BRPI1014157B1 - Uso de anticorpos humanos manipulados contra dkk-1 - Google Patents

Abstract

anticorpos humanos manipulados contra dkk-1, composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos, bem como uso dos mesmos. a invenção refere-se a anticorpos humanos, fragmentos de ligação antigênica dos mesmos, que ligam a, e inibem a atividade de, dkk-1 humano, e os quais são eficazes no tratamento de doenças nas quais a patogêneses é mediada por dkk-1.

Description

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos manipulados humanos contra DKK-1 e a sua aplicação no tratamento de doenças nas quais a patogênese é mediada por DKK-1.

[002] Dickkopf-1 (Dkk-1) é um membro da família dickkopf de proteínas que foi demonstrado que são reguladores negativos do caminho de sinalização de Wnt canônico. O caminho desempenha um papel central no desenvolvimento e na formação de ossos. Dkk-1 inibe a sinalização de Wnt através de sua interação com o correceptor de Wnt LRP5 ou LRP6 e as proteínas kremen. Dkk-1 evita que membros do caminho de Wnt que interajam com quer LRP5 ou LRP6, deste modo evitando a transdução de sinal mediado por Wnt. Foi demonstrado que DKK1 está envolvida em cânceres metastatizantes dos ossos, in-clusive mieloma múltiplo, carcinoma de mama, carcinoma renal e câncer pulmonar de células não pequenas.

[003] Foram descritos anticorpos que ligam Dkk-1 (por exemplo, vide a publicação de patente internacional No. WO2006/015373), no entanto, ainda existe a necessidade de anticorpos terapêuticos manipulados contra DKK-1 humano que inibirão a interação de Dkk-1 com LRP5 e LRP6. Além disso, em vista do envolvimento de Dkk-1 na re-gulação da formação dos ossos, existe a necessidade de anticorpos terapêuticos anti-DKK-1 manipulados humanos para aplicação na cura óssea. Além disso, dado o envolvimento de Dkk-1 em cânceres, existe a necessidade de anticorpos anti-DKK-1 manipulados humanos para tratar cânceres, inclusive mieloma múltiplo, cânceres de mama e pulmonar de células não pequenas.

[004] Os anticorpos da presente invenção são antagonistas de DKK-1 terapeuticamente úteis possuindo uma série de propriedades desejáveis. Os presentes anticorpos manipulados humanos apresen- tam elevada afinidade (Kd) para DKK-1 humano, DKK-1 de cynomol- gus, DKK-1 de rato, DKK-1 de camundongo, e DKK-1 de coelho. Anticorpos da presente invenção bloqueiam a inibição, mediada por DKK- 1, de fosfatase alcalina, um marcador da atividade dos osteoblastos. Além disso, os anticorpos da presente invenção apresentam um aumento na densidade da massa óssea tanto nos córtices anterior quanto posterior em um modelo de defeito cortical in vivo e demonstram significativa inibição do crescimento de xenoenxertos pulmonares de células não pequenas in vivo.

[005] A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que tem uma Kd a 37°C de menos de 5,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32).

[006] A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 5, LCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 47, LCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 49, HCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 44.

[007] A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[008] A presente invenção proporciona um método de curar osso compreendendo administrar um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção. A presente invenção também proporciona um método de tratar câncer compreendendo administrar um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção, em que o câncer é selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

[009] A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 1,5 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 1,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 5,0 X 10-12 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado hu-mano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 0,5 X 10-12 M e 1,5 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 1,0 X 10-12 M e 1,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Os valores de Kd são estabelecidos por um equilíbrio de ligação a 37oC conforme descrito no Exemplo 2.

[0010] A presente invenção também proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 5,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 3,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 2,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), e DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 1,0 X 10-11 M e 5,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 1,5 X 10-11 M e 3,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), e DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33). Os valores de Kd são estabelecidos por um equilíbrio de ligação a 37oC conforme descrito no Exemplo 2.

[0011] Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd de menos de 3,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd de menos de 2,5 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd de menos de 2,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cyno- molgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação anti- gênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação an- tigênica do mesmo tem uma Kd entre 0,5 X 10-12 M e 3,0 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd entre 1,0 X 10-12 M e 2,5 X 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Os valores de Kd são estabelecidos por um equilíbrio de ligação a 37oC conforme descrito no Exemplo 2.

[0012] A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende regiões determinantes de complementariedade (CDRs) LCDR1, LCDR2, e LCDR3 e a HCVR compreende CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que a LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 5, a HCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, e a HCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 2.

[0013] A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que a LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 46, a LCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 48, a LCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 50, a HCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, a HCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 43, e a HCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 45. A presente invenção pre-ferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que a LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 5, a LCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 47, a LCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 49, a HCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, a HCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 2, e a HCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 44.

[0014] A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que a LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 5, a LCDR2 tem uma sequência amino selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 10, a LCDR3 tem uma sequência amino selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, a HCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, a HCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 2, e a HCDR3 tem uma sequência amino selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

[0015] A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação an- tigênica do mesmo em que LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 têm sequências de aminoácidos selecionadas entre o grupo consistindo em: (i) LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 6, LCDR3 é SEQ ID NO: 7, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HCDR3 é SEQ ID NO: 3, (ii) LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 8, LCDR3 é SEQ ID NO: 7, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HCDR3 é SEQ ID NO: 4, (iii) LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 6, LCDR3 é SEQ ID NO: 9, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HCDR3 é SEQ ID NO: 3, (iv) LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 10, LCDR3 é SEQ ID NO: 9, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HCDR3 é SEQ ID NO: 3

[0016] A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo em que a LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e a HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

[0017] A presente invenção preferencialmente proporciona um an ticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação an- tigênica do mesmo em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, e SEQ ID NO: 16.

[0018] A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação an- tigênica do mesmo, em que a HCVR compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

[0019] A presente invenção preferencialmente proporciona um an ticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação an- tigênica do mesmo, em que a LCVR e a HCVR compreendem sequências de aminoácidos selecionadas entre o grupo consistindo em: (i) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 13 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (ii) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (iii) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 15 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (iv) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 16 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0020] A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação an- tigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0021] A presente invenção preferencialmente proporciona um an ticorpo manipulado contra DKK-1 humano em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano compreende uma cadeia leve em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, e SEQ ID NO: 22.

[0022] A presente invenção preferencialmente proporciona um an ticorpo manipulado contra DKK-1 humano, em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano compreende uma cadeia pesada em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18.

[0023] Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano, em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada e uma de cadeia leve selecionadas entre o grupo consistindo em (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (iii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iv) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[0024] A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

[0025] A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

[0026] A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

[0027] A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[0028] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, o qual compete com o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação an- tigênica do mesmo da presente invenção para ligação a DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29) conforme determinado através de uma prova de competição de anticorpo.

[0029] A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0030] Além disso, a presente invenção proporciona uma compo sição farmacêutica compreendendo o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção junto com um veículo, diluente, ou excipiente farma- ceuticamente aceitável e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.

[0031] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de curar osso compreendendo administrar um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção.

[0032] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de tratar câncer compreendendo administrar um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção, em que o câncer é preferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

[0033] Além disso, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção para aplicação em terapia. Preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção para aplicação no tratamento para curar osso ou no tratamento de câncer, em que o câncer é preferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

[0034] Além disso, a presente invenção também proporciona a aplicação de um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção na fabricação de um medicamento para terapia, curar osso ou para tratar câncer, em que o câncer é preferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

Definições

[0035] Um anticorpo de comprimento total conforme existe naturalmente é uma molécula de imunoglobulina compreendendo 2 cadeias pesadas (H) e 2 cadeias leves (L) interconectadas por ligações dis- sulfeto. A porção terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 aminoácidos essencialmente responsá-veis por reconhecimento antigênico através das regiões determinantes de complementariedade (CDRs) contidas nas mesmas. A porção terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante essencialmente responsável por função efetora.

[0036] As CDRs são intercaladas com regiões que são mais con- servadas, denominadas regiões de framework (“FR”). Cada região variável de cadeia leve (LCVR) e região variável de cadeia pesada (HCVR) é composta de 3 CDRs e 4 FRs, dispostas do término amino para o término carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As 3 CDRs da cadeia leve são referidas como “LCDR1, LCDR2, e LCDR3” e as 3 CDRs da cadeia pesada são referi-das como “HCDR1, HCDR2, e HCDR3.” As CDRs contêm a maioria dos resíduos os quais formam interações específicas com o antígeno. A numeração e o posicionamento de resíduos aminoácidos de CDR dentro das regiões LCVR e HCVR estão de acordo com a convenção de numeração de Kabat de conhecimento geral.

[0037] Cadeias leves são classificadas como kappa ou lâmbda, e são caracterizadas por uma região constante em particular conforme é de conhecimento na técnica. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, e definem o isotipo de um anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD, ou IgE, respectivamente. Anticorpos de IgG podem ser adicionalmente divididos em subclasses, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma região constante em particular com uma sequência de conhecimento geral na técnica.

[0038] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo “anticorpo monoclonal” (Mab) se refere a um anticorpo que é derivado de uma única cópia ou clone inclusive, por exemplo, qualquer clone eucariótico, procariótico, ou de fago, e não o método pelo qual é produzido. Mabs da presente invenção preferencialmente existem em uma população homogênea ou substancialmente homogênea. Mabs completos contêm 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves. “Fragmentos de ligação antigênica” de semelhantes anticorpos monoclonais incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, e fragmentos Fv de cadeia única. Anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos da presente invenção podem ser produzidos, por exemplo, por tecnologias recombinantes, tecnologias de display de fago, tecnologias sintéticas, por exemplo, enxerto de CDR, ou combinações de semelhantes tecnologias, ou ou-tras tecnologias conhecidas na técnica. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com DKK-1 humano ou fragmentos dos mesmos, os anticorpos resultantes podem ser recuperados e purificados, e a determinação de se eles possuem propriedades de ligação e funcionais similares a ou as mesmas que os compostos dos anticorpos revelados aqui, neste requerimento de patente, pode ser avaliada pelos métodos revelados nos Exemplos abaixo. Fragmentos de ligação an- tigênica também podem ser preparados por métodos convencionais. Métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmentos de ligação antigênica são de conhecimento geral na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, capítulos 5-8 e 15, ISBN 0-87969-314-2.

[0039] A expressão “anticorpo quimérico” se refere a um anticorpo contendo domínios de diferentes espécies (geralmente 2 espécies). O anticorpo V é um anticorpo quimérico em que os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada contêm resíduos de um anticorpo mu- rino, enquanto o domínio de cadeia leve de região constante contém resíduos compreendendo uma cadeia leve kappa de rato e os domínios de cadeia pesada de região constante contém resíduos compreendendo um anticorpo IgG1 de rato. O Anticorpo V é uma quimera murina/ de rato e é usado em estudos para reduzir a probabilidade de reação imune em modelos pré-clinicos de longo termo.

[0040] A expressão “anticorpos manipulados humanos” se refere a anticorpos monoclonais que têm propriedades de ligação e funcionais de acordo com a invenção, e que têm regiões de framework que são substancialmente humanas ou plenamente humanas em torno de CDRs derivadas de um anticorpo não humano. “Fragmentos de ligação antigênica” de semelhantes anticorpos manipulados humanos incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, e fragmentos Fv de cadeia única. “Região de framework” ou “sequência de framework” se refere a qualquer uma das regiões do framework 1 a 4. Anticorpos manipulados humanos e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos englobados pela presente invenção incluem moléculas em que qualquer uma ou mais das regiões de framework 1 a 4 é substancialmente ou plenamente humana, isto é, em que está presente qualquer uma das possíveis combinações de regiões de framework 1 a substancialmente ou plenamente humanas 4 individuais. Por exemplo, isto inclui moléculas nas quais a região de framework 1 e a região de framework 2, a região de framework 1 e a região de framework 3, a região de framework 1, 2, e 3, etc., são substancialmente ou plenamente humanas. Frameworks substancialmente humanos são aqueles que têm no mínimo cerca de 80% de identidade de sequência com uma sequência de framework da linhagem germina- tiva (germline) humana conhecida. Preferencialmente, os frameworks substancialmente humanos têm no mínimo cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99% de identidade de sequência com uma sequência de framework da linhagem germinativa humana conhecida.

[0041] Frameworks plenamente humanos são aqueles que são idênticos a uma sequência de framework da linhagem germinativa humana conhecida. Sequências da linhagem germinativa de framework humana podem ser obtidas na ImMunoGeneTics (IMGT) através de seu website http://imgt.cines.fr, ou no The Immunoglobulin FactsBook de Marie-Paule Lefranc e Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por exemplo, frameworks de cadeia leve da linha- gem germinativa podem ser selecionados entre o grupo consistindo em: Al1, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2, e O8, e regiões de framework de cadeia pesada da linhagem germinativa podem ser selecionadas entre o grupo consistindo em: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, e VH5-5I.

[0042] Anticorpos manipulados humanos além daqueles revelados aqui, neste requerimento de patente, apresentando propriedades funcionais similares de acordo com a presente invenção podem ser gerados usando vários métodos diferentes. Os compostos dos anticorpos específicos revelados aqui, neste requerimento de patente, podem ser usados como modelos ou compostos dos anticorpos de origem para preparar compostos dos anticorpos adicionais. Em uma abordagem, as CDRs de compostos dos anticorpos de origem são enxertadas em um framework humano que tem uma elevada identidade de sequência com o framework do composto do anticorpo de origem. A identidade de sequência do novo framework geralmente será no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, ou no mínimo cerca de 99% idêntica à sequência do framework correspondente no composto do anticorpo de origem. Esta enxertação pode resultar em uma redução na afinidade de ligação em comparação com a do anticorpo de origem. Se for este o caso, o framework pode ser retromutado para o framework de origem em determinadas posições com base em critérios específicos revelados por Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Referências adicionais descrevendo métodos úteis em humanização de anticorpos de camundongo incluem as Patentes U.S. Nos. 4.816.397; 5.225.539, e 5.693.761; os programas de computação ABMOD e ENCAD conforme descrito em Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620; e o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; e Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536.

[0043] A identificação de resíduos a considerar para retromutação pode ser realizada como se segue:

[0044] Quando um aminoácido se encaixa sob a seguinte catego ria, o aminoácido de framework da sequência da linhagem germinativa humana que está sendo usada (o “framework aceitador”) é substituído por um aminoácido de framework de um framework do composto do anticorpo de origem (o “framework doador”): (a) o aminoácido na região de framework humana do framework aceitador é incomum para frameworks humanos naquela posição, ao passo que o aminoácido correspondente na imunoglobulina do doador é típico para frameworks humanos naquela posição; (b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDRs; ou (c) qualquer átomo de cadeia lateral de um aminoácido de framework está dentro de cerca de 5-6 ângstroms (centro-a-centro) de qualquer átomo de um aminoácido da CDR em um modelo de imuno- globulina tridimensional.

[0045] Quando cada um dos aminoácidos na região de framework humana do framework aceitador e um aminoácido correspondente no framework doador é geralmente incomum para frameworks humanos naquela posição, o aminoácido referido pode ser substituído por um aminoácido típico para frameworks humanos naquela posição. Este critério de retromutação permite que se recupere a atividade do composto do anticorpo de origem.

[0046] Outra abordagem para gerar anticorpos manipulados humanos apresentando propriedades funcionais similares aos compostos dos anticorpos revelados aqui, neste requerimento de patente, envolve mutar aleatoriamente aminoácidos dentro das CDRs enxertadas sem alterar o framework, e triar as moléculas resultantes para afinidade de ligação e outras propriedades funcionais que são tão boas quanto ou melhores do que as dos compostos dos anticorpos de origem. Além disso, mutações únicas podem ser introduzidas em cada posição de aminoácido dentro de cada CDR, seguidas por avaliação dos efeitos de semelhantes mutações sobre a afinidade de ligação e outras propriedades funcionais. Mutações únicas produzindo propriedades aprimoradas podem ser combinadas para avaliar seus efeitos em combinação umas com as outras.

[0047] Adicionalmente, é possível uma combinação de ambas as abordagens precedentes. Depois de enxertação de CDR, pode-se re- tromutar regiões de framework específicas além de introduzir alterações de aminoácidos nas CDRs. Esta metodologia é descrita em Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

[0048] Aplicando os ensinamentos da presente invenção, uma pessoa versada na técnica pode usar técnicas comuns, por exemplo, mutagênese direcionada por sítio, para substituir aminoácidos dentro das sequências de framework e CDR presentemente reveladas e portanto gerar sequências de aminoácidos de regiões variáveis adicionais derivadas das presentes sequências. Todos os aminoácidos alternativos que ocorrem naturalmente podem ser introduzidos em um sítio de substituição específico. Os métodos revelados aqui, neste requerimento de patente, podem ser então usados para triar estas sequências de aminoácidos de regiões variáveis adicionais para identificar sequências tendo as funções indicadas in vivo. Deste modo, podem ser identificadas sequências adicionais adequadas para preparar anticorpos manipulados humanos e porções de ligação antigênica dos mesmos de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, substituição de aminoácido dentro dos frameworks é restrita a uma, duas, ou três posições dentro de qualquer uma ou mais das 4 regiões de framework de cadeia leve e/ou de cadeia pesada reveladas aqui, neste requerimento de patente. Preferencialmente, substituição de aminoácido dentro das CDRs é restrita a uma, duas, ou três posições dentro de qualquer uma ou mais das 3 CDRs de cadeia leve e/ou de cadeia pesada. Também são possíveis combinações das várias alterações dentro destas regiões de framework e CDRs descritas acima. O mais preferencialmente, estas técnicas são usadas para gerar sequências de aminoácidos de regiões variáveis adicionais usando as sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve variáveis descritas na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14 respectivamente.

[0049] Anticorpos manipulados humanos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos que “competem” com as moléculas reveladas aqui, neste requerimento de patente, são aqueles que ligam DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29) em um ou mais sítios que são idênticos a, ou se sobrepõem a, o um ou mais sítios nos quais as presentes moléculas ligam. Anticorpos manipulados humanos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos competitivos podem ser identificados, por exemplo, através de uma prova de competição de anticorpo. Por exemplo, uma amostra de DKK-1 humano purificado ou parcialmente purificado (SEQ ID NO: 29) é ligada a um suporte sólido. Um anticorpo revelado aqui, neste requerimento de patente, e um anticorpo monoclonal de teste ou fragmento de ligação antigênica, com quer o teste ou o anticorpo da presente invenção etiquetado, são em seguida adicionados. Se o anticorpo etiquetado e o anticorpo não etiquetado ligam a sítios separados e distintos sobre DKK-1, o anticorpo etiquetado ligará no mesmo nível se ou não o anticorpo competitivo suspeito estiver presente. No entanto, se os sítios de interação são idênticos ou se sobrepõem, o anticorpo não etiquetado competirá, e a quantidade de anticorpo etiquetado ligado ao antígeno será reduzida. Se o anticorpo não etiquetado estiver presente em excesso, nenhum anticorpo não etiquetado ligará. Para os fins da presente invenção, anticorpos manipulados humanos competitivos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos são aqueles que reduzem a ligação dos presentes anticorpos a DKK-1 por cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99%. Detalhes de procedimentos para realizar semelhantes provas de competição são de conhecimento geral na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, às páginas 567-569, ISBN 0-87969-314-2. As provas referidas podem ser tornadas quantitativas usando anticorpos purificados. Uma curva padrão é estabelecida titulando um anticorpo contra uma versão etiquetada do mesmo. A capacidade de um anticorpo monoclonal competitivo não etiquetado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo para inibir a ligação da molécula etiquetada à lâmina é titulada. Os resultados são plotados, e as concentrações necessárias para obter o grau desejado de inibição de ligação são comparadas. Se anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos que competem com anticorpos manipulados humanos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos da presente invenção em semelhantes provas de competição possuem as mesmas propriedades funcionais ou similares dos presentes anticorpos manipulados humanos pode ser determinado através dos métodos revelados nos Exemplos aqui, neste requerimento de patente.

[0050] O termo “inibir” significa a capacidade para substancialmen te antagonizar, impedir, prevenir, refrear, retardar, romper, eliminar, parar, reduzir, ou reverter os efeitos biológicos de DKK-1.

[0051] O termo “tratar” (ou “tratar” ou “tratamento”) se refere a pro cessos envolvendo um retardamento, interrupção, suspensão, contro- le, parada, redução, ou reversão da progressão ou gravidade de um sintoma, distúrbio, condição, ou doença, mas não envolvem necessariamente uma eliminação total de todos os sintomas, condições, ou distúrbios relacionados com a doença associados com atividade de DKK-1.

[0052] O termo “prevenir” (ou “evitar” ou “prevenção”) significa impedir, restringir, ou inibir a incidência ou ocorrência de um sintoma, distúrbio, condição, ou doença. Eventos agudos e condições crônicas podem ser tratados e prevenidos. Em um evento agudo, um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo é administrado no início de um sintoma, distúrbio, condição, ou doença, e é descontinuado quando o evento agudo termina. Em contraste, um sintoma, distúrbio, condição, ou doença crônicos é tratado durante um período de tempo mais prolongado.

[0053] O termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade ou dose de um composto do anticorpo da presente invenção o qual, na administração de dose única ou múltipla a um paciente, proporciona o tratamento ou prevenção desejados. Quantidades terapeuticamente eficazes dos compostos dos anticorpos presentes podem compreender uma quantidade na faixa de a partir de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg por dose única. Uma quantidade terapeuticamente eficaz para qualquer paciente individual pode ser determinada pelo responsável pelo tratamento monitorando o efeito dos compostos dos anticorpos em um biomarcador.

[0054] O termo “cura de osso” se refere à estimulação da formação de osso em sítios de lesão por bloqueio de DKK-1. Exemplos de indicações de cura de osso incluem, mas não estão limitados a, cura de fratura, fixação/ retenção de implante, e fixação/ retenção de implante dentário.

[0055] Os anticorpos manipulados humanos da presente invenção podem ser usados como medicamentos em medicina humana, administrados por uma variedade de vias. O mais preferencialmente, as composições referidas são para administração parenteral. As composições farmacêuticas referidas podem ser preparadas por métodos de conhecimento geral na técnica (Vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) e compreendem um anticorpo manipulado humano conforme revelado aqui, neste requerimento de patente, e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0056] Os resultados dos seguintes testes demonstram que os anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos, da presente invenção são úteis como um inibidor de DKK-1. Os anticorpos da presente invenção possuem uma série de propriedades desejáveis. Por exemplo, o anticorpo II da presente invenção tem aumentadas estabilidade química e física, e solubilidade. Estudos acelerados são realizados para avaliar a estabilidade química de anticorpos incubando os anticorpos da presente invenção sob diferentes condições tampão (variação de pH e de NaCl) e incubando a 4°C, 25°C, e 40°C por 4 semanas. Modificações químicas dos anticorpos da presente invenção são detectadas por cromatografia de permuta de cátion (“CEX”) para separar variantes de carga (por exemplo, desamidação de asparagina para ácido aspártico) e análise por LC-MS para identificar sítios específicos de degradação. O Anticorpo II tem a menor quantidade de degradação detectada por CEX e este resultado é adicionalmente confirmado por dados de LC-MS mostrando que todos os três resíduos asparagina nas CDRs tiveram a menor quantidade de desamidação comparados com os outros anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente, depois de incubação por 4 semanas a 40°C em tampão de pH 8. A solubilidade para o Anticorpo II é mais favorável comparado com o Anticorpo I quando formulado em pH 6 + 150 mM de NaCl. Além disso, o Anticorpo II manteve solubilidade de >105 mg/mL quando armazenado em 4°C, ao passo que a solubilidade para o Anticorpo I é de somente 48 mg/mL e precipitou sob as mesmas condições. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “EC50” se refere à concentração de um agente o qual produz 50% da resposta máxima possível para aquele agente. “Kd” se refere à constante de dissociação de equilíbrio a qual pode ser calculada pela fórmula: koff /kon = Kd.

Exemplo 1-Produção de Anticorpos

[0057] Os Anticorpos I, II, III, e IV podem ser produzidos e purifi cados como se segue. Uma célula hospedeira apropriada, tal como HEK 293 EBNA ou CHO, é quer transitoriamente ou estavelmente transfectada com um sistema de expressão para secretar anticorpos usando uma proporção ótima predeterminada de vetor HC:LC ou um único sistema vetorial codificando tanto HC, tal como SEQ ID NO: 23, ou SEQ ID NO: 24, quanto LC, tal como SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28. Meio clarificado, no qual o anticorpo foi secretado, é purificado usando quaisquer de muitas técnicas comumente usadas. Por exemplo, o meio pode ser convenientemente aplicado a uma coluna de Proteína A ou G Sepharose FF que tenha sido equilibrada com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna é lavada para remover componentes de ligação inespecífica. O anticorpo ligado é elutriado, por exemplo, por gradiente de pH (tal como 0,1 M de tampão de fosfato de sódio pH 6,8 a 0,1 M de tampão de citrato de sódio pH 3,0). São detectadas frações de anticorpos, tal como por SDS-PAGE, e em seguida são reunidas. Purificação adicional é opcional, dependendo da aplicação pretendida. O anticorpo pode ser concentrado e/ou filtrado estéril usando técnicas comuns. Agregado solúvel e multímeros podem ser removidos de modo eficaz por técnicas comuns, inclusive cromatografia de exclusão de tamanho, de interação hidrofóbica, de permuta iônica, ou em hidroxiapatita. A pureza do anticorpo depois destas etapas de cromatografia é maior do que 99%. O produto pode ser congelado imediatamente a -70°C ou pode ser liofilizado. As se-quências de aminoácidos para estes anticorpos são proporcionadas abaixo.

Exemplo 2: Medições da afinidade (Kd) para anticorpos contra DKK-1

[0058] Para estabelecer um equilíbrio de ligação, uma concentração constante de anticorpo é misturada com concentrações variáveis de DKK-1 com etiqueta de His (His-tagged) (SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33) (faixa de 1 nM a 1 pM) em PBS (pH 7,4) + 1 mg/mL albumina sérica bovina (“BSA”) ou tampão isolado e incubada por vários dias a 37°C. São estabelecidas duas séries de reações de ligação, uma série em baixa concentração de anticorpo (3 pM) e uma série em concentração elevada de anticorpo (30 ou 50 pM).

[0059] Depois de estabelecer equilíbrio, um instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) é usado para sonda para fração de anticorpo ‘livre’ (não ligado). Em resumo, DKK-1 com etiqueta de His é ligado de modo covalente a contas de Sepharose 4 Fast Flow ativadas com NHS (GE Healthcare) as quais são comprimidas pelo instrumento para criar uma coluna pequena. As misturas pré-equilibradas de anticorpo + DKK-1 com etiqueta de His são passadas sobre as contas para capturar somente anticorpo livre. A quantidade de anticorpo livre capturado é proporcional à concentração livre nas amostras equilibradas, e é detectada por injeção de um anticorpo secundário com etiqueta fluorescente. Séries de dados de concentrações baixas e elevadas de anticorpo são ajustadas globalmente usando análise de curva-n no software KinExA. Este ajuste retorna um valor de Kd bem como o intervalo de confiança de 95%.Tabela 1: Afinidade de Anticorpo II para DKK-1 de várias espécies

Exemplo 3: Prova do efeito de anticorpos contra Dkk-1 em fosfa- tase alcalina C2C12

[0060] Sinalização de Wnt canônica é importante para diferenciação e atividade dos osteoblastos. Wnt-3a CM (Condicioned Media) combinado com BMP-4 induz células C2C12 de camundongo pluripo- tentes a diferenciar em osteoblastos com um desfecho mensurável de fosfatase alcalina (“AP”), um marcador da atividade dos osteoblastos. DKK-1, um inibidor da sinalização de Wnt canônica, inibe a diferenciação e produção de fosfatase alcalina. Anticorpos contra DKK-1 neutra- lizantes previnem a inibição de fosfatase alcalina mediada por DKK-1. Anticorpos os quais bloqueiam a atividade inibitória de DKK-1 previnem a perda da atividade de fosfatase alcalina.

[0061] Células C2C12 são cultivadas até 60% a 80% de confluência em frascos de cultura de tecido em meio de crescimento (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (“DMEM”) contendo L-glutamina, 10% de soro bovino fetal inativado por calor (“FBS”), 1x antibiótico/ antimi- cótico, 1x piruvato de sódio). Células C2C12 são ressuspendidas até uma concentração de 30.000 células/mL em meio de crescimento e 100 μL/ poço são adicionados a uma lâmina de cultura de tecido de 96 poços e incubadas de um dia para o outro a 37oC, 95% de umidade, 5% de CO2. O meio de crescimento é substituído com 50 μL de meio de teste (DMEM contendo L-glutamina, 5% de FBS inativado por calor, 1x antibiótico/ antimicótico, 1x piruvato de sódio). Para estimular diferenciação (e deste modo induzir a produção de fosfatase alcalina), 100 μL de meio de teste mais 1,5x Wnt-3a CM + BMP-4 (R & D Systems catalogue no. 314-BP) são adicionados. Isto produz uma concentração final de 1x Wnt-3a CM e 25 ng/mL de BMP-4. Controles negativos contêm somente L-cell CM (nenhum Wnt-3a ou BMP-4). As células são incubados a 37oC, 95% de umidade, 5% de CO2 por 72 horas. O meio é removido, as células são lavadas com 200 μL de solução salina tamponada com fosfato (“PBS”), e a PBS é removida. As células são congeladas-degeladas 3 vezes. 100 μL de substrato One-step pNPP (Thermo Scientific catalogue no. 37621) são adicionados por poço, e a lâmina é incubada em temperatura ambiente. A absorvência é lida a 405 nm. Para determinar a concentração de DKK-1 requerida para inibir diferenciação, moléculas de Dkk-1 de várias espécies são tituladas para identificar a concentração mínima requerida para inibir plenamente a indução de fosfatase alcalina.

[0062] A concentração mínima de DKK-1 de cada espécie a qual inibe plenamente a indução de fosfatase alcalina é como se segue: DKK-1 humano = 38 nM, DKK-1 de cynomolgus = 11,4 nM, DKK-1 de rato = 5,8 nM, e DKK-1 de coelho = 25,0 nM.

[0063] Tendo determinado a concentração de DKK-1 a qual inibe plenamente a indução de fosfatase alcalina, concentrações crescentes de um anticorpo anti-DKK-1 são pré-incubadas em meio de prova com uma concentração inibitória de Dkk-1 por 30 minutos em temperatura ambiente. A indução de fosfatase alcalina é determinada conforme descrito acima. Os resultados são reportados como uma EC50 (nM ± erro padrão).

[0064] O Anticorpo II bloqueia a inibição de C2C12 AP mediada por Dkk-1. Para o DKK-1 de várias espécies, as EC50’s (dadas como nM ± erro padrão) são como se segue: humana = 9,8 ± 0,41, cynomo- lgus = 6,4 ± 0,25, rato = 2,9 ± 0,25, e coelho = 6,0 ± 0,32.

Exemplo 4: Prova de defeito cortical (CD) in vivo

[0065] Ratos fêmeas Sprague-Dawley de seis semanas de idade são ovariectomizados e deixados para perder osso por dois meses. Defeitos de 2 mm de diâmetro são introduzidos no fêmur esquerdo e no fêmur direito com uma furadeira elétrica com uma broca dental de 2 mm. Este furo se estende através tanto do córtice anterior quanto do córtice posterior. A cura do osso é monitorada longitudinalmente avaliando a densidade da massa óssea (“BMD”) através da aplicação de tomografia computadorizada quantitativa (“qCT”) por 35 dias depois da cirurgia. Ao final do experimento, os animais são sacrificados e os fêmures inteiros são submetidos a determinações de teste de resistência (loaded-to-failure) para determinar a resistência biomecânica da diáfise inteira. Anticorpos são administrados por via subcutânea em doses e intervalos conforme indicado.

[0066] O Anticorpo II é dosado como se segue: 5 mg/kg uma vez a cada duas semanas iniciando um dia depois da cirurgia (Grupo 1), 1 mg/kg (Grupo 2), 5 mg/kg (Grupo 3), ou 15 mg/kg (Grupo 4) são admi- nistrados uma vez a cada duas semanas iniciando nove dias depois da cirurgia. A densidade da massa óssea é avaliada por tomografia computadorizada quantitativa no dia 35. O Grupo 1 apresentou um aumento estatisticamente significativo na densidade da massa óssea tanto nos córtices anterior quanto posterior. O Grupo 4 apresentou um aumento estatisticamente significativo na densidade da massa óssea em ambos os córtices, embora os Grupos 2 e 3 tenham apresentado um aumento não significativo na densidade da massa óssea.

Exemplo 5: Prova de eficácia em câncer in vivo

[0067] Camundongos (camundongos fêmeas C.B-17, modelo imu-nodeficiente combinado Fox Chase grave no. CB17SC-M) são aclimatados por uma semana em uma instalação animal antes da iniciação do experimento. Depois da aclimatação, os camundongos são randomiza- dos em grupos de 10 por tratamento. Células de carcinoma pulmonar de células não pequenas A549 humanas cultivadas são implantadas por via subcutânea no flanco posterior dos camundongos e os tumores são deixados para atingir um volume tumoral médio ~ 100 mm3. O Anticorpo II (1 mg/kg e 5 mg/kg), anticorpo IgG controle (1 mg/kg e 5 mg/kg), ou veículo (solução salina tamponada com citrato suplementada com 0,02% de Tween 80) é administrado através de injeção subcutânea. Os animais recebem 2 tratamentos separados por 7 dias.

[0068] Os tumores são medidos 2 vezes por semana por calibra dores eletrônicos para plotar curvas de crescimento. Os animais também são monitorados duas vezes por semana para flutuações no peso corporal e sinais de toxicidade. Medições do volume tumoral mostradas na tabela 3 são tomadas no dia 29.

[0069] Conforme mostrado na Tabela 2, grupos de tratamento recebendo o Anticorpo II, demonstraram significativa inibição do crescimento de xenoenxertos pulmonares de células não pequenas A549 humanos in vivo. Tabela 2: Eficácia do Anticorpo II em modelo de xenoenxerto de carcinoma pulmonar de células não pequenas humano A549

Exemplo 6: Prova de renormalização angiogênica de xenoenxerto in vivo

[0070] Para entender o mecanismo da eficácia antitumoral, análise de estudo por imagens de alto conteúdo (high content imaging) é realizada sobre tumores A549 tratados com o Anticorpo II ou IgG controle. Vários marcadores de base fenotípica são analisados tanto quantitativamente e qualitativamente para avaliar os processos biológicos relevantes para o câncer de angiogênese (CD31 e actina dos músculos lisos, SMA), indução de hipóxia (transportador de Glicose 1, GLUT1), proliferação celular (Ki67), e apoptose (Terminal UDP Nick-End Labeling, TUNEL).

[0071] Camundongos fêmeas C.B-17 (Fox Chase SCID) modelo no. CB17SC-M com idades de 7 a 8 semanas são aclimatados por uma semana e deixados para se alimentar ad libitum em uma dieta de baixo teor de gordura normal (4,5%), a qual é continuada pela duração do estudo.

[0072] Células A549 de origem da ATCC são cultivadas e divididas em meios F-12 de Kaighn (InVitrogen no. 21127) suplementados com 10% de FBS (InVitrogen no. 0, e 100x diluições de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e pen-strep (Invitrogen no. 11360, no. 11140 e no. 15140 respectivamente). Elas são destacadas e prepara-das em uma concentração final de 50x106 células/ml em PBS na pas- sagem 19 com 95% de viabilidade.

[0073] 5x106 células de carcinoma pulmonar humano A549 são injetadas por via subcutânea no flanco dos camundongos em questão em uma mistura a 1:1 de PBS e Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA). São realizadas medições do tumor e peso corporal duas vezes por semana. Antes do tratamento, os camundongos são randomizados com base no tamanho do tumor usando um algoritmo de randomiza- ção.

[0074] Iniciando quando os tumores atingiram 200 mm3, os camundongos randomizados são separados em 2 grupos de 10 animais e dosados por via subcutânea no dia 1 e novamente no dia 8 com 5 mg/kg de quer o Anticorpo II ou o controle de IgG4. O estudo é terminado 10 dias depois da administração da primeira dose de anticorpo.

[0075] O Anticorpo II é preparado em Solução Salina Tamponada com Citrato (CBS) (10 mM de citrato pH 6, 150 mM de NaCl e 0,2% de polissorbato). O controle de IgG4 é proporcionado a 6,0 mg/ml em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS).

[0076] Tumores de xenoenxerto são excisados dos camundongos depois de 17 dias de dosagem e colocados em fixador Zinco-Tris (BD Pharmingen). Os tumores fixados são processados, bloqueados em parafina, e seccionados como cortes de 3 μM sobre lâminas de microscópio de rotina. As lâminas são cozidas a 15,56 °C (60 °F) por 1 hora e em seguida desparafinizadas em xileno (4 tratamentos, 10 minutos cada). As lâminas são reidratadas através de uma série de imersões em etanol/ água com lavagens finais em solução salina Tris- tamponada /Tween (TBST). As lâminas são em seguida bloqueadas com Protein Block (DAKO) por 30 minutos. Para o Painel de Saúde Tumoral, as lâminas são coradas com uma combinação de Hoechst 33324 (Invitrogen), CD31 de rato anti-humano (Pharmingen)/ Alexa- 488 antirrato (Invitrogen), anti-Ki67 de coelho (NeoMarkers)/ Alexa 647 anticoelho (Invitrogen), e vermelho TUNEL-TMR (diluído a 1:5 em tampão de diluição TUNEL; Roche). Para o Painel de Angiogênese, as lâminas são coradas com uma combinação de Hoechst 33324 (Invitro- gen), CD31 de rato anti-humano (Pharmingen)/antirrato Alexa-488 (In- vitrogen), anti-GLUT1 de coelho (Chemicon)/ Alexa 647 anticoelho (In- vitrogen), e antiActina dos Músculos Lisos de camundongo /Cy3 (Sigma). As lâminas são estudadas por imagens usando um citômetro de varredura a laser iCys Laser Scanning Cytometer (CompuCyte) e uma estação de trabalho digital Marianas Digital Imaging Workstation configurada com um microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M (Intelligent Imaging Innovations). Comparações de dados quantitativos de grupos de tratamento são realizadas usando a análise de Dunnet em software estatístico JMP (SAS).

[0077] Conforme mostrado na Tabela 3, xenoenxertos A549 de animais tratados com IgG controle são modestamente vascularizados, têm níveis moderados de miofibroblastos e muitras áreas focalizadas de hipóxia. Tumores tratados com IgG controle têm uma rede estendida de vasos consistindo tanto de brotos vasculares neoangiogênicos quanto de vasos maduros que são pobremente cobertos por pericitos. Tumores tratados com IgG controle têm áreas hipóxicas (marcadas por GLUT1) que são claramente zonas demarcadas a alguma distância de vasos perfundidos e áreas necróticas que estão ainda mais longe dos vasos. Tratamento com o Anticorpo II resulta em reduzida área de vasos, reduzida área de pericito, e reduzida cobertura por pericitos dos vasos. No entanto, este tratamento não resultou em uma diferença significativa em hipóxia tumoral. Qualitativamente, a vasculatura do tumor tratado com o Anticorpo II parece consistir em vasos menores e menos reticulados e com menos cobertura por pericitos comparado com o grupo tratado com IgG controle.

[0078] Conforme mostrado na Tabela 3, tumores tratados com IgG têm células tumorais proliferativas distribuídas uniformemente por toda parte, mas também apresentam frequentemente uma ou mais grandes áreas de necrose que são avasculares. Tratamento com o Anticorpo II resulta em nenhuma modificação na apoptose e somente uma redução ligeira, não significativa na área de proliferação total. No entanto, há uma profunda redução na percentagem de área de células Ki67 de intensidade elevada nos tumores tratados com o Anticorpo II, a qual pode indicar uma quantidade reduzida de células na fase do ciclo celular G2.Tabela 3: Prova de anticorpo II em renormalização angiogênica de xenoenxerto in vivo

Exemplo 7: Prova de eficácia óssea in vivo

[0079] Para avaliar a capacidade do Anticorpo V (Cadeia leve SEQ ID NO: 34 e Cadeia pesada SEQ ID NO: 35) acelerar a formação de osso peri-implante e regenerar tecido ósseo, são utilizados ratos Sprague-Dawley machos de quatro meses de idade (Harlan Sprague Dawley Inc) pesando cerca de 425 gramas. Os ratos são implantados cirurgicamente com parafuso de titânio (2 mm x 4mm) em ambas as pernas na face lateral média (media lateral side) logo acima da junção tibial-fibular. Em seguida os ratos são aleatoriamente divididos em 2 grupos de acordo com o peso corporal e recebem quer 10 mg/kg do Anticorpo V ou 10 mg/kg de controle de IgG por injeção por via subcutânea uma vez por semana iniciando no mesmo dia da cirurgia por 21 dias. Tomografia computadorizada quantitativa (scanner de CT Aloka LaTheta modelo LTC-100) é usada para escanear e quantificar ex vivo o osso recém-formado com uma medida de voxel de 60 μm. O Volume de interesse (VOI) é definido como 28 cortes em intervalo de 0,1 mm sobre o sítio do implante prévio. Diferenças entre os grupos são avaliadas com o software JMP versão 5.1. (Cary, North Carolina), comparação contra controle de IgG usando o Método de Dunnett com um nível de significância de P<0,05. Avaliação qualitativamente por imagens de raios-x faxitron ex vivo indica que os ratos tratados com o Anticorpo V têm mais osso novo ou calo em torno do implante. Análises por CT quantitativa revelam um aumento estatisticamente significativo do teor de mineral do osso peri-implante cortical (14%), da área óssea nova (16%), da espessura cortical (7%) e do teor de mineral do osso novo peri-implante esponjoso da medula óssea (18%), e da área óssea (16%) em ratos tratados com o Anticorpo V quando comparado com controle de IgG. Os dados demonstram que o Anticorpo V estimula formação óssea nova e acelera a regeneração do tecido ósseo em ratos implantados com titânio.Tabela 4: Análises Micro-CT de Formação de Osso Novo Peri-implante

Dados são apresentados como Média ± SE. *, p<0,05, vs controle de IgG, teste de JMP Dunnett. Listagem de SEQ ID CDRs de cadeia pesada SEQ ID NO: 1 GFTFSSYTMS SEQ ID NO: 2 TISGGGFGTYYPDSVKG SEQ ID NO: 3 PGYHNYYFDI SEQ ID NO: 4 PGYNNYYFDI CDRs de cadeia leve Regiões variáveis de cadeia pesada SEQ ID NO: 11 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGL EWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARPGYHNYYFDIWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGL EWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARPGYNNYYFDIWGQGTTVTVSS Regiões variáveis de cadeia leve SEQ ID NO: 13 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWP LHFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 14 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYARQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPL HFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 15 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWP LHFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 16 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYARQSEQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWP LHFGGGTKVEIK Cadeias pesadas completas SEQ ID NO: 17 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGL EWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARPGYHNYYFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGL EWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARPGYNNYYFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG Cadeias leves completas SEQ ID NO: 19 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWP LHFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYARQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPL HFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 21 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWP LHFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 22 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYARQSEQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWP LHFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Sequências de Nucleotídeos - Regiões variáveis de cadeia pesada SEQ ID NO: 23 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCA GTAGCTATACCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGGTGGTGGTTTCGGCACATA CTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAA CGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGA GGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATCACAACTA CTACTTTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC AGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCT CCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTC AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGT CCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGAC CATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC AGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAA CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC TGGGT SEQ ID NO: 24 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCA GTAGCTATACCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGGTGGTGGTTTCGGCACATA CTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAA CGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGA GGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATAATAACTA CTACTTTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC AGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCT CCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTC AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGT CCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGAC CATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC AGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAA CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC TGGGT Sequências de Nucleotídeos - Regiões variáveis de cadeia leve SEQ ID NO: 25 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCA GGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAG CAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATTATGGCAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAG CCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCA TCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACA GAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTG GAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT TCAACAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO: 26 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCA GGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAG CAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATTATGCTAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAG CCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCA TCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACA GAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTG GAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT TCAACAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO: 27 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCA GGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAG CAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATTATGGCAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAG CCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCA TCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACA GAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTG GAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT TCAACAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO: 28 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCA GGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAG CAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATTATGCTAGACAGTCCGAGCAGGGCATCCCAG CCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCA TCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACA GAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTG GAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT TCAACAGGGGAGAGTGC DKK-1 Humana SEQ ID NO: 29 TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDN YQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRH AMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRR TTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEG QVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTC QRH DKK-1 de Cynomolgus SEQ ID NO: 30 TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDN YQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRH AMCCPGNYCKNGICVSSDQNNFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRR TTLSSKMYHSKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEG QVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTC QR DKK-1 de rato SEQ ID NO: 31 TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTL DNYQPYPCAEDEECGTDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKR CMRHAMCCPGNYCKNGICMPSDHSHLPRGEIEEGIIENLGNDHGAG DGYPRRTTLTSKIYHTKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKP VLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLACRIQKDHHQTSNSS RLHTCQRHAFIDYKDDDDKHV DKK-1 de coelho SEQ ID NO: 32 TLNSVLVNSNAIKNLPPPLGGANGHPGSAVSATPGILYEGGNKYLPLD NYQPYPCTEDEECGTDEYCASPARGGGAGVQICLACRKRRKRCMR HAMCCPGNYCKNGICMPSDHNHFHRGEIEETIVESFGNDHSTSDGY SRRTTLSSKMYHAKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVL KEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGDGLSCRLQNDQHEASNSSRL HTCQR DKK-1 de camundongo SEQ ID NO: 33 TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTL DNYQPYPCAEDEECGSDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKR CMTHAMCCPGNYCKNGICMPSDHSHFPRGEIEESIIENLGNDHNAAA GDGYPRRTTLTSKIYHTKGQEGSVCLRSSDCAAGLCCARHFWSKICK PVLKEGQVCTKHKRKGSHGLEIFQRCYCGEGLACRIQKDHHQASNS SRLHTCQRH Anticorpo V - Cadeia leve completa SEQ ID NO: 34 DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWP LNFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPR DISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLSKADYESH NLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC Anticorpo V - Cadeia pesada completa SEQ ID NO: 35 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLE WVATISGGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTAL YYCARPGYNNYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGTALKSN SMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSS VTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRNCGGDCKPCICTGS EVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISQDDPEVHFSWFVDDVE VHTAQTRPPEEQFNSTFRSVSELPILHQDWLNGRTFRCKVTSAAFPS PIEKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEEMTQNEVSITCMVKGFYPPDIY VEWQMNGQPQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKEKWQQGNTF TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK Anticorpo V - Região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 36 DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWP LNFGAGTKLELK Anticorpo V - Região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 37 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLE WVATISGGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTAL YYCARPGYNNYYFDYWGQGTTLTVSS Anticorpo V - CDRs de Cadeia Pesada SEQ ID NO: 38 TISGGGGNTYYPDSVKG SEQ ID NO: 39 PGYNNYYFDY Anticorpo V - CDRs de Cadeia Leve SEQ ID NO: 40 RASDSISGSLH SEQ ID NO: 41 YASQSIS SEQ ID NO: 42 QQSNSWPLN CDRs de Cadeia Pesada de Consenso TISGGGX1X2TYYPDSVKG PGYX3NYYFDI PGYX4NYYFDX5 CDRs de Cadeia Leve de Consenso X16 é H, N Região variável de cadeia pesada de consenso SEQ ID NO: 51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGL EWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARPGYX17NYYFDI WGQGTTVTVSS X17 é H, N Região variável de cadeia leve de consenso SEQ ID NO: 52 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLI YYX18RQS X19QGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQSX20SWPLHFGGGTKVEIK X18 é G, A X19 é I, E X20 é E, A

Claims (5)

1. Uso de um anticorpo manipulado humano contra DKK-1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende regiões de determinação de complementariedade (CDRs) LCDR1, LCDR2, e LCDR3 e a HCVR compreende CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que LCDR1 é a SEQ ID NO: 5, LCDR2 é a SEQ ID NO: 8 LCDR3 é a SEQ ID NO: 7, HCDR 1 é a SEQ ID NO: 1, HCDR2 é a SEQ ID NO: 2, e HCDR3 é a SEQ ID NO: 4.

2. Uso de um anticorpo manipulado humano contra DKK-1, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado entre mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

3. Uso de um anticorpo manipulado humano contra DKK-1, de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e a HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

4. Uso de um anticorpo manipulado humano contra DKK-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo manipulado humano contra DKK-1 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

5. Uso de um anticorpo manipulado humano contra DKK-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.