas sem a presença de quantidades visíveis de contamínantes de proteínas adicionais.
Exemplo 5
Ligação do Anticorpo Anti-Biotina Humanizado Recombinante ao Composto Marcado com Biotina (Composto Biotinilado) [00206] As propriedades de ligação do anticorpo anti-biotina quimérico e humanizado recombinante e uma variante do mesmo, que tem uma cisteína na posição 53 na HVR-H2, de acordo com a numeração de Kabat, foram analisadas por tecnologia de interferometria de biocamada (BLI) com o uso de um instrumento Octet QK (Fortebio Inc.). Esse sistema é bem estabelecido para o estudo de interações moleculares. A tecnologia BLi é baseada na medição do padrão de interferência da luz branca refletida a partir da superfície de uma extremidade do biossensor e uma referência interna. A ligação de moléculas à extremidade do biossensor é resultante de uma mudança do padrão de interferência que pode ser medida. Para analisar se o procedimento de humanização descrito acima diminui a capacidade do anticorpo anti-biotina se ligar à biotina, as propriedades das versões quimérica e humanizada do anticorpo em sua capacidade de se ligar a uma proteína biotinilada foram comparadas diretamente. Estudos de ligação foram realizados por captura do anticorpo anti-biotina em um biossensor anti-hulgG Fc antibody Capture (AHC) (Fortebio Inc.). Em primeiro lugar, os biossensores foram incubados em uma solução de anticorpo com uma concentração de 0,5 mg/mL em histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0 por 1 min. Em seguida, os biossensores foram incubados por 1 min em 1x PBS pH 7,4 para alcançar um nível basal estável. A ligação foi medida por incubação do biossensor revestido de anticorpo em uma solução contendo proteína biotinilada com uma
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 84/104
77/90 concentração de 0,06 mg/mL em histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0 por 5 min. A dissociação foi monitorada por 5 min. em 1x PBS pH 7,4. As curvas de ligação resultantes para anticorpos anti-biotina quiméricos e humanizados foram comparadas diretamente.
[00207] A versão humanizada do anticorpo mostrou ligação igual ou até mesmo melhor do antígeno biotinilado do que o anticorpo quimérico. O mesmo é verdade para o anticorpo humanizado com a mutação Cys na posição Kabat VH53. A proteína biotinilada mostrou ligação residual inespecífica aos biossensores, que foi reduzida quando os biossensores foram revestidos com Herceptin, que não se liga à biotina. Dessa forma, a funcionalidade do anticorpo anti-biotina foi mantida em sua variante humanizada (que é definida pelas sequências conforme representado na SEQ ID NO: 12 e 16, SEQ ID NO: 20 e 24).
Ressonância Plasmónica de Superfície [00208] A medição de ressonância plasmónica de superfície foi realizada em um instrumento BIAcore® T200 (GE Healthcare Biosciences AB, Suécia) a 25QC. Cerca de 4300 unidades de ressonância (RU) do sistema de captura (10 pg/mL de captura anti-humano (IgG Fc) do kit de anticorpo de captura humano, BR-1008-39, GE Healthcare Biosciences AB, Suécia) foram acoplados em um chip CM3 (GE Healthcare, BR-1005-36) em pH 5,0 com o uso do kit de acoplamento de amina padrão fornecido pela GE Healthcare (BR1000-50). O tampão de corrida para acoplamento de amina foi HBS-N (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, GE Healthcare, BR-1006-70). O tampão de corrida e de diluição para o estudo de ligação a seguir foi PBS-T (solução salina tamponada com fosfato 10 mM incluindo Tween 20 0,05%) pH 7,4. O anticorpo anti-biotina humanizado foi capturado por injeção de solução 2 nM por 60 seg a uma taxa de fluxo de 5 pL/min. siRNA biotinilado foi diluído com PBS-T em concentrações de 0,14 a 100 nM (séries de diluição 1:3). A ligação
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 85/104
78/90 foi medida injetando-se cada concentração por 180 s a uma taxa de fluxo de 30 pL/min, tempo de dissociação 600 s. A superfície foi regenerada por 30 seg de lavagem com uma solução de MgCI2 3M a uma taxa de fluxo de 5 pL/min. Os dados foram avaliados com o uso de um software BIAevaluation (GE Healthcare Biosciences AB, Suécia). As diferenças do índice de refração de massa foram corrigidas pela subtração da resposta obtida a partir de uma superfície de anti-Fc IgG humano. Injeções em branco também foram subtraídas (= referência dupla). Para cálculo de KD e parâmetros cinéticos, foi usado o modelo de Langmuir 1:1.
[00209] A análise de ligação cinética por ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi realizada para anticorpo anti-biotina humanizado SEQ ID NO: 12 e 16 e anticorpo anti-biotina humanizado VH53C SEQ ID NO: 20 e 24. Anticorpos anti-biotina em uma concentração de 2 nM foram capturados pelo anticorpo anti-Fc IgG humano que estava ligado a um chip sensor CM3. A ligação de siRNA biotinilado (Mw: 13868 Da) foi registrada em concentrações de 0,41, 1,23, 3,7, 11,1, 33,3,100 e 300 nM. As medições foram realizadas em duplicata. O Kd calculado para anticorpo anti-biotina humanizado e anticorpo anti-biotina humanizado VH53C foram 0,633 nM e 0,654 nM, respectivamente.
Exemplo 6
Geração de Complexos Nâo Covalentes de Compostos Biotinilados com Anticorpos Anti-Biotina Método Geral [00210] A geração de complexos de anticorpos anti-biotina com compostos biotinilados (=biotina conjugada a uma carga útil) deve resultar em complexos definidos e deve garantir que o composto (=carga útil) nesses complexos mantenham sua atividade. Para a geração de complexos de compostos biotinilados com o anticorpo anti-biotina, o composto biotinilado foi dissolvido em H2O a uma concentração final de 1 mg/mL. O anticorpo foi
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 86/104
79/90 concentrado a uma concentração final de 1 mg/mL (4,85 μΜ) em tampão histidina 20mM, NaCI 140 mM, pH=6,0. A carga útil biotinilada e o anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2:1 (composto para anticorpo) por pipetagem para cima e para baixo e incubados por 15 minutos à RT.
[00211] De maneira alternativa, o composto biotinilado foi dissolvido em DMF 100% a uma concentração final de 10 mg/mL. O anticorpo foi concentrado a uma concentração final de 10 mg/mL em Tris-HCI 50 mM, EDTA 1 nM, pH=8,2. O composto biotinilado e o anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (composto para anticorpo) por pipetagem para cima e para baixo e incubados por 60 minutos à RT e 350 rpm.
Método Exemplar para a Formação de Complexos de Corantes Fluorescentes Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Complexo Anticorpo Anti-Biotina Biotina Cy5 / Quimérica (Subclasse IgG Humana) [00212] Para a geração de complexos de Cy5 derivada de biotina (Biotina-Cys-Cy5) contendo um ligante cisteinilado, 0,16 mg de Biotina-CysCy5 foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 1 mg do anticorpo foi usado em uma concentração de 10,1 mg/mL (cerca de 69 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Biotina-CysCy5 e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (Biotin-Cys-Cy5 para anticorpo) e incubados por 60 min à RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por SDS-PAGE conforme descrito no Exemplo 7. A detecção de fluorescência foi realizada conforme descrito no Exemplo 7.
Método Exemplar para a Formação de Complexos de Corantes Fluorescentes Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Biotina-Cys-Cy5 / Anticorpo Anti-Biotina Humanizado [00213] Para a geração de complexos de Cy5 derivada de biotina (Biotina-Cys-Cy5) contendo um ligante cisteinilado, 0,16 mg de Biotina-CysCy5 foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 1 mg
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 87/104
80/90 do anticorpo foi usado em uma concentração de 5,5 mg/mL (cerca de 38 pM) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Biotina-CysCy5 e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (Biotin-Cys-Cy5 para anticorpo) e incubados por 60 min à RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por SDS-PAGE conforme descrito no Exemplo 7. A detecção de fluorescência foi realizada conforme descrito no Exemplo 7.
Método Exemplar para a Formação de Complexos de Polipeptídeos Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Complexo Ac-PYY-PEG3-Cys-bAla-Biotina / Anticorpo Anti-Biotina Quimérico [00214] Para a geração de complexos não covalentes de polipeptídeo PYY biotinilado contendo um ligante cisteinilado, 0,19 mg de AcPYY-PEG3-Cys-B-Ala-Biotina foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. O anticorpo foi usado em uma concentração de 10,7 mg/mL (cerca de 73 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Ac-PYY-PEG3-Cys-B-Ala-Biotina e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (Ac-PYY-PEG3-Cys-B-Ala-Biotina para anticorpo) e incubados por 60 min à RT e 350 rpm. O complexo resultante foi definido como molécula monomérica similar à IgG através da ocorrência de um único pico em uma cromatografia de exclusão por tamanho (monômero 95%). O complexo resultante foi ainda analisado por SDS-PAGE e subsequente análise Western Blot. 10 pg do complexo foi misturado com tampão de amostra LDS 4x (Invitrogen) e incubado a 95QC por 5 min. A amostra foi aplicada a um gel poliacrilamida Bis-Tris 4 a 12% (NuPAGE, Invitrogen) que foi executado por 35 min a 200V e 120 mA. As moléculas que foram separadas no gel de poliacrilamida foram transferidas para uma membrana de PVDF (tamanho de poros de 0,2 pm, Invitrogen) por 40 min a 25V e 160 mA. A membrana foi bloqueada em leite desnatado 1% (p/v) em PBST 1x (PBS 1x + Tween 20 0,1%) por 1h à RT. A membrana foi lavada 3x por 5 min em PBST 1x e
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 88/104
81/90 subsequentemente incubada com um conjugado estreptavidina-POD (2.900 U/mL, Roche) que foi usado em uma diluição de 1:2000. A detecção de estreptavidina-POD ligada à biotina na membrana foi realizada com o uso de substrato Lumi-Light Western Blotting (Roche).
Método Exemplar para a Formação de Complexos de Polipeptídeos Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Complexo Ac-PYY-PEG3-CysPEG2-Biotina / Anticorpo Anti-Biotina Quimérico [00215] Para a geração de complexos não covalentes de polipeptídeo PYY biotinilado contendo um ligante cisteinilado, 0,16 mg de AcPYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotina foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. O anticorpo foi usado em uma concentração de 10,7 mg/mL (cerca de 73 pM) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotina e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotina para anticorpo) e incubados por 60 min à RT e 350 rpm. O complexo resultante foi definido como 63% de molécula similar à IgG monomérica e 37% de agregados solúveis diméricos através de cromatografia de exclusão por tamanho. O complexo resultante foi ainda analisado por SDS-PAGE e subsequente análise Western Blot. 10 pg do complexo foi misturado com tampão de amostra LDS 4x (Invitrogen) e incubado a 95QC por 5 min. A amostra foi aplicada a um gel poliacrilamida Bis-Tris 4 a 12% (NuPAGE, Invitrogen) que foi executado por 35 min a 200V e 120 mA. As moléculas que foram separadas no gel de poliacrilamida foram transferidas para uma membrana de PVDF (tamanho de poros de 0,2 pm, Invitrogen) por 40 min a 25V e 160 mA. A membrana foi bloqueada em leite desnatado 1 % (p/v) em PBST 1x (PBS 1x + Tween 20 0,1%) por 1h à RT. A membrana foi lavada 3x por 5 min em PBST 1x e subsequentemente incubada com um conjugado estreptavidina-POD (2.900 U/mL, Roche) que foi usado em uma diluição de 1:2000. A detecção de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 89/104
82/90 estreptavidina-POD ligada à biotina na membrana foi realizada com o uso de substrato Lumi-Light Western Blotting (Roche).
Geração de Conjugados Covalentes Definidos de Corantes Haptenilado e Polipeptídeos com um Anticorpo Anti-Hapteno VH53C na Ausência de
Agentes Redox [00216] Para a geração de anticorpo anti-biotina covalente/polipeptídeo biotinilado ou conjugados ligados a corante bissulfeto biotinilado é necessário (i) acoplar a biotina através de um grupo reativo adequado (como, por exemplo, cisteína, maleimida) que contêm ligantes para o polipeptídeo ou corante que permite que o polipeptídeo seja exposto acima da superfície do anticorpo e, então, mantenha sua atividade, e (ii) gerar conjugados específicos para sítios covalentes dos polipeptídeos biotinilados com o anticorpo anti-biotina com uma mutação em cisteína (= anticorpo VH52bC/VH53C) em que a atividade biológica do polipeptídeo é mantida, e (iii) efetuar a reação na ausência de um agente de redução, a fim de evitar a redução das pontes bissulfeto intercadeias do anticorpo.
Método Geral [00217] A geração de conjugados de anticorpos anti-biotina com compostos biotinilados deve resultar em conjugados com estequiometria definida e deve garantir que o composto nesses conjugados mantenha sua atividade. Para a geração de conjugados de compostos biotinilados com o anticorpo anti-biotina, o composto biotinilado foi dissolvido em DMF 100% a uma concentração final de 10 mg/mL. O anticorpo anti-biotina VH52bC/VH53C foi concentrado a uma concentração de 10 mg/mL em Tris-HCI 50 mM, EDTA 1 nM, pH=8,2. O composto biotinilado e o anticorpo anti-biotina VH52bC/VH53C foram misturados em uma razão molar de 2,5:1 (composto para anticorpo) por pipetagem e incubados por 60 minutos à RT e 350 rpm.
[00218] Um polipeptídeo conjugado à biotina através de uma
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 90/104
83/90 cisteína contendo ligante é denominado biotina-Cys-polipeptídeo ou polipeptídeo-Cys-biotina, a seguir. O polipeptídeo pode ter tanto uma terminação N livre como uma terminação coberta, por exemplo, com grupo acetila (Ac-polipeptídeo-Cys-biotina) ou um resíduo PEG (PEG-polipeptídeoCys-biotina).
[00219] Um corante fluorescente conjugado à biotina através de uma cisteína contendo ligante é denominado corante-Cys-biotina ou biotinaCys-corante, a seguir.
Método Exemplar para a Formação de Conjugados de Corantes Fluorescentes Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Biotina-Ser-Cy5 / Anticorpo Anti-Biotina Humanizado [00220] Para a geração de complexos de Cy5 derivada de biotina (Biotina-Ser-Cy5) contendo um resíduo serina no ligante, 0,61 mg de Biotin-Ser -Cy5 foram dissolvidos em histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0, a uma concentração de 10 mg/mL. 18,5 mg do anticorpo anti-biotina humanizado foi usado em uma concentração de 10 mg/mL (cerca de 69 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Biotina-Ser-Cy5 e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (Biotin-Ser-Cy5 para anticorpo) e incubados por 60 min à RT, agitados a 350 rpm. A amostra foi então submetida à cromatografia de exclusão por tamanho com o uso de coluna de grau prep de carga alta Superdex 200 16/60 (GE Healthcare) com uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min e histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0 como fase móvel. As frações de pico foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE quanro à pureza. A razão de corante para anticorpos foi calculada por (1) medição da absorbância das amostras no comprimento de onda 280 nm (proteína) e 650 nm (Cy5); (2) com o uso da fórmula: A6so de proteína marcada/£(Cy5)*concentração de proteína (M) = moles de corante por mol de proteína, onde s(Cy5) = 250000 M'1cm'1, A65o do complexo = 47,0 e a concentração de proteína é 86,67 μΜ. A razão
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 91/104
84/90 resultante de corante para a molécula de anticorpo foi 2,17, sugerindo que todos os parátopos de anticorpo estão saturados com moléculas de Biotina-Cy 5.
Método Exemplar para a Formação de Conjugados de Corantes Fluorescentes Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Biotina-CysCy5/Anticorpo Anti-Biotina Quimérico VH53C [00221] Para a geração de conjugados de Cy5 derivados de biotina contendo um ligante cisteinilado, 0,16 mg de Biotina-Cys-Cy5 foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 1 mg do anticorpo anti-biotina VH53C foi usado em uma concentração de 9,7 mg/mL (cerca de 68 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Biotina-Cys-Cy5 e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (Ac-Biotin-Cys-Cy5 para anticorpo) e incubados por 60 min a RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por SDS-PAGE conforme descrito no Exemplo 7. A detecção de fluorescência foi realizada conforme descrito no Exemplo 7.
Método Exemplar para a Formação de Conjugados de Corantes Fluorescentes Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina-Biotina-CysCy5/Anticorpo Anti-Biotina Humanizado VH53C [00222] Para a geração de conjugados de Cy5 derivados de biotina contendo um ligante cisteinilado, 0,16 mg de Biotina-Cys-Cy5 foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 1 mg do anticorpo anti-biotina humanizado VH53C foi usado em uma concentração de 7,4 mg/mL (cerca de 51 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Biotina-Cys-Cy5 e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (Ac-Biotin-Cys-Cy5 para anticorpo) e incubados por 60 min a RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por SDSPAGE conforme descrito no Exemplo 7. A detecção de fluorescência foi
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 92/104
85/90 realizada conforme descrito no Exemplo 7.
Método Exemplar para a Formação de Conjugados de Polipeptídeos Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Ac-PYY(PEG3-Cys-bAlaBiotinaVAnticorpo Anti-Biotina Quimérico VH53C [00223] Para a geração de conjugados de polipeptídeo PYY derivados de biotina contendo um ligante cisteinilado, 0,19 mg de AcPYY(PEG3-Cys-BAIa-Biotina) foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 1 mg do anticorpo anti-biotina quimérico VH53C foi usado em uma concentração de 9,7 mg/mL (cerca de 67 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Ac-PYY(PEG3-Cys-BAIaBiotina) e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (AcPYY(PEG3-Cys-BAIa-Biotina) para anticorpo) e incubados por 60 min à RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por espectrometria de massa. 87,7 % das espécies detectadas foi identificada como anticorpo acoplado a 2 moléculas peptídicas, 12,3 % foi identificada como anticorpo acoplado a 1 molécula peptídica.
Método Exemplar para a Formação de Conjugados de Polipeptídeos Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2BiotinaVAnticorpo Anti-Biotina Quimérico VH53C [00224] Para a geração de conjugados de polipeptídeo PYY derivados de biotina contendo um ligante cisteinilado, 0,16 mg de AcPYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotina) foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 1 mg do anticorpo anti-biotina quimérico VH53C foi usado em uma concentração de 9,9 mg/mL (cerca de 68 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2Biotina) e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 AcPYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotina) para anticorpo) e incubados por 60 min à RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por espectrometria de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 93/104
86/90 massa. 100% das espécies detectadas foi identificado como anticorpo acoplado a 2 moléculas peptídicas.
Método Exemplar para a Formação de Conjugados de Polipeptídeos Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina-Ac-PYY(PEG3-Cys-bAlaBiotinaVAnticorpo Anti-Biotina Humanizado VH53C [00225] Para a geração de conjugados de polipeptídeo PYY derivados de biotina contendo um ligante cisteinilado, 0,06 mg de AcPYY(PEG3-Cys-BAIa-Biotina) foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 0,8 mg do anticorpo anti-biotina humanizado VH53C foi usado em uma concentração de 9 mg/mL (cerca de 62 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Ac-PYY(PEG3-CysBAIa-Biotina) e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 (AcPYY(PEG3-Cys-BAIa-Biotina) para anticorpo) e incubados por 60 min à RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por espectrometria de massa. 62,2 % das espécies detectadas foi identificada como anticorpo acoplado a 2 moléculas peptídicas, 33,9 % foi identificada como anticorpo acoplado a 1 molécula peptídica e 3,9% foi identificada como anticorpo desacoplado.
Método Exemplar para a Formação de Conjugados de Polipeptídeos Biotinilados e Anticorpos Anti-Biotina-Ac-PYY(PEG3-Cys-PEGBiotinaVAnticorpo Anti-Biotina Humanizado VH53C [00226] Para a geração de conjugados de polipeptídeo PYY derivados de biotina contendo um ligante cisteinilado, 0,08 mg de AcPYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotina) foram dissolvidos em DMF 100% a uma concentração de 10 mg/mL. 0,8 mg do anticorpo anti-biotina humanizado VH53C foi usado em uma concentração de 9 mg/mL (cerca de 62 μΜ) em um tampão composto de Tris-HCI 50 mM, EDTA 1mM, pH 8,2. Ac-PYY(PEG3-CysPEG2-Biotina) e anticorpo foram misturados a uma razão molar de 2,5:1 Ac
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 94/104
87/90
PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotina) para anticorpo) e incubados por 60 min à RT, agitados a 350 rpm. O conjugado resultante foi analisado por espectrometria de massa. 71,4 % das espécies detectadas foi identificada como anticorpo acoplado a 2 moléculas peptídicas, 26 % foi identificada como anticorpo acoplado a 1 molécula peptídica e 2,5% foi identificada como anticorpo desacoplado.
Exemplo 7
Métodos de Detecção
Eletroforese em Gel de SDS [00227] Para eletroforese em gel de SDS, 4x tampão de amostra LDS (Invitrogen) foi adicionado às amostras. Para cada amostra também uma versão reduzida foi preparada por adição de agente redutor de amostra NuPAGE 10x (Invitrogen). Todas as amostras foram incubadas a 70QC por 5 min antes da eletroforese em um gel de poliacrilamida Bis-Tris 4 a 12 % (NuPAGE, Invitrogen) com tampão MOPS 1x (Invitrogen).
Detecção de Fluorescência [00228] A fluorescência relacionada a Cy5 no gel foi detectada com um dispositivo Lumilmager F1 (Roche) em um comprimento de onda de excitação de 645 nm. Após a detecção da fluorescência, o gel foi corado com SimplyBlue SafeStain (Invitrogen).
Exemplo 8
Estabilidade no Soro [00229] Estabilidade no soro de complexos de Cy5 biotinilada com anticorpo anti-biotina humanizado em comparação a conjugados covalentes de Cy5 biotinilada com anticorpo anti-biotina humanizado VH53C.
[00230] O objetivo da tecnologia de modificação de peptídeo descrita é melhorar a aplicabilidade terapêutica dos peptídeos. Os principais pontos de estrangulamento para a aplicação terapêutica de peptídeos são
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 95/104
88/90 atualmente a estabilidade limitada in vivo e/ou meia vida curta no soro e rápida depuração. Os parâmetros de PK de conjugados de anticorpos de fluoróforos foram determinados in vivo e comparados com a PK de complexos anticorpofluoróforo não covalentes. Portanto, (i) o anticorpo anti-biotina VH53C foi conjugado covalentemente ao fluoróforo biotinilado Biot-Cys-Cy5, (ii) foi gerado um complexo não covalente do anticorpo anti-biotina com fluoróforo biotinilado Biot-Cy5, (iii) os compostos complexados conjugados covalentemente e não covalentemente foram aplicados a animais e (iv) as concentrações séricas dos compostos ao longo do tempo nesses animais foram analisadas.
Procedimentos Experimentais [00231] Para analisar a influência nos parâmetros PK de complexação de anticorpo de um pequeno substrato fluorescente, 13 nmol de conjugado ligado a bissulfeto de Cy5-biotina/anticorpo anti-biotina humanizado, ou do composto complexado não covalentemente do anticorpo correspondente em histidina 20 mM/NaCI 140 mM, pH 6,0 foram aplicados a seis camundongos fêmeas (linhagem NRMI) para cada substância. Cerca de 0,1 mL de amostras de sangue são coletadas depois dos seguintes pontos no tempo: 0,08 h, 8 h e 48 h para camundongo 1 e 2 e 0,08 h, 24 h e 48 h para camundongo 3 e 4 e 0,08 h, 36 h e 48h para camundongo 5 e 6. As amostras séricas de pelo menos 40 pL são obtidas depois de 1 h à RT por centrifugação (9.300 x g, 3 min, 4QC). As amostras séricas são armazenadas a -80QC.
[00232] Para determinar a quantidade de composto no soro em dados pontos no tempo, as propriedades fluorescentes de Cy5 são usadas: Cy5 relacionado à fluorescência nas amostras de soro são medidas em cadinhos de quartzo de 120 pL à temperatura ambiente com o uso de um Espectrofotômetro de Fluorescência Cary Eclipse (Varian). O comprimento de onda de excitação é 649 nm, a emissão é medida a 670 nm. As amostras de soro são diluídas em 1 x PBS para atingir uma variação adequada de
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 96/104
89/90 intensidade de Emissão. O soro sanguíneo de um camundongo não tratado na mesma diluição em PBS 1x como a respectiva amostra é usado como uma sonda vazia.
[00233] Embora a invenção acima mencionada tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitação ao escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas no presente pedido são expressamente incorporadas em sua totalidade como referência.
Exemplo 9
Determinação de Estrutura de Raio X de Fragmentos Fab de Anticorpo Anti-Biotina Murino no Complexo com Biocitinamida [00234] A estrutura da proteína de fragmento Fab de anticorpo anti-biotina murino foi determinada no complexo com biocitinamida. Portanto, cristais do fragmento Fab foram cultivados em ácido succínico 0,8 M, seguido por carregamento dos cristais de anticorpo com Biocitidinamida (diluído para concentração de trabalho de 10 mM em solução de cristalização, aplicada aos cristais em gotas de cristalização). Os cristais foram lavados três vezes com 2 pl_ de solução de biocitidinamida 10 mM e foram finalmente incubados por 16 horas com Biocitidinamida a 21QC, coletados com glicerol 15% como crioprotetor e rapidamente congelados em nitrogênio líquido. As imagens de difração processadas produziram uma estrutura de proteína em resolução de 2,5 Â. A estrutura e a composição da carga da região variável ligada à biotina é mostrada na Figura 2: A biotina se liga em uma superfície de bolso que é flanqueada por regiões carregadas que compõem os aminoácidos das regiões CDR. O hapteno complexado está posicionado em estreita proximidade a um agrupamento de aminoácidos carregado negativamente. A biotina que, como hapteno, é derivada por acoplamento em seu grupo carboxila, se liga com boa
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 97/104
90/90 eficácia como se não houvesse repulsão de carga nessa posição (devido à falta do grupo COOH). Por outro lado, a biotina livre (normal) não pode se ligar de maneira eficiente ao anticorpo porque seu grupo carboxila estaria em estreita proximidade com este agrupamento carregado negativamente e, portanto, seria repelida.

Claims (15)

1. ANTICORPO anti-biotina humanizado, caracterizado pelo fato do anticorpo compreender:
(a) um resíduo da região hipervariável (HVR)-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) um HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, e (c) um HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do anticorpo compreender:
(a) um HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 09, (b) um HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e (c) um HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
3. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato do anticorpo compreender:
(a) um HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13;
(b) um HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e (c) um HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
4. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender na posição 24 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoâcido
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 99/104
2/3 serina e/ou compreender na posição 73 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido treonina.
5. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender na posição 60 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido alanina e na posição 61 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, o resíduo de aminoácido glutamina.
6. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender:
(a) uma sequência de estrutura de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12;
(b) uma sequência de estrutura de domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; ou (c) uma sequência de VH como em (a) e uma sequência de VL como em (b) em que o resíduo de aminoácido na posição 24 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, é serina e/ou o resíduo de aminoácido na posição 73 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, é treonina.
7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de VH da SEQ ID NO: 12.
8. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 4 ou 7, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de VL da SEQ ID NO: 16.
9. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de compreender uma
Petição 870160031923, de 28/06/2016, pág. 100/104
3/3 sequência de VH da SEQ ID NO: 12 e uma sequência de VL da SEQ ID NO:
16.
10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo lgG1 inteiro ou um anticorpo lgG4 inteiro.
11. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a
10, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo monoclonal.
12. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a
11, caracterizado pelo fato de ser um fragmento de anticorpo que se liga à biotina.
13. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a
12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
14. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
15. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento.
BR112014030844A 2012-07-04 2013-07-04 anticorpo anti-biotina humanizado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo BR112014030844A2 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12174957 2012-07-04
PCT/EP2013/064099 WO2014006123A1 (en) 2012-07-04 2013-07-04 Anti-biotin antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112014030844A2 true BR112014030844A2 (pt) 2019-10-15

Family

ID=48771418

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112014030844A BR112014030844A2 (pt) 2012-07-04 2013-07-04 anticorpo anti-biotina humanizado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9765153B2 (pt)
EP (2) EP3339328A1 (pt)
JP (2) JP6247287B2 (pt)
KR (1) KR20150030755A (pt)
CN (1) CN104411725B (pt)
BR (1) BR112014030844A2 (pt)
CA (1) CA2872192A1 (pt)
HK (1) HK1208235A1 (pt)
MX (1) MX354303B (pt)
RU (2) RU2630296C2 (pt)
WO (1) WO2014006123A1 (pt)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107973856B (zh) 2012-07-04 2021-11-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 共价连接的抗原-抗体缀合物
HUE029435T2 (en) 2012-07-04 2017-02-28 Hoffmann La Roche Anti-theophylline antibodies and methods of their application
CA2930046A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
MX2016008189A (es) 2014-01-03 2016-09-29 Hoffmann La Roche Conjugados helicoidales-anticuerpo anti-helicoidal unidos covalentemente y usos de los mismos.
PL3089996T3 (pl) 2014-01-03 2021-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste przeciwciała przeciw haptenowi/przeciw receptorowi występującemu w barierze krew-mózg, ich kompleksy i ich zastosowanie jako przenośniki wahadłowe występujące w barierze krew-mózg
WO2015197736A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-brdu antibodies and methods of use
WO2016127149A2 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 Cell Idx, Inc. Antigen-coupled immunoreagents
US11041850B2 (en) 2015-07-07 2021-06-22 The Regents Of The University Of California Method for detecting protein-specific glycosylation
CN110088129A (zh) * 2016-12-27 2019-08-02 豪夫迈·罗氏有限公司 新的生物素特异性单克隆抗体及其用途
KR102448439B1 (ko) * 2016-12-27 2022-09-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 신규한 비오틴-특이적 단일클론 항체 및 그 용도
BR112019010915A2 (pt) * 2016-12-27 2019-10-01 Hoffmann La Roche anticorpo monoclonal, métodos para medir um analito em uma amostra e para produzir um anticorpo, uso de um anticorpo, kit de teste de imunoensaio e imunógeno
CN107085111B (zh) * 2017-04-14 2019-02-01 江苏福隆生物技术有限公司 乙型肝炎病毒前s1抗原的板式化学发光法检测试剂盒及制备方法
CN111171154B (zh) 2020-02-25 2021-05-11 杭州百凌生物科技有限公司 一种抗生物素抗体及其应用
WO2024061058A1 (zh) * 2022-09-20 2024-03-28 重庆艾生斯生物工程有限公司 一种抗生物素抗体或其功能性片段及其应用

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4533493A (en) 1981-08-27 1985-08-06 Miles Laboratories, Inc. Theophylline immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4524025A (en) 1982-06-30 1985-06-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to theophylline
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4855226A (en) 1985-06-07 1989-08-08 Beckman Instruments, Inc. Novel competitive assay for theophylline and reagent for use therein
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US6881536B1 (en) 1986-04-30 2005-04-19 Bioveris Corporation Particle based electrochemiluminescent assays
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8706503D0 (en) 1987-03-19 1987-04-23 British Petroleum Co Plc Aromatic hydrocarbons
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
DE3836656A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
WO1991006305A1 (en) 1989-11-07 1991-05-16 Bristol-Myers Squibb Company Oligomeric immunoglobulins
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR930702029A (ko) 1990-08-31 1993-09-08 스티븐 체스노프 동종접합된 면역 글로불린
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
NZ258392A (en) 1992-11-13 1997-09-22 Idec Pharma Corp Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
WO1996003423A1 (de) 1994-07-25 1996-02-08 Boehringer Mannheim Gmbh Hapten-markierte peptide
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
AU730388B2 (en) * 1996-01-11 2001-03-08 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Antibodies with reduced net positive charge
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6350860B1 (en) 1997-08-18 2002-02-26 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
AU3370000A (en) * 1999-02-22 2000-09-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biotinylated-chemokine antibody complexes
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
GB9926529D0 (en) 1999-11-09 2000-01-12 Ks Biomedix Ltd Targeting agents
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
ATE344801T1 (de) 1999-12-29 2006-11-15 Immunogen Inc Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1560596A1 (en) 2002-11-15 2005-08-10 Immunomedics, Inc. Use of multi-specific, non-covalent complexes for targeted delivery of therapeutics
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004065569A2 (en) 2003-01-23 2004-08-05 The Regents Of The University Of California Multi-functional antibodies
US20050026263A1 (en) 2003-07-31 2005-02-03 The Regents Of The University Of California Multi-functional antibodies
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
WO2004097372A2 (en) 2003-04-28 2004-11-11 The Regents Of The University Of California Element-coded affinity tags
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
SI1725249T1 (sl) 2003-11-06 2014-04-30 Seattle Genetics, Inc. Spojine monometilvalina, sposobne konjugacije na ligande
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
AU2005230848B9 (en) 2004-03-31 2011-06-02 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ATE549350T1 (de) 2005-12-07 2012-03-15 Hoffmann La Roche Neuropeptid-2-rezeptor-agonisten
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
WO2007131242A2 (en) 2006-05-05 2007-11-15 The Regents Of The University Of California Streptavidin-biotin-link antibody-hapten system
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US10118970B2 (en) 2006-08-30 2018-11-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
SI2087002T1 (sl) 2006-10-27 2014-11-28 Lpath, Inc. Sestavki in postopki za vezavo sfingozin-1-fosfata
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CA2695969A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Yeda Research & Development Co. Ltd. Regulators of mmp-9 and uses therof
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
DE102008048796A1 (de) 2008-09-24 2010-03-25 Emitec Gesellschaft Für Emissionstechnologie Mbh Abgasreinigungssystem für Dieselmotoren
WO2010045388A2 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Dyax Corp. Use of mmp-9 and mmp-12 binding proteins for the treatment and prevention of systemic sclerosis
WO2010056893A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-20 Imclone Llc Humanization and affinity-optimization of antibodies
US7816856B2 (en) 2009-02-25 2010-10-19 Global Oled Technology Llc Flexible oled display with chiplets
MX2011010159A (es) 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
JP5812418B2 (ja) 2009-04-17 2015-11-11 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
EP2435473B1 (en) 2009-05-27 2013-10-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
US9050375B2 (en) * 2009-07-06 2015-06-09 Hoffmann-La Roche, Inc. Bi-specific digoxigenin binding antibodies
US8936792B2 (en) 2009-09-11 2015-01-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin a with reduced immunogenicity
CN103282054A (zh) 2011-01-03 2013-09-04 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗dig抗体和与肽缀合的地高辛配基的复合物的药物组合物
CN104379604A (zh) 2012-05-24 2015-02-25 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 多特异性抗体
HUE029435T2 (en) 2012-07-04 2017-02-28 Hoffmann La Roche Anti-theophylline antibodies and methods of their application
CN107973856B (zh) 2012-07-04 2021-11-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 共价连接的抗原-抗体缀合物
MX2016008189A (es) 2014-01-03 2016-09-29 Hoffmann La Roche Conjugados helicoidales-anticuerpo anti-helicoidal unidos covalentemente y usos de los mismos.
CA2930046A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
CN104411725B (zh) 2018-09-28
JP6247287B2 (ja) 2017-12-13
US9765153B2 (en) 2017-09-19
KR20150030755A (ko) 2015-03-20
CA2872192A1 (en) 2014-01-09
HK1208235A1 (en) 2016-02-26
RU2017128882A (ru) 2019-03-01
RU2630296C2 (ru) 2017-09-06
RU2015102069A (ru) 2016-08-20
US20150232577A1 (en) 2015-08-20
WO2014006123A1 (en) 2014-01-09
EP2870180A1 (en) 2015-05-13
MX354303B (es) 2018-02-23
JP2015527984A (ja) 2015-09-24
MX2014014376A (es) 2015-02-05
EP3339328A1 (en) 2018-06-27
CN104411725A (zh) 2015-03-11
JP6470384B2 (ja) 2019-02-13
JP2018090567A (ja) 2018-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12023378B2 (en) Covalently linked antigen-antibody conjugates
JP6470384B2 (ja) 抗ビオチン抗体および使用方法
EP3089759B1 (en) Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
US20240043564A1 (en) Anti-brdu antibodies and methods of use
US9925272B2 (en) Anti-theophylline antibodies and methods of use
LGGLLGGGGGG kk da kkS kkkk da 3) DEMANDE DE BREVET CANADIEN

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06I Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA.

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NAO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NAO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUAANCIA PRA VIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVAA AO DOS TERMOS DO PARECER NAO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NAO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDAANCIAS CABA-VEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B11B Dismissal acc. art. 36, par 1 of ipl - no reply within 90 days to fullfil the necessary requirements
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]