ES2644244T3 - Anticuerpos DKK-1 - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos DKK-1

La presente invencion se refiere a anticuerpos humanos manipulados contra DKK-1 y a su uso en el tratamiento de enfermedades en las que la patogenia esta mediada por DKK-1.

Dickkopf-1 (Dkk-1) es un miembro de la familia de proteinas dickkopf que han demostrado ser reguladores negativos de la via de senalizacion Wnt canonica. La via desempena un papel central en el desarrollo y la formacion de hueso. Dkk-1 inhibe la senalizacion Wnt a traves de su interaccion con el correceptor Wnt LRP5 o LRP6 y las proteinas kremen. Dkk-1 impide que los miembros de la via Wnt interaccionen con LRP5 o LRP6, evitando asi la transduccion de senal mediada por Wnt. DKK1 ha demostrado tambien que interviene en los canceres con metastasis oseas, entre ellos mieloma multiple, carcinoma de mama, carcinoma renal y cancer de pulmon no microcitico.

El documento WO-2007/084.344 describe anticuerpos que se unen a la proteina Dickkopf (DKK-1) que se usan para tratar celulas con condiciones osteoliticas y, en particular, para tratar lesiones osteoliticas asociadas con el cancer.

Tambien se han descrito anticuerpos que se unen a Dkk-1 (por ejemplo, vease el documento WO2006/0.165.373), sin embargo, existe todavia la necesidad de anticuerpos humanos manipulados DKK-1 terapeuticos que inhiban la interaccion de Dkk-1 con LRP5 y LRP6. Ademas, en vista de la intervencion de Dkk-1 en la regulacion de la formacion de hueso, existe la necesidad de anticuerpos anti-DKK-1 humanos manipulados terapeuticos para su uso en la cicatrizacion del hueso. Ademas, dada la participacion de Dkk-1 en los canceres, existe la necesidad de anticuerpos anti-DKK-1 humanos manipulados para tratar canceres, incluyendo mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.

Yaccoby Shmeul y col., Blood, American Society of Hematology, US LNKD_D01: 10.1182/BLOOD _2006_09_047712, Vol. 109, n° 5, 1 de marzo de 2007, paginas 2106-2111, XP002485200 describe actividad de osteoblastos simulada por DKK-1, reduccion de la osteoclastogenia y promocion de formacion de hueso en huesos mielomatosos y no mielomatosos.

Los anticuerpos de la presente invencion son antagonistas de DKK-1 utiles terapeuticamente que poseen un conjunto de propiedades convenientes. Los anticuerpos humanos manipulados de la presente invencion muestran una alta afinidad (Kd) por DKK-1 humano, DKK-1 de Cynomolgus, dKk-1 de rata, DKK-1 de raton y DKK-1 de conejo. Los anticuerpos de la presente invencion bloquean la inhibicion mediada por DKK-1 de fosfatasa alcalina, un marcador de la actividad de osteoblastos. Ademas, los anticuerpos de la presente invencion muestran un aumento en la densidad de masa osea en las cortezas anterior y posterior en un modelo in vivo de defecto cortical y muestran una importante inhibicion del crecimiento de xenoinjertos de pulmon no microciticos in vivo.

Segun un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera (LCVR) y una region variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la HCVR comprende las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que LCDR1 presenta la SEQ ID NO: 5, LCDR2 presenta la SEQ ID NO: 8, LCDR3 presenta la SEQ ID NO: 7, HCDR1 presenta la SEQ ID NO: 1, HCDR2 presenta la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 presenta la SEQ ID NO: 4 para su uso en el tratamiento del cancer.

Preferentemente, el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, segun la presente invencion se usa en el tratamiento del cancer, en el que el cancer se selecciona entre mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.

Preferentemente, el anticuerpo DKK-1 humano manipulado es para su uso segun la presente invencion y en el que la LCVR comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y la HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12.

Mas preferentemente, el anticuerpo DKK-1 humano manipulado es para su uso segun la presente invencion y en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20.

El anticuerpo DKK-1 humano manipulado es preferentemente para su uso segun la presente invencion y que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18.

Segun un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera (LCVR) y una region variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la HCVR comprende las CdR HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que LCDR1 presenta la SEQ ID NO: 5, LCDR2 presenta la SEQ ID NO: 8, LCDR3 presenta la SEQ ID NO: 7, HCDR1 presenta la

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SEQ ID NO: 1, HCDR2 presenta la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 presenta la SEQ ID NO: 4 junto con un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable para su uso en el tratamiento del cancer.

Preferentemente, la composicion farmaceutica es para su uso segun la presente invencion en el tratamiento del cancer, en el que el cancer se selecciona entre mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.

La composicion farmaceutica para su uso segun la presente invencion puede comprender opcionalmente ademas otros ingredientes terapeuticos.

La presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una Kd a 370C inferior a 5,0 x 10-11 M para dKk-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SeQ ID NO: 31), DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33) y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32).

La presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 5, LCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 47, LCDR3 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 49, HCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 2 y HCDR3 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 44.

La presente invencion proporciona tambien una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion y un vehiculo, diluyente

0 excipiente farmaceuticamente aceptable.

La presente invencion proporciona un procedimiento de tratamiento de cancer que comprende la administracion de un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion, en el que el cancer se selecciona entre el grupo que consiste en mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.

La presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en el que el anticuerpo tiene una Kd inferior a 1,5 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd inferior a 1,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). De forma mas preferida, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd inferior a 5,0 x 10-12 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 0,5 x 10-12 M y 1,5 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). De forma mas preferida, la presente invencion proporciona el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 1,0 x 10-12 M y 1,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Los valores Kd se establecen mediante un equilibrio de union a 370C tal como se describe en el Ejemplo 2.

La presente invencion proporciona tambien un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en el que el anticuerpo tiene una Kd inferior a 5,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (sEq ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DkK-1 de raton (SEQ ID NO: 33) y DkK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd inferior a 3,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SeQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33) y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). De forma mas preferida, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd inferior a 2,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de rata (SeQ ID NO: 31) y DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33). Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 1,0 x 10-11 M y 5,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33) y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). De forma mas preferida, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 1,5 x 10-11 M y 3,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31) y DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33). Los valores Kd se establecen por un equilibrio de union a 370C tal como se describe en el Ejemplo 2.

Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 y en el que el anticuerpo DKK-

1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo tiene una Kd inferior a 3,0 x 10-11 M para DKK- 1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de

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raton (SEQ ID NO: 33) y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). De forma mas preferida, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo tiene una Kd inferior a 2,5 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33) y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo tiene una Kd inferior a 2,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33) y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). De forma mas preferida, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo tiene una Kd entre 0,5 x 10-12 M y 3,0 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33) y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo tiene una Kd entre 1,0 x 10-12 M y 2,5 x 10-11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de Cynomolgus (SEQ ID NO: 30), DKK-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de raton (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Los valores Kd se establecen por un equilibrio de union a 370C tal como se describe en el Ejemplo 2.

La presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera (LCVR) y una region variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende las regiones de determin de complementariedad (CDR) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la HCVR comprende las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 5, HCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 1 y HCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 2.

La presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 46, LCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 48, LCDR3 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 50, HCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 43 y HCDR3 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 45. La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 5, LCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 47, LCDR3 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 49, HCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 2 y HCDR3 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 44.

La presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 5, LCDR2 tiene una secuencia amino seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, LCDR3 tiene una secuencia amino seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, HCDR1 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia amino de SEQ ID NO: 2 y HCDR3 tiene una secuencia amino seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo en el que LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 tienen secuencias de aminoacidos seleccionadas entre el grupo que consiste en:

(i) LCDR1 presenta la SEQ ID NO: 5, LCDR2 presenta la SEQ ID NO: 6, LCDR3 presenta la SEQ ID NO: 7, HCDR1 presenta la SEQ ID NO: 1, HCDR2 presenta la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 presenta la SEQ ID NO: 3,

(ii) LCDR1 presenta la SEQ ID NO: 5, LCDR2 presenta la SEQ ID NO: 8, LCDR3 presenta la SEQ ID NO: 7, HCDR1 presenta la SEQ ID NO: 1, HCDR2 presenta la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 presenta la SEQ ID NO: 4,

(iii) LCDR1 presenta la SEQ ID NO: 5, LCDR2 presenta la SEQ ID NO: 6, LCDR3 presenta la SEQ ID NO: 9, HCDR1 presenta la SEQ ID NO: 1, HCDR2 presenta la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 presenta la SEQ ID NO: 3,

(iv) LCDR1 presenta la SEQ ID NO: 5, LCDR2 presenta la SEQ ID NO: 10, LCDR3 presenta la SEQ ID NO: 9, HCDR1 presenta la SEQ ID NO: 1, HCDR2 presenta la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 presenta la SEQ ID NO: 3

La presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo en el que la LCVR comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 52 y la HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 51.

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La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo en el que la LCVR comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo, en el que la HCVR comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo, en el que la LCVR y la HCVR comprenden secuencias de aminoacidos seleccionadas entre el grupo que consiste en:

(i) una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 13 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11;

(ii) una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12;

(iii) una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11;

(iv) una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado comprende una cadena ligera en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado, en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado comprende una cadena pesada en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

Mas preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado, en el que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado comprende una secuencia de aminoacidos de cadena pesada y cadena ligera seleccionada entre el grupo que consiste en

(i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 19,

(ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20,

(iii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 21, y

(iv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 22.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 19, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 21, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 22, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17.

La presente invencion proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano manipulado que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18.

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La presente invencion proporciona tambien un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo, que compite con el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion para union a DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29) tal como se determina por medio de un ensayo de competencia de anticuerpos.

La presente invencion proporciona tambien una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion y un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Ademas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion junto con un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapeuticos.

El anticuerpo de la presente invencion puede usarse en un procedimiento de cicatrizacion de hueso que comprende la administracion de un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un procedimiento de tratamiento de cancer que comprende la administracion de un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion, en el que el cancer se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.

Ademas, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion para su uso en terapia. Preferentemente, la presente invencion proporciona un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion para su uso en el tratamiento del cancer, en el que el cancer se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.

Ademas, la presente invencion proporciona tambien el uso de un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion en la fabricacion de un medicamento para tratar el cancer, en el que el cancer se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.

Definiciones

Un anticuerpo de longitud completa tal como existe en forma natural es una molecula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. La parte del extremo amino de cada cadena incluye una region variable de aproximadamente 100-110 aminoacidos responsables principalmente del reconocimiento de antigenos por medio de las regiones de determinacion de complementariedad (CDR) contenidas en los mismos. La parte del extremo carboxi de cada cadena define una region constante responsable principalmente de la funcion de efector.

Las CDR estan intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco ("FR"). Cada region variable de cadena ligera (LCVR) y cada region variable de cadena pesada (HCVR) esta compuesta por 3 CDR y 4 FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las 3 CDR de la cadena ligera se refieren como "LCDR1, LCDR2 y LCDR3" y las 3 CDR de la cadena pesada se refieren como "HCDR1, HCDR2 y HCDR3". Las CDR contienen la mayor parte de los residuos que forman interacciones especificas con el antigeno. La numeracion y la posicion de los residuos de aminoacidos de las CDR en las regiones LCVR y HCVR estan de acuerdo con la bien conocida convencion de numeracion de Kabat.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda, y se caracterizan por una region constante particular tal como se conoce en la tecnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, y definen el isotipo de un anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Los anticuerpos IgG pueden dividirse adicionalmente en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una region constante particular con una secuencia bien conocida en la tecnica.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el termino "anticuerpo monoclonal" (AMc) se refiere a un anticuerpo que procede de una copia o clon unico que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota o de fagos, y no el procedimiento por el que se produce. Los AMc de la presente invencion existen preferentemente en una poblacion homogenea o sustancialmente homogenea. Los AMc completos contienen 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Los "fragmentos de union a antigeno" de dichos anticuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2 y fragmentos Fv monocatenarios. Los anticuerpos monoclonales y los fragmentos de union a antigeno de los mismos de la presente invencion pueden producirse, por ejemplo, por tecnologias recombinantes, tecnologias de presentacion de fagos, tecnologias sinteticas, por ejemplo, injerto de CDR, o combinaciones de dichas tecnologias, u otras tecnologias conocidas en la tecnica. Por ejemplo, los ratones pueden estar inmunizados con DKK-1 humano o fragmentos del mismo, los anticuerpos resultantes pueden recuperarse y purificarse, y la determinacion de si poseen propiedades de union o funcionales similares o

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iguales a los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva puede evaluarse por los procedimientos descritos en los Ejemplos mostrados a continuacion. Los fragmentos de union a antigeno tambien pueden prepararse por procedimientos convencionales. Los procedimientos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de union a antigeno son bien conocidos en la tecnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, capitulos 5-8 y 15, ISBN 0-87969-314-2.

La frase "anticuerpo quimerico" se refiere a un anticuerpo que contiene dominios de diferentes especies (generalmente 2 especies). El anticuerpo V es un anticuerpo quimerico en el que los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada contienen residuos de un anticuerpo murino, mientras que el dominio de cadena ligera de region constante contiene residuos que comprenden una cadena ligera kappa de rata y los dominios de cadena pesada de region constante contienen residuos que comprenden un anticuerpo IgG1 de rata. El anticuerpo V es una quimera murina/de rata y se usa en estudios para reducir la probabilidad de respuesta inmunitaria en modelos preclinicos a largo plazo.

La frase "anticuerpos humanos manipulados" se refiere a anticuerpos monoclonales que tienen propiedades de union y funcionales segun la invencion, y que tienen regiones marco que son sustancialmente humanas o totalmente humanas alrededor de las CDR obtenidas de un anticuerpo no humano. Los "fragmentos de union a antigeno" de dichos anticuerpos humanos manipulados incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2 y fragmentos Fv monocatenarios. "Region marco" o "secuencia marco" se refiere a una cualquiera de las regiones marco 1 a 4. Los anticuerpos humanos manipulados y los fragmentos de union a antigeno de los mismos comprendidos por la presente invencion incluyen moleculas en las que una cualquiera o mas de regiones marco 1 a 4 son sustancial o totalmente humanas, es decir, en las que esta presente cualquiera de las posibles combinaciones de regiones marco individuales sustancial o totalmente humanas 1 a 4. Por ejemplo, esto incluye moleculas en las que la region marco 1 y la region marco 2, la region marco 1 y la region marco 3, la region marco 1, 2 y 3, etc., son sustancial o totalmente humanas. Los marcos sustancialmente humanos son aquellos que tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencias con una secuencia marco de linea germinal humana conocida. Preferentemente, los marcos sustancialmente humanos tienen al menos aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o aproximadamente el 99% de identidad de secuencias con una secuencia marco de linea germinal humana conocida.

Los marcos totalmente humanos son aquellos que son identicos a una secuencia marco de linea germinal humana conocida. Las secuencias de linea germinal marco humana pueden obtenerse de ImMunoGeneTics (IMGT) por medio de su pagina web
http://imgt.cines.fr, o de The Immunoglobulin FactsBook de Marie-Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, los marcos de cadena ligera de linea germinal pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, 02 y 08, y las regiones marco de cadena pesada de linea germinal pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI- 69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-5I.

Pueden generarse anticuerpos humanos manipulados ademas de los descritos en la presente memoria descriptiva que muestran propiedades funcionales similares segun la presente invencion usando varios procedimientos diferentes. Los compuestos de anticuerpos especificos descritos en la presente memoria descriptiva pueden usarse como plantillas o compuestos de anticuerpos progenitores para preparar compuestos de anticuerpos adicionales. En un enfoque, las CDR de compuesto de anticuerpo progenitor se injertan en un marco humano que tiene una alta identidad de secuencias con el marco del compuesto del anticuerpo progenitor. La identidad de secuencias del nuevo marco sera generalmente al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 99% identica a la secuencia del marco correspondiente en el compuesto del anticuerpo progenitor. Este injerto puede producir una reduccion en la afinidad de union en comparacion con el del anticuerpo progenitor. Si asi sucede, el marco puede experimentar mutacion restauradora en el marco progenitor en ciertas posiciones basandose en criterios especificos descritos por Queen y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869. Las referencias adicionales que describen procedimientos utiles en la humanizacion de anticuerpos de raton incluyen las patentes de EE.UU. n° 4.816.397; 5.225.539 y 5.693.761; los programas informaticos ABMOD y ENCAD tal como se describe en Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168: 595-620; y el procedimiento de Winter y col. (Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-327; y Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 1534-1536.

La identificacion de residuos que se consideraran para mutacion restauradora puede realizarse del modo siguiente:

Cuando un aminoacido se encuadra en la siguiente categoria, el aminoacido marco de la secuencia de linea germinal humana que se esta usando (el "marco aceptor") es sustituida por un aminoacido marco de un marco del compuesto del anticuerpo progenitor (el "marco donador"):

(a) el aminoacido en la region marco humana del marco aceptor es infrecuente para marcos humanos en esa posicion, mientras que el aminoacido correspondiente en la inmunoglobulina donadora es tipico para marcos humanos en esa posicion;

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(b) la posicion del aminoacido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c) cualquier atomo de cadena lateral de un aminoacido marco esta a menos de aproximadamente 5-6 angstroms (entre centros) de cualquier atomo de un aminoacido de CDR en un modelo tridimensional de inmunoglobulina.

Cuando cada uno de los aminoacidos en la region marco humana del marco aceptor y un aminoacido correspondiente en el marco donador es en general infrecuente para marcos humanos en esa posicion, dicho aminoacido puede ser sustituido por un aminoacido tipico para marcos humanos en esa posicion. Este criterio de mutacion restauradora permite recuperar la actividad del compuesto del anticuerpo progenitor.

Otro enfoque para generar anticuerpos humanos manipulados que muestran propiedades funcionales similares a los compuestos de anticuerpos descritos en la presente memoria descriptiva implica la mutacion aleatoria de aminoacidos en las CDR injertadas sin cambiar el marco, y el cribado de las moleculas resultantes segun su afinidad de union y otras propiedades funcionales que son tan buenas o mejores que las de los compuestos de anticuerpos progenitores. Tambien pueden introducirse mutaciones individuales en cada posicion de aminoacido en cada CDR, seguido por la valoracion de los efectos de dichas mutaciones en la afinidad de union y otras propiedades funcionales. Las mutaciones individuales que producen propiedades mejoradas pueden combinarse para evaluar sus efectos en combinacion mutua.

Ademas, es posible una combinacion de los dos enfoques anteriores. Despues de injerto de CDR, se pueden someter a mutacion restauradora regiones marco especificas ademas de introducir cambios de aminoacidos en las CDR. Esta metodologia se describe en Wu y col. (1999) J. Mol. Biol. 294: 151 -162.

Aplicando las ensenanzas de la presente invencion, un experto en la materia puede usar tecnicas comunes, por ejemplo, mutagenia dirigida al sitio, para sustituir aminoacidos en las secuencias marco y CDR descritas en la presente memoria descriptiva y generar asi secuencias de aminoacidos de regiones variables obtenidas de las secuencias de la presente memoria descriptiva. Todos los aminoacidos alternativos de ocurrencia natural pueden introducirse en un sitio de sustitucion especifico. Los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva pueden usarse a continuacion para cribar estas secuencias de aminoacidos de regiones variables adicionales con el fin de identificar secuencias que tienen las funciones in vivo indicadas. De este modo, pueden identificarse secuencias adicionales adecuadas para preparar anticuerpos humanos manipulados y porciones de union a antigenos de los mismos de acuerdo con la presente invencion. Preferentemente, la sustitucion de aminoacidos en los marcos se limita a una, dos o tres posiciones en una cualquiera o mas de las 4 regiones marco de cadena ligera y/o cadena pesada descritas en la presente memoria descriptiva. Preferentemente, la sustitucion de aminoacidos en las CDR se limita a una, dos o tres posiciones en una cualquiera o mas de las 3 CDR de cadena ligera y/o de cadena pesada. Son posibles tambien combinaciones de los diversos cambios en estas regiones marco y CDR descritas anteriormente. Con la maxima preferencia, estas tecnicas se usan para generar secuencias de aminoacidos de regiones variables adicionales usando las secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera variables descritas en las SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 respectivamente.

Los anticuerpos humanos manipulados o fragmentos de union a antigeno de los mismos que "compiten" con las moleculas descritas en la presente memoria descriptiva son aquellos que se unen a DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29) en un sitio o sitios que son identicos a, o que se solapan con, el sitio o sitios en los que se unen las moleculas de la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos humanos manipulados en competencia o fragmentos de union a antigeno de los mismos pueden identificarse, por ejemplo, por medio de un ensayo de competencia de anticuerpos. Por ejemplo, una muestra de DKK-1 humano purificado o parcialmente purificado (SEQ ID NO: 29) esta unida a un vehiculo solido. A continuacion, se anade un anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva y un anticuerpo monoclonal de prueba o un fragmento de union a antigeno, con la prueba o el anticuerpo de la presente invencion marcados. Si el anticuerpo marcado y el anticuerpo no marcado se unen a sitios separados y discretos en DKK-1, el anticuerpo marcado se unira al mismo nivel este presente o no el anticuerpo en competencia sospechado. Sin embargo, si los sitios de interaccion son identicos o estan solapados, el anticuerpo no marcado competira, y la cantidad de anticuerpo marcado unida al antigeno se reducira. Si el anticuerpo no marcado esta presente en exceso, no se unira el anticuerpo marcado. Para los fines de la presente invencion, los anticuerpos humanos manipulados en competencia o los fragmentos de union a antigeno de los mismos son aquellos que disminuyen la union de los anticuerpos de la presente invencion a DKK-1 en aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o aproximadamente el 99%. Los detalles de los procedimientos para llevar a cabo dichos ensayos de competencia son bien conocidos en la tecnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, paginas 567-569, ISBN 0-87969-314-2. Dichos ensayos pueden hacerse cuantitativos usando anticuerpos purificados. Se establece una curva estandar valorando un anticuerpo frente a una version marcada de si mismo. Se valora la capacidad de un anticuerpo monoclonal en competencia no marcado o un fragmento de union a antigeno del mismo para inhibir la union de la molecula marcada a la placa. Se representan graficamente los resultados y se comparan las concentraciones necesarias para conseguir el grado deseado de inhibicion de union. Puede determinarse si los anticuerpos monoclonales o fragmentos de union a antigeno de los mismos que compiten con anticuerpos humanos manipulados o fragmentos de union a antigeno de los mismos de la presente invencion en dichos ensayos de competencia poseen propiedades funcionales identicas similares de los anticuerpos humanos

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manipulados de la presente invencion por medio de los procedimientos descritos en los Ejemplos mostrados en la presente memoria descriptiva.

El termino "inhibir" significa capacidad de antagonizar, prohibir, prevenir, limitar, ralentizar, perturbar, eliminar, detener, reducir o revertir sustancialmente los efectos biologicos de DKK-1.

El termino "que trata" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere a procedimientos que implican ralentizacion, interrupcion, detencion, control, parada, reduccion o reversion de la progresion o la gravedad de un sintoma, trastorno, afeccion o enfermedad, pero no implica necesariamente una eliminacion total de todos los sintomas, afecciones o trastornos relacionados con la enfermedad asociados con la actividad de DKK-1.

El termino "que previene" (o "prevenir" o "prevencion") significa prohibir, limitar o inhibir la incidencia u ocurrencia de un sintoma, trastorno, afeccion o enfermedad. Los episodios agudos y las afecciones cronicas pueden tratarse o prevenirse. En un episodio agudo, se administra un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo al inicio de un sintoma, trastorno, afeccion o enfermedad, y se interrumpe cuando termina el episodio agudo. En cambio, un sintoma, trastorno, afeccion o enfermedad cronicos se tratan durante un marco temporal mas prolongado.

El termino "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis de un compuesto de anticuerpo de la presente invencion que, tras la administracion de una unica o multiples dosis a un paciente, proporciona el tratamiento o prevencion deseados. Las cantidades terapeuticamente eficaces de los compuestos de anticuerpos de la presente invencion pueden comprender una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg por dosis individual. Una cantidad terapeuticamente eficaz para cualquier paciente individual puede ser determinada por el proveedor de atencion sanitaria monitorizando el efecto de los compuestos de anticuerpos en un biomarcador.

El termino "cicatrizacion del hueso" se refiere a la estimulacion de formacion de hueso en puntos de lesion bloqueando el DKK-1. Los ejemplos de indicaciones de cicatrizacion del hueso incluyen, pero no se limitan a, curacion de fracturas, fijacion/retencion de implantes y fijacion/retencion de implantes dentales.

Los anticuerpos humanos manipulados de la presente invencion pueden usarse como medicamentos en medicina humana, administrados por diversas vias. Con la maxima preferencia, dichas composiciones son para administracion parenteral. Dichas composiciones farmaceuticas pueden prepararse por procedimientos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practise of Pharmacy, 19s ed. (1995), A. Gennaro y col., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo humano manipulado tal como se describe en la presente memoria descriptiva, y un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Los resultados de los ensayos siguientes muestran que los anticuerpos monoclonales y fragmentos de union a antigeno de los mismos, de la presente invencion son utiles como inhibidor de DKK-1. Los anticuerpos de la presente invencion poseen un conjunto de propiedades convenientes. Por ejemplo, el Anticuerpo II de la presente invencion tiene una mayor estabilidad quimica y fisica, y solubilidad. Se realizan estudios acelerados para evaluar la estabilidad quimica de los anticuerpos incubando los anticuerpos de la presente invencion en diferentes condiciones tampon (variacion de pH y NaCl) e incubando a 40C, 250C y 40°C durante 4 semanas. Las modificaciones quimicas de los anticuerpos de la presente invencion se detectan por cromatografia de intercambio de cationes ("CEX") para separar las variantes de carga (por ejemplo., desamidacion de asparagina en acido aspartico) y analisis LC-MS para identificar sitios especificos de degradacion. El Anticuerpo II tiene la minima cantidad de degradacion detectada por CEX y este resultado es confirmado adicionalmente por datos de LC-MS que muestran que los tres residuos de asparagina en las CDR tenian la minima cantidad de desamidacion en comparacion con los otros anticuerpos descritos en la presente memoria descriptiva despues de incubacion de 4 semanas a 40°C en tampon de pH 8. La solubilidad para el Anticuerpo II es mas favorable que con el Anticuerpo I cuando se formula a pH 6 + NaCl 150 mM. Ademas, el Anticuerpo II mantenia una solubilidad > 105 mg/mL cuando se almaceno a 40C, mientras que la solubilidad para el Anticuerpo I era de solo 48 mg/mL y precipito en estas mismas condiciones. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "CE50" se refiere a la concentracion de un agente que produce el 50% de la respuesta maxima posible para ese agente. "Kd" se refiere a la constante de disociacion en equilibrio que puede calcularse mediante la formula: koff/kon = Kd.

Ejemplo 1 - Produccion de anticuerpos

Los Anticuerpos I, II, III y IV pueden prepararse y purificarse del modo siguiente. Se transfecta de forma transitoria o estable una celula hospedadora apropiada, tal como HEK 293 EBNA o CHO, con un sistema de expresion para secretar anticuerpos usando una proporcion de vector HC:LC predeterminada optima o un unico sistema de vectores que codifica al mismo tiempo HC, por ejemplo SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, y LC, por ejemplo SEQ ID NO: 25, SeQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28. Se purifica el medio aclarado, en el que se ha secretado el anticuerpo, usando cualquiera de las numerosas tecnicas usadas comunmente. Por ejemplo, el medio puede aplicarse comodamente a una columna de Sefarosa FF de Proteina A o G que se ha equilibrado con un tampon compatible, tal como suero salino con tampon de fosfato (pH 7,4). Se lava la columna para eliminar los componentes de union no especificos. Se eluye el anticuerpo unido, por ejemplo, por gradiente de pH (tal como tampon de fosfato de sodio 0,1 M pH 6,8 a tampon de citrato de sodio 0,1 M pH 3,0). Se detectan las fracciones de anticuerpo, por

ejemplo, por SDS-PAGE, y a continuacion se almacenan en reserva. La purificacion adicional es opcional, dependiendo del uso pretendido. El anticuerpo puede concentrarse y/o filtrarse en condiciones esteriles usando tecnicas comunes. El agregado soluble y los multimeros pueden eliminarse de manera efectiva mediante tecnicas comunes, que incluyen exclusion por tamanos, interaccion hidrofoba, intercambio de iones o cromatografia de 5 hidroxiapatita. La pureza del anticuerpo despues de estas etapas de cromatografia es superior al 99%. El producto puede congelarse inmediatamente a -70oC o puede liofilizarse. A continuacion, se proporcionan las secuencias de aminoacidos para estos anticuerpos.

SEQ ID NO

Anticuerpo

Cadena pesada Cadena ligera HCVR LCVR

I

17 19 11 13

II

18 20 12 14

III

17 21 11 15

IV

17 22 11 16

V

35 34 37 36

Anticuerpo

HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3

I

1 2 3 5 6 7

II

1 2 4 5 8 7

III

1 2 3 5 6 9

IV

1 2 3 5 10 9

V

1 38 39 40 41 42

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Ejemplo 2: Medidas de afinidad (Kd) para anticuerpos DKK-1

Para establecer un equilibrio de union, se mezcla una concentracion constante de anticuerpo con concentraciones variables de DKK-1 His-tagged (SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 33) (intervalo 1 nM - 1 pM) en PBS (pH 7,4) + 1 mg/mL de albumina de suero bovinofBSA") o tampon en solitario y se 15 incuba durante varios dias a 370C. Se establecen dos conjuntos de reacciones de union, un conjunto a baja concentracion de anticuerpo (3 pM) y un conjunto a alta concentracion de anticuerpo (30 o 50 pM).

Despues de establecer el equilibrio, se usa un instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) para sondear la fraccion de anticuerpo ’libre’ (no unido). Brevemente, el DKK-1 His-tagged se acopla de forma covalente con perlas de flujo rapido de Sefarosa 4 activadas por NHS (GE Healthcare) que son empaquetadas por el instrumento para 20 crear una pequena columna. Las mezclas preequilibradas de anticuerpo + DKK-1 His-tagged se pasan sobre las perlas para capturar solo anticuerpo libre. La cantidad de anticuerpo libre capturado es proporcional a la concentracion libre en las muestras en equilibrio, y se detecta por inyeccion de un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia. Los conjuntos de datos de concentraciones de anticuerpo altas y bajas se ajustan globalmente usando analisis de curva n en el software KinExA. Este ajuste devuelve un valor de Kd, asi como el intervalo de 25 confianza al 95%.

Tabla 1: Afinidad de Anticuerpo II a DKK-1 de distintas especies

Especie DKK-1

Kd (pM) Intervalo de confianza al 95% para Kd (pM)

Human

3,3 1,4 - 7,5

Cynomolgus

14 8,4 - 26

Rata

8,4 3,9 - 23

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Murina

7,0 4,7 - 11

Conejo

17 11 - 27

Ejemplo 3: Efecto de los anticuerpos DKK-1 en el ensayo de fosfatasa alcalina C2C12

La senalizacion Wnt canonica es importante para la diferenciacion y la actividad de osteoblastos. Wnt-3a de CM (Medios Acondicionados) combinado con BMP-4 induce a las celulas C2C12 de raton pluripotentes a diferenciarse en osteoblastos con un criterio de valoracion mensurable de fosfatasa alcalina ("AP"), un marcador de actividad de osteoblastos. DKK-1, un inhibidor de la senalizacion Wnt canonica, inhibe la diferenciacion y la produccion de AP. Los Anticuerpos DKK-1 de neutralizacion evitan la inhibicion mediada por DKK-1 de AP. Los anticuerpos que bloquean la actividad inhibidora de DKK-1 previenen la perdida de actividad de AP.

Las celulas C2C12 se cultivan en confluencia al 60%-80% en matraces de cultivo de tejidos en medio de crecimiento (Medio Eagle Modificado de Dulbecco ("DMEM") que contiene L-glutamina, suero bovino fetal (“FBS”) inactivado por calor al 10%, 1x antibiotico/antimicotico, 1x piruvato de sodio). Las celulas C2C12 se vuelven a suspender a una concentracion de 30.000 celulas/mL en medio de crecimiento y se anaden 100 pL/pocillo a una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos y se incuba durante toda la noche a 370C, 95% de humedad, CO2 al 5% El medio de cultivo se sustituye por 50 pL de medio de ensayo (DMEM que contiene L-glutamina, FBS inactivado por calor al 5%, 1x antibiotico/antimicotico, 1x piruvato de sodio). Para estimular la diferenciacion (y asi inducir la produccion de AP), se anaden 100 pL de medio de ensayo mas 1,5x Wnt-3a CM + BMP-4 (R&D Systems catalogo #314-BP). Esto produce una concentracion final de 1x Wnt-3a CM y 25 ng/mL de BMP-4. Los controles negativos contienen celulas L CM (no Wnt-3a o BMP-4). Las celulas se incuban a 370C, 95% de humedad, CO2 al 5% durante 72 horas. El medio se elimina, se lavan las celulas con 200 pL de solucion salina con tampon de fosfato ("PBS"), y se elimina el PBS. Se liofilizan las celulas 3 veces. Se anaden 100 pL de sustrato pNPP (Thermo Scientific catalogo #37621) por pocillo y se incuba la placa a temperatura ambiente. Se lee la absorbancia a 405 nm. Para determinar la concentracion de DKK-1 necesaria para inhibir la diferenciacion, se valoran moleculas de Dkk-1 de diversas especies para identificar la concentracion minima necesaria para inhibir totalmente la induccion de AP.

La concentracion minima de DKK-1 de cada especie que inhibe totalmente la induccion de AP es la siguiente: DKK-1 humano = 38 nM, DKK-1 de Cynomolgus = 11,4 nM, DkK-1 de rata = 5,8 nM y DKK-1 de conejo = 25,0 nM.

Una vez determinada la concentracion de DKK-1 que inhibe totalmente la induccion de AP, se preincuban concentraciones crecientes de un anti-anticuerpo DKK-1 en medio de ensayo con una concentracion inhibidora de Dkk-1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. La induccion de AP se determina tal como se describe anteriormente. Los resultados se comunican como una CE50 (nM ± error estandar).

El Anticuerpo II bloquea la inhibicion mediada por Dkk-1 de AP C2C12. Para el DKK-1 de diversas especies, los CE50 (expresados como nM ± error estandar) son los siguientes: ser humano = 9,8 ± 0,41, cynomolgus = 6,4 ± 0,25, rata = 2,9 ± 0,25 y conejo = 6,0 ± 0,32.

Ejemplo 4: Ensayo in vivo de defecto cortical (DC)

Se someten a ovariectomia ratas Sprague-Dawley hembra de seis meses y se permite la perdida osea durante dos meses. Se introducen defectos de 2 mm de diametro en los femures izquierdo y derecho mediante un taladro electrico con una broca dental de 2 mm. Este orificio se extiende a traves de las cortezas anterior y posterior. La cicatrizacion del hueso se monitoriza longitudinalmente evaluando la densidad de masa osea ("DMO") a traves del uso de tomografia computarizada cuantitativa ("qCT") durante 35 dias despues de la intervencion quirurgica. Al final del experimento, se sacrifican los animales y se someten los femures enteros a determinaciones de carga hasta fallo para establecer la resistencia biomecanica de la diafisis completa. Los anticuerpos se administran por via subcutanea en las dosis e intervalos indicados.

Se administra la dosis del Anticuerpo II del modo siguiente: 5 mg/kg una vez cada dos semanas empezando un dia despues de la intervencion quirurgica (Grupo 1), 1 mg/kg (Grupo 2), 5 mg/kg (Grupo 3) o 15 mg/kg (Grupo 4) una vez cada dos semanas empezando nueve dias despues de la intervencion quirurgica. La DMO se valora mediante qCT en el dia 35. El grupo 1 mostro un aumento estadisticamente significativo en DMO en las cortezas anterior y posterior. El Grupo 4 mostro un aumento estadisticamente significativo en DMO en las dos cortezas, aunque los Grupos 2 y 3 mostraron un aumento no significativo en DMO.

Ejemplo 5: Ensayo de eficacia in vivo en cancer

Se aclimata a ratones (ratones C.B-17 hembra, modelo inmunodeficiente combinado grave Fox Chase # CB17SC-M) durante una semana en un centro de animales antes del inicio del experimento. Despues de la aclimatacion, se distribuye aleatoriamente a los ratones en grupos de 10 por tratamiento. Se implantan celulas de carcinoma pulmonar no microcitico A549 humano en cultivo por via subcutanea en el flanco trasero de los ratones y se deja que el tumor alcance un volumen tumoral medio ~ 100 mm3. Se administra Anticuerpo II (1 mg/kg y 5 mg/kg),

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anticuerpo IgG de control (1 mg/kg y 5 mg/kg) o vehiculo (solucion salina con tampon de citrato suplementada con Tween 80 al 0,02%) por medio de inyeccion subcutanea. Los animales reciben 2 tratamientos separados por 7 dias.

Los tumores se miden 2 veces por semana mediante calibres electronicos para representar graficamente curvas de crecimiento. Los animales se monitorizan tambien dos veces por semana para analizar las fluctuaciones en el peso corporal y signos de toxicidad. Las medidas del volumen tumoral mostradas en la tabla 3 se toman en el dia 29.

Tal como se muestra en la Tabla 2, los grupos de tratamiento que reciben Anticuerpo II mostraron una inhibicion de crecimiento significativa de xenoinjertos de pulmon microcitico A549 humanos in vivo.

Tabla 2: Eficacia de Anticuerpo II en modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmon no microcitico A549

Grupo de tratamiento

Volumen tumoral ± Error estandar (mm3) Valor p (relativo al grupo control del vehiculo)

Vehiculo de citrato

402 ± 36 -

Control IgG (1 mg/kg)

372 ± 45 -

Control IgG (5 mg/kg)

492 ± 72 -

Anticuerpo II (1 mg/kg)

279 ± 32 0,01 - 0,05

Anticuerpo II (5 mg/kg)

202 ± 21 < 0,001

Ejemplo 6: Ensayo de xenoinjerto in vivo de renormalizacion angiogena

Para comprender el mecanismo de la eficacia antitumoral, se efectua un analisis de imagenes de alto contenido en tumores A549 tratados con Anticuerpo II o IgG de control. Se analizan varios marcadores de base fenotipica en terminos cuantitativos y cualitativos para valorar los procedimientos biologicos relevantes de cancer de angiogenia (CD31 y actina de musculo liso, SMA), induccion de hipoxia (transportador de glucosa 1, GLUT1), proliferacion celular (Ki67) y apoptosis (Terminal UDp Nick-End Labeling, TUNEL).

Se aclimatan ratones C.B-17 hembra (Fox Chase SCID) modelo # CB17SC-M de 7 a 8 semanas de vida durante una semana y se deja que ingieran ad libitum una dieta normal baja en grasas (4,5%), que se continua a lo largo de la duracion del estudio.

Se cultivan celulas A549 de origen ATCC y se dividen en medio de Kaighn F-12 (InVitrogen #21127) suplementadas con FBS al 10% (InVitrogen #0, y diluciones 100x de piruvato de sodio, aminoacidos no esenciales y penicilina- estreptomicina (Invitrogen #11360, #11140 y #15140 respectivamente). Se separan y se preparan a una concentracion final de 50 x 106 celulas/ml en PBS en el paso 19 con viabilidad del 95%.

Se inyectan 5 x 106 celulas de carcinoma pulmonar humano A549 por via subcutanea en el flanco de los ratones objeto en una mezcla 1:1 de PBS y Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA). Se realizan medidas del tumor y el peso corporal dos veces por semana. Antes del tratamiento, se aleatoriza a los ratones basandose en el tamano del tumor usando un algoritmo de aleatorizacion.

Empezando cuando el tumor llego a 200 mm3, se separan los ratones aleatorizados en 2 grupos de 10 animales y se les administra la dosis subcutanea en el dia 1 y de nuevo en el dia 8 con 5 mg/kg de Anticuerpo II o el control de IgG4. El estudio se termina 10 dias despues de la administracion de la primera dosis de anticuerpo.

El Anticuerpo II se prepara en solucion salina con tampon de citrato (CBS) (citrato 10 mM pH6, NaCl 150 mM y polisorbato al 0,2%). Se proporciona control de IgG4 a 6,0 mg/ml en suero salino con tampon de fosfato (PBS).

Los tumores de xenoinjertos se extirpan en los ratones despues de 17 dias de dosis y se colocan en fijador Cinc-Tris (BD Pharmingen). Los tumores fijados se procesan, se bloquean en parafina y se seccionan en cortes de 3 pM en cortes histologicos estandar. Los cortes histologicos se hornean a 150C durante 1 hora y despues se desparafinan en xileno (4 tratamientos, 10 minutos cada uno). Se hidratan los cortes histologicos a traves de una serie de inmersiones en etanol/agua con lavados finales en solucion salina con tampon Tris/Tween (TBST). A continuacion, se bloquean los cortes histologicos con Bloque de Proteina (DAKO) durante 30 minutos. Para el Panel Tumoral, se tinen los cortes histologicos con una combinacion de Hoechst 33324 (Invitrogen), CD31 antihumano de rata (Pharmingen)/ Alexa-488 anti-rata (Invitrogen), anti-Ki67 de conejo (NeoMarkers)/Alexa 647 anti-conejo (Invitrogen) y rojo TUNEL-TMR (diluido 1:5 en tampon de dilucion TUNEL; Roche). Para el Panel de Angiogenia, se tinen los cortes histologicos con una combinacion de Hoechst 33324 (Invitrogen), CD31 anti-humano de rata (Pharmingen)/Alexa-488 anti-rata (Invitrogen), anti-GLUT1 de conejo (Chemicon)/Alexa 647 anti-conejo (Invitrogen) y anti-Actina de musculo liso/Cy3 de raton (Sigma). Se obtienen imagenes de los cortes histologicos usando un citometro de exploracion laser iCys (CompuCito) y una estacion de trabajo Marianas Digital Imaging configurada con

un microscopio de fluorescencia invertido Zeiss Axiovert 200M (Intelligent Imaging Innovations). Se realizan comparaciones de datos cuantitativos de los grupos de tratamiento usando el analisis de Dunnet en el software estadistico JMP (SAS).

Tal como se muestra en la Tabla 3, los xenoinjertos A549 de animales tratados con IgG de control estan 5 moderadamente vascularizados, tienen niveles moderados de miofibroblastos y numerosas areas focalizadas de hipoxia. Los tumores tratados con IgG de control tienen una red extensa de vasos consistentes en brotes vasculares neoangiogenos y vasos maduros que estan deficientemente cubiertos por pericitos. Los tumores tratados con IgG de control tienen areas hipoxicas (marcadas por GLUT1) que son zonas claramente demarcadas a cierta distancia de los vasos perfundidos y las areas necroticas que estan todavia mas alejadas de los vasos. El tratamiento con 10 Anticuerpo II produce un area de los vasos disminuida, un area de pericitos reducida y una cobertura por pericitos de los vasos disminuida. Sin embargo, este tratamiento no produjo una diferencia significativa en la hipoxia tumoral. Cualitativamente, la vasculatura tumoral tratada con anticuerpo II parece consistir en vasos mas pequenos menos en red y con menor cobertura de pericitos que el grupo tratado con IgG de control.

Tal como se muestra en la Tabla 3, los tumores tratados con IgG tienen las celulas tumorales en proliferacion 15 distribuidas uniformemente, pero tambien muestran con frecuencia una o mas areas grandes de necrosis que son avasculares. El tratamiento con Anticuerpo II no produce cambios en la apoptosis y solo una disminucion ligera no significativa en el area de proliferacion total. Sin embargo, existe una disminucion acusada en el porcentaje de area de celulas Ki67 de alta intensidad en los tumores tratados con anticuerpo II, lo que podria indicar una menor cantidad de celulas en la fase del ciclo celular G2.

20 Tabla 3: Anticuerpo II en ensayo de xenoinjerto in vivo de renormalizacion angiogena

Panel fenoti'pico

Parametro biologico Valor IgG de control: valor de tratamiento con anticuerpos II Significacion estadistica (valor p de Dunnet)

Panel de angiogenia tumoral

% area de vaso total 10,26: 7,88 0,001

Panel de angiogenia tumoral

% area de vaso funcional 9,84: 7,59 0,0009

Panel de angiogenia tumoral

% area de vaso no funcional 0,42: 0,30 0,1341

Panel de angiogenia tumoral

% vasos cubiertos por pericito 42,44: 30,88 0,0234

Panel de angiogenia tumoral

% area hipoxica tumoral 14,90: 11,77 0,3615

Panel de proliferacion tumoral

% area de proliferacion tumoral 12,16: 9,68 0,1739

Panel de proliferacion tumoral

% area con Ki67 alto 0,66: 0,19 0,0012

Panel de proliferacion tumoral

% celulas tumorales en ciclo con Ki67 alto 5,24: 1,68 <0,0001

Panel de apoptosis tumoral

% area de apoptosis tumoral 8,63: 8,24 0,7466

% area de vaso total - Porcentaje de area de tejido tumoral cubierta por todos los vasos con independencia de su estado funcional. % area de vaso funcional - Porcentaje de area de tejido tumoral cubierta por vasos en regiones no hipoxicas. % area de vaso no funcional - Porcentaje de area de tejido tumoral cubierta por vasos en regiones hipoxicas. % vasos cubiertos por pericito - Porcentaje de todos los vasos tumorales que se asocian con celulas que expresan actina del musculo liso (SMA). % area hipoxica tumoral - Porcentaje de area de tejido tumoral cubierta por celulas que expresan GLUT 1, un marcador sustituto de hipoxia. % area de proliferacion tumoral - Porcentaje de area de tejido tumoral que es positiva para Ki67, una proteina nuclear usada rutinariamente como marcador de celulas de proliferacion activa.

5

10

15

20

25

30

% area con Ki67 alto - Porcentaje de area de tejido tumoral que se tine intensamente para Ki67. Las celulas que expresan niveles altos de Ki67 estan en las fases del ciclo celular mas tardias que aquellas que expresan niveles inferiores de Ki67.

% celulas tumorales en ciclo con Ki67 alto - Porcentaje de todas las celulas Ki67 positivas que estan disenadas para tener un nivel alto de expresion de Ki67. Las celulas que expresan niveles altos de Ki67 se encuentran en fases del ciclo celular mas tardias que aquellas que expresan niveles inferiores de Ki67.

% area de apoptosis tumoral - Porcentaje de area de tejido tumoral con alta tincion TUNEL. TUNEL es un procedimiento usado rutinariamente para detectar roturas de ADN bicatenario que es indicativo de apoptosis terminal.

Ejemplo 7: Ensayo de eficacia in vivo en hueso

Para evaluar la capacidad del Anticuerpo V (cadena ligera SEQ ID NO: 34 y cadena pesada SEQ ID NO: 35) que acelera la formacion de hueso periimplante y regenera el tejido oseo, se usan ratas Sprague-Dawley macho de cuatro meses (Harlan Sprague Dawley Inc) que pesaban 425 gramos aproximadamente. En las ratas se implanta quirurgicamente un tornillo de titanio (2 mm x 4 mm) en las dos patas del lado derecho medio por encima de la union tibial-peronea. A continuacion, se distribuyen las ratas aleatoriamente en 2 grupos segun el peso corporal y reciben 10 mg/kg de Anticuerpo V o 10 mg/kg de IgG de control por inyeccion subcutanea una vez por semana empezando el mismo dia de la intervencion quirurgica durante 21 dias. Se usa tomografia computarizada cuantitativa (escaner TC modelo Aloka LaTheta LTC-100) para exploracion ex vivo y se cuantifica el hueso recien formado con un tamano de voxel de 60 pm. El volumen de interes (VOI) se define como 28 cortes a intervalos de 0,1 mm sobre el punto de implante anterior. Las diferencias entre grupos se valoran con software JMP version 5.1. (Cary, Carolina del Norte), y se compara frente al control de IgG usando el metodo de Dunnett con un nivel de significacion de P<0,05. Cualitativamente la evaluacion por imagenes de rayos X faxitron ex vivo indica que las ratas tratadas con el Anticuerpo V tienen mas hueso nuevo y callo alrededor del implante. Los analisis de TC cuantitativos revelan un aumento estadisticamente significativo del contenido mineral del hueso cortical periimplante (14%), nueva area de hueso (16%), grosor cortical (7%) y nuevo contenido mineral del hueso periimplante esponjoso en la medula osea (18%), y area de hueso (16%) en ratas tratadas con Anticuerpo V en comparacion con el IgG de control. Los datos revelan que el Anticuerpo V estimula la nueva formacion de hueso y acelera la regeneracion del tejido oseo en ratas con implante de titanio.

Tabla 4: Analisis de micro-TC de formacion de hueso nuevo periimplante

Analisis periimplante de la medula osea Analisis periimplante corticales

Grupo

n Contenido mineral del hueso (mg) Area de hueso (cmA2) Contenido mineral del hueso (mg) Area de hueso (cmA2) Grosor cortical (cm)

Control IgG

10 0,84 ± 0,04 0,034 ± 0,001 6,70 ± 0,07 0,064 ± 0,001 0,054 ± 0,001

Anticuerpo V

10 1,00 ± 0,04* 0,039 ± 0,002* 7,61 ± 0,06* 0,074 ± 0,001* 0,057 ± 0,001*

Los datos se presentan como media ± EE. *, p<0,05, con respecto a IgG de control, prueba de Dunnett JMP.

LISTADO DE SEQ ID CDR de cadena pesada

SEQ ID NO: 1 GFTFSSYTMS

SEQ ID NO: 2 TISGGGFGTYYPDSVKG

SEQ ID NO: 3 PGYHNYYFDI

SEQ ID NO: 4 PGYNNYYFDI

CDR de cadena ligera

SEQ ID NO: 5 HASDSISNSLH

10

15

20

SEQ ID NO: 6 YGRQSIQ SEQ ID NO: 7 QQSESWPLH

SEQ ID NO: 8 YARQSIQ SEQ ID NO: 9 QQSASWPLH

SEQ ID NO: 10 YARQSEQ

Regiones variables de cadena pesada

SEQ ID NO: 11

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GF GTY YPD S VKGRFTISRDN AKN S LYLQMNSLRAEDTA VY Y C ARPGYHNY YFDI WGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 12

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GF GTY YPD S VKGRFTTSRDN AKN S LYLQMNSLR AEDT A VY YC ARPGYNN Y YFDI WGQGTTVTVSS

Regiones variables de cadena ligera

SEQ ID NO: 13

imagen1

SEQ ID NO: 14

ETVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLTYYARQSIQG

IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 15

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQG

IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 16

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSEQ

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIK

Cadenas pesadas completas

SEQ ID NO: 17

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG

GFGTYYPDSVKGRFTTSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYEFNYYFDI

WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK.TYTCNVDHKPSNTKVDKRVE

SKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMTSRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG

LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALFfNHYT

QKSLSLSLG

SEQ ID NO: 18

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG

GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYNNYYFDI

WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE

SKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG

LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPYLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSLG

Cadenas ligeras completas

SEQ ID NO: 19

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQG

IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPS

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

5 SEQ ID NO: 20

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSIQG IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S VTEQD S KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 21

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQG

IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIKRTVAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

10 SEQ ID NO: 22

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSEQ

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKYEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Secuencias de nucleotidos - Regiones variables de cadena pesada

SEQ ID NO: 23

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC

T GAGACTCTCCT GT GC AGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCT AT ACC ATGTCTT

GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGG

TGGTGGTTTCGGCACAT ACT ATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCAT CT

CC AGAGAC A AC GCC A AGAACT C ACTGT ATCTGC AA AT GA ACAGCCT GAGAGC

CG AG G AC ACG GCTGT GTATTACT GT G CG AG ACCT GG AT ATC AC AACT ACT ACT

TTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA

GGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC

ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG

TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC

CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG

CAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC

ACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT

GCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAA

ACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG

GT GG ACGTGAGCC AGG A AGACC CCGAGGTCC AGTTC A ACTGGT ACGTGGAT G

GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACA

GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAC

GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCG

AGA A A ACC AT CT CCA A AGCC A A AGGGC AGCCCCGAGAGCC AC AGGTGT ACA

CCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG

CCTGGT CAAAGGCTT CT ACCCC AGCGAC ATCGCCGT GGAGT GGGAAAGC AAT

GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG

GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA

GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA

CACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

SEQ ID NO: 24

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC T GAG ACT CTCCT GT GC AGCCT CTGG ATT C ACTTT CAGT AG CT AT ACC ATGT CTT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGG TGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCT CCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC CGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATAATAACTACTACT

TTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA

GGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC

ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG

TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC

CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG

CAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC

ACC AAGGT GG AC AAGAG AGTTG AGT CC AAAT ATGGTCCCCC AT GCCC ACCCT

GCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAA

ACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG

GTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATG

GCGTGGAGGT GCATAAT GCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTT CAACA

GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAC

GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCG

AGA AAACCAT CT CCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGT ACA

CCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG

CCTGGT CAAAGGCTT CT ACCCC AGCGAC ATCGC CGT GG AGT GGGAAAGC AAT

GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG

GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA

GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA

CACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

Secuencias de nucleotidos - Regiones variables de cadena ligera

SEQ ID NO: 25

G AAATTGTGTT GAC AC AGT CT CC AGCC AC CCT GT CTTT GT CTCC AGGGG AAAG

AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACA

GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC

TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG

TCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GC AGTTG AAAT CT GG AACT GCCTCTGTT GT GTGCCTGCT G AAT AACTTCT AT C

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGC GAAGT C ACC CAT C AGGGCCT G AGCT CGCCC GT C AC AA AGAGCTTC A

ACAGGGGAGAGTGC

5 SEQ ID NO: 26

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG

AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACA

GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC

TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG

TCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GC AGTTG AAAT CT GGAACT GCCTCTGTT GT GT GCCTGCT G AAT AACTTCT AT C

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA

ACAGGGGAGAGTGC

SEQ ID NO: 27

G AAATTGTGTT GAC AC AGT CT CC AGCC AC CCT GT CTTT GT CTCC AGGGG AAAG

AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACA

GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC

TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CT AG AGCCT G AAGATTTT GC AGTTT ATT ACT G

TCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GC AGTTG A AATCT GGA ACTGCCT CTGTT GT GTGCCTGCT GA AT AACTTCT ATC

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA

ACAGGGGAGAGTGC

SEQ ID NO: 28 5 DKK-1 humano

G AAATTGTGTT GAC AC AGT CT CC AGCC AC CCT GT CTTT GT CTCC AGGGG AAAG

AGCC ACCCT CTCCT GCC ACGCC AGCG AC AGT ATT AGC AAC AGCCT AC ACT GGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACA

GTCCGAGCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC

TTC ACTCTC ACC ATC AGC AGCCTAG AGCCT G AAGATTTT GC AGTTT ATT ACTG

TCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GC AGTTG AAAT CT GGAACT GCCTCTGTT GT GTGCCTGCT G AAT AACTTCT AT C

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA

ACAGGGGAGAGTGC

SEQ ID NO: 29

TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCA

EDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICV

SSDQNHFRGE1EETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDC

ASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRTQKD

HHQASNSSRLHTCQRH

DKK-1 de Cynomolgus

10 SEQ ID NO: 30

TLN S VLN SNAIKNLPPPLGG AAGHPG S AV S AAPGIL YPGGNKY QTIDNY QPYPC A EDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICV SSDQNNFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHSKGQEGSVCLRSSDC ATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKD HHQ ASNS SRLHTCQR

DKK-1 de rata

SEQ ID NO: 31

TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQPYPC

AEDEECGTDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNG

ICMPSDHSHLPRGEIEEGIIENLGNDHGAGDGYPRRTTLTSKJYHTKGQEGSVC'LR

SSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLAC

RIQKDHHQTSNSSRLHTCQRHAFIDYKDDDDKHV

5 DKK-1 de conejo

SEQ ID NO: 32

TLNSVLVNSNAIKNLPPPLGGANGHPGSAVSATPGILYEGGNKYLPLDNYQPYPC TEDEECGTDEYCASPARGGGAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGTC MPSDHNHFHRGE1EETIVESFGNDHSTSDGYSRRTTLSSKMYHAKGQEGSVCLRS SDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGDGLSCR LQNDQHEASNS SRLHTCQR

DKK-1 de raton

SEQ ID NO: 33

TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQPYPC AEDEECGSDEYCSSPSRGAAGVGGVQTCLACRKRRKRCMTHAMCCPGNYCKNG ICMPSDHSHFPRGEIEESIIENLGNDHNAAAGDGYPRRTTLTSKTYHTKGQEGSVC LRS SDC AAGLCC ARHF WSKICKP VLKEGQ V CTKHKRKGSHGLEIFQRC Y CGEGL ACRIQKDHHQ ASNS SRLHTCQRH

Anticuerpo V - Cadena ligera completa

SEQ ID NO: 34

DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSTSGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSTSGT PSRF SGSGS GTDFTLSINS VETEDF GMYFCQQSNS WPLNF G AGTKLELKRAD AAP

TVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKJDGTERRDGVLDSVTDQDS

KDSTYSMSSTLSLSKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC

15 Anticuerpo V - Cadena pesada completa

SEQ ID NO: 35

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISGG

GGNTYYPDSVKGRFTTSRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGYNNYYFDY

WGQGTTLTV S S AKTTPP S VYPLAPGT ALKSN SM VTLGCLVKGYFPEP VTVT WN S

GALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIV

PRNCGGDCKPCTCTGSEVSSVFTFPPKPKDVLTTTLTPKVTCVVVDTSQDDPEVHFS

WF VDD VEVHT AQTRPPEEQFNSTER S VSELPILHQD WLN GRTERCK VTS A AFP SPI

EKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEEMTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQ

PQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKEKAVQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK

SLSHSPGK

5

10

15

20

25

30

Anticuerpo V - Region variable de cadena ligera

SEQ ID NO: 36

DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGI

PSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLNFGAGTKLELK

Anticuerpo V - Region variable de cadena pesada

SEQ ID NO: 37

EVQFVESGGGFVKPGGSFKFSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRFEWVATISGG

GGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTFYFQFSSFRSEDTAFYYCARPGYNNYYFDY

WGQGTTFTVSS

Anticuerpo V - CDR de cadena pesada

SEQ ID NO: 38 TISGGGGNTYYPDSVKG SEQ ID NO: 39 PGYNNYYFDY Anticuerpo V - CDR de cadena ligera SEQ ID NO: 40 RASDSISGSLH SEQ ID NO: 41 YASQSIS SEQ ID NO: 42 QQSNSWPLN

CDR de cadena pesada de consenso SEQ ID NO: 43 TISGGGX1X2TYYPDSVKG

XI es F, G X2 es G, N

SEQ ID NO: 44 PGYX3NYYFDI X3 es H, N

SEQ ID NO: 45 PGYX4NYYFDX5 X4 es H, N X5 es I, Y

CDR de cadena ligera de consenso

SEQ ID NO: 46 X6ASDSISX7SLH X6 es H, R X7 es N, G

SEQ ID NO: 47 YX8RQSX9Q X8 es G, A X9 es I, E

SEQ ID NO: 48 YX10X11QSX12X13 X10 es G, A

XII es R, S X12 es I, E X13 es Q, S

SEQ ID NO: 49 QQSX14SWPLH X14 es E, A

SEQ ID NO: 50 QQSX15SWPLX16

X15 es E, A, N

5 X16 es H, N

Region variable de cadena pesada de consenso

SEQ ID NO: 51

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYX17NYYF DI WGQGTTVTVSS

X17 es H, N

10 Region variable de cadena ligera de consenso

SEQ ID NO: 52

etvltqspatlslspgeratlschasdstsnslhwyqqkpgqaprlltyyx18rqs

X19QGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQSX20SWPLHFGGGTKVEIK X18 es G, A X19 es I, E 15 X20 es E, A

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. - Un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, que comprende una

   region variable de cadena ligera (LCVR) y una region variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la HCVR comprende las cDr HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 5, LCDR2 es la SEQ ID NO: 8, LCDR3 es la SEQ ID NO: 7, HCDR1 es la SEQ ID NO: 1, HCDR2 es la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 es la SEQ ID nO: 4 para su uso en el tratamiento del cancer.
2. 2. - Un anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de union a antigeno del mismo, para su uso segun la

   reivindicacion 1 en el que el cancer se selecciona entre mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.
3. 3. - Un anticuerpo DKK-1 humano manipulado para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la LCVR

   comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y la HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12.
4. 4. - Un anticuerpo DKK-1 humano manipulado para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el

   que el anticuerpo DKK-1 humano manipulado comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20.
5. 5. - Un anticuerpo DKK-1 humano manipulado para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que

   comprende dos cadenas ligeras en el que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20, y dos cadenas pesadas en el que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18.
6. 6. - Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano manipulado o un fragmento de

   union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera (LCVR) y una region variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la HCVR comprende las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que LCDR1 es la SEQ ID NO: 5, LCDR2 es la SEQ ID NO: 8, LCDR3 es la SEQ ID NO: 7, HCDR1 es la SEQ ID NO: 1, HCDR2 es la SEQ ID NO: 2 y HCDR3 es la SEQ ID NO: 4 junto con un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable para su uso en el tratamiento del cancer.
7. 7. - Una composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 6 en el tratamiento del cancer, en el que el

   cancer se selecciona entre mieloma multiple, cancer de mama y cancer de pulmon no microcitico.
8. 8. - Una composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 6 y 7 que comprende opcionalmente ademas

   otros ingredientes terapeuticos.