KR20140090273A

KR20140090273A - Ｄｋｋ-１ 항체

Info

Publication number: KR20140090273A
Application number: KR1020147018130A
Authority: KR
Inventors: 마르시오 체디드; 리안 제임스 달링; 레이첼 쟈넷 갈빈; 바바라 앤 스완슨
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2014-07-16
Also published as: HRP20211343T1; PT2930184T; JP5759977B2; CY1119399T1; TWI546079B; CN102388065B; HUE055376T2; DK3514173T3; PT2417158T; NZ595011A; EP2930184A1; US8148498B2; ME02798B; SI2417158T1; SI3514173T1; US20100260754A1; EP2930184B1; RS56505B1; EP3514173B1; ME03378B

Abstract

본 발명은 인간 DKK-1에 결합하여 그 활성을 억제하고 발병기전이 DKK-1에 의해 매개되는 질병의 치료에 효과적인 인간 조작 항체, 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

Description

ＤＫＫ-１ 항체{DKK-1 ANTIBODIES}

본 발명은 DKK-1에 대한 인간 조작 (human engineered) 항체 및 발병기전이 DKK-1에 의해 매개되는 질병의 치료에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.

Dickkopf-1 (Dkk-1)은 정형적인 (canonical) Wnt-신호 전달 경로의 음성 조절인자인 것으로 밝혀진 단백질의 dickkopf 패밀리의 멤버이다. 경로는 골 발달 및 형성에서 중심 역할을 한다. Dkk-1은 Wnt 보조수용체 (co-receptor) LRP5 또는 LRP6 및 크레멘 (kremen) 단백질과의 그의 상호작용을 통해 Wnt 신호 전달을 억제한다. Dkk-1은 Wnt 경로의 멤버가 LRP5 또는 LRP6과 상호작용하는 것을 방지하여 Wnt-매개 신호 전달을 억제한다. 또한, DKK1은 다발성 골수종, 유방 암종, 신장 암종 및 비-소세포 폐암을 포함하는 골 전이성 암에 관련되는 것으로 밝혀졌다.

Dkk-1에 결합하는 항체가 문헌 (예를 들어, WO2006015373 참조)에 기재되어 있지만, Dkk-1과 LRP5 및 LRP6의 상호작용을 억제할 인간 조작된 DKK-1 치료 항체에 대한 필요성이 계속 존재하고 있다. 또한, 골 형성의 제어에서 Dkk-1이 관련된다는 측면에서, 골 치유에 사용하기 위한 인간 조작된 항-Dkk-1 치료 항체에 대한 필요성이 존재한다. 또한, 암에 Dkk-1이 관련된다는 사실을 감안할 때, 다발성 골수종, 유방 및 비-소세포 폐암을 포함하여 암을 치료하기 위한 인간 조작된 항-Dkk-1 항체에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명의 항체는 많은 바람직한 특성을 갖는 치료상 유용한 DKK-1 길항제이다. 본 발명의 인간 조작 항체는 인간 DKK-1, 시노몰구스 DKK-1, 래트 DKK-1, 마우스 DKK-1, 및 토끼 DKK-1에 대한 높은 친화도 (Kd)를 보인다. 본 발명의 항체는 골모세포 활성의 마커인 알칼리성 포스파타제의 DKK-1-매개된 억제를 차단한다. 또한, 본 발명의 항체는 피질 결손 생체내 모델에서 전방 및 후방 피질 모두에서 골 질량 밀도의 증가를 보이고, 생체 내에서 비-소세포 폐 이종이식편의 유의한 성장 억제를 보인다.

본 발명은 37℃에서의 Kd가 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 5.0 X 10^-11 M 미만인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 LCDR1이 서열 5의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 47의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 49의 아미노산 서열을 갖고, HCDR1이 서열 1의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2가 서열 2의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3이 서열 44의 아미노산 서열을 갖는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여를 포함하는 골 치유 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여를 포함하는, 다발성 골수종, 유방암 및 비-소세포 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29)에 대해 1.5 X 10^-11 M 미만의 Kd를 갖는 본원에서 설명되는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29)에 대해 1.0 X 10^-11 M 미만의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 추가로 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29)에 대해 5.0 X 10^-12 M 미만의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29)에 대해 0.5 X 10^-12 M 내지 1.5 X 10^-11 M의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 추가로 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29)에 대해 1.0 X 10^-12 M 내지 1.0 X 10^-11 M의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. Kd 값은 실시예 2에서 설명되는 바와 같이 37℃에서의 결합 평형에 의해 확립된다.

또한, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 5.0 X 10^-11 M 미만의 Kd를 갖는 본원에서 설명되는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 3.0 X 10^-11 M 미만의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 추가로 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29), 래트 Dkk-1 (서열 31), 및 마우스 DKK-1 (서열 33)에 대해 2.0 X 10^-11 M 미만의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 1.0 X 10^-11 M 내지 5.0 X 10^-11 M의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 추가로 바람직하게는, 본 발명은 인간 DKK-1 (서열 29), 래트 Dkk-1 (서열 31), 및 마우스 DKK-1 (서열 33)에 대해 1.5 X 10^-11 M 내지 3.0 X 10^-11 M의 Kd를 갖는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. Kd 값은 실시예 2에서 설명되는 바와 같이 37℃에서의 결합 평형에 의해 확립된다.

보다 바람직하게는, 본 발명은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 Kd는 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 3.0 X 10^-11 M 미만이다. 추가로 바람직하게는, 본 발명은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 Kd는 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 2.5 X 10^-11 M 미만이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 Kd는 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 2.0 X 10^-11 M 미만이다. 추가로 바람직하게는, 본 발명은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 Kd는 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 0.5 X 10^-12 M 내지 3.0 X 10^-11 M이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 Kd는 인간 DKK-1 (서열 29), 시노몰구스 DKK-1 (서열 30), 래트 Dkk-1 (서열 31), 마우스 DKK-1 (서열 33), 및 토끼 DKK-1 (서열 32)에 대해 1.0 X 10^-12 M 내지 2.5 X 10^-11 M이다. Kd 값은 실시예 2에서 설명되는 바와 같이 37℃에서의 결합 평형에 의해 확립된다.

본 발명은 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 결합 단편을 제공하고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR) LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, LCDR1은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고, HCDR1은 서열 1의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 LCDR1이 서열 46의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 48의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 50의 아미노산 서열을 갖고, HCDR1이 서열 1의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2가 서열 43의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3이 서열 45의 아미노산 서열을 갖는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 바람직하게는 LCDR1이 서열 5의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 47의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 49의 아미노산 서열을 갖고, HCDR1이 서열 1의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2가 서열 2의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3이 서열 44의 아미노산 서열을 갖는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 LCDR1이 서열 5의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 6, 서열 8, 및 서열 10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 7 및 서열 9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, HCDR1이 서열 1의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2가 서열 2의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3이 서열 3 및 서열 4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:

(i) LCDR1은 서열 5이고, LCDR2는 서열 6이고, LCDR3은 서열 7이고, HCDR1은 서열 1이고, HCDR2는 서열 2이고, HCDR3은 서열 3이고,

(ii) LCDR1은 서열 5이고, LCDR2는 서열 8이고, LCDR3은 서열 7이고, HCDR1은 서열 1이고, HCDR2는 서열 2이고, HCDR3은 서열 4이고,

(iii) LCDR1은 서열 5이고, LCDR2는 서열 6이고, LCDR3은 서열 9이고, HCDR1은 서열 1이고, HCDR2는 서열 2이고, HCDR3은 서열 3이고,

(iv) LCDR1은 서열 5이고, LCDR2는 서열 10이고, LCDR3은 서열 9이고, HCDR1은 서열 1이고, HCDR2는 서열 2이고, HCDR3은 서열 3이다.

본 발명은 LCVR이 서열 52의 아미노산 서열을 포함하고 HCVR이 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 LCVR이 서열 13, 서열 14, 서열 15, 및 서열 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 HCVR이 서열 11 및 서열 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 LCVR 및 HCVR이 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:

(i) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR;

(ii) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR;

(iii) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR;

(iv) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR.

본 발명은 바람직하게는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체를 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 서열 17 및 서열 18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체를 제공한다.

보다 바람직하게는, 본 발명은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체를 제공한다:

(i) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,

(ii) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,

(iii) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및

(iv) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.

본 발명은 바람직하게는 각각 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 및 각각 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체를 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 각각 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 및 각각 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체를 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 각각 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 및 각각 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체를 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 각각 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 및 각각 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 인간 조작된 DKK-1 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 항체 경쟁 분석을 통해 결정되는 바와 같이 인간 DKK-1 (서열 29)에 결합하기 위해 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여를 포함하는 골 치유 방법을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여를 포함하는, 바람직하게는 다발성 골수종, 유방암 및 비-소세포 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 골 치유를 위한 치료 또는 바람직하게는 다발성 골수종, 유방암 및 비-소세포 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 요법, 골 치유를 위한 치료 또는 바람직하게는 다발성 골수종, 유방암 및 비-소세포 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 인간 조작된 DKK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.

정의

천연에서 존재하는 바와 같이, 전장 항체는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자이다. 각각의 사슬의 아미노 말단부는 그 내에 함유된 상보성 결정 영역 (CDR)을 통해 주로 항원 인식을 담당하는 약 100-110개 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단부는 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다.

CDR에는 프레임워크 영역 ("FR")으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재한다. 각각의 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 경쇄의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"로서 칭하고, 중쇄의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"로서 칭한다. CDR은 항원과 특이적인 상호작용을 형성하는 대부분의 잔기를 함유한다. LCVR 및 HCVR 영역 내의 CDR 아미노산 잔기의 넘버링 (numbering) 및 위치 결정은 잘 공지된 카바트 (Kabat) 넘버링 규약에 따른다.

경쇄는 카파 또는 람다로서 분류되고, 당업계에 공지된 바와 같이 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로서 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE로서 규정한다. IgG 항체는 하위클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 추가로 나누어질 수 있다. 각각의 중쇄 종류는 당업계에 잘 공지된 서열을 갖는 특정 불변 영역을 특징으로 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" (Mab)는 항체가 생산되는 방법이 아니라, 예를 들어, 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하는 단일 카피 또는 클론으로부터 유래되는 항체를 의미한다. 본 발명의 Mab는 바람직하게는 균일한 또는 실질적으로 균일한 집단으로 존재한다. 완전 Mab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. 그러한 모노클로날 항체의 "항원 결합 단편"은 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 및 단일쇄 Fv 단편을 포함한다. 본 발명의 모노클로날 항체 및 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 예를 들어, CDR-그래프팅 (grafting), 또는 상기 기술의 조합, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 마우스는 인간 DKK-1 또는 그의 단편으로 면역화될 수 있고, 생성되는 항체는 회수 및 정제될 수 있고, 본원에서 개시되는 항체 화합물과 유사하거나 동일한 결합 및 기능적 특성의 보유 여부는 하기 실시예에서 개시되는 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 항원 결합 단편은 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편의 생산 및 정제 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2]에서 볼 수 있다.

구문 "키메라 항체"는 상이한 종 (일반적으로 2개의 종)으로부터의 도메인을 함유하는 항체이다. 항체 V는 키메라 항체로서, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 쥐 항체로부터의 잔기를 함유하는 반면, 불변 영역 경쇄 도메인은 래트 카파 경쇄를 포함하는 잔기를 함유하고 불변 영역 중쇄 도메인은 래트 IgG1 항체를 포함하는 잔기를 함유한다. 항체 V는 쥐/래트 키메라이고, 장기 전임상 모델에서 면역 반응의 가능성을 감소시키기 위해 연구에서 사용된다.

구문 "인간 조작 항체"는 본 발명에 따른 결합 및 기능적 특성을 갖고 비-인간 항체로부터 유래한 CDR을 둘러싸는 실질적으로 인간 또는 완전 인간인 프레임워크 영역을 갖는 모노클로날 항체를 나타낸다. 그러한 인간 조작 항체의 "항원 결합 단편"은 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 및 단일쇄 Fv 단편을 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "프레임워크 서열"은 프레임워크 영역 1 내지 4 중의 임의의 하나를 나타낸다. 본 발명에 포함되는 인간 조작 항체 및 그의 항원 결합 단편은 프레임워크 영역 1 내지 4 중의 임의의 하나 이상이 실질적으로 또는 완전 인간인, 즉, 개개의 실질적으로 또는 완전 인간 프레임워크 영역 1 내지 4의 임의의 가능한 조합이 존재하는 분자를 포함한다. 예를 들어, 상기 분자는 프레임워크 영역 1 및 프레임워크 영역 2, 프레임워크 영역 1 및 프레임워크 영역 3, 프레임워크 영역 1, 2 및 3 등이 실질적으로 또는 완전 인간인 분자를 포함한다. 실질적으로 인간 프레임워크는 공지의 인간 생식계열 (germ-line) 프레임워크 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 것이다. 바람직하게는, 실질적으로 인간 프레임워크는 공지의 인간 생식계열 프레임워크 서열에 대해 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는다.

완전 인간 프레임워크는 공지의 인간 생식계열 프레임워크 서열과 동일한 것이다. 인간 프레임워크 생식계열 서열은 이뮤노제네틱스 (ImMunoGeneTics) (IMGT)로부터 그의 웹사이트 http://imgt.cines.fr로부터, 또는 문헌 [The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351]로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생식계열 경쇄 프레임워크는 A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2, 및 O8로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 생식계열 중쇄 프레임워크 영역은 VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, 및 VH5-51로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본원에서 개시된 것 이외에 본 발명에 따른 유사한 기능적 특성을 보이는 인간 조작 항체는 여러 상이한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 개시되는 구체적인 항체 화합물은 추가의 항체 화합물을 제조하기 위한 주형 또는 모 항체 화합물로서 사용될 수 있다. 한 방법에서, 모 항체 화합물 CDR은 모 항체 화합물 프레임워크와 높은 서열 동일성을 갖는 인간 프레임워크 내로 그래프팅된다. 새로운 프레임워크의 서열 동일성은 일반적으로 모 항체 화합물의 대응하는 프레임워크의 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일할 것이다. 상기 그래프팅은 모 항체에 비해 결합 친화도를 감소시킬 수 있다. 그러한 경우에, 프레임워크는 문헌 [Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869]에 개시된 특정 기준을 기초로 하여 특정 위치에서 모 프레임워크로 역돌연변이될 수 있다. 마우스 항체의 인간화에 유용한 방법을 기재하고 있는 추가의 참고문헌에는 미국 특허 4,816,397; 5,225,539, 및 5,693,761; 문헌 [Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620]에 기재된 컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD; 및 윈터 및 공동연구자들의 방법 ([Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; 및 [Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536])이 포함된다.

역돌연변이를 위해 고려되는 잔기의 확인은 다음과 같이 수행될 수 있다:

아미노산이 다음 범주에 해당할 때, 사용되는 인간 생식계열 서열의 프레임워크 아미노산 ("수용자 프레임워크")은 모 항체 화합물의 프레임워크로부터의 프레임워크 아미노산 ("공여자 프레임워크")에 의해 교체된다:

(a) 수용자 프레임워크의 인간 프레임워크 영역 내의 아미노산은 그 위치에서 인간 프레임워크에 대해 드문 것인 반면, 공여자 면역글로불린의 대응하는 아미노산은 그 위치에서 인간 프레임워크에 대해 전형적인 것이거나;

(b) 아미노산의 위치는 CDR 중의 하나에 바로 인접하거나; 또는

(c) 프레임워크 아미노산의 임의의 측쇄 원자는 3차원 면역글로불린 모델에서 CDR 아미노산의 임의의 원자의 약 5-6 옹스트롬 (중심 대 중심) 내에 존재한다.

수용자 프레임워크의 인간 프레임워크 영역 내의 각각의 아미노산 및 공여자 프레임워크 내의 대응하는 아미노산이 그 위치에서 인간 프레임워크에 대해 일반적으로 드문 것일 때, 상기 아미노산은 그 위치에서 인간 프레임워크에 대해 전형적인 아미노산에 의해 교체될 수 있다. 상기 역-돌연변이 기준을 사용하여 모 항체 화합물의 활성을 회복시킬 수 있다.

본원에 개시된 항체 화합물에 유사한 기능적 특성을 보이는 인간 조작 항체를 생성하는 또 다른 방법은 프레임워크를 변경하지 않으면서 그라프팅된 CDR 내의 아미노산을 무작위로 돌연변이시키고, 모 항체 화합물만큼 양호하거나 그보다 더 우수한 결합 친화도 및 다른 기능적 특성에 대해 생성되는 분자를 스크리닝하는 것을 수반한다. 또한, 단일 돌연변이를 각각의 CDR 내의 각각의 아미노산 위치에 도입한 후, 결합 친화도 및 다른 다른 기능적 특성에 대한 상기 돌연변이의 효과를 평가할 수 있다. 특성을 개선하는 단일 돌연변이는 서로 조합할 때 그의 효과를 평가하기 위해 조합될 수 있다.

또한, 상기 두 방법의 조합도 가능하다. CDR 그래프팅 후에, CDR에 아미노산 변화를 도입하는 것에 추가하여 특정 프레임워크 영역을 역-돌연변이시킬 수 있다. 상기 방법은 문헌 [Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294: 151-162]에 기재되어 있다.

본 발명의 교시내용을 적용할 때, 당업자는 본원에서 개시되는 CDR 및 프레임워크 서열 내의 아미노산을 치환하여 본 발명의 서열로부터 유래되는 추가의 가변 영역 아미노산 서열을 생성하기 위해 통상적인 기술, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발을 사용할 수 있다. 모든 대체 천연 아미노산은 특이적인 치환 부위에 도입될 수 있다. 이어서, 본원에 개시된 방법은 나타낸 생체내 기능을 갖는 서열을 확인하기 위해 상기 추가의 가변 영역 아미노산 서열을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방식에서, 본 발명에 따른 인간 조작 항체 및 그의 항원 결합부를 제조하기 적합한 추가의 서열이 확인될 수 있다. 바람직하게는, 프레임워크 내의 아미노산 치환은 본원에 개시된 4개의 경쇄 및/또는 중쇄 프레임워크 영역 중의 임의의 하나 이상 내의 1, 2 또는 3개의 위치로 제한된다. 바람직하게는, CDR 내의 아미노산 치환은 3개의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR 중의 임의의 하나 이상 내의 1, 2 또는 3개의 위치로 제한된다. 또한, 상기 설명한 상기 프레임워크 영역 및 CDR 내의 다양한 변화의 조합도 가능하다. 가장 바람직하게는, 이들 기술은 각각 서열 12 및 서열 14에 기재된 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 사용하여 추가의 가변 영역 아미노산 서열을 생성하기 위해 사용된다.

본원에 개시된 분자와 "경쟁하는" 인간 조작 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본 발명의 분자가 결합하는 부위(들)과 동일하거나 중첩되는 부위(들)에서 인간 DKK-1 (서열 29)에 결합하는 것이다. 경쟁하는 인간 조작 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 항체 경쟁 분석을 통해 확인될 수 있다. 예를 들어, 정제된 또는 부분적으로 정제된 인간 DKK-1 (서열 29)의 샘플은 고체 지지체에 결합된다. 이어서, 시험 또는 본 발명의 항체를 표지하여 본원에 개시된 항체 및 시험 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편이 첨가된다. 표지된 항체 및 표지되지 않은 항체가 DKK-1 상의 별개의 분리된 부위에 결합할 경우, 표지된 항체는 추측되는 경쟁하는 항체의 존재 여부와 상관없이 동일한 수준으로 결합할 것이다. 그러나, 상호작용의 부위가 동일하거나 중첩될 경우, 표지되지 않은 항체는 경쟁할 것이고, 항원에 결합된 표지된 항체의 양은 저하될 것이다. 표지되지 않은 항체가 과량으로 존재할 경우, 표지된 항체는 결합하지 않을 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 경쟁하는 인간 조작 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 DKK-1에 대한 본 발명의 항체의 결합을 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 감소시키는 것이다. 상기 경쟁 분석을 수행하기 위한 절차의 상세한 내용은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pages 567-569, ISBN 0-87969-314-2]에서 볼 수 있다. 상기 분석은 정제된 항체를 사용함으로써 정량 분석으로 실시될 수 있다. 표준 곡선은 한 항체를 그 자체의 표지된 버전에 대해 적정함으로써 확립된다. 표지되지 않은 경쟁하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 표지된 분자의 플레이트에 대한 결합을 억제하는 능력이 적정된다. 그 결과를 도면으로 작성하고, 요구되는 정도의 결합 억제를 달성하기 위해 필요한 농도를 비교한다. 상기 경쟁 분석에서 본 발명의 인간 조작 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 경쟁하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 발명의 인간 조작 항체의 동일하거나 유사한 기능적 특성을 갖는지의 여부는 본원의 실시예에서 개시되는 방법을 통해 결정될 수 있다.

용어 "억제하다"는 DKK-1의 생물학적 효과를 실질적으로 길항, 금지, 예방, 제한, 지연, 붕괴, 제거, 정지, 감소 또는 역전시키는 능력을 의미한다.

용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")는 증상, 질환, 병태, 또는 질병의 진행 또는 심도를 지연, 간섭, 저지, 조절, 정지, 감소 또는 역전시키는 과정을 의미하지만, DKK-1 활성과 연관된 모든 질병-관련 증상, 병태 또는 질환의 완전한 제거를 반드시 수반하지는 않는다.

용어 "예방하는" (또는 "예방하다" 또는 "예방")은 증상, 질환, 병태, 또는 질병의 발생 또는 출현의 금지, 제한, 또는 억제를 의미한다. 급성 사건 및 만성 병태는 치료되고 예방될 수 있다. 급성 사건에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 증상, 질환, 병태, 또는 질병의 발생시에 투여되고, 급성 사건이 종료되면 중단된다. 이와 대조적으로, 만성 증상, 질환, 병태, 또는 질병은 보다 연장된 시간에 걸쳐 치료된다.

용어 "유효량"은 환자에게 단일 또는 다중 용량으로 투여시에 요구되는 치료 또는 예방을 제공하는 본 발명의 항체 화합물의 양 또는 용량을 의미한다. 본 발명의 항체 화합물의 치료 유효량은 단일 용량당 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 양을 포함할 수 있다. 임의의 개별적인 환자에 대한 치료 유효량은 생체마커에 대한 항체 화합물의 효과를 모니터링함으로써 의료담당자에 의해 결정될 수 있다.

용어 "골 치유"는 DKK-1을 차단함으로써 손상 부위에서 골 형성의 자극을 의미한다. 골 치유 적응증의 예는 골절 치유, 임플란트 (implant) 고정/유지, 및 치과용 임플란트 고정/유지를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 인간 조작 항체는 다양한 경로에 의해 투여되는 인간 의약의 약제로서 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 그러한 조성물은 비경구 투여를 위한 것이다. 상기 제약 조성물은 당업계에 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.] 참조)에 의해 제조될 수 있고, 본원에 개시된 인간 조작된 항체, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.

다음 분석 결과는 본 발명의 모노클로날 항체 및 그의 항원 결합 단편이 DKK-1 억제제로서 유용함을 입증한다. 본 발명의 항체는 많은 바람직한 특성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 항체 II는 증가된 화학적 및 물리적 안정성, 및 용해도를 갖는다. 본 발명의 항체를 상이한 버퍼 조건 (pH 및 NaCl 변화) 하에 인큐베이팅하고 4℃, 25℃, 및 40℃에서 4주 동안 인큐베이팅함으로써 항체의 화학적 안정성을 평가하기 위해 가속 연구를 수행한다. 본 발명의 항체의 화학적 변형은 하전 변이체 (예를 들어, 아스파라긴의 아스파르트산으로의 탈아미드화)를 분리하기 위한 양이온-교환 ("CEX") 크로마토그래피 및 특정 분해 부위를 확인하기 위한 LC-MS 분석에 의해 검출된다. 항체 II는 CEX에 의해 검출된 최소량의 분해를 보이고, 이 결과는 CDR 내의 3개 모두의 아스파라긴 잔기가 pH 8 버퍼에서 40℃에서 4주 동안 인큐베이팅한 후에 본원에서 설명되는 다른 항체에 비해 최소량의 탈아미드화를 갖는다는 것을 보여주는 LC-MS 데이타에 의해 다시 확인된다. 항체 II의 용해도는 pH 6 + 150 mM NaCl에서 제형화될 때 항체 I에 비해 보다 유리하다. 또한, 항체 II는 4℃에서 보관할 때 >105 mg/mL의 용해도를 유지하고, 항체 I의 용해도는 단지 48 mg/mL에 불과하고, 상기 동일한 조건 하에서 침전된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "EC50"은 그 물질에 대해 가능한 최대 반응의 50%를 생성하는 물질의 농도를 의미한다. "Kd"는 평형 해리 상수를 의미하고, 다음 식으로 계산될 수 있다: k_off/k_on= Kd.

실시예 1-항체의 생산

항체 I, II, III, 및 IV를 정제된 다음과 같이 제조하고 정제할 수 있다. 적절한 숙주 세포, 예를 들어 HEK 293 EBNA 또는 CHO를, 최적의 소정 HC:LC 벡터 비율, 또는 HC, 예를 들어 서열 23 또는 서열 24 및 LC, 예를 들어 서열 25, 서열 26, 서열 27, 또는 서열 28을 모두 코딩하는 단일 벡터 시스템을 이용하여 항체를 분비하기 위한 발현 시스템으로 일시적으로 또는 안정하게 형질감염시켰다. 항체가 분비된 청정화시킨 배지를 임의의 많은 일반적으로 사용되는 기술을 이용하여 정제하였다. 예를 들어, 배지를 편리하게 상용성 버퍼, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 평형화시킨 단백질 A 또는 G 세파로스 (Sepharose) FF 컬럼에 적용할 수 있다. 컬럼을 세척하여 비특이적 결합 성분을 제거하였다. 결합된 항체를, 예를 들어 pH 구배 (예를 들어, 0.1 M 인산나트륨 버퍼 (pH 6.8) 내지 0.1 M 시트르사나트륨 버퍼 (pH 3.0))에 의해 용출시켰다. 항체 분획을 예를 들어 SDS-PAGE에 의해 검출한 후 모았다. 추가의 정제는 의도된 용도에 따라 선택적이다. 항체를 일반적인 기술을 이용하여 농축 및/또는 멸균 여과할 수 있다. 가용성 응집물 및 다량체는 일반적인 기술, 예를 들어 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 효과적으로 제거할 수 있다. 이들 크로마토그래피 단계 후 항체의 순도는 99% 초과이다. 생성물은 -70℃에서 즉시 동결시킬 수 있거나 동결건조할 수 있다. 이들 항체에 대한 아미노산 서열을 아래에 제공한다.

서열

실시예 2: DKK -1 항체에 대한 친화도 ( Kd ) 측정

결합 평형을 확립하기 위해, 일정 농도의 항체를 PBS (pH 7.4) + 1 mg/mL 소 혈청 알부민 ("BSA") 또는 버퍼 단독 내에서 가변 농도의 His-태깅된 DKK-1 (서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 또는 서열 33) (1 nM - 1 pM 범위)와 혼합하고 37℃에서 수일 동안 인큐베이팅하였다. 2개의 세트의 결합 반응을 준비하였고, 여기서 하나의 세트는 저농도의 항체 (3 pM)에서, 하나의 세트는 고농도의 항체 (30 또는 50 pM)에서이다.

평형을 확립한 후, KinExA 3000 기기 (사피다인 인스트. 인크. (Sapidyne Inst. Inc.))를 사용하여 '유리' (비결합된) 항체의 분획에 대해 탐지하였다. 간단히 설명하면, His-태깅된 DKK-1을 작은 컬럼을 생성하도록 기기에 채운 NHS-활성화된 세파로스 4 고속 (Fast Flow) 비드 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))에 공유 결합시켰다. 항체 + His-태깅된 DKK-1의 예비-평형화된 혼합물을 비드 위로 통과시켜 유리 항체만을 포획시켰다. 포획된 유리 항체의 양은 평형화된 샘플 내의 유리 농도에 비례하고, 형광 표지된 2차 항체의 주사에 의해 검출되었다. 저 및 고농도의 항체로부터의 데이타 세트를 KinExA 소프트웨어에서 n-곡선 분석을 이용하여 전반적으로 피팅시켰다. 상기 피팅으로 Kd 값 및 95% 신뢰 구간을 얻는다.

실시예 3: C2C12 알칼리성 포스파타제 분석에서 Dkk -1 항체의 효과

정형적인 Wnt 신호 전달은 골모세포 분화 및 활성에 중요하다. BMP-4와 조합한 Wnt-3a CM (조건화 배지)는 만능 (pluripotent) 마우스 C2C12 세포가 골모세포 활성의 마커인 알칼리성 포스파타제 ("AP")의 측정가능한 종점을 갖는 골모세포로 분화하도록 유도한다. DKK-1 (정형적인 Wnt 신호 전달의 억제제)은 AP의 분화 및 생산을 억제한다. 중화 DKK-1 항체는 AP의 DKK-1-매개된 억제를 방지한다. DKK-1 억제 활성을 차단하는 항체는 AP 활성의 손실을 방지한다.

C2C12 세포를 성장 배지 (L-글루타민, 10% 열-불활성화된 태소 혈청 ("FBS"), 1x 항생제/항진균제, 1x 피루브산나트륨을 함유하는 둘베코 (Dulbecco) 변형 이글 (Eagle) 배지 ("DMEM")) 내에서 조직 배양 플라스크 내에서 60% - 80% 융합으로 성장시켰다. C2C12 세포를 30,000 세포/mL의 농도로 성장 배지 내에 재현탁시키고, 100 ㎕/웰을 96-웰 조직 배양 플레이트에 첨가하고 37℃, 95% 습도, 5% CO₂에서 철야 인큐베이팅하였다. 성장 배지를 50 ㎕ 분석 배지 (L-글루타민, 5% 열-불활성화된 FBS, 1x 항생제/항진균제, 1x 피루브산나트륨을 함유하는 DMEM)로 교체하였다. 분화를 자극하기 (따라서, AP 생산을 유도하기) 위해서, 100 ㎕ 분석 배지 + 1.5x Wnt-3a CM + BMP-4 (알앤디 시스템즈 (R&D Systems) 카탈로그 #314-BP)를 첨가하였다. 이에 의해 1x Wnt-3a CM 및 25 ng/mL BMP-4의 최종 농도를 얻었다. 음성 대조군은 L세포 CM만을 함유하였다 (Wnt-3a 또는 BMP-4 없음). 세포를 37℃, 95% 습도, 5% CO₂에서 72시간 동안 인큐베이팅하였다. 배지를 제거하고, 세포를 200 ㎕ 포스페이트-완충 염수 ("PBS")로 세척하고, PBS를 제거하였다. 세포를 3회 동결-해동하였다. 100 ㎕ 1-단계 pNPP 기질 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific) 카탈로그 #37621)을 웰 당 첨가하고, 플레이트를 실온에서 인큐베이팅하였다. 흡광도를 405 nm에서 판독하였다. 분화를 억제하기 위해 요구되는 DKK-1 농도를 결정하기 위해, 다양한 종으로부터의 Dkk-1 분자를 적정하여, AP 유도를 완전히 억제하기 위해 요구되는 최소 농도를 확인하였다.

AP 유도를 완전히 억제하는 각각의 종으로부터의 DKK-1의 최소 농도는 다음과 같았다: 인간 DKK-1 = 38 nM, 시노몰구스 DKK-1 = 11.4 nM, 래트 DKK-1 = 5.8 nM, 및 토끼 DKK-1 = 25.0 nM.

AP 유도를 완전히 억제하는 DKK-1의 농도를 결정하면, 증가하는 농도의 항-DKK-1 항체를 억제 농도의 Dkk-1을 갖는 분석 배지 내에서 30분 동안 실온에서 예비-인큐베이팅하였다. AP 유도를 상기 설명한 바와 같이 결정하였다. 결과를 EC50 (nM ± 표준 오차)로서 보고하였다.

항체 II는 C2C12 AP의 Dkk-1-매개된 억제를 차단한다. 다양한 종의 DKK-1에 대해, EC50 (nM ± 표준 오차로서 제공됨)은 다음과 같다: 인간 = 9.8 ± 0.41, 시노몰구스 = 6.4 ± 0.25, 래트 = 2.9 ± 0.25, 및 토끼 = 6.0 ± 0.32.

실시예 4: 피질 결손 ( CD ) 생체내 분석

6월령 암컷 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트를 난소적출하고, 2개월 동안 골을 손실시켰다. 2 mm 치과용 비트 (bit)를 갖는 전기 드릴을 사용하여 2 mm 직경 결손을 좌측 및 우측 대퇴골 내로 도입하였다. 상기 구멍은 전방 및 후방 피질 모두를 통해 연장한다. 골의 치유를 수술 후 35일 동안 정량적 전산화 단층촬영 ("qCT")의 사용을 통해 골 질량 밀도 ("BMD")를 평가함으로써 종단으로 모니터링하였다. 실험의 끝에, 동물을 희생시키고, 전체 대퇴부를 파괴까지 적하 (loaded-to-failure) 결정으로 처리하여 전체 골간 (diaphysis)의 생물기계적 강도를 확인하였다. 항체를 지시된 용량 및 간격으로 피하 투여하였다.

항체 II은 다음과 같이 투약하였다: 수술 1일 후에 시작하여 2주마다 1회 5 mg/kg (제1군), 1 mg/kg (제2군), 5 mg/kg (제3군), 또는 15 mg/kg (제4군)를 수술 9일 후에 시작하여 2주마다 1회 투여하였다. BMD는 제35일에 qCT에 의해 평가하였다. 제1군은 전방 및 후방 피질 모두에서 BMD의 통계상 유의한 증가를 보였다. 제4군은 두 피질에서 BMD의 통계상 유의한 증가를 보였지만, 제2군 및 제3군은 BMD의 유의하지 않은 증가를 보였다.

실시예 5: 암 생체내 효능 분석

마우스 (암컷 C.B-17 마우스, 폭스 체이스 (Fox Chase) 중증 조합된 면역결핍 모델 # CB17SC-M)를 실험 개시 전에 1주 동안 동물 시설 내에서 적응시켰다. 적응 후에, 마우스를 처리당 10마리의 군으로 무작위로 나누었다. 배양된 인간 A549 비-소세포 폐 암종 세포를 마우스의 뒤옆구리에 피하 이식하고, 종양을 ~100 mm³의 평균 종양 부피에 도달시켰다. 항체 II (1 mg/kg 및 5 mg/kg), 대조군 IgG 항체 (1 mg/kg 및 5 mg/kg), 또는 비히클 (0.02% Tween 80을 보충한 시트레이트 완충 염수)을 피하 주사를 통해 투여하였다. 동물에게 7일 간격으로 2회 처리제를 투여하였다.

종양을 전자 캘리퍼스 (calipers)로 매주 2회 측정하여, 성장 곡선을 작성하였다. 동물을 또한 체중의 변동 및 독성의 징후에 대해 매주 2회 모니터링하였다. 표 3에 제시된 종양 부피 측정치는 제29일에 취한 것이다.

표 2에 보이는 바와 같이, 항체 II를 투여한 처리군이 생체 내에서 인간 A549 비-소세포 폐 이종이식편의 유의한 성장 억제를 나타냈다.

실시예 6: 혈관신생성 재-표준화 생체내 이종이식편 분석

항-종양 효능의 메카니즘을 이해하기 위해, 항체 II 또는 IgG 대조군으로 처리한 A549 종양에 대해 고집적 (high content) 영상 분석을 수행한다. 몇몇 표현형-기반 마커를 정량적 및 정성적으로 분석하여, 혈관신생 (CD31 및 평활근 액틴, SMA), 저산소증 유도 (글루코스 수송체 1, GLUT1), 세포 증식 (Ki67), 및 아폽토시스 (말단 UDP 닉-엔드 (Nick-End) 표지, TUNEL)의 암-관련 생물학적 과정을 평가하였다.

7 내지 8주령의 암컷 C.B-17 (폭스 체이스 SCID) 모델 # CB17SC-M 마우스를 1주 동안 적응시키고, 규정 저지방 (4.5%) 식이를 자유롭게 먹도록 하고, 상기 식이는 연구 지속 기간 동안 유지하였다.

ATCC 기원의 A549 세포를 성장시키고, 10% FBS (인비트로겐 #0, 및 피루브산나트륨, 비-필수 아미노산 및 pen-strep (각각 인비트로겐 #11360, #11140 및 #15140)의 100x 희석액을 보충한 F-12 케인 (Kaighn) 배지 (인비트로겐 (InVitrogen) #21127) 내에서 나누었다. 이들을 탈착시키고, 95% 생활력을 갖는 계대배양 (passage) 19에서 PBS 내에 50 x 10⁶ 세포/ml의 최종 농도로 제조하였다.

5 x 10⁶개의 A549 인간 폐 암종 세포를 PBS 및 Matrigel (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson, 미국 매사추세츠주 베드포드))의 1:1 혼합물 내에서 대상체 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 및 체중 측정을 매주 2회 수행하였다. 처리 전에, 마우스를 무작위화 알고리즘을 이용하여 종양 크기에 기초하여 무작위로 골랐다.

종양이 200 mm³에 도달할 때 시작하여, 무작위로 고른 마우스를 10마리 동물의 2개 군으로 나누고, 제1일 및 다시 제8일에 5 mg/kg의 항체 II 또는 IgG4 대조군을 피하 투약하였다. 연구를 항체의 제1 용량 투여의 10일 후에 종료하였다.

항체 II를 시트레이트 완충 염수 (CBS) (10 mM 시트레이트 (pH 6), 150 mM NaCl 및 0.2% 폴리소르베이트) 내에 제조하였다. IgG4 대조군은 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내에 6.0 mg/ml로 제공하였다.

이종이식편 종양을 투약 17일 후에 마우스로부터 절제하고, Zinc-Tris 고정제 (비디 파밍엔 (BD Pharmingen))에 넣었다. 고정된 종양을 처리하고, 파라핀 내에 차단시키고, 표준 현미경 슬라이드 상으로 3 μM 슬라이스로서 절편화하였다. 슬라이드를 60℉ 1시간 동안 구운 후, 자일렌 내에서 탈파라핀화하였다 (4회 처리, 각각 10분). 슬라이드를 일련의 에탄올/물 침액 후 Tris-완충 염수/Tween (TBST) 내에서 최종 세척시켜 재수화시켰다. 이어서, 슬라이드를 프로테인 블록 (Protein Block) (다코 (DAKO))으로 30분 동안 차단하였다. 종양 건강 패널에 대해, 슬라이드를 획스트 (Hoechst) 33324 (인비트로겐), 래트 항-인간 CD31 (파밍엔 (Pharmingen))/항-래트 알렉사 (Alexa)-488 (인비트로겐), 토끼 항-Ki67 (네오마커스 (NeoMarkers))/항-토끼 알렉사 647 (인비트로겐), 및 TUNEL-TMR 레드 (TUNEL 희석 버퍼 내에 1:5 희석시킴; 로슈 (Roche))의 조합물로 염색하였다. 혈관신생 패널에 대해, 슬라이드를 획스트 33324 (인비트로겐), 래트 항-인간 CD31 (파밍엔)/항-래트 알렉사-488 (인비트로겐), 토끼 항-GLUT1 (케미콘 (Chemicon))/항-토끼 알렉사 647 (인비트로겐), 및 마우스 항-평활근 액틴/Cy3 (시그마 (Sigma))의 조합물로 염색하였다. 슬라이드를 iCys 레이저 스캐닝 세포측정기 (컴퓨사이트 (CompuCyte)) 및 Zeiss Axiovert 200M 도립 형광 현미경이 설치된 Marianas 디지탈 영상화 워크스테이션 (인텔리전트 이미징 이노베이션스 (Intelligent Imaging Innovations))을 사용하여 영상화하였다. 처리군의 정량적 데이타 비교를 JMP 통계 소프트웨어 (SAS)에서 던넷 (Dunnet) 분석을 이용하여 수행하였다.

표 3에 보이는 바와 같이, 대조군 IgG-처리 동물로부터의 A549 이종이식편은 보통으로 혈관형성되고, 중간 수준의 근섬유모세포 및 많은 집중된 저산소성 영역을 갖는다. 대조군 IgG-처리 종양은 혈관주위세포 (pericyte)로 불량하게 덮인 신생혈관성 혈관 발아 및 성숙 혈관 모두로 이루어지는 혈관의 연장된 네트워크를 갖는다. 대조군 IgG-처리 종양은 관류된 (perfused) 혈관으로부터 일부 거리에 명백하게 구획된 대역인 저산소성 영역 (GLUT1로 표지됨) 및 혈관으로부터 훨씬 더 멀리 있는 괴사 영역을 갖는다. 항체 II로 처리하면 감소된 혈관 면적, 감소된 혈관주위세포 면적, 및 혈관의 감소된 혈관주위세포 피복율이 얻어진다. 그러나, 상기 처리는 종양 저산소증의 유의한 차이를 생성시키지 않았다. 정성적으로, 항체 II-처리 종양 혈관계는 대조군 IgG-처리군에 비해 더 작고 네트워크가 덜 형성된 혈관으로 이루어지고 더 적은 혈관주위세포 피복률을 갖는 것으로 보인다.

표 3에 보이는 바와 같이, IgG-처리 종양은 전체에 균등하게 분포된 증식하는 종양 세포를 갖지만, 또한 종종 무혈관성인 하나 이상의 큰 면적의 괴사를 보인다. 항체 II로 처리하면 아폽토시스는 변화가 없고 총 증식 면적은 단지 근소하게 비-유의하게 감소하였다. 그러나, 항체 II-처리 종양에서 고-강도 Ki67 세포의 면적의 백분율은 현저하게 감소하였고, 이는 G2 세포 주기 시기 내의 세포의 감소된 양을 나타낼 수 있다.

실시예 7: 골 생체내 효능 분석

임플란트-주위 골 형성을 가속화하고 골 조직을 재생하는 항체 V (서열 34의 경쇄 및 서열 35의 중쇄)의 능력을 평가하기 위해, 무게 약 425 g의 4월령 수컷 스프라그-돌리 래트 (할란 스프라그 돌리 인크 (Harlan Sprague Dawley Inc))를 이용하였다. 래트에 티탄 나사 (2 mm x 4 mm)를 장골-비골 접합부 바로 위의 내측 측면의 두 다리 내로 수술에 의해 이식하였다. 이어서, 래트를 체중에 따라 2개의 군으로 무작위로 나누고, 항체 V 10 mg/kg 또는 IgG 대조물 10 mg/kg를 21일 동안 수술일에 시작하여 매주 1회 피하 주사하였다. 정량적 전산화 단층촬영 (Aloka LaTheta LTC-100 모델 CT 스캐너 (scanner))를 사용하여 60-μm 복셀 (voxel) 크기로 새로 형성된 골을 생체외 스캐닝하고 정량하였다. 관심있는 부피 (VOI)는 선행 임플란트 부위 위에서 0.1 mm 간격의 28개의 슬라이스로서 규정된다. 군 차이는 JMP 버전 5.1. 소프트웨어 (미국 노스 캐롤라이나주 캐리)로 평가하였다 (P<0.05의 유의성 수준으로 던넷 방법을 이용하는 IgG-대조군에 대한 비교). 생체외 팍시트론 (faxitron) x-선 영상에 의한 정성적 평가는 항체 V 처리군이 임플란트 둘레에 보다 많은 새로운 골 또는 가골 (callus)을 가짐을 나타낸다. 정량적 CT 분석은 IgG 대조군에 비해 항체 V 처리군에서 피질 임플란트-주위 골 무기질 함량 (14%), 새로운 골 면적 (16%), 피질 두께 (7%) 및 골수 해면상 임플란트-주위 새로운 골 무기질 함량 (18%), 및 골 면적 (16%)의 통계상 유의한 증가를 밝혔다. 데이타는 항체 V가 새로운 골 형성을 자극하고 티탄 이식된 래트에서 재생하는 골 조직을 가속화함을 입증한다.

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ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320 tccctgtctc tgggt 1335 <210> 24 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc 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ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320 tccctgtctc tgggt 1335 <210> 25 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgcc acgccagcga cagtattagc aacagcctac actggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctattat ggcagacagt ccatccaggg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacag agtgagagct ggccgctcca cttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642 <210> 26 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgcc acgccagcga cagtattagc aacagcctac actggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctattat gctagacagt ccatccaggg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacag agtgagagct ggccgctcca cttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642 <210> 27 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgcc acgccagcga cagtattagc aacagcctac actggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctattat ggcagacagt ccatccaggg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacag agtgccagct ggccgctcca cttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642 <210> 28 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Tyr Asn Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Pro Gly Tyr Asn Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Arg Ala Ser Asp Ser Ile Ser Gly Ser Leu His 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Asn 1 5 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 = Phe or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 = Gly or Asn <400> 43 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Xaa Xaa Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 = His or Asn <400> 44 Pro Gly Tyr Xaa Asn Tyr Tyr Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 = His or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 = Ile or Tyr <400> 45 Pro Gly Tyr Xaa Asn Tyr Tyr Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = His or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 = Asn or Gly <400> 46 Xaa Ala Ser Asp Ser Ile Ser Xaa Ser Leu His 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 = Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 = Ile or Glu <400> 47 Tyr Xaa Arg Gln Ser Xaa Gln 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 = Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 = Arg or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 = Ile or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 = Gln or Ser <400> 48 Tyr Xaa Xaa Gln Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 = Glu or Ala <400> 49 Gln Gln Ser Xaa Ser Trp Pro Leu His 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 = Glu, Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 = His or Asn <400> 50 Gln Gln Ser Xaa Ser Trp Pro Leu Xaa 1 5 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa at position 102 = His or Asn <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Phe Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Tyr Xaa Asn Tyr Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 = Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa at position 55 = Ile or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(92) <223> Xaa at position 92 = Glu or Ala <400> 52 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys His Ala Ser Asp Ser Ile Ser Asn Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Xaa Arg Gln Ser Xaa Gln Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Xaa Ser Trp Pro Leu 85 90 95 His Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims

경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 아미노산 서열은
(i) 서열 13에 나타낸 바와 같은 LCVR 및 서열 11에 나타낸 바와 같은 HCVR;
(ii) 서열 15에 나타낸 바와 같은 LCVR 및 서열 11에 나타낸 바와 같은 HCVR; 및
(iii) 서열 16에 나타낸 바와 같은 LCVR 및 서열 11에 나타낸 바와 같은 HCVR
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 인간 조작된 DKK-1 항체.
제1항에 있어서, 인간 조작된 DKK-1 항체는 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열은 서열 19에 나타낸 바와 같고, 중쇄 아미노산 서열은 서열 17에 나타낸 바와 같은 인간 조작된 DKK-1 항체.
제2항에 있어서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 각 경쇄 아미노산 서열은 서열 19의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같고, 각 중쇄 아미노산 서열은 서열 17의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 인간 조작된 DKK-1 항체.
제1항에 있어서, 인간 조작된 DKK-1 항체는 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열은 서열 21에 나타낸 바와 같고, 중쇄 아미노산 서열은 서열 17에 나타낸 바와 같은 인간 조작된 DKK-1 항체.
제4항에 있어서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 각 경쇄 아미노산 서열은 서열 21의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같고, 각 중쇄 아미노산 서열은 서열 17의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 인간 조작된 DKK-1 항체.
제1항에 있어서, 인간 조작된 DKK-1 항체는 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열은 서열 22에 나타낸 바와 같고, 중쇄 아미노산 서열은 서열 17에 나타낸 바와 같은 인간 조작된 DKK-1 항체.
제6항에 있어서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 각 경쇄 아미노산 서열은 서열 22의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같고, 각 중쇄 아미노산 서열은 서열 17의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 인간 조작된 DKK-1 항체.