CN114945593A

CN114945593A - 抗IL-1β抗体

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Publication number: CN114945593A
Application number: CN202180009404.5A
Authority: CN
Inventors: W·L·霍布斯; A·D·斯科拉
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-08-26
Also published as: WO2021150486A1; TWI793503B; US20230057665A1; JP2023512481A; TW202140549A; JP7419544B2; EP4093766A1

Abstract

本公开提供了经工程化的人IL‑1β抗体、细胞和包含编码所述抗体的DNA的载体，以及用于产生所述抗体的方法。此外，本公开提供了经工程化的人IL‑1β抗体用于治疗炎性疾病诸如心血管疾病和癌症的用途。

Description

抗IL-1β抗体

本公开涉及医学领域。具体而言，本公开涉及结合人IL-1β(IL-1 beta或IL-1β或白介素-1β在本文中具有相同的含义)并且可用于治疗和/或预防炎性疾病的抗体，所述炎性疾病包括但不限于动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)、心力衰竭、癌症和罕见遗传性疾病(诸如导致IL-1β过度产生的遗传突变)。本公开还涉及治疗和/或预防这些炎性疾病的方法。

心血管疾病(CVD)是一类涉及心脏或血管的疾病。CVD的常见表现包括心绞痛、心肌梗塞(MI，通常称为心脏病发作)、中风、心力衰竭和心律不齐等等。由于该疾病的复杂性，已经确定出导致该疾病的起始和进展的很多风险因素。这些风险因素包括血脂异常、高血压、糖尿病、烟草使用、不健康的饮食、缺乏运动和肥胖。然而，虽然在控制这些传统的风险因素方面进行了很多工作，但是心血管疾病在美国和世界范围内仍然是死亡的主要原因。

过去二十年的研究强调炎症过程是CVD(尤其是动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD))发病机理的关键组成部分。1990年代中期的流行病学数据表明，通过高敏C-反应蛋白(hsCRP)或白介素-6(IL-6)确定的炎症在一级预防和二级预防中与未来主要不良心血管事件(MACE)密切相关，而与传统的风险因素无关(Ridker等人(2018)J.Am.Coll.Cardiol.72：3320-3331)。临床前研究还展示了炎症在动脉粥样硬化斑块起始和进展中的作用(Aday等人(2019)Front.Cardiovasc.Med.6：16 doi：10.3389/fcvm.2019.00016)。重要的是，炎症还会导致斑块不稳定和破裂，从而引发急性心血管事件，诸如MI和中风。

白介素-1家族是炎症的关键组成部分，并且作为各种炎性疾病的治疗靶标已经对其进行了深入研究(Szekely等人(2018)Cardiol.Ther.7：25-44)。IL-1基因家族有三个成员：IL-1、IL-1β和IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)。IL-1和IL-1β是IL-1受体的激动剂，而IL-1ra是特异性受体拮抗剂，因此是IL-1(IL-1a或IL-1β)的内源性竞争性抑制剂。IL-1β是IL-1的主要循环形式。它以前体(前IL-1β)产生，所述前体在许多炎症刺激下通过NLRP3(含NOD、LRR和热蛋白结构域蛋白3)炎症小体活化。重要的是，最近发现已知与动脉粥样硬化相关的多个因素可以活化NLRP3炎症小体。这些因素包括胆固醇晶体、动脉粥样硬化倾向振荡流、缺氧和中性粒细胞胞外陷阱，它们支持NLRP3炎症小体-IL 1β通路在动脉粥样硬化形成中的关键作用(Ridker(2016)Circ.Res.118：145-156)。

IL-1β的活性形式具有自分泌、旁分泌和内分泌作用，因此涉及广泛的炎性疾病。罕见遗传性疾病(诸如穆-韦二氏综合征(Muckle Wells Syndrome)(MWS)、隐热蛋白相关周期性综合征(CAPS)和新生儿发病的多***炎症综合征(NOMIS))与IL-1β的过度产生相关等等。使用卡纳单抗(canakinumab)(IL-1β抗体)、阿那白滞素(anakinra)(IL-1R拮抗剂)和利洛西普(rilonocept)(IL-1陷阱)进行干预均可改善这些过度产生综合征的症状(Ridker(2016)Circ.Res.118：145-156)。

IL-1β抑制也可以在治疗具有炎症基础的癌症中发挥作用。很多恶性肿瘤出现在慢性炎症区域，并且炎症的不充分消退可以在肿瘤侵袭、进展和转移中发挥主要作用(Grivennikov等人(2010)Cell 140：883-899)。炎症在肺癌中具有病理生理学意义；例如，吸烟和其他外部吸入的毒素会触发持续的炎症反应。这种炎症活化通过NLRP3炎症小体的活化来部分介导，并且局部产生活性IL-1β。在临床中，已经发现hsCRP和IL-6的高基线浓度与随后诊断的肺癌相关。使用卡纳单抗进行的IL-1β阻断与癌症总死亡率、肺癌发病率和肺癌死亡率的降低相关(Ridker等人(2017)Lancet390：1833-1842)。

因此，本公开可以用于治疗或预防许多癌症，包括但不限于肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌，例如三阴性乳腺癌(TNBC)；***癌，例如转移性***癌；血癌，诸如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如低或中等风险骨髓增生异常白血病；胃癌，包括食道癌；卵巢癌、肾癌、肝癌，例如肝细胞癌(HCC)；皮肤癌，例如黑素瘤；头颈癌；脑癌；结肠直肠癌；膀胱癌；胰腺癌；和肾癌，例如局限性肾癌。

仍然需要提供结合人IL-1β的治疗性抗体。尤其是，仍然需要提供具有有利的临床属性的IL-1β抗体。

本公开涵盖针对人IL-1β的经工程化的人抗体。本公开的抗体具有以下性质中的一种或多种：(1)以所期望的结合亲和力以及/或者缔合和解离速率结合人和食蟹猕猴IL-1b；(2)有效的IL-1β中和活性；(3)对IL-1β的高特异性；以及(4)低免疫原性风险。

本公开提供了经工程化的IL-1β抗体和包含编码所述抗体的DNA的载体，以及用于产生所述抗体的方法。此外，本公开提供了经工程化的IL-1β抗体用于治疗炎性疾病诸如心血管疾病和癌症的用途，所述炎性疾病可以受益于调节例如拮抗IL-1β信号传导和/或改善IL-1β的过度产生的作用。

因此，在一些实施方案中，本公开提供了结合人IL-1β蛋白的抗体，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中

所述HCDR1包含AASGFTFSDHYMS(SEQ ID NO：7)，

所述HCDR2包含YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：8)，

所述HCDR3包含AREADSSGYYYVGVDV(SEQ ID NO：9)，

所述LCDRI包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO：11)，

所述LCDR2包含YGASSDQS(SEQ ID NO：12)，以及

所述LCDR3包含QQGYYFPPT(SEQ ID NO：13)。

在一些实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：6，并且所述VL包含SEQ ID NO：10。在其他实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述VH由SEQID NO：6组成，并且所述VL由SEQ ID NO：10组成。

在一些实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：17或SEQID NO：18，并且所述VL包含SEQ ID NO：10。在其他实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述VH由SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18组成，并且所述VL由SEQ ID NO：10组成。

在一些实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：2的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。在一些实施方案中，所述抗体包含由SEQ IDNO：2组成的HC和由SEQ ID NO：4组成的LC。

在一些实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。在其他实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述抗体包含由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16组成的重链(HC)和由SEQ ID NO：4组成的轻链(LC)。

在一些实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：2的氨基酸2-445的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。在其他实施方案中，本公开提供了一种抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸2-445的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。

在一些实施方案中，抗体的表位通过获得抗体：抗原复合物的X射线晶体结构以及鉴定所述抗原上的哪些残基在所关注的抗体上的残基的

范围内来确定。在一个实施方案中，本发明的抗体在包含SEQ ID NO：1的残基R120、E153、K219、E221、N224、M264、Q265、F266和S268中的一些或全部的表位处结合至人IL-1β(SEQ ID NO：1)。

在一些实施方案中，所述抗体具有经工程化的人IgG1或IgG4同种型。

在一个优选的实施方案中，所述抗体具有经工程化的人IgG4同种型。

在一些实施方案中，本公开包括编码SEQ ID NO：2或4的核酸序列。

在一些实施方案中，本公开包括编码SEQ ID NO：15或4的核酸序列。

在一些实施方案中，本公开包括编码SEQ ID NO：16或4的核酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了包含编码SEQ ID NO：2的第一核酸序列和编码SEQ ID NO：4的第二核酸序列的载体。

在一些实施方案中，本公开提供了包含编码SEQ ID NO：15的第一核酸序列和编码SEQ ID NO：4的第二核酸序列的载体。

在一些实施方案中，本公开提供了包含编码SEQ ID NO：16的第一核酸序列和编码SEQ ID NO：4的第二核酸序列的载体。

在一些实施方案中，本公开提供了包含编码SEQ ID NO：2的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO：4的核酸序列的第二载体。

在一些实施方案中，本公开提供了包含编码SEQ ID NO：15的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO：4的核酸序列的第二载体。

在一些实施方案中，本公开提供了包含编码SEQ ID NO：16的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO：4的核酸序列的第二载体。

在一些实施方案中，本公开提供了包含载体的细胞，所述载体包含编码SEQ IDNO：2的第一核酸序列和编码SEQ ID NO：4的第二核酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了包含载体的细胞，所述载体包含编码SEQ IDNO：15的第一核酸序列和编码SEQ ID NO：4的第二核酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了包含载体的细胞，所述载体包含编码SEQ IDNO：16的第一核酸序列和编码SEQ ID NO：4的第二核酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了包含第一载体和第二载体细胞，所述第一载体包含编码SEQ ID NO：2的核酸序列，所述第二载体包含编码SEQ ID NO：4的核酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了包含第一载体和第二载体细胞，所述第一载体包含编码SEQ ID NO：15的核酸序列，所述第二载体包含编码SEQ ID NO：4的核酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了包含第一载体和第二载体细胞，所述第一载体包含编码SEQ ID NO：16的核酸序列，所述第二载体包含编码SEQ ID NO：4的核酸序列。

在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。

在一个实施方案中，本公开提供了一种产生抗体的方法，所述方法包括在使所述抗体表达的条件下培养如上文所述的细胞以及从所述培养基回收表达的抗体。

在一个实施方案中，本公开提供了一种通过以下步骤产生的抗体：在使所述抗体表达的条件下培养如上文所述的细胞以及从所述培养基回收表达的抗体。

在一个实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本公开的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。

在一个实施方案中，本公开提供了一种包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链具有SEQ ID NO：4中给出的氨基酸序列，并且每条重链具有SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本公开提供了一种包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链具有SEQ ID NO：4中给出的氨基酸序列，并且每条重链具有SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16中给出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本公开提供了一种预防疾病的方法，所述方法包括施用本公开的抗体和可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。在一个具体实施方案中，本公开提供了一种治疗炎性疾病的方法，其中所述炎性疾病选自包括但不限于以下各项的列表：心血管疾病、癌症、穆-韦二氏综合征(MWS)、隐热蛋白相关周期性综合征(CAPS)、新生儿发病的多***炎症综合征(NOMIS)、类风湿性关节炎、全身发病的幼年特发性关节炎(soJIA)、痛风关节炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、1型糖尿病、2型糖尿病、家族性寒冷型自身炎症综合征(FCAS)和眼部疾病例如年龄相关性黄斑变性。

在一个具体实施方案中，本公开提供一种治疗心血管疾病的方法，其中所述心血管疾病选自包括但不限于以下各项的列表：动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)或心力衰竭。

在一个具体实施方案中，本公开提供了一种治疗癌症的方法，其中所述癌症的类型选自包括但不限于以下各项的列表：肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性***癌、低或中等风险骨髓增生异常白血病和局限性肾癌。

在一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体，其用于疗法。在一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体，其用于治疗炎性疾病。在一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体，其用于治疗心血管疾病。在一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体，其用于治疗癌症。在另一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体，其用于治疗炎性疾病，其中所述炎性疾病是心血管疾病。在另一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体，其用于治疗炎性疾病，其中所述炎性疾病是癌症。

在另一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体在制造用于治疗炎性疾病的药物的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体在制造用于治疗心血管疾病或癌症的药物的用途。

如本文所用，包括所附权利要求，除非上下文另外明确指明，否则诸如“一个”、“一种”和“所述”的单词的单数形式包括它们对应的复数引用词。

如本文所用，“抗体”是结合抗原的免疫球蛋白多肽分子。天然存在的全长抗体是包含通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链的免疫球蛋白分子。每条链的氨基末端部分包含约100-110个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责通过其中包含的互补决定区(CDR)来进行抗原识别。每条链的羧基末端部分定义恒定区，所述恒定区主要负责效应子功能。

CDR散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个轻链可变区(LCVR，也称为VL)和重链可变区(HCVR，也称为VH)由3个CDRS和4个FR组成，从氨基末端至羧基末端依次排列为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”，重链的3个CDR称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDR含有大多数与抗原形成特异性相互作用的残基。VL和VH区域内的CDR氨基酸残基的编号和定位根据熟知的Kabat编号惯例进行。

轻链被分类为κ或λ，并且特征在于本领域已知的特定恒定区。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗体可以被另外分为亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。每种重链类型的特征在于具有本领域熟知的序列的特定恒定区。

在一些用于产生的生物***和方法中，抗体可以经历共翻译和翻译后修饰，诸如糖基化、脱酰胺化、酰化、氧化、环化、岩藻糖基化以及本领域熟知的其他修饰。另一种已知的修饰是在包含重链的重链可变区的N-末端处将谷氨酰胺或谷氨酸环化为焦谷氨酸(通常缩写为pyrGlu、pyrE、pGlu或pE)。根据所用的方法和抗体，转化为焦谷氨酸的谷氨酸的百分比会有所不同，并且可以表示混合物，涉及基本上所有正在产生的抗体，或非常低百分比的抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)是指来源于单拷贝或克隆，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是所述克隆产生的方法的抗体。本公开的mAb优选地存在于同质或基本上同质的群体中。完整的mAb含有2条重链和2条轻链。例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(例如CDR-接枝)或者本领域已知的此类或其他技术的组合来产生。

短语“经工程化的人”或“经工程化的人IL-1β抗体”是指这样产生和/或操作的单克隆抗体：具有根据本发明的结合和功能性质、结合至人IL-1β并且具有被工程化为含有与人变体基本上相似或相同的框架序列的框架区，所述框架区围绕来源于非人抗体的CDR。人和人源化抗体是本领域熟知的。与天然序列相比，本文的经工程化的人抗体可以被有意修饰，例如在恒定区中，以改变效应子或其他生物功能特征，或者生物物理特征(诸如稳定性、可开发性和/或溶解性等等)。本文的另一个实施方案包括经工程化的人抗体，其包含完全人或基本上完全人重链和/或轻链恒定区。本文的另一个实施方案包括包含通过二硫键相互连接的2个HC和2个LC的免疫球蛋白分子，其包含完全人或基本上完全人HC和LC恒定区。

此类经工程化的人抗体的“抗原结合片段”包括例如Fab片段、Fab′片段、F(abz′)₂片段和单链Fv片段。

“框架区”或“框架序列”是指框架区1至4中的任一者。本公开涵盖的经工程化的人抗体及其抗原结合片段包括这样的分子：其中框架区1至4中的任何一者或多者是基本上或完全人的，即其中提供了单独的基本上或完全人框架区1至4的可能的组合中的任一者。例如，这包括其中框架区1和框架区2、框架区1和框架区3、框架区1、2和3等是基本上或完全人的分子。基本上人的框架是与已知的人种系框架序列具有至少约80％序列同一性的那些框架。人框架种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)或从The 20 ImmunoglobulinFactsBook，Marie-Paule Lefranc和Gerard Leffanc著，Academic Press，2001，ISBN012441351获得。例如，种系轻链框架可以选自由以下各项组成的组：A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2和O8，并且种系重链框架区可以选自由以下各项组成的组：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、25VH3-72、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-51。

如本文所用，“IL-1β”(也称为IL-1 beta或IL-1β或白介素-1β)是指IL-1的主要循环形式。它以前体(前IL-1β或IL-1β前蛋白)产生，所述前体在许多炎性疾病下通过NLRP3炎症小体活化。人前IL-1β包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其变体。成熟的人IL-1β蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或其变体。

如本文所用，“炎性”包括炎性和自身炎性疾病。术语“炎性疾病”包括但不限于心血管疾病、癌症、导致IL-1β过度产生的罕见遗传性疾病以及可以受益于调节例如拮抗IL-1b信号传导的其他疾病。“炎性疾病”可以包括但不限于心血管疾病、心力衰竭、癌症、穆-韦二氏综合征(MWS)、隐热蛋白相关周期性综合征(CAPS)、新生儿发病的多***炎症综合征(NOMIS)、类风湿性关节炎、全身发病的幼年特发性关节炎(soJIA)、痛风关节炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、1型糖尿病、2型糖尿病、家族性寒冷型自身炎症综合征(FCAS)和眼部疾病包括例如年龄相关性黄斑变性。

本文的术语“心血管疾病”是指一类涉及心脏或血管的疾病。CVD表现的非详尽列表包括但不限于心绞痛、心肌梗塞(MI，通常称为心脏病发作)、中风、心力衰竭和心律不齐。

本文的术语“癌症”是指一组涉及异常细胞生长并且可能入侵或扩散到身体的其他部位的疾病。癌症类型的非详尽列表包括但不限于肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性***癌、低或中等风险骨髓增生异常白血病和局限性肾癌。因此，癌症可以涉及来自实体组织或器官的细胞，诸如脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、***癌、头颈癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、胃癌(包括食管癌在内的胃癌)；***癌，诸如肉瘤或骨癌；或血癌，诸如淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。癌症也可以以它们的细胞来源来描述，诸如起源于身体各个部位的上皮细胞的癌，或起源于腺体的腺瘤。

当“治疗”适用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物体液的接触。适用于人或研究受试者的术语“治疗”(或者“医治”或“医疗”)是指涉及减慢、中断、阻止、控制、停止、减少或逆转与IL-1β活性相关的症状、障碍、病症或疾病的进展或严重度，但是不一定涉及与IL-1β活性相关的所有疾病相关症状、病症或障碍的完全消除的方法。适用于药代动力学、诊断、研究和实验方法的“治疗”(或者“医治”或“医疗”)涵盖试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。术语“预防”(或“防止”)是指阻止某事的发生、存在或出现以及/或者妨碍或停止做某事。

术语“活化”可以指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。

分子的“活性”可以描述或指分子与配体或受体的结合，催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性、其他分子的活性的调节等等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞间相互作用例如粘附的活性，或者维持细胞的结构例如细胞膜或细胞骨架的活性。“活性”还可以指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]、或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等等。

除表现出根据本公开的类似的功能性质的本文公开的那些抗体之外的经工程化的人抗体可以使用若干不同的方法产生。本文公开的特定抗体化合物可以用作模板或亲本抗体化合物来制备另外的抗体化合物。在一种方法中，将亲本抗体化合物CDR接枝到与亲本抗体化合物框架具有高序列同一性的人框架。新框架的序列同一性通常与亲本抗体化合物中的对应的框架的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性。与亲本抗体相比，这种接枝可以导致结合亲和力的降低。在这种情况下，根据Queen等人A1(1991)Proc.Natl.Acad.Sci US 88：2869公开的特定标准，可以在某些位置将框架回复突变为亲本框架。描述在人源化抗体中使用的方法的其他参考文献包括美国专利号4,816,397；5,225,539和5,693,761；Levitt(1983)J.Mol.Biol.168：595-620描述的计算机程序ABMOD和ENCAD；以及Winter及其同事(Jones等人(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332：323-327；和Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534-1536)的方法。

可以按如下方式确定要考虑进行回复突变的残基：

当氨基酸落入这样的类别时，其中受体框架的人框架区域中的氨基酸对于该位置的人框架是不常见的，而供体免疫球蛋白中的对应的氨基酸对于该位置的人框架是典型的，正在使用的人种系序列的框架氨基酸(“受体框架”)被来自亲本抗体化合物的框架(“供体框架”)的框架氨基酸替代。

当受体框架的人框架区中的氨基酸中的每个和供体框架中的对应的氨基酸对于该位置的人框架通常是不常见的时，这种氨基酸可以被该位置的人框架的典型氨基酸替代。这种回复突变标准使人们能够恢复亲本抗体化合物的活性。

产生表现出与本文公开的抗体化合物的类似的功能性质的经工程化的人抗体的另一种方法涉及在不改变框架的情况下使接枝CDR内的氨基酸随机突变，以及在所得的分子中筛选出结合亲和力和其他功能性质与亲本抗体化合物一样好或者比亲本抗体化合物更好的分子。单个突变还可以引入每个CDR内的每个氨基酸位置处，然后评估这些突变对结合亲和力和其他功能性质的作用。可以将产生改善的性质的单个突变组合起来，以评估它们彼此组合的作用。

此外，前述两种方法的组合是可能的。在CDR接枝后，除在CDR中引入氨基酸变化之外，还可以回复突变特定框架区。该方法在Wu等人，(1999)J.Mol.Biol.294：151-162中有所描述。

本公开的经工程化的人抗体可以用作通过许多途径施用的人体医学的药物。最优选地，此类组合物用于肠胃外施用。此类药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备(参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy；第19^版(1995)，A.Gennaro等人，Mack Publishing Co.)，并且包含如本文公开的经工程化的人抗体，以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

以下测定法的结果表明，本公开的示例性单克隆抗体及其抗原结合片段结合和/或中和IL-1β，因此可以用于治疗炎性疾病诸如心血管疾病或癌症。

实施例1：抗体表达和纯化

在构建本公开的抗IL-1β抗体时遇到了化学和物理稳定性的重大问题。例如，初始构建体遇到的问题包括低结合亲和力、可变区脱酰胺化、氧化和低效力。

在结合亲和力以及化学和物理稳定性方面存在需要克服的重大问题，并且本公开的化学和物理修饰出乎意料地克服了这些问题。在重链和轻链二者中引入氨基酸修饰。本公开的抗体包括与原始构建体相比的多个残基变化，被鉴定为具有高结合亲和力并且在化学和物理上是稳定的。在初始构建体中未鉴定到包含本公开的抗体的修饰。

本公开的示例性抗体提供于表1中。

本公开的抗体可以如下所述制备和纯化。使用最佳预定HC：LC载体比率用分泌抗体的表达***瞬时转染适当的宿主细胞，诸如HEK 293或CHO，HC载体和LC载体分别编码抗体I_HC或抗体II_HC的序列以及抗体I和II的共同LC序列。使用很多常用技术中的任一者来纯化已经分泌抗体的澄清培养基。例如，培养基可方便地施加于已用相容的缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡的蛋白A或G色谱柱。洗涤色谱柱以除去非特异性结合组分。例如，通过pH梯度(诸如0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)洗脱结合的抗体。检测抗体级分，诸如通过SDS-PAGE进行检测，然后合并抗体级分。根据预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常用技术来浓缩和/或无菌过滤抗体。可溶性聚集体和多聚体可通过常用技术有效地除去，包括尺寸排阻、疏水相互作用或离子交换色谱。这些色谱步骤后的抗体纯度大于99％。产物可以立即冷冻在-70℃下，也可以冻干或保存在4℃下以供立即使用。

实施例2：抗体发现和工程化

使用完全人酵母展示文库来获得一组人抗IL-1β抗体，并对该组人抗IL-1β抗体进行筛选以鉴定可以是有效的IL-1β中和抗体的试剂。将突变***地引入每个抗体的单独互补决定区(CDR)，并且对所得的变体进行多轮选择，通过抗原浓度降低和/或解离时间增加来分离亲和力改善的克隆。确定单个变体的序列并且将该序列用于构建组合文库，该组合文库经受以增加的严格性进行的另外一轮选择，以鉴定单个CDR区之间的加合或协同突变配对。对单个组合克隆进行测序并确定结合特征。还可以对选定的抗体进行诱变以修复翻译后修饰，诸如甲硫氨酸氧化，同时仍然保持与IL-1β的结合亲和力。另外，对抗体进行框架(FW)替换，以将这些FW1序列恢复为它们的种系状态，从而降低潜在的免疫原性。

获得了在本文中称为抗体I和抗体II的经工程化的和/或优化的抗IL-1β抗体，它们具有重链和轻链可变区的氨基酸序列，以及完整的重链和轻链氨基酸序列，以及编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，如标题为“氨基酸和核苷酸序列”的部分所述。对应于这些片段的序列ID以及轻链和重链CDR氨基酸序列如下表1所示。

表1.

	抗体I(SEQ ID NO)	抗体II(SEQ ID NO)
			VH	17	18
VL	10	10
			HC	15	16
LC	4	4
			HC CDR1	7	7
HC CDR2	8	8
			HC CDR3	9	9
LC CDR1	11	11
			LC CDR2	12	12
LC CDR3	13	13

实施例3：人或食蟹猕猴IL-1β的体外中和

重组人或食蟹猕猴IL-1β在大肠杆菌(E.coli)中以N-末端HIS-SUMO融合蛋白产生。使用HisPur Ni-NTA色谱来纯化蛋白质，然后除去内毒素。然后用SUMO蛋白酶Ulp1处理纯化的融合蛋白，以将HIS-SUMO从融合蛋白上切割下来。然后通过HisPur Ni-NTA从反应中除去切割的HIS-SUMO蛋白，并使用Superdex 75尺寸排阻色谱将未标记的IL-1β进一步纯化至均质性。

预期本公开的抗体可中和IL-1β。抗体I和/或抗体II对IL-1β活性的中和可以通过一种或多种基于IL-1β细胞的活性测定法来评估，例如，如下文所述。

筛选IL-1β/IL-1R结合的中和剂最初可以通过高通量基于细胞的测定法来完成，该测定法使用在NF-kB启动子控制下的表达萤光素酶基因的HeLa细胞。该测定法使用NF-κB-萤光素酶报告信号作为重组IL-1β诱导信号传导的读数。然后通过测量抗IL-1β抗体滴定后的萤光素酶活性降低水平来定量IL-1β的中和。或者，下文详细描述了另一种体外中和测定法，诸如HEK-Blue基于细胞的测定法。

具体而言，将HEK-Blue^TM IL-1β细胞在T-75烧瓶中的生长培养基(DMEM、4.5g/l葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、10％(v/v)胎牛血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、100μg/mLNormocin^TM、100μg/mL Zeocin^TM和200μg/mL潮霉素B金)中培养直到90％汇合。用PBS(不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺)洗涤细胞两次，并在1mL PBS中温育2分钟。然后通过拍打烧瓶侧面使细胞脱壁，再用10mL测试培养基(DMEM、4.5g/l葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、10％(v/v)热火活FBS(56℃30分钟)、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、100μg/mL Normocin^TM)重悬细胞，对细胞进行计数并用测试培养基稀释至0.33×10⁶个细胞/mL。在测试培养基中将重组人或食蟹猕猴IL-1β和测试制品制备到所需的浓度。在BioCoat聚-D-赖氨酸平板(Corning 354461)中将40μL抗体(5×浓度)与10μL IL-1β(20×浓度，测定法的最终浓度为4pM)混合，并在室温下温育30分钟。将150μL HEK-Blue^TM IL-1β细胞悬浮液以0.33×10⁶个细胞/mL分配到含有抗体和IL-1β混合物的聚D-赖氨酸平板的每个孔中。将平板在37℃、5％CO₂和90％相对湿度下温育过夜。第二天，将来自聚-D-赖氨酸平板的25μL培养基转移到Costar测定板(Corning 3695)。将预热至37℃的75μL QUANTI-Blue检测溶液(Invivogen产品目录＃rep-qb1、rep-qb2)添加至测定板中。将测定板盖上并在37℃下温育1小时，然后在读板器(SpectraMax Plus，Molecular Device)上在OD₆₅₀nm处读数。将数据归一化并表示为4pM IL-1β的抑制百分比：0％抑制＝4pM IL-1β，100％抑制＝0pM IL-1β。中和抗hIL-1β抗体阻断重组人IL-1β刺激HEK-Blue^TM IL-1β细胞的活性。使用4参数逻辑拟合来计算中和抗体的相对效力并以IC50值表示。

表2：人或食蟹猕猴IL-1β的体外中和

NA：不适用

实施例4：人IL-1β的体内中和

人IL-1β可以结合至并刺激小鼠IL-1受体，导致血清中的小鼠细胞因子IL-6升高。进行时间和剂量范围研究以确定人IL-1β的最佳剂量和小鼠IL-6诱导的最佳时间。为了测试本公开的抗体的体内中和活性，下文描述了优化的方案。具体而言，将来自Envigo的雄性C57BL/6小鼠在大约9周龄时用于研究。给小鼠喂食正常饮食(Harlan Teklad饮食，2014)并按体重随机分配到治疗组(n＝5～8只/组)。将本公开的抗体和对照抗体溶解于盐水中并以所示剂量水平皮下施用。在二十四小时后，将人IL-1β溶解于盐水中，并以1μg/kg的剂量水平腹膜内给药。在两小时后，通过眼眶后出血收集血液样品，然后以2000g离心3分钟以分离血清样品。

按照制造商的说明，使用V-PLEX小鼠IL-6试剂盒(Meso Scale Discovery，产品目录＃K152QXD-2)测定血清中的小鼠IL-6水平。简而言之，MSD平板用150μL洗涤缓冲液洗涤3次。将50μL预先制备的校准品(连续稀释)、对照和测试样品(1∶10稀释)转移到平板上的适当孔中，然后在室温下振荡2小时(500～1000rpm)。平板用150μL洗涤缓冲液洗涤3次。然后将25μL检测抗体溶液添加至每个孔中，然后在室温下振荡(500～1000rpm)2小时。平板用150μL洗涤缓冲液洗涤3次。将150μL 2×读取缓冲液添加至每个孔中。平板立即在MSDSQ120读板器上读取。使用4参数逻辑拟合从校准曲线分析测试样品的1L-6浓度。

将同种型匹配对照抗体(IgG4-PAA)用作研究的阴性对照。数据计算为与对照组的平均IL-6水平相比的抑制百分比。使用单因素方差分析评估平均差的统计显著性(用JMP11软件进行Dunnett事后分析)。本公开的抗体剂量依赖性地阻断人IL-1β刺激小鼠IL-1受体介导的小鼠IL-6增加的作用(表3-1、3-2)。

表3-1：使用抗体I在体内中和人IL-1β

表3-2：使用抗体II在体内中和人IL-1β

实施例5：通过MSD-SET进行的抗体I和抗体II的结合亲和力测量

利用MSD(Meso Scale Discovery)电化学发光测定法来测量抗体I、抗体II和卡纳单抗对人IL-1β的亲和力。首先，建立抗体和人IL-1β的平衡混合物；在混合物中，抗体浓度保持恒定在1pM、10pM和100pM，而配体的滴定浓度范围为0.9nM至0.00004nM(浓度之间稀释2.5倍)。将平衡混合物放置于密封的非结合96孔板中，在37℃下放置72小时。

将MSD金链霉亲和素平板用于检测平衡混合物中的游离抗体。首先将MSD平板在设置为800rpm的振荡器上用封闭缓冲液(PBS+1％BSA)封闭1小时，然后用洗涤缓冲液PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗涤3次。用生物素酰化的人IL-1β涂覆平板，然后用PBST洗涤3次。将平衡混合物添加至涂覆的平板中，在室温下振荡温育2.5分钟，并立即用PBST洗涤3次。将山羊抗人Sulfo-TAG抗体添加至平板中，并在室温下振荡温育1小时。再洗涤三次后，将在MilliQ水中稀释的1∶2浓度的MSD读取缓冲液添加至孔中。然后立即使用MSD扇区成像仪SI6000仪器读取平板。

对于数据评估，将MSD仪器的读数导入定制的基于Excel或GraphPad Prism 8的评估程序，该程序会自动绘制滴定数据，并计算K_D值以及统计参数。

表4：抗体的结合亲和力(配体：人IL-1β，37℃)

实施例6：免疫原性风险评估

通过与代表US 7,714,120(本文为US′120)和卡纳单抗的抗体进行比较使用计算机上和离体方法来表征抗体II的临床免疫原性的相对风险，如下文所示。

树突细胞(DC)内化测定法

该测定法评估人DC内化测试抗体的能力。CD14+细胞用IL-4和GM-CSF培养并分化为不成熟的DC。将测试抗体、同种型对照或阳性对照与检测剂(Fab-QSY7-TAMRA)以1∶1的比率预温育以形成复合物，然后添加至培养物中。细胞培养一天。在内化和切割后，通过流式细胞术检测阳性TAMRA信号，并使用IgG1-EN同种型对照和抗CXCR抗体来计算归一化的内化指数。

MAPPS测定法(MHC相关肽蛋白质组学)

MAPPS分析了在此前用测试抗体处理的人树突细胞上的MHC-II呈递肽。将从正常人供体的PBMC分离的CD14+细胞通过与IL-4和GM-CSF一起温育来培养并分化为不成熟的DC。在第4天，将培养基更换为含有测试抗体的新鲜培养基。在第5天，添加LPS以将细胞转化为成熟的DC。在第6天，使细胞在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。使用与链霉亲和素珠粒偶联的生物素酰化的抗MHC-II抗体对MHC-II复合物进行免疫沉淀。洗脱和过滤结合的复合物。通过质谱仪分析分离的MHC-II肽。肽鉴定通过内部蛋白质组学管道，使用无酶搜索算法和具有附加测试序列的牛/人类数据库来生成，以确定显示来自测试候选物的互补性决定区的MHC-II肽的供体的百分比。将KNIME工作流程用于处理样品的鉴定文件。将从测试制品鉴定的肽与亲本序列进行比对。

计算机上TCEM(T细胞暴露基序)分析

该分析评估了通过MAPPS鉴定的特定肽簇将活化CD4+T细胞的可能性。将MAPPS鉴定的含有非种系残基的肽序列输入到免疫表位数据库(IEDB)分析资源MHCII结合预测页面中。选择IEDB推荐的预测方法。该预测认为27个最常见的HLA-DR、-DP和-DQ等位基因覆盖很大一部分人类群体。每个长度等于或大于15个残基的输入序列被分为重叠的15聚体偏移1个氨基酸以跨越整个序列。对于每个肽，通过将肽的得分与从SWISSPROT数据库中选择的五百万个随机15聚体的得分进行比较来生成百分位排序。定位于寄存器的推定P-1、P2、P3、P5、P7和P8位置的氨基酸生成TCEM，并且风险基于在这些位置上存在的非种系残基来定义。非种系残基和核心与多个等位基因结合的可能性在图形渲染中报告，并考虑用于免疫原性风险评估。

MS血清结合

该测定法评估测试候选物与血清蛋白的脱靶结合。将测试抗体涂覆在Immulon4HBX微孔板上。在封闭后，添加人血清并温育过夜。洗脱、还原、烷基化和消化结合的蛋白质。通过质谱仪分析肽。肽和蛋白质鉴定通过内部蛋白质组学管道，使用具有胰蛋白酶的搜索算法和具有附加测试抗体序列的人类数据库来生成。离子通过内部蛋白质组学工具(Chrom-Alignment、Metaconsense和Quant)进行定量，并在JMP中使用单向分析/每对、学生t检验平台进行分析。使用JMP对离子的log2auc进行分析：每个离子用X拟合Y/比较平均值/所有对、Tukey HSD。

T细胞增殖测定法

该测定法评估测试抗体或测试MAPPS肽通过诱导细胞增殖来活化CD4+T细胞的能力。制备CD8+T细胞剔除的PBMC，并用CFSE标记。每个样品都用培养基对照、匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH；阳性临床基准对照)、测试抗体或测试MAPPS肽进行测试。培养物温育7天。在第7天，通过流式细胞术分析样品。

预先存在的反应性(ACE桥格式)

该测定法评估针对测试抗体的预先存在的抗体在人血清中的存在。在涂覆有生物素酰化的测试抗体的平板上过夜捕获稀释的血清。在第二天，用酸洗脱捕获的反应蛋白，然后在存在生物素酰化的和钌化的测试抗体的情况下中和。如果存在抗药物抗体，它们将桥接标记的测试抗体并形成复合物。复合物通过链霉亲和素涂覆的中尺度平板捕获，所得的信号称为第1层信号(表示为电化学发光)。该信号在第2层中通过在检测步骤中添加过量的未标记的测试抗体来确认，这会导致第1层信号的抑制。预先存在的抗药物抗体的存在表示为第2层抑制的第90^个百分位的大小。

表5.免疫原性风险评估汇总

缩写：ACE＝酸捕获洗脱；CDR＝互补决定区；DC＝树突细胞；H1＝VH CDR1；H2＝VHCDR2；H3＝VH CDR3；L1＝VL CDR1；L2＝VL CDR2；MAPP＝MHC相关肽蛋白质组学；MHC＝主要组织相容性复合体；MS＝质谱；T2＝第2层；TCEM＝T细胞暴露基序；VH＝可变重链；VL＝可变轻链；VHFR3＝可变重链框架3

实施例7：抗人IL-1β抗体II的表位作图

X射线晶体学用于获得IL-1β抗体II Fab复合物的高分辨率结构。表达、纯化和混合IL-1β SEQ ID NO：14和抗体II，以形成IL 1β抗体II Fab复合物。使用通常已知的技术使复合物结晶。参见Vonrhein，C.等人，Biological Crystallography 67，293-302(2011)，Evans，P.R.&Murshudov，G.N.，Biological Crystallography 69，1204-1214(2013)，McCoy，A.J.等人，Journal of Applied Crystallography 40，658-674(2007)，Emsley，P.，Lohkamp，B.，Scott，W.G.&Cowtan，K.，Biological Crystallography 66，486-501(2010)，Murshudov，G.N.等人，Biological Crystallography 67，355-367(2011)，Winn，M.D.等人，Biological Crystallography 67，235-242(2011)和Williams，C.J.等人，ProteinScience 27，293-315(2018)。

表位显示在抗体II上的

范围内的IL-1β氨基酸残基包括R120、E153、K219、E221、N224、M264、Q265、F266和S268(根据SEQ ID NO：1)。

氨基酸和核苷酸序列

SEQ ID NO：1：(人IL-1β前蛋白或前hIL-1β)

SEQ ID NO：2：(抗体I和抗体II的HC)

其中X₁是E或pE

其中X₂是M或L

SEQ ID NO：3：(抗体I和II的HC DNA)

SEQ ID NO：4：(抗体I和抗体II的LC)

SEQ ID NO：5：(抗体I和抗体II的LC DNA)

SEQ ID NO：6：(抗体I和抗体II的VH)

其中X₁是E或pE

其中X₂是M或L

SEQ ID NO：7：(抗体I和抗体II的HCDR1)

AASGFTFSDHYMS

SEQ ID NO：8：(抗体I和抗体II的HCDR2)

YISSSGSTIYYADSVKG

SEQ ID NO：9：(抗体I和抗体II的HCDR3)

AREADSSGYYYVGVDV

SEQ ID NO：10：(抗体I和抗体II的VL)

SEQ ID NO：11：(抗体I和抗体II的LCDR1)

RASQSISSYLN

SEQ ID NO：12：(抗体I和抗体II的LCDR2)

YGASSDQS

SEQ ID NO：13：(抗体I和抗体II的LCDR3)

QQGYYFPPT

SEQ ID NO：14(成熟人IL-1β；SEQ ID NO：1的残基117-269)

SEQ ID NO：15(抗体I的HC)

其中X₁是E或pE

SEQ ID NO：16：(抗体II的HC)

其中X₁是E或pE

SEQ ID NO：17：(抗体I的VH)

其中X₁是E或pE

SEQ ID NO：18：(抗体II的VH)

其中X₁是E或pE

SEQ ID NO：19：(卡纳单抗HC)

SEQ ID NO：20：(卡纳单抗LC)

序列表

<110> 伊莱利利公司(Eli Lilly and Company)

<120> 抗IL-1β抗体

<130> X22586

<150> US 62/963,327

<151> 2020-01-20

<160> 20

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 269

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser

1 5 10 15

Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met

20 25 30

Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile

35 40 45

Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala

50 55 60

Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro

65 70 75 80

Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe

85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala

100 105 110

Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp

115 120 125

Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala

130 135 140

Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met

145 150 155 160

Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu

165 170 175

Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp

180 185 190

Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys

195 200 205

Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn

210 215 220

Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr

225 230 235 240

Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly

245 250 255

Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

260 265

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 第1位的Xaa是E或焦谷氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (118)..(118)

<223> 第118位的Xaa是M或L

<400> 2

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Gly Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Gly

<210> 3

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgaggctc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gaccactaca tgagctggat ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt actactgcgc cagagaggct 300

gacagcagcg gatactacta cgtgggcgta gacgtatggg gtcagggtac aatggtcacc 360

gtctcctcag ccagcaccaa gggcccatcg gtcttcccac tagcgccctg ctccaggagc 420

acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgagccggtg 480

acggtgtcgt ggaactcagg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600

acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660

gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccctgcccag cacctgaggc cgccggggga 720

ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtaacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840

tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 1080

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggaaagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320

cagaagagcc tctccctgtc tctgggt 1347

<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Asp Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Tyr Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 5

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatccagtg atcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcaa ggatactact tccctcctac ttttggcgga 300

gggaccaagg ttgagatcaa acgaaccgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

<210> 6

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 第1位的Xaa是E或焦谷氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (118)..(118)

<223> 第118位的Xaa是M或L

<400> 6

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Gly Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

Ala Arg Glu Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Gly Val Asp Val

1 5 10 15

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Asp Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Tyr Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

Tyr Gly Ala Ser Ser Asp Gln Ser

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

Gln Gln Gly Tyr Tyr Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 14

<211> 153

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys

1 5 10 15

Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln

20 25 30

Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln

35 40 45

Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu

50 55 60

Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu

85 90 95

Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe

100 105 110

Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu

115 120 125

Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr

130 135 140

Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 15

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 第1位的Xaa是E或焦谷氨酸

<400> 15

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Gly Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Gly

<210> 16

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 第1位的Xaa是E或焦谷氨酸

<400> 16

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Gly Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Gly

<210> 17

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 第1位的Xaa是E或焦谷氨酸

<400> 17

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Gly Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 第1位的Xaa是E或焦谷氨酸

<400> 18

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Gly Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种结合人IL-1β蛋白的抗体，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中

所述HCDR1包含AASGFTFSDHYMS(SEQ ID NO：7)，

所述HCDR2包含YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：8)，

所述HCDR3包含AREADSSGYYYVGVDV(SEQ ID NO：9)，

所述LCDR1包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO：11)，

所述LCDR2包含YGASSDQS(SEQ ID NO：12)，以及

所述LCDR3包含QQGYYFPPT(SEQ ID NO：13)。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：6，并且所述VL包含SEQ IDNO：10。

3.如权利要求1所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：17，并且所述VL包含SEQ IDNO：10。

4.如权利要求1所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：18，并且所述VL包含SEQ IDNO：10。

5.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：2的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。

6.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：15的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。

7.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：16的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。

8.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO：2的氨基酸2-449的重链(HC)和包含SEQ ID NO：4的轻链(LC)。

9.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包含由SEQ ID NO：2组成的HC和由SEQID NO：4组成的LC。

10.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体具有人IgG1或IgG4同种型。

11.如权利要求10所述的抗体，其中所述抗体具有人IgG4同种型。

12.一种核酸，所述核酸包含编码SEQ ID NO：2或4的序列。

13.一种组合物，所述组合物包含

(a)包含编码SEQ ID NO：2的第一核酸序列和编码SEQ ID NO：4的第二核酸序列的载体；或者

(b)包含编码SEQ ID NO：2的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO：4的核酸序列的第二载体。

14.一种细胞，所述细胞包含

15.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

16.一种产生抗体的方法，所述方法包括在使得所述抗体得以表达的条件下培养如权利要求14-15中任一项所述的细胞以及从所述培养基回收所表达的抗体。

17.一种抗体，所述抗体通过在使得所述抗体得以表达的条件下培养如权利要求14-15中任一项所述的细胞以及从所述培养基回收所表达的抗体来产生。

18.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。

19.一种治疗有需要的受试者的与人IL-1β相关的炎性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体施用于所述受试者。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述炎性疾病是穆-韦二氏综合征(MWS)、隐热蛋白相关周期性综合征(CAPS)、新生儿发病的多***炎症综合征(NOMIS)、类风湿性关节炎、全身发病的幼年特发性关节炎(soJIA)、痛风关节炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、1型糖尿病、2型糖尿病、家族性寒冷型自身炎症综合征(FCAS)或年龄相关性黄斑变性。

21.一种治疗有需要的受试者的心血管疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体施用于所述受试者。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述心血管疾病是心绞痛、心肌梗塞(MI)、中风、心力衰竭或心律不齐。

23.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体施用于所述受试者。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性***癌、低或中等风险骨髓增生异常白血病或局限性肾癌。

25.如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体，其用于疗法。

26.如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体，其用于治疗炎性疾病。

27.如权利要求26所述的抗体，其中所述炎性疾病是穆-韦二氏综合征(MWS)、隐热蛋白相关周期性综合征(CAPS)、新生儿发病的多***炎症综合征(NOMIS)、类风湿性关节炎、全身发病的幼年特发性关节炎(soJIA)、痛风关节炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、1型糖尿病、2型糖尿病、家族性寒冷型自身炎症综合征(FCAS)或年龄相关性黄斑变性。

28.如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体，其用于治疗心血管疾病。

29.如权利要求28所述的抗体，其中所述心血管疾病是心绞痛、心肌梗塞(MI)、中风、心力衰竭或心律不齐。

30.如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体，其用于治疗癌症。

31.如权利要求30所述的抗体，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性***癌、低或中等风险骨髓增生异常白血病或局限性肾癌。

32.一种包含如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体的药物组合物，其用于治疗炎性疾病。

33.一种包含如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体的药物组合物，其用于治疗心血管疾病。

34.一种包含如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体的药物组合物，其用于治疗癌症。

35.如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体在制造用于治疗炎性疾病的药物中的用途。

36.如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体在制造用于治疗心血管疾病的药物中的用途。

37.如权利要求1-11和17中任一项所述的抗体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。