ES2887176T3 - Anticuerpos DKK-1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo DKK-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en la que la LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 y la VHCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos DKK-1

La presente invención se refiere a los anticuerpos humanos modificados genéticamente contra DKK-1 y su uso en el tratamiento de enfermedades en las que la patogénesis está mediada por DKK-1.

Dickkopf-1 (Dkk-1) es un miembro de la familia de proteínas dickkopf que han demostrado ser reguladores negativos de la vía de señalización Wnt canónica. Esta vía desempeña un papel fundamental en el desarrollo y la formación de los huesos. Dkk-1 inhibe la señalización Wnt a través de su interacción con el correceptor Wnt LRP5 o LRP6 y las proteínas kremen. Dkk-1 impide que los miembros de la vía Wnt interactúen bien sea con LRP5 o LRP6, impidiendo así la transducción de señales mediada por Wnt. También se ha demostrado que el DKK1 está implicado en los cánceres con metástasis en los huesos, incluyendo el mieloma múltiple, el carcinoma de mama, el carcinoma renal y el cáncer de pulmón de células no pequeñas.

El documento WO2007/084344 describe anticuerpos que interfieren o neutralizan la proteína Dickkopf (Dkk-1) y/o el antagonismo de la señalización Wnt mediado por Dickkopf (Dkk-4) que se utilizan para tratar las anomalías de la densidad ósea, el metabolismo, la diabetes y los cánceres relacionados con Dkk.

El anticuerpo BHQ880 (MOR-4910) descrito en Fulcintini Mariateresa et al: "Anti-DKK1 mAb (BHQ880) as a potential therapeutic agent for multiple myeloma" Blood, vol. 114, no. 2, 9 de julio de 2009, páginas 371-379, Gaviatopoulou Maria et al"Dickkopf-1: a suitable target for the management of myeloma bone disease", Expert Opinion on Therapeutic Targets, vol. 13, n° 7, julio de 2009, páginas 839-848 Yaccoby Shmeul et al: "Antibody-based inhibition of DKK1 suppresses tumor-induced bone resorption and multiple myeloma growth in vivo", Blood, American Society of Hematology, vol. 109, no. 5, 1 de marzo de 2007, páginas 2106-211 y Ettenberg Seth et al: "BHQ880, a novel anti-DKK1 neutralizing antibody, inhibits tumor-induced osteolytic bone disease", Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, vol. 49, 1 de abril de 2008, página 947 se informa que es un anticuerpo anti-DKK1/DKK4 que neutraliza tanto el DKK1 como el DKK4.

Se han descrito anticuerpos que se unen a Dkk-1 (por ejemplo, véase WO2006015373), sin embargo, sigue existiendo la necesidad de anticuerpos humanos terapéuticos modificados genéticamente contra DKK-1 que inhiban la interacción de Dkk-1 con LRP5 y LRP6. Además, en vista de la implicación de Dkk-1 en la regulación de la formación ósea, se necesitan anticuerpos humanos terapéuticos modificados genéticamente anti-Dkk-1 para su uso en la curación ósea. Además, dada la implicación de Dkk-1 en los cánceres, se necesitan anticuerpos humanos modificados genéticamente anti-Dkk-1 para el tratamiento de cánceres, incluyendo el mieloma múltiple, de mama y de pulmón de células no pequeñas.

Los anticuerpos de la presente invención son antagonistas de DKK-1 terapéuticamente útiles que poseen una serie de propiedades deseables. Los presentes anticuerpos humanos modificados genéticamente muestran una alta afinidad (Kd) con DKK-1 humano, DKK-1 de cynomolgus, DKK-1 de rata, DKK-1 de ratón y DKK-1 de conejo. Los anticuerpos de la presente invención bloquean la inhibición de la fosfatasa alcalina mediada por el DKK-1, un marcador de la actividad de los osteoblastos. Además, los anticuerpos de la presente invención muestran un aumento de la densidad de la masa ósea en las corticales anterior y posterior en un modelo in vivo de defecto cortical y demuestran una inhibición significativa del crecimiento de xenoinjertos de pulmón de células no pequeñas in vivo.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo DKK-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en la que la LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 36 y la VHCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37.

Preferentemente, el anticuerpo DKK-1 de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.

Más preferentemente, el anticuerpo DKK-1 de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo DKK-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene una Kd a 37 °C de menos de 5,0 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32).

La presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:5, LCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:47, LCDR3 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:49, HCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:2, y HCDR3 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:44.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un procedimiento de curación ósea que comprende la administración de un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. La presente invención también proporciona un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende la administración de un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, cáncer de mama y cáncer de pulmón de células no pequeñas.

La presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo tiene una Kd de menos de 1,5 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd de menos de 1,0 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Además, se prefiere que la presente invención proporcione un anticuerpo d KK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd de menos de 5,0 X 10'12 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 0,5 X 10'12 M y 1,5 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Además, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 1,0 X 10'12M y 1,0 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29). Los valores de Kd se establecen mediante un equilibrio de unión a 37 °C como se describe en el Ejemplo 2.

La presente invención también proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo tiene una Kd de menos de 5,0 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd de menos de 3,0 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Además, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd de menos de 2,0 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), y DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33). Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 1,0 X 10'11 M y 5,0 X 10-11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Además, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo tiene una Kd entre 1,5 X 10'11 M y 3,0 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), Dkk-1 de rata (SEQ ID No : 31), y DKK-1 de ratón (SEQ ID n O: 33). Los valores de Kd se establecen mediante un equilibrio de unión a 37 °C como se describe en el Ejemplo 2.

Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd de menos de 3,0 X 10'11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Además, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd de menos de 2,5 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd de menos de 2,0 X 10'11 M para DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Además, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd entre 0,5 X 10-12 M y 3,0 X 10-11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVr que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12 y en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd entre 1,0 X 10-12 M y 2,5 X 10'11 M para el DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), DKK-1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 de rata (SEQ ID NO: 31), DKK-1 de ratón (SEQ ID NO: 33), y DKK-1 de conejo (SEQ ID NO: 32). Los valores de Kd se establecen mediante un equilibrio de unión a 37 °C como se describe en el Ejemplo 2.

La presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en la que la LCVR comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la HCVR comprende CDRs HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en la que LCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:5, HCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO: 1, y HCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:2.

La presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:46, LCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:48, lCd R3 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:50, HCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:43, y HCDR3 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:45. La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:5, LCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:47, LCDR3 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:49, HCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:2, y HCDR3 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:44.

La presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión del mismo en el que LCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:5, LCDR2 tiene una secuencia amino seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10, LCDR3 tiene una secuencia amino seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:9, HCDR1 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:1, HCDR2 tiene la secuencia amino de la SEQ ID NO:2, y HCDR3 tiene una secuencia amino seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo en el que LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) LCDR1 es SEQ ID NO: 5, LCDR2 es SEQ ID NO: 6, LCDR3 es SEQ ID NO: 7, HCDR1 es SEQ ID NO: 1, HCDR2 es SEQ ID NO: 2, y HCDR3 es SEQ ID NO: 3,

(ii) LCDR1 es SEQ ID NO: 5, LCDR2 es SEQ ID NO: 8, LCDR3 es SEQ ID NO: 7, HCDR1 es SEQ ID NO: 1, HCDR2 es SEQ ID NO: 2, y HCDR3 es SEQ ID NO: 4,

(iii) LCDR1 es SEQ ID NO: 5, LCDR2 es SEQ ID NO: 6, LCDR3 es SEQ ID NO: 9, HCDR1 es SEQ ID NO: 1, HCDR2 es SEQ ID NO: 2, y HCDR3 es SEQ ID NO: 3,

(iv) LCDR1 es SEQ ID NO: 5, LCDR2 es SEQ ID NO: 10, LCDR3 es SEQ ID NO: 9, HCDR1 es SEQ ID NO: 1, HCDR2 es SEQ ID NO: 2, y HCDR3 es SEQ ID NO: 3

La presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que la LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52 y la HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el RHC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que la LCVR y la HCVR comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11;

(ii) una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12;

(iii) una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11;

(iv) una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente comprende una cadena ligera en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente, en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente comprende una cadena pesada en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18.

Más preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente, en el que el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente comprende una cadena pesada y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en

(i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19,

(ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20,

(iii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21, y

(iv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17.

La presente invención proporciona preferentemente un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para la unión a DKK-1 humano (SEQ ID NO: 29), tal como se determinó mediante un ensayo de competencia de anticuerpos.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de curación ósea que comprende la administración de un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende la administración de un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en el que el cáncer se selecciona preferentemente del grupo que consiste en mieloma múltiple, cáncer de mama y cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Además, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para su uso en terapia. Preferentemente, la presente invención proporciona un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para su uso en el tratamiento para curación del hueso o en el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer se selecciona preferentemente del grupo que consiste en mieloma múltiple, cáncer de mama y cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Además, la presente invención también prevé el uso de un anticuerpo DKK-1 humano modificado genéticamente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para terapia, curación de huesos o para tratar el cáncer, en el que el cáncer se selecciona preferentemente del grupo que consiste en mieloma múltiple, cáncer de mama y cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Definiciones

Un anticuerpo de longitud completa, tal como existe en la naturaleza, es una molécula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento del antígeno a través de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) contenidas en la misma. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora.

Las CDR están intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco ("FR"). Cada región variable de la cadena ligera (LCVR) y la región variable de la cadena pesada (HCVR) están compuestas por 3 CDR y 4 FR, dispuestas desde el amino-terminal al carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, f R4. Las 3 CDR de la cadena ligera se denominan "LCDR1, LCDR2 y LCDR3" y las 3 CDR de la cadena pesada se denominan "HCDR1, HCDR2 y HCDR3" Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y el posicionamiento de los residuos de aminoácidos de la CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR se ajustan a la conocida convención de numeración de Kabat.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda, y se caracterizan por una región constante particular como se conoce en la técnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo de un anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Los anticuerpos IgG pueden dividirse a su vez en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante particular con una secuencia bien conocida en la técnica.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo monoclonal" (Mab) se refiere a un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon, incluyendo, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no el procedimiento por el que se produce. Los Mabs de la presente invención existen preferentemente en una población homogénea o sustancialmente homogénea. Los Mabs completos contienen 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Los "fragmentos de unión a antígeno" de tales anticuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fv de cadena única. Los anticuerpos monoclonales y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención pueden producirse, por ejemplo, mediante tecnologías recombinantes, tecnologías de visualización de fagos, tecnologías sintéticas, por ejemplo, injerto de CDR, o combinaciones de tales tecnologías, u otras tecnologías conocidas en la técnica. Por ejemplo, los ratones pueden ser inmunizados con DKK-1 humano o fragmentos del mismo, los anticuerpos resultantes pueden ser recuperados y purificados, y la determinación de si poseen propiedades de unión y funcionales similares o iguales a los compuestos de anticuerpos divulgados en el presente documento puede ser evaluada por los procedimientos divulgados en los Ejemplos a continuación. Los fragmentos de unión al antígeno también pueden prepararse mediante procedimientos convencionales. Los procedimientos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, capítulos 5-8 y 15, ISBN 0-87969­ 314-2.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene dominios de diferentes especies (generalmente 2 especies). El anticuerpo V es un anticuerpo quimérico en el que los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada contienen residuos de un anticuerpo murino, mientras que el dominio de la región constante de la cadena ligera contiene residuos de una cadena ligera kappa de rata y el dominio de la región constante de la cadena pesada contiene residuos de un anticuerpo IgG1 de rata. El anticuerpo V es una quimera murina/rata y se utiliza en estudios para reducir la probabilidad de respuesta inmunitaria en modelos preclínicos a largo plazo.

La expresión "anticuerpos humanos modificado genéticamente" se refiere a los anticuerpos monoclonales que tienen propiedades de unión y funcionales de acuerdo con la invención, y que tienen regiones marco que son sustancialmente humanas o totalmente humanas que rodean a las CDR derivadas de un anticuerpo no humano. Los "fragmentos de unión a antígeno" de tales anticuerpos humanos modificados genéticamente incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fv de cadena única. "Región marco" o "secuencia marco" se refiere a una cualquiera de las regiones marco 1 a 4. Los anticuerpos humanos modificados genéticamente y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos abarcados en la presente invención incluyen moléculas en las que una o más de las regiones marco 1 a 4 son sustancial o totalmente humanas, es decir, en las que está presente cualquiera de las posibles combinaciones de regiones marco 1 a 4 individuales sustancial o totalmente humanas. Por ejemplo, esto incluye moléculas en las que la región marco 1 y la región marco 2, la región marco 1 y la región marco 3, la región marco 1, 2 y 3, etc., son sustancial o totalmente humanas. Los marcos sustancialmente humanos son aquellos que tienen al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de marco de línea germinal humana conocida. Preferentemente, las estructuras sustancialmente humanas tienen al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de marco de línea germinal humana conocida.

Los marcos totalmente humanos son aquellos que son idénticos a una secuencia de marco de línea germinal humana conocida. Las secuencias de la línea germinal del marco humano pueden obtenerse de ImMunoGeneTics (IMGT) a través de su sitio web http://imgt.cines.fr, o de The Immunoglobulin FactsBook de Marie-Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, los marcos de la cadena ligera de la línea germinal pueden seleccionarse del grupo que consiste en: Al1, A17, a 18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, O2 y O8, y las regiones marco de la cadena pesada de la línea germinal pueden seleccionarse del grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-5I.

Los anticuerpos humanos modificados genéticamente, además de los divulgados en el presente documento, que presentan propiedades funcionales similares de acuerdo con la presente invención, pueden generarse utilizando varios procedimientos diferentes. Los compuestos de anticuerpos específicos divulgados en el presente documento pueden utilizarse como plantillas o compuestos de anticuerpos originales para preparar compuestos de anticuerpos adicionales. En un enfoque, las CDR del compuesto de anticuerpo original se injertan en un marco humano que tiene una alta identidad de secuencia con el marco del compuesto de anticuerpo original. La identidad de secuencia del nuevo marco será generalmente al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia del marco correspondiente en el compuesto de anticuerpo original. Este injerto puede dar como resultado una reducción de la afinidad de unión en comparación con la del anticuerpo original. Si este es el caso, el marco puede ser retro-mutado al marco original en ciertas posiciones basadas en criterios específicos divulgados por Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Referencias adicionales que describen procedimientos útiles para humanizar anticuerpos de ratón incluyen Patente de EE.UU. n° 4.816.397 5,225,539 y 5,693,761; los programas informáticos ABMOD y ENCAD descritos en Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620y el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525 Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327y Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

La identificación de los residuos a considerar para la retro-mutación puede llevarse a cabo como sigue:

Cuando un aminoácido entra en la siguiente categoría, el aminoácido marco de la secuencia de la línea germinal humana que se está utilizando (el "marco aceptor") se sustituye por un aminoácido marco de un marco del compuesto de anticuerpos originales (el "marco donante"):

(a) el aminoácido en la región de del marco humano del marco aceptor es inusual para los marcos humanos en esa posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es típico para los marcos humanos en esa posición;

(b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c) cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido del marco está dentro de aproximadamente 5-6 angstroms (de centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo tridimensional de inmunoglobulina.

Cuando cada uno de los aminoácidos en la región de marco humano del marco aceptor y un aminoácido correspondiente en el marco donante es generalmente inusual para los marcos humanos en esa posición, dicho aminoácido puede ser reemplazado por un aminoácido típico para los marcos humanos en esa posición. Este criterio de retro-mutación permite recuperar la actividad del compuesto del anticuerpo original.

Otro enfoque para generar anticuerpos humanos modificados genéticamente que muestren propiedades funcionales similares a las de los compuestos de anticuerpos divulgados en el presente documento implica mutar aleatoriamente aminoácidos dentro de las CDR injertadas sin cambiar el marco, y cribar las moléculas resultantes para ver si tienen afinidad de unión y otras propiedades funcionales que sean tan buenas o mejores que las de los compuestos de anticuerpos originales. También se pueden introducir mutaciones individuales en cada posición de aminoácido dentro de cada CDR, para luego evaluar los efectos de tales mutaciones en la afinidad de unión y otras propiedades funcionales. Las mutaciones individuales que producen propiedades mejoradas pueden combinarse para evaluar sus efectos en combinación con otras.

Además, es posible una combinación de los dos enfoques anteriores. Después del injerto de CDR, se pueden retromutar regiones marco específicas además de introducir cambios de aminoácidos en las CDR. Esta metodología se describe en Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

Aplicando las enseñanzas de la presente invención, un experto en la técnica puede utilizar técnicas comunes, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, para sustituir aminoácidos dentro de las secuencias CDR y de marco divulgadas actualmente y generar así secuencias de aminoácidos de región variable adicionales derivadas de las presentes secuencias. Todos los aminoácidos alternativos de origen natural pueden ser introducidos en un sitio de sustitución específico. Los procedimientos divulgados en este documento pueden utilizarse entonces para cribar estas secuencias de aminoácidos de la región variable adicional para identificar las secuencias que tienen las funciones in vivo indicadas. De este modo, pueden identificarse secuencias adicionales adecuadas para preparar anticuerpos humanos modificados genéticamente y porciones de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de los marcos se restringe a una, dos o tres posiciones dentro de una o más de las 4 regiones marco de la cadena ligera y/o de la cadena pesada divulgadas en el presente documento. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de las CDRs se limita a una, dos o tres posiciones dentro de una o más de las 3 CDRs de la cadena ligera y/o de la cadena pesada. También son posibles combinaciones de los diversos cambios dentro de estas regiones marco y CDR descritas anteriormente. Más preferentemente, estas técnicas se utilizan para generar secuencias adicionales de aminoácidos de la región variable utilizando las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera variables descritas en la SEQ ID NO:12 y la SEQ ID NO:14 respectivamente.

Los anticuerpos humanos modificados genéticamente o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que "compiten" con las moléculas divulgadas en el presente documento son aquellos que se unen a DKK-1 humano (SEQ ID NO:29) en sitio(s) que son idénticos a, o se superponen con, el(los) sitio(s) al(los) que se unen las presentes moléculas. Los anticuerpos humanos modificados genéticamente competidores o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden identificarse, por ejemplo, mediante un ensayo de competencia de anticuerpos. Por ejemplo, una muestra de DKK-1 humano purificado o parcialmente purificado (SEQ ID NO:29) se une a un soporte sólido. A continuación, se añade un anticuerpo divulgado en el presente documento y un anticuerpo monoclonal de prueba o un fragmento de unión a antígeno, bien sea con la prueba o el anticuerpo de la presente invención etiquetados. Si el anticuerpo marcado y el anticuerpo no marcado se unen a sitios separados y discretos en DKK-1, el anticuerpo marcado se unirá al mismo nivel, esté o no presente el anticuerpo competidor sospechoso. Sin embargo, si los sitios de interacción son idénticos o se superponen, el anticuerpo no marcado competirá, y la cantidad de anticuerpo marcado unido al antígeno será menor. Si el anticuerpo no marcado está presente en exceso, no se unirá ningún anticuerpo marcado. Para propósitos de la presente invención, los anticuerpos humanos modificados genéticamente competidores o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son aquellos que disminuyen la unión de los presentes anticuerpos a DKK-1 en aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 %. Los detalles de los procedimientos para llevar a cabo estos ensayos de competencia son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, páginas 567-569, ISBN 0-87969-314­ 2. Estos ensayos pueden hacerse cuantitativos utilizando anticuerpos purificados. Se establece una curva estándar titulando un anticuerpo contra una versión marcada de sí mismo. Se titula la capacidad de un anticuerpo monoclonal competidor no marcado o de un fragmento de unión a antígeno del mismo para inhibir la unión de la molécula marcada a la placa. Los resultados se grafican y se comparan las concentraciones necesarias para lograr el grado deseado de inhibición de la unión. Si los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que compiten con los anticuerpos humanos modificados genéticamente o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención en tales ensayos de competencia poseen las mismas o similares propiedades funcionales de los presentes anticuerpos humanos modificados genéticamente puede determinarse mediante los procedimientos divulgados en los Ejemplos del presente documento.

El término "inhibir" significa la capacidad de antagonizar, prohibir, prevenir, restringir, frenar, interrumpir, eliminar, detener, reducir o revertir sustancialmente los efectos biológicos del DKK-1.

El término "tratar" (o "trato" o "tratamiento") se refiere a procesos que implican una ralentización, interrupción, suspensión, control, detención, reducción o reversión de la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad, pero no implica necesariamente una eliminación total de todos los síntomas, condiciones o trastornos relacionados con la enfermedad y asociados con la actividad de la DKK-1.

El término "prevenir" (o "previene" o "prevención") significa prohibir, restringir o inhibir la incidencia o aparición de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad. Los eventos agudos y las afecciones crónicas pueden ser tratados y prevenidos. En un evento agudo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo se administra al inicio de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad, y se suspende cuando el evento agudo termina. En cambio, un síntoma, un trastorno, una afección o una enfermedad crónicos se tratan durante un periodo de tiempo más prolongado.

El término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad o dosis de un compuesto de anticuerpo de la presente invención que, tras la administración de una dosis unitaria o múltiple a un paciente, proporciona el tratamiento o la prevención deseados. Las cantidades terapéuticamente eficaces de los presentes compuestos de anticuerpos pueden comprender una cantidad en el rango de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg por dosis unitaria. El médico puede determinar una cantidad terapéutica eficaz para cualquier paciente individual mediante la monitorización del efecto de los compuestos de anticuerpos sobre un biomarcador.

El término "curación ósea" se refiere a la estimulación de la formación ósea en los sitios de lesión mediante el bloqueo de la DKK-1. Los ejemplos de indicaciones de curación ósea incluyen, entre otros, la curación de fracturas, la fijación/retención de implantes y la fijación/retención de implantes dentales.

Los anticuerpos humanos modificados genéticamente de la presente invención pueden utilizarse como medicamentos en medicina humana, administrados por una variedad de vías. Más preferentemente, tales composiciones son para administración parenteral. Tales composiciones farmacéuticas pueden prepararse por procedimientos bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo humano modificado genéticamente como se describe en el presente documento, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los resultados de los siguientes ensayos demuestran que los anticuerpos monoclonales y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención, son útiles como inhibidores de DKK-1. Los anticuerpos de la presente invención poseen una serie de propiedades deseables. Por ejemplo, el anticuerpo II de la presente invención tiene una mayor estabilidad química y física, y solubilidad. Se realizan estudios acelerados para evaluar la estabilidad química de los anticuerpos incubando los anticuerpos de la presente invención en diferentes condiciones de tampón (variación de pH y NaCl) e incubando a 4 °C, 25 °C y 40 °C durante 4 semanas. Las modificaciones químicas de los anticuerpos de la presente invención se detectan mediante cromatografía de intercambio catiónico ("CEX") para separar las variantes de carga (por ejemplo, la desamidación de la asparagina a ácido aspártico) y el análisis LC-MS para identificar los sitios específicos de degradación. El anticuerpo II tiene la menor cantidad de degradación detectada por CEX y este resultado se confirma además por los datos de LC-MS que muestran que los tres residuos de asparagina en las CDRs tenían la menor cantidad de desamidación en comparación con los otros anticuerpos descritos en este documento después de 4 semanas de incubación a 40 °C en tampón de pH 8. La solubilidad del anticuerpo II es más favorable que la del anticuerpo I cuando se formula a pH 6 NaCl 150 mM. Además, el anticuerpo II mantuvo una solubilidad de >105 mg/ml cuando se almacenó a 4 °C, mientras que la solubilidad del anticuerpo I es sólo de 48 mg/ml y precipitó bajo estas mismas condiciones. Tal como se utiliza aquí, "EC50" se refiere a la concentración de un agente que produce el 50 % de la respuesta máxima posible para ese agente. "Kd" se refiere a la constante de disociación de equilibrio que puede calcularse mediante la fórmula: kinactivo/kactivo = Kd.

Ejemplo 1- Producción de anticuerpos

Los anticuerpos I, II, III y IV pueden hacerse y purificarse como sigue. Una célula huésped apropiada, tal como HEK 293 EBNA o CHO, se transfecta bien sea de forma transitoria o estable con un sistema de expresión para secretar anticuerpos utilizando una relación óptima predeterminada de vector HC:LC o un sistema de vector único que codifica ambos HC, tales como SEQ ID NO: 23, o SEQ ID NO: 24, y LC, tales como SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, o SEQ ID NO: 28. El medio clarificado, en el que se ha secretado el anticuerpo, se purifica utilizando cualquiera de las muchas técnicas comúnmente utilizadas. Por ejemplo, el medio puede aplicarse convenientemente a una columna de proteína A o G Sepharose FF que haya sido equilibrada con un tampón compatible, tal como la solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La columna se lava para eliminar los componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido se eluye, por ejemplo, mediante un gradiente de pH (tal como un tampón de fosfato de sodio 0,1 M con pH 6,8 a un tampón de citrato de sodio 0,1 M con pH 3,0). Las fracciones de anticuerpos se detectan, tal como mediante SDS-PAGE, y luego se agrupan. La purificación adicional es opcional, dependiendo del uso previsto. El anticuerpo puede concentrarse y/o filtrarse de forma estéril mediante las técnicas habituales. Los agregados y multímeros solubles pueden eliminarse eficazmente mediante técnicas comunes, incluyendo la exclusión por tamaño, la interacción hidrófoba, el intercambio iónico o la cromatografía de hidroxiapatita. La pureza del anticuerpo tras estas etapas de cromatografía es superior al 99 %. El producto puede ser congelado inmediatamente a -70 °C o puede ser liofilizado. Las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos se indican a continuación.

SEQ TD NOs

Ejemplo 2: Mediciones de afinidad (Kd) para los anticuerpos DKK-1

Para establecer un equilibrio de unión, se mezcla una concentración constante de anticuerpo con concentraciones variables de DKK-1 marcado con His (SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:33) (rango de 1 nM - 1 pM) en PBS (pH 7,4) 1 mg/ml de albúmina de suero bovino ("BSA") o tampón solo y se incuba durante varios días a 37 °C. Se establecen dos conjuntos de reacciones de unión, un conjunto a baja concentración de anticuerpo (3 pM) y otro conjunto a alta concentración de anticuerpo (30 o 50 pM).

Después de establecer el equilibrio, se utiliza un instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) para sondear la fracción de anticuerpo "libre" (no unido). En resumen, el DKK-1 marcado con His se acopla covalentemente a perlas de Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) activadas con NHS, que son empaquetadas por el instrumento para crear una pequeña columna. Las mezclas preequilibradas de anticuerpo DKK-1 marcado con His se pasan sobre las perlas para capturar sólo el anticuerpo libre. La cantidad de anticuerpo libre capturado es proporcional a la concentración libre en las muestras equilibradas, y se detecta mediante la inyección de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Los conjuntos de datos de concentraciones bajas y altas de anticuerpos se ajustan globalmente utilizando el análisis de la curva n en el software KinExA. Este ajuste devuelve un valor Kd así como el intervalo de confianza del 95 %.

Tabla 1: Afinidad del anticuerpo II con el DKK-1 de diversas especies

Ejemplo 3: Efecto de los anticuerpos Dkk-1 en el ensayo de fosfatasa alcalina de C2C12

La señalización canónica de Wnt es importante para la diferenciación y la actividad de los osteoblastos. El CM (medio condicionado) de Wnt-3a combinado con BMP-4 induce a las células pluripotentes C2C12 de ratón a diferenciarse en osteoblastos con un punto final medible de fosfatasa alcalina ("AP"), un marcador de la actividad osteoblástica. El DKK-1, un inhibidor de la señalización Wnt canónica, inhibe la diferenciación y la producción de AP. Los anticuerpos neutralizantes del DKK-1 impiden la inhibición de AP mediada por el DKK-1. Los anticuerpos que bloquean la actividad inhibidora de la DKK-1 evitan la pérdida de actividad de la AP.

Las células C2C12 se cultivan hasta un 60 % - 80 % de confluencia en frascos de cultivo de tejidos en medio de crecimiento (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ("DMEM") que contiene L-glutamina, 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor ("FBS"), 1x antibiótico/antimicótico, 1x piruvato de sodio). Las células C2C12 se resuspenden hasta una concentración de 30.000 células/ml en medio de crecimiento y se añaden 100 pl/pocillo a una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se incuban durante la noche a 37 °C, 95 % de humedad, 5 % de CO2. El medio de crecimiento se sustituye por 50 pl de medio de ensayo (DMEM con L-glutamina, 5 % de FBS inactivado por calor, 1x antibiótico/antimicótico, 1x piruvato de sodio). Para estimular la diferenciación (y así inducir la producción de AP), se añaden 100 pl de medio de ensayo más 1,5x Wnt-3a CM BMP-4 (catálogo de R & D Systems #314-BP). Esto produce una concentración final de 1x Wnt-3a CM y 25 ng/ml de BMP-4. Los controles negativos sólo contienen CM de células L (sin Wnt-3a ni BMP-4). Las células se incuban a 37 °C, 95 % de humedad y 5 % de CO2 durante 72 horas. Se elimina el medio, se lavan las células con 200 pl de solución salina tamponada con fosfato ("PBS") y se elimina el PBS. Las células se congelan y descongelan 3 veces. Se añaden 100 pl de sustrato pNPP de una etapa (catálogo Thermo Scientific n° 37621) por pocillo y se incuba la placa a temperatura ambiente. La absorbencia se lee a 405 nm. Para determinar la concentración de DKK-1 necesaria para inhibir la diferenciación, se titulan moléculas de Dkk-1 de diversas especies para identificar la concentración mínima necesaria para inhibir completamente la inducción de AP.

La concentración mínima de DKK-1 de cada especie que inhibe completamente la inducción de AP es el siguiente: DKK-1 humano=38 nM, DKK-1 de cynomolgus=11,4 nM, DKK-1 de rata=5,8 nM, y DKK-1 de conejo = 25,0 nM.

Una vez determinada la concentración de DKK-1 que inhibe completamente la inducción de AP, se preincuban concentraciones crecientes de un anticuerpo anti-DKK-1 en el medio de ensayo con una concentración inhibitoria de Dkk-1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. La inducción de AP se determina como se ha descrito anteriormente. Los resultados se presentan como EC50 (nM ± error estándar).

El anticuerpo II bloquea la inhibición mediada por Dkk-1 de C2C12 AP. Para el DKK-1 de diversas especies, las EC50 (dadas como nM ± error estándar) son las siguientes: humano = 9,8 ± 0,41, cynomolgus = 6,4 ± 0,25, rata= 2,9 ± 0,25, y conejo = 6,0 ± 0,32.

Ejemplo 4: Ensayo in vivo del defecto cortical (CD)

Las ratas hembras Sprague-Dawley de seis meses son ovariectomizadas y se les permite perder hueso durante dos meses. Se introducen defectos de 2 mm de diámetro en los fémures izquierdo y derecho con un taladro eléctrico con una broca dental de 2 mm. Este orificio se extiende a través de las cortezas anterior y posterior. La cicatrización del hueso se monitoriza longitudinalmente mediante la evaluación de la densidad de masa ósea ("BMD") a través del uso de la tomografía computarizada cuantitativa ("qCT") durante 35 días después de la cirugía. Al final del experimento, los animales se sacrifican y los fémures enteros se someten a determinaciones de carga hasta el fallo para determinar la resistencia biomecánica de toda la diáfisis. Los anticuerpos se administran por vía subcutánea en las dosis e intervalos indicados.

El anticuerpo II se dosifica como sigue: Se administran 5 mg/kg una vez cada dos semanas empezando un día después de la cirugía (Grupo 1), 1 mg/kg (Grupo 2), 5 mg/kg (Grupo 3), o 15 mg/kg (Grupo 4) una vez cada dos semanas empezando nueve días después de la cirugía. La BMD se evalúa mediante qCT en el día 35. El grupo 1 mostró un aumento estadísticamente significativo de la BMD tanto en la corteza anterior como en la posterior. El grupo 4 mostró un aumento estadísticamente significativo de la BMD en ambas corticales, aunque los grupos 2 y 3 mostraron un aumento no significativo de la BMD.

Ejemplo 5: Ensayo de eficacia in vivo del cáncer

Los ratones (ratones hembra C.B-17, modelo de inmunodeficiencia combinada severa de Fox Chase # CB 17SC-M) se aclimatan durante una semana en una instalación de animales antes de iniciar el experimento. Después de la aclimatación, los ratones se distribuyen aleatoriamente en grupos de 10 por tratamiento. Se implantan células de carcinoma pulmonar de células no pequeñas humanas A549 por vía subcutánea en el flanco posterior de los ratones y se deja que el tumor alcance un volumen tumoral medio ~ 100 mm3. El anticuerpo II (1 mg/kg y 5 mg/kg), el anticuerpo IgG de control (1 mg/kg y 5 mg/kg), o el vehículo (solución salina tamponada con citrato suplementada con 0,02 % de Tween 80) se administran mediante inyección subcutánea. Los animales reciben 2 tratamientos separados por 7 días.

Los tumores se miden 2 veces por semana con calibradores electrónicos para trazar las curvas de crecimiento. Los animales también son monitorizados dos veces por semana para detectar fluctuaciones en el peso corporal y signos de toxicidad. Las mediciones del volumen del tumor que se muestran en la tabla 3 se toman el día 29.

Como se muestra en la Tabla 2, los grupos de tratamiento que recibieron el anticuerpo II, demostraron una inhibición significativa del crecimiento de xenoinjertos de pulmón de células no pequeñas A549 humanos in vivo.

Tabla 2: Eficacia del anticuerpo II en el modelo de xenoinjerto de carcinoma pulmonar humano de células no pequeñas A549

Ejemplo 6: Ensayo de renormalización angiogénica in vivo de xenoinjertos

Para comprender el mecanismo de la eficacia antitumoral, se lleva a cabo un análisis de imágenes de alto contenido en los tumores A549 tratados con el anticuerpo II o el control IgG. Se analizan varios marcadores basados en el fenotipo tanto cuantitativa como cualitativamente para evaluar los procesos biológicos relevantes para el cáncer de la angiogénesis (CD31 y actina del músculo liso, s Ma ), la inducción de la hipoxia (transportador de glucosa 1, GLUT1), la proliferación celular (Ki67) y la apoptosis (Terminal UDP Nick-End Labeling, TUNEL).

Los ratones hembra C.B-17 (Fox Chase SCID) modelo # CB17SC-M de 7 a 8 semanas de edad se aclimatan durante una semana y se les permite alimentarse ad libitum con una dieta normal baja en grasas (4,5 %), que se mantiene durante la duración del estudio.

Las células A549 de origen ATCC se cultivan y dividen en medio F-12 Kaighn (InVitrogen #21127) suplementado con FBS al 10 % (InVitrogen #0, y diluciones 100x de piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y pen-strep (Invitrogen #11360, #11140 y #15140 respectivamente). Se desprenden y se preparan a una concentración final de 50x106 células/ml en PBS en el pasaje 19 con una viabilidad del 95 %.

Se inyectan 5x106 células de carcinoma pulmonar humano A549 por vía subcutánea en el flanco de los ratones sujetos en una mezcla 1:1 de PBS y Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA). Las mediciones del tumor y del peso corporal se realizan dos veces por semana. Antes del tratamiento, los ratones son aleatorizados con base en el tamaño del tumor mediante un algoritmo de aleatorización.

A partir del momento en que los tumores alcanzan los 200 mm3, los ratones aleatorizados se separan en 2 grupos de 10 animales y se dosifican por vía subcutánea el día 1 y de nuevo el día 8 con 5 mg/kg de anticuerpo II o del control IgG4. El estudio finaliza 10 días después de la administración de la primera dosis de anticuerpos.

El anticuerpo II se prepara en una solución salina tamponada con citrato (CBS) (10 mM de citrato pH6, 150 mM de NaCl y 0,2 % de polisorbato). El control IgG4 se suministra a 6,0 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Los tumores de xenoinjerto se extirpan de los ratones después de 17 días de la dosis y se colocan en el fijador Zinc-Tris (BD Pharmingen). Los tumores fijados se procesan, se bloquean en parafina y se seccionan como cortes de 3 pM en portaobjetos de microscopio estándar. Los portaobjetos se hornean a 60°F durante 1 hora y luego se desparafinan en xileno (4 tratamientos, 10 minutos cada uno). Los portaobjetos se rehidratan mediante una serie de inmersiones en etanol/agua con lavados finales en solución salina tamponada con Tris/Tween (TBST). A continuación, los portaobjetos se bloquean con Protein Block (DAKO) durante 30 minutos. Para el panel de salud tumoral, los portaobjetos se tiñen con una combinación de Hoechst 33324 (Invitrogen), anti-CD31 humano de rata (Pharmingen)/anti-rata Alexa-488 (Invitrogen), anti-Ki67 de conejo (NeoMarkers)/anti-conejo Alexa 647 (Invitrogen), y TUNEL-TMR rojo (diluido 1:5 en tampón de dilución TUNEL; Roche). Para el panel de angiogénesis, los portaobjetos se tiñen con una combinación de Hoechst 33324 (Invitrogen), anti-CD31 humano de rata (Pharmingen)/anti-rata Alexa-488 (Invitrogen), anti-GLUT1 de conejo (Chemicon)/anti-conejo Alexa 647 (Invitrogen), y anti-Actina de músculo liso de ratón/Cy3 (Sigma). Los portaobjetos se visualizan utilizando un citómetro de barrido láser iCys (CompuCyte) y una estación de trabajo de generación de imágenes digitales Marianas configurada con un microscopio de fluorescencia invertido Zeiss Axiovert 200M (Intelligent Imaging Innovations). Las comparaciones de datos cuantitativos de los grupos de tratamiento se realizan mediante el análisis de Dunnet en el software estadístico JMP (SAS).

Como se muestra en la Tabla 3, los xenoinjertos A549 de animales tratados con IgG de control están modestamente vascularizados, tienen niveles moderados de miofibroblastos y muchas áreas focalizadas de hipoxia. Los tumores tratados con IgG de control presentan una extensa red de vasos que consiste tanto por brotes vasculares neoangiogénicos como por vasos maduros escasamente cubiertos por pericitos. Los tumores tratados con IgG de control tienen áreas hipóxicas (marcadas por GLUT1) que son zonas claramente delimitadas a cierta distancia de los vasos perfundidos y áreas necróticas que están icluso adicionalmente lejos de los vasos. El tratamiento con el Anticuerpo II da como resultado una disminución del área de los vasos, una disminución del área de los pericitos y una disminución de la cobertura de los vasos por pericitos. Sin embargo, este tratamiento no dio como resultado una diferencia significativa en la hipoxia tumoral. Cualitativamente, la vasculatura tumoral tratada con el anticuerpo II parece consistir en vasos más pequeños, menos conectados en red y con menos cobertura de pericitos en comparación con el grupo tratado con IgG de control.

Como se muestra en la Tabla 3, los tumores tratados con IgG tienen células tumorales proliferantes distribuidas uniformemente por todas partes, pero también muestran frecuentemente una o más áreas grandes de necrosis que son avasculares. El tratamiento con el anticuerpo II no produce ningún cambio en la apoptosis y sólo una ligera y no significativa disminución del área de proliferación total. Sin embargo, hay una profunda disminución del porcentaje del área de células Ki67 de alta intensidad en los tumores tratados con el anticuerpo II, lo que podría indicar una disminución de la cantidad de células en la fase del ciclo celular G2.

Tabla 3: Anticuerpo II en ensayo de xenoinjerto in vivo de renormalización angiogénica

Ejemplo 7: Ensayo de eficacia ósea in vivo

Para evaluar la capacidad del anticuerpo V (cadena ligera SEQ ID NO:34 y cadena pesada SEQ ID NO:35) de acelerar la formación ósea peri-implante y regenerar el tejido óseo, se utilizan ratas macho Sprague-Dawley (Harlan Sprague Dawley Inc) de cuatro meses de edad que pesan alrededor de 425 gramos. A las ratas se les implanta quirúrgicamente un tornillo de titanio (2 mm x 4 mm) en las dos patas de la cara lateral media justo por encima de la unión tibial - fibular. A continuación, las ratas se dividen aleatoriamente en 2 grupos de acuerdo con el peso corporal y reciben el anticuerpo V 10mg/kg o el control IgG 10mg/kg por inyección subcutánea una vez a la semana empezando el mismo día de la cirugía durante 21 días. La tomografía computarizada cuantitativa (escáner CT modelo Aloka LaTheta LTC-100) se utiliza para escanear ex vivo y cuantificar el hueso recién formado con un tamaño de voxel de 60 pm. El volumen de interés (VOI) se define como 28 cortes con un intervalo de 0,1 mm sobre el sitio del implante anterior. Las diferencias entre los grupos se evaluaron con el programa informático JMP versión 5.1. (Cary, Carolina del Norte), comparando con el control IgG mediante el procedimiento de Dunnett con un nivel de significación de P<0,05. La evaluación cualitativa mediante imágenes de rayos X de faxitrón ex vivo indica que las ratas tratadas con el anticuerpo V tienen más hueso nuevo o callo alrededor del implante. Los análisis cuantitativos de TC revelan un aumento estadísticamente significativo del contenido mineral óseo cortical periimplantario (14 %), del área de hueso nuevo (16 %), del grosor cortical (7 %) y del contenido mineral óseo nuevo esponjoso periimplantario de la médula ósea (18 %), y del área ósea (16 %) en las ratas tratadas con el anticuerpo V en comparación con el control IgG. Los datos demuestran que el anticuerpo V estimula la formación de hueso nuevo y acelera la regeneración del tejido óseo en ratas implantadas con titanio.

Tabla 4: Análisis por micro-CT de la formación de hueso nuevo periimplantario

Grupo n Análisis de la médula ósea Análisis corticales periimplantaria periimplantarios

Contenido mineral Área ósea Contenido mineral Área ósea Grosor óseo (mg) (cmA2) óseo (mg) (cmA2) cortical (cm) IgG

control ^{10 0,034} 0,064

0,84 ±0,04 6,70 ±0,07_{±0,001 ±0,001} 0,054 ±0,001 Anticuerpo

^{V 1} 0,074 0,057

1⁰0 1,00 ±0,04* ^0,039 7,61 ±0,06*_±0,002* ±0,001* ±0,001* Los datos se presentan como media ± SE, *p<0,05, frente al control IgG, prueba de Dunnett JMP,

Listado de la SEQ ID

CDRs de cadena pesada

SEQ ID NO: 1 GFTFSSYTMS

SEQ ID NO:2 TISGGGFGTYYPDSVKG

SEQ ID NO:3 PGYHNYFDI

SEQ ID NO:4 PGYNNYYFDI

Cadena ligera

SEQ ID NO:5 HASDSISNSLH

SEQ ID NO:6 YGRQSIQ

SEQ ID NO:7 QQSESWPLH

SEQ ID NO: 8 YARQSIQ

SEQ ID NO:9 QQSASWPLH

SEQ ID NO:10 YARQSEQ

Regiones variables de la cadena pesada

SEQ ID NO: 11 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GF GT YYPDS VKGRFTISRDNAKN SLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARPGYHNYYFDI WGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GF GT YYPDS VKGRFTISRDNAKN SLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARPGYNNYYFDI WGQGTTVTVSS

Regiones variables de la cadena ligera

SEQ ID NO: 13

EIVLTQ SP ATL SL SPGERATL SCHASD SISN SLHW Y QQKPGQ APRLLIYY GRQ SIQG IP ARF S GS GS GTDFTLTIS SLEPEDF A V Y YCQQ SE S WPLHF GGGTK VEIK

SEQ ID NO: 14

EIVLTQ SP ATL SL SPGERATL SCHASD SISN SLHW Y QQKPGQ APRLLI YY ARQ SIQG IP ARF SGSGSGTDFTLTIS SLEPEDF AVY Y CQQ SE SWPLHF GGGTK VEIK

SEQ ID NO: 15

EIVLTQ SP ATL SL SPGERATL SCHASD SISN SLHW Y QQKPGQ APRLLI YY GRQ SIQG IP ARF SGSGSGTDFTLTIS SLEPEDF AVYY CQQS ASWPLHF GGGTKVEIK

SEQ ID NO: 16

EIVLTQ SP ATL SL SPGERATL SCHASD SI SN SLHW Y QQKPGQ APRLLI YY ARQ SEQ GIP ARF SGSGSGTDFTLTIS SLEPEDF AVYY CQQS ASWPLHF GGGTKVEIK

Cadenas pesadas completas

SEQ ID NO: 17 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GF GT YYPDS VKGRFTISRDNAKN SLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARPGYHNYYFDI WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVP S S SLGTKT YT CNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLY SRLTVDKSRWQEGNVF SC SVMHEALHNHYT QKSLSLSLG

SEQ ID NO: 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GF GT YYPDS VKGRFTISRDNAKN SLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARPGYNNYYFDI WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFP A VLQ SSGLYSL S S VVTVP S S SLGTKT YTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKG LP S SIEKTISK AKGQPREPQ V YTLPP S QEEMTKN Q VSLT CL VKGF YP SDIA VEWE S N GQPENN YKTTPP VLD SD GSFFL Y SRLT VDK SRW QEGNVF S C SVMHEALHNHYT QKSLSLSLG

Cadenas ligeras completas

SEQ ID NO: 19

EIVLTQ SP ATL SL SPGERATL SCHASD SISN SLHW YQQKPGQ APRLLI YY GRQ SIQG

IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEDCRTVAAPS

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KD S T YSL S S TLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGEC

SEQ ID NO:20

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSIQG

IP ARF SGSGSGTDFTLTIS SLEPEDF AYY Y CQQ SE SWPLHF GGGTKVEIKRT YAAP S

VFIFPP SDEQLK S GT A S V V CLLNNF YPRE AK V Q WK VDN ALQ S GN S QE S VTEQD S

KD S T YSL S S TLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGEC

SEQ ID N0:21

EIVLTQ SP ATL SL SPGERATL SCHASD SISN SLHW Y QQKPGQ APRLLIYY GRQ SIQG

IP ARF SGSGSGTDFTLTIS SLEPEDF AYYY CQQS ASWPLHF GGGTKVEIKRT YAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KD ST Y SL S STLTL SKAD YEKHK VY ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGEC

SEQ ID NO:22

EIVLTQ SP ATL SL SPGERATL SCHASD SISN SLHW YQQKPGQ APRLLI YYARQ SEQ

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKD ST Y SL S STLTL SKAD YEKHK VY ACEVTHQGL S SP VTKSFNRGEC

Secuencias de nucleótidos - Regiones variables de la cadena pesada

SEQ ID NO:23

GAGGT GC AGC T GGT GGAGT C T GGGGG AGGC TT GGT C C AGC C T GGGGGGT C C C

TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTT

GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGG

TGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCT

CCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC

CGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATCACAACTACTACT

TTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA

GGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC

ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG

TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC

CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG

CAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC

ACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT

GCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAA

ACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG

GTGGACGTGAGCC AGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTC AACTGGT ACGT GGAT G

GCGT GGAGGT GC AT AAT GCC AAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGC AGTT C AAC A

GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAC

GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCG

AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACA

CCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG

CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAAT

GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG

GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA

GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA

CACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

SEQ ID NO:24

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC

TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTT

GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGG

TGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCT

CCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC

CGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATAATAACTACTACT

TTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA

GGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC

ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG

TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC

CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG

CAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC

ACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT

GCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAA

ACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG

GT GGACGT GAGCC AGGAAGACCCCGAGGTCC AGTTC A ACTGGT ACGT GGAT G

GCGT GGAGGT GC AT AAT GCC AAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGC AGTT C AAC A

GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAC

GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCG

AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACA

CCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG

CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAAT

GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG

GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA

GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA

CACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

Secuencias de nucleótidos - Regiones variables de la cadena ligera

SEQ ID NO:25

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG

AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACA

GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC

TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG

TCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA

ACAGGGGAGAGT GC

SEQ ID NO:26

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG

AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACA

GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC

TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG

TCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA

ACAGGGGAGAGT GC

SEQ ID NO:27

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG

AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACA

GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC

TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG

TCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA

ACAGGGGAGAGT GC

SEQ ID NO:28

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG

AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT

ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACA

GTCCGAGC AGGGC ATCCC AGCC AGGTT C AGT GGC AGT GGGTCTGGGAC AGAC

TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG

TCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG

ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA

GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC

CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA

ACAGGGGAGAGT GC

DKK-1 humano

SEQ ID NO:29

TLN S VLN SNAIKNLPPPLGGAAGHPGS AV S AAPGIL YPGGNK Y QTIDNY QP YPC A

EDEECGTDEY C ASPTRGGD AGV QICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNY CKNGIC V

S SDQNHFRGEIEETITESF GNDHSTLDGY SRRTTL S SKM YHTKGQEGS V CLRS SDC

AS GLC C ARHF W SKICKP VLKEGQ V C TKHRRKGSHGLEIF QRC Y CGEGL S CRIQKD

HHQASNSSRLHTCQRH

DKK-1 de Cynomolgus

SEQ ID NO:30

TLN S VLN SNAIKNLPPPLGGAAGHPGS AV S AAPGIL YPGGNK Y QTIDNY QP YPC A

EDEECGTDEY C ASPTRGGD AGV QICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNY CKNGIC V

S SDQNNFRGEIEETITESF GNDHSTLDGY SRRTTLS SKMYHSKGQEGS VCLRS SDC

ATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKD

HHQASNS SRLHTCQR

DKK-1 de rata

SEQ ID NO:31

TLN S VLIN SNAIKNLPPPLGGAGGQPGS AY S VAPGVL YEGGNK Y QTLDNY QP YPC

AEDEECGTDEY C S SP SRGAAGY GGV QICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNY CKNG

ICMP SDHSHLPRGEIEEGIIENLGNDHGAGDGYPRRTTLT SKIYHTKGQEGS YCLR

S SDC AT GLCC ARHFW SKICKP VLKEGQ YCTKHRRKGSHGLEIF QRC Y CGEGL AC

RIQKDHHQT SN S SRLHTCQRHAFID YKDDDDKHV

DKK-1 de conejo

SEQ ID NO:32

TLN S VL VN SNAIKNLPPPLGGAN GHPGS AV S ATPGIL YEGGNK YLPLDNY QP YPC

TEDEECGTDEYCASPARGGGAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGIC

MPSDHNHFHRGEIEETIVESFGNDHSTSDGYSRRTTLSSKMYHAKGQEGSVCLRS

SDC AT GLCC ARHFW SKICKP VLKEGQ VCTKHRRKGSHGLEIF QRC Y CGDGL SCR

LQND QHE ASN S SRLHTC QR

DKK-1 de ratón

SEQ ID NO:33

TLN S VLIN SNAIKNLPPPLGGAGGQPGS AV SVAPGVL YEGGNK Y QTLDNY QP YPC

AEDEECGSDE Y C S SP SRGAAGY GGV QICL ACRKRRKRCMTHAMCCPGNY CKNG

ICMPSDHSHFPRGEIEESIIENLGNDHNAAAGDGYPRRTTLTSKIYHTKGQEGSVC

LRS SDC AAGLCCARHFW SKICKP VLKEGQ VCTKHKRKGSHGLEIF QRC Y CGEGL

ACRIQKDHHQ ASN S SRLHTCQRH

Anticuerpo V - Cadena ligera completa

SEQ ID NO:34

DILLTQSPATLSVTPGDSYSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGI

P SRF SGSGSGTDFTL SIN S VETEDF GM YF CQQ SN S WPLNF GAGTKLELKRAD AAP

TVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDS

KD S T Y SM S S TL SL SK AD YE SHNL YT CE VVHKT S S SP V VK SFNRNEC

Anticuerpo V - Cadena pesada completa

SEQ ID NO:35

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISGG

GGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGYNNYYFDY

WGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNS

GALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIV

PRN C GGDCKPCIC T GSE V S S VFIFPPKPKD VLTITLTPK VT C V VVDIS QDDPE VHF S

WF VDD VEVHT AQTRPPEEQFNSTFRS V SELPILHQDWLN GRTFRCK VT S A AFP SPI

EKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEEMTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQ

PQEN YKNTPPTMDTDGS YFL Y SKLNVKKEKW QQGNTFTC S VLHEGLHNHHTEK

SLSHSPGK

Anticuerpo V - Región variable de la cadena ligera

SEQ ID NO:36

DILLTQSPATLSVTPGDSYSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGI

P SRF SGSGSGTDFTL SIN S VETEDF GM YF CQQ SN S WPLNF GAGTKLELK

Anticuerpo V - Región variable de la cadena pesada

SEQ ID NO:37

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISGG

GGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGYNNYYFDY

WGQGTTLTVSS

Anticuerpo V - CDRs de cadena pesada

SEQ ID NO:38 TISGGGGNTYYPDSVKG

SEQ ID NO:39 PGYNNYYFDY

Anticuerpo V - CDRs de Cadena ligera

SEQ ID NO:40 RASDSI SGSLH

SEQ ID NO:41 YASQSI S

SEQ ID NO:42 QQSNSWPLN

CDRs de Cadena pesada de consenso

SEQ ID NO:43 T I S GGGX ¹X ²TYYPDSVKG

Xi es F, G

X ² es G, N

SEQ ID NO:44 PGYX ³NYYFDI

X ³ es H, N

SEQ ID NO:45 PGYX4 NYYFDX5

X⁴ es H, N

X ⁵ es I, Y

CDRs de Cadena l igera de consenso

SEQ ID NO:46 X ⁶ASDSI SX⁷SLH

X6 es H, R

X ⁷ es N, G

SEQ ID NO:47 YX8RQSX9Q

X8 es G, A

X ⁹ es I, E

SEQ ID NO:48 Y X 10X 11Q S X 12X 13

Xio es G, A

X ¹¹ es R, S

X ¹² es I, E

X ¹³ es Q, S

SEQ ID NO:49 Q QS X ¹⁴SWPLH

X ¹⁴ es E, A

SEQ ID NO:50 Q QS X 15SWPLX 16

X ¹⁵ es E, A, N

Xi6 es H, N

Región variable de la cadena pesada de consenso

SEQ ID NO:51 ’ ~ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYX17NYYF DI WGQGTTYTVSS

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo DKK-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en la que la LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 y la VHCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37.

2. Un anticuerpo DKK-1 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo DKK-1 comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.

3. Un anticuerpo DKK-1 de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende dos cadenas ligeras en las que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34, y dos cadenas pesadas en las que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.

4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo DKK-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.