BRPI1014157A2 - anticorpos humanos manipulados contra dkk-1, composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos, bem como uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS HUMANOS MANIPULADOS CONTRA DKK-1, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO TAIS ANTICORPOS, BEM COMO USO DOS MESMOS. A invenção refere-se a anticorpos humanos, fragmentos de ligação antigênica dos mesmos, que ligam a, e inibem a atividade de, DKK-1 humano, e os quais são eficazes no tratamento de doenças nas quais a patogêneses é mediada por DKK-1.

Description

í 1/40 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS HUMANOS MANIPULADOS CONTRA DKK-1, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO TAIS ANTICORPOS, BEM COMO USO DOS MESMOS".

A presente invenção refere-se a anticorpos manipulados huma- nos contra DKK-1 e a sua aplicação no tratamento de doenças nas quais a patogênese é mediada por DKK-1.

Dickkopf-1 (DKk-1) é um membro da família dickkopf de proteí- nas que foi demonstrado que são reguladores negativos do caminho de sina- lização de Wnt canônico. O caminho desempenha um papel central no de- senvolvimento e na formação de ossos. Dkk-1 inibe a sinalização de Wnt através de sua interação com o correceptor de Wnt LRP5 ou LRP6 e as pro- teínas kremen. DKkk-1 evita que membros do caminho de Wnt que interajam com quer LRP5 ou LRP6, deste modo evitando a transdução de sinal medi- . 15 adopor Wnt. Foi demonstrado que DKK1 está envolvida em cânceres me- tastatizantes dos ossos, inclusive mieloma múltiplo, carcinoma de mama, ' carcinoma renal e câncer pulmonar de células não pequenas.

Foram descritos anticorpos que ligam Dkk-1 (por exemplo, vide a publicação de patente internacional No. WO2006/015373), no entanto, ainda existea necessidade de anticorpos terapêuticos manipulados contra DKK-1 humano que inibirão a interação de DKkKk-1 com LRP5 e LRP6. Além disso, em vista do envolvimento de DKkKk-1 na regulação da formação dos ossos, existe a necessidade de anticorpos terapêuticos anti-DKK-1 manipulados humanos para aplicação na cura óssea. Além disso, dado o envolvimento de Dkk1 em cânceres, existe a necessidade de anticorpos anti-DKK-1 ma- nipulados humanos para tratar cânceres, inclusive mieloma múltiplo, cânce- res de mama e pulmonar de células não pequenas. Os anticorpos da presente invenção são antagonistas de DKK-1 terapeuticamente úteis possuindo uma série de propriedades desejáveis. Os presentes anticorpos manipulados humanos apresentam elevada afinidade (Kd) para DKK-1 humano, DKK-1 de cynomolgus, DKK-1 de rato, DKK-1 de camundongo, e DKK-1 de coelho. Anticorpos da presente invenção bloquei-

. 2/40 am a inibição, mediada por DKK-1, de fosfatase alcalina, um marcador da atividade dos osteoblastos.

Além disso, os anticorpos da presente invenção apresentam um aumento na densidade da massa óssea tanto nos córtices anterior quanto posterior em um modelo de defeito cortical in vivo e demons- tram significativa inibição do crescimento de xenoenxertos pulmonares de células não pequenas in vivo.

A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado con- tra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que tem uma Kd a 37ºC de menos de 5,0 X 10 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado con- tra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que LCDR1 R 15 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 5, LCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 47, LCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 49, HCDR1 . tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 44. A presente invenção também proporciona uma composição far- —macêutica compreendendo o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção proporciona um método de curar osso compreendendo administrar um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano oufragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção.

A pre- sente invenção também proporciona um método de tratar câncer compreen- dendo administrar um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou frag- mento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção, em que o câncer é selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer —demama e câncer pulmonar de células não pequenas.

A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado con- tra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo conforme NNE—

. 3/40 descrito aqui, neste requerimento de patente, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 1,5 X 10º M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 1,0 X 10º M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Adicionalmente preferencial, a presente invenção propor- ciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 5,0 X 107? M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 0,5 X 10º? M e 1,5 X 10º M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona anticorpo con- tra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mes- S 15 mo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 1,0 X 10? M e 1,0 X 10 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Os valores de Kd são estabelecidos por

“ um equilíbrio de ligação a 37ºC conforme descrito no Exemplo 2. A presente invenção também proporciona um anticorpo manipu- lado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 5,0 X 10” M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 3,0 X 10" M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou frag- mento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd de menos de 2,0 X 10º M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de

. 4/40 rato (SEQ ID NO: 31), e DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33). Mais pre- ferencialmente, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 1,0 X 10º M e 5,0 X 107! M para DKK-1 hu- —mano(SEOQID NO: 29), DKK-1de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adicionalmente preferencial, a presente invenção proporciona anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo tem uma Kd entre 1,5 X 10 Me3,0X10*'M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), e DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33). Os valores de Kd são estabelecidos por um equilíbrio de ligação a 37ºC conforme descrito no Exemplo 2. Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona um à 15 anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação anti- gênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência . de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kddemenos de 3,0X10'M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adi- cionalmente preferencial, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipu- lado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd de menos de 2,5 X 10 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de — cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipula-

. 5/40 do contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano oufragmento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd de menos de 2,0 X 10º M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Adicionalmente pre- ferencial, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreen- dendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou frag- mento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd entre 0,5 X 10º Me30 X 10 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus Ê (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo - (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Mais preferencial- mente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreen- dendo uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e em que o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou frag- mento de ligação antigênica do mesmo tem uma Kd entre 1,0 X 10º Me 2,5 X 10” M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQIDNO: 30), DKK-1 de rato (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de camundongo (SEQ ID NO: 33), e DKK-1 de coelho (SEQ ID NO: 32). Os valores de Kd são estabelecidos por um equilíbrio de ligação a 37ºC conforme descrito no

Exemplo 2. A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado con- tra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende regiões determinantes de

- 6/40 complementariedade (CDRs) LCDR1, LCDR2, e LCDR3 e a HOVR compre- ende CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que a LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 5, a HCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1,e a HCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado con- tra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que a LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 46, a LCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 48, a LCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 50, a HCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, a HCDR2 tem a sequên- ciaaminodeSEQ ID NO: 43, e a HCDR3 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 45. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que a LCDR1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 5, a LCDR2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 47, a LCDR3 tem a sequência amino de : 15 SEQID NO: 49,aHCDRI1 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 1, a HC- DR?2 tem a sequência amino de SEQ ID NO: 2, e a HCDR3 tem a sequência - amino de SEQ ID NO: 44.

A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado con- tra DKK-1 humano ou um fragmento de ligação do mesmo em que a LCDR1 tema sequência amino de SEQ ID NO: 5, a LCDR2 tem uma sequência a- mino selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 10, a LCDR3 tem uma sequência amino selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, a HCDR1 tem a se- quência amino de SEQ ID NO: 1, a HCDR2 tem a sequência amino de SEQ IDNO:2,eaHCDR3 tem uma sequência amino selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo em que LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 têm sequências de aminoácidos selecionadas entre o grupo consistindo em: () LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 6, LCDR3 é SEQ ID NO: 7, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HCDR3

- 7/40 é SEQID NO: 3, (ii) LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 8, LCDR3 é SEQ ID NO: 7, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HCDR3 é SEQID NO: 4, (iii) LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 6, LCDR3 é SEQ ID NO: 9, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HCDR3 é SEQ ID NO: 3, (iv) LCDR1 é SEQ ID NO: 5, LCDR2 é SEQ ID NO: 10, LCDR3 é SEQ ID NO: 9, HCDR1 é SEQ ID NO: 1, HCDR2 é SEQ ID NO: 2, e HC- DR3éSEQIDNO:3 A presente invenção proporciona um anticorpo manipulado con- tra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo em que a LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e a HC- VR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. é: 15 A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do - mesmo em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácidos sele- cionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, e SEQ ID NO: 16.

A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que a HCVR compreende uma sequência de aminoácidos sele- cionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que a LCVR e a HCVR compreendem sequências de aminoáci- dos selecionadas entre o grupo consistindo em: (i) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos deSEQIDNO:11; (ii) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos

- 8/40 de SEQ ID NO: 12; (iii) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (iv) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreendendo uma LCVR compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 12. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano em que o anticorpo contra DKK-1 ma- õ 15 —nipulado humano compreende uma cadeia leve em que a cadeia leve com- preende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consis- - tindo em SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, e SEQ ID NO: 22. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano, em que o anticorpo contra DKK-1 “manipulado humano compreende uma cadeia pesada em que a cadeia pe- sada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18. Mais preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano, em que o anticorpo contra —DKK-1 manipulado humano compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada e uma de cadeia leve selecionadas entre o grupo consistindo em (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 17 e cadeia leve compreendendo a sequência de a- —minoácidos de SEQ ID NO: 19, (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência

- 9/40 de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (iii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e Ss (iv) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreen- de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves Ê 15 em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreen- - de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreen- de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. A presente invenção preferencialmente proporciona um anticor- po manipulado contra DKK-1 humano compreendendo duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada compreen- de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. A presente invenção também proporciona um anticorpo ou frag- mento de ligação antigênica do mesmo, o qual compete com o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção para ligação a DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29) conforme determinado através de uma prova de competição de anticor-

] 10/40 po.

A presente invenção também proporciona uma composição far- macêutica compreendendo o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Além disso, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo contra DKK-1 manipulado humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção junto com um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável e op- cionalmente outros ingredientes terapêuticos.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de curar osso compreendendo administrar um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção.

. 15 Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de tratar câncer compreendendo administrar um anticorpo manipu- - lado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção, em que o câncer é preferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmo- —narde células não pequenas.

Além disso, a presente invenção proporciona um anticorpo ma- nipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mes- mo da presente invenção para aplicação em terapia. Preferencialmente, a presente invenção proporciona um anticorpo manipulado contra DKK-1 hu- mano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção para aplicação no tratamento para curar osso ou no tratamento de câncer, em que o câncer é preferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

Além disso, a presente invenção também proporciona a aplica- ção de um anticorpo manipulado contra DKK-1 humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da presente invenção na fabricação de um

- 11/40 medicamento para terapia, curar osso ou para tratar câncer, em que o cân- cer é preferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

Definições Um anticorpo de comprimento total conforme existe naturalmen- te é uma molécula de imunoglobulina compreendendo 2 cadeias pesadas (H) e 2 cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto.

A porção terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 aminoácidos essencialmente responsáveis por reconhecimento antigê- nico através das regiões determinantes de complementariedade (CDRs) contidas nas mesmas.

A porção terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante essencialmente responsável por função efetora.

As CDRs são intercaladas com regiões que são mais conserva- das, denominadas regiões de framework ("FR"). Cada região variável de ; 15 cadeialeve (LCVR) e região variável de cadeia pesada (HCVR) é composta de 3 CDRs e 4 FRs, dispostas do término amino para o término carbóxi na - seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As 3 CDRs da cadeia leve são referidas como “LCDR1, LCDR2, e LCDR3' e as 3 CDRs da cadeia pesada são referidas como “HCDR1, HCDR2, e HCDR3." As CDRs contêm a maioria dos resíduos os quais formam interações específicas com o antígeno.

A numeração e o posicionamento de resíduos aminoácidos de CDR dentro das regiões LCVR e HCVR estão de acordo com a convenção de numeração de Kabat de conhecimento geral.

Cadeias leves são classificadas como kappa ou lâmbda, e são caracterizadas por uma região constante em particular conforme é de co- nhecimento na técnica.

Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, e definem o isotipo de um anticorpo como IgG, IgM, IgA, I1gD, ou IgE, respectivamente.

Anticorpos de IgG podem ser adicional- mente divididos em subclasses, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipode cadeia pesada é caracterizado por uma região constante em particu- lar com uma sequência de conhecimento geral na técnica.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo

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“anticorpo monocional” (Mab) se refere a um anticorpo que é derivado de uma única cópia ou clone inclusive, por exemplo, qualquer clone eucariótico, procariótico, ou de fago, e não o método pelo qual é produzido.

Mabs da presente invenção preferencialmente existem em uma população homogê- nea ou substancialmente homogênea.

Mabs completos contêm 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves. “Fragmentos de ligação antigênica” de seme- lhantes anticorpos monoclonais incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab'),, e fragmentos Fv de cadeia única.

Anti- corpos monoclonais e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos da pre- sente invenção podem ser produzidos, por exemplo, por tecnologias recom- binantes, tecnologias de display de fago, tecnologias sintéticas, por exemplo, enxerto de CDR, ou combinações de semelhantes tecnologias, ou outras tecnologias conhecidas na técnica.

Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com DKK-1 humano ou fragmentos dos mesmos, os anticorpos . 15 resultantes podem ser recuperados e purificados, e a determinação de se eles possuem propriedades de ligação e funcionais similares a ou as mes- . mas que os compostos dos anticorpos revelados aqui, neste requerimento de patente, pode ser avaliada pelos métodos revelados nos Exemplos abai- xo.

Fragmentos de ligação antigênica também podem ser preparados por métodos convencionais.

Métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmentos de ligação antigênica são de conhecimento geral na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, New York, capítulos 5-8 e 15, ISBN 0-87969-314-2. A expressão “anticorpo quimérico” se refere a um anticorpo con- tendo domínios de diferentes espécies (geralmente 2 espécies). O anticorpo V é um anticorpo quimérico em que os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada contêm resíduos de um anticorpo murino, enquanto o do- mínio de cadeia leve de região constante contém resíduos compreendendo uma cadeia leve kappa de rato e os domínios de cadeia pesada de região constante contém resíduos compreendendo um anticorpo IgG1 de rato.

O Anticorpo V é uma quimera murina/ de rato e é usado em estudos para re-

. 13/40 duzir a probabilidade de reação imune em modelos pré-clinicos de longo termo.

A expressão “anticorpos manipulados humanos” se refere a an- ticorpos monoclonais que têm propriedades de ligação e funcionais de acor- docoma invenção, e que têm regiões de framework que são substancial- mente humanas ou plenamente humanas em torno de CDRs derivadas de um anticorpo não humano. “Fragmentos de ligação antigênica” de seme- lhantes anticorpos manipulados humanos incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')>, e fragmentos Fv de cadeia única.

“Região de framework" ou “sequência de framework” se refere a qualquer uma das regiões do framework 1 a 4. Anticorpos manipulados humanos e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos englobados pela presente invenção incluem moléculas em que qualquer uma ou mais das regiões de framework 1 a 4 é substancialmente ou plenamente humana, isto é, em que está presente qualquer uma das possíveis combinações de regiões de fra- mework 1 a substancialmente ou plenamente humanas 4 individuais. Por . exemplo, isto inclui moléculas nas quais a região de framework 1 e a região de framework 2, a região de framework 1 e a região de framework 3, a regi- ão de framework 1, 2, e 3, etc., são substancialmente ou plenamente huma- nas. Frameworks substancialmente humanos são aqueles que têm no míi- nimo cerca de 80% de identidade de sequência com uma sequência de fra- mework da linhagem germinativa (germline) humana conhecida. Preferenci- almente, os frameworks substancialmente humanos têm no mínimo cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99% de identidade de se- —quênciacom uma sequência de framework da linhagem germinativa humana conhecida, Frameworks plenamente humanos são aqueles que são idênti- cos a uma sequência de framework da linhagem germinativa humana co- nhecida. Sequências da linhagem germinativa de framework humana po- dem ser obtidas na ImMunoGeneTics (IMGT) através de seu website http://imgt.cines.fr, ou no The Immunoglobulin FactsBook de Marie-Paule Lefranc e Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por

: 14/40 exemplo, frameworks de cadeia leve da linhagem germinativa podem ser selecionados entre o grupo consistindo em: Al1, A17, A18, A19, A20, A27, A30, UI, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2, e OB, e regiões de frame- work de cadeia pesada da linhagem germinativa podem ser selecionadas entreo grupo consistindo em: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, e VH5-51. Anticorpos manipulados humanos além daqueles revelados a- qui, neste requerimento de patente, apresentando propriedades funcionais similares de acordo com a presente invenção podem ser gerados usando vários métodos diferentes. Os compostos dos anticorpos específicos reve- lados aqui, neste requerimento de patente, podem ser usados como mode- los ou compostos dos anticorpos de origem para preparar compostos dos anticorpos adicionais. Em uma abordagem, as CDRs de compostos dos an- ticorpos de origem são enxertadas em um framework humano que tem uma | elevada identidade de sequência com o framework do composto do anticor- - po de origem. A identidade de sequência do novo framework geralmente será no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, ou no mínimo cerca de 99% idêntica à se- —quência do framework correspondente no composto do anticorpo de origem. Esta enxertação pode resultar em uma redução na afinidade de ligação em comparação com a do anticorpo de origem. Se for este o caso, o framework pode ser retromutado para o framework de origem em determinadas posi- ções com base em critérios específicos revelados por Queen et al. (1991) Proc Natl. Acad. Sci USA 88:2869. Referências adicionais descrevendo métodos úteis em humanização de anticorpos de camundongo incluem as Patentes U.S. Nos. 4.816.397; 5.225.539, e 5.693.761; os programas de computação ABMOD e ENCAD conforme descrito em Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620; e o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; e Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536.

A identificação de resíduos a considerar para retromutação pode

& 15/40 ser realizada como se segue: Quando um aminoácido se encaixa sob a seguinte categoria, o aminoácido de framework da sequência da linhagem germinativa humana que está sendo usada (o “framework aceitador”) é substituído por um amino- ácidode framework de um framework do composto do anticorpo de origem (o “framework doador”): (a) o aminoácido na região de framework humana do framework aceitador é incomum para frameworks humanos naquela posição, ao passo que o aminoácido correspondente na imunoglobulina do doador é típico para frameworks humanos naquela posição; (b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDRs; ou (c) qualquer átomo de cadeia lateral de um aminoácido de fra- mework está dentro de cerca de 5-6 ângstroms (centro-a-centro) de qualquer . 15 átomo de um aminoácido da CDR em um modelo de imunoglobulina tridi- mensional.

- Quando cada um dos aminoácidos na região de framework hu- mana do framework aceitador e um aminoácido correspondente no frame- work doador é geralmente incomum para frameworks humanos naquela po- sição, o aminoácido referido pode ser substituído por um aminoácido típico para frameworks humanos naquela posição. Este critério de retromutação permite que se recupere a atividade do composto do anticorpo de origem.

Outra abordagem para gerar anticorpos manipulados humanos apresentando propriedades funcionais similares aos compostos dos anticor- pos revelados aqui, neste requerimento de patente, envolve mutar aleatori- amente aminoácidos dentro das CDRs enxertadas sem alterar o framework, e triar as moléculas resultantes para afinidade de ligação e outras proprieda- des funcionais que são tão boas quanto ou melhores do que as dos compos- tos dos anticorpos de origem. Além disso, mutações únicas podem ser in- troduzidas em cada posição de aminoácido dentro de cada CDR, seguidas por avaliação dos efeitos de semelhantes mutações sobre a afinidade de ligação e outras propriedades funcionais. Mutações únicas produzindo pro-

- 16/40 priedades aprimoradas podem ser combinadas para avaliar seus efeitos em combinação umas com as outras.

Adicionalmente, é possível uma combinação de ambas as abor- dagens precedentes.

Depois de enxertação de CDR, pode-se retromutar regiões de framework específicas além de introduzir alterações de aminoáci- dos nas CDRs.

Esta metodologia é descrita em Wu et al. (1999) J.

Mol.

Biol. 294:151-162. Aplicando os ensinamentos da presente invenção, uma pessoa versada na técnica pode usar técnicas comuns, por exemplo, mutagênese direcionada por sítio, para substituir aminoácidos dentro das sequências de framework e CDR presentemente reveladas e portanto gerar sequências de aminoácidos de regiões variáveis adicionais derivadas das presentes se- quências.

Todos os aminoácidos alternativos que ocorrem naturalmente podem ser introduzidos em um sítio de substituição específico.

Os métodos . 15 revelados aqui, neste requerimento de patente, podem ser então usados para triar estas sequências de aminoácidos de regiões variáveis adicionais - para identificar sequências tendo as funções indicadas in vivo.

Deste modo, podem ser identificadas sequências adicionais adequadas para preparar an- ticorpos manipulados humanos e porções de ligação antigênica dos mesmos de acordo com a presente invenção.

Preferencialmente, substituição de a- minoácido dentro dos frameworks é restrita a uma, duas, ou três posições dentro de qualquer uma ou mais das 4 regiões de framework de cadeia leve e/ou de cadeia pesada reveladas aqui, neste requerimento de patente.

Pre- ferencialmente, substituição de aminoácido dentro das CDRs é restrita a uma, duas, outrês posições dentro de qualquer uma ou mais das 3 CDRs de cadeia leve e/ou de cadeia pesada.

Também são possíveis combinações das várias alterações dentro destas regiões de framework e CDRs descritas acima.

O mais preferencialmente, estas técnicas são usadas para gerar se- quências de aminoácidos de regiões variáveis adicionais usando as sequên- ciasde aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve variáveis descritas na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14 respectivamente.

Anticorpos manipulados humanos ou fragmentos de ligação an-

. 17/40 tigênica dos mesmos que “competem” com as moléculas reveladas aqui, neste requerimento de patente, são aqueles que ligam DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29) em um ou mais sítios que são idênticos a, ou se sobrepõem a, o um ou mais sítios nos quais as presentes moléculas ligam.

Anticorpos ma- —nipulados humanos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos com- petitivos podem ser identificados, por exemplo, através de uma prova de competição de anticorpo.

Por exemplo, uma amostra de DKK-1 humano pu- rificado ou parcialmente purificado (SEQ ID NO: 29) é ligada a um suporte sólido.

Um anticorpo revelado aqui, neste requerimento de patente, e um anticorpo monoclonal de teste ou fragmento de ligação antigênica, com quer o teste ou o anticorpo da presente invenção etiquetado, são em seguida adi- cionados.

Se o anticorpo etiquetado e o anticorpo não etiquetado ligam a sítios separados e distintos sobre DKK-1, o anticorpo etiquetado ligará no mesmo nível se ou não o anticorpo competitivo suspeito estiver presente.

Noentanto, se os sítios de interação são idênticos ou se sobrepõem, o anti- Ê corpo não etiquetado competirá, e a quantidade de anticorpo etiquetado |li- - gado ao antígeno será reduzida.

Se o anticorpo não etiquetado estiver pre- sente em excesso, nenhum anticorpo não etiquetado ligará.

Para os fins da presente invenção, anticorpos manipulados humanos competitivos ou frag- mentos de ligação antigênica dos mesmos são aqueles que reduzem a liga- ção dos presentes anticorpos a DKK-1 por cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99%. Detalhes de procedimentos para realizar semelhantes provas de competição são de conhecimento geral na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, às páginas 567-569, ISBN 0-87969-314-2. As provas referidas podem ser tornadas quantitativas usando anticorpos purificados.

Uma curva padrão é estabelecida titulando um anticorpo contra uma versão etiquetada do mesmo.

A capacidade de um anticorpo monoclonal competitivo não etique- tado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo para inibir a ligação da molécula etiquetada à lâmina é titulada.

Os resultados são plotados, e as

: 18/40 concentrações necessárias para obter o grau desejado de inibição de liga- ção são comparadas. Se anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos que competem com anticorpos manipulados huma- nos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos da presente invenção em semelhantes provas de competição possuem as mesmas propriedades funcionais ou similares dos presentes anticorpos manipulados humanos po- de ser determinado através dos métodos revelados nos Exemplos aqui, nes- te requerimento de patente.

O termo “inibir” significa a capacidade para substancialmente antagonizar, impedir, prevenir, refrear, retardar, romper, eliminar, parar, re- duzir, ou reverter os efeitos biológicos de DKK-1.

O termo “tratar” (ou “tratar” ou “tratamento”) se refere a proces- sos envolvendo um retardamento, interrupção, suspensão, controle, parada, redução, ou reversão da progressão ou gravidade de um sintoma, distúrbio, í 15 condição, ou doença, mas não envolvem necessariamente uma eliminação total de todos os sintomas, condições, ou distúrbios relacionados com a do- ença associados com atividade de DKK-1.

O termo “prevenir” (ou “evitar” ou “prevenção”) significa impedir, restringir, ou inibir a incidência ou ocorrência de um sintoma, distúrbio, con- dição,oudoença. Eventos agudos e condições crônicas podem ser tratados e prevenidos. Em um evento agudo, um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo é administrado no início de um sintoma, distúrbio, con- dição, ou doença, e é descontinuado quando o evento agudo termina. Em contraste, um sintoma, distúrbio, condição, ou doença crônicos é tratado du- rante um período de tempo mais prolongado.

O termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade ou dose de um composto do anticorpo da presente invenção o qual, na administração de dose única ou múltipla a um paciente, proporciona o tratamento ou preven- ção desejados. Quantidades terapeuticamente eficazes dos compostos dos anticorpos presentes podem compreender uma quantidade na faixa de a partir de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg por dose única. Uma quantidade terapeuticamente eficaz para qualquer paciente individual pode

- 19/40 ser determinada pelo responsável pelo tratamento monitorando o efeito dos compostos dos anticorpos em um biomarcador.

O termo “cura de osso” se refere à estimulação da formação de osso em sítios de lesão por bloqueio de DKK-1. Exemplos de indicações de cura de osso incluem, mas não estão limitados a, cura de fratura, fixação/ retenção de implante, e fixação/ retenção de implante dentário.

Os anticorpos manipulados humanos da presente invenção po- dem ser usados como medicamentos em medicina humana, administrados por uma variedade de vias. O mais preferencialmente, as composições refe- ridas são para administração parenteral. As composições farmacêuticas re- feridas podem ser preparadas por métodos de conhecimento geral na técni- ca (Vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19" ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) e compreendem um anticorpo manipulado humano conforme revelado aqui, neste requerimento de patente, e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitá- : vel.

. Os resultados dos seguintes testes demonstram que os anticor- pos monoclionais e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos, da pre- sente invenção são úteis como um inibidor de DKK-1. Os anticorpos da pre- sente invenção possuem uma série de propriedades desejáveis. Por exem- plo, o anticorpo Il da presente invenção tem aumentadas estabilidade quími- ca e física, e solubilidade. Estudos acelerados são realizados para avaliar a estabilidade química de anticorpos incubando os anticorpos da presente in- venção sob diferentes condições tampão (variação de pH e de NaCl) e incu- bandoad4C,25ºC,e40ºC por 4 semanas. Modificações químicas dos anti- corpos da presente invenção são detectadas por cromatografia de permuta de cátion ('(CEX”) para separar variantes de carga (por exemplo, desamida- ção de asparagina para ácido aspártico) e análise por LC-MS para identificar sítios específicos de degradação. O Anticorpo |! tem a menor quantidade de degradação detectada por CEX e este resultado é adicionalmente confirma- do por dados de LC-MS mostrando que todos os três resíduos asparagina nas CDRs tiveram a menor quantidade de desamidação comparados com os

. 20/40 outros anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente, depois de incubação por 4 semanas a 40ºC em tampão de pH 8. A solubilidade para o Anticorpo |l é mais favorável comparado com o Anticorpo | quando formula- do em pH 6 + 150 mM de NaCl.

Além disso, o Anticorpo |l manteve solubili- dadede>105mg/mL quando armazenado em 4ºC, ao passo que a solubili- dade para o Anticorpo | é de somente 48 mg/mL e precipitou sob as mesmas condições.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “EC50” se refere à concentração de um agente o qual produz 50% da resposta máxima possível para aquele agente. “Kd” se refere à constante de dissociação de equilíbrio a qual pode ser calculada pela fórmula: Kot /Kon = Kd

Exemplo 1-Produção de Anticorpos

Os Anticorpos |, Il, Ill, e IV podem ser produzidos e purificados como se segue.

Uma célula hospedeira apropriada, tal como HEK 293 EB- NA ou CHO, é quer transitoriamente ou estavelmente transfectada com um sistema de expressão para secretar anticorpos usando uma proporção ótima : predeterminada de vetor HC:LC ou um único sistema vetorial codificando - tanto HC, tal como SEQ ID NO: 23, ou SEQ ID NO: 24, quanto LC, tal como SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28. Meio clarificado, no qual o anticorpo foi secretado, é purificado usando quaisquer de muitastécnicas comumente usadas.

Por exemplo, o meio pode ser con- venientemente aplicado a uma coluna de Proteína A ou G Sepharose FF que tenha sido equilibrada com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna é lavada para remover compo- nentes de ligação inespecífica.

O anticorpo ligado é elutriado, por exemplo, porgradiente de pH (tal como 0,1 M de tampão de fosfato de sódio pH 6,8 a 0,1 M de tampão de citrato de sódio pH 3,0). São detectadas frações de anticorpos, tal como por SDS-PAGE, e em seguida são reunidas.

Purifica- ção adicional é opcional, dependendo da aplicação pretendida.

O anticorpo pode ser concentrado e/ou filtrado estéril usando técnicas comuns.

Agrega- do solúvel e multímeros podem ser removidos de modo eficaz por técnicas comuns, inclusive cromatografia de exclusão de tamanho, de interação hi- drofóbica, de permuta iônica, ou em hidroxiapatita.

A pureza do anticorpo

* 21/40 depois destas etapas de cromatografia é maior do que 99%. O produto pode ser congelado imediatamente a -70ºC ou pode ser liofilizado. As sequências de aminoácidos para estes anticorpos são proporcionadas abaixo.

SEQ ID NOs eta a Oda | e nz as | da |

A nv 2

HCDRI Loro a e Jos os oe 7 tt =: | 4 | s | s | 7 E A ss e o La des se | a Exemplo2: Medições da afinidade (Kd) para anticorpos contra DKK-1 Para estabelecer um equilíbrio de ligação, uma concentração constante de anticorpo é misturada com concentrações variáveis de DKK-1 com etiqueta de His (His-tagged) (SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33) (faixa de 1 nM a 1 DM) em PBS (pH74) + 1 mg/mL albumina sérica bovina (“BSA”) ou tampão isolado e incubada por vários dias a 37ºC. São estabelecidas duas séries de reações de ligação, uma série em baixa concentração de anticorpo (3 pM) e uma sé- rie em concentração elevada de anticorpo (30 ou 50 pM).

Depois de estabelecer equilíbrio, um instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) é usado para sonda para fração de anticorpo “livre' (não ligado). Em resumo, DKK-1 com etiqueta de His é ligado de modo covalente a contas de Sepharose 4 Fast Flow ativadas com NHS (GE Healthcare) as quais são comprimidas pelo instrumento para criar uma coluna pequena. As

. 22/40 misturas pré-equilibradas de anticorpo + DKK-1 com etiqueta de His são passadas sobre as contas para capturar somente anticorpo livre. A quanti- dade de anticorpo livre capturado é proporcional à concentração livre nas amostras equilibradas, e é detectada por injeção de um anticorpo secundário com «etiqueta fluorescente. Séries de dados de concentrações baixas e ele- vadas de anticorpo são ajustadas globalmente usando análise de curva-n no software KinExA. Este ajuste retorna um valor de Kd bem como o intervalo de confiança de 95%. Tabela 1: Afinidade de Anticorpo Il para DKK-1 de várias espécies 84-26 Murino 47-11 ; Exemplo 3: Prova do efeito de anticorpos contra DKkk-1 em fosfatase ' alcalina C20C12 Sinalização de Wnt canônica é importante para diferenciação e atividade dos osteoblastos. Wnt-3a CM (Condicioned Media) combinado com BMP-4 induz células C2C12 de camundongo pluripotentes a diferenciar em osteoblastos com um desfecho mensurável de fosfatase alcalina ('AP”), um marcador da atividade dos osteoblastos. DKK-1, um inibidor da sinaliza- ção de Wnt canônica, inibe a diferenciação e produção de fosfatase alcalina. Anticorpos contra DKK-1 neutralizantes previnem a inibição de fosfatase al- calina mediada por DKK-1. Anticorpos os quais bloqueiam a atividade inibi- tóriade DKK-1 previnem a perda da atividade de fosfatase alcalina.

Células C2C12 são cultivadas até 60% a 80% de confluência em frascos de cultura de tecido em meio de crescimento (Meio de Eagle Modifi- cado por Dulbecco (“DMEM”) contendo L-glutamina, 10% de soro bovino fetal inativado por calor (“FBS”), 1x antibiótico/ antimicótico, 1x piruvato de sódio. Células C2C12 são ressuspendidas até uma concentração de

30.000 células/ml. em meio de crescimento e 100 ul/ poço são adicionados a uma lâmina de cultura de tecido de 96 poços e incubadas de um dia para o outro a 37 e, 95% de umidade, 5% de CO2. O meio de crescimento é subs- tituído com 50 ul de meio de teste (DMEM contendo L-glutamina, 5% de FBS inativado por calor, 1x antibiótico/ antimicótico, 1x piruvato de sódio). Para estimular diferenciação (e deste modo induzir a produção de fosfatase alcalina), 100 ul de meio de teste mais 1,5x Wnt-3a CM + BMP-44 (R & D Systems catalogue no. 314-BP) são adicionados.

Isto produz uma concen- tração final de 1x Wnt-3a CM e 25 ng/ml de BMP-4. Controles negativos contêm somente L-cell CM (nenhum Wnt-3a ou BMP-4). As células são in- cubadosa37ºC,95% de umidade, 5% de CO2 por 72 horas.

O meio é re- movido, as células são lavadas com 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (“PBS”), e a PBS é removida.

As células são congeladas- degeladas 3 vezes. 100 ul de substrato One-step pNPP (Thermo Scientific catalogue no. 37621) são adicionados por poço, e a lâmina é incubada em õ 15 temperatura ambiente.

A absorvência é lida a 405 nm.

Para determinar a concentração de DKK-1 requerida para inibir diferenciação, moléculas de - Dkk-1 de várias espécies são tituladas para identificar a concentração míni- ma requerida para inibir plenamente a indução de fosfatase alcalina.

A concentração mínima de DKK-1 de cada espécie a qual inibe plenamente a indução de fosfatase alcalina é como se segue: DKK-1 huma- no = 38 nM, DKK-1 de cynomolgus = 11,4 nM, DKK-1 de rato = 58 nM, e DKK-1 de coelho = 25,0 nM.

Tendo determinado a concentração de DKK-1 a qual inibe ple- namente a indução de fosfatase alcalina, concentrações crescentes de um anticorpo anti:-DKK-1 são pré-incubadas em meio de prova com uma con- centração inibitória de DKK-1 por 30 minutos em temperatura ambiente.

A indução de fosfatase alcalina é determinada conforme descrito acima.

Os resultados são reportados como uma EC50 (nM + erro padrão). O Anticorpo Il bloqueia a inibição de C2C12 AP mediada por Dkk-1. ParaoDKK-1 de várias espécies, as EC50's (dadas como nM + erro padrão) são como se segue: humana = 9,8 + 0,41, cynomolgus = 6,4 + 0,25, rato = 2,9 + 0,25, e coelho = 6,0 + 0,32.

Exemplo 4: Prova de defeito cortical (CD) in vivo Ratos fêmeas Sprague-Dawley de seis semanas de idade são ovariectomizados e deixados para perder osso por dois meses.

Defeitos de 2 mm de diâmetro são introduzidos no fêmur esquerdo e no fêmur direito com uma furadeira elétrica com uma broca dental de 2 mm.

Este furo se estende através tanto do córtice anterior quanto do córtice posterior.

A cura do osso é monitorada longitudinalmente avaliando a densidade da massa óssea (“BMD”) através da aplicação de tomografia computadorizada quanti- tativa (“qCT”) por 35 dias depois da cirurgia.

Ao final do experimento, os a- nimais são sacrificados e os fêmures inteiros são submetidos a determina- ções de teste de resistência (loaded-to-failure) para determinar a resistência biomecânica da diáfise inteira.

Anticorpos são administrados por via subcu- tânea em doses e intervalos conforme indicado.

O Anticorpo Il é dosado como se segue: 5 mg/kg uma vez a é 15 cada duas semanas iniciando um dia depois da cirurgia (Grupo 1), 1 mg/kg (Grupo 2), 5 mg/kg (Grupo 3), ou 15 mg/kg (Grupo 4) são administrados uma : vez a cada duas semanas iniciando nove dias depois da cirurgia.

A densi- dade da massa óssea é avaliada por tomografia computadorizada quantitati- va no dia 35. O Grupo 1 apresentou um aumento estatisticamente significa- tivona densidade da massa óssea tanto nos córtices anterior quanto poste- rior.

O Grupo 4 apresentou um aumento estatisticamente significativo na densidade da massa óssea em ambos os córtices, embora os Grupos 2 e 3 tenham apresentado um aumento não significativo na densidade da massa Óssea.

Exemplo5: Prova de eficácia em câncer in vivo Camundongos (camundongos fêmeas C.B-17, modelo imunodefi- ciente combinado Fox Chase grave no.

CB17SC-M) são aclimatados por uma semana em uma instalação animal antes da iniciação do experimento.

Depois da aclimatação, os camundongos são randomizados em grupos de 10 por tratamento.

Células de carcinoma pulmonar de células não pequenas AS49 humanas cultivadas são implantadas por via subcutânea no flanco posterior dos camundongos e os tumores são deixados para atingir um volume tumoral

. 25/40 médio -— 100 mmº?. O Anticorpo Il (1 mg/kg e 5 mg/kg), anticorpo IgG controle (1 mg/kg e 5 mg/kg), ou veículo (solução salina tamponada com citrato su- plementada com 0,02% de Tween 80) é administrado através de injeção sub- cutânea. Os animais recebem 2 tratamentos separados por 7 dias.

Os tumores são medidos 2 vezes por semana por calibradores eletrônicos para plotar curvas de crescimento. Os animais também são mo- nitorados duas vezes por semana para flutuações no peso corporal e sinais de toxicidade. Medições do volume tumoral mostradas na tabela 3 são to- madas no dia 29.

Conforme mostrado na Tabela 2, grupos de tratamento rece- bendo o Anticorpo Il, demonstraram significativa inibição do crescimento de xenoenxertos pulmonares de células não pequenas A549 humanos in vivo. Tabela 2: Eficácia do Anticorpo |l em modelo de xenoenxerto de carci- noma pulmonar de células não pequenas humano AS49 Erro Padrão (mm? grupo controle de veículo) : Iveco de cirato — = lanesas 1 | lcontrole de g6 (mare) fazesas E | [contrate de 196 (s mate) faeza E Exemplo 6: Prova de renormalização angiogênica de xenoenxerto in vivo Para entender o mecanismo da eficácia antitumoral, análise de estudo por imagens de alto conteúdo (high content imaging) é realizada so- bre tumores A549 tratados com o Anticorpo Il ou 19G controle. Vários mar- cadores de base fenotípica são analisados tanto quantitativamente e qualita- tivamente para avaliar os processos biológicos relevantes para o câncer de angiogênese (CD31 e actina dos músculos lisos, SMA), indução de hipóxia (transportador de Glicose 1, GLUT1), proliferação celular (Ki67), e apoptose (Terminal UDP Nick-End Labeling, TUNEL).

Camundongos fêmeas C.B-17 (Fox Chase SCID) modelo no.

. 26/40 CB17SC-M com idades de 7 a 8 semanas são aclimatados por uma semana e deixados para se alimentar ad libitum em uma dieta de baixo teor de gor- dura normal (4,5%), a qual é continuada pela duração do estudo. Células AS49 de origem da ATCC são cultivadas e divididas em meios F-12 de Kaighn (InVitrogen no. 21127) suplementados com 10% de FBS (InVitrogen no. O, e 100x diluições de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e pen-strep (Invitrogen no. 11360, no. 11140 e no. 15140 respectivamente). Elas são destacadas e preparadas em uma concentração final de 50x10º células/ml em PBS na passagem 19 com 95% de viabilidade.

5x105 células de carcinoma pulmonar humano A549 são injeta- das por via subcutânea no flanco dos camundongos em questão em uma mistura a 1:1 de PBS e Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA). São reali- zadas medições do tumor e peso corporal duas vezes por semana. Antes do tratamento, os camundongos são randomizados com base no tamanho do : 15 tumor usando um algoritmo de randomização. Iniciando quando os tumores atingiram 200 mm?, os camundon- : gos randomizados são separados em 2 grupos de 10 animais e dosados por via subcutânea no dia 1 e novamente no dia 8 com 5 mg/kg de quer o Anti- corpo Il ou o controle de I9G4. O estudo é terminado 10 dias depois da ad- ministração da primeira dose de anticorpo.

O Anticorpo Il é preparado em Solução Salina Tamponada com Citrato (CBS) (10 mM de citrato pH 6, 150 mM de NaCl e 0,2% de polissor- bato). O controle de IgG4 é proporcionado a 6,0 mg/ml em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS).

Tumores de xenoenxerto são excisados dos camundongos de- pois de 17 dias de dosagem e colocados em fixador Zinco-Tris (BD Phar- mingen). Os tumores fixados são processados, bloqueados em parafina, e seccionados como cortes de 3 uM sobre lâminas de microscópio de rotina. As lâminas são cozidas a 15,56 ºC (60 ºF) por 1 hora e em seguida despa- rafinizadas em xileno (4 tratamentos, 10 minutos cada). As lâminas são rei- dratadas através de uma série de imersões em etanol/ água com lavagens finais em solução salina Tris-tamponada /Tween (TBST). As lâminas são em seguida bloqueadas com Protein Block (DAKO) por 30 minutos. Para o Pai- nel de Saúde Tumoral, as lâminas são coradas com uma combinação de Hoechst 33324 (Invitrogen), CD31 de rato anti-humano (Pharmingen)/ Alexa- 488 antirrato (Invitrogen), anti-Ki87 de coelho (NeoMarkers)/ Alexa 647 anti- coelho (Invitrogen), e vermelho TUNEL-TMR (diluído a 1:5 em tampão de diluição TUNEL; Roche). Para o Painel de Angiogênese, as lâminas são co- radas com uma combinação de Hoechst 33324 (Invitrogen), CD31 de rato anti-humano (Pharmingen)/antirrato Alexa-488 (Invitrogen), anti-GLUT1 de coelho (Chemicon)/ Alexa 647 anticoelho (Invitrogen), e antiActina dos Mús- culos Lisos de camundongo /Cy3 (Sigma). As lâminas são estudadas por imagens usando um citômetro de varredura a laser iCys Laser Scanning Cy- tometer (CompuCyte) e uma estação de trabalho digital Marianas Digital |- maging Workstation configurada com um microscópio de fluorescência inver- tido Zeiss Axiovert 200M (Intelligent Imaging Innovations). Comparações de ÁS 15 dados quantitativos de grupos de tratamento são realizadas usando a análi- se de Dunnet em software estatístico JMP (SAS).

" Conforme mostrado na Tabela 3, xenoenxertos A549 de animais tratados com IgG controle são modestamente vascularizados, têm níveis moderados de miofibroblastos e muitras áreas focalizadas de hipóxia. Tu- mores tratados com IgG controle têm uma rede estendida de vasos consis- tindo tanto de brotos vasculares neoangiogênicos quanto de vasos maduros que são pobremente cobertos por perícitos. Tumores tratados com IgG con- trole têm áreas hipóxicas (marcadas por GLUT1) que são claramente zonas demarcadas a alguma distância de vasos perfundidos e áreas necróticas queestão ainda mais longe dos vasos. Tratamento com o Anticorpo || resul- ta em reduzida área de vasos, reduzida área de pericito, e reduzida cobertu- ra por periícitos dos vasos. No entanto, este tratamento não resultou em uma diferença significativa em hipóxia tumoral. Qualitativamente, a vascula- tura do tumor tratado com o Anticorpo Il parece consistir em vasos menores emenosreticuladose com menos cobertura por pericitos comparado com o grupo tratado com IgG controle.

Conforme mostrado na Tabela 3, tumores tratados com IgG têm f 28/40 células tumorais proliferativas distribuídas uniformemente por toda parte, mas também apresentam frequentemente uma ou mais grandes áreas de necrose que são avasculares.

Tratamento com o Anticorpo Il resulta em ne- nhuma modificação na apoptose e somente uma redução ligeira, não signifi- cativana área de proliferação total.

No entanto, há uma profunda redução na percentagem de área de células Ki67 de intensidade elevada nos tumo- res tratados com o Anticorpo Il, a qual pode indicar uma quantidade reduzida de células na fase do ciclo celular G2. Tabela 3: Prova de anticorpo Il em renormalização angiogênica de xe- —noenxerto in vivo Valor de IgG Contro- | Importância Es- le: Valor de Tratamen-| tatística (valor-p Painel Fenotípico |Parâmetro Biológico | to com Anticorpo ll de Dunnet) Painel de Angiogê- |% da Área Total dos S nese Tumoral Vasos 10,26 : 7,88 0,001 Painel de Angiogê- /% da Área Funcional nese Tumoral dos Vasos 9,84 : 7,59 0,0009 Painel de Angiogê- |% da Área Não Fun- nese Tumoral cional dos Vasos 0,42: 0,30 0,1341 Painel de Angiogê- |% de Vasos Cobertos nese Tumoral com Pericito 42,44 : 30,88 0,0234 Painel de Angiogê- 1% da Área Hipóxica nese Tumoral ITumoral 14,90 : 11,77 0,3615 Painel de Prolifera- |% da Área de Prolife- ção Tumoral ração Tumoral 12,16: 9,68 0,1739 Painel de Prolifera- |% da Área de Elevado ção Tumoral Ki67 0,66 : 0,19 0,0012 % de Ciclagem de Painel de Prolifera- jCélulas Tumorais ão Tumoral com Elevado Ki67 5,24 : 1,68 <0,0001 rs ua Leme Tumoral Itose Tumoral 8,63: 8,24 0,7466

. 29/40 os vasos independente de seu status funcional. vasos em regiões não hipóxicas. por vasos em regiões hipóxicas. são associados com células expressando actina de músculos lisos (SMA). células expressando GLUT1, um marcador substituto para hipóxia. % da Área de Proliferação Tumoral — Percentagem da área de tecido tumoral que é positiva para Ki67, uma proteína nuclear rotineiramente usada como um marcador de células ativamente proliferativas. % da Área com Elevado Ki67 - Percentagem da área de tecido tumoral que cora inten- . samente para Ki67. Células expressando altos níveis de Ki67 estão em fases posterio- res do ciclo celular do que aquelas que expressam menores níveis de Ki67.

' % de Ciclagem de Células Tumorais com Elevado Ki67 — Percentagem de todas as células positivas para Ki67 que são designadas como tendo um alto nível de expressão de Ki67. Células expressando altos níveis de Ki67 estão em fases posteriores do ciclo celular do que aquelas que expressam menores níveis de Ki67.

% da Área de Apoptose Tumoral — Percentagem da área de tecido tumoral com eleva- da coloração por TUNEL. TUNEL é um método usado rotineiramente para detectar rup- Ituras de DNA de filamento duplo as quais são indicativas de apoptose terminal. Exemplo 7: Prova de eficácia óssea in vivo Para avaliar a capacidade do Anticorpo V (Cadeia leve SEQ ID NO: 34 e Cadeia pesada SEQ ID NO: 35) acelerar a formação de osso peri- implante e regenerar tecido ósseo, são utilizados ratos Sprague-Dawley ma- chosde quatro meses de idade (Harlan Sprague Dawley Inc) pesando cerca de 425 gramas. Os ratos são implantados cirurgicamente com parafuso de titânio (2 mm x 4mm) em ambas as pernas na face lateral média (media late- ral side) logo acima da junção tibial-fibular. Em seguida os ratos são aleato- riamente divididos em 2 grupos de acordo com o peso corporal e recebem

' 30/40 quer 10 mg/kg do Anticorpo V ou 10 mg/kg de controle de IgG por injeção por via subcutânea uma vez por semana iniciando no mesmo dia da cirurgia por 21 dias.

Tomografia computadorizada quantitativa (scanner de CT Aloka LaTheta modelo LTC-100) é usada para escanear e quantificar ex vivo o os- sorecém-formado com uma medida de voxel de 60 um.

O Volume de inte- resse (VOI) é definido como 28 cortes em intervalo de 0,1 mm sobre o sítio do implante prévio.

Diferenças entre os grupos são avaliadas com o softwa- re JMP versão 5.1. (Cary, North Carolina), comparação contra controle de IgG usando o Método de Dunnett com um nível de significância de P<0,05. Avaliação qualitativamente por imagens de raios-x faxitron ex vivo indica que os ratos tratados com o Anticorpo V têm mais osso novo ou calo em torno do implante.

Análises por CT quantitativa revelam um aumento estatisticamente significativo do teor de mineral do osso peri-implante cortical (14%), da área óssea nova (16%), da espessura cortical (7%) e do teor de mineral do osso : 15 novo peri-implante esponjoso da medula óssea (18%), e da área óssea (16%) em ratos tratados com o Anticorpo V quando comparado com controle " de IgG.

Os dados demonstram que o Anticorpo V estimula formação óssea nova e acelera a regeneração do tecido ósseo em ratos implantados com titânio.

Tabela4: Análises Micro-CT de Formação de Osso Novo Peri-implante Análises de Peri-implante Análises de Peri- da Medula Óssea implante Cortical Ghia Teordemine- ÁreaÓssea — Teordemine- ÁreaÓs- Espessura ral ósseo (mg; (emº2 ral ósseo (mg) sea (cm'2) cortical (cm) Controle deigG 10 0,84 0,034 6,70 0,064 0,054 +0,04 +0,001 +0,07 +0,001 +0,001 Anticor- poV 10 1,00 0,039 7,61 0,074 0,057 +0,04* +0,002* +0,06* +0,001* +0,001* Dados são apresentados como Média + SE. *, p<0,05, vs controle de IgG, teste de JMP Dunnett,

. 31/40 Listagem de SEQID CDRs de cadeia pesada SEQ ID NO: 1 GFTFSSYTMS SEQ ID NO: 2 TISGGGFGTYYPDSVKG SEQIDNO:3 PGYHNYYFDI SEQ ID NO: 4 PGYNNYYFDI CDRs de cadeia leve SEQ ID NO: 5 HASDSISNSLH SEQ ID NO: 6 YGROSIQ SEQIDNO:7 QQASESWPLH SEQ ID NO: 8 YARQSIQ SEQ ID NO: 9 QQASASWPLH SEQ ID NO: 10 YARQSEQ Regiões variáveis de cadeia pesada SEQIDNO: 11 : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVA - TISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPG

YHNYYFDIWGOGTTVTVSS SEQ ID NO: 12

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVA TISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPG

YNNYYFDIWGQGTTVTVSS Regiões variáveis de cadeia leve SEQ ID NO: 13

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGR QSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCAQASESWPLHFGGGTK

VEIK SEQ ID NO: 14

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYAR —QSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQASESWPLHFGGGTK

VEIK SEQ ID NO: 15 o: 32/40

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGR OQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCAQQASASWPLHFGGGTK

VEIK SEQ ID NO: 16

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYAR QSEQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQASASWPLHFGGGTK

VEIK Cadeias pesadas completas SEQ ID NO: 17

EVOALVESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVA TISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPG YHNYYFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTC NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS - QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 18

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVA TISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPG YNNYYFDIWGQGTTVIVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTC NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSRLTVDKSRWOQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG Cadeias leves completas SEQIDNO:19

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQOQAPRLLIYYGR QSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQASESWPLHFGGGTK

' 33/40

VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSP

VTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYAR QSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQASESWPLHFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSP

VTKSFNRGEC SEQIDNO:21

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGR QSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQASASWPLHFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL

QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSP í 15 VITKSFNRGEC SEQ ID NO: 22

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYAR QSEQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCAQASASWPLHFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSP

VTKSFNRGEC Sequências de Nucleotídeos - Regiões variáveis de cadeia pesada SEQ ID NO: 23

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGCG GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTAT ACCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGT GGCCACCATTTCCGGTGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGT GAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT —GCGAGACCTGGATATCACAACTACTACTTTGACATCTGGGGCCAAGGGA CCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC

CGCTAGCGCCCETGCTECAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTG o. 34/40

GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCAT GCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTC CTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCOCCOTG AGGTCACGTGCGTGEGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTC CAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA AAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATOEGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCOGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC AGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA

ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT SEQIDNO: 24

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTAT ACCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGST GGCCACCATTTCCEGGTGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGT GAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGACCTGGATATAATAACTACTACTTTGACATCTGGGGCCAAGGGA CCACGGTCACCGTCTCOTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCE CGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTG GGCTGCCTGEGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTEG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC

. 35/40

AGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCAT GCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTC CTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCOTGS AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTC CAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA AAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATOEGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG

GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC S 15 AGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA

ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT x Sequências de Nucleotídeos - Regiões variáveis de cadeia leve SEQ ID NO: 25

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGG — AAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCC TACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TTATGGCAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAG TGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGA AGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCAC TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCEGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC — CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCEGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA CAGGGGAGAGTGC

É 36/40 SEQ ID NO: 26

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTITTGTCTCCAGGGG AAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCC TACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TTATGCTAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAG TGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGA AGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCAC TTCGGCEGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG

CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA : 15 CAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO: 27

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGG AAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCC TACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TTATGGCAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAG TGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGA AGATTTTGCAGTITTATTACTGTCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCAC TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG

CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA —CAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO: 28

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGEGG

. 37/40

AAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCC TACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TTATGCTAGACAGTCCGAGCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAG TGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGA — AGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCAC TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATO TGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCECCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAMAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA

CAGGGGAGAGTGC DKK-1 Humana SEQIDNO:29 í TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQP

YPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGN YCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTK GQAQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGL

EIFORCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCARH DKK-1 de Cynomolgus SEQ ID NO: 30

TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQP YPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVOICLACRKRRKRCMRHAMCCPGN YCKNGICVSSDOQNNFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHSK GQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGL

EIFORCYCGEGLSCRIQKDHHAASNSSRLHTCOR DKK-1 de rato SEQ ID NO: 31 —TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQ

PYPCAEDEECGTDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKRCMRHAMCC PGNYCKNGICMPSDHSHLPRGEIEEGIIENLGNDHGAGDGYPRRTTLTSKIY

. 38/40

HTKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGS

HGLEIFORCYCGEGLACRIQKDHHOTSNSSRLHTCQRHAFIDYKDDDDKHV DKK-1 de coelho SEQ ID NO: 32

TLNSVLVNSNAIKNLPPPLGGANGHPGSAVSATPGILYEGGNKYLPLDNYQ PYPCTEDEECGTDEYCASPARGGGAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPG NYCKNGICMPSDHNHFHRGEIEETIVESFGNDHSTSDGYSRRTTLSSKMYH AKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSH

GLEIFORCYCGDGLSCRLQNDQHEASNSSRLHTCOR DKK-1de camundongo SEQ ID NO: 33

TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQ

PYPCAEDEECGSDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKRCMTHAMCC PGNYCKNGICMPSDHSHFPRGEIEES!IENLGNDHNAAAGDGYPRRTTILTS ' 15 KIYHTKGQEGSVCLRSSDCAAGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHKRK

GSHGLEIFORCYCGEGLACRIQOKDHHQASNSSRLHTCOARH Anticorpo V - Cadeia leve completa SEQ ID NO: 34

DILLTAOSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYAS —OQOSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLNFGAGTK LELKRADAAPTVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTER RDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLSKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPV

VKSFNRNEC Anticorpo V - Cadeia pesada completa SEQIDNO:35

EVOLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVAT ISGGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGY NNYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGY FPEPVTVTWNSGALSSGVHTFPAVLOSGLYTLTSSVTVPSSTWPSQTVTC — NVAHPASSTKVDKKIVPRNCGGDCKPCICTGSEVSSVFIFPPKPKDVLTITLT PKVTCVVVDISQDDPEVHFSWFVDDVEVHTAGTRPPEEQFNSTFRSVSEL

PILHQODWLNGRTFRCKVTSAAFPSPIEKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEE às 39/40

MTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQOPQENYKNTPPTMDTDGSYFLY

SKLNVKKEKWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK Anticorpo V - Região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 36 — DILLTASPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYAS

QSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLNFGAGTK

LELK Anticorpo V - Região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 37

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVAT ISGGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGY

NNYYFDYWGQGTTLTVSS Anticorpo V - CDRs de Cadeia Pesada SEQ ID NO: 38 TISGGGGNTYYPDSVKG É 15 SEQIDNO:39 PGYNNYYFDY Anticorpo V - CDRs de Cadeia Leve SEQ ID NO: 40 RASDSISGSLH SEQ ID NO: 41 YASQSIS SEQ ID NO: 42 QQSNSWPLN CDRs de CadeiaPesada de Consenso SEQ ID NO: 43 TISGGGX,X2TYYPDSVKG XérF,G X2éG N SEQ ID NO: 44 PGYX;NYYFDI XéH,N SEQ ID NO: 45 PGYXaNYYFDXs X4éH,N Xsél,Y CDRs de Cadeia Leve de Consenso SEQIDNO:46 XsASDSISX;SLH XséHR X;éN G

” 40/40 SEQ ID NO: 47 YXaRASXsQ XséG A Xsél E SEQ ID NO: 48 YX1oX1ASX12X13 XméGA XnéR S Xnél E XxéQ,S SEQ ID NO: 49 QOSX,SWPLH XÂméE A SEQ ID NO: 50 QQSX1sSWPLX16 X:i5é E, A,N Xi é H,N Região variável de cadeia pesada de consenso à 15 SEQIDNO:51

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVA

TISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCARPG YXaNYYFDI WGQAGTTVTVSS X17 é H, N Região variável de cadeia leve de consenso SEQ ID NO: 52 EIVLTASPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHVWYQQKPGQAPRLLIYYX18 ROS XisQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQASXxSWPLHFGGGTKVEIK XeséGA X1nélE XnÉéE,A

Claims (18)

, 114 REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo manipulado humano contra DKK-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende regiões de determinação de complementariedade (CDRs) LCDR1, LCDR2, e LCDR3 e a LCDR3 compreende CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que LCDR1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, LCDR?2 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:47, LCDR3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:49, HCDR 1 tem a sequência de aminoácidos de SEQID NO: 1, HCDR2 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, e HCDR3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:44.

2. Anticorpo manipulado humano contra DKK-1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a LCVR compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e a HCVR compreende a se- quênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 51. À

3. Anticorpo manipulado humano contra DKK-1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a LCDR2 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8, LCDR3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7, e HCDR3 tem a a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOA4

4. Anticorpo manipulado humano contra DKK-1 de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a LCVR e a HCVR compre- endem sequências de aminoácidos selecionadas entre o grupo consistindo em: (i) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (li) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos deSEQIDNO:12; (iii) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos ê 2/4 de SEQ ID NO: 11; (iv) uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

5. Anticorpo manipulado humano contra DKK-1 de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a LCVR compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e a HCVR compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

6. Anticorpo manipulado humano contra DKK-1 de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada e uma de cadeia leve selecionadas entre o grupo consistindo em a. uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 17 e cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 19, : b. uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoá- : cidos de SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, Cc. uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoá- cidosdeSEQID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e d. uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

7. Anticorpo manipulado humano contra DKK-1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende duas cadeias leves em que cada cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e duas cadeias pesadas em que cada cadeia pesada com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo manipulado humano contra DKK-1 como definido na reivindicação 1, e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente

À 3/4 aceitável.

9. Método para curar osso, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz do anticorpo manipulado humano contra DKK-1 como de- finidonareivindicação 1.

10. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz do anticorpo manipulado humano contra DKK-1 como de- finido na reivindicação 1.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lo fato de que o câncer é selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo manipulado humano contra DKK-1 como definido : 15 na reivindicação 6, e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

: 13. Método para curar osso, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz do anticorpo manipulado humano contra DKK-1 como de- finidona reivindicação 7.

14. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz do anticorpo manipulado humano contra DKK-1 como de- finido na reivindicação 7.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe- lo fato de que o câncer é selecionado entre o grupo consistindo em mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer pulmonar de células não pequenas.

16. Uso de um anticorpo como definido na reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição útil para — curarosso ou tratar de câncer.

17. Uso de um anticorpo como definido na reivindicação 7, ca- racterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição útil para

à 414 curar osso ou tratar de câncer.

18. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, reve- ladaouilustrada no pedido de patente.